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KR20040002881A - 써코바이러스의 배양 방법 - Google Patents

써코바이러스의 배양 방법 Download PDF

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KR20040002881A
KR20040002881A KR10-2003-7012491A KR20037012491A KR20040002881A KR 20040002881 A KR20040002881 A KR 20040002881A KR 20037012491 A KR20037012491 A KR 20037012491A KR 20040002881 A KR20040002881 A KR 20040002881A
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티쿠수레쉬케이.
윌슨필립
바비욱론에이.
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유니버시티 오브 사스카췌완
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Abstract

본 발명은 써코바이러스, 특히 돼지 써코바이러스의 배양 방법에 관련된다. 본 발명은 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 발현하는 포유동물 세포에서 돼지 써코바이러스를 배양하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

써코바이러스의 배양 방법 {METHODS TO CULTURE CIRCOVIRUS}
식물 및 동물 종에서 발견되고 통상적으로는 써코바이러스라고 지칭되는 바이러스의 과인, 써코비리대 (Circoviridae)는 둥글고, 고리형의 단일 가닥 데옥시리보핵산 (ssDNA)을 함유한 17 내지 23.5 nm의 평균 지름을 갖는 비-엔벨로프성 바이러스 입자로서 특성결정 된다. 써코바이러스의 ssDNA 게놈은 공지된 가장 작은 바이러스 DNA 레플리콘을 나타낸다. WO 99/45956에 개시된 것과 같이, 적어도 6종의 바이러스가 바이러스의 분류를 위한 국제 위원회의 6차 보고서에 따라 과의 구성원으로서 동정되었다 (Lukert, P. D. 등 1995,The Circoviridae, pp. 166-168.InF. A. Murphy, 등 (편저) Virus Taxonomy, Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Arch. Virol. 10 부록).
이 과에 포함된 동물 바이러스는 닭 빈혈증 바이러스 (CAV); 부리 및 깃털 질병 바이러스 (BFDV); 돼지 써코바이러스 (PCV); 및 비둘기 써코바이러스이다.PCV는 원래 돼지 신장 세포 배양물에서 분리되었다. PCV는 세포 핵에서 복제하고 거대한 핵내 봉입체를 생산한다. Murphy 등(1999,Circoviridae357-361, Veterinary Virology, 제 3 판. Academic Press, San Diego)을 참조한다. 현재에는 1형 PCV (PCV1) 및 2형 PCV (PCV2)인, 두 가지 형의 PCV가 승인된다. 연속 돼지 신장 세포주 PK-15 (ATCC CCL31)의 지속성 오염물질로서 분리된 PCV1은, 세포 배양물에서 검출가능한 세포변성 효과를 야기하지 않으며 실험적 주사 후 돼지에서 임상적인 질병을 일으키지 않는다 (Allan G., 1995,Vet. Microbiol.44: 49-64; Tischer, I. 등, 1982,Nature295 : 64-66 ; 및 Tischer, I. 등, 1986,Arch. Virol91 : 271-276 참조). PCV1과는 대조적으로, PCV2는 이유중인 돼지에서 이유후 전신 소모성 증후군 (PMWS)에 연관된다 (Allan G. 등, 1998,Europe. J. Vet. Diagn. Investig10: 3-10; Ellis, J. 등, 1998,Can. Vet. J.39: 44-51 및 Morozov, I. 등, 1998,J. Clin. Microbiol.36: 2535-2541 참조). PCV1에 대한 뉴클레오티드 서열은 Mankertz, A., 등 (1997,J. Virol71 : 2562-2566) 및 Meehan, B. M., 등 (1997,J. Gen. Virol.78 : 221-227)에 개시되고 PCV2에 대한 뉴클레오티드 서열은 Hamel, A. L. 등 (1998,J. Virol.72: 5262-5267); Mankertz, A. 등 (2000,Virus Res.66:65-77) 및 Meehan, B. M. 등 (1998,J. Gen. Virol.79:2171 -2179)에 개시된다. PCV2 균주는 WO 00/01409에 개시되고 European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom에 기탁되며 기탁번호 V97100219; 기탁번호 V9700218; 기탁번호 V97100217; 기탁번호V98011608 ; 및 기탁번호 V98011609를 포함한다. WO 00/77216 또한 PCV2를 개시한다.
오늘날 PCV2에 대하여 공지된 연구는 조직 호모지네이트 아니면 필드 분리물로부터 유래된 배양 바이러스를 사용하였다. Tischer 등 (1987,Arch Virol.96: 3957)은 돼지 신장 세포가 D-글루코사민 처리에 의해 세포 주기에서 S 시기로 들어가도록 자극된다는 것을 보고한다. 그러나, 이 처리는 D-글루코사민이 세포 배양물에 대하여 독성이기 때문에 주의하여 수행되어야만 한다 (Allan 등, (2000).J. Vet. Diagn. Investigation.12: 3-14 참조). 순수한 써코바이러스를 얻기 위해, 예를 들어, PCV1 및 PCV2와 같은 써코바이러스, 및 다른 써코바이러스의 배양 방법에 대한 필요성이 남아있다. 이러한 방법은 특히, PMWS에 대항하는 백신으로서 PCV2 항원의 제제에 유리할 것이다. 본 발명은 이러한 필요성을 해결한다.
모든 특허 및 공보는 그 전문이 여기에 포함된다.
발명의 개시
본 발명은 a) 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 발현하는 포유동물 세포를 얻는 단계 (여기에서, 상기 세포는 포유동물 써코바이러스 복제를 허용한다); b) 상기 포유동물 써코바이러스 게놈, 또는 복제할 수 있는 그것의 부분을, 상기 포유동물 세포 내로 도입하는 단계; 및 c) 상기 포유동물 써코바이러스의 복제에 적합한 조건 하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 포유동물 써코바이러스의 배양 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 방법은 상기 써코바이러스를 상기 배양된 세포로부터 회수하는 단계를 더욱 포함한다.
몇몇 구체예에서, 포유동물 써코바이러스는 돼지 써코바이러스 1 (PCV1) 또는 돼지 써코바이러스 2 (PCV2)와 같은, 돼지 써코바이러스이다. 추가적인 구체예에서, 돼지 써코바이러스는 키메라 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 돼지 기원인 것이다. 또다른 구체예에서, 포유동물 세포는 돼지 망막 세포이다.
다른 구체예에서, 포유동물 아데노바이러스 E1 기능은 인간 아데노바이러스 E1 기능이다. 또다른 구체예에서, 포유동물 아데노바이러스 E1 기능은 돼지 아데노바이러스 El 기능이다. 나아간 구체예에서, E1 기능은 ElA 및/또는 E1B 기능이다. 더욱 나아간 구체예에서, 포유동물 E1 기능을 발현하는 포유동물 세포는 포유동물 E1 유전자 서열로 안정하게 형질전환된다. 다른 구체예에서, 포유동물 E1 유전자 서열은 상기 포유동물 세포에 대하여 이종이다.
본 발명은 또한 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 발현하고 포유동물 써코바이러스 게놈, 또는 복제할 수 있는 그것의 부분을 포함하는 재조합 포유동물 세포를 제공하고, 여기에서 상기 세포는 상기 포유동물 써코바이러스의 복제를 허용한다. 몇몇 구체예에서, 포유동물 써코바이러스는 돼지 써코바이러스 1 (PCV1) 또는 돼지 써코바이러스 2 (PCV2)와 같은 돼지 써코바이러스이다. 더욱 추가적인 구체예에서, 돼지 써코바이러스는 키메라 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 아데노바이러스 E1 기능은 인간 아데노바이러스 E1 기능이다. 다른 구체예에서, E1 기능은 돼지 아데노바이러스 El 기능이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 돼지 기원의 것이다. 나아간 구체예에서, 포유동물 세포는 돼지 망막 세포이다. 더욱 나아간 구체예에서, 포유동물 E1 기능을 발현하는 포유동물 세포는 포유동물 아데노바이러스 E1 유전자 서열로 안정하게 형질전환된다. 다른 구체예에서, 포유동물 E1 유전자 서열은 상기 포유동물 세포에 대하여 이종이다.
본 발명은 또한 a) 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 발현하는 포유동물 세포를 얻는 단계; 및 b) 포유동물 써코바이러스 게놈, 또는 복제할 수 있는 그것의 부분을 상기 포유동물 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 발현하고 포유동물 써코바이러스 게놈을 포함하는 재조합 포유동물 세포의 제조 방법을 제공한다. 추가적인 구체예에서, 방법은 재조합 포유동물 세포를 상기 포유동물 써코바이러스의 복제에 적합한 조건 하에서 배양하는 추가적인 단계를 포함한다. 추가의 구체예에서, 방법은 상기 배양된 세포로부터 상기 써코바이러스를 회수하는 단계를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 포유동물 써코바이러스는 예를 들어 돼지 써코바이러스 1 (PCV1) 또는 돼지 써코바이러스 2 (PCV2)와 같은 돼지 써코바이러스이다. 더욱 추가적인 구체예에서, 돼지 써코바이러스는 키메라 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 구체예에서, 포유동물 세포는 돼지 기원의 것이다. 더욱 추가의 구체예에서, 포유동물 세포는 돼지 망막 세포이다. 추가적인 구체예에서, 아데노바이러스 E1 기능은 인간 아데노바이러스 El 기능 또는 돼지 아데노바이러스 E1 기능이다. 더욱 추가의 구체예에서, 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 발현하는 포유동물 세포는 포유동물 아데노바이러스 E1 유전자 서열로 안정하게 형질전환된다. 다른 구체예에서, 포유동물 E1 유전자 서열은 상기 포유동물 세포에 대하여 이종이다.
본 발명은 써코바이러스의 분야에 관련되며 써코바이러스, 특히 돼지의 써코바이러스의 배양을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 포유동물 아데노바이러스 E1 유전자 기능을 발현하는 포유동물 세포에서 돼지 써코바이러스의 배양 방법에 관련된다.
도 lA-1B는 DNA 트랜스펙션 및 Hirt 방법에 의한 감염된 VIDO RI 세포로부터의 추출에 의해 생성된 PCV2 바이러스의 특성결정 및 역가측정을 제공한다. (A) PCV2-특이적 프라이머 및, PCV2-감염 (레인 1) 및 모의-감염 (레인 2) 세포 유래의 DNA를 사용한 PCR. PCV2 게놈을 함유한 플라스미드는 대조군으로서 사용하였다 (레인 3). GIBCO BRL사의 1-kb DNA 래더는 레인 M에 로딩하였다. (B) PCV2-감염 (레인 1, 3, 및 5) 및 모의-감염 (레인 2,4, 및 6) 세포 유래의 바이러스 DNA를NcoI 및StuI (레인 1 및 2),EcoRI 및StuI (레인 3 및 4), 및EcoRl 및EcoRV (레인 5 및 6)로 효소절단하였다. GIBCO BRL사의 1-kb-플러스 DNA 래더는 레인 M에 로딩하였다.
도 2A-2B는 면역퍼록시다제 염색에 의한 PCV2의 역가측정을 나타낸다. 72 h.p.i.에, 모의- (A) 또는 PCV2- (B) 감염된 VIDO R1 세포를 토끼 항-ORF2 다클론 항체 및 바이오틴화 2차 항체로 인큐베이션 하였다. 아비딘 및 바이오틴화 고추냉이풀 퍼록시다제 복합체를 가한 후, 디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드 (DAB)에 의해 단일층이 발생되었다. 하나의 검은 세포는 하나의 바이러스 입자 감염의 결과이다.
도 3A-3C는 Genbank 기탁 번호 AF086834에서 설명된 것과 같이 돼지 써코바이러스 2 (PCV2)의 뉴클레오티드 서열 (A) 및, ORF 1 (B) 및 ORF 2 (C)에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명은 포유동물 써코바이러스, 특히 돼지 써코바이러스의 배양을 위한 조성물 및 방법에 관련된다. 본 발명은 인간 E1 기능을 발현하는 돼지 세포가 PCV2 바이러스 게놈으로 트랜스펙션될 수 있고 높은 바이러스 역가를 갖는 PCV2 바이러스를 생성했다는 발견에 기초한다. ATCC에 기탁되어 ATCC 기탁 번호 PTA-155를 갖는 VIDO R1 세포주는, 인간 아데노바이러스-5 (HAV5) E1으로 형질전환된 돼지 망막 세포주로서, 세포 주기의 S 시기를 유도하고 전사를 트랜스활성화하는 것으로 나타났다. Shenk, T. (1996). "Adenoviridae:the viruses and their replication"In Fields Virology. 3판. B. N. Fields, D. M. Knipe 및 P. M. Howley (편저) Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, New York, pp. 2111-2148을 참조한다. 여기 실시예 3에 설명된 것과 같이, VIDO R1 세포는 PCV2 게놈으로 트랜스펙션되고 2x107IU/ml로 바이러스를 생성한다.
본 발명의 실행은, 다른 지시가 없으면, 당업계의 범위에 있는 종래의 미생물학, 면역학, 바이러스학, 분자생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용한다. 이들 기술은 문헌에서 완전하게 설명된다. 예를 들어, Maniatis 등,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982) ;DNA Cloning: A Pactical Approach, vols. Ⅰ & Ⅱ (D. Glover, 편저) ;Oligonucleotide Synthesis(N. Gait, 편저 (1984));Nucleic Acid Hybridization(B. Hames & S. Higgins, 편저 (1985)) ;Transcription and Translation(B. Hames & S. Higgins, 편저 (1984)) ;Animal Cell Culture(R. Freshney, 편저 (1986)); Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984); Ausubel, 등,Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley & Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); 및 Sambrook 등,Molecular Cloning : A Laboratory Manual(2판); vols. Ⅰ, Ⅱ & Ⅲ (1989)을 참조한다.
둥글고, 고리형의 단일 가닥 데옥시리보핵산 (ssDNA)을 함유한 평균 지름 17 내지 23.5 nm의 비-엔벨로프성 바이러스 입자를 갖는 써코비리대 과는 상기 바이러스의 분류를 위한 국제 위원회의 6차 보고서에서 설명된다. 집단의 구성원은 돼찌 써코바이러스인 PCV 1 및 PCV2를 포함한다. 몇몇 PCV는 PCV2와 같이, PMWS와 연관된 병원성인 것으로 공지된다.
PCV1에 대한 뉴클레오티드 서열은 Mankertz, A., 등, 1997,J. Virol.71: 2562-2566 및 Meehan, B. M. 등, 1997,J. Gen. Virol.78: 221-227에서 제공된다. PCV2에 대한 뉴클레오티드 서열은 Hamel, A. L. 등, 1998,J. Virol.72: 5262-5267; Mankertz, A. 등, 2000,Virus Res.66: 65-77 및 Meehan, B. M. 등, 1998,J. Gen. Virol.79: 2171-2179에서 제공된다. PCV2의 대표적인 균주는 European Collection of Cell Cultures (Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom)에 기탁되었고 기탁번호 V97100219; 기탁번호 V9700218 ; 기탁번호 V97100217; 기탁번호 V98011608; 및 기탁번호 V98011609를 포함한다. WO 00/77216 또한 PCV2를 개시한다. PCV2 뉴클레오티드 서열은 또한 Hamel 등, (1998),J. Virol.vol. 72,6: 5262-5267 (GenBank AF027217) 및 Morozov 등, (1998),J. Clinical Microb.vol. 36, 9:2535-2541은 물론이고 GenBank AF086834 ; AF086835; 및 AF086836에서 공개되었다. PCV1 및 PCV2에 있어서 공개된 뉴클레오티드 서열의 비교는 80% 이상의 동일성을 나타내지만, 게놈 조직은, DNA의 추정적인 복제 개시점을 갖는 두 개의 가장 거대한 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 배치에서 특히 유사하다.
본 발명은 포유동물 써코바이러스 및 특히, 돼지 써코바이러스 (PCV)의 배양 방법을 포함한다. 본 발명은 여기에서 개시되거나 또는 업계에 공지된 PCV 뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 ORF, 또는 복제할 수 있는 그것의 부분을 포함하는 PCV의 배양 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 여기에 개시되거나 또는 업계에 공지된 것에 대한 유전 코드의 디제네라시와 완전히 다른 PCV 뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 ORF, 또는 복제할 수 있는 그것의 부분을 갖는 PCV의 배양 방법을 포함한다. 본 발명은 뉴클레오티드 서열의 기능 또는 균주 특이성을 변화시키지 않는 PCV 뉴클레오티드 서열 변체, 또는 그것의 ORF, 또는 복제할 수 있는 그것의 부분을 포함하는 PCV의 배양 방법을 더욱 포함한다. 본 발명은 또한 중간 내지 고 긴축 조건 하에서 여기에서 개시된 서열에 혼성화할 수 있는 PCV 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PCV의 배양 방법, 및 결손 또는 지점 돌연변이와 같은, 여기에서 개시되거나 또는 업계에 공지된 PCV 뉴클레오티드 서열의 돌연변이, 또는 그것의 ORF, 또는 복제할 수 있는 그것의 부분을 포함하는 PCV의 배양 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PCV의 배양 방법을 포함한다. 본 발명은 예를 들어, 파보바이러스를 포함하는 병원성 돼지 바이러스와 같은 다른 병원성 바이러스 유래의 뉴클레오티드 서열에 융합된, 돼지 써코바이러스 유래의 뉴클레오티드서열과 같은 키메라 써코바이러스 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PCV의 배양 방법을 포함한다.
여기에서 사용될 때, 써코바이러스 또는 포유동물 세포에 관하여, 이종 뉴클레오티드 서열이 각각 써코바이러스 게놈의 부분으로서 써코바이러스 서열에 정상적으로 결합되지 않는 것 또는 포유동물 세포에 정상적으로 결합되지 않는 것이다. 이종 뉴클레오티드 서열은 합성 서열을 포함한다. 혼성화 반응은 상이한 "긴축" 조건 하에서 수행될 수 있다. 혼성화 반응의 긴축을 증가시키는 조건은 업계에 널리 공지되며 공개된다. 예를 들어, Sambrook 등의 저서 (1989) 페이지 7.52를 참조한다. 관련된 조건의 예는 (긴축이 증가하는 순서로) 25℃, 37℃, 50℃ 및 68℃의 인큐베이션 온도; 10 X SSC, 6 X SSC, 1 X SSC, 0.1 X SSC 농도의 완충액 (여기에서 SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트르산 완충액이다) 및 다른 완충액 시스템을 이용한 등가물; 0%, 25%, 50%, 및 75% 농도의 포름아미드; 5분 내지 24시간의 인큐베이션 시간; 1, 2 이상의 세척 단계; 1, 2, 또는 15분의 세척시간; 및 6 X SSC, 1 X SSC, 0.1 X SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함한다. 긴축 혼성화 조건의 예시적 세트는 68℃ 및 0.1 X SSC이다.
PCV 게놈은 대략 8 내지 35kD 정도의 범위를 갖는 몇몇 폴리펩티드 서열을 암호화한다. 예를 들어, MacVector® (Oxford Molecular Group Inc., MD 21030)와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 돼지 써코바이러스에 대한 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 결정하는 것은 일상적인 것으로 생각된다. 가장 큰 ORF인, 두가지 형의 PCV 중 ORF1은, (클러스탈 프로그램으로 측정될 때) 85%의 동일성을 갖는 작은 변이만을 나타내고 PCV1에서 Rep 단백질이 되는 것으로 예증되었다 (Mankertz, A. 등, 1998,J. Gen. Virol.79: 381-384). 이론에 제한되지 않고, PCV1 및 PCV2의 ORF2 서열에서 나타난 더 높은 비율의 변이 (약 65% 동일성)는 PCV의 타입-특이적 특징이 각 ORF2 단백질에 의해 결정될 수 있다는 것을 제시한다. 몇몇 PCV 타입-특이적 에피토프는 PCV2 ORF2 서열 상에서 맵핑되었다. Mahe, D. 등, 2000,J. Gen. Virol.81: 1815-24를 참조한다. 또다른 최근의 연구에서, PCV2 ORF2는 ORF2 발현 재조합 배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 바이러스 캡시드-유사 입자를 형성할 수 있는 주요 구성 단백질로서 확인되었다. Nawagitgul, P. 등, 2000,J. Gen. Virol.81: 2281- 2287을 참조한다.
여기에서 개시된 본 발명의 몇몇 예시적 구체예에서, PCV 게놈 또는 그것의 ORF, 또는 항원 구역과 같은 그것의 부분을 포함하는 재조합 벡터가 플라스미드 및 PCV 게놈 간의 시험관내 재조합에 의해 구성된다. 몇몇 구체예에서, PCV 게놈은 PCV2 게놈이다. 다른 구체예에서, PCV 게놈 또는 그것의 ORF, 또는 항원 구역과 같은 그것의 부분을 포함하는 재조합 벡터는 생체내 재조합에 의해 구성된다. 생체내 재조합 방법은 업계에 공지되며 예를 들어 Chartier, 등 (1996,J. Virol.70: 4805-4810)에 개시된 방법을 포함한다. 써코바이러스 게놈을 구성하기 위한 벡터는 예를 들어, 생산될 클로닝된 써코바이러스 뉴클레오티드 서열의 다중 카피를 허용하는 박테리아 플라스미드를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 플라스미드는 재조합에 적당한 숙주 세포 내로 공-트랜스펙션된다. 재조합에 적당한 숙주 세포는 PCV 게놈 및 PCV 서열을 함유하는 플라스미드 간의 재조합, 또는 PCV 서열을 각각함유하는 둘 이상의 플라스미드 간의 재조합을 지지할 어떠한 세포라도 포함한다. 재조합은 일반적으로, 예를 들어 E.coli와 같은 원핵 세포에서 수행되지만, 반면 써코바이러스의 생성은 예를 들어, 돼지 세포, 특히 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 발현할 수 있는 돼지 세포와 같은, PCV 복제를 허용하는 포유동물 세포에서 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명은 써코바이러스의 복제를 허용하는, 특히 PCV1 및 PCV2와 같은, PCV의 복제를 허용하는 어떤 포유동물 숙주 세포의 사용을 포함한다. Allan 등 (1995,Veterinary Microbiology44: 49-64)은 PCV가 돼지 및 소의 단핵구/대식세포 배양물에서 복제한다는 것을 보고한다. Tischer 등 (1987,Arch. Virol.96: 39-57)은 PCV가 세포 배양물에서의 복제에 있어서 활성적으로 분열하는 세포를 요구한다고 공지된다는 것을 보고한다. PCV의 복제에 유용한 세포 또는 세포주의 예는 E1 기능을 포함하고 PCV 복제를 허용하는 포유동물 세포를 포함하는데, 이것은 아데노바이러스 E1 기능을 발현하는 돼지 세포 (예를 들어, 돼지 단핵구/대식세포 및 돼지 망막 세포)를 포함한다. 여기에서 개시된 예시적인 구체예에서, 인간 아데노바이러스 E1 기능을 발현하는 돼지 망막 세포는 PCV2의 복제를 허용하는 것으로 나타나고 2xl07IU/ml로 바이러스를 생성하는 것으로 나타난다. 돼지 세포주는 예를 들어, American Type Tissue Collection (ATCC)과 같은 공공 공급원으로부터 이용가능하다. 박테리아 세포 배양물의 성장은 물론이고, 진핵 세포 및 포유동물 세포주의 배양 및 유지는 당업자에게 주지된 방법이다.
본 발명은 포유동물 써코바이러스, 특히 돼지 써코바이러스를 포유동물 아데노바이러스 E1 유전자 서열로 트랜스펙션된 포유동물 숙주 세포에서 배양하는 방법을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 포유동물 세포는 아데노바이러스 E1 유전자 서열로 안정하게 형질전환된다. 몇몇 구체예에서, E1 유전자 서열은 포유동물 세포의 게놈 내로 포함된다. 다른 구체예에서, E1 유전자 서열은 복제 플라스미드 상에 존재한다. 또다른 구체예에서, E1 유전자 서열은 포유동물 세포에 대하여 이종이다. 여기에서 개시된 예시적인 구체예에서, 돼지 포유동물 세포는 인간 아데노바이러스 5 E1 유전자 서열로 형질전환된다. 본 발명은 E1 기능을 발현하는 포유동물 세포 또는 세포주가 써코바이러스, 특히 예를 들어 돼지 써코바이러스 1 또는 돼지 써코바이러스 2와 같은 돼지 써코바이러스의 복제를 허용하는 한, E1 기능을 발현하는 어떠한 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주의 사용을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 포유동물 세포는 돼지 세포 또는 세포주이다. 본 발명은 포유동물 E1 기능을 발현하는 숙주 세포가 써코바이러스, 특히 예를 들어, 돼지 써코바이러스 1 또는 돼지 써코바이러스 2와 같은 PCV의 복제를 허용하는 한, 어떠한 포유동물 E1 기능의 사용을 포함한다. 포유동물 아데노바이러스 게놈은 업계에 공지되며 예를 들어, 소 아데노바이러스 3 (BAV3)의 뉴클레오티드 서열, 게놈 조직, 및 전사 맵을 개시한 Reddy 등 (1998,Journal of Virology,72: 1394); 및 PAV4의 E1 구역을 개시한 Kleiboeker (1995,Virus Res.36: 259-268)에 개시된다. 본 발명은 Ad2, Ad5, Adl2, 및 Ad40과 같은, 인간 아데노바이러스의 다양한 혈청형 중 어떤 것으로부터 유래된 E1 기능을 포함한다. 여기 실시예 1에서 개시된 예시적인 구체예에서, E1 기능은 인간 Ad5 E1 기능이다. 인간 ElA 유전자는 바이러스 감염 직후 (0-2 시간) 및 어떤 다른 바이러스 유전자 전에 발현된다 (Flint (1982)Biochem. Biophys. Acta651: 175-208; Flint (1986)Advances Virus Research31: 169-228 ; Grand (1987)Biochem. J.241: 25-38). Ad5 ElA의 전사 시작 부위는 뉴클레오티드 498이고 E1A 단백질의 ATG 시작 부위는 바이러스 게놈에 있는 뉴클레오티드 560이다. E1B 단백질은 트랜스로 기능하고 핵으로부터 세포질로 후기 mRNA의 운반에 필요하다. Ad5의 E1B 프로모터는 Spl에 대한 단일 고-친화도 인식 부위 및 TATA 박스로 구성된다. 특히, 인간 아데노바이러스 5 E1A 및 E1B 유전자 서열은 Chroboezek, J. 등 (1992,Virology.186: 280-285)에서 제공된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 505-4034에 위치한다. 여기 실시예에 개시된 예시적 구체예에서, 포유동물 숙주 세포는 인간 아데노바이러스 5 E1 유전자 서열로 트랜스펙션된 돼지 숙주 세포이다.
PCV 게놈은 분자 생물학 및 생명공학의 표준 기술을 이용하여, PCV 바이러스 입자로부터 분리될 수 있고, 또는 플라스미드 내로 삽입된 PCV 게놈을 포함할 수 있다. PCR로써 Strategene 사의 벡터 pBluescript Ⅱ KS (+) 내로 전장의 PCV2 게놈을 클로닝하는 것은 Liu, 등 (2000,J. Clin. Microbiol.vol 38: 3474-3477)에서 설명된다. 전장의 PCV2 게놈 DNA는SacII 효소절단 후 결과 플라스미드로부터 방출될 수 있다.
복제 허용 숙주 세포 내로 써코바이러스 뉴클레오티드 서열의 도입은 업계에 공지된 어떤 방법에 의해 성취될 수 있고, 이 방법은 미세주입, 일렉트로포레이션,CaP04침전법, DEAE-덱스트란, 리포솜, 입자 충격 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 트랜스펙션 및 형질전환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. VIDO R1 세포 내로 PCV2 뉴클레오티드 서열을 트랜스펙션하는 예시적인 방법은 여기 실시예 3에 개시된다.
박테리아 세포와 같은 원핵 세포, 및 아데노바이러스 E1 기능을 발현하는 포유동물 숙주 세포와 같은 진핵 세포의 배양 방법은 당업자에게 평이한 것으로 생각된다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하지만 이를 제한하는 것으로 제공되는 것은 아니다. 여기에 개시된 모든 참고문헌 및 특허 공보는 그 전문이 참고문헌으로서 여기에 포함된다.
실시예 1: 인간 아데노바이러스 E1 유전자 서열로 트랜스펙션된 돼지 망막 세포의 제조 (VIDO RI 세포)
돼지 배아 망막 세포의 1차 배양물은 인산 칼슘 기술로써 10 ㎍의 플라스미드 pTG 4671 (Transgene, Strasbourg, France)로 트랜스펙션 하였다. pTG 4671 플라스미드는 선별가능한 마커로서의 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라제 유전자와 함께, HAV-5의 전체 ElA 및 E1B 서열 (nts 505-4034)을 포함한다. 이 플라스미드에서, El 구역은 마우스 포스포글리세레이트 키나제 유전자 유래의 구성 프로모터의 제어 하에 있고, 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라제 유전자는 구성 SV40 초기 프로모터에의해 제어된다. 형질전환된 세포는 7 ㎍/ml 퓨로마이신을 함유한 배지에서 3회 계대하여 선별하고, 단일 촛점으로부터 이것의 형태학에서의 변화 (즉, 접촉 저해의 손실)에 기초하여 동정하고, 단일 세포를 클로닝 하였다. 확립된 세포주는 우선 HAV-5의 E1 결손 돌연변이체의 성장을 지지하는 능력에 대하여 시험하였다. 그 다음 세포주는 PCR로써 게놈 내 E1 서열의 존재에 대하여, 웨스턴 블롯으로써 ElA 및 E1B 단백질의 발현에 대하여, 그리고 세포 배양 조건 하에서의 배가시간에 대하여 더욱 연구하였다. E1 서열을 검출하고, 면역침전법으로써 ElA 및 E1B 단백질의 생성을 설명하였다. 친세포주와 비교할 때, 배가시간은 더 짧았다.
El 발현의 안정성을 평가하기 위하여, VIDO RI 세포를 50회 이상의 계대를 통해 배양하였고(매주 2회씩 1:3으로 분할) El-결손 HAV-5의 복제를 지지하는 능력에 대하여 시험하였다. 규칙적인 간격에서 E1A 및 E1B 단백질의 발현 또한 웨스턴 블롯으로써 모니터링하였다. 결과는 VIDO R1 세포주가 E1-결손 바이러스의 성장을 지지하는 능력을 보유하고 배양물에서 50회 이상의 계대 도중에 유사한 수준의 E1 단백질을 발현한다는 것을 나타낸다. 그러므로, VIDO Rl은 확립된 세포주인 것으로 생각할 수 있다. VIDO Rl 세포주는 American Type Culture collection (ATCC)에 기탁하였고 ATCC 기탁번호 PTA-155를 갖는다.
실시예 2
실시예 2는 전장 PCV2 게놈의 분자적 클로닝의 설명을 제공한다.
우선, PMWS를 갖는 새끼돼지로부터 추출된 전체 DNA로부터 PCR을 이용하여 PCV2 DNA를 증폭하였다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의한 벡터 pBluescript IIKS (+) (Stratagene)내로 전장의 PCV2 게놈 DNA를 클로닝하는 것은 Liu 등 (2000).J. Clin. Microbiol.38: 3474-3477)이 설명하였다. PCV2 서열은 GenBank (기탁번호 AF086834)에 기탁하였다. 전장 PCV2 게놈 DNA는SacⅡ 효소절단 후의 결과 플라스미드로부터 방출된다.
실시예 3
실시예 3은 실시예 2에서 구성한 것과 같은 PCV2 게놈을 함유한 플라스미드로, 실시예 1에서 설명한 것과 같은 VIDO R1 세포의 트랜스펙션을 설명한다.
재료 및 방법
세포 배양
실시예 1에서 설명한 것과 같은 돼지 태아 망막 세포주인 VIDO R1, 및 Vero 세포 (ATCC)는 10% 또는 5% 가열-비활성화 소 태아 혈청을 보충한 Eagles 기재 MEM 배지에서 5% C02및 37℃로 각각 유지하였다.
트랜스펙션 및 감염
6-웰 디쉬에서 성장한 VIDO R1 세포의 단일층은 클로닝된 PCV2 DNA로 제조사의 권장 (GIBCO BRL)에 따라 리포펙션 (Lipofectin)을 이용하여 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션에 앞서, PCV2 전장 게놈은 SacⅡ로 효소절단하여 플라스미드로부터 방출하였다 (Liu, Q., 등, 2000,J. Clin. Microbiol. 38: 3474-3477). 감염을 위하여, 트랜스펙션한 VIDO Rl 세포는 동결 (-70℃) 및 해동 (37℃)를 세 주기 수행하였다. 그 다음 가수분해물은 원심분리로 정제하고 신선한 VIDO R1 세포를 감염시키는데에 사용하였다. 공개된 보고에서, 무-PCV1 돼지 신장 세포주는 PCV2 바이러스를 배양하는데에 사용한다. 세포 주기에서 S 시기로의 돌입을 자극하기 위하여, 돼지 신장 세포는 항상 D-글루코사민으로 처리한다 (Tischer 등, (1987).Arch Virol.96 : 39-57 참조). 그러나, D-글루코사민은 세포 배양에 있어서 독성이므로 주의깊게 처리를 수행하여야 한다 (Allan 등, (2000).J. Vet. Diagn. Investigation.12: 3-14). 반대로, 본 연구에 사용한 VIDO R1 세포주는 S 시기로 유도할 수 있는 HAV5-E1으로 형질전환했기 때문에, D-글루코사민 처리가 필요없다.
실시예 4
바이러스 정제 및 역가측정
PCV2 바이러스의 정제를 위하여, PCV2-감염 VIDO R1 세포는 37℃에서 45분 동안 인산-완충 식염수 (PBS) 중 0.5% Triton X-114로 인큐베이션 한 후 Freon 113 (1,1,2-트리클로로-트리플루오로에탄)으로 추출한다. 2000g에서 15분동안 원심분리하여 세포 데브리 및 막을 정제하였다. 상청액 중 바이러스는 20% 수크로스 쿠션을 통해 3 시간동안 35000g에서 펠릿화 하였다. 바이러스 펠릿은 PBS에 현탁하고 -70℃에서 저장하였다. 정량 ORF2 단백질 면역-퍼록시다제 염색으로 감염 유닛 (IU)으로서의 바이러스 역가를 측정하였다. 본 목적으로, 12-웰 디쉬 중 세포 단일층은 바이러스의 연속적인 희석물로 감염시켰다. 바이러스의 흡수 1시간 후, 세포를 세척하고 2% FBS 및 0.7% 아가로스를 함유한 MEM으로 덮었다. 감염 후 (p.i.) 3일에, 아가로스 덮개를 제거한 후 -20℃에서 20분동안 메탄올/아세톤 (부피로 1 : 1)으로 세포를 고정하고 삼투하였다. 실온에서 1시간동안 1% 소 혈청 알부민으로 차단한 후, 토끼 항-ORF2 혈청으로 세포를 인큐베이션 하였다 (Liu 등, 2001,Protein Expression and Purification.21: 115-120). 2 시간의 인큐베이션 후, PBS로 플레이트를 세척한 다음 VECTASTAIN Elite ABC 키트 (Vector Laboratories)를 사용하여 프로세싱하였다. The reaction was developed with 3,3'디아미노벤지딘 (DAB) 테트라히드로클로라이드로 반응을 발생시키고 현미경하에서 관찰하였다. 양성 염색된 세포를 계수함으로써, IU로서 바이러스 역가를 표현하였는데, 1 IU는 하나의 양성으로 염색된 세포/3 d.p.i.에서의 촛점으로 정의된다.
바이러스 DNA 추출 및 특성결정
Hirt (1967,J. Mol. Biol.26: 365-369)의 방법으로써 PCV2-감염 VIDO R1 세포 단일층으로부터 바이러스 DNA를 추출하였다. 그 다음 Liu 등 (2000).J. Clin. Microbiol.38: 3474-3477)에 설명된 것과 같이 제한효소 분석 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로써 바이러스 DNA를 특성결정하였다.
감염된 세포로부터 추출한 DNA 주형 및 PCV2-특이적 프라이머를 사용한 PCR은 특정 크기의 생성물을 증폭하였고, 반면 대조군인 감염되지 않은 세포로부터는 어떤 DNA도 증폭되지 않았다. 기대한 제한효소 패턴과 일치하여,NcoI 및StuI으로의 바이러스 DNA 효소절단은 크기로 각각 1291bp 및 477bp의 두 단편을 나타냈고;EcoRI 및StuI으로의 효소절단은 크기로 각각 1492bp 및 276bp의 두 단편을 생산했고;EcoRI 및EcoRV로의 효소절단은 크기로 각각 1094bp 및 674bp의 두 단편을 생성했다.
데이터는 PCV2 바이러스를 획득했음을 가리킨다. 면역염색 검정을 이용하고 양성 염색 세포를 계수함으로써, 본 제제의 바이러스 역가는 2x107IU/ml인 것으로 결정하였다.

Claims (34)

  1. a) 포유동물 써코바이러스 복제를 허용하고, 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 발현하는 포유동물 세포를 얻는 단계;
    b) 포유동물 써코바이러스 게놈, 또는 복제할 수 있는 그것의 부분을 상기 포유동물 세포 내로 도입하는 단계; 및
    c) 포유동물 써코바이러스의 복제에 적합한 조건 하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 포유동물 써코바이러스의 배양 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 배양한 세포로부터 상기 써코바이러스를 회수하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물 써코바이러스는 돼지 써코바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 돼지 써코바이러스는 2형 돼지 써코바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 돼지 써코바이러스는 1형 돼지 써코바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 돼지 기원인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 돼지 망막 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물 아데노바이러스 E1 기능은 인간 아데노바이러스 E1 기능인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물 아데노바이러스 E1 기능은 돼지 아데노바이러스 E1 기능인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 발현하는 상기 포유동물 세포는 포유동물 아데노바이러스 E1 유전자 서열로 안정하게 형질전환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 E1 유전자 서열은 인간 아데노바이러스 E1 유전자 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 포유동물 아데노바이러스 E1 유전자 서열은 상기 포유동물 세포에 대하여 이종인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 E1 기능은 E1A 및/또는 E1B 기능인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 3 항에 있어서, 상기 돼지 써코바이러스는 키메라 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 발현하고 돼지 써코바이러스 게놈, 또는 복제할 수 있는 그것의 부분을 포함하는 재조합 포유동물 세포로서, 상기 세포는 상기 돼지 써코바이러스의 복제를 허용하는 것을 특징으로 하는 재조합 포유동물 세포.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 E1 기능은 인간 아데노바이러스 E1 기능인 것을 특징으로 하는 재조합 포유동물 세포.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 E1 기능은 돼지 아데노바이러스 E1 기능인 것을 특징으로 하는 재조합 포유동물 세포.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 세포는 돼지 기원인 것을 특징으로 하는 재조합 포유동물 세포.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 세포는 돼지 망막 세포인 것을 특징으로 하는 재조합 포유동물 세포.
  20. 제 15 항에 있어서, 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 발현하는 포유동물 세포는 포유동물 아데노바이러스 E1 유전자 서열로 안정하게 형질전환되는 것을 특징으로 하는 재조합 포유동물 세포.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 E1 유전자 서열은 인간 아데노바이러스 E1 유전자 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 포유동물 세포.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 포유동물 아데노바이러스 E1 유전자 서열은 상기 포유동물 세포에 대하여 이종인 것을 특징으로 하는 재조합 포유동물 세포.
  23. a) 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 발현하는 포유동물 세포를 얻는 단계; 및 b) 돼지 써코바이러스 게놈, 또는 복제할 수 있는 그것의 부분을 포유동물 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 포유동물 아데노바이러스 E1 기능 및 돼지 써코바이러스 게놈을 포함하는 재조합 포유동물 세포의 제조 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 돼지 써코바이러스의 복제에 적합한 조건 하에서 상기 재조합 포유동물 세포를 배양하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 배양한 세포로부터 상기 써코바이러스를 회수하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, 상기 돼지 써코바이러스는 2형 돼지 써코바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 23 항에 있어서, 상기 돼지 써코바이러스는 1형 돼지 써코바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 23 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 돼지 기원인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 돼지 망막 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 23 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 E1 기능은 인간 아데노바이러스 E1 기능인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 23 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 E1 기능은 돼지 아데노바이러스 E1 기능인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 23 항에 있어서, 상기 돼지 써코바이러스는 키메라 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 23 항에 있어서, 포유동물 아데노바이러스 E1 기능을 포함하는 상기 포유동물 세포는 포유동물 아데노바이러스 E1 유전자 서열로 안정하게 형질전환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 포유동물 아데노바이러스 E1 유전자 서열은 상기 포유동물 세포에 대하여 이종인 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040062775A1 (en) * 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
PT1379671E (pt) 2001-03-27 2009-07-20 Univ Saskatchewan Métodos de cultura de circovírus
US20030096377A1 (en) * 2001-06-28 2003-05-22 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7276353B2 (en) * 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
PT2371383E (pt) * 2005-12-29 2015-11-24 Boehringer Ingelheim Vetmed Utilização de uma composição imunogénica de pcv2 para atenuar os sintomas clínicos em porcos
MX365868B (es) * 2005-12-29 2019-06-18 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc Composiciones inmunogenicas de pcv2 multivalentes y metodos de producir composiciones de este tipo.
EP2859900A1 (en) 2006-12-11 2015-04-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
HUE044410T2 (hu) * 2006-12-15 2019-10-28 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Egydózisú anti-PCV2 sertés vakcina
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US8518696B2 (en) * 2007-05-11 2013-08-27 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Production of homogeneous cell line highly permissive to porcine circovirus type 2 (PCV2) infection
WO2008151215A1 (en) * 2007-06-04 2008-12-11 Merial Limited Production of porcine circovirus proteins in plants
US7829274B2 (en) * 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
KR20100094587A (ko) * 2007-12-21 2010-08-26 와이어쓰 엘엘씨 돼지 써코바이러스에 대해 돼지를 면역시키는 방법 및 조성물
CN101932336B (zh) * 2007-12-31 2014-07-09 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 有外来氨基酸插入的pcv2 orf2病毒样颗粒
BRPI0907438A2 (pt) * 2008-01-23 2015-08-04 Boehringer Ingelheim Vetmed Composições imunogênicas para mycoplasma hyopneumoniae e pcv2 e métodos para produzir tais composições
NZ588639A (en) * 2008-04-16 2012-10-26 Virginia Tech Intell Prop CHIMERIC PORCINE CIRCOVIRUS PCV2Gen-1Rep AND USES THEREOF
AR078253A1 (es) * 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad
WO2011091389A2 (en) * 2010-01-25 2011-07-28 Blood Systems, Inc. Cyclovirus and method of use
CA2925281C (en) 2013-09-25 2022-05-03 Zoetis Services Llc Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use
ES2778425T3 (es) 2013-10-02 2020-08-10 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Variante de la proteína ORF2 del PCV2 y partículas similares a virus compuestas por esta
EP3294876A1 (en) 2015-05-14 2018-03-21 Merial, Inc. Method for porcine circovirus production and pcv2 vaccines
WO2018071511A1 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 Orion Labs Group communication forwarding to a secondary service
CN114934020B (zh) * 2022-01-30 2024-02-13 山东省滨州畜牧兽医研究院 猪视网膜上皮细胞系及其建立方法和应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070108418A (ko) * 1996-10-23 2007-11-09 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 면역 치료법 및 개량 백신
AUPO856097A0 (en) 1997-08-14 1997-09-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Vector
US6391314B1 (en) 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US7192594B2 (en) 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
UA78180C2 (uk) 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
US6517843B1 (en) * 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
FR2772047B1 (fr) 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US6287856B1 (en) 1998-03-13 2001-09-11 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vaccines against circovirus infections
US6492343B1 (en) 1998-04-15 2002-12-10 University Of Saskatchewan Porcine adenovirus type 3 genome
ATE451378T1 (de) 1998-09-08 2009-12-15 Brij P Giri Chemolumineszente 1,2-dioxetane
WO2000026395A2 (en) 1998-11-02 2000-05-11 University Of Saskatchewan Bovine cells expressing adenovirus essential functions for propagation of recombinant adenoviral vectors
FR2789695B1 (fr) 1999-02-11 2003-03-07 Merial Sas Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
US6943152B1 (en) 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
CA2413265A1 (en) 2000-05-03 2001-11-08 University Of Guelph Porcine adenovirus type 5 vector and vaccine
PT1379671E (pt) * 2001-03-27 2009-07-20 Univ Saskatchewan Métodos de cultura de circovírus

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002077210A2 (en) 2002-10-03
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Prasetyoa et al. Mutation of the first ATG ORF-3 of Chicken Anemia Virus into ACG completely abolish the apoptin production

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