KR20040045478A - 인간 조직인자 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 응고 인자 VIIa(FVIIa)의 결합을 저해하기 위해서 인간 조직인자 (TF)와 면역반응하는 분리된 완전한 인간 항체에 관한 것이다.
Description
혈액응고는 다양한 혈액 성분, 즉 인자들의 복잡한 상호작용으로 구성되는 과정이며 결국에는 피브린 응고체를 제공하게 된다. 일반적으로, 응고"연쇄"로 지칭되어온 과정에 참여하는 혈액 성분은 그 자체가 활성화된 응고인자인 활성화제의 작용에 의하여 단백질 분해 효소로 전환되는, 효소적으로 불활성인 단백질인 효소전구체 또는 효소원이다. 이같은 전환을 겪은 응고인자는 일반적으로 "활성인자"라고 지칭되고 소문자 "a"를 접미사로 첨가하여 표시된다 (예를 들어, 인자 VIIa).
활성화된 인자 X("Xa")는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환하는데에 필요하며, 그것은 피브린 응고체를 형성하는 마지막 단계에서 피브리노겐을 피브린으로 전환시킨다. 인자 X의 활성화를 촉진하는 두가지 시스템, 즉 경로가 있다. "내인적 경로"는 오직 혈장내에 존재하는 인자의 사용을 통하여만 트롬빈 형성을 수행하는 반응을 지칭한다. 일련의 프로테아제-매개 활성화는 궁극적으로 인자 VIIIa와 결합하여 인자 X를 Xa로 절단하는 인자 IXa를 생성한다. 동일한 단백질분해가 FVIIa 및 그것의 보조인자인 TF에 의하여 혈액응고의 "외인적 경로"에서 초래된다. TF는 막결합단백질이며 정상적으로는 활성형태로 혈장에서 순환하지 않는다. 그러나, 혈관 파열 후에는 TF는 FVIIa와 복합체를 이루어 Ca2+및 인지질의 존재 하에서 인자 X 활성화 또는 인자 IX 활성화를 촉매한다. 지혈에 있어서 두가지 응고 경로의 상대적 중요성은 명확하지 않지만, 인자 VII 와 TF는 혈액응고의 개시에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.
환자에서 응고연쇄를 선택적으로 저지하는 것이 종종 필요하다. 예를 들어, 신장투석 동안 또는 심정맥혈전증, 파종혈관내응고(DIC) 및 다른 의학적 질환을 앓는 환자를 치료하기 위하여 헤파린, 코마린, 코마린의 유도체, 인단디온 유도체 같은 항응고제 또는 다른 약제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 처치 동안의 응고를 방지하기 위하여 투석에서 헤파린 치료 또는 시트레이트 이온으로의 체외 치료가 사용될 수 있다. 헤파린은 또한 수술 중인 환자의 심정맥혈전증을 방지하는데 사용될 수 있다.
그러나, 헤파린 및 다른 항응고제는 바람직하지 않은 부작용을 갖는다. 유효한 항응고제는 일반적으로 상처 부위에 특이하게 작용하기 보다는 전신적으로 작용한다. 예를 들어, 헤파린은 과다출혈을 유발할 수 있다. 게다가, 약 80 분의 반감기를 갖기 때문에 헤파린은 신속하게 혈액에서 제거되며, 빈번한 투여가 필요하다. 헤파린은 안티트롬빈 III (ATIII)에 대한 보조인자로서 작용하고 ATIII는 DIC 치료에서 신속하게 고갈되므로, 적정 헤파린 투여량을 유지하는 것이 종종 어렵고 ATIII 및 헤파린 농도의 연속적인 모니터링이 요구된다. ATIII 고갈이 극단적인 경우에 또한 헤파린은 효과가 없다. 게다가, 헤파린의 장기간 사용은 또한 혈소판 응고를 증가시키고 혈소판수를 감소시키며 헤파린-유도 저혈소판증의 발달에 관여되어왔다. 인단디온 유도체 또한 독성 부작용을 갖는다. 상기 약술한 항응고제 뿐 아니라, 몇몇의 천연 발생 단백질이 항응고 활성을 갖는 것이 밝혀져 왔다. 또한, ATIII는 치료적 항응고제로서 제안되어 왔다.
국제특허출원 WO 92/15686은 혈액응고를 저해하기 위한 불활성화된 인자 FVIIa에 관한 것이다.
항체는 외래 단백질, 당단백질, 세포, 또는 다른 항원성 외래 물질에 의한 외래 항원자극에 반응하여 척추동물 면역계에 의하여 생산되는 특이적 면역글로불린 (Ig) 폴리펩티드이다. 생체가 외래 세포에 의한 침입을 극복하거나 시스템으로부터 외래 물질을 제거하도록 하는 일련의 과정은 적어도 부분적으로는 이해되고 있다. 이 과정에서의 중요한 부분은 특정 외래 물질에 특이적으로 결합하는 항체의 제조이다. 이같은 폴리펩티드의 특정 항원에 대한 결합 특이성은 고도로 정제된 것이며 개개의 척추동물에 의하여 생성될 수 있는 특이성의 정도는 그 복잡성 및 다양성에 있어서 뛰어나다. 수백만 가지의 항원이 항체 반응을 유발할 수 있고, 각 항체는 그것을 유발한 특정 항원에만 거의 배타적으로 영향을 미친다.
현재 사용되는 척추동물 항체의 두 가지 주요 공급원은 포유동물 B 림프구에 의한 원위치 생성 및 B 세포 혼성체에 의한 세포배양에서의 생성이다. 항체는 특이적 항원에 의한 자극에 대한 반응으로서 미숙 B 림프구가 형질세포로 분화한 결과로서 원위치 생성된다. 미분화된 B 세포에서, 면역글로불린 사슬상의 다양한 영역에 대하여 코딩하는 DNA의 부분이 게놈 DNA에서 나누어진다. 서열은 발현 전에 순차적으로 조립된다. 결과의 재배열된 유전자는 성숙 B 림프구에서 발현되어 소망의 항체를 발현할 수 있게 된다. 그러나, 특정 포유동물이 단지 단일 항원에 대하여만 노출된 경우라도 균일한 항체 집단을 결과하는 것은 아니다. 어떤 특정 항원에 대한 원위치 면역 반응은 항원 상에 제공되는 다양한 결정인자에 대한 반응들의 모자이크에 의하여 정의된다. 동종 항체의 각 서브세트는 B세포의 단일 집단에 의하여 기여되므로 항체의 원위치 생성은 "폴리클론적" 이다.
이와 같은 제한적이지만 본질적인 이종성은, 하이브리도마 기술을 사용하여 B세포 하이브리도마에 의하여 세포배양에서 "단일클론" 항체를 생산함으로써 다수의 특정 경우에서 극복되어 왔다.
이 방법에서, 항원이 투여된 포유동물로부터의, 상대적으로 단기생존하는, 즉 사멸하는 비장세포 또는 림프구가 불사멸 종양세포주와 융합되고, 따라서 불사멸이면서 동시에 유전적으로 코딩된 B세포의 항체를 생산할 수 있는 혼성 세포 즉 "하이브리도마"가 생산된다. 이와 같이 형성된 혼성체는 선택, 희석, 및 재성장에 의하여 단일 유전적 종류로 분류되고, 각 종류들은 따라서 단일 유전계통을 나타낸다. 그러므로, 그것들은 소망의 항체에 대하여 동종인 것이 보장되는 항체를 생산한다. 이들 항체를 그것들의 순수한 유전적 태생을 가리켜 "단일클론"이라 지칭한다.
단일 특이성을 갖는 단일클론 항체는 면역학에 큰 영향을 끼쳐왔으며 그것의 유용성은 생물학, 약학, 생화학같은 과학 및 다른 학문에서 이미 증명되어왔다. 이같은 단일클론 항체는 진단시약 뿐 아니라 치료적으로도 폭넓은 사용이 발견되고 있다 (예를 들어 Ritz 및 Schlossman, Blood, 59:1-11, (1982)).
하이브리도마에 의하여 생산되는 단일클론 항체는, 전술한 바와 같이 이론적으로 유효하고 그 특이성 때문에 폴리클론 항체보다 바람직한 것은 분명하지만, 중요한 단점을 갖는다. 많은 응용에서, 인간에게 단일클론 항체가 사용되는 경우 인간아닌 동물에서 생산되는 단일클론 항체의 사용은 심하게 제한된다. 인간에서 반복되는 마우스 항체 같은 "외래" 항체의 주입은 유해한 과민 반응을 유발한다. 이같은 비인간 유래 단일클론 항체는 인간에게 주입될 때 항-비인간 항체 반응을 유발한다.
TF에 대한 마우스 Mabs의 사용은 미국 특허 제 6,001,978 호 및 제 5,223,427 호로부터 알려진다.
국제특허출원 WO 99/51743은 인간 TF에 대하여 유발된 인간/마우스 키메라 단일클론 항체에 관한 것이다.
유럽특허출원 제833911호는 인간 TF에 대한 CDR-이식 항체에 관한 것이다.
Presta L. 등, Thrombosis and Haemostasis, Vol. 85 (3) pp. 379-389(2001) 는 TF에 대한 인간화 항체에 관한 것이다.
당업계에서는 상대적으로 낮은 투여량으로 투여될 수 있고 전통적 항응고 조성물이 갖는 바람직하지 않은 부작용을 야기하지 않는 항응고 활성을 갖는 개선된 조성물에 대한 요구가 있다. 본 발명은 비인간 서열을 갖는 전통적 항체가 갖는 부작용을 가지지 않는 항응고제를 제공함으로써 이 요구를 만족시키며, 그것은 상처 부위에 특이적으로 작용하고 다른 관련된 이점을 더 제공한다.
더욱이, 본 발명은 패혈증, 염증, 동맥경화증, 재협착 및 암과 관련된 TF의 세포적 기능을 저해하는 화합물을 제공한다.
본 발명은 조직인자(TF)와 면역반응하여 응고인자 VIIa(FVIIa)의 결합을 저해하는 분리된 항체에 관한 것이고, 따라서 수술, 미세수술, 혈관조형술 또는 외상과 관련된 혈전형성을 저해하거나 심정맥혈전증, 파종혈관내응고(DIC), 심장동맥 질환, 패혈증, 염증, 동맥경화증, 또는 암과 같은 질환과 관련된 비정상적 지혈 상태에서의 TF의 혈전형성 및 다른 기능을 저해하기 위하여 TF에 대한 인간 항체를 사용하는 면역요법에 관한 것이다. 인간 단일클론 항체(Mabs)의 제조를 위한 세포주 뿐 아니라 항체의 제조를 위한 방법 또한 개시된다.
본원발명은 첨부된 도면을 참조하여 실시예에서 더욱 상세하게 기재된다.
도 1. TF 에 대한 인간 단일클론 고친화성 항체의 선택을 위해 실험된 스크리닝 검정의 개략도.
도 2. 실시예 1 에 기재된 스크리닝 검정 1-3의 상세화된 개략도.
도 3. 실시예 1 에 기재된 스크리닝 검정 4-7의 상세화된 개략도.
도 4. 실시예 1 에 기재된 스크리닝 검정 8-10의 상세화된 개략도.
도 5. 검정 번호 4에 의한 항체 스크리닝의 예. FFR-rFVIIa(채워진 원) 및 인간 항 TF 단일클론 항체 HuTF-31F2(채워지지 않은 원)에 의한 sTF/FVIIa 아미도용해 활성의 저해.
도 6. 검정 번호 5에 의한 항체 스크리닝의 예. FFR-rFVIIa(채워진 원) 및 인간 항-TF 단일클론 항체 HuTF-31F2(채워지지 않은 원)에 의한 인자 Xa 생성의 저해.
도 7. 검정 번호 7에 의한 항체 스크리닝의 예. FFR-rFVIIa(채워진 원) 및 인간 항-TF 단일클론 항체 HuTF-31F2(채워지지 않은 원)에 의한 인간 TF-유도 응고체의 저해.
도 8. 검정 번호 10에 의한 항체 스크리닝의 예. FVIIa 결합을 방해하는 항-TF 단일클론 항체만이 TF/FVIIa-매개 신호화를 저해한다.
도 9. 인간 항 TF Mab 는 p44/42 MAPK의 FVIIa 유도 인산화를 저해한다(검정 번호 10). TF 로 트랜스펙션된 BHK 세포를 2 시간동안 혈청을 제거하여 세포를 무활동성으로 한다. 항체 HuMab 30F5(500nM) 및 HuMab 31F2(500nM)를, FVIIa (15nM)를 첨가하기 15분전에 세포에 첨가하였다. 세포가 용균되어서 단백질이 SDS-PAGE 상에서 분리되고, 일렉트로블로팅에 의해서 니트로셀룰로스로 옮겨졌다. p44/42 MAPK 에 대하여 폴리클론 포스포-특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 제2의 항체는 허스래디쉬 퍼옥시다제에 콘쥬게이션된 항-래빗 IgG 였다. 냉각된 CCD-카메라를 사용하여 화학발광의 검출을 수행하였다. 디지탈화된 사진상에서의 밴드를 정량화하고 FVIIa 로 얻어진 밴드를 100%로 정하였다. 세포를, HuMab 30F5(500nM)과 함께 사전 인큐베이션하였을 때, 인산화 밴드내의 50% 감소가 관찰되었고, 세포를 HuMab 31F2(500nM)과 함께 사전 인큐베이션하였을 때, 25% 감소가 관찰되었다. 결과적으로, 이 실험은 TF(30F5 및 31F2)에 대한 인간 항체가 p44/42 MAPK 의 FVIIa 유도 인산화를 부분적으로 저해한다는 것을 보여준다. 유사한 결과를 50nM FVIIa 를 사용하여 얻었다.
도 10. 검정번호 16에 의한 항체 스크리닝의 예. 도면은 TF 에 대하여 단일클론 항체에 의한 TF 발현 세포에서 TF 세포내 활성의 저해를 나타낸다. 항-TF Mab B 는 TF 세포내 활성을 저해하는 반면에, 항-TF Mab A 는 TF 세포내 활성을 저해하지 않는다.
도 11. 검정번호 12에 의한 항체 스크리닝의 예. 0.5nM 의 FFR-rFVIIa 및 인간 항-TF 항체 HuTF-31F2 로 얻어진 트롬보엘라스토그람의 속도 프로파일.
본원 발명은 다음 실시예에 의해서 더욱 상술되며, 실시예는 발명의 보호 범위를 제한하는 것으로는 해석되지 않는다. 전술한 기술에서 개시된 특징 및 후술하는 실시예는 단독으로 그리고 그것의 어떤 조합으로 그것의 다양한 형태로서 본 발명을 구체화하는 자료가 될 것이다.
본 발명은 응고인자 VII/VIIa의 결합을 저해하는, 인간 TF에 대한 비면역적 고친화도 인간 항체 및 인간 TF에 대한 치료학적으로 유효한 인간 항체의 선택방법에 관한 것이다.
첫번째 양태에서, 본 발명은 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하는 분리된 인간항체에 관한 것이다.
용어 "인간 조직 인자" 또는 "인간 TF"는 여기에서 사용될 때, 천연 인간 조직인자의 아미노산 서열 1 내지 263을 포함하는 전장 폴리펩티드 리셉터를 지칭한다.
용어 "항체"는 여기에서 사용될 때, 항원 (예를 들어, 인간 TF)에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 면역 글로불린 분자 및 그것의 단편을 지칭하도록 의도된다. 전장 항체는 이황화 결합에 의하여 서로 연결된 두개의 중쇄 (H) 및 두개의경쇄 (L)인 네개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 각 중쇄는 하나의 (여기에서 HCVR 또는 VH로 축약표현된) 중쇄가변부 및 하나의 중쇄불변부를 포함한다. 중쇄 불변부는 세개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 하나의 (여기에서 LCVR 또는 VL로 축약표현된) 경쇄가변부 및 하나의 경쇄불변부를 포함한다. 경쇄불변부는 하나의 도메인 CL을 포함한다. VH 및 VL 부위는 골격부 (FR)라는 더 보존적인 부분에 간격을 두고 배치된 상보적 결정부 (CDR)라는 고도가변부로 더 세분화된다. 각 VH 및 VL은 세 개의 CDR과 네 개의 FR로 구성되며, 아미노말단으로부터 카르복시말단으로 하기의 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배치된다. 그러므로, 항체 (예를 들어, 인간 TF)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편 또한 항체의 정의 내에 있다. 항체의 항원결합 기능은 전장 항체의 단편에 의하여 수행될 수 있다는 것이 밝혀져 왔다. 용어 "항체" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 경첩부에서 이황화 다리에 의하여 연결된 두개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인 F(ab) 및 F(ab)'; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAB 단편 (Ward 등, (1989) Nature 341:544-546); (vi) 분리된 상보적 결정부 (CDR)를 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 두 개 도메인인 VL 및 VH은 별개의 유전자에 의하여 코딩되지만 그것은 재조합 기술을 사용하여 (단일사슬 Fv (scFv)로 알려진; 예를 들어 Bird 등, (1988) Science 242:423-426: 및 Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) VL 및 VH 짝이 일가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로서 제조되도록 할 수 있는 합성 링커에 의하여 연결될 수 있다. 이같은 단일사슬항체는 또한 용어 "항체" 내에 포괄되도록 의도될 수 있다. 디아바디(diabody)같은 단일사슬항체의 다른 형태 또한 포괄된다. 디아바디는 VH와 VL 도메인이 단일 폴리펩티드에서 발현되지만 동일한 사슬 상에서 두 도메인 사이를 짝짓기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써 도메인을 다른 사슬의 상보적 도메인과 짝짓도록 강제하여 두개의 항원 결합부를 생성하는 이가의 이특이적 항체이다 (예를 들어, Holliger, P. 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J. 등 (1994) Structure 2:1121-1123). 인간 TF는 (1) 인간 TF 내의 단일 펩티드 사슬로 구성되는 펩티드 항원결정인자; (2) 각자의 아미노산 서열이 인간 TF 폴리펩티드 서열을 따라 따로 떨어져 위치하는 하나 이상의 간헐적으로 근접하는 펩티드 사슬로 구성된 구조적 항원 결정인자; 및 (3) 탄수화물 같은, 번역 이후에 인간 TF에 공유적으로 부착된 분자구조 전체 또는 부분으로 구성된 번역후 항원결정인자를 포함하는 하나 이상의 항원결정인자를 갖는 것으로 이해되고 있다.
용어 "인간 항체", ":인간 항체들", "인간 TF 항체" 및 "인간 TF 항체들"은 여기에서 사용될 때, 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변부 및 불변부를 같은 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의하여 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 무작위 또는 부위특정 돌연변이 유발에 의하거나 생체내 체세포 돌연변이에 의하여 도입되는 돌연변이), 예를 들어 CDR 특히 CDR3에서의 서열을 포함한다. 그러나, 용어 "인간 항체"는 여기에서 사용될 때, 마우스 같은 다른 포유동물종의 생식계열로부터 유래한 CDR 서열이 인간 골격서열에 이식된 항체, 예를 들어 소위 인간화 항체 또는 인간/마우스 키메라 항체를 포함하려는 의도는 아니다.
"분리된 인간 항체"는 여기에서 사용될 때, 상이한 항원특이성을 같는 다른 항체가 실질적으로 없는 인간 항체를 지칭하려는 의도이다 (예를 들어, 인간 TF에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 인간 TF외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없는 것이다). 그러나, 인간 TF에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종으로부터 유래한 TF 분자와 같은 다른 항원과 교차반응성을 갖는다 (아래에서 더 논의함). 더욱이, 분리된 항체는 다른 물질 및/또는 화합물이 실질적으로 없다.
용어 "에피토프"는 여기에서 사용될 때, 항체가 결합하는 항원 상의 어떤 항원결정인자를 의미한다. 에피토프결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 당의 곁사슬 같은 화학적으로 활성인 표면 배치로 구성되고, 일반적으로 특이적 삼차원적 구조적 특성 및 특이적 전하 특성을 갖는다.
용어 "면역반응하다" 또는 "면역반응하는"은 여기에서 사용될 때, 10-4보다 낮은 해리상수 Kd로 그것의 에피토프에 결합하는 항체를 의미한다. "면역반응하다" 또는 "면역반응하는"은 용어 "특이적으로 결합하다"와 적당한 경우 호환적으로 사용된다.
용어 "저해하다"는 여기에서 사용될 때, 대조군에 비하여 감소하는 것을 의미한다. 예를 들어, 인간 응고인자 VIIa의 인간 TF에 대한 결합을 저해하는 항체라는 것은 그 항체의 부존재시에 인간 응고인자 VIIa의 인간 TF에 대한 결합 능력과 비교하여 인간 응고인자 VIIa의 인간 TF에 대한 결합 능력을 감소시키는 어떤 항체를 의미한다.
용어 "친화도"는 여기에서 사용될 때, 항체의 에피토프에 대한 결합의 세기를 의미한다. 항체의 친화도는 [Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]로 정의되는 해리상수 Kd에 의하여 측정되는데 여기에서 [Ab-Ag]는 항원항체 복합체의 몰농도, [Ab]는 비결합 항체의 몰농도이며 [Ag]는 비결합 항원의 몰농도이다. 친화도 상수 Ka는 1/Kd로 정의된다. 경쟁적 저해에 의한 Mab 특이성 및 친화도를 결정하기 위한 바람직한 방법은 여기에 참고문헌으로 전체가 수록된, Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988), Colligan 등, eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), 및 Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)에서 찾을 수 있다.
두번째 양태에서, 본 발명은 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하는 치료학적 유효량의 인간항체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
용어 "치료학적 유효량"은 소망의 반응을 얻기 위한 투여량을 적정하는 자격있는 의사에 의하여 결정되는 유효한 투여량이다. 투여량 결정에서 고려되는 인자는 효능, 생물학적이용가능성, 소망의 약물생체반응학적 프로파일, 치료의 상태 (예를 들어, 외상, 염증, 패혈 쇼크), 환자관련 요인 (예를 들어, 체중, 건강, 나이 등), 투여보조의약의 존재, 투여시기 또는 의사에게 알려진 다른 인자를 포함할 것이다. 환자에게 투여되는 TF에 대한 인간 항체의 투여량은 치료될 상태의 종류 및 심한 정도에 따라 다양할 것이지만, 일반적으로 0.1-5.0 mg/kg체중 범위이다.
"피험체"는 여기에서 사용될 때, 어떤 동물 특히 인간 같은 포유동물을 의미하려는 의도이고 적당한 경우에는 "환자"와 호환적으로 사용된다.
세번째 양태에서, 본 발명은 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하는 인간 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
더 나아간 양태에서, 본 발명은 FVIIa/TF 관련 질환의 치료를 위한 방법에 관한 것이며, 이 방법은 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하는 인간 항체의 치료학적 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.
"치료"는 어떤 증상이나 질환상태가 진행하는 것을 방지하려는 목적으로 또는 이미 진행된 그같은 증상이나 질환상태를 치료하거나 완화하려는 목적으로 치료학적으로 활성인 본 발명의 화합물을 유효량으로 투여하는 것을 의미한다. 용어 "치료"는 그러므로 예방적 치료를 포함하도록 의도된다.
용어 "FVIIa/TF 관련 질환"은 여기에서 사용될 때, TF 및 FVIIa가 관련된 질환 또는 장애를 의미한다. 심정맥혈전증, 동맥혈전증, 수술후 혈전증, 심장동맥 우회로 조성술(CABG), 경피 피부통과 심장 혈관조형술(PTCA), 뇌중풍, 종양성장, 종양 전이, 혈관형성, 혈전용해, 동맥경화증 및 혈관조형술 후의 재협착, 염증, 패혈 쇼크, 패혈균증, 저혈압, 성인 호흡곤란증후군(ARDS), 파종혈관내응고(DIC), 허파색전증, 혈소판 침착, 심근경색증, 또는 혈전증의 위험이 있는 동맥경화 혈관을 갖는 포유동물의 예방적 치료 및 다른 질환 또는 이상 같은, 염증 반응 및 만성 혈전색전증 또는 혈관 장애를 포함하는 피브린 형성에 관련된 이상을 포함하는 혈전증 또는 응고병 관련 질환 또는 장애가 포함된다. FVIIa/TF 관련 질환은 상기 열거한 생체내 응고병적 질환에 국한되지 않고, 투석 과정, 수술중의 혈여과 또는 혈액 조형술 같은 방법에서 환자로부터 직렬 제거된 혈액을 포함하는 혈액의 체외 순환으로부터 결과할 수 있는 응고 같은 생체외 FVIIa/TF 관련 과정을 포함한다.
용어 "인자 VIIa", 또는 "FVIIa"는 Arg 152-Ile153 펩티드 결합에서의 특이적 절단에 의하여 절단되는 "두개의 사슬" 활성화 응고 인자 VII를 의미한다. FVIIa는 혈액으로부터 정제되거나 재조합 방법에 의하여 생산된다. 여기에 기재된 방법의 실시는 정제된 인자 FVIIa가 무슨 방법으로 유래하는지에 독립적이며, 따라서 본 발명은 여기에 사용되기에 적당한 어떤 인자 FVIIa 제재의 사용도 포괄하는 것으로 고려됨이 명백하다. 인간 FVIIa가 바람직하다.
용어 "FVII"는 "단일 사슬" 응고 인자 VII를 의미한다.
더 나아간 양태에서, 본 발명은:
a) 인간 TF에 대한 인간 항체를 제조하는 단계; 및
b) TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 500 pM 미만 같이 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는 200 pM 보다 낮은, 50 pM 미만 같이 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 5 pM 보다 낮은 IC50값으로응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는
FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 10 nM 미만 같이 (0.1 nM 농도의 FVIIa를 사용한 검정에서) 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 0.1 nM 보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는
FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 40 nM 미만 같이 (10 nM 농도의 FVIIa를 사용한 검정에서) 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 20 nM 보다 낮은, 바람직하게는 10 nM 보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는
FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험한 후 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하거나, 또는
TF를 포함하는 TF ELISA 검정에서 항체를 시험한 후 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함하는 인간 항체 제조방법에 관한 것이다.
TF-유도 응고체 검정에서 인용되는 특이적 IC50값은 정상 인간 혈장을 사용한 때의 것으로 이해되어야 한다.
더 나아간 양태에서 본 발명은:
a) 인간 TF에 대한 인간항체를 제조하는 단계; 및
b) TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 500 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는FFR-rFVIIa의 IC50값 + 200 pM 보다 낮은, FFR-rFVIIa의 IC50값 + 50 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는
FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 미만 같이 (0.1 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 0.1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는
FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 40 nM 미만 같이 (검정에서 10 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 20 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를선택하거나, 또는
FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험한 후 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하거나, 또는
TF를 포함하는 TF ELISA 검정에서 항체를 시험한 후 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함하는 인간 항체 제조방법에 관한 것이다.
TF-유도 응고체 검정에서 인용되는 특이적 IC50값은 정상 인간 혈장을 사용한 때의 것으로 이해되어야 한다.
용어 "TF-유도 응고체 검정"은 여기에서 사용될 때 응집시간이 혈장 및 TF를 포함하는 샘플에서 측정되는 어떤 검정을 의미하는 것으로 의도된다. TF-유도 응고체 검정의 한 예는 실시예 1, 검정 7에 기재된다.
용어 "FXa 생성 검정"은 여기에서 사용될 때, TF, FVIIa, FX, 칼슘 및 인지질을 포함하는 샘플에서 FX의 활성화가 측정되는 어떤 검정을 의미하는 것으로 의도된다. FXa 생성 검정의 한 예는 실시예 1, 검정 5에 기재된다.
용어 "FVIIa/TF 아미도용해 검정"은 여기에서 사용될 때, TF 존재 하에서 FVIIa의 아미도용해 활성 (즉, 작은 펩티드 기질의 절단)이 측정되는 어떤 검정을 의미하는 것으로 의도된다. FVIIa/TF 아미도용해 검정의 한 예는 실시예 1, 검정 4에 기재된다.
용어 "TF ELISA 검정"은 여기에서 사용될 때, TF 및 TF에 대한 항체를 포함하는 어떤 ELISA 검정을 의미하는 것으로 의도된다. TF ELISA 검정의 한 예는 실시예 1, 검정 1 및 2 에 기재되는 직접 및 간접 TF ELISA 검정이다.
용어 "직접 TF ELISA 검정"은 여기에서 사용될 때 고정화된 TF를 포함하는 어떤 TF ELISA 검정을 의미하는 것으로 의도된다. 직접 TF ELISA 검정의 예는 실시예 1, 검정 1에 기재된다.
용어 "간접 TF ELISA 검정"은 여기에서 사용될 때 TF가 용액에 있는 어떤 TF ELISA 검정을 의미하는 것으로 의도된다. 직접 TF ELISA 검정의 예는 실시예 1, 검정 2에 기재된다.
더 나아간 양태에서, 본 발명은:
a) 인간 TF에 대한 인간 항체를 제조하는 단계; 및
b) TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 500 pM 미만 같이 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는 200 pM 보다 낮은, 50 pM 미만 같이 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 5 pM 보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는
FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 10 nM 미만 같이 (0.1 nM 농도의 FVIIa를 사용한 검정에서) 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 0.1 nM 보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는
FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 40 nM 미만 같이 (10 nM 농도의 FVIIa를 사용한 검정에서) 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 20nM 보다 낮은, 바람직하게는 10 nM 보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는
FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험한 후 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하거나, 또는
TF를 포함하는 TF ELISA 검정에서 항체를 시험한 후 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어질 수 있는, 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하여 인간 TF에 대한 인간 응고인자 VIIa의 결합을 저해하는 인간 항체에 관한 것이다.
TF-유도 응고체 검정에서 인용되는 특이적 IC50값은 정상 인간 혈장을 사용한 때의 것으로 이해되어야 한다.
더 나아간 양태에서, 본 발명은:
a) 인간 TF에 대한 인간 항체를 제조하는 단계; 및
b) TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 500 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 200 pM 보다 낮은, FFR-rFVIIa의 IC50값 + 50 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는
FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 미만 같이 (0.1 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 0.1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는
FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 40 nM 미만 같이 (검정에서 10 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 20 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는
FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험한 후 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하거나, 또는
TF를 포함하는 TF ELISA 검정에서 항체를 시험한 후 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어질 수 있는, 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하여 인간 TF에 대한 인간 응고인자 VIIa의 결합을 저해하는 인간 항체에 관한 것이다.
TF-유도 응고체 검정에서 인용되는 특이적 IC50값은 정상 인간 혈장을 사용한 때의 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 한 구체예에서, 인간 TF에 대한 인간 항체는 포유동물을 인간 TF로 면역화하는 단계 및 면역화된 포유동물에 의하여 생산된 항체를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 생산된다. 바람직한 구체예에서, 포유동물은 마우스이다. 면역화된 포유동물 또는 마우스는 인간 항체를 생산할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
더 나아간 양태에서, 본 발명은:
a) 인간 TF로 마우스를 면역화하는 단계.
b) 면역화된 마우스로부터 항체생산세포를 분리하고 불사세포를 만들어 인간 항체를 분비하도록 하는 단계,
c) 생산된 항체를 포함하는 불사세포로부터 배양배지를 분리하는 단계,
d) 용액에 TF를 포함하는 간접 TF ELISA 검정에서 항체를 시험하고 용액에서 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계,
e) FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험하고 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하는 단계,
f) FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 40 nM 미만같이 (10 nM 농도의 FVIIa를 사용한 검정에서) 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 20 nM 보다 낮은, 바람직하게는 10 nM 보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,
g) FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 10 nM 미만 같이 (0.1 nM 농도의 FVIIa를 사용한 검정에서) 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 0.1 nM 보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,
h) TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 500 pM 미만 같이 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는 200 pM 보다 낮은, 50 pM 미만 같이 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 5 pM 보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,
i) 선택한 후, 단계 d 내지 h에 따라 선택된 항체를 생산하는 불사세포의 적당한 배양배지에서 배양하는 단계, 및
j) 선택된 불사세포의 배양배지로부터 선택된 항체를 분리하는 단계를 포함하는 인간 항체의 제조방법에 관한 것이다.
TF-유도 응고체 검정에서 인용되는 특이적 IC50값은 정상 인간 혈장을 사용한 때의 것으로 이해되어야 한다.
더 나아간 양태에서, 본 발명은:
a) 인간 TF로 마우스를 면역화하는 단계.
b) 면역화된 마우스로부터 항체생산세포를 분리하고 불사세포를 만들어 인간 항체를 분비하도록 하는 단계,
c) 생산된 항체를 포함하는 불사세포로부터 배양배지를 분리하는 단계,
d) 용액에 TF를 포함하는 간접 TF ELISA 검정에서 항체를 시험하고 용액에서 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계,
e) FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험하고 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하는 단계,
f) FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 40 nM 미만 같이 (검정에서 10 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 20 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,
g) FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 미만 같이 (0.1 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 0.1nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,
h) TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 500 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 200 pM 보다 낮은, FFR-rFVIIa의 IC50값 + 50 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,
i) 선택한 후, 단계 d 내지 h에 따라 선택된 항체를 생산하는 불사세포의 적당한 배양배지에서 배양하는 단계, 및
j) 선택된 불사세포의 배양배지로부터 선택된 항체를 분리하는 단계를 포함하는 인간 항체의 제조방법에 관한 것이다.
TF-유도 응고체 검정에서 인용되는 특이적 IC50값은 정상 인간 혈장을 사용한 때의 것으로 이해되어야 한다.
용어 "항체생산 세포"는 여기에서 사용될 때, 항체를 생산할 수 있는 어떤 세포를 의미한다. 항원이 주입된 포유동물로 부터의 하이브리도마, 트렌스펙션된 세포주 및 상대적으로 단기생존하는, 즉 사멸성의 비장세포 또는 림프구를 포함한다.
더 나아간 양태에서 본 발명은:
a) 인간 TF로 마우스를 면역화하는 단계.
b) 면역화된 마우스로부터 항체생산세포를 분리하고 불사세포를 만들어 인간 항체를 분비하도록 하는 단계,
c) 생산된 항체를 포함하는 불사세포로부터 배양배지를 분리하는 단계,
d) 용액에 TF를 포함하는 간접 TF ELISA 검정에서 항체를 시험하고 용액에서 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계,
e) FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험하고 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하는 단계,
f) FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 40 nM 미만 같이 (10 nM 농도의 FVIIa를 사용한 검정에서) 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 20 nM 보다 낮은, 더욱 바람직하게는 10 nM 보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,
g) FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 10 nM 미만 같이 (0.1 nM 농도의 FVIIa를 사용한 검정에서) 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 0.1 nM 보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,
h) TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 500 pM 미만 같이 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는 200 pM 보다 낮은, 50 pM 미만 같이 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 5 pM 보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,
i) 선택한 후, 단계 d 내지 h에 따라 선택된 항체를 생산하는 불사세포의 적당한 배양배지에서 배양하는 단계, 및
j) 선택된 불사세포의 배양배지로부터 선택된 항체를 분리하는 단계를 포함하는방법에 의하여 얻어질 수 있는, 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하며 인간 TF에 대한 인간 응고인자 VIIa의 결합을 저해하는 인간 항체에 관한 것이다.
TF-유도 응고체 검정에서 인용되는 특이적 IC50값은 정상 인간 혈장을 사용한 때의 것으로 이해되어야 한다.
더 나아간 양태에서, 본 발명은:
a) 인간 TF로 마우스를 면역화하는 단계.
b) 면역화된 마우스로부터 항체생산세포를 분리하고 불사세포를 만들어 인간 항체를 분비하도록 하는 단계,
c) 생산된 항체를 포함하는 불사세포로부터 배양배지를 분리하는 단계,
d) 용액에 TF를 포함하는 간접 TF ELISA 검정에서 항체를 시험하고 용액에서 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계,
e) FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험하고 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하는 단계,
f) FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 40 nM 미만 같이 (검정에서 10 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 20 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,
g) FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 미만 같이 (0.1 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 0.1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,
h) TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 500 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 200 pM 보다 낮은, FFR-rFVIIa의 IC50값 + 50 pM 미만 같이FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,
i) 선택한 후, 단계 d 내지 h에 따라 선택된 항체를 생산하는 불사세포의 적당한 배양배지에서 배양하는 단계, 및
j) 선택된 불사세포의 배양배지로부터 선택된 항체를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어질 수 있는, 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하며 인간 TF에 대한 인간 응고인자 VIIa의 결합을 저해하는 인간 항체에 관한 것이다.
TF-유도 응고체 검정에서 인용되는 특이적 IC50값은 정상 인간 혈장을 사용한 때의 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 한 구체예에서 불사세포는 하이브리도마 세포이다.
더 나아간 양태에서, 본 발명은 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하며 인간 TF에 대한 인간 응고인자 VIIa의 결합을 저해하는 인간 항체를 생산하는 세포에 관한 것이다.
한 구체예에서 세포는 분리된 림포이드 세포이다.
더 나아간 구체예에서 세포는 마우스로부터 분리된다.
더 나아간 구체예에서 세포는 하이브리도마 세포이다. 한 구체예에서 하이브리도마 세포는 항체생산 림포이드 세포를 불사세포와 융합시켜 항체생산 하이브리도마 세포를 제공하도록 함으로써 얻어진다.
본 발명의 더 나아간 구체예에서 분리된 인간 항체는 인간 TF에 대한 인간 응고인자 VIIa의 결합을 저해한다.
본 발명의 더 나아간 구체예에서 분리된 인간항체는 단일클론 항체이다.
용어 "단일클론 항체"는 여기에서 사용될 때, 면역글로불린의 동종 집단 (즉, 항체 집단의 개별 분자는 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단)을 가리킨다. 항체는 정상적으로 골수의 B림프구로부터 유래한 림포이드 세포에 의하여 합성된다. 동일한 클론으로부터 유래한 림프구는 단일한 아미노산 서열의 면역글로불린을 생산한다. 림프구는 유의량의 특이적 항체를 생산하기 위하여 장기간 동안 직접배양될 수 없다.
그러나, Kohler 등, 1975, Nature, 256:495 는 체세포 융합 과정, 특히 림프구와 골수종 세포간의 체세포 융합 과정으로, 배양액에서 증식하고 "단일클론 항체"로 지칭되는 특이성 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 생산될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 골수종 세포는 "비-생산성" 세포로 알려져 있지만, 세포 종류에 따라서는, 종종 항체 그 자체를 생산하는 림프구 종양 세포이다.
본원발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 재조합 항체이다.
여기에서 사용될 때, 용어 "재조합 항체"는 숙주 세포로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체(하기의 단락 III 에서 상세히 기술), 재조합, 조합성 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체(하기의 단락 III 에서 상세히기술), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 (예를 들어, 마우스와 같은)동물로부터 분리된 항체(예를 들어, Taylor, L.D. 등(1992) Nucl.Acids Res. 20:6287-6295)와 같은 재조합 수단에 의해서 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 인간 항체, 또는 다른 DNA 서열과 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 어떤 다른 수단에 의해서 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변부 및 불변부를 보유한다. 그러나, 어떤 구체예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 생체외 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대하여 동물 트랜스제닉이 사용될 때, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 놓일 수 있고 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 와 VL 서열로부터 유래되고 이들과 관계되지만, 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리내에 본래 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 Fab 단편이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 F(ab)2단편이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 F(ab')2단편이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 단일 사슬 Fv 단편이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 10-15-10-8M 범위내의, 인간 TF 에 결합하기 위한 Kd를 가진다. 지칭된 인간 TF 에 대한 인간 항체의 결합Kd는, 인간 항체가 고정되어 있는 검정에서 결정된 바와 같다(검정 6 참조).
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 10-15-10-10M 범위내의, 인간 TF 에 결합하기 위한 Kd를 가진다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 10-8M 보다 낮은 인간 TF 에 대한 결합 Kd를 가진다. 본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 10-9M 보다 낮은 인간 TF 에 대한 결합 Kd를 가진다. 본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 10-10M 보다 낮은 인간 TF 에 대한 결합 Kd를 가진다. 본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 10-11M 보다 낮은 인간 TF 에 대한 결합 Kd를 가진다. 본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 10-12M 보다 낮은 인간 TF 에 대한 결합 Kd를 가진다. 본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 10-13M 보다 낮은 인간 TF 에 대한 결합 Kd를 가진다. 본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 10-14M 보다 낮은 인간 TF 에 대한 결합 Kd를 가진다. 본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 10-15M 보다 낮은 인간 TF 에 대한 결합 Kd를 가진다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 1nM 보다 낮은 IC50값으로 응고 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 더 이상의 구체예에서, IC50값은 500 pM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, IC50값은 200pM 미만이다.더 이상의 구체예에서, IC50값은 100pM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, IC50값은 50 pM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, IC50값은 10pM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, IC50값은 5pM 미만이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFFIIa 의 IC50값 + 500 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 1nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 200 pM 보다 낮은, FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 50 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 100pM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 10pM 보다 낮은, 더욱 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 5pM 보다 낮은, 더욱 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
TF 유도 응고체 검정에서 인용되는 특정의 IC50값은 정상 인간 혈장을 사용한 때의 값이라는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 더이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 FXa 생성 검정에서 항체를 시험하는 단계, 및 (0.1nM 농도의 FVIIa 를 사용한 검정에서) 100nM 보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 더 이상의 구체예에서, IC50값은 10nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, IC50값은 5nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, IC50값은 1nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, IC50값은 0.1nM 미만이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 10nM 미만같이 (0.1nM FIIa를 사용한 검정에서)FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 5nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 1nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 0.1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 (검정에서 10 nM 농도의 FVIIa 를 사용하여) 100 nm 보다 낮은 IC50값으로 TF-유도 FVIIa 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를선택하는 단계를 포함한다. 더 이상의 구체예에서 IC50값은 40 nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서 IC50값은 20 nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서 IC50값은 10 nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서 IC50값은 5 nM 미만이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa 의 IC50값 +40 nM 미만 같이 (10nM FVIIa 를 사용한 검정에서) FFR-rFVIIa 의 IC50값 +100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값 +20nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값 +10 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험하는 단계 및 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 TF 를 포함하는 TF ELISA 검정에서 항체를 시험하는 단계 및 인간 TF 와 결합하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 고정화된 TF 를 포함하는 직접 TF ELISA 검정에서 항체를 시험하는 단계 및 고정화된 인간 TF 와결합하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 용액내에 TF 를 포함하는 간접 TF ELISA 검정에서 항체를 시험하는 단계 및 용액내에 인간 TF 와 결합하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 TF 발현 세포상에서 FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 (1nM 농도의 FVIIa 를 사용한 검정에서) 500 nM 보다 낮은 IC50값을 가지는 TF 발현 세포상에서 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 더 이상의 구체예에서 IC50값은 100nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, IC50값은 50nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, IC50값은 10nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, IC50값은 5nM 미만이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 TF 발현 세포상에서 FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 100nM 미만같이 (0.1nM FVIIa를 사용한 검정에서) FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 500 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 50nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 10nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값 + 5 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa 의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 TF 발현세포상에서 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
용어 "TF 발현 세포"는 인간 TF 를 발현하는 어떤 포유동물 세포를 의미한다.
본 발명의 더이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 전체 세포 TF 결합 검정에서 항체를 시험하는 단계 및 전 세포의 세포표면상에 발현된 인간 TF 에 결합하는 FVIIa 와 경쟁적인 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 바이오센서 검정에서 항체를 시험하는 단계 및 100 nM 보다 낮은, 인간 TF 에 대한 결합 Kd값을 가지는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 더 이상의 구체예에서, 인간 TF 에 대한 결합 Kd값은 10nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, 인간 TF 에 대한 결합 Kd값은 5nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, 인간 TF 에 대한 결합 Kd값은 1nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, 인간 TF 에 대한 결합 Kd값은 0.5nM 미만이다. 더 이상의 구체예에서, 인간 TF 에 대한 결합 Kd값은 10-10M 미만이다. 더 이상의 구체예에서, 인간 TF 에 대한 결합 Kd값은 10-11M 미만이다. 더 이상의 구체예에서, 인간 TF 에 대한 결합 Kd값은 10-12M 미만이다. 더 이상의 구체예에서, 인간 TF 에 대한 결합 Kd값은 10-13M 미만이다. 더 이상의 구체예에서, 인간 TF 에 대한 결합 Kd값은10-14M 미만이다. 더 이상의 구체예에서, 인간 TF 에 대한 결합 Kd값은 10-15M 미만이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 MAPK 신호화 검정에서 항체를 시험하는 단계 및 MAPK 신호화의 FVIIa-유도 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 인간 항체는 98% 로 MAPK 혈관조형술의 FVIIa-유도 활성을 저해한다. 한 구체예에서, 인간 항체는 90% 로 MAPK 신호화의 FVIIa-유도 활성을 저해한다. 한 구체예에서, 인간 항체는 70% 로 MAPK 신호화의 FVIIa-유도 활성을 저해한다. 한 구체예에서, 인간 항체는 50% 로 MAPK 신호화의 FVIIa-유도 활성을 저해한다. 한 구체예에서, 인간 항체는 30% 로 MAPK 신호화의 FVIIa-유도 활성을 저해한다.
용어 "MARK 신호화"는 다양한 세포외 자극에 반응하는, 미토겐-활성화-단백질 키나제(MARK) 또는 그것의 상동체의 활성을 매개하는 세포내 과정의 연쇄를 의미하는 것으로 의도된다. MAP 키나제의 3개의 구별되는 영역이 포유동물 세포에서 확인되었다: 1) 세포외-조절 키나제(Erk1/2 또는 p44/42), 2)c-Jun N-말단 키나제(JNK) 및 3)p38 키나제. Erk1/2 경로는 Erk1(p44) 및/또는 Erk2(p42)의 인산화를 포함한다. 예를 들어, p44/42 MAPK 와 같은, 활성화된 MAP 키나제는 Elk1 을 포함하여 전사 인자 및 시그널 트랜스듀서 및 전사 활성화제(Stat)를 인산화하고 활성화할 수 있는 핵내로 이동될 수 있다. Erk1/2 는 또한 세포질내에서 또는 핵내에서 키나제 p90RSK 를 인산화할 수 있고, 그 다음 p90RSK 는 몇개의 전사 인자를활성화할 수 있다.
용어 "단백질 키나제"는 펩티드 및/또는 단백질에서 세린 및/또는 트레오닌 및/또는 티로신을 인산화할 수 있는 효소를 나타내고자 한다.
용어 "MAPK 신호화의 FVIIa-유도 활성"은 포유동물 세포에서 FVIIa 가 TF 와 결합함으로써 MAPK 신호화를 유도한다는 것을 나타내고자 한다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 유전자 발현 분석 검정에서 항체를 시험하는 단계(검정 15) 및 Fra-1, Id2, 및 Cys61 을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된 유전자의 FVIIa 유도 상향-조절을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
TF 의 활성을 저해하는 TF 에 대한 항체는 TF 상에 존재하는 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 인간 TF 와 FVIIa 의 결합 또는 인간 TF 와 FX 또는 FXa 의 결합 모두를 저해할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 과제는 인간 TF 와 FVIIa 의 결합을 저해함으로써, FVIIa 유도 세포내 신호화를 유발하는 항체를 선택하는 것이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 인간 암 검정에서 항체를 시험하는 단계(검정 13) 및 인간 암의 성장 또는 전이를 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 Fra-1, Id2, 및 Cyr61 을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된 유전자의 FVIIa 유도 상향 조절을 저해한다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 인간 TF 와 FX 또는 FXa 의 결합을 저해하지 않는다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 TF 의 세포내 활성을 저해하지 않는다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인간 항체의 제조 방법은 에피토프 맵핑 검정에서 항체를 시험하는 단계 및 TF 상의 바람직한 에피토프에 결합하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 바람직한 에피토프는 하나 이상의 잔기 Trp45, Lys46 및 Tyr94 를 포함한다. 한 구체예에서, 바람직한 에피토프는 잔기 Trp45 를 포함한다. 한 구체예에서, 바람직한 에피토프는 잔기 Lys46 을 포함한다. 한 구체예에서, 바람직한 에피토프는 잔기 Tyr94 를 포함한다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 분리된 인간 항체는 TF 와 FVIIa 의 계면내의 에피토프와 결합한다.
X선 구조로부터 결정된(Banner 등, 1996 Nature, 380: 41-46) FVIIa 의 프로테아제 도메인과 TF 의 상호 작용에 관여하는 TF 내의 잔기는; Ser39, Gly43, Trp45, Ser47, Phe50, Arg74, Phe76, Tyr94, Pro92 이다. FVIIa 의 프로테아제 도메인과 TF 간의 계면은 FVIIa 의 결합 과정에서 높은 특이성을 얻기 위하여 TF 와 FVIIa 간의 많은 정교한 접촉이 이루어지도록 하는 많은 분자간 수소 결합을 함유하는 복합체 계면 영역인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 TF 에 대한 고친화성 인간 단일클론 항체에 관한 것이다. FVIIa 의 프로테아제 도메인에 대한 접촉 계면을 함유하는 TF 표면은 단백질-단백질 상호작용을 일으키도록 반응하는 경향이 있는 특이적 기하학을 유지하고, 여기서 다른 형태의 단백질-단백질 상호작용은 항체와 단백질 리간드간의 복합체 형성이다. 따라서, 인간 TF 상의 에피토프에 대하여 유발된 단일클론 항체는 Mabs 에 높은 친화성을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 양태는 FVIIa 의 프로테아제에 대한 접촉 계면과 면역반응하는 고친화성 인간 단일클론 항체이다.
본 발명의 인간 TF 항체는 응고의 TF-매개 유도에 대하여 길항제로 작동하여 TF 와 응고체 FVIIa 의 결합을 저해함으로써, 트롬빈의 생성과 피브린의 연속적인 침착을 차단한다. 혈관내 응고를 포함하는 다양한 상태를 치료하기 위해 인간에게 투여하기에 특히 적합한 것은 인간 TF 항체이다. 그 자체로, 인간 TF 항체는, 예를 들어, 혈액응고의 저해, 혈전증 또는 혈소판 침착을 초래하는 TF 활성 저해에 유용하다. 더욱이, 본 발명에 따른 인간 TF 항체는 TF 의 세포성 기능, TF 의 신호화 기능을 저해하는 작용을 하며, 패혈증, 염증, 동맥경화증, 재협착, 또는 암과 같은 상태에 유용할 수 있다.
인간 TF 항체는 다양한 질환에 유용할 수 있다. 심정맥혈전증, 동맥혈전증, 수술후 혈전증, 심장동맥 우회로 조성술 (CABG), 경피 피부통과 심장 혈관조형술(PTCA), 뇌중풍, 종양성장, 종양 전이, 혈관형성, 혈전용해, 동맥경화증 및 혈관조형술 후의 재협착과 같은 혈관 장애, 염증, 패혈 쇼크, 패혈균증, 저혈압, 성인 호흡곤란증후군 (ARDS), 전신성 염증반응증후군 (SIRS), 파종혈관내응고 (DIC), 허파색전증, 병리적 혈소판 침착, 심근경색증, 또는 혈전증의 위험이 있는동맥경화 혈관을 갖는 포유동물의 예방적 치료 및 말초혈 전구세포(PBPC) 이식에 따른 정맥폐색성 질환, 용혈성 요독증후군(HUS), 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP) 및 다른 질환 또는 장애와 같은, 염증 반응 및 만성 혈전색전증 또는 혈관 이상을 포함하는 피브린 형성에 관련된 이상을 포함하는 혈전증 또는 응고병 관련 질환 또는 장애를 포함한다. 인간 TF 항체는 외과적 처치를 받거나, 울혈성 심부전을 앓는 환자들과 같은, 확인된 높은 위험성을 가진 환자에서 혈전색전성 합병증의 발생을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 인간 TF 항체는 급성 혈관 손상으로 인한 초기 증식 또는 재협착의 처리에 특히 유용할 수 있다. 급성 혈관 손상은 평생에 걸쳐 진행하는 (예를 들어, 동맥경화증과 같은) 만성 혈관 손상과는 대조적으로 빠르게(즉, 수시간 내지 수개월) 발생한다. 급성 혈관 손상은 종종 혈관조형술, 내막절제술, 동맥절제술, 혈관 이식편 정치등의 기술이 사용된 혈관 재구성과 같은 외과적 과정으로 초래될 수 있다. 증식은 또한 예를 들어, 이식편 정치 또는 기관 이식에 대해 반응하여 지연된 반응으로 발생할 수 있다. 인간 TF 항체는 손상 부위에 노출된 TF 에만 결합하기 때문에 헤파린에 비하여 더욱 선택적이고, 인간 TF 항체는 다른 응고 단백질을 손상시키거나 저해하지 않기 때문에, 심정맥 혈전증을 막기 위해 예방적으로 사용될 때, 헤파린보다 더욱 효과적이며, 출혈 합병증을 덜 유발할 것이다.
다음의 실시예에서 보여진 대로, 본 발명의 인간 TF 항체는 세포-표면 TF 에 선택적으로 결합하여 TF 와 응고 FVIIa 와의 결합을 저해함으로써 그것의 기능적 활성을 저해할 수 있다. TF 와의 결합을 유지하는 인간 TF 항체는 트롬빈의 생성및 수반되는 피브린의 침착을 차단함으로써 혈관 손상의 부위에서 혈소판 축적을 저해한다.
인간 TF 항체의 급성 혈관 손상 부위에서 트롬빈 생성을 차단하고 혈소판 침착을 제한할 수 있는 능력때문에, TF 와의 결합을 유지함으로써 FVIIa 결합을 저해하는 인간 TF 항체는 혈관 재협착을 저해하기 위해 사용될 수 있다.
응고-관련 상태를 치료하기 위한 다양한 질환 상태를 앓는 개체에게 투여될 수 있는 약학적 조성물로서 인간 TF 항체를 포함하는 조성물이 제조되었을 때, 이것은 환자를 치료하는 방법에서 특히 유용하다. TF 와 결합할 수 있고 TF 와 FVIIa 와의 결합을 저해할 수 있는 이러한 인간 TF 항체는, 다른 항응고제와 비교할 때, 더욱 긴 혈장 반감기를 가져서, 이에 상응하는 장기간의 항응고 활성을 나타낼 수 있다. 대상 조성물이 사용될 수 있는 의학적 징후는, 예를 들어, 심정맥혈전증, 허파색전증, 뇌중풍, 파종혈관내응고(DIC), 패혈증과 관련된 허파 및 신장내의 피브린 침착, 항인지질증후군(APS), 동맥경화증 및 심근경색증과 같은 항응고제로 통상 치료되는 것들이다. 조성물은 수술, 미세수술, 풍선 혈관조형술, 동맥내막절제술, 환원성 동맥절제술, 스텐트 배치, 레이저 요법 또는 부패물절제와 같은 기계적 혈관 손상으로 발생하거나, 또는 혈관 이식, 스텐트, 우회로 이식 또는 기관 이식으로 이차적으로 발생하는 혈관 재협착을 저해하는데 사용될 수 있다. 따라서, 조성물은 혈소판 침착 및 관련된 장애를 저해하기 위해서 사용될 수 있다. 따라서, 응고, 혈관 재협착 또는 혈소판 침착을 저해하는 방법은 예를 들어, 응고, 혈관 재협착 또는 혈소판 침착을 효과적으로 저해하기 위해서 충분한 양으로 인간 TF 항체를포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 조직 플라스미노겐 활성인자 또는 스트렙토키나제와 함께, 인간 TF 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 본 방법은 (예를 들어, 급성 심근경색증과 같은) 개체에서 관상동맥의 급성 폐쇄의 치료에 사용된다는 것이 발견되었고, tPA 유도된 혈전용해를 가속화시킬 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성인자와 같은 혈전용해제의 투여전, 투여와 함께, 또는 투여 직후에 인간 TF 항체를 투여하였다.
본 발명에 따라서, 인간 TF 에 대하여 유발되는 인간 단일클론 항체는 인간 TF 와 함께 마우스 시스템이 아닌 인간 면역 시스템의 일부를 운반하는 면역화 트랜스제닉 마우스(Medarex 로부터 얻음)에 의해서 제조될 수 있다. 트랜스제닉 세포로부터의 비장세포가 기술된 대로 인간 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하기 위해서 사용된다(예를 들어, Wood 등, 국제출원 WO 91/00906, Kucherlapati 등. PCT 공개 WO 91/10741; Lonberg 등. 국제출원 WO 92/03918; Kay 등, 국제출원 92/03917; Lonberg, N. 등 1994 Nature 368:856-859; Green, L. L. 등 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrision, S. L. 등 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Bruggeman 등 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon 등 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman 등. 1991 Eur J Immuno 21:1323-1326 참조).
인간 TF 에 대하여 유발된 인간 단일클론 항체는 또한 파지 전개에 의해서 생산될 수 있다. 인간 항체 라이브러리는 면역화된 인간으로부터 제조될 수 있고, 섬유상 파지 표면에서 전개된다. 많은 경우에서, 고친화성 인간 단일사슬 Fv(ScFv) 및 Fab 항체 단편은, 관심 항원을 고형 표면, 즉 마이크로타이터 플레이트 또는 비드상에 고정한 패닝기술을 사용하여 이러한 라이브러리로부터 분리되었다(Barbas C. F., III 및 Burton, D. R. Trends. Biotechnol. 1996, 14:230-234; Aujame L. 등, Hum. Antibodies 1997, 8:155-68). 거대한 천연 라이브러리의 파지 전개는 또한 면역화 없이 직접적으로 인간 항체를 분리하는 것을 가능하게 하였다(DeHaard H. J.등, J. Biol. Chem. 1999, 18218-18230).
실시예 1
인간 TF 에 대해 면역특이적인 인간 Mabs 의 제조
시약
Rao, L.V.M, Thrombosis Research, 51:373-384 1988 에 기술된 대로 인간 뇌로부터 인간 TF 를 분리할 수 있다.
지질화 재조합 인간 TF (Dade Innovin, Baxter)는 또한 인간 트롬보플라스틴 시약으로 사용될 수 있다. 래트, 래빗, 개코원숭이, 및 돼지 트롬보플라스틴이 뇌조직으로부터 제조될 수 있다. 2부피의 45℃ 0.9% NaCl를 뇌조직에 첨가하고, 조직을 수동 글래스 호모제니세이터로 균질화하였다. 때때로 와동시키면서 45℃ 에서 30분 인큐베이션한 후에, 샘플을 2000 ×g 으로 20분 원심분리하였다. 침착물을 폐기하고, 상청액을 알리쿼트하여 사용전까지 -80℃에서 저장했다.
인지질 소포로(PC/PS 75/25) 재조합 인간 전장 TF(American Diagnosis#4500)를 재구성시킴으로써 재-지질화 TF 를 얻을 수 있다.
비오틴화 인간 TF 를 다음과 같이 제조하였다: 비오틴-NHS(n-숙신이미도 비오틴, Sigma H-1759)을 1.7mg/ml 농도의 DMF(디메틸포름아미드)에 용해시켰다. 0.1M NaHCO3완충액내의 1mg/ml 의 인간 TF 를 60㎕의 비오틴-NHS 용액에 첨가하고 실온에서 4시간동안 반응하도록 허용하였다. 비오틴화 TF 를 함유하는 반응 용액을 하룻밤동안 PBS-완충액에 대하여 투석하였다.
사용된 FVIIa 는 Thim, L. 등 Biochem 27:7785-7793, 1988 에 기재된대로 제조된 재조합 인간 FVIIa 이다.
sTF: Freskgard, P. O. 등, Protein Sci. 5, 1531-1540(1996)에 기술된 대로 E.coli 에서 발현되고 본질적으로 정제된, 재조합 인간 가용성 TF1-209.
S2288: H2O 에서 17.24mg/ml(Chromogenix)로 재구성하였다.
FX: 정제된 인간 혈장 FX(HFX, Enzyme Research Laboratories Ltd.)
FXa: 러셀 바이퍼 베놈으로 활성화된 정제된 인간 혈장 FX(HFXa, Enzyme Research Laboratories Ltd.).
염색체 X: H2O 에서 1.25mg/ml 로 용해되었다(Boehringer Mannheim).
125I-FVIIa 를 표준 방사능표지 과정으로 얻었다.
FFR-rFVIIa: D-Phe-L-Phe-L-Arg-클로로메틸 케톤으로 활성화 부위에서 차단된 FVIIa.
Sorensen B.B.등 J. Biol.Chem. 272:11863-11868, 1997 에 의해서 기재된대로 제조되었다.
면역화
인간 TF 를 프로인트 완전 아주반트에서 에멀젼화하였다. HuMab 마우스 또는 이것의 혼성체(Medarex)에 피하 주사로 40㎍을 주입하였다. 14 일 내지 28일 후에, 그리고 마지막으로 14일의 간격으로 수회 더, 더이상의 불완전 프로인트 완전 아주반트내의 20㎍ TF 를 유사한 주사로 마우스에 추가접종하였다. 마지막 주사후 10일에, 혈샘플을 채취하여, TF ELISA에 의해서 인간 TF 특이적인 항체에 대해서 혈청을 시험하였다(검정 1 및 2).
융합
검정 1-3으로부터의 양성적인 혈청 시험을 한 마우스에 정맥내 주사로 20㎍의 인간 TF 를 추가접종하고, 3 일후에 희생시켰다. 비장을 무균상태로 제거하고 단일 세포 현탁액이 되도록 분산시켰다.
여우-골수종 세포를 CD 하이브리도마 배지에서 배양하였다(Gibco 11279-023).
비장 세포와 골수종 세포의 융합체(P3×63 Ag8.653, ATCC CRL-1580), 및 Sp2/0(ATCC CRL-1581) 골수종 세포주를 PEG 방법을 사용하여 융합하였다(Kohler, G& Milstein C.(1976), European J. Immunology, 6:511-19). 세포를 마이크로타이터 플레이트에 접종하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 배지를 다음 2주일동안 3회 교환하였다. 하이브리도마 세포로부터의 100㎕의 상청액을 각 웰로부터 제거하고TF ELISA 에서 TF 특이적인 항체에 대하여 시험하였다(검정 1 및 2).
실시예 2
스크리닝
선택된 항체에 특이적인 혈청 및 배양 상청액의 스크리닝에 사용된 다양한 검정은 다음에 기술된다.
직접 TF ELISA 검정(검정 1):
Nunc 면역플레이트를 PBS 내의 1㎍/ml 의 인간 sTF 로 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 플레이트를 차단 완충액(5mM CaCl2및 2% BSA를 가진 TBS)으로 차단하고 TBS+0.05% 트윈 20 으로 세척하였고, 하이브리도마 세포로부터의 상청액을 첨가하였다. 1시간동안 실온에서 인큐베이션한 후에, 플레이트를 세척하고 허스래디쉬 퍼옥시다제(HRPO)로 표지화된 항-인간 IgG 를 첨가하였다. 제조자에 의해서 기술된 대로, 한 번 더 한시간 인큐베이션한 후에, 플레이트를 세척하고 TMB-기질(Kem-ET-Tec)로 전개하였다. ELISA-해독기로 450 nm 에서의 흡광도를 측정하였다.
간접 TF ELISA 검정(검정 2)
Nunc-면역플레이트를 PSB 내의 0.5㎍/ml 의 염소 항-인간 IgG로(Southern Biotechnology Associates, Cat-#2040-1) 코팅하고 4℃에서 하룻밤동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 차단 완충액(5ml CaCl2와 2% BSA 를 가진 TBS)으로 차단시키고, TBS +5mM CaCl2+ 0.05% 트윈 20 에서 세척하였다. 하이브리도마 세포로부터의 배양 상청액을 첨가하고 플레이트를 1시간동안 실온에서 인큐베이션하였다. 한시간세척후에, 비오틴화 인간 sTF 를 1㎍/ml 의 농도로 첨가하고, 1 시간동안 인큐베이션하였다. 세척후에, 100 ㎕ 의 스트렙타비딘-HRPO 용액을 첨가하고 1 시간동안 인큐베이션하였다. 검정 1에 기술된 바와 같이 플레이트를 TMB-기질로 전개하였다.
FVIIa 경쟁 검정(검정 3):
Nunc-면역플레이트를 4℃에서 하룻밤동안 인간 sTF(PBS 내의 농도 5㎍/ml)와 함게 인큐베이션하였다. 플레이트를 5mM CaCl2및 2% BSA 를 가진 TBS 완충액에서 세척 및 차단하였다. 항-인간 TF Mabs 를 첨가하고 플레이트를 2 시간동안 인큐베이션하였다. 비오틴화 인간 FVIIa 를 첨가하기 전에 플레이트를 세척하고(5mM CaCl2및 2% BSA 를 가진 TBS 완충액내의 1㎍/ml), 플레이트를 1 시간동안 인큐베이션하였다. HRPO-표지된 스트렙타비딘을 첨가하기 전에 플레이트를 세척하고 45분동안 인큐베이션하였다. 제조법에 기술된 대로, TMB 기질(Kem-EN-Tec)로 전개하기전에, 플레이트를 다시 세척하였다.
FVIIa/sTF 아미도용해 활성의 저해(검정 4):
가용성 인간 TF(10nM), 재조합 인간 FVIIa(10nM)를 사용하고, Mabs의 농도를 증가시켜서(0.0122-50nM) 항-인간 TF MaBs 에 의한 FVIIa-TF 촉매 아미도용해 활성의 저해를 시험했다. 기질 S2288(1.2mM, Chromogenix)를 첨가하기 전에, 다양한 농도의 항-인간 TF Mabs 또는 FFR-rFVIIa 를, 실온에서 60분동안 BSA 완충액(50nM Hepes, pH 7.4, 100mM NaCl, 5mM CaCl2및 1mg.ml BSA)내의 10nM sTF 와 10nM FVIIa 와 함께 사전 인큐베이션하였다. 405nm 에서 30분동안 연속적으로 색전개를 측정하였다. 아미도용해 활성은 mOD/분으로 표시된다. Mabs 에 의한 FVIIa/TF 아미도용해 활성의 저해에 대한 IC50 값을 계산할 수 있다. 검정에서 FFR-rFVIIa 에 대한 IC50값은 7 +/-3nM 이다.
FXa 생성의 저해(검정 5):
FX(50nM) 을 첨가하기 전에, BSA 완충액내의 지질화 TF(10pM), FVIIa(100pM) 및 항-TF Mabs 또는 FFR-rFVIIa(0-50nM)(검정 4 참조)를 실온에서 60분동안 인큐베이션하였다. 1/2 부피의 정지 완충액(50mM Heps, pH 7.4, 100ml NaCl, 20mM EDTA)을 첨가함으로써, 다음 10분 후에 반응을 종결시켰다. 기질 S2765(0.6mM, Chromogenix)을 첨가하고, 405nm 에서 10분동안 연속적으로 흡광도를 측정함으로써, 생성된 FXa 의 양을 결정한다. FVIIa/FX 의 지질화 TF-매개 활성의 Mab 저해에 대한 IC50값을 계산할 수 있다. 검정에서 FFR-rFVIIa 에 대한 IC50값은 51 +/- 26pM 이다.
바이오센서 저해(검정 6):
인간 IgG 에 고정화된 항체를 가진 칩상에 항-인간 TF Mab 의 표준 용액을 통과시킴으로써, 비아코어(Biacore) 기구상에서 항체를 시험했다. 150mM NaCl, 10mM CaCl2및 0.0003% 폴리소르베이트 20를 함유하는, pH 7.4 의 10mM Hepes 내의 상이한 농도의 sTF 로 수행했다. 통합된 비아코아 평가 소프트웨어를 사용하여 센서그람으로부터 Kd값을 계산하였다.
TF-의존성 응고체 검정(검정 7)
ACL300 리서치 응고 장치(ILS 실험실)에서 검정을 수행하였다. 50mM 이미다졸, pH 7.4, 100mM NaCl, 0.1% BSA 내의 항-인간 TF Mabs 의 희석액을 2 내지 5 의 비율로 25mM CaCl2와 혼합하고 응고 장치내에 샘플 컵에 첨가하였다. 항체가 없는 샘플에서 약 30초의 응집시간을 얻기 위해서 이미다졸 완충액으로 희석된 인간, 래트, 래빗, 개코원숭이, 또는 돼지에서 얻은 트롬보플라스틴을 시약 저장소 2에 놓았고, 인간, 래트, 래빗, 개코원숭이 또는 돼지 혈장을 시약 저장소 3에 놓았다. 분석동안에 70㎕의 항체와 CaCl2혼합물을 25㎕ 트롬보플라스틴 시약에 옮기고, 60㎕ 혈장을 첨가하여 응집시간을 측정하기 전에 900 초동안 사전 인큐베이션하였다. 최대 응고 시간은 400 초로 정해진다. 트롬보플라스틴의 희석액을 항-TF Mabs 또는 FFR-rFVIIa 가 첨가되지 않은 대조표준에 대하여, 응집 시간을 TF 활성으로 전환시키기 위한 표준 커브로서 사용하였다. 이 검정에서, FFR-rFVIIa 에 대한 IC50값은 4.4 +/- 0.4pM 이다.
Mabs 에 의해 FVIIa/FX 의 세포 표면 TF 촉매화 활성의 저해(검정 8):
예를 들어, 인간 폐 섬유아세포 Wl38(ATTC No. CCL-75), 인간 방광암종 세포주 J82(ATTC No. HTB-1), 인간 각질형성세포 세포주 CCD 1102KerTr(ATCC No. CRL-2310), 인간 교모세포종 세포주 U87, 또는 인간 유방암 세포주 MDA-MB231 과 같은 을 인간 TF 를 발현하는 세포의 단층을, FVIIa/FX의 TF 촉매화 활성에서의 TF원으로 사용하였다. 24-, 48-, 또는 96-웰 플레이트내의 융합성 세포 단층을 완충액 A (10mM Hepes, pH 7.45, 150mM NaCl, 4mM KCl, 및 11mM 글루코스)로 1회, 그리고 완충액 B(1mg/ml BSA 및 5mM Ca2+로 보충된 완충액 A)로 1회 세척하였다. 완충액 B 의 FVIIa(1nM), FX(135nM) 및 다양한 농도의 Mab(또는 FFR-rFVIIa)를 동시에 세포에 첨가하였다. 택일적으로, rFVIIa 및 FX 를 첨가하기전에, 세포를 항-TF Mabs 또는 FFR-rFVIIa 와 함께 15분 사전 인큐베이션하였다. 37℃에서 15분동안 FXa 형성을 허용하였다. 각 웰로부터 50㎕의 알리쿼트를 제거하여, 50㎕의 정지 완충액(10mM EDTA 및 1mg/ml BSA 로 보충된 완충액 A)에 첨가하였다. 50㎕의 상기 혼합물을 마이크로타이터 플레이트에 옮기고, 웰에 25㎕ 크로모짐 X (최종 농도 0.6mM)를 첨가함으로써 생성된 FXa 의 양을 결정하였다. 405nm 에서 흡광도를 연속적으로 측정하고, FXa 표준 커브를 사용하여 색상 전개의 초기 속도를 FXa 농도로 전환시켰다. 검정에서 FFR-rFVIIa 에 대한 IC50값은 1.5nM 이었다.
Mab 에 의한 세포 표면 TF 와
125
I-FVIIa 결합의 저해 (검정 9):
예를 들어, 인간 폐 섬유아세포 Wl38(ATTC No. CCL-75), 인간 방광암종 세포주 J82(ATTC No. HTB-1), 인간 각질형성세포 세포주 CCD 1102KerTr(ATCC No. CRL-2310), 인간 교모세포종 세포주 U87, 또는 인간 유방암 세포주 MDA-MB231 과 같은 인간 TF 를 발현하는 세포를 사용하여 결합 연구를 하였다. 24-웰 조직 배양 플레이트내의 융합성 단층을 완충액 A(검정 8 참조)로 한번, 그리고 완충액 B(검정 8 참조)로 한번 세척하였다. 단층을 100㎕의 찬 완충액 B 와 함께 2분동안 사전 인큐베이션하였다. 다양한 농도의 Mabs(또는 FFR-rFVIIa)와 방사능표지된 FVIIa(0.5nM125I-FVIIa) 를 동시에 세포에 첨가하였(최종 부피 200㎕). 4℃에서 2시간동안 플레이트를 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 종결시에, 미결합 물질을 제거하고, 세포를 아이스-냉각된 완충액 B 로 4회 세척하고, 300㎕ 용균 완충액으로 용균시켰다(200mM NaOH, 1% SDS 및 10mM EDTA). 감마 카운터(Cobra, Packard Instruments)로 방사능을 측정하였다. 결합 데이터를 분석하고 GraFit4(Erithacus Software, Ltd., (U.K.))를 사용하여 커브를 고정시켰다.
Mab 에 의한 FVIIa/TF-유도 p44/42 MAPK 활성의 저해(검정 10):
인산화된 p44/42 MAPK 및/또는 Akt, 및/또는 p90RSK 의 양을 웨스턴 블롯 분석으로부터 화학발광(후지필름 LAS-1000)의 정량적 검출로 결정하였다. 예를 들어, CCD1102KerTr, NHEK P166, 인간 교모세포종 세포주 U87, 또는 인간 유방암세포주 MDA-MB231 과 같은 인간 TF 를 발현하는 세포를 0 - 0.1% FCS 를 가지는 배지에서 24 내지 48 시간동안 배양한 다음 세포를 무활동으로 하여 실험하였다. 실험시에, 세포는 70-80% 융합되어야만 한다. 10-100 nM FVIIa 를 첨가하기 전에, 37℃에서 30분동안 무혈청 배지에서 과량의 Mab 또는 FFR-rFVIIa 와 함께 사전 인큐베이션하고, 10분동안 인큐베이션함으로써 실험을 수행한다. 세포 신호화의 양성적 대조표준으로서, 세포를 10분동안 10% FCS 로 처리하였다. 세포를 용균 완충액(0.1mM 4-(2-아미노에틸)벤젠술포닐 플로라이드(AEBSF) 및 1mM 벤자미딘을 함유하는 pH 7.5, 20mM Tris, 0.1% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 50mM 나트륨-플로라이드, 10mM 나트륨 β-글리세로포스페이트, 5mM 나트륨 피로포스페이트, 150mM NaCl. 사용전에 1mM 나트륨 또는 토바나데이트, 5㎍/ml 류펩틴, 10㎍/ml 아프로티닌을 첨가하였다.)에서 용균시켰다. 여액을 SDS-샘플 완충액과 혼합하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에 로딩하였다. 표준 비오틴화 단백질 마커를 각각의 겔상에 로딩하였다. SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 분리된 단백질을 일렉트로블로팅에 의해서 니트로셀룰로스에 옮기고, 포스포-특이적인 항체와의 면역블로팅으로 키나제 p44/42 MAPK, Akt 및 p90RSK 를 가시화하고, 후지필름 LAS1000 으로 화학발광을 정량화하였다.
에피토프 맵핑 검정 (검정 11):
가용성 TF(sTF)변이체의 제조
주형으로서 야생형 플라스미드(Freskgard 등, Protein Sci. 5, 1531-1540, 1996)를 사용하여 역 PCR 을 사용하여 sTF 변이체(122C, W45C, K46C, Y94C, F140C, W158C, K201C)를 제조하였다. 야생형 및 변이체는 다양한 문헌의 기재와 그것의 약간의 변형으로(Freskagard 등, Protein Sci. 5, 1531-1540, 1996)E.coli에서 발현되고 정제된다. pH 7.5 의 10mM Tris-HCl 완충액에서 X-프레스(Biox, Sweden) 기술로 세포 용균을 수행한 다음, 1mg 의 DNAse 가 첨가된 동일한 완충액에서 재현탁하였다. 4℃에서 20분동안 11000×g 으로 용액을 원심분리하고, pH 8.0, 75ml 의 6M GuHCl, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl에서 봉입체를 변성시켰다. 약 2시간동안 온화하게 교반시키면서, pH 8.0, 50mM Tris-HCl, 0.25M NaCl 을 함유하는 1 L 용액내에 변성된 단백질을 한방울씩 첨가하여 희석시키면서 실온에서 1시간 인큐베이션한 후에 재결합시켰다. Freskgard 등(1996)에 기재된 바와 같이, Q-세파로스 패스트 플로우(Pharmacia, Uppsala, Sweden) 및 FVIIa 친화성 크로마토그라피를 사용하여 정제하였다. SDS-PAGE 로 단백질의 균질성을 증명하였다. A280nm에서 농도를 측정하고 37440M-1cm-1의 계산된 흡광 계수를(Gill 및 Von Hippel, 1989) 사용하여 농도를 결정하였다.
MaxiSorp 플레이트(Nunc-Immuno)를 TBS 내의 야생형 sTF 와 변이체(10㎍/ml)로 코팅하고 차단 완충액(0.1% 트윈 20 및 0.5% BSA 를 가진 TBS)으로 차단하였다. 플레이트를 세척 완충액(TBS 및 0.1% 트윈 20)으로 세척하였다. 항-인간 TF Mabs 를 차단 완충액내에 1ng/ml 의 농도로 적용하고 1시간동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 세척 완충액을 사용하여 (6×) 플레이트를 세척하였다. TMBplus-기질(Kem Tech Cat. 4390A)을 사용하여 차단 완충액에서 1:2000 희석으로 HRP-표지된 항-인간 IgG(Helica Biosystems, Inc)를 사용하여 항체 결합을 연속적으로 검출하였다. 최종 ELISA 시그널(OD450-620)을 모든 sTF 변이체에 대한 각 항체의 결합 적량으로 사용한다.
트롬보엘라스토그라피 (검정 12)
인간 트롬보플라스틴(예를 들어, Dade Behring, 최종 희석 50,000 ×)을 CaCl2(최종 농도 16.7mM) 및 항-TF Mabs 와 혼합하여 실온에서 15분동안 인큐베이션하였다. 40㎕의 트롬보플라스틴/CaCl2/항-TF Mab 혼합물을 첨가하기 전에, 시트레이트-안정화 인간의 총혈액(280㎕)을 RoTEC 샘플컵(Pentapharm)에 첨가하고, 37℃에서 5분동안 사전 가열하였다. RoTEC 장치(Pentapharm)에서 한시간동안 트롬보엘라스토그라피를 수행하였다. CoagPro SoftwareTM(MedScience, Arhus, Denmark)을 사용하여 트롬보그람으로부터 속도 프로파일을 얻었다.
실시예 3.
인간 암 검정. 마우스 모델에서 인간 암의 성장 및 전이에 대한 인간 항-TF Mabs 로의 처리의 효과를 조사(검정 13).
처리
볼루스 주입 i.v.; 10mg/kg=0.1mg/10g 으로 주입된 인간 항-TF Mabs; 주입량은 3개의 처리 용액중 어느 것에서도 10g 마우스당 0.1ml 이다.
A. 운반체 대조표준
B. 1mg/ml 인간 FFR-rFVIIa
C. 1mg/ml 항-TF Mabs
모델 기술:
1. 결장암의 1차 성장 및 간으로의 전이
생후 7-8주 된 건강한 암컷 치매 마우스(nu/nu)를 사용하였다. 인간 세포 이식에 대한 누드 마우스의 나머지 면역저항성을 없애기 위해서, 인간 종양을 이식하기 2틀전에, 5Gy로 마우스에 정기적으로 방사선을 조사하였다(Vogel 등, 1997). (Li 등, Human Gene Therapy 10:3045-3053, 1999)에 기재된 대로 15% 송아지 태아 혈청(FCS)을 가진 RPMI 1640 에서 배양된 LS174T 인간결장 암종세포(ATCC CCL 188)를 종양 이식하여 마우스의 면역성을 시험하였다. 요약하면, 세포를 트립신-EDTA로 채취하여, 2번 세척하고, 나트륨-헤파린 용액(1U/ml)으로 보충된 무혈청 RPMI 에서 재현탁하였다. 그 다음, 마취된 마우스에서 작은 좌측 아늑골의 절개를 수행하고, 50m 로프 인산염-완충액을 가진 식염수(PBS)내의 3 3 106 LS174T 세포를 비장에 주입하였다. 3 내지 5 분후에, 비장 혈관을 결찰시키고 비장을 외과적으로 제거하였다. 이 과정은 (95% 이상의) 간 전이의 안정한 발생율을 유도할 것이다. 항-TF Mabs 로의 처리는 이식 후 즉시 개시될 것이고, 남은 연구 기간동안 지속될 것이다. 종양 세포 접종 마우스를 희생시킨 후 15 내지 30 일에, 간을 제거하여 무게를 재고, 간 표면상의 가시적인 종양 결절의 수를 카운팅하였다. AFA(5% 아세트산, 75% 에틸 알코올, 2% 포르말린, 18% 물)내에서 간 샘플을 하룻밤동안 고정시켜서, 10% 에탄올에 옮긴 다음, 파라핀에 포매하여, 5-mm 절개물을 전이성 결정의 조직학적 정량화, 면역조직화학 및 아포프토시스의 정량화용으로 제조하였다.
연구 I-1
목적 : 볼루스 주입 i.v.; 10mg/kg 로 주입된 항-TF Mabs 의 누드 마우스에서 LS174T 결장 종양의 육안적 성장 및 간 전이에 대한 효과를 검사하는 것.
마우스 : 60 동형접합 nu/nu 6 주된 NMRI 수컷
군 : 마우스를 무작위로 15 마리씩의 4개의 군으로 할당하고 용액 A, B, 또는 C 로 처리함.
종결 : 〉20%의 무게 감량 또는 심각한 독성의 객관적인 징후시에 동물을 죽인다.
파라미터 : 성장 시기동안 매일, 2개의 직교 지름내의 종양 크기를 기록한다. 최초에 그리고 주마다 2-3회 체중을 기록한다. 부검으로 간에서 전이 형성을 측정한다.
II. 유방암의 제1차 성장 및 폐로의 전이
인간 가슴 암종 세포 MDA-MB-231(ATCC HTB26)을 10% 송아지 태아 혈청(FCS)으로 보충된 덜베코(Dulbecco) 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하였다. 누드 마우스에(7-8주된 암컷 마우스) MDA-MB-231 세포(3 3 106)를 피하로 주입하였다. 제1차 종양 성장 및 전이를 이미 기술된 대로 평가하였다(Li등, Human Gene Therapy 12:515-526, 2001).
연구 II-1 :
목적 : 볼루스 주입 i.v.; 10mg/kg 로 주입된 항-TF Mabs 의 누드 마우스에서 MDA-MB-231 유방 종양의 육안적 성장 및 폐로의 전이에 대한 효과를 검사하는 것
마우스 : 60 동형접합 nu/nu 6 주된 NMRI 수컷
군 : 마우스를 무작위로 15 마리씩의 4개의 군으로 할당하고 용액 A, B, 또는 C 로 처리함.
종결 : 〉20%의 무게 감량 또는 심각한 독성의 객관적인 징후시에 동물을 죽인다.
파라미터 : 성장 시기동안 매일 2개의 직교 지름내의 종양 크기를 기록한다. 최초에 그리고 주마다 2-3회 체중을 기록한다. 부검으로 폐에서의 전이 형성을 측정한다.
III. 신경교종 종양 이종이식편의 제1차 성장
종양 세포주 MG U373 은 누드 마우스에서 높은 혈관형성 활성, 높은 혈관 밀도 및 빠른 성장을 나타내는 인간 다형성 교모세포종 세포주이다. 종양을 표준 절차에 따라서 플랭크에 접종시켰다(실험 계획에 대해서는 포함된 프로토콜 참조). 독성의 징후에 대해서 매일 2번씩 마우스를 관찰하고, 매일 2개의 수직 지름내의 종양을 측정하였다.
NMRI 백그라운드의 nu/nu 동형접합 누드 마우스의 플랭크에 종양을 이식하였다. 마우스는 M&B(Ry, Denmark)로부터 얻은 7 주된 수컷이었다. 무균환경에서 동물을 사육하고, 임의로 무균 사료 펠릿과 식수를 공급하였다.
신경교종 종양 모델로 3 개의 상이한 연구를 수행하였다.
연구 III-1
목적 : 볼루스 주입 i.v.; 10mg/kg 로 주입된 항-TF Mabs 의 누드 마우스에서 U373 종양의 육안적 성장에 대한 효과를 검사하는 것.
마우스 : 60 동형접합 nu/nu 6 주된 NMRI 수컷
군 : 마우스를 무작위로 15 마리씩의 4개의 군으로 할당하고 용액 A, B, 또는 C 로 처리함.
종결 : 〉20%의 무게 감량 또는 심각한 독성의 객관적인 징후시에 동물을 죽인다.
파라미터 : 성장 시기동안 매일 2개의 직교 지름내의 종양 크기를 기록한다.최초에 그리고 주마다 2-3회 체중을 기록한다.
연구 III-2
목적 : 예비 치료적 종양 성장이 확립된 후에, 볼루스 주입 i.v.; 10mg/kg 로 주입된 항-TF Mabs 의 누드 마우스에서 U373 종양의 육안적 성장에 대한 효과를 검사하는 것
마우스 : 60 동형접합체 nu/nu 6 주된 NMRI 수컷
군 : 마우스를 무작위로 15 마리씩의 4개의 군으로 할당하고 용액 A, B, 또는 C 로 처리함. (매일) 6 번의 연속적인 측정이 곰페르트지안 성장을 나타냈을 때, 처리를 개시한다. 이것은 100-200 mm3에 해당한다.
종결 : 종양이 최대 크기가 약 1.0cm3이상으로 자랄때까지, 즉, 종양 지름이 15mm 이하로 또는 콤페르트지안 재성장이 6 번의 연속적인 측정으로 확립되었을때까지, 처리를 계속한다. 종결시에, 조직학 및 면역화학 평가를 위해 각 군으로부터 종양을 절개한다. 〉20%의 무게 감량 또는 심각한 독성의 객관적인 징후시에 동물을 죽인다.
파라미터 : 성장 시기동안 매일, 2개의 직교 지름내의 종양 크기를 기록한다. 최초에 그리고 주마다 2회 체중을 기록한다.
연구 III-3
목적 : 누드 마우스에서 두개내 U373 종양의 성장에 대한 항-TF Mabs 의 효과를 검사하는 것.
마우스 : 60 동형접합체 nu/nu 6 주된 NMRI 수컷.
종양 : 표준 절차에 따라서 오른쪽 대뇌반구의 같은자리로 이식된 U373.
군 : 마우스를 무작위로 15 마리씩의 4개의 군으로 할당하고 용액 A, B, 또는 C 로 처리함.
종결 : 만성 신경학적 손상을 가진 마우스를 안락사시켰다.
데이타 : 생존(즉, 신경학적 손상에 대한 시간)을 Kaplan-Meyer 통계학으로 정량화하였다.
실시예 4(검정 14)
TF 유전자가 녹아웃되고 인간 TF 유전자가 삽입된 마우스에(mTF-KO/hTF-KI 마우스), 0.5ml 마트리겔 플러그를 복부하의 피하로 위치시킨다. 마트리겔에서, b-FGF(5ng)가 통합될 것이고, 1 주일 후에, 겔내의 새로운 명백한 혈관 형성은 헤모글로빈의 함량을 측정하는 것에 의해서 정량화될 것이다(혈관형성). 단백질의 1회 또는 반복된 비경구적 투여후에 인간 항-TF Mabs 의 저해력이(헤모글로빈 함량의 저해%) 평가될 수 있다.
실시예 5(검정 15)
TF 와 FVIIa 의 결합을 방해하는 항체와 TF 와 FX 의 결합을 방해하는 항체를 구별하기 위한 유전자 발현 분석 검정
cDNA 미세배열에서, FVIIa 로 처리된 BHK-TF 세포에서 3개의 유전자의 특이적인 상향 조절이 관찰되었다. 이들 유전자는 Fos 관련 항원 1을 코딩하는 유전자, Fra-1, 단백질의 헬릭스-루프-헬릭스 클래스의 인자를 코딩하는 유전자, Id2, 및세포외 매트릭스 신호화 단백질을 코딩하는 Cyr61 을 포함한다. 다음의 검정은 Fra-1, Id2 또는 Cyr61 의 FVIIa 유도 상향-조절을 방해하는 항-TF Mabs 에 대해 스크리닝하기 위해 설계되었다.
세포 배양
달리 언급되지 않는 한, 시약은 GIBCO-BRL 라이프 테크놀러지로부터 구입한다.
Poulsen L.K. 등, J Biol. Chem. 273,6228-6232,1998 의 기재에 따라 제조된 BHK-TF 세포를 10% FCS, 100IU/ml 페니실린, 및 100㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 덜베코 변형 이글 배지에서 95-100% 융합에 이를때까지 배양하여, 세척하고, FCS 가 결여된 배지에서 추가의 16-18 시간동안 배양한다. 세포를 다시 세척하고 100nM FVIIa 를 함유하는 FCS 결여 배지에 노출시켰다.
노던 블롯 분석용 단편을 클로닝하기 위해, 세포를 다음과 같이 처리했다. BHK-TF 세포를 10% FCS, 100IU/ml 페니실린, 및 100㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 덜베코 변형 이글 배지에서 95-100% 융합에 이를때까지 배양하여, 세척하고, FCS 가 결여된 배지에서 추가의 16-18 시간동안 배양한다. 세포를 다시 세척하고 100nM FVIIa 를 함유하는 FCS 결여 배지에 1시간동안 노출시켰다. CRL2091 세포(ATCC)를 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 및 100㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 이스코베(Iscove) 변형 덜베코 배지에서 95-100% 융합에 이를때까지 배양하였다. 연속적으로, 세포를 16-18시간동안 무혈청으로 하고, 6 시간동안 100nM FVIIa를 함유하는 FBS 결여 배지로 처리하였다. 뮤린 3T3-L1 세포(ATCC)를 10% 소 태아혈청, 100U/ml 페니실린, 및 100㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 덜베코 변형 이글 배지에서 유지시켰다. 세포를 융합에 이를때까지 배양하고, 1μM 덱사메타손 (Sigma), 10㎍/ml 인간 인슐린(Novo Nordisk A/S), 및 1μM BRL49653(Novo Nordisk A/S)를 함유하는 배지로 1시간동안 유도하였다.
노던 블롯 분석을 위한 단편의 클로닝
제조자의 지시에 따라 슈퍼스크립트 II 키트(라이프 테크놀러지)를 사용하여, 덱사메타손, 인슐린 및 BRL49653으로 1시간동안 처리된 3T3-L1 세포에서 분리된 RNA 로부터 역전사 PCR 에 의해서 Fra-1 을 클로닝하였다. 각각, FVIIa 로 1 시간동안 처리된 BHK-TF 세포에서 분리된 RNA 와, FVIIa 로 6시간동안 처리된 CRL2091 세포에서 분리된 RNA 로부터 역전사 PCR 에 의해서 Id2 및 Cyr61 을 클로닝하였다. 업스트림 및 다운스트림 프라이머는; Fra-1의 경우에, 5'-GCGGCCGCCATGTACCGAGACTACGGGGAACCG-3' 및 5'-GCGGCCGCTCACAAAGCCAGGAGTGTAGG-3', Id2 의 경우에, 5'-CAGCATGAAAGCCTTCAGTC-3' 및 5'-CTCTGGTGATGCAGGCTGAC-3', Cyr61 의 경우에, 5'-CGTCACCCTTCTCCACTTGA-3' 및 5'-CTTGGTCTTGCTGCATTTCT-3' 이다. PCR 에 대한 파라미터는 94℃에서 10초동안 1순환 변성시켜서, 65℃에서 15초동안 어닐링하고, 72℃에서 1.5분동안 연장시키고, 94℃에서 10초동안 1순환 변성시켜서, 64℃에서 15초동안 어닐링하고, 72℃에서 1.5분동안 연장시키고, 94℃에서 10초동안 1순환 변성시켜서, 63℃에서 15초동안 어닐링하고, 72℃에서 1.5분동안 연장시키고, 94℃에서 10초동안 1순환 변성시켜서, 62℃에서 15초동안 어닐링하고, 72℃에서 1.5분동안 연장시키고, 94℃에서 10초동안 1순환 변성시켜서, 61℃에서15초동안 어닐링하고, 72℃에서 1.5분동안 연장시키고, 94℃에서 10초동안 1순환 변성시켜서, 60℃에서 15초동안 어닐링하고, 72℃에서 1.5분동안 연장시키고, 94℃에서 10초동안 40순환 변성시켜서, 55℃에서 15초동안 어닐링하고, 72℃에서 1.5분동안 연장시키는 것이다. 모든 단편을 TOPO 2.1(Invitrogen)내로 클로닝하여 메가베이스 시퀀서를 사용하여 서열결정하였다.
노던 블롯 분석
벤더의 지시에 따라서 TriZol 을 사용하여, FVlla, FX, ASIS, 1F44A1 또는 TF85G9 과 함께 인큐베이션된 BHK-TF 세포로부터 모든 RNA 를 분리하였다. 1% 아가로스, 20 mM MOPS, 5 mM NaOAc, 6% 포름알데히드, 및 1 mM EDTA를 함유하는 변성겔에서 20㎍의 RNA 를 크기-분획하여, 모세혈관 블로팅으로 하이본드 N+ 멤브레인(Amersham)에 옮기고, UV 교차결합으로 고정화하였다. 제조자의 지시에 따라서, Fra-1, Id2 또는 Cyr61를 코딩하는 cDNA 를 [α-32P]dATP(Amersham)를 사용하여 프라임 잇 키트(Stratagene)로 표지화하고, 익스프레스 하이비(Clontech)를 사용하여 혼성화하여 결과물을 오토라디오그라피로 가시화하였다.
실시예 6 (검정 16)
Elk 전사 인자/루시페라제 리셉터에 의한 MAPK 검정(PathDetect)
트랜스펙션 하루 전에 T-80 플라스크에 40% 융합이 되도록 HeLa 세포를 접종하였다. 매뉴얼에 기재된 대로 36㎕ FuGene(Roche)을 사용하여 150 ng pFA-Elk1 (Stratagene), 3㎍ pFR-Luc(Stratagene), 3㎍ 인간 TF/pcDNA3 및 3㎍ 마우스 프로테아제 활성된 리셉터 2/pcDNA3,1+ 로 세포를 트랜스펙션시켰다. 다음날, 세포를 VerseneTM(Invitrogen)으로 분리하여 웰당 20,000의 세포밀도로 블랙 96 웰 뷰 플레이트(Packard)에 접종하였다. 세포를 플레이트에 재부착시킨 다음, 배지를 무혈청 덜베코 변형 이글 배지(Invitrogen)당 160 ㎕ 로 교체하고 16 시간동안 인큐베이션하였다.
세포를 20㎕ 무혈청 배지(대조표준), 20㎕ 2,5μM FFR-rFVIIa(대조표준), 20㎕ 2,5μM 항 TF Mab B 또는 20㎕ 2,5μM 항 TF Mab A와 함께 1시간동안 예비인큐베이션하였다. 20㎕ 0,5μM FVIIa 를 웰의 반이 되도록 첨가하고 나머지 반은 배지로 채웠다. 4시간 인큐베이션한 후, 세포를 루시페라제 유전자 검정하였다. 제조업자에 의해서 기재된 대로 세포에 루크라이트(Packard)시약을 첨가하였다. 탑카운트 마이크로플레이트 신틸레이션(Packard)상에서 루시페라제 발현 수준을 해독하였다.
Claims (49)
- 인간 TF 상에 제공된 에피토프와 면역반응하는 분리된 인간 항체.
- 제 1 항에 있어서, 인간 응고인자 VIIa의 인간 TF에 대한 결합을 저해하는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 항체.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 분리된 인간 항체.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 항체인 것을 특징으로 하는 분리된 인간 항체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 Fab 단편인 것을 특징으로 하는 분리된 인간 항체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 F(ab)2단편인 것을 특징으로 하는 분리된 인간 항체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 F(ab')2단편인 것을 특징으로 하는 분리된 인간 항체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일사슬 Fv 단편인 것을 특징으로 하는 분리된 인간 항체.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 10-15내지 10-8M 범위 내의, 인간 TF와 결합하기 위한 Kd값을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 항체.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 10-15내지 10-10M 범위 내의, 인간 TF와 결합하기 위한 Kd값을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 항체.
- 인간 TF 상에 제공된 에피토프와 면역반응하는 인간 항체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물.
- 인간 TF 상에 제공된 에피토프와 면역반응하는, 제 1 항 내지 제 10 항 중어느 한 항에 따르는 인간 항체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물.
- 인간 TF 상에 제공된 에피토프와 면역반응하는 인간 항체를 포함하는 조성물.
- 인간 TF 상에 제공된 에피토프와 면역반응하는 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따르는 인간 항체를 포함하는 조성물.
- 인간 TF 상에 제공된 에피토프와 면역반응하는 인간 항체를 치료학적 유효량으로 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 FVIIa/TF 관련 질환을 치료하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따르는 인간 항체를 치료학적 유효량으로 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 FVIIa/TF 관련 질환을 치료하기 위한 방법.
- a) 인간 TF에 대한 인간 항체를 제조하는 단계; 및b) TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 500 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는FFR-rFVIIa의 IC50값 + 200 pM 보다 낮은, FFR-rFVIIa의 IC50값 + 50 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 미만 같이 (0.1 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 0.1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 40 nM 미만 같이 (검정에서 10 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 20 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를선택하거나, 또는FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험한 후 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하거나, 또는TF를 포함하는 TF ELISA 검정에서 항체를 시험한 후 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함하는 인간 항체 제조방법.
- 제 17 항에 있어서, 인간 TF에 대한 인간 항체가a) 인간 TF로 포유동물을 면역화하는 단계 및b) 면역화된 포유동물에 의하여 생산되는 항체를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 18 항에 있어서, 포유동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 500 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 200 pM 보다 낮은, FFR-rFVIIa의 IC50값 + 50 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 미만 같이 (0.1 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 0.1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 40 nM 미만 같이 (검정에서 10 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 20 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험한 후 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, TF를 포함하는 TF ELISA 검정에서 항체를 시험한 후 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- a) 인간 TF에 대한 인간 항체를 제조하는 단계; 및b) TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 500 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 200 pM 보다 낮은, FFR-rFVIIa의 IC50값 + 50 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 미만 같이 (0.1 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 0.1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 40 nM 미만 같이 (검정에서 10 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 20 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하거나, 또는FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험한 후 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하거나, 또는TF를 포함하는 TF ELISA 검정에서 항체를 시험한 후 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어질 수 있는, 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하여 인간 TF에 대한 인간 응고인자 VIIa의 결합을 저해하는 인간 항체.
- a) 인간 TF로 마우스를 면역화하는 단계.b) 면역화된 마우스로부터 항체생산세포를 분리하고 불사세포를 만들어 인간 항체를 분비하도록 하는 단계,c) 생산된 항체를 포함하는 불사세포로부터 배양배지를 분리하는 단계,d) 용액에 TF를 포함하는 간접 TF ELISA 검정에서 항체를 시험하고 용액에서 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계,e) FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험하고 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하는 단계,f) FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 40 nM 미만 같이 (검정에서 10 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 20 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,g) FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값+ 10 nM 미만 같이 (0.1 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 0.1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,h) TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 500 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 200 pM 보다 낮은, FFR-rFVIIa의 IC50값 + 50 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,i) 선택한 후, 단계 d 내지 h에 따라 선택된 항체를 생산하는 불사세포의 적당한 배양배지에서 배양하는 단계, 및j) 선택된 불사세포의 배양배지로부터 선택된 항체를 분리하는 단계를 포함하는 인간 항체의 제조방법.
- 제 26 항에 있어서, 상기 방법은 고정화 TF를 포함하는 직접 TF ELISA 검정에서 항체를 시험한 후 고정화 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서, 상기 방법은 TF 발현 세포 상에서 FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 미만 같이 (검정에서 1 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 500 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 50 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 전체 세포 TF 결합검정에서 항체를 시험한 후 전체 세포의 세포표면 상에 발현되는 인간 TF에 결합하는 FVIIa와 경쟁적인 인간 항체를 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 바이오센서검정에서 항체를 시험한 후 10 nM 미만과 같은, 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 5 nM 미만의, 바람직하게는 1 nM 미만의, 더 바람직하게는 0.5 nM 미만의, 인간 TF에 대한 결합 Kd를 갖는 인간 항체를 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 MAPK 신호화 검정에서 항체를 시험한 후 MAPK 신호화의 FVIIa-유도 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 에피토프 맵핑 검정에서 항체를 시험한 후 TF 상의 바람직한 에피토프와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 32 항에 있어서, 상기 바람직한 에피토프는 잔기 Trp45, Lys46 및 Tyr94를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불사세포는 하이브리도마 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- a) 인간 TF로 마우스를 면역화하는 단계.b) 면역화된 마우스로부터 항체생산세포를 분리하고 불사세포를 만들어 인간 항체를 분비하도록 하는 단계,c) 생산된 항체를 포함하는 불사세포로부터 배양배지를 분리하는 단계,d) 용액에 TF를 포함하는 간접 TF ELISA 검정에서 항체를 시험하고 용액에서 인간 TF와 면역반응하는 인간 항체를 선택하는 단계,e) FVIIa 경쟁 검정에서 항체를 시험하고 FVIIa 결합과 경쟁적인 인간 항체를 선택하는 단계,f) FVIIa/TF 아미도용해 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 40 nM 미만 같이 (검정에서 10 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 20 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FVIIa/TF 아미도용해 활성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,g) FXa 생성 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 nM 미만 같이 (0.1 nM FVIIa를 사용하여) FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 0.1nM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 FXa 생성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,h) TF-유도 응고체 검정에서 항체를 시험한 후 이 검정에서 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 500 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 1 nM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 200 pM 보다 낮은, FFR-rFVIIa의 IC50값 + 50 pM 미만 같이 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 100 pM 보다 낮은, 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 10 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값 + 5 pM 보다 낮은, 더 바람직하게는 FFR-rFVIIa의 IC50값보다 낮은 IC50값으로 응고체 형성을 저해하는 인간 항체를 선택하는 단계,i) 선택한 후, 단계 d 내지 h에 따라 선택된 항체를 생산하는 불사세포의 적당한 배양배지에서 배양하는 단계, 및j) 선택된 불사세포의 배양배지로부터 선택된 항체를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어질 수 있는, 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하며 인간 TF에 대한 인간 응고인자 VIIa의 결합을 저해하는 인간 항체.
- 제 26 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따르는 방법에 의하여 생산되는, 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하며 인간 TF에 대한 인간 응고인자 VIIa의 결합을 저해하는 인간 항체.
- 인간 TF 상에 제공되는 에피토프와 면역반응하며 인간 TF에 대한 인간 응고인자 VIIa의 결합을 저해하는 인간 항체를 생산하는 세포.
- 제 37 항에 있어서, 상기 세포는 분리된 림포이드 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 상기 세포는 마우스로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 37 항에 있어서, 상기 세포는 하이브리도마 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 40 항에 있어서, 상기 하이브리도마 세포는 항체생산 림포이드 세포와 불사세포를 융합하여 항체생산 하이브리도마 세포를 제공함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 37 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 응고인자 VIIa의 인간 TF에 대한 결합을 저해하는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 37 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 잔기 Trp45, Lys46 및 Tyr94 모두를 포함하는 3차원적 표면과 면역반응하는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 37 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 Fab 단편인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 37 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 F(ab)2단편인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 37 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 F(ab')2단편인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 37 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일사슬 Fv 단편인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 37 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 10-15내지 10-8M 범위 내의, 인간 TF와 결합하기 위한 Kd값을 갖는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 37 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 10-15내지 10-10M 범위 내의, 인간 TF와 결합하기 위한 Kd값을 갖는 것을 특징으로 하는 세포.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20040402 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| PC1203 | Withdrawal of no request for examination | ||
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |