KR102067211B1

KR102067211B1 - 디알데히드 전분 및 콜라겐을 포함하는 다공성 골 이식재, 및 이를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR102067211B1
Application number: KR1020190036200A
Authority: KR
Inventors: 이광일; 라호종
Original assignee: 이광일
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2039-03-28

Abstract

본 발명은 다공성 골 이식재 및 이를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 디알데히드 전분, 콜라겐, 및 헤파린의 고분자 복합체를 포함하는 다공성 골 이식재, 및 상기 다공성 골 이식재를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

디알데히드 전분 및 콜라겐을 포함하는 다공성 골 이식재, 및 이를 제조하는 방법 {Porous bone substitutes comprising dialdehyde starch and collagen, and method for manufacturing the same}

디알데히드 전분 및 콜라겐을 포함하는 다공성 골 이식재, 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

골 조직은 유기 화합물과 무기 화합물의 복합체로 구성된다. 상기 유기 화합물로는 교원질(collagen), 비교원질 단백질(proteoglycan) 등으로 구성되며, 제1형 콜라겐이 유기 성분의 90%를 차지하는 주성분이다. 무기 성분의 주 성분은 인산칼슘 계통의 무기화합물인 수산화 인회석이다. 골 조직은 피질골(cortical bone), 망상골(cancellous bone), 골막(periosteum), 및 골내막(endosteum)으로 구성되어 있다. 피질골은 골의 외면을 구성하며, 골 조직을 보호하는 역할을 하며, 골 조직의 85%를 차지한다. 골 조직의 내부는 다공성이 높은 망상골로 구성되어 있으며, 골 조직의 약 15%를 차지한다. 유무기 복합체로 구성된 골조직은 단단하면서도 유연성이 있는 기계적 특성을 가지며, 인체 내에서 발생하는 다양한 대사 작용에 관여하는 칼슘을 저장하거나 신속하게 제공하는 기능을 수행한다. 따라서 골 조직은 인체의 구조적 기능을 수행할 뿐만 아니라, 생물학적 기능에도 중요한 역할을 한다. 그럼에도 불구하고 골 조직에 대한 연구는 다른 생체조직들에 비해 미진한 상황이다.

한편, 손상된 골조직을 대체 및 재생하기 위한 다양한 형태의 골 이식 재료에 대한 연구가 진행되고 있다. 손상된 골 조직을 대체하기 위한 이식재료는 기본적으로 형태학적으로나 기계적인 역할과 함께 골 조직이 수행하는 생물학적 기능을 촉진시킬 수 있도록 설계되어야 한다. 또한, 생체 적합성이 우수하여야 하며, 독성, 발암성, 알러지, 염증, 및 이물 반응 등을 유발시키지 않아야 하며, 이와 동시에 골유착성(osteointegration) 및 골전도성(osteoconduction)이 우수하여야 한다. 골 이식재로 사용되는 재료로는 자가골(autograft), 동종골(allograft), 이종골(xenograft), 합성골(alloplastic material)로 분류할 수 있다. 자가골은 2차적인 수술에 대한 부담과 공급량의 제한의 문제점을 지니고 있으며, 동종골 및 이종골은 면역반응의 유발 또는 감염 등의 위험이 존재한다. 합성골은 다양한 형태와 성분으로 제조 및 대량생산이 가능하며, 신체에 대한 충격을 최소화할 수 있다는 장점이 있다. 골 조직의 대체 물질에 대한 연구에서, 초기에는 골 조직의 높은 강도를 대체하기 위한 목적으로 주로 금속 및 금속합금 등이 활용되었으나, 최근에는 재료의 생체 적합성, 생분해성 등을 고려하여 고분자나 세락믹이 활용되고 있으며, 특히, 골 조직의 독특한 기계적 특성을 모사하기 위해 복합 재료에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다(한국 등록특허 10-0957546).

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 우수한 생체 적합성 및 강도를 갖는 고분자 유래의 골 이식재를 개발하기 위하여, 예의 노력한 결과, 디알데히드 전분 및 콜라겐 기반 골 이식재의 우수한 효능을 실험적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 디알데히드 전분 용액, 콜라겐 용액, 및 헤파린 용액을 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계; 상기 혼합 용액을 중화시켜 겔을 형성시키는 단계; 및 상기 형성된 겔을 동결 건조하는 단계를 포함하는, 다공성 골 이식재를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 방법에 의한 제조된 다공성 골 이식재를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위와 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

일 양상은 디알데히드 전분 용액, 콜라겐 용액, 및 헤파린 용액을 혼합하여 단계; 상기 혼합 용액을 중화시켜 겔을 형성시키는 단계; 및 상기 형성된 겔을 동결 건조하는 단계를 포함하는, 다공성 골 이식재를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 다공성 골 이식재를 제조하는 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면, 다음과 같다.

우선, 상기 방법은 디알데히드 전분 용액, 콜라겐 용액, 및 헤파린 용액을 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 상기 디알데히드 전분 용액, 콜라겐 용액, 및 헤파린 용액을 동시에 또는 순차적으로 혼합하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 디알데히드 전분 용액과 상기 콜라겐 용액을 혼합하여 디알데히드 전분-콜라겐 혼합 용액을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 디알데히드 전분-콜라겐 혼합 용액에 헤파린 용액을 첨가하여 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 디알데히드 전분 용액의 농도는 12 내지 30%(w/v)일 수 있다. 상기 범위를 벗어나 용액 내 디알데히드 전분의 농도가 너무 낮으면, 기계적 강도가 지나치게 약해지거나 제조된 골 이식재가 시간의 경과에 따라 수축될 우려가 있고, 반대로 디알데히드 전분의 농도가 너무 높으면, 디알데히드 전분이 균질하게 용해되지 않아 성형에 어려움을 겪을 수 있다. 예를 들어, 상기 디알데히드 전분 용액의 농도는 12 내지 25%(w/v), 12 내지 20%(w/v), 12 내지 15%(w/v), 14 내지 30%(w/v), 14 내지 25%(w/v), 14 내지 20%(w/v), 14 내지 15%(w/v), 16 내지 30%(w/v), 16 내지 25%(w/v), 16 내지 20%(w/v), 18 내지 30%(w/v), 18 내지 25%(w/v), 또는 18 내지 20%(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에 있어서, 상기 콜라겐 용액의 농도는 5 내지 10%(w/v)일 수 있다. 상기 범위를 벗어나 용액 내 콜라겐의 농도가 너무 낮으면 생체 적합성이 저하될 수 있으며, 반대로 콜라겐의 농도가 너무 높으면, 균질하게 용해되지 않거나, 제조된 골 이식재가 시간의 경과에 따라 수축될 우려가 있다. 예를 들어 콜라겐 용액의 농도는 5 내지 9%(w/v), 5 내지 8%(w/v), 5 내지 7%(w/v), 5 내지 6%(w/v), 6 내지 10%(w/v), 6 내지 9%(w/v), 6 내지 8%(w/v), 6 내지 7%(w/v), 7 내지 10%(w/v), 7 내지 9%(w/v), 7 내지 8%(w/v), 8 내지 10%(w/v), 8 내지 9%(w/v), 또는 9 내지 10%(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 디알데히드 전분 및 콜라겐은 추후 진행되는 가교 반응을 통해 고분자 복합체를 형성하게 되며, 이러한 복합체의 형성에 따라 이들은 골 조직의 주요한 기능인 구조적 지지체와 같은 역할을 할 수 있다. 상기 혼합되는 디알데히드 전분 용액 및 콜라겐 용액의 부피비는 1:6 내지 1:12일 수 있으며, 예를 들어, 1:6 내지 1:10, 1:6 내지 1:8, 1:8 내지 1:12, 1:8 내지 1:10, 또는 1:10 내지 1:12일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에 있어서, 상기 헤파린 용액의 농도는 0.01 내지 1%(w/v)일 수 있으며, 예를 들어, 0.01 내지 0.5%(w/v), 0.01 내지 0.1%(w/v), 0.05 내지 1%(w/v), 0.05 내지 0.5%(w/v), 0.05 내지 0.1%(w/v), 0.1 내지 1%(w/v), 또는 0.1 내지 0.5%(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 헤파린은 골 이식재에 분포함으로써, 외부로부터 제공되거나 생체 내 존재하는 성장 인자와 골 이식재간 결합 또는 접착을 가능하게 하며, 이를 통해 골유착성 및 골전도성 등을 향상시키는 역할을 할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 용액 형태의 헤파린 염, 예를 들어, 헤파린 나트륨 염의 첨가는 파우더 형태의 헤파린을 사용한 경우에 비해, 골 이식재 내 헤파린을 균질하게 분포시킬 수 있었는바, 골 이식재로서의 효능을 향상시킬 수 있다.

한편, 상기 방법은 상기 다공성 골 이식재를 성장 인자가 포함된 용액에 담지시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 단계는 다공성 골 이식재를 성장 인자가 포함된 용액에 담지시킨 후, 상기 용액을 특정 조건 하에서 보관 또는 방치함으로써, 다공성 골 이식재 표면의 헤파린과 성장 인자간 결합을 유도하는 것일 수 있다. 예를 들어, 2 내지 10℃의 온도 조건에서 6 내지 24시간 동안 상기 용액을 방치함으로써, 다공성 골 이식재 표면의 헤파린과 성장 인자간 결합을 유도하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 성장 인자로는 예를 들어, BMP(bone morphogenic protein), PDGF(Platelet-derived growth factor), TGF-beta(Transgenic growth factor), IGF-I(Insulin-like growth factor), IGF-II, FGF(Fibroblast growth factor), BGDF-II(beta-2-microglobulin), 오스테오칼신(osteocalcin), 본사이알로프로테인(bonesialo protein), 및 오스테오게닌(osteogenin), 등을 사용할 수 있고, 예를 들어, BMP2, BMP4, BMP7 / PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-9, FGF-18, FGF-20, FGF-22, FGF-23일 수 있으나, 상기 상장 인자는 인체에 무해하고 골 성장을 촉진하는 물질이라면 제한없이 사용이 가능하다.

이후, 상기 방법은 상기 혼합 용액을 중화시켜 겔을 형성시키는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 겔을 형성시키는 단계는 혼합 용액에 중화 용액을 첨가하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 중화 용액은 염기성 용액일 수 있고, 암모니아, 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘, 수산화아연, 수산화세슘, 수산화바륨, 수산화루비듐, 수산화제1철, 수산화제2철, 수산화알루미늄, 메틸아민, 에틸아민, n-프로필아민, n-부틸아민, 탄산칼슘, 중탄산칼륨, 탄산나트륨 및 중탄산나트륨 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어, 수산화 나트륨을 포함하는 용액일 수 있다. 여기에서, 상기 용액 내 수산화나트륨의 농도는 0.5 내지 1N일 수 있다. 예를 들어, 농도는 0.5 내지 0.9N, 0.5 내지 0.8N, 0.5 내지 0.7N, 0.5 내지 0.6N, 0.6 내지 1N, 0.6 내지 0.9N, 0.6 내지 0.8N, 0.6 내지 0.7N일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에 있어서, 상기 겔을 형성시키는 단계는 30 내지 37℃의 조건에서 1 내지 10분 동안 실시되는 것일 수 있다. 예를 들어, 온도 조건은 30 내지 35℃, 30 내지 33℃, 30 내지 31℃, 32 내지 37℃, 32 내지 35℃, 32 내지 33℃, 34 내지 37℃, 34 내지 35℃, 또는 36 내지 37℃의 조건에서 실시될 수 있으며, 가교 반응 시간은 1 내지 9분, 1 내지 8분, 1 내지 7분, 1 내지 6분, 1 내지 5분, 1 내지 4분, 1 내지 3분, 또는 1 내지 2분일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 실시예에 따른 겔을 형성시키는 단계에서, 상기 중화 용액의 농도 및/또는 가교 반응 시간은 골 이식재의 강도 및 다공성 구조에 영향을 미칠 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 겔을 형성시키는 단계는 가교(Cross linking) 반응을 유도하는 것으로서, 상기 콜라겐은 디알데히드 전분과 이민 결합을 형성하고, 상기 헤파린은 콜라겐과 아마이드 결합을 형성하는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 콜라겐은 디알데히드 전분에 의해 가교되어 이민 결합을 형성한다(Schiff's base reaction). 이와 같은 콜라겐에 대한 디알데히드 전분의 첨가는 콜라겐의 라이신 또는 히드록시라이신 측쇄의 -아미노 그룹과 디알데히드 전분의 그룹간 Schiff's base 형성으로 C=N 그룹으로 변환되어 가교 결합을 형성한다. 상기 반응에 의해, 상기 콜라겐은 디알데히드 전분과 이민 결합에 의해 상호 가교되며, 상기 콜라겐과 디알데히드 전분간 가교는 전술한 바와 같이 우수한 기계적 강도와 물성을 부여할 수 있다.

또한, 상기 헤파린은 콜라겐과 아마이드 결합에 의해 상호 연결되어 COL-DAS-HEP 복합체를 형성하며, 상기 헤파린과의 가교는 전술한 바와 같이 성장인자와의 결합을 향상시키는데 기여할 수 있다.

한편, 겔을 형성시키는 단계 전 또는 그 이후, 손상된 골 조직의 형태에 맞추어 골 조직을 성형하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일례로서, 상기 혼합 용액 또는 겔을 압출기가 연결된 실린지에 주입한 후, 3차원 쾌속 조형법에 기초하여 압출기에 압력을 가하는 방식으로 성형체를 제조할 수 있으며, 이때, 압출기는 피스톤 또는 스크류 방식을 사용하여 재료에 압력을 가해 압출시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 일례로서, 당업계에 알려진 공지의 3차원 프린팅 방법을 사용하여 성형체를 제조할 수 있다. 이때, 3차원 프린터의 노즐, 방사 형태 등의 세부 조건들은 손상된 골 부위의 형태 및 면적 등에 따라 적의 변경 가능하다.

이후, 상기 방법은 상기 형성된 겔을 동결 건조하는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 동결 건조하는 단계는 상기 형성된 겔에 글리세롤을 첨가한 후, 동결 건조하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 동결 건조하는 단계에서 글리세롤의 첨가 또는 사용은 골 이식 수술에 적합한 상태의 물리적 특성, 예를 들어, 봉합 가능성과 같은 물성을 골 이식재에 부여할 수 있다. 또한, 상기 단계는 형성된 겔을 -70 내지 -90℃에서 동결하고 2일 내지 5일간 건조하여 실시할 수 있으나, 이는 적의 변경 가능하다.

다른 양상은 상기 방법에 의한 제조된 다공성 골 이식재를 제공한다.

하기 다공성 골 이식재에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 제조하는 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 상기한 바와 같다.

일 실시예에 따르면, 상기 골 이식재는 디알데히드 전분 및 콜라겐을 특정 범위의 농도로 포함함으로써, 골 조직 구조와 유사한 수준의 강도 및 다공성을 모사할 수 있었으며, 용액 형태의 헤파린을 혼합시킴으로써 성장 인자와의 접착력이 유의적으로 향상되었다. 또한, 동결 건조 과정에서 글리세롤의 첨가는 골 이식 수술에 적합한 상태의 골 이식재를 제공할 수 있도록 하였다. 따라서, 상기 골 이식재는 손상된 골조직의 대체제로서 유용하게 활용될 수 있다.

상기 골 이식재는 다공성 구조를 포함함으로써, 세포가 부착하고 증식할 수 있는 공간을 제공하며, 영양분과 대사 폐기물의 흐름을 원활하게 하고, 세포 접착에 적합한 표면 화학 특성과 세포 성장에 충분한 표면적을 가질 수 있도록 한다.

일 구체예에 있어서, 상기 골 이식재는 4 내지 8% (w/v)의 콜라겐, 0.05 내지 0.15% (w/v)의 헤파린, 및 1 내지 2% (w/v)의 디알데히드 전분을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 골 이식재는 헤파린이 균질하게 분포되어 있는 것일 수 있다. 상기 헤파린의 균질한 분포는 성장 인자와 골 이식재간 결합을 증진시켜, 골유착성 및 골전도성 등을 향상시키는데 기여할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 골 이식재는 전술한 성장 인자를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 골 이식재의 성형성을 증가시키기 위한 다양한 재료가 더 첨가될 수 있다. 즉, 생체적합성이 뛰어난 선형의 소재, 튜브형의 소재, 입자형의 소재 및 부정형의 소재 등이 더 첨가되어 상기 골 재생용 지지체의 물리적 특성을 향상시킬 수 있다. 이러한 형태의 소재들은 카르복시메틸셀룰로오스(CMC, carboxymethylcellulose) 또는 동물 유래 젤라틴 등의 소재로부터 선택될 수 있으며, 이식 대상에 면역반응을 유발하지 않는다면, 비제한적으로 적용될 수 있다.

일 양상에 따른 다공성 골 이식재를 제조하는 방법에 따르면, 특정 함량을 갖는 디알데히드 전분 용액 및 콜라겐 용액을 사용함으로써, 우수한 생체 적합성 및 강도를 갖는 다공성 골 이식재를 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 실온 조건에서 짧은 시간 내에 대량 생산이 가능하다는 장점이 있다.

일 양상에 따른 다공성 골 이식재에 따르면, 골 이식재로서의 기계적 물성, 즉 우수한 강도 및 다공성과 함께, 성장인자와의 우수한 결합력을 지니므로, 효과적으로 손상된 골 조직을 대체할 수 있다.

도 1은 일 실시예에 따른 다공성 골 이식재의 제조 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 다공성 골 이식재의 제조 과정에서, 성형 및 압출하는 과정을 예시적으로 나타낸 도이다.
도 3은 일 실시예에 따른 다공 성 골 이식재에서, 디알데히드 전분의 농도에 따른 골 이식재의 강도 변화를 육안으로 확인한 것으로, 도 3의 A는 6%Col-10%DAS 및 6%Col-20%DAS 골 이식재를 관찰한 결과이며, 도 3의 B는 8%Col-10%DAS 및 8%Col-20%DAS 골 이식재를 관찰한 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 다공성 골 이식재에서, 디알데히드 전분의 농도에 따른 골 이식재의 다공성 변화를 육안 및 현미경을 통하여 확인한 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 다공성 골 이식재에서, 재구성 용액 내 수산화나트륨의 농도에 따른 골 이식재의 물리적 특성 변화를 확인한 것으로서, 도 5의 A는 골 이식재의 강도를 비교한 결과이며, 도 5의 B는 가교 반응 시간을 비교한 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 다공성 골 이식재에서, 골 이식재에 분포하는 헤파린을 톨루엔 블루 염색을 통해 확인한 것으로, 도 6의 A는 헤파린 파우더를 사용하여 제조된 골 이식재 내 헤파린 분포를 확인한 결과이고, 도 6의 B는 헤파린 용액을 사용하여 제조된 골 이식재 내 헤파린 분포를 확인한 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 다공성 골 이식재의 제조 과정에서, 글리세롤에 침지 또는 전 처리없이 동결 건조한 경우, 상기의 처리 공정이 골 이식재에 대한 봉합에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 8은 성장인자의 첨가에 따른 세포의 프로테오글라이칸 생성능 변화를 확인한 결과이다.
도 9는 일 실시예에 따른 다공성 골 이식재에서, 성장인자의 첨가에 따른 세포의 이동성 변화를 확인한 것으로, 도 9의 A는 본 실험에 대한 개략적인 모식도를 나타낸 것이고, 도 9의 B는 DAS-COL-HEP 및 PDGF-BB를 포함하는 골 이식재가 위치하는 영역을 현미경으로 관찰한 결과이며, 도 9의 C는 DAS-COL-HEP을 포함하는 골 이식재가 위치하는 영역을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 10은 일 실시예에 따른 다공성 골 이식재에서, 성장인자의 첨가에 따른 효능 향상을 확인한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 다공성 골 이식재의 제조

1-1. 실험 재료

디알데히드 전분(C₉H₁₆O₄, 분자량: 188.223g/mol, DAS)은 MONOMER-POLYMER AND DAJAC LABS(미국)으로부터 입수하였고, 제1형 또는 제2형 콜라겐(COL), 헤파린 나트륨 염(H3129, HEP), 및 아세트산은 시그마-알드리치로부터 입수하였다. 10× DPBS(10×Dulbecco's Phosphate-Buffered Salines)는 써모피셔사이언티픽으로부터 입수하였고, 페놀 레드 용액, 탄산수소나트륨(NaHCO₃), HEPES 나트륨 염(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid sodium salt), 및 수산화 나트륨은 시그마-알드리치로부터 입수하였다.

1-2. 실험 준비

DAS를 10×DPBS에 용해시켜 20%(w/v) DAS 용액을 제조하였으며, 상기 용해 과정은 90℃조건의 가열 블록 상에서 500-700rpm 조건의 교반과 함께 진행하였다.

8%(w/v)의 콜라겐을 1mM의 아세트산 용액에 첨가하여, 8%(w/v) COL 용액을 제조하였으며, 상기 용해 과정은 700rpm 조건의 교반과 함께 진행하였다. 예시적으로, 3ml의 COL 용액을 제조하기 위하여, 240mg의 콜라겐 파우더를 1mM의 아세트산 용액 (2.7ml)에 첨가하였다.

0.1%(w/v)의 헤파린 나트륨 염을 10ХDPBS에 용해시켜 HEP 용액을 제조하였다. 예시적으로, 3mg의 헤파린 파우더가 375ul의 10×DPBS에 용해되었다.

2.2% (w/v)의 탄산수소나트륨 및 200mM의 HEPES를 0.75N의 수산화 나트륨 용액에 용해시켜 pH 중화를 위한 재구성 용액을 제조하였다. 예시적으로, 300ml의 재구성 용액을 제조하기 위하여, 6.6g의 탄산수소나트륨 및 15.9mg의 HEPES을 0.75N의 수산화 나트륨 용액에 용해시켰다.

0.5% 페놀 레드를 10×DPBS에 첨가하여, pH의 변화 측정을 위한 페놀 레드 용액을 제조하였다.

1-3. 다공성 골 이식재의 제조

일 실시예에 따른 다공성 골 이식재의 제조 과정은 도 1에 나타낸 바와 같다. 우선, 0.3ml의 20%(w/v) DAS 용액과 2.7ml의 8% COL 용액을 1:9의 부피 비율로 혼합하여, 3ml의 DAS-COL 혼합 용액을 제조하였다. 이후, 상기 DAS-COL 혼합 용액에 HEP 용액을 첨가하여, DAS-COL-HEP 혼합 용액을 제조하였다. 이후, 상기 DAS-COL-HEP 혼합 용액을 실린지에 충진한(filling) 뒤, 커넥터를 사용하여 상기 충진된 실린지에 빈 실린지를 연결하였으며, 피스톨을 사용하여 실린지 내에 존재하는 DAS-COL-HEP 혼합 용액을 수 차례 혼합하였다. 여기에 12.5% (v/v), 즉 0.375ml의 재구성 용액을 첨가하고 상기와 동일한 방법으로 혼합하여, DAS-COL-HEP 혼합 용액을 중화하였다. 이후, 상기 중화된 혼합 용액을 성형된 금형에 주입하고, 약 37 ℃에서 약 1 내지 30분간 겔화를 진행한 뒤, 이를 압출하였다. 상기 압출된 겔을 글리세롤에 침지시킨 후, 이를 -80℃에서 동결하고 3일간 건조시킴으로써, 다공성 골 이식재를 제조하였다.

추가적으로, 일 실시예에 따른 골이식재와의 효능 비교를 위하여, 상기 제조 과정에서 1) DAS 및 콜라겐 용액의 농도, 2) 가교 시간, 3) 헤파린의 첨가 방식, 및 4) 글리세롤 첨가 유무에 대한 조건을 변형시켜, 비교 혼합 용액 또는 비교 골 이식재를 제조하였다. 한편, 6%(w/v) 콜라겐 용액을 사용하여 골 이식재를 제조한 경우, 상기 다공성 골 이식재는 4.8% (w/v)의 콜라겐, 0.08% (w/v)의 헤파린, 및 1.6% (w/v)의 디알데히드 전분을 포함하였다. 또한, 8%(w/v) 콜라겐 용액을 사용하여 골 이식재를 제조한 경우, 상기 다공성 골 이식재는 6.4% (w/v)의 콜라겐, 0.08% (w/v)의 헤파린, 및 1.6% (w/v)의 디알데히드 전분을 포함하였다.

실험예 1. 디알데히드 전분의 농도에 따른 골 이식재의 물리적 특성 변화

본 실험예에서는 디알데히드 전분의 농도에 따른 골 이식재의 물리적 특성 변화를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 6%(w/v) 또는 8%(w/v) 콜라겐 용액과 20%(w/v) 디알데히드 전분 용액을 혼합하여 제조한 일 실시예에 따른 골 이식재(6%Col-20%DAS, 및 8%Col-20%DAS)와 6%(w/v) 또는 8% 콜라겐 용액과 10%(w/v) 디알데히드 전분 용액을 혼합하여 제조한 골 이식재(6%Col-10%DAS, 및 8%Col-10%DAS)를 육안 및 현미경으로 관찰하여, 이들의 강도 및 다공성 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 10%(w/v) 디알데히드 전분 용액을 사용하여 제조된 골 이식재에 비해, 20%(w/v) 디알데히드 전분 용액을 사용한 경우, 골 이식재의 강도가 유의적으로 향상됨을 육안으로 확인하였다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 증가된 디알데히드 전분의 농도는 골 이식재 내부의 다공성 구조를 더욱 향상시킴을 알 수 있었다. 즉, 이러한 실험 결과는 디알데히드 전분의 농도를 증가시킴으로써, 손상된 부위에 삽입되어 구조를 지탱할 수 있는 우수한 기계적 강도를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 뼈의 생물학적 기능을 수행하는데 관여하는 망상 구조, 즉, 다공성 구조를 재현할 수 있음을 나타내는 것이다.

실험예 2. 재구성 용액의 농도에 따른 골 이식재의 물리적 특성 변화

본 실험예에서는 재구성 용액 내 수산화나트륨의 농도에 따른 골 이식재의 물리적 특성 변화를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 8%(w/v)의 콜라겐 용액을 사용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 DAS-COL-HEP 혼합 용액에, 각각 0.25N, 0.5N, 0.75N의 수산화나트륨을 포함하는 재구성 용액을 첨가함으로써, 겔화, 즉, 가교 반응을 유도하였다. 이후, 상기 겔화된 골 이식재의 강도 및 가교 반응 시간을 비교하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 0.75N(normality)의 수산화나트륨을 포함하는 재구성 용액을 첨가한 경우, 골 이식재의 강도가 현격하게 향상되었고, 이때, 가교 반응 시간은 약 3-4분 정도로서 매우 빠른 가교 반응이 진행됨을 알 수 있었다. 즉, 이러한 실험 결과는 재구성 용액 내 수산화나트륨의 농도가 증가될 수록 골 이식재의 강도를 향상시키고, 가교 반응 시간을 단축시킬 수 있음을 나타내는 것이다. 또한, 골 이식재의 제조에 적용 가능한 조건으로서, 재구성 용액 내 수산화나트륨 농도는 약 0.75N, 가교 반응시간은 3-4분임을 도출할 수 있었다.

실험예 3. 헤파린 용액의 혼합 및 글리세롤의 첨가에 따른 골 이식재의 물리적 특성 변화

3-1. 헤파린 용액과의 혼합에 따른 성장인자와의 접착력 변화

본 실험예에서는 가교 시간에 따른 골 이식재의 물리적 특성 변화를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 실시예 1에서 제조된 골 이식재를 대상으로 톨루엔 블루 염색을 실시하여, 상기 골 이식재에 분포해 있는 헤파린을 확인하였다. 비교군으로는 DAS-COL 혼합 용액에 헤파린 용액이 아닌, 헤파린 파우더를 첨가하여 제조된 골 이식재를 사용하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 헤파린 파우더를 사용하여 제조된 골 이식재에서는 헤파린이 불균질하게 분포하는 반면, 헤파린 용액을 사용하여 제조된 골 이식재에서는 헤파린이 균질하게 분포하고 있음을 확인하였다. 즉, 이러한 결과는 일 실시예에 따른 골 이식재는 헤파린이 골고루 분포하고 있어 내인성 성장인자와의 결합이 보다 용이할 것임을 나타내는 것이다.

3-2. 동결 건조 공정에서 글리세롤 첨가에 따른 물리적 특성 변화

본 실험예에서는 동결 건조 공정에서 글리세롤의 첨가가 골 이식재의 물리적 특성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1의 겔화 및 중화된 혼합 용액을 글리세롤에 침지시키거나, 별도의 전 처리없이 동결 건조한 후, 상기 골 이식재에 대하여 봉합을 실시하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 전 처리없이 동결건조한 골 이식재는 봉합 과정에서 그 구조를 유지할 수 없었던 반면, 글리세롤에 침지시킨 후 동결건조한 골 이식재는 봉합사가 적절하게 삽입되어 고정됨을 확인하였다. 즉, 이러한 실험결과는 동결 건조 과정에서 글리세롤의 사용은 골 이식 수술에 적합한 상태의 물리적 특성을 부여함을 나타내는 것이다.

실험예 4. 성장인자를 함유하는 골 이식재의 효능 평가

4-1. 성장인자의 첨가에 따른 세포의 활성 변화

DAS-COL-HEP 혼합 용액을 사용하여 제조된 골 이식재에 1×10⁷ 세포/ml의 세포를 담지시킨 후, 이를 50mg/ml의 TGF-beta3를 함유하는, ITS(Insulin-Transferrin-Sele)가 보충된 DMEM 배지에 21일간 배양하였다. 이후, 상기 골 이식재에 담지된 세포에 의해 생성된 프로테오글라이칸(proteoglycan)을 사프라닌-O 염색을 통해 관찰하였다.

그 결과, 도 8에 나타내 바와 같이, TGF-beta3를 함유하는 배지에서 배양된 골 이식재 내 세포는 대조군에 비해 보다 증진된 프로테오글라이칸의 생성을 보여주었고, 이는 세포의 성장이 보다 활발하였음을 의미한다. 즉, 이러한 실험 결과는 골 이식재에 성장인자를 추가 또는 함유시킴으로써, 이식 부위에 존재하는 세포의 성장 및 증식을 향상시킬 수 있음을 나타내는 것이다.

4-2. 성장인자에 의한 세포 이동성 변화

세포를 10cm dish에서 평판 배양하였으며, 배지에 존재하는 세포가 배지의 면적 대비 90% 이상이 되면, 배지의 중앙부에 존재하는 세포를 cell scratch tool로 제거하였다(scratched zone의 생성). 이후, 도 9의 A에 나타낸 바와 같이, 일 측에는 DAS-COL-HEP 및 PDGF-BB를 포함하는 골 이식재, 그 반대측에는 DAS-COL-HEP를 포함하는 골 이식재를 포함하는 슬라이드 글라스를 상기 scratched zone에 위치시켰다. 상기 슬라이드 글라스는 커버 슬립으로 덮어두어 평판 배지 내에서 이동되지 않도록 고정시켰다. 이로부터 3일 경과 후, 상기 scratched zone으로 이동한 세포의 수를 관찰하였다.

그 결과, 도 9의 B 및 C에 나타낸 바와 같이, DAS-COL-HEP 및 PDGF-BB를 포함하는 골 이식재가 위치하는 영역에서 현저하게 많은 수의 세포가 관찰되었다. 즉, 이러한 실험 결과는 골 이식재에 성장인자를 추가 또는 함유시킴으로써, 이식 부위 주변에 존재하는 세포의 이동성을 향상시킬 수 있음을 나타내는 것이다.

4-3. 성장인자를 함유하는 골 이식재의 효능 평가

실시예 1에서 제조된 골 이식재를 성장 인자(TGF-beta3)를 포함하는 PBS 용액에 담지시킨 후, 4℃ 조건에서 12시간 동안 방치하였다. 이러한 공정을 통하여, 상기 골 이식재의 표면에 존재하는 헤파린과 성장 인자를 결합시킴으로써, 성장인자를 함유하는 골 이식재, 즉 DAS-COL-HEP를 제조하였다. 이후, 소뼈에 직경 3mm 결손부를 만든 후, DAS-COL-HEP 및 50mg/ml의 TGF-beta3를 포함하는 골 이식재, 또는 DAS-COL-HEP를 포함하는 골 이식재를 상기 골 결손부에 충진하였다. 이로부터 3주 경과 후, 이식재가 충진된 영역 주변에 존재하는 세포에 의해 생성된 프로테오글라이칸을 사프라닌-O 염색을 통해 관찰하였다.

그 결과, 도 10에 나타내 바와 같이, TGF-beta3를 포함하는 골 이식재를 충진한 경우, 대조군에 비해 프로테오글라이칸의 생성이 보다 증진되었고, 이는 골 결손부의 복구가 보다 활발하게 이루어졌음을 나타내는 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

16 내지 25%(w/v) 농도의 디알데히드 전분(Dialdehyde starch: DAS) 용액, 6 내지 8%(w/v) 농도의 콜라겐(Collagen: COL) 용액, 및 헤파린(Heparin) 용액을 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계;
상기 혼합 용액에 0.5 내지 1N 농도의 염기성 용액을 첨가하여 겔을 형성시키는 단계; 및
상기 형성된 겔을 글리세롤에 침지시켜 동결 건조하는 단계를 포함하며,
상기 디알데히드 전분 용액 및 콜라겐 용액은 1:6 내지 1:12의 부피비로 혼합되는 것인, 다공성 골 이식재를 제조하는 방법.

청구항 1에 있어서, 상기 혼합하는 단계는, 상기 디알데히드 전분 용액과 상기 콜라겐 용액을 혼합하여 디알데히드 전분-콜라겐 혼합 용액을 제조하는 단계; 및
상기 제조된 디알데히드 전분-콜라겐 혼합 용액에 헤파린 용액을 첨가하여 혼합하는 단계를 포함하는 것인, 방법.

삭제

청구항 2에 있어서, 상기 헤파린 용액은 0.01 내지 1 %(w/v)의 헤파린 또는 이의 염을 포함하는 것인, 방법.

삭제

청구항 1에 있어서, 상기 염기성 용액은 0.5 내지 1N 농도의 수산화나트륨을 포함하는 것인, 방법.

청구항 1에 있어서, 상기 겔을 형성시키는 단계는 30 내지 37℃의 조건에서 1 내지 5분 동안 실시되는 것인, 방법.

청구항 1에 있어서, 상기 겔을 형성시키는 단계는 가교(Cross linking) 반응을 유도하는 것으로서, 상기 콜라겐은 디알데히드 전분과 이민 결합을 형성하고, 상기 헤파린은 콜라겐과 아마이드 결합을 형성하는 것인, 방법.

삭제

청구항 1에 있어서, 상기 다공성 골 이식재를 성장 인자가 포함된 용액에 담지시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

청구항 1의 방법에 의해 제조된 다공성 골 이식재.

삭제

청구항 12에 있어서, 상기 골 이식재는 헤파린이 균질하게 분포되어 있는 것인, 다공성 골 이식재.

청구항 12에 있어서, 상기 골 이식재는 성장 인자를 추가로 포함하는 것인, 다공성 골 이식재.