KR20030074643A - 정신분열증-관련된 전압-개폐 이온 채널 유전자와 단백질 - Google Patents
정신분열증-관련된 전압-개폐 이온 채널 유전자와 단백질 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20030074643A KR20030074643A KR10-2003-7007511A KR20037007511A KR20030074643A KR 20030074643 A KR20030074643 A KR 20030074643A KR 20037007511 A KR20037007511 A KR 20037007511A KR 20030074643 A KR20030074643 A KR 20030074643A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- canion
- polypeptide
- allele
- polynucleotide
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 160
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 50
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 title abstract description 32
- 101000962322 Homo sapiens Sodium leak channel NALCN Proteins 0.000 claims abstract description 359
- 102100039242 Sodium leak channel NALCN Human genes 0.000 claims abstract description 279
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 235
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 232
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 230
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 347
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 345
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 345
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 293
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 240
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 240
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 117
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 112
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 109
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 95
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 83
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 83
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 66
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 60
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 57
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 44
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 43
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 42
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 40
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 27
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 25
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 16
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 7
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 abstract description 456
- 208000020925 Bipolar disease Diseases 0.000 abstract description 24
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 17
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 abstract 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 272
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 149
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 141
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 119
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 114
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 111
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 111
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 106
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 90
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 78
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 63
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 57
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 57
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 56
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 51
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 51
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 48
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 47
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 47
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 43
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 39
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 33
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 29
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 26
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 26
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 25
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 22
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 21
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 20
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 19
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 19
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 19
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 18
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 18
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 17
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 16
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 14
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 14
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 101150036876 cre gene Proteins 0.000 description 13
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 13
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 12
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 12
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 12
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 11
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 11
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 10
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000003491 array Methods 0.000 description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 7
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 7
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 6
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 6
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 6
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 5
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 5
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 5
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 5
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 5
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 4
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 4
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 4
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 4
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 208000027753 pain disease Diseases 0.000 description 4
- 208000022821 personality disease Diseases 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101710122931 Replication and transcription activator Proteins 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010052164 Sodium Channels Proteins 0.000 description 3
- 102000018674 Sodium Channels Human genes 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001314 paroxysmal effect Effects 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 2
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 2
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 2
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 2
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108091005462 Cation channels Proteins 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000026331 Disruptive, Impulse Control, and Conduct disease Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030814 Eating disease Diseases 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 208000019454 Feeding and Eating disease Diseases 0.000 description 2
- 101001096074 Homo sapiens Regenerating islet-derived protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 208000030990 Impulse-control disease Diseases 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 206010026749 Mania Diseases 0.000 description 2
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 2
- 108091092919 Minisatellite Proteins 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 208000019022 Mood disease Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037889 Regenerating islet-derived protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000027520 Somatoform disease Diseases 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 201000007930 alcohol dependence Diseases 0.000 description 2
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 2
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 2
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 2
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 2
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000002801 charged material Substances 0.000 description 2
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000005016 dendritic process Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- -1 dinitrophenyl Chemical group 0.000 description 2
- 235000014632 disordered eating Nutrition 0.000 description 2
- 206010013663 drug dependence Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 102000040854 high voltage-gated calcium channel activity Human genes 0.000 description 2
- 108091092197 high voltage-gated calcium channel activity Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 208000029308 periodic paralysis Diseases 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- 208000028280 polygenic inheritance Diseases 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 230000000698 schizophrenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 208000011317 telomere syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- CZIHNRWJTSTCEX-UHFFFAOYSA-N 2 Acetylaminofluorene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=C(NC(=O)C)C=C3CC2=C1 CZIHNRWJTSTCEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N 2-{[3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy}-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound OCC1OC(CO)(OC2OC(CO)C(O)C(O)C2O)C(O)C1O CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100238293 Arabidopsis thaliana MOR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108700040618 BRCA1 Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010008025 Cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 1
- 102000034573 Channels Human genes 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 206010008748 Chorea Diseases 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000713575 Homo sapiens Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 1
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 208000016285 Movement disease Diseases 0.000 description 1
- 108700005084 Multigene Family Proteins 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 206010033892 Paraplegia Diseases 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100029796 Protein S100-A10 Human genes 0.000 description 1
- 101710110950 Protein S100-A10 Proteins 0.000 description 1
- 102000009516 Protein Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010009341 Protein Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108020004412 RNA 3' Polyadenylation Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 101100460161 Streptomyces fradiae neoD gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102100036790 Tubulin beta-3 chain Human genes 0.000 description 1
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000795442 Uranoscopus chinensis Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N [amino(ethoxy)phosphanyl]oxyethane Chemical compound CCOP(N)OCC SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 1
- 238000012093 association test Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000000480 calcium channel blocker Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 229940121657 clinical drug Drugs 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 101150056310 gem1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000008303 genetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007674 genetic toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 208000020673 hypertrichosis-acromegaloid facial appearance syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012804 iterative process Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N levan Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](CO)(CO[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@](O)(CO)O2)O)O1 AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000001690 micro-dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000010082 neurochemical mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003176 neuroleptic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000701 neuroleptic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000005257 nucleotidylation Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 208000013667 paroxysmal dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 210000000449 purkinje cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 102220047090 rs6152 Human genes 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002416 scanning tunnelling spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003195 sodium channel blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 108010040614 terminase Proteins 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본원 발명은 전압-개폐 이온 채널 단백질인 CanIon의 게놈 DNA, cDNA, 폴리펩티드 서열에 관한다. 본원 발명은 또한, CanIon 유전자의 이중대립인자 마커에 관한다. CanIon 유전자는 정신분열증, 양극성 장애, 다른 질환과 이상의 치료 및 진단을 위한 생물학적 표적으로 이용될 수 있다.
Description
임상 연자에게 가용한 기술 설비의 발전으로 건강 상태와 질환 상태에서 뇌와 신경계 기능의 정교한 연구가 가능하게 되었다. 정신 질환과 신경퇴행성 질환을 비롯한 중추신경계(CNS) 질환에 관여하는 신경화학적ㆍ유전학적 기전의 측면에서 많은 신경학적ㆍ약리학적 가설이 제시되고 있다. 하지만, CNS 질환은 복합적이고 이해하기 어려운 병인 및 중복되고 거의 특성화되지 않으며 측정하기 어려운 증상을 보인다. 결과적으로, 앞으로의 치료 섭생과 약물 개발 노력은 좀더 정교하고다중유전적 원인에 좀더 집중되어야 하고, 질환 개체군을 구분하는 신규한 분석법을 필요로 하며, CNS 질환 환자에 대한 좀더 정확한 진단과 예후 정보를 제공해야 한다.
CNS 질환은 광범위한 질환 및 상응하는 광범위한 유전적 요인을 동반할 수 있다. CNS 질환의 예에는 신경퇴행성 질환, 정신 질환, 기분 장애, 자폐증, 약물 의존과 알코올 중독, 정신 지체 및 인식 장애, 정신 장애, 불안 장애, 섭식 장애, 충동 조절 장애, 인격 장애를 비롯한 다른 정신 질환이 포함된다. 질환은 Diagnosis Statistical Manual of Mental Disorder fourth edition(DSM-Ⅳ) 분류에 따라 정의할 수 있다.
CNS 질환의 소규모 부분집합을 고려하는 경우에도 정신 분열증 및 양극성 장애에 대한 적절한 치료 및 분자적 기초의 이해 부족으로 인해 치료 발명의 새로운 표적 및 개선된 치료 방법이 필요하다는 것은 명백하다. 정신분열증과 양극성 장애의 치료에 사용되는 현재 공지된 모든 분자는 부작용을 보이고 효과가 이들의 증상에만 한정된다. 관련된 부작용이 없으면서 정신분열증과 양극성 장애의 원인 기전에 관여하는 표적을 저해하는 신규한 분자가 절실히 필요하다. 따라서, 이들 표적의 발견과 특성화를 용이하게 하는 도구는 유용하다.
전압-개폐 이온 채널
전압-개폐 이온 채널은 세포막에서 전위의 조절과 유지, 분비, 신호 전달을 비롯한 여러 기능을 수행하는 거대분자의 대과이다. 이들 채널 단백질은 뉴우런으로부터 신경전달물질의 조절에 관여하고 막 흥분성, 근육 수축, 시냅스 전달을 비롯한 다양한 세포 기능의 조절에 중요한 역할을 수행한다. Na+ 채널의 주요 알파-아단위와 Ca+ 채널의 알파-1 아단위는 대략 2000개의 아미노산으로 구성되고 이온 전도 경로를 보유한다. 생화학적 분석에서 생리활성 이온 채널이 여러 개의 상이한 아단위로 구성되는 것으로 밝혀졌다. Na+ 채널의 알파 아단위를 보조하는 하는 2개의 보조 아단위, 베타-1과 베타-2 아단위가 존재한다. Ca+ 채널에서 추가의 아단위(알파-2, 베타, 감마, 시그마)는 조절 작용을 갖는 것으로 확인되었다. 알파-2와 베타-아단위는 Ca+ 알파-1 아단위의 기능적 활성을 강화시키는 것으로 보인다. K+ 채널의 알파-아단위는 1:1 방식으로 베타 아단위와 결합하여 (알파)4(베타)4입체화학적 성상을 보이는 K+ 채널 복합체를 유도한다(Terlau et al., Naturwissenschaften 85: 437-444 (1998)). 칼슘과 나트륨 이온 채널의 기본 구조와 예는 예로써 Williams, et al. Science 257: 389-395 (1992); Mori, et al., Nature 350: 398-402 (1991); Koch, et al., J.Biol.Chem. 265 (29): 17786-17791 (1990)에서 기술한다. CanIon 채널과 높은 수준의 서열 상동성을 공유하고 쥐로부터 유래된 Ca+와 Na+ 이온 채널 핵산 서열은 Lee et al., FEBS Lett. 445 231:236 (1999)에서 기술한다.
알파 아단위는 모든 전압-의존 양이온 채널과 서열 특징을 공유하고 전위 막 스패닝(spanning) 도메인의 6개-나선 번들을 포함하는 동일한 구조 모티프를 이용한다. 나트륨과 칼슘 양 채널에서, 상기 모티프는 서열내에서 4회 반복되고 24개-나선 번들을 제공한다. 아미노산 서열은 종(예, 사람과 초파리)간에 그리고 상이한 이온 채널간에 고도로 보존된다.
다중-유전자 군에서 개별적인 유전자에 의해 코드되는 칼슘 채널의 조직-특이적인 약리학적ㆍ전기생리적으로 구별되는 여러 동소체가 존재한다. 골격근에서, 알파, 베타, 감마 아단위의 단단하게 결합된 각 조립체는 4개의 다른 조립체와 결합하여 오합체의 거대분자를 형성한다. 가령, 신경 칼슘 채널 알파-1 아단위는 적어도 7개의 상이한 유전자(알파 1 A에서 H까지)의 산물이다. 면역세포화학적 연구에서는 알파-1 칼슘 채널 아단위의 차별적인 분포를 보였다. 알파-1A와 알파-1B는 주로 수상돌기와 전시냅스 말단에서 발현되는데, 알파-1A가 알파-1B보다 좀더 많은 수의 신경 말단에 농축된다. 쥐와 사람 신경근 연접(neuromuscular junction)에서, 전시냅스에는 알파-1A가 집중적으로 위치하는 반면, 축삭-결합된 슈반세포(Schwann cell)에는 알파-1B와 알파-1A가 모두 존재한다. 알파-1E는 세포체에 집중적으로 위치하고, 일부 경우에 근접 수지상 돌기 및 푸르키니에세포(Purkinje cell)의 말단 가지에 위치한다. 알파-1C와 알파-1D는 세포체 및 중심성 뉴우런의 근접 수지상 돌기에 집중적으로 위치한다.
고유 칼슘 채널은 약리학적 및/또는 전기생리학적 특성에 기초하여 분류되었다. 전압 의존한 칼슘 채널은 다음과 같이 구분된다: L-, N-, P-, Q-형을 비롯한 고전압-활성화 채널(HVA); 중간 채널(IVA, R-형); 저전압-활성화 채널(LVA, T-형)(Morena et al., Annals NY Acad. Sci. 102-117(1999)).
주요 아단위(알파-1)는 이질성 발현계에서 발현되는 경우에 막이 자체적으로 기능적 채널을 형성할 수 있는 유전자에 속한다(Zhang et al., Neuropharmacology32(11): 1075-1088(1993). 고유 세포에서, 알파-1 아단위는 알파-1 단위의 기능적 특성을 변화시키는 보조 아단위를 보유하는 다중아단위 복합체로 발현된다. 많은 경우에, 보조 아단위의 공동발현은 채널의 생물물리학적 특성에 영향을 준다. 특히, 베타 아단위는 알파-1 아단위에 상당한 영향을 준다; 베타 아단위는 활성화 특성, 항정상태 비활성화, 비활성화 동력학, 피크 전류를 변화시키는 것으로 밝혀졌다.
채널의 분자 다양성중 대부분은 복합적 형태의 알파-1 아단위의 존재에 의해 발생한다. 가령, 상이하게 절단접합된 형태의 칼슘 채널은 차별적으로 발현되고 세린-트레오닌 키나아제에 의한 인산화에 대하여 독특한 감수성을 보유한다(Hell et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 747: 282-293(1994)). 이온 채널 유전자에서 돌연변이는 여러 중추 신경계 질환을 비롯한 광범위한 질환에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 주기성 마비, 발작성 운동실조증, 편두통, 연장된 QT 증후군, 발작성 운동장애를 비롯한 다양한 발작성 질환을 유발하는 이온 채널 돌연변이의 예는 Bulman et al., Hum. Mol. Gen. 6(10) 1679-1685(1997)에서 자세하게 기술한다. 몇몇 Ca+ 채널 돌연변이 질환의 예는 표 A에 도시한다(Moreno, supra).
표 A
| 질환 | 칼슘 채널 아단위 | 모델 |
| 가족성 반측마비성 편두통 | 알파-1A | 사람 |
| 발작성 운동실조증 2형 | 알파-1A | 사람 |
| 척수소뇌성 운동실조증 6형 | 알파-1A | 사람 |
| 토터링(Tottering) 및 러너(Learner) 표현형 | 알파-1A | 생쥐 |
| 람버트-이튼 증후군 | 알파-1A, α-1B | 사람 |
| 저칼륨성 주기성 마비 | 알파-1S | 사람 |
| 근육 이형성 | 알파-1S | 생쥐 |
| Zucker 당뇨성 지방과다 표현형 | α-1C; α-1D | 쥐 |
| 혼수상태 | 베타-4 | 생쥐 |
| 악성 저체온증 | 알파-2/δ | 사람 |
| 스타가제르(Stargazer) | 감마 | 생쥐 |
칼슘과 나트륨 채널의 조절물질은 다양한 질환과 이상의 치료에 일반적으로 사용된다. 가령, 칼슘 및/또는 나트륨 채널 차단제는 다양한 질환이나 이상, 예를 들면 다양한 심장 질환과 이상(예, 협심증, 부정맥), 고혈압, 편두통, 발작의 신경학적 효과, 조병, 신경이완제-유도된 지발성 운동장애, 양극성 장애, 통증, 간질 등과 관련된 하나 또는 복수의 증상을 치료 또는 예방하는데 유용한 것으로 밝혀졌다.
신경계에서 현저한 기능적 차이가 상이한 이온 채널간에 존재하는 것으로 보인다. 이에 더하여, 동일한 이온 채널 유전자에서 상이한 돌연변이간에 그리고 동일한 이온 채널의 절단접합 변이체간에 기능적 차이가 존재한다. 따라서, CNS 질환에서 이온 채널의 연관에도 불구하고 어떤 이온 채널이 특정 질환에 대한 치료 개입에 효과적인 표적인 가를 예측하는 것은 어려운 일이다. 한가지 난제는 정신분열증, 양극성 장애 또는 이들과 관련된 질환에 연관된 이온 채널 유전자를 제공하는 것이다.
본원 발명의 요약
본원 발명은 CanIon이라고 하는 전압-개폐 이온 채널 단백질을 인코드하는 신규한 사람 유전자의 게놈 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한다. 상기 CanIon 게놈 서열은 상기 유전자의 전사 영역의 상류(5' 말단)와 하류(3' 말단)에 위치하는 조절 서열을 포함하는데, 이들 조절 서열 역시 본원 발명에 속한다.
본원 발명은 또한, CanIon 단백질을 인코드하는 완전 cDNA 서열 및 상응하는 번역 산물을 제공한다.
CanIon 게놈이나 cDNA 서열과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머 및 이런 프라이머와 프로브를 이용한 DNA 증폭과 검출 방법 역시 본원 발명에 속한다.
본원 발명의 다른 목적은 전술한 핵산 서열중 한가지를 포함하는 재조합 벡터, 특히 CanIon 조절 서열 또는 CanIon 단백질을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 핵산 서열이나 재조합 벡터를 포함하는 세포 숙주와 유전자도입 사람제외 동물을 제공하는 것이다.
또한, 본원 발명은 CanIon 유전자의 이중대립인자 마커 및 이의 용도에 관한다.
최종적으로, 본원 발명은 CanIon의 발현이나 활성을 조절하는 물질이나 분자의 스크리닝 방법 및 CanIon 폴리펩티드와 상호작용하는 물질이나 분자의 스크리닝 방법에 관한다.
이들 방법으로 동정된 물질을 이용하는 방법을 또한 제공한다. 가령,CanIon 채널 길항물질을 이용하여 정신분열증이나 양극성 장애를 비롯한 질환이나 이상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
따라서, 한 측면에서 본원 발명은 SEQ ID NO 1 내지 4 또는 6으로 도시된 뉴클레오티드 서열중 하나, 또는 이들 서열에 상보적인 서열을 포함하는 분리된, 정제된 또는 재조합된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 측면에서, 본원 발명은 SEQ ID NO 4의 적어도 50개 뉴클레오티드의 연속 스팬을 포함하는 분리된, 정제된 또는 재조합된 폴리뉴클레오티드를 제공하는데, 상기 폴리뉴클레오티드는 생물학적 활성 CanIon 폴리펩티드를 인코드한다.
다른 측면에서, 본원 발명은 SEQ ID NO 5의 아미노산 서열 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는 사람 CanIon 폴리펩티드를 인코드하는 분리된, 정제된 또는 재조합된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
한 구체예에서, 전술한 폴리뉴클레오티드는 고체 서포트에 부착된다. 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 라벨을 포함한다.
다른 측면에서, 본원 발명은 전술한 폴리뉴클레오티드중 적어도 한가지를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 어레이를 제공한다. 한 구체예에서, 어레이는 어드레스(address)가능하다.
다른 측면에서, 본원 발명은 프로모터에 동작가능하게 연결되고 전술한 폴리뉴클레오티드중 한가지를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 측면에서, 본원 발명은 세포에서 CanIon 유전자의 발현 수준을 변화시키는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는CanIon 유전자 또는 CanIon 게놈 영역에 삽입된다. 한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 CanIon 유전자 프로모터에 삽입된다. 한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상동성 재조합, 예를 들면 내인성 CanIon 프로모터 또는 인헨서 영역의 한가지이상 요소를 치환하여 삽입한다.
다른 측면에서, 본원발명은 전술한 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드중 한가지를 포함하는 사람제외 숙주 세포를 제공한다.
다른 측면에서, 본원 발명은 적중(knock out) 벡터와의 상동성 재조합에 의해 파괴된CanIon유전자를 포함하는 포유동물 숙주 세포 또는 사람제외 숙주 포유동물을 제공한다.
다른 측면에서, 본원 발명은 SEQ ID NO 5에 도시된 아미노산 서열 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는 분리된, 정제된 또는 재조합된 폴리펩티드를 제공한다.
다른 측면에서, 본원 발명은 폴리펩티드를 만드는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 프로모터에 동작가능하게 연결된 본원 발명에 따른 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 개체군을 제공하고; b) 세포내에서 상기 폴리펩티드의 생산에 도움이 되는 조건하에 세포 개체군을 배양하며; c) 상기 세포 개체군으로부터 폴리펩티드를 정제하는 단계로 구성된다.
다른 측면에서, 본원 발명은 CanIon 폴리펩티드에 항-CanIon 항체를 결합시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 항체와 폴리펩티드가 특이적으로 결합할 수 있는 조건하에 상기 항체와 전술한 CanIon 폴리펩티드를 접촉시키는 단계로 구성된다. 다른 측면에서, CanIon 단백질이나 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 제공한다.
다른 측면에서, 본원 발명은 세포내에서 CanIon 유전자의 발현을 검출하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) i) 엄격한 조건하에 전술한 CanIon 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 폴리뉴클레오티드; 또는 ii) 전술한 CanIon 폴리펩티드중 한가지에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 세포 혹은 세포 추출물과 접촉시키고; b) 상기 세포 혹은 세포 추출물에서 폴리뉴클레오티드와 RNA 종간 혼성화의 존부, 또는 상기 세포 혹은 세포 추출물에서 폴리펩티드와 단백질 결합의 존부를 확인하는 단계로 구성되고, 여기서 혼성화 또는 결합의 존재는 상기 CanIon 유전자가 세포내에서 발현된다는 것을 암시한다. 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 프라이머이고, 혼성화는 상기 프라이머의 서열을 포함하는 증폭 산물의 존재에 의해 확인된다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 항체, 예를 들면 항-CanIon 항체이다.
다른 측면에서, 본원 발명은 CanIon 폴리펩티드의 후보 조절물질을 동정하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 전술한 CanIon 폴리펩티드중 한가지와 검사 화합물을 접촉시키고; b) 상기 화합물이 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지를 확인하는 단계로 구성되고, 여기서 상기 화합물이 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다는 확인은 상기 화합물이 CanIon 폴리펩티드의 후보 조절물질이라는 것을 암시한다.
한 구체예에서, 상기 방법에는 후보 조절물질의 존재하의 CanIon 폴리펩티드의 생물활성을 측정하는 단계가 추가로 포함되는데, 후보 조절물질 부재하의 활성과 비교하여 후보 조절물질 존재하의 CanIon 폴리펩티드의 생물활성 변화는 후보 조절물질이 CanIon 폴리펩티드의 조절물질이라는 것을 암시한다.
다른 측면에서, 본원 발명은 CanIon 폴리펩티드의 조절물질을 동정하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 전술한 CanIon 폴리펩티드중 한가지와 검사 화합물을 접촉시키고; b) 상기 화합물의 존부하에 상기 폴리펩티드의 활성을 확인하는 단계로 구성되고, 여기서 상기 화합물 부재하의 활성과 비교하여 상기 화합물 존재하의 활성에서 차이의 확인은 상기 화합물이 CanIon 폴리펩티드의 조절물질이라는 것을 암시한다.
본원 발명의 한 구체예에서, 폴리펩티드는 세포 혹은 세포막에 존재하고, 생물활성은 전압-개폐 이온 채널 활성이다.
다른 측면에서, 본원 발명은 제약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 전술한 방법중 한가지를 이용하여 CanIon 폴리펩티드의 조절물질을 동정하고; b) 상기 조절물질과 생리학적으로 수용가능한 담체를 혼합하는 단계로 구성된다. 제약학적 조성물을 이용하는 방법 역시 제공한다.
또한, 예로써 인체의 치료 또는 전술한 질환이나 이상의 치료를 위한 약물의 제조에서 전술한 CanIon 조절물질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체중 한가지의 용도를 제공한다.
또한, 시험관내 또는 생체내에서 본원 발명의 CanIon 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드를 이용 및 검출하는 키트를 제공한다.
본원 발명은 전압-개폐 이온 채널 유전자와 단백질 및 질환에서 이의 역할에 관한다. 본원 발명은 CanIon 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 코딩 영역의 5'-와 3'-말단에 위치하는 조절 영역에 관한다. 본원 발명은 또한, CanIon 채널 조절물질(예, 길항물질)의 스크리닝 방법 및 다양한 질환이나 이상의 치료 또는 예방에 이런 조절물질을 사용하는 방법에 관한다. 본원 발명은 또한, 진단 시약으로 유용한이런 폴리펩티드를 특이적으로 지향하는 항체에 관한다. 본원 발명은 또한, 유전자 분석에 유용한 CanIon 유전자의 이중대립인자 마커에 관한다.
도 1 은 CanIon 유전자를 포함하는 크로모좀 13q 영역의 BAC 지도를 도시하는 다이어그램이다.
도 2 는 전형적 컴퓨터 시스템의 블록 다이어그램이다.
도 3 은 신규한 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 데이터베이스의 서열과 비교하여 신규한 서열과 데이터베이스의 서열간 상동성 수준을 측정하기 위한 프로세스(200)의 한 구체예를 예시하는 흐름도이다.
도 4 는 2개의 서열이 상동한 지를 측정하기 위한 컴퓨터에서 프로세스(250)의 한 구체예를 예시하는 흐름도이다.
도 5 는 서열에서 지형(feature)의 존재를 검출하기 위한 확인 프로세스(300)의 한 구체예를 예시하는 흐름도이다.
서열 리스트에 제시된 서열의 간단한 설명
SEQ ID No 1은 5' 조절영역(상류의 전사되지 않은 영역)과 엑손 1 내지 7을 포함하는 CanIon의 게놈 서열을 보유한다.
SEQ ID No 2는 엑손 8 내지 27을 포함하는 CanIon의 게놈 서열을 보유한다.
SEQ ID No 3은 엑손 28 내지 44 및 3' 조절영역(하류의 전사되지 않은 영역)을 포함하는 CanIon의 게놈 DNA 서열을 보유한다.
SEQ ID No 4는 CanIon의 cDNA 서열을 보유한다.
SEQ ID No 5는 SEQ ID No 4에 의해 인코드되는 아미노산 서열을 보유한다.
SEQ ID No 6은 이중대립인자 마커 A18을 포함하는 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열을 보유한다.
SEQ ID No 7은 실시예 2에 자세하게 기술된 PU 5' 서열을 추가로 포함하는 프라이머를 보유한다.
SEQ ID No 8은 실시예 2에 자세하게 기술된 RP 5' 서열을 추가로 포함하는 프라이머를 보유한다.
서열 리스트와 관련된 규정에 따라, 서열내에서 이중대립인자 마커의 위치를 표시하고 다형적염기에 존재하는 대립유전자 각각을 동정하기 위하여 서열 리스트에 다음과 같은 코드가 이용되었다. 서열에서 코드 "r"은 다형적염기의 한 대립유전자가 구아닌이고 다른 대립유전자가 아데닌이라는 것을 나타낸다. 서열에서 코드 "y"는 다형적염기의 한 대립유전자가 티민이고 다른 대립유전자가 시토신이라는 것을 나타낸다. 서열에서 코드 "m"은 다형적염기의 한 대립유전자가 아데닌이고 다른 대립유전자가 시토신이라는 것을 나타낸다. 서열에서 코드 "k"는 다형적염기의 한 대립유전자가 구아닌이고 다른 대립유전자가 티민이라는 것을 나타낸다. 서열에서 코드 "s"는 다형적염기의 한 대립유전자가 구아닌이고 다른 대립유전자가 시토신이라는 것을 나타낸다. 서열에서 코드 "w"는 다형적염기의 한 대립유전자가 아데닌이고 다른 대립유전자가 티민이라는 것을 나타낸다. 각 이중대립인자 마커에 대한 원형 대립유전자의 뉴클레오티드 코드는 다음과 같다:
이중대립인자 마커원형 대립유전자
5-124-273-----------A(예를 들면)
일부 경우에, 이중대립인자 마커의 다형적염기는 인코드된 폴리펩티드에서 아미노산의 본성을 변화시킨다. 이는 변이(VARIANT) 특징, 다형적 아미노산의 위치에 Xaa의 배치 및 2개의 양자택일적 아미노산으로 Xaa의 정의를 이용하여 첨부된 서열 리스트에 나타낸다. 가령, 이중대립인자 마커의 한 대립유전자가 히스티딘을 인코드하는 코돈 CAC이고 이중대립인자 마커의 다른 대립유전자가 글루타민을 인코드하는 CAA이면, 인코드된 폴리펩티드에 대한 서열 리스트는 다형적 아미노산의 위치에 Xaa를 보유하게 된다. 이런 경우에, Xaa는 히스티딘 또는 글루타민으로 정의된다.
다른 경우에, Xaa는 뉴클레오티드 서열 다의성으로 인해 실체가 불명확한 아미노산을 표시할 수 있다. 이런 경우에, 불명확(UNSURE) 특징, 불명확 아미노산의 위치에 Xaa의 배치 및 유전자 코드에 의한 20개 아미노산이나 한정된 수의 아미노산으로 Xaa의 정의가 이용된다.
가족에서 정신분열증과 양극성 장애의 집중, 쌍둥이와 입양 연구의 증거, 전세계적 발병률에서 변화 결여는 환경적 위험 요인이 일정 수준으로 발병에 관여한다 하더라도 정신분열증과 양극성 장애가 일차적으로 유전적 질환이라는 것을 암시한다. 가령, 정신분열증은 전체 인구의 1%에서 발병한다. 하지만, 조부모중 1명에게 정신분열증이 있으면, 병에 걸릴 위험이 3% 정도; 부모중 1명에게 정신분열증이 있으면 10% 정도로 증가한다. 부모 모두에게 정신분열증이 있으면 위험은 40% 정도까지 상승한다.
특정 형질, 예를 들면 정신분열증과 같은 특이적인 중추신경계 질환에 관여하는 유전자의 동정은 현재 유전자 지도작성에 활용되고 있는 2가지 주요 전략: 연쇄 분석 및 연관 연구를 통하여 실시할 수 있다. 연쇄 분석은 여러 환자의 가족 연구를 필요로 하고, 현재 단일- 또는 저인자(oligogenic) 유전된 형질의 검출에 이용된다. 반대로, 연관 연구는 형질 음성 (T-) 대조군과 비교하여 무관한 형질 (T+) 개체에서 마커 대립유전자의 빈도를 검사하고, 일반적으로 다인자(polygenic) 유전의 검출에 이용된다.
유전적 링크 또는 "연쇄"는 크로모좀에서 2개의 인접한 서열이 감수분열동안 유전자 교환에 의한 재조합을 최소한으로 보유하는 지에 대한 분석에 기초한다. 이를 위하여, 마이크로위성(microsatellite) 마커와 같은 크로모좀 마커는 게놈에 정확하게 위치시킨다. 유전자 링크 분석은 계통도(genealogical tree)에 따라 사용된 크로모좀 마커와 표적 유전자에서 재조합, 상기 질환의 전달, 마커의 전달 가능성을 측정한다. 따라서, 상기 질환에서 임의 마커의 특정 대립유전자가 통상적 수준(0 내지 0.5의 재조합 수준)보다 더 높은 빈도로 전달되면, 표적 유전자가 마커의 인근에서 발견된다고 추론하는 것이 가능하다. 이런 기술을 활용하여, 가족성 암의 유전적 소인을 보이는 몇몇 유전자의 위치를 확인하였다. 유전자 연쇄 연구에 포함되기 위해서는 유전 질환의 영향을 받은 가족은 "정보적 요소" 기준을 충족시켜야 한다: 세대마다 여러 명의 영향을 받은 개체(구성 DNA가 가용함) 및 많은 후손.
기존 연쇄 연구의 결과는 크로모좀 13이 13q32에서 정신분열증 감수성 좌위를 보유할 가능성이 높다는 가설을 뒷받침하였다(Blouin JL et al., 1998, Nature Genetics, 20:70-73; Lin MW et al., 1997, Hum. Genet., 99(3):417-420;Brzustowicz et al., Am. J. Hum. Genet. 65:1096-1103(1999)). 연쇄 분석은 형질(trait)에 관여하는 유전자를 검출하는데 효과적인 방법이긴 하지만, 분석능력이 메가염기 수준을 넘지 못하고 상기 방법으로 처음에 동정된 영역의 분석결과를 정련하는데 상보성 연구가 종종 요구된다.
크로모좀 13q-31-q33 좌위의 후보 게놈 영역을 포함하는 BAC contig(콘틱)은 7개의 게놈 등가의 독점적 BAC 라이브러리를 스크린하기 위하여 크로모좀 13q31-33q 영역에 위치하는 공개된 STS로 작제하였다. 이들 물질로부터 신규한 STS를 만들고, 상기 영역의 밀집된 물리적 지도를 작성하였다. BAC는 검증을 위하여 in situ 크로모좀 혼성화로 크기를 측정하고 지도를 작성하였다. 최소한의 BAC가 동정되고 완전하게 서열분석되었는데, 여기에서 4Mb이상 서열로 구성되는 콘틱이 작성되었다. 이런 지도의 작성은 정신분열증과 현저한 연쇄를 보이는 게놈 영역내에 위치하는 CanIon 유전자의 동정을 결과하였다.
CanIon 아미노산 서열은 칼슘 채널의 알파-1 아단위에 대한 기호(signature)를 제공하는 7개-구성요소 핑거프린트인 Ca 채널의 특징이다. 이런 핑거프린트는 6개 서열로 구성되는 초기 정렬로부터 유래되었다: 모티프는 이들과 다른 양이온 채널을 구별할 수 있는 보존된 루프 영역으로부터 도출되었다; 모티프 1과 2는 막통 분절 4와 5 및 5와 6(첫 번째 내부 반복서열)간 보존된 루프 영역을 인코드한다; 모티프 3은 반복서열 1의 분절 6과 반복서열 2의 분절 1간 보존된 루프 영역에 상응한다; 모티프 4는 반복서열 2의 분절 5와 6간 보존된 루프 영역을 인코드한다; 모티프 5는 반복서열 3의 분절 6과 반복서열 4의 분절 1간 보존된 루프 영역에 상응한다; 모티프 6과 7은 반복서열 4의 분절 4와 5 및 5와 6간 보존된 루프 영역을 인코드한다
도 1 은 CanIon 유전자를 포함하는 관심있는 크로모좀 13 영역을 포괄하는 BAC 콘틱을 도시하고, 연쇄 연구에서 가장 높은 중요성을 보이는 유전자 마커와 관련하여 CanIon 유전자의 게놈 위치를 보여준다. 특히, Blouin 등(1998)은 54개 복합 혈통에서 452개의 마이크로위성 마커를 이용하여 정신분열증 감수성 좌위에 대한 전체 게놈 검색(genome wide scan)을 실시하였다. 가족에서 정신분열증간 가장 현저한 연쇄는 마커 D13S174 주변의 크로모좀 13q32에서 확인되었다. Brzustowics 등(1999)은 21개의 확대된 캐나다 가계에서 크로모좀 8과 13에 걸쳐 마이크로위성 마커를 평가하였다. 크로모좀 13q 영역에서 마커는 이용된 각 분석 모델에서 파지티브 LOD 스코어를 보였다: 정신분열증의 좁은 또는 넓은 정의에 따라 상염색체 우성과 열성. 최대 3점 LOD 스코어는 열성의 넓은 모델하의 마커 D13S798로 얻었다: 상동성하의 재조합 분율(fraction)(θ).1에서 3.92; 이질성하의 α=.65와 θ=0에서 4.42. 도 1을 참고하면, CanIon 유전자는 콘틱 'E 영역' 및 콘틱 C0001A10에 부분적으로 위치한다. CanIon 유전자는 연쇄 연구에서 가장 높은 중요성을 보인 2개의 마커가 측면에 접한다. 마커 D13S174는 콘틱 C0001A10에 위치하고, 마커 D13S793은 CanIon 유전자의 대략 3.5 Mb 중심에 위치한다.
정신분열증, 양극성 장애 및 다른 CNS와 심혈관의 질환과 이상에 관여하는 유전자를 동정하는 하는 것이 필요하다. 또한, 병에 관여하는 신규한 이온 채널을 동정하는 것이 필요하다. 이들 유전자와 단백질은 정신분열증, 양극성 장애 또는다른 CNS 질환 및 다른 질환, 예를 들면 심장 질환과 고혈압의 치료에 새로운 개입지점을 제공하고, CanIon 유전자 및 관련된 생물학적 경로의 추가적인 연구와 특성화를 가능하게 한다. 이들 질환과 이상에 관여하는 이들 유전자 및 관련된 생물학적 경로에 관한 지식은 연자들이 예로써 정신분열증과 양극성 장애의 병인을 이해하도록 하고, 상기 질환의 원인에 대한 약물과 약물 치료를 결과할 것이다. 가령, CanIon 채널을 차단하는 화합물은 다양한 질환이나 이상, 바람직하게는 정신분열증이나 양극성 장애, 통증 질환, 간질, 다양한 심혈관 질환(예, 심장 부정맥), 조병, 고혈압을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 정신분열증, 양극성 장애 및 다른 이상에 대한 감수성을 검출하고 이들 질환의 발병을 예방 또는 추적하는 신규한 방법이 필요하다. 진단 도구 역시 매우 유용하다. 실제로, 정신분열증이 발병할 위험이 높은 개체의 조기 확인은 진단 및/또는 예방 치료를 가능하게 한다. 게다가, 약물의 효능과 이에 대한 환자의 내약성에 대한 정확한 평가는 의사들이 정신분열증과 양극성 장애 치료의 이익/위험 비율을 향상시킬 수 있도록 할 것이다.
본원 발명은 CanIon 유전자와 관련된 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드에 관한다. CanIon의 게놈이나 cDNA 서열과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머 역시 본원 발명에 속한다. 본원 발명의 다른 목적은 본원에서 밝힌 핵산 서열중 한가지를 포함하는 재조합 벡터, 특히 CanIon의 조절영역 또는 CanIon 단백질을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 핵산 서열 또는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다. 본원 발명은 또한, CanIon 유전자나 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 능력에 대한 분자의 스크리닝 방법및 정신분열증, 양극성 장애 또는 다양한 다른 질환이나 이상을 치료 또는 예방하기 위하여 이런 분자를 이용하는 방법에 관한다. 본원 발명은 또한, 진단 시약으로 유용한이런 폴리펩티드를 특이적으로 지향하는 항체에 관한다.
본원 발명은 또한, 가족에서 연쇄 연구, 개체군에서 연쇄 불균형 연구, 사례 대조 개체군에서 연관 연구를 비롯한 유전자 분석 방법에서 CanIon-관련된 이중대립인자 마커 및 이들의 용도에 관한다. 본원 발명의 중요한 측면은 이중대립인자 마커를 통하여 복잡한 형질에 관여하는 유전자의 역할을 확인하는 연관 연구를 실시할 수 있다는 점이다.
정의
본원 발명을 좀더 자세하게 설명하기에 앞서, 본원 발명을 설명하기 위하여 이용된 용어의 의미와 범위를 한정하기 위하여 다음과 같은 정의를 제시한다.
본원에서 "CanIon 유전자"에는 CanIon 단백질을 인코드하고 게놈 DNA의 번역되지 않은 조절영역을 포함하는 게놈, mRNA, cDNA 서열이 포함된다.
본원에서 "이질성 단백질"은 CanIon 단백질을 제외한 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 가령, 이질성 단백질은 CanIon 조절 영역과의 추가적인 검사에 마커로 사용할 수 있는 화합물일 수 있다.
"분리된"은 물질이 원래의 환경(예, 자연 발생하는 경우에 고유 환경)으로부터 이동되는 것을 의미한다. 가령, 살아있는 동물에 존재하는 자연-발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리된 것이 아니지만, 고유 시스템에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 격리된 상기와 동일한 폴리뉴클레오티드, DNA 또는 폴리펩티드는 분리된 것이다. 이런 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부가 되거나 또는 이런 폴리뉴클레오티드 혹은 폴리펩티드는 조성물의 일부가 될 수 있는데, 벡터나 조성물이 고유 환경의 일부가 아니라는 점에서 이 역시 분리된 것이다.
가령, 살아있는 동물에 존재하는 자연-발생 폴리펩티드는 분리된 것이 아니지만, 고유 시스템에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 격리된 상기와 동일한 폴리뉴클레오티드는 분리된 것이다. "분리된"의 정의에서 자연-발생 크로모좀(예, 크로모좀 스프레드); 인공 크로모좀 라이브러리; 게놈 라이브러리; 시험관내 핵산 제형 또는 트랜스펙션/형질전환된 숙주 세포 제형(여기서, 숙주 세포는 시험관내 이질성 제형이거나 또는 단일 콜로니의 이질성 개체군으로 도말된다)으로 존재하는 cDNA 라이브러리는 제외된다. 특정된 폴리뉴클레오티드가 벡터 분자에서 핵산 삽입체 수의 5% 미만을 구성하는 라이브러리 역시 제외된다. 전체 세포 게놈 DNA 또는 전체 세포 RNA 제형(기계적으로 전단된 또는 효소적으로 절단된 전체 세포 제형 포함) 역시 제외된다. 전기영동(블랏 전달)에 의해 분리되는 시험관내 제형 또는 이질성 혼합물로서 상기 전체 세포 제형 역시 배제되는데, 여기서 본원 발명의 폴리뉴클레오티드는 전기영동 매체에서 이질성 폴리뉴클레오티드로부터 더 이상 분리되지 않는다(예, 아가로즈 겔 또는 나일론 블랏에서 이질성 밴드 개체군으로부터 단일 밴드를 절단함으로써 추가적인 분리).
본원에서 "정제된"은 절대 순도를 요구하지는 않는다; 오히려, 이는 상대적 정의로서 이해한다. 출발 물질 또는 천연 물질의 정제는 최소한 1 크기 자릿수, 바람직하게는 2 또는 3 크기 자릿수, 좀더 바람직하게는 4 또는 5 크기 자릿수로생각한다. 예로써, 0.1% 농도에서 10% 농도로의 정제는 2 크기 자릿수이다. 예시하면, cDNA 라이브러리로부터 개별 cDNA 클론은 통상적으로 전기영동적 동질성까지 정제된다. 이들 클론으로부터 수득된 서열은 라이브러리로부터 또는 전체 사람 DNA로부터 구할 수 없었다. cDNA 클론은 자연 발생하지 않고, 부분적으로 정제된 자연 발생 물질(메신저 RNA)의 조작을 통하여 얻는다. mRNA의 cDNA 라이브러리로의 전환에는 합성 물질(cDNA)의 생성이 포함되고, 순수한 개별 cDNA 클론은 클론 선별로 합성 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 따라서, 메신저 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 만들고, 후속으로 상기 라이브러리로부터 개별 클론을 분리하면 고유 메시지가 104-106배 정제된다.
이에 더하여, "정제된"은 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 지질 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 화합물로부터 격리되는 본원 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 설명하는데 이용될 수 있다. "정제된"은 호모- 또는 헤테로- 이합체, 삼합체 등과 같은 올리고형으로부터 본원 발명의 단량체형 폴리펩티드의 분리를 명기하는데 이용될 수도 있다. "정제된"은 선형 폴리뉴클레오티드로부터 공유 결합된 폴리뉴클레오티드의 분리를 명기하는데 이용될 수도 있다. 폴리펩티드는 적어도 50%, 바람직하게는 60 내지 75%의 시료가 단일 폴리뉴클레오티드 서열과 입체형태를 보이는 경우에 실질적으로 순수하다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 각각 대략 50%, 바람직하게는 60 내지 90%, 좀더 바람직하게는 대략 95%, 가장 바람직하게는 99% w/w이상의 폴리펩티드 또는폴리뉴클레오티드 시료로 구성된다. 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드 순도 또는 동질성은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면 시료의 아가로즈 또는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 후속으로 겔을 염색한 직후에 단일 밴드 가시화로 표시한다. 특정 목적을 위한 더 높은 분석은 HPLC 또는 다른 공지된 방법으로 제공할 수 있다. 대안적 구체예로 본원 발명에 따른 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드의 정제는 이질성 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드(DNA, RNA 또는 둘 모두)와 관련하여 "적어도" 순도%로 표시할 수도 있다. 적절한 구체예에서, 본원 발명의 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드는 각각 이질성 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드와 관련하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99%, 또는 100% 순도이다. 다른 적절한 구체예에서, 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드는 각각 이질성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 90% 내지 100%사이에서 1/1000 자릿수까지의 순도(예, 적어도 99.995% 순도의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드), 또는 담체에 존재하는 화합물 및 분자를 제외한 모든 화합물 및 분자와 관련하여 w/w 비율로 순도를 갖는다. 1/1000 자릿수까지 순도 %를 표시하는 각 숫자는 순도의 개별 형식으로 주장할 수 있다.
본원에서 "폴리펩티드"는 중합체의 길이와 상관없이 아미노산 중합체를 의미한다; 따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 단백질은 폴리펩티드의 정의에 포함된다. 이 용어는 폴리펩티드의 발현-후 수식을 명기 또는 배제하지 않는다, 예를 들면 글리코실기, 아세틸기, 포스페이트기, 지질기 등을 보유하는 폴리펩티드는 폴리펩티드에 포함된다. 하나이상의 아미노산 유사체를 보유하는 폴리펩티드(예, 비-자연발생 아미노산, 무관한 생물체에서만 자연적으로 발생하는 아미노산, 포유동물체로부터 유래된 수식된 아미노산 등), 치환된 연쇄를 보유하는 폴리펩티드, 자연 발생하고 자연-발생하지 않는 당분야에 공지된 다른 변형체 역시 폴리펩티드에 포함된다.
본원에서 "재조합 폴리펩티드"는 인위적으로 설계되고 최초 고유 환경의 연속 폴리펩티드 서열에서 발견되지 않는 적어도 2개의 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 "사람제외 동물"은 사람제외 척추동물, 조류, 포유동물, 바람직하게는 영장류, 가금(예, 돼지, 염소, 양, 당나귀, 말, 토끼) 또는 설취류, 좀더 바람직하게는 쥐 또는 생쥐를 의미한다. 본원에서 "동물"은 임의의 척추동물, 바람직하게는 포유동물을 의미한다. "동물"과 "포유동물"에는 "사람제외"를 명시하지 않는 경우 사람이 포함된다.
본원에서 "항체"는 한 개이상의 결합 도메인으로 구성되는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 군을 의미하는데, 여기서 항체 결합 도메인은 항체 분자에서 다양한 도메인의 접힙(folding)으로 생성되고 항원의 항원 결정기 외형에 상보적인 내부 표면 형태 및 전하 분포를 갖는 3차원 결합 공간을 형성하는데, 이는 항원과의 면역학적 반응을 가능하게 한다. 항체에는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2를 비롯하여 결합 도메인을 보유하는 재조합 단백질이 포함된다.
본원에서 "항원 결정기"는 항원-항체 반응의 특이성을 결정하는 항원 분자의 일부분, 본원에서는 CanIon 폴리펩티드를 의미한다. "에피토프"는 폴리펩티드의 항원 결정기를 의미한다. 에피토프는 상기 에피토프에 독특한 공간적 입체형태를 제공하는 적게는 3개의 아미노산으로 구성된다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 6개의 이런 아미노산, 바람직하게는 적어도 8-10개의 이런 아미노산으로 구성된다. 에피토프를 구성하는 아미노산을 측정하는 방법에는 x-레이 결정법; 2-차원 핵 자기 공명법; 에피토프 지도작성, 예를 들면 Geysen et al. 1984; PCT 출원 WO 84/03564; PCT 출원 WO 84/03506에서 밝힌 Pepscan 방법이 포함된다.
본원에서, "뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 의미한다. 좀더 구체적으로, "뉴클레오티드 서열"에는 핵산 물질 자체가 포함되고, 따라서 특정 DNA 또는 RNA 분자를 생화학적으로 특성화하는 서열 정보(즉, 4개의 염기 문자에서 선택되는 문자의 연속)에 제한되지 않는다.
본원에서, "핵산", "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드"는 서로 동일한 의미를 가지고, 여기에는 단일 사슬 또는 이중 나선 형태로 한 개이상의 뉴클레오티드를 포함하는 RNA, DNA, 또는 RNA/DNA 하이브리드 서열이 포함된다. 본원에서 "뉴클레오티드"에는 단일 사슬 또는 이중 나선 형태로 임의 길이의 RNA, DNA, 또는 RNA/DNA 하이브리드 서열을 포함하는 서열 역시 포함된다. 또한, 본원에서 "뉴클레오티드"는 개별 뉴클레오티드 또는 다수의 뉴클레오티드, 다시 말하면 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 경우에 퓨린 또는 피리미딘, 리보즈 또는 디옥시리보즈 당 성분, 인산염 기 또는 포스포디에스터 결합으로구성되는 분자 또는 좀더 큰 핵산 분자에서 개별 단위를 의미한다. "뉴클레오티드"에는 적어도 한 개의 변형체 (a) 다른 결합기, (b) 퓨린의 유사체, (c) 피리미딘의 유사체 또는 (d) 당 유사체를 포함하는 "변형된 뉴클레오티드"가 포함된다(참조: WO95/04064). 본원 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 합성, 재조합,ex vivo발생 또는 이들의 조합을 비롯한 임의의 공지된 방법 및 당분야에 공지된 정제 방법을 활용하여 만들 수 있다.
조절 서열, 예를 들면 프로모터에 "동작가능하게 연결된" 서열은 조절 요소가 핵산에서 정확한 위치와 방향으로 존재하여 RNA 중합효소 개시 및 관심있는 핵산의 발현을 조절한다는 것을 의미한다. 본원에서 "동작가능하게 연결된"은 기능적 상관관계에서 폴리뉴클레오티드 요소의 연쇄를 의미한다. 가령, 프로모터 또는 인헨서는 코딩 서열에 동작가능하게 연결되고 코딩 서열의 전사에 영향을 준다.
"형질"과 "표현형"은 본원에서 동일한 의미를 갖고 미생물의 가시적인, 검출가능한 또는 달리 측정가능한 특성, 예를 들면 질환의 증상 또는 질환에 대한 감수성을 의미한다. 일반적으로, "형질" 또는 "표현형"은 질환의 증상 또는 이에 대한 감수성, 치료와 관련된 유익한 반응 또는 치료와 관련된 부작용을 의미한다. 적절하게는, 이런 형질은 정신분열증이나 양극성 장애와 같은 정신 질환; 간질이나 통증 질환과 같은 다른 CNS 또는 신경 질환; 협심증, 고혈압, 부정맥과 같은 심혈관 질환; 이들 질환이나 이상중 한가지의 임의 측면, 특징 또는 특질일 수 있지만, 이들에 국한되지는 않는다.
"대립유전자"는 뉴클레오티드 서열의 변이를 의미한다. 이중대립인자 다형성은 2가지 형태를 갖는다. 이배체 미생물은 하나의 대립유전자형에 대하여 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다.
본원에서 "이형접합률(heterozygosity rate)"은 특정 대립유전자에서 이형접합성인 개체군에서 개체 빈도를 의미한다. 이중대립인자 시스템에서, 이형접합률은 평균 2Pa(1-Pa)인데, 여기서 Pa는 최소 공통 대립유전자의 빈도이다. 유전자 연구에 유용한 유전자 마커는 무작위로 선택되는 개체가 이형접합일 가능성을 온당하게 허용하는 적합한 수준의 이형접합성을 보유한다.
본원에서 "유전형"은 개체 또는 시료에 존재하는 대립유전자의 본성을 의미한다. 적절하게는, 유전형은 개체 또는 시료에 존재하는 이중대립인자 마커 대립유전자, 예를 들면 CanIon 유전자 또는 게놈 영역에서 이중대립인자 마커의 대립유전자의 의미한다. "이중대립인자 마커"에 대한 시료 또는 개체의 "유전자형판별(genotyping)"에는 이중대립인자 마커에서 개체가 보유하는 특정 대립유전자 또는 특정 뉴클레오티드를 결정하는 것이 포함된다.
본원에서 "돌연변이"는 1% 미만의 빈도로 상이한 게놈 또는 개체간 DNA 서열에서 차이를 의미한다.
본원에서 "일배체형"은 개체 또는 시료에 존재하는 대립유전자의 조합을 의미한다. 적절하게는, 일배체형은 임의의 개체에서 발견되고 표현형과 연관된 이중대립인자 마커 대립유전자의 조합을 의미한다.
본원에서 "다형성"은 상이한 게놈 또는 개체간 2개이상의 게놈 서열 또는 대립유전자의 발생을 의미한다. "다형적(polymorphic)"은 특정 게놈 서열에서 2개 이상 변이가 개체군에서 발견되는 상태를 의미한다. "다형적 부위"는 변이가 발생하는 좌위이다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 다형적 부위에서 1개 뉴클레오티드의 다른 뉴클레오티드로의 치환이다. 단일 뉴클레오티드의 결실 또는 단일 뉴클레오티드의 부가 역시 단일 뉴클레오티드 다형성을 유발한다. 본원에서, "단일 뉴클레오티드 다형성"은 가급적 단일 뉴클레오티드 치환을 의미한다. 전형적으로, 상이한 개체간 다형적 부위가 2개의 상이한 뉴클레오티드에 의해 점유될 수도 있다. 본원에서 "이중대립인자 다형성"과 "이중대립인자 마커"는 동일한 의미를 갖고 개체군에서 상당히 높은 빈도로 2개의 대립유전자를 갖는 단일 뉴클레오티드 다형성을 의미한다. "이중대립인자 마커 대립유전자"는 이중대립인자 마커 부위에 존재하는 뉴클레오티드 변이를 의미한다. 전형적으로, 본원 발명에 따른 이중대립인자 마커의 조금 덜 공통된 대립유전자의 빈도는 1%이상, 바람직하게는 10%이상, 좀더 바람직하게는 20%이상(즉, 적어도 0.32의 이형접합률), 가장 바람직하게는 30%이상(즉, 적어도 0.42의 이형접합률)이다. 조금 덜 공통된 대립유전자의 빈도가 30%이상인 이중대립인자 마커는 "고 품질 이중대립인자 마커"라고 한다.
폴리뉴클레오티드의 중심과 관련하여 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 위치는 다음의 방식으로 설명한다. 폴리뉴클레오티드가 홀수의 뉴클레오티드를 보유하면, 폴리뉴클레오티드의 3'와 5' 말단으로부터 동등한 거리에 있는 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 "중심"으로 간주하고, 중심에 위치한 뉴클레오티드에 바로 인접하는 뉴클레오티드 또는 중심 자체에 위치하는 뉴클레오티드는 중심으로부터 1개 뉴클레오티드 이내"에 위치하는 것으로 간주한다. 홀수개의 뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드 중간에서 5개의 뉴클레오티드 위치중 하나는 중심으로부터 2개 뉴클레오티드 이내에 위치하는 것으로 간주한다. 폴리뉴클레오티드가 짝수개의 뉴클레오티드를 보유하면, 폴리뉴클레오티드의 중심에는 뉴클레오티드가 아닌 결합이 존재한다. 따라서, 2개의 중심 뉴클레오티드중 하나는 "중심으로부터 1개 뉴클레오티드 이내"에 위치하는 것으로 간주하고, 폴리뉴클레오티드 중간에서 4개의 뉴클레오티드중 하나는 "중심으로부터 2개 뉴클레오티드 이내"에 위치하는 것으로 간주한다. 1개이상 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 부가를 비롯한 다형성의 경우에, 다형성의 치환된, 삽입된 또는 결실된 폴리뉴클레오티드로부터 거리와 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 말단간 차이 및 다형성의 치환된, 삽입된 또는 결실된 폴리뉴클레오티드로부터 거리와 상기 폴리뉴클레오티드의 5' 말단간 차이가 0이나 1개 뉴클레오티드이면 다형성, 대립유전자 또는 이중대립인자 마커는 폴리뉴클레오티드의 "중심"에 위치한다. 이런 차이가 0 내지 3이면, 다형성은 "중심으로부터 1개 뉴클레오티드 이내"에 위치하는 것으로 간주한다. 이런 차이가 0 내지 5이면, 다형성은 "중심으로부터 2개 뉴클레오티드 이내"에 위치하는 것으로 간주한다. 이런 차이가 0 내지 7이면, 다형성은 "중심으로부터 3개 뉴클레오티드 이내"에 위치하는 것으로 간주한다.
본원에서 "상류"는 특정 기준지점으로부터 폴리뉴클레오티드의 5'말단 방향, 또는 유전자의 경우에 코딩 서열로부터 프로모터 방향으로의 위치를 의미한다.
본원에서 "염기쌍"과 "Watson & Crick 염기쌍"은 동일한 의미를 갖고 이중나선 DNA에서 발견되는 것과 유사한 방식으로 서열 상동성으로 인해 서로 수소 결합된 뉴클레오티드를 의미하는데, 여기서 티민 또는 우라실 잔기는 2개의 수소 결합에 의해 아데닌 잔기에 결합하고, 사이토신 잔기는 3개의 수소 결합에 의해 구아닌 잔기에 결합한다(Stryer, L., Biochemistry, 4thedtion, 1995)
"상보성" 또는 "이의 보체"는 상보성 전체 영역에서 다른 특정된 폴리뉴클레오티드와 Watson & Crick 염기쌍을 형성할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 본원 발명에서는 첫 번째 폴리뉴클레오티드에서 각 염기가 상보성 염기와 쌍을 이루는 경우에 첫 번째 폴리뉴클레오티드는 두 번째 폴리뉴클레오티드와 상보성이라고 한다. 상보성 염기는 A와 T(또는 A와 U), 또는 C와 G이다. 본원에서 "보체"는 "상보성 뉴클레오티드", "상보성 핵산", "상보성 뉴클레오티드 서열과 동의어로 사용된다. 이들 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드가 실제로 반응하는 특정 조건이 아닌 순전히 서열에 기초한 폴리뉴클레오티드의 쌍에 적용된다.
변이와 단편
본원 발명은 전술한 폴리뉴클레오티드, 특히 본원 발명에 따른 하나이상의 이중대립인자 마커를 보유하는 CanIon 유전자의 변이와 단편에 관한다.
본원에서 폴리뉴클레오티드의 변이는 기준 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드의 변이는 자연 발생 변이, 예를 들면 자연 발생 대립유전자 변이이거나 또는 자연 발생하는 것으로 알려져 있지 않은 변이이다. 폴리뉴클레오티드의 이런 비-자연 발생 변이는 폴리뉴클레오티드, 세포 또는미생물에 적용되는 것을 비롯하여 돌연변이유발 기술로 만들 수 있다. 일반적으로, 차이는 제한적이고, 기준 뉴클레오티드 서열과 변이는 전반적으로 유사하고 다수의 영역에서 상동하다.
본원 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 변이에는 SEQ ID No 1 내지 4 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 상동한 뉴클레오티드 서열 혹은 SEQ ID No 1 내지 4 뉴클레오티드 서열의 적어도 12개 연속 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 단편 및 SEQ ID No 1 내지 4 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID No 1 내지 4 뉴클레오티드 서열의 적어도 12개 연속 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 단편과 바람직하게는 적어도 99% 상동한, 좀더 바람직하게는 99.5% 상동한, 가장 바람직하게는 적어도 99.8% 상동한 뉴클레오티드 서열이 포함되지만, 이들에 국한되지 않는다.
변이 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드 변화는 침묵할 수도 있는데, 이는 이들이 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 아미노산을 변화시키지 않는다는 것을 의미한다. 하지만, 뉴클레오티드 변화는 기준 서열에 의해 인코드되는 폴리펩티드에서 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합, 절두를 유발할 수도 있다. 치환, 결실 또는 부가에는 하나이상의 뉴클레오티드가 참여할 수 있다. 변이는 코딩 영역, 비-코딩 영역 또는 둘 모두에서 발생할 수 있다. 코딩 영역에서 변화는 보존성 또는 비-보존성 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 유발할 수 있다.
본원 발명의 특히 적절한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 성숙 CanIon 단백질과 동일한 생물학적 기능이나 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩티드, 또는 특정 생물 활성을 유지 혹은 증가시키면서 이차적인 생물 활성을 감소시키는 폴리펩티드를 인코드한다.
폴리뉴클레오티드 단편은 임의의 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 CanIon 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이의 변이의 일부분과 완전히 상동한 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드이다. 단편은 CanIon 유전자의 인트론이나 엑손의 일부일 수 있다. 이는 CanIon의 조절 영역의 일부일 수도 있다. 적절하게는, 이런 단편은 이중대립인자 마커 A1 내지 A17중 적어도 한가지 혹은 이들의 보체, 또는 이중대립인자 마커 A1 내지 A17중 적어도 한가지와 연쇄 불균형한 이중대립인자 마커를 포함한다.
이런 단편은 "프리-스탠딩(free-standing)", 다시 말하면 다른 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 다른 폴리뉴클레오티드에 융합되지 않거나, 또는 좀더 큰 단일 폴리뉴클레오티드에서 일부분 또는 영역을 형성할 수도 있다. 실제로, 이들 단편중 몇몇 단편은 좀더 큰 폴리뉴클레오티드상에 존재한다.
선택적으로, 이런 단편은 적어도 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 또는 1000개의 연속 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 일단의 적합한 단편은 본원에서 밝힌 CanIon 유전자의 이중대립인자 A1 내지 A17중 적어도 한가지 또는 이의 보체를 보유한다.
2-폴리펩티드
또한, 본원 발명은 돌연변이된 CanIon 단백질을 비롯하여, 전술한 폴리펩티드의 변이체, 단편, 유사체, 유도체에 관한다.
변이는 하나이상의 아미노산 잔기가 보존된 또는 비-보존된 아미노산 잔기로치환되고 이런 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 인코드되는 또는 인코드되지 않는 변이; 2) 하나이상의 아미노산 잔기가 치환기를 보유하는 변이; 3) 돌연변이된 CanIon이 다른 화합물, 예를 들면 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되는 변이; 또는 4) 부가된 아미노산이 돌연변이된 CanIon, 예를 들면 리더나 분비 서열 또는 돌연변이된 CanIon 혹은 전단백질(preprotein) 서열의 정제에 사용되는 서열에 융합되는 변이일 수 있다.
폴리펩티드 단편은 임의의 폴리펩티드 서열, 바람직하게는 CanIon 유전자에 의해 인코드되는 폴리펩티드 및 이의 변이체의 일부분과 완전히 상동한 서열을 보유하는 폴리펩티드이다.
본원 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 아미노산 치환의 경우에, 하나 또는 수 개의 아미노산은 "등가의" 아미노산으로 치환될 수 있다. 본원에서 "등가의" 아미노산은 펩티드 화학분야의 당업자가 폴리펩티드의 이차 구조와 수치(hydropathic) 성질이 실질적으로 변화지 않을 것으로 예상할 수 있을 정도로, 유사한 특성을 보유하는 아미노산을 대체할 수 있는 임의의 아미노산을 의미한다. 일반적으로, 다음의 아미노산 군은 등가의 변화를 나타낸다: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Il3, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His.
본원 발명에 따른 변형된 CanIon 펩티드 분자의 특정 구체예에는 단백분해에 저항하는 펩티드 분자, 다시 말하면 -CONH-펩티드 결합이 변화되고 (CH2NH) 환원된 결합, (NHCO) 레트로 인벌소 결합, (CH2-O) 메틸렌-옥시 결합, (CH2-S) 티오메틸렌결합, (CH2CH2) 카바 결합, (CO-CH2) 케토메틸렌 결합, (CHOH-CH2) 하이드록시에틸렌 결합, (N-N) 결합, E-알센 결합 또는 -CH=CH 결합으로 치환되는 펩티드가 포함되지만, 이들에 국한되지 않는다. 또한, 본원 발명에는 사람 CanIon 폴리펩티드 또는 적어도 한 개의 펩티드 결합이 전술한 바와 같이 변형된 이의 단편이나 변이가 포함된다.
이런 단편은 "프리-스탠딩(free-standing)", 다시 말하면 다른 폴리펩티드의 일부 또는 다른 폴리펩티드에 융합되지 않거나, 또는 좀더 큰 단일 폴리펩티드에서 일부분 또는 영역을 형성할 수도 있다. 실제로, 몇몇 단편은 좀더 큰 단일 폴리펩티드에 포함된다.
본원 발명에 다른 폴리펩티드 단편의 대표적 예는 대략 5, 6, 7, 8, 9, 10 내지 15, 10 내지 20, 15 내지 40, 또는 30 내지 55개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드이다. 적절하게는, CanIon 단백질에서 적어도 한 개의 아미노산 돌연변이를 갖는 폴리펩티드 단편이다.
핵산 또는 폴리펩티드간 상동성
본원에서 "서열 상동성 %"와 "동질성 %"는 동일한 의미를 갖고 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드간 비교를 의미하며 비교 윈도우에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정하는데, 여기서 비교 윈도우상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부분은 두 서열의 최적 정렬을 위하여 기준 서열(부가 또는 결실을 보유하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 보유할 수도 있다. 서열 상동성 %는 양 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 총수를 측정하여 대합된 위치의 총수를 산출하고, 대합된 위치의 총수를 비교 윈도우에서 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 계산한다. 동질성은 당분야에 공지된 다양한 서열 비교 알고리즘과 프로그램을 활용하여 평가한다. 이런 알고리즘과 프로그램에는 TBLASTN, BLASTIP, FASTA, TFASTA, CLUSTALW (Pearson and Lipman, 1988; Altschul et al., 1990; Thompson et al., 1994; Higgins et al., 1996; Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1993)이 포함되지만, 이들에 국한되지 않는다. 특히 적절한 구체예에서, 단백질과 핵산 서열 동질성은 당분야에 공지된 Basic Local Alignment Tool("BLAST")를 활용하여 평가한다(Karlin and Altschul, 1990; Altschul et al., 1990 1993, 1997).
특히, 5종류의 특정 BLAST 프로그램이 다음의 작업을 실행하는데 활용되고 있다:
(1) BLASTP와 BLAST3은 단백질 서열 데이터베이스와 아미노산 쿼리 서열을 비교한다;
(2) BLASTN은 뉴클레오티드 서열 데이터베이스와 뉴클레오티드 쿼리 서열을 비교한다;
(3) BLASTX는 단백질 서열 데이터베이스와 쿼리 뉴클레오티드 서열(양 가닥)의 6개-프레임 추정 변역 산물을 비교한다;
(4) TBLASTN은 6개의 해독틀(양 가닥)에서 번역된 뉴클레오티드 서열 데이터베이스와 쿼리 단백질 서열을 비교한다;
(5) TBLASTX는 뉴클레오티드 서열 데이터베이스의 6개-프레임 번역과 뉴클레오티드 쿼리 서열의 6개-프레임 번역을 비교한다.
BLAST 프로그램은 유사한 분절을 동정하여 상동성 서열을 동정하는데, 이는 이후 쿼리 아미노 서열이나 핵산 서열과 단백질이나 핵산 서열 데이터베이스로부터 얻은 시험 서열간 "하이-스코어링 분절 쌍"이라고 한다. 하이-스코어링 분절 쌍은 가급적 당분야에 공지된 스코어링 매트릭스로 동정(즉, 정렬)한다. 이용되는 스코어링 매트릭스는 바람직하게는 BLOSUM62 매트릭스(Gonnet et al., 1992; Henikoff and Henikoff, 1993)이다. 조금 덜 선호되긴 하지만, PAM 또는 PAM250 매트릭스 역시 이용할 수 있다(Schwartz and Dayhoff, eds., 1978). BLAST 프로그램은 확인된 모든 하이-스코어링 분절 쌍의 통계학적 유의성을 평가하고, 가급적 사용자-특정된 유의성 한계, 예를 들면 사용자-특정된 동질성 %를 만족시키는 분절을 선택한다. 적절하게는, 하이-스코어링 분절 쌍의 통계학적 유의성은 Karlin의 통계 유의성 공식(Karlin and Altschul, 1990)을 활용하여 평가한다.
BLAST 프로그램은 디폴트 변수 또는 사용자가 제공한 파라미터로 이용할 수 있다.
엄격한 혼성화 조건
본원 발명에 따른 혼성화 핵산을 정의하기 위한 엄격한 혼성화 조건은 다음과 같다:
혼성화 단계는 6 x SSC 완충액, 5 x 덴하르트 용액, 0.5% SDS, 100㎍/㎖ 연어 정자 DNA의 존재하에 65℃에서 달성한다.
혼성화 단계에 이어 4가지 세척 단계를 실시한다:
- 2 x SSC와 0.1% SDS 완충액의 존재하에 65℃에서 5분동안 2회 세척;
- 2 x SSC와 0.1% SDS 완충액의 존재하에 65℃에서 30분동안 1회 세척;
- 2 x SSC와 0.1% SDS 완충액의 존재하에 65℃에서 10분동안 1회 세척.
이들 혼성화 조건은 대략 20개 뉴클레오티드로 구성되는 핵산 분자에 적합하다. 전술한 혼성화 조건은 당업자에게 공지된 기술로 원하는 핵산의 길이에 따라 조정할 수 있다. 가령, 적합한 혼성화 조건은 Hames와 Higgins(1985)의 책자에서 공개한 내용에 따라 조정할 수 있다.
CanIon 유전자의 게놈 서열
본원 발명은 CanIon의 게놈 서열에 관한다. 본원 발명에는 CanIon 유전자, SEQ ID No 1 내지 3 서열을 포함하는 CanIon 게놈 서열, 이들의 상보적 서열, 이들의 단편과 변이체가 포함된다. 이들 폴리뉴클레오티드는 정제, 분리 또는 재조합될 수 있다.
또한, 본원 발명에는 SEQ ID No 1 내지 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 이의 상보적 서열 또는 이의 단편을 포함하는 분리된, 정제된 또는 재조합된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 일반적으로, SEQ ID No 1 내지 3 뉴클레오티드 서열과 관련된 뉴클레오티드 차이는 핵산 전체에 무작위로 분포한다. 그럼에도 불구하고, 바람직한 핵산은 SEQ ID No 1 내지 3 뉴클레오티드 서열과 관련된 뉴클레오티드 차이가 엑손에 포함되는 코딩 서열 외부에 위치하는 핵산이다. 이들 핵산, 이들의 단편과 변이체는 테스트 시료에서 CanIon 유전자 사본의 존재를 검출하는, 또는 대안으로CanIon 서열에서 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브로 사용될 수 있다.
본원 발명의 다른 목적은 전술한 엄격한 혼성화 조건하에 SEQ ID No 1 내지 3 뉴클레오티드 서열, 이의 상보적 서열 또는 변이체와 혼성화되는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산에 관한다. 적절한 구체예에서, 상기 정제된, 분리된 또는 재조합된 핵산은 사람 CanIon 유전자의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화되고, 좀더 적절하게는 상기 핵산은 사람 CanIon 유전자의 뉴클레오티드와 혼성화할 수 있지만 쥐 CanIon 유전자의 핵선 서열과는 혼성화될 수 있다.
본원 발명의 특히 적합한 핵산에는 SEQ ID No 1 내지 3의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 또는 1000개의 연속 뉴클레오티드를 보유하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 임의 크기와 서열의 핵산 단편 역시 본 섹션에서 밝힌 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
CanIon 게놈 핵산은 44개의 엑손으로 구성된다. SEQ ID No 1 내지 3에서 엑손 위치는 하기 표 B에 상세하게 기술한다.
표 B
따라서, 본원 발명에는 CanIon 유전자의 44개 엑손에서 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보체 서열을 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 또한, 본원 발명은 CanIon 유전자의 적어도 2개 엑손의 조합을 포함하는 정제된, 분리된, 재조합된 핵산을 제공하는데, 여기서 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID No 1 내지 3에서와 동일한 순서로 상기 핵산에서 5' 말단에서 3' 말단으로 정렬된다.
인트론 1은 엑손 1과 엑손 2 사이에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 인트론의 위치는 표 A에 상세하게 기술한다. 따라서, 본원 발명에는 CanIon 유전자의 43개 인트론에서 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보체 서열을 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본 섹션의 타이틀이 "CanIon 유전자의 게놈 서열"이긴 하지만, 양 측면에서 CanIon의 게놈 서열에 접하는 또는 2개이상의 이런 게놈 서열간 임의의 크기와 서열의 핵산 단편 역시 본 섹션에서 밝힌 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
CanIon cDNA 서열
CanIon 유전자의 발현은 적어도 한가지 종류의 mRNA를 생산하는데, 이의 핵산 서열은 SEQ ID No 4에 제시한다.
본원 발명의 다른 목적은 SEQ ID No 4 뉴클레오티드 서열, 이의 상보적 서열, 대립유전자 변이체, 단편을 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산이다. 적절하게는, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드에는 SEQ ID No 4의 서열을 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 CanIon cDNA가 포함된다. 특히 적절하게는, 본원 발명의 핵산에는 SEQ ID No 4의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000개 뉴클레오티드의 연속 스팬(span) 또는 이의 보체를 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 적절한 구체예에서, 상기 스팬은 A12 내지 A16에서 선택되는 CanIon-관련된 이중대립인자 마커를 포함한다.
또한, 본원 발명은 SEQ ID No 4 폴리뉴클레오티드와 적어도 95% 뉴클레오티드 상동성, 바람직하게는 99% 뉴클레오티드 상동성, 좀더 바람직하게는 99.5% 뉴클레오티드 상동성, 가장 바람직하게는 99.8% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 이의 상보적 서열 또는 생물학적 활성 단편을 포함하는 분리되거나 정제된 핵산에 관한다.
본원 발명의 다른 목적은 전술한 엄격한 조건하에 SEQ ID No 4 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 폴리뉴클레오티드, 이의 상보적 서열, 변이체 또는 생물학적 활성 단편을 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산에 관한다.
본원 발명의 다른 목적은 SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산의 연속 스팬을 포함하는 CanIon 폴리펩티드를 인코드하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드에 관하는데, 여기서 상기 연속 스팬은 SEQ ID No 5의 아미노산 위치 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709중 적어도 1, 2, 3, 5 또는 10개를 보유한다. 또한, SEQ ID No 5의 아미노산 서열, 이의 유도체 또는 생물학적 활성 단편을 인코드하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID No 5의 아미노산 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 98, 99, 99.5 또는 99.8% 상동한 CanIon 폴리펩티드를 인코드하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드가 본원 발명에 포함된다.
SEQ ID No 4의 cDNA는 SEQ ID No 4의 1번 위치 뉴클레오티드에서 시작하여 65번 위치 뉴클레오티드에서 종결되는 5'-UTR 영역을 포함한다. SEQ ID No 4의 cDNA는 5283번 위치 뉴클레오티드에서 시작하여 6799 위치 뉴클레오티드에서 종결되는 3'-UTR 영역을 포함한다.
결과적으로, 본원 발명은 CanIon cDNA 5'UTR의 뉴클레오티드 서열, 이의 상보적 서열 또는 대립유전자 변이체를 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산에 관한다. 또한, 본원 발명은 CanIon cDNA 3'UTR의 뉴클레오티드 서열, 이의 상보적서열 또는 대립유전자 변이체를 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산에 관한다.
본 섹션의 타이틀이 "CanIon cDNA 서열"이긴 하지만, 양 측면에서 CanIon의 게놈 서열에 접하는 또는 2개이상의 이런 게놈 서열간 임의의 크기와 서열의 핵산 단편 역시 본 섹션에서 밝힌 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
코딩 영역
CanIon 개방해독틀은 SEQ ID No 4 cDNA의 상응하는 mRNA에 포함된다. 좀더 구체적으로, 효과적인 CanIon 코딩 서열(CDS)은 SEQ ID No 4의 66번 위치 뉴클레오티드(ATG 코돈의 첫 번째 뉴클레오티드)와 5282번 위치 뉴클레오티드(TGA 코돈의 마지막 뉴클레오티드)간 영역을 포함한다. 본원 발명은 SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 스팬을 포함하는 폴리펩티드를 인코드하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드에 관한다.
CanIon 유전자의 코딩 서열을 포함하는 전술한 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 신호의 조절하에 원하는 숙주 세포 또는 숙주 미생물에서 발현될 수 있다. 발현 신호는 본원 발명의 CanIon 유전자상의 조절 영역에 포함된 발현 신호이거나 또는 외인성 조절 핵산 서열이다. 이런 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 신호하에 발현 및/또는 증폭을 위한 벡터에 삽입될 수도 있다.
CanIon의 조절 서열
전술한 바와 같이, CanIon 유전자의 게놈 서열은 상기 유전자의 44개 엑손을포함하는 CanIon 코딩 영역에 접하는 비-코딩 5-측부영역과 비-코딩 3-측부영역에 조절 서열을 보유한다.
5'와 3' 조절 영역으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드는 테스트 시료에서 CanIon 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편의 1개이상 사본의 존재를 검출하는데 유용하다.
CanIon에 포함된 5'조절 영역의 프로모터 활성은 후술한 바와 같이 평가할 수 있다.
SEQ ID No 1의 유관한 생물학적 활성 폴리뉴클레오티드 단편 또는 변이체를 동정하기 위하여, 당업자는 마커 유전자(즉, 베타 갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 등)를 보유하는 재조합 벡터의 용도를 설명하는 Sambrook et al.(Sambrook, 1989)을 참조하는데, 상기 마커 유전자의 발현은 SEQ ID No 1의 생물학적 활성 폴리뉴클레오티드 단편 또는 변이체의 조절하에 검출될 수 있다. CanIon 유전자의 첫 번째 엑손의 상류에 위치한 게놈 서열은 적절한 프로모터 리포터 벡터, 예를 들면 pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer, pβgal-Basic, pβgal-Enhancer, pEGEP-1 프로모터 리포터 벡터(Clontech); 또는 pGL2-Basic, pGL3-Basic 무-프로모터 루시페라제 리포터 유전자 벡터(Promega)로 클론시킨다. 간단히 말하면, 이들 프로모터 리포터 벡터 각각은 쉽게 분석가능한 단백질, 예를 들면 배출된 알칼리성 포스파타제, 루시페라제, β-갈락토시다제 또는 녹색 형광 단백질을 인코드하는 리포터 유전자의 상류에 위치하는 다중 클로닝 부위를 보유한다. CanIon 코딩 영역의 상류 서열은 양 방향으로 리포터 유전자 상류의 클로닝 부위로 삽입되고 적합한 숙주 세포에 도입된다. 리포터 단백질의 수준은 클로닝 부위에 삽입체가 없는 벡터로부터 얻어진 수준과 비교 분석한다. 대조군 벡터에서 수준과 비교하여 삽입체를 보유하는 벡터에서 상승된 발현 수준의 존재는 삽입체에서 프로모터의 존재를 암시한다. 필요한 경우, 상류 서열은 약한 프로모터 서열로부터 전사 수준을 증가시키기 위한 인헨서를 보유하는 벡터에 클론할 수 있다. 삽입체가 없는 벡터에서 관찰되는 수준보다 현저하게 높은 발현 수준은 프로모터 서열이 삽입된 상류 서열에 존재한다는 것을 암시한다.
상류 게놈 DNA에서 프로모터 서열은 통상적인 기술, 예를 들면 엑소뉴클레아제 III 또는 적합한 제한 엔도뉴클레아제 절단으로 상류 DNA에서 중첩(nested) 5' 및/또는 3' 결실을 작제함으로써 추가로 정의한다. 생성된 결실 단편은 프로모터 리포터 벡터에 삽입하여 결실이 프로모터 활성을 감소 또는 소멸시키는 지를 확인할 수 있다(Coles et al.(1998)). 이런 방식으로, 경계를 정의할 수 있다. 원하는 경우, 프로모터에서 잠재적인 개별 조절 부위는 개별적으로 또는 복합적으로 프로모터내에서 잠재적인 전사 인자를 소멸시키는 특정 부위 돌연변이유발 또는 링커 스캐닝으로 확인할 수 있다. 전사 수준에 대한 이들 돌연변이의 효과는 돌연변이를 프로모터 리포터 벡터상의 클로닝 부위로 삽입하여 확인할 수 있다. 이런 유형의 분석법은 당분야에 공지된 것이다(WO 97/17359, US Patent No. 5, 374,544; EP 582 796; US Patent No. 5,698,389; US 5,643,746; US Patent No. 5,502,176; US Patent 5,266,488;).
CanIon 유전자의 프로모터의 강도와 특이성은 상이한 유형의 세포와 조직에서 CanIon 프로모터에 동작가능하게 연결된 검출가능한 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 통하여 평가할 수 있다. 검출가능한 폴리뉴클레오티드는 사전결정된 올리고뉴클레오티드 프로브와 특이적으로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드, 또는 CanIon 폴리펩티드, 이의 단편 혹은 변이체를 비롯한 검출가능한 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 이런 유형의 분석법은 당분야에 공지된 것이다(US Patent No. 5,502,176; US Patent No. 5,266,488). 이런 방법중 일부는 하기에 상술한다.
CanIon 코딩 영역의 5' 말단과 3' 말단에 위치하는 조절 요소를 보유하는 폴리뉴클레오티드는 관심있는 이질성 폴리뉴클레오티드의 전사와 번역 활성을 조절하는데 효과적으로 사용할 수 있다.
따라서, 본원 발명은 5'와 3' 조절 영역에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리되거나 정제된 핵산, 이의 상보적 서열, 생물학적 활성 단편 또는 변이체에 관한다. 한 측면에서, "5' 조절 영역"은 SEQ ID No 1의 1 내지 2000번 위치에 존재하는 뉴클레오티드에 존재한다. 한 측면에서, "3' 조절 영역은 SEQ ID No 3의 45842 내지 47841번 위치에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 존재한다.
또한, 본원 발명은 5'와 3' 조절 영역에서 선택되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 95% 뉴클레오티드 상동성, 바람직하게는 99% 뉴클레오티드 상동성, 좀더 바람직하게는 99.5% 뉴클레오티드 상동성, 가장 바람직하게는 99.8% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리되거나 정제된 핵산, 이의 상보적 서열, 변이체 또는 생물학적 활성 단편에 관한다.
본원 발명의 다른 목적은 전술한 엄격한 조건하에 5'와 3' 조절 영역의 뉴클레오티드 서열, 이의 상보적 서열, 변이체 또는 생물학적 활성 단편에서 선택되는 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산에 관한다.
적절하게는, 5' 조절 영역의 단편은 대략 1500 내지 1000개, 바람직하게는 500개, 좀더 바람직하게는 400개, 이보다 좀더 바람직하게는 300개, 가장 바람직하게는 200개의 뉴클레오티드를 보유한다.
적절하게는, 3' 조절 영역의 단편은 적어도 50, 100, 150, 200, 300, 400개의 염기이다.
SEQ ID No 1과 3의 "생물학적 활성" 폴리뉴클레오티드 유도체는 재조합 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 조절 영역으로 기능하는 상기 폴리뉴클레오티드의 단편을 포함하는 또는 상기 단편으로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 이는 인헨서 또는 억제체로 작용할 수 있다.
본원 발명에서, 조절 폴리뉴클레오티드가 전사와 번역 조절 정보를 담고 있는 뉴클레오티드 서열을 보유하고 이런 서열이 원하는 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 또는 원하는 폴리뉴클레오티드에 "동작가능하게 연결되는" 경우에 이런 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 조절 영역으로 "기능한다".
본원 발명의 조절 뉴클레오티드는 Sambrook et al.(1989)에서 밝힌 바와 같이 적절한 제한 효소를 이용한 절단으로 SEQ ID No 1 내지 3의 뉴클레오티드 서열로부터 만들 수 있다. 조절 폴리뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제 효소, 예를 들면 Bal31(Wabiko et al., 1986)로 SEQ ID No 1 내지 3을 절단하여 만들 수도 있다. 또한, 이들 조절 폴리뉴클레오티드는 본원에서 밝힌 핵산 화학적 합성으로 만들 수 있다.
본원 발명에 따른 조절 폴리뉴클레오티드는 원하는 숙주 세포 또는 숙주 미생물에서 코딩 서열을 발현하는데 사용할 수 있는 재조합 발현 벡터의 일부분이 될 수 있다. 본원 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 본원에서 제시한다.
적절하게는, 본원 발명의 5'-조절 폴리뉴클레오티드는 CanIon cDNA의 5-비번역 영역(5'-UTR), 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다.
적절하게는, 본원 발명의 3'-조절 폴리뉴클레오티드는 CanIon cDNA의 3-비번역 영역(3'-UTR), 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다.
본원 발명의 다른 목적은 다음과 같이 구성되는 분리된 또는 정제된 핵산을 제공하는 것이다:
a) 다음에서 선택되는 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산:
(i) 5' 조절 영역의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 서열을
포함하는 뉴클레오티드 서열 ;
(ii) 5' 조절 영역의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%의
뉴클레오티드 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보성
서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열;
(iii) 엄격한 혼성화 조건하에 5' 조절 영역의 뉴클레오티드 서열과
혼성화되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 서열을 포함하는
뉴클레오티드 서열 ;
(iv) (ⅰ),(ⅱ), (ⅲ) 뉴클레오티드의 생물학적 활성 단편 또는 변이체
b) 상기 (a) 정의된 핵산에 동작가능하게 연결되고 원하는 폴리펩티드 또는 핵산을 인코드하는 폴리뉴클레오티드;
c) 선택적으로, 3'-조절 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 CanIon 유전자의 3'-조절 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
상기 정의된 핵산의 특정 구체예에서, 핵산은 CanIon cDNA의 5'-비번역 영역(5'-UTR), 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다.
상기 정의된 핵산의 다른 특정 구체예에서, 핵산은 CanIon cDNA의 3'-비번역 영역(3'-UTR), 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다.
5'-비번역 영역(5'-UTR)의 조절 폴리뉴클레오티드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체는 원하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 동작가능하게 연결된다.
3'-비번역 영역(3'-UTR)의 조절 폴리뉴클레오티드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체는 원하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 동작가능하게 연결된다.
전술한 핵산에 의해 인코드되는 원하는 폴리펩티드는 다양한 특성 또는 기원을 보일 수 있는데, 여기에는 진핵과 원핵 기원의 단백질이 포함된다. CanIon 조절 영역의 조절하에 발현되는 폴리펩티드에는 박테리아, 진균 또는 바이러스 항원이 포함된다. 또한, 진핵 단백질, 예를 들면 "하우스 키핑" 단백질과 같은 세포내 단백질; 수용체와 같은 막-결합된 단백질; 내인성 매개물질(예, 사이토킨)과 같은 배출된 단백질이 포함된다. 원하는 폴리펩티드는 CanIon 단백질, 특히 SEQ ID No 5의 아미노산 서열로 구성되는 단백질, 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
전술한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 원하는 핵산, 일반적으로 RNA 분자는 원하는 코딩 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 CanIon 코딩 서열에 상보적이고, 따라서 안티센스 폴리뉴클레오티드로 유용하다.
이런 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 또는 숙주 미생물에서 원하는 폴리펩티드 또는 원하는 핵산을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터에 포함될 수 있다. 이런 폴리뉴클레오티드를 포함하는데 적합한 재조합 벡터는 전술한 바 있다.
폴리뉴클레오티드 구조체
본원에서 ""폴리뉴클레오티드 구조체"와 "재조합 폴리뉴클레오티드"는 동일한 의미를 갖고 인위적으로 설계되고 최초 고유 환경에서 연속 뉴클레오티드 서열로 발견되지 않는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형이나 환형의 분리되거나 정제된 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
재조합 세포 숙주와 유전자도입 동물에서 시간적, 공간적 CanIon 유전자 발현을 조절하는 DNA 구조체
세포 수준과 다세포 미생물 수준에서 CanIon 단백질 합성의 결핍으로 인한 생리적, 표현형 결과를 조사하기 위하여, 본원 발명에는 CanIon 게놈 서열이나cDNA의 특정 대립유전자 및 SEQ ID No 1 내지 4의 CanIon 뉴클레오티드 서열이나 이의 단편과 관련하여 하나이상 염기의 치환, 결실 혹은 부가를 보유하는 상기 게놈 서열이나 cDNA 사본의 조건 발현을 가능하게 하는 DNA 구조체와 재조합 벡터가 포함되는데, 여기서 염기 치환, 결실, 부가는 엑손, 인트론 또는 조절 서열, 바람직하게는 5'-조절 서열, CanIon 게놈 서열의 엑손 또는 SEQ ID No 4의 CanIon cDNA에 위치한다. 적절한 구체예에서, CanIon 서열은 본원 발명에 따른 이중대립인자 마커를 포함한다. 적절한 구체예에서, CanIon 서열은 본원 발명에 따른 이중대립인자 마커, 바람직하게는 이중대립중 마커 A1 내지 A17중 한가지를 포함한다.
본원 발명에는 본원 발명에서 밝힌 폴리뉴클레오티드중 임의 하나로 구성되는 재조합 벡터가 포함된다. 좀더 구체적으로, 본원 발명에 다른 폴리뉴클레오티드 구조체는 "CanIon 유전자의 게놈 서열" 섹션, "CanIon cDNA 서열" 섹션, "코딩 영역" 섹션, "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머" 섹션에서 밝힌 폴리뉴클레오티드중 임의 하나로 구성될 수 있다.
바람직한 첫 번째 DNA 구조체는 Gossen et al.(1992, 1995)과 Furth et al.(1994)에서 밝힌 바와 같이 CanIon 유전자 발현을 조절하는 대장균(E. Coli) 트랜스포손 Tn10으로부터 유래된 테트라사이클린 저항성 오페론tet에 기초한다. 이런 DNA는 Tn10으로부터 유래된 7개의tet오퍼레이터 서열(tetop)을 보유하는데, 이들 서열은 CanIon 유전자의 최소 프로모터 또는 5'-조절 서열에 융합되고, 상기 최소 프로모터 또는 CanIon 조절 서열은 센스 혹은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 CanIon 폴리펩티드 혹은 이의 펩티드 단편을 비롯한 폴리펩티드를 코딩하는폴리뉴클레오티드에 동작가능하게 연결된다. 이런 DNA 구조체는 동일 세포가 프로모터, 예를 들면 HCMVIE1 인헨서/프로모터 또는 MMTV-LTR의 조절하에 단순 포진 바이러스의 바이러스 단백질 VP16의 활성화 도메인에 융합된 야생형(tTA) 또는 돌연변이(rTA) 억제체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우에, 관심있는 뉴클레오티드 서열에 대한 조건 발현 시스템으로 기능한다. 실제로, 본원 발명의 바람직한 DNA 구조체는tet오퍼레이터 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 tTA 또는 rTA 억제체를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된다.
특정 구체예에서, 조건 발현 DNA 구조체는 돌연변이 테트라사이클린 억제체 rTA를 인코드하는 서열을 보유하는데, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 발현은 테트라사이클린의 부재하에서는 침묵하고 이의 존재하에서는 유도된다.
상동성 재조합을 가능하게 하는 DNA 구조체: 치환 벡터
바람직한 두 번째 DNA 구조체는 5'-말단에서 3'-말단까지 다음과 같이 구성된다: (a) CanIon 게놈 서열에 포함되는 제 1 뉴클레오티드 서열; (b) 양성(positive) 선별 마커, 예를 들면 네오마이신 저항성(neo) 마커를 포함하는 뉴클레오티드 서열; (c) CanIon 게놈 서열에 포함되고 게놈에서 (a) CanIon 뉴클레오티드 서열의 하류 게놈에 위치하는 제 2 뉴클레오티드 서열.
적절한 구체예에서, 상기 DNA 구조체는 (a) 뉴클레오티드 서열 상류 또는 (c) 뉴클레오티드 서열 하류에 위치하는 음성(negative) 선별 마커로 구성된다. 적절하게는, 음성 선별 마커는 티미딘 키나아제(tk) 유전자(Thomas et al., 1986), 히그로마이신 베타 유전자(Te Riele et al., 1990), hprt 유전자(Van der Lugt etal., 1991; Reid et al., 1990) 또는 디프테리아 독소 A 단편(Dt-A) 유전자(Nada et al., 1993; Yagi et al. 1990)로 구성된다. 적절하게는, 양성 선별 마커는 CanIon 단백질을 인코드하는 서열을 깨뜨리기 위하여 CanIon 엑손 서열내에 위치시킨다. 이들 치환 벡터는 Thomas et al.(1986; 1987); Mansour et al.,(988); Koller et al.(1992)에서 기술한다.
제 1과 제 2 뉴클레오티드 서열 (a)와 (c)는 CanIon 조절 서열, 인트론 서열, 엑손 서열, 또는 조절 서열, 인트론 서열 및/또는 엑손 서열을 포함하는 서열내에 독립적으로 위치시킬 수 있다. 뉴클레오티드 서열 (a)와 (c)의 크기는 1 내지 50kb, 바람직하게는 1 내지 10kb, 좀더 바람직하게는 2 내지 6kb, 가장 바람직하게는 2 내지 4kb이다.
상동성 재조합을 가능하게 하는 DNA 구조체: Cre-LoxP 시스템
이들 신규한 DNA 구조체는 P1 파지의 부위 특이적 재조합 시스템을 이용한다. P1 파지는 34 염기쌍 loxP와 특이적으로 상호작용하는 Cre라고 하는 재조합효소(recombinase)를 보유한다. loxP 부위는 8bp 보존된 서열에 의해 분리되는 13bp의 팰린드롬 서열 2개로 구성된다(Hoess et al., 1986). 동일 배향된 2개의 loxP 부위사이에서 Cre 효소에 의한 재조합은 DNA 단편의 결실을 초래한다.
상동성 재조합 기술과 짝으로 사용되는 Cre-loxP 시스템은 Gu et al.(1993, 1994)에서 처음으로 기술되었다. 간단히 말하면, 게놈의 표적 위치로 삽입되는 뉴클레오티드 서열은 동일 배향되고 재조합 게놈으로부터 절단되는 뉴클레오티드 서열의 각 말단에 위치하는 적어도 2개의 loxP 부위를 보유한다. 절단은 재조합 세포 숙주의 핵내에 재조합효소(Cre) 효소의 존재를 필요로 한다. 재조합효소 효소는 (a) Araki et al.(1995)에서 밝힌 바와 같이 Cre 효소를 원하는 세포에 직접 주사하여 또는 Baubonis et al.(1993)에서 밝힌 바와 같이 상기 효소의 세포로의 리포펙션으로 이런 효소를 함유하는 배양 배지에서 재조합 세포 숙주를 배양하고; (b) 재조합 세포 숙주에서 기능하는 프로모터에 동작가능하게 연결된Cre코딩 서열을 포함하는 벡터로 숙주 세포를 트랜스펙션시키고, 상기 프로모터는 상기 세포 숙주에서 선택적으로 유도되고, 상기 벡터는 Gu et al.(1993)와 Sauer et al.(1988)에서 밝힌 바와 같이 재조합 세포 숙주에 도입되고; (c) 재조합 숙주 세포에서 기능하는 프로모터에 동작가능하게 연결된Cre코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포 숙주의 게놈에 도입하고, 상기 프로모터는 상기 숙주 세포에서 선택적으로 유도되고, 상기 폴리뉴클레오티드는 Gu et al.(1994)에서 밝힌 바와 같이 무작위 삽입 또는 상동성 재조합으로 세포 숙주의 게놈에 삽입된다.
특정 구체예에서, 상동성 재조합으로 CanIon 유전자에 삽입되는 서열을 포함하는 벡터는 선별 마커가 동일 배향의 loxP가 측면에 접하도록 작제하는데, Cre 효소 처리로 선별 마커는 제거하면서 상동성 재조합에 의해 삽입된 CanIon 서열은 존속하도록 하는 것이 가능하다. 한번 더, 2개의 선택 마커가 필요하다: 재조합 현상을 선별하는 양성 선별 마커 및 상동성 재조합 현상을 선별하는 음성 선별 마커. Cre-loxP 시스템을 이용한 벡터와 방법은 Zou et al.(1994)에서 기술한다.
따라서, 바람직한 본원 발명의 세 번째 DNA 구조체는 5'-말단에서 3'-말단까지 다음과 같이 구성된다: (a) CanIon 게놈 서열을 포함하는 제 1 뉴클레오티드 서열; (b) 양성 선별 마커를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열은 재조합효소에 의해 인식되는 부위, 예를 들면 loxP 부위를 정의하는 2개의 서열을 추가로 포함하고, 상기 두 부위는 동일 배향으로 위치하고; (c) CanIon 게놈 서열로 구성되고 게놈에서 (a) CanIon 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는 제 2 뉴클레오티드 서열.
적절하게는, 재조합효소에 의해 인식되는 부위, 예를 들면 loxP 부위를 정의하는 서열은 (b) 뉴클레오티드 서열에서, 조건 절단이 요구되는 뉴클레오티드 서열에 인접하는 위치에서 존재한다. 특정 구체예에서, 2개의 loxP 부위는 상동성 재조합이후 원하는 시점에 절단을 가능하게 하기 위하여 각각의 양성 선별 마크 서열에 위치시킨다.
전술한 세 번째 DNA 구조체를 이용한 방법의 적절한 구체예에서, 재조합효소에 의해 인식되는 두 부위, 바람직하게는 두 개의 loxP 부위가 측면에서 접하는 폴리뉴클레오티드 단편의 절단은 Gu et al.(1994)에서 밝힌 바와 같이 재조합 숙주 세포 게놈에서 프로모터 서열, 바람직하게는 유도성 프로모터, 좀더 바람직하게는 조직-특이적 프로모터 서열, 가장 바람직하게는 유도성이고 조직-특이적인 프로모터 서열에 동작가능하게 연결된 Cre 효소를 인코드하는 서열의 존재로 인하여 원하는 시점에 실행된다.
재조합 숙주 세포의 게놈에서 Cre 효소의 존재는 Gu et al.(1994)에서 밝힌 바와 같이 2마리의 유전자도입 동물, 전술한 바와 같이 loxP 부위를 보유하는 CanIon-유래된 서열을 포함하는 제 1 유전자도입 동물 및 적합한 프로모터 서열에동작가능하게 연결된Cre코딩 서열을 포함하는 제 2 유전자도입 동물의 번식으로부터 유래할 수 있다.
또한, Cre 효소 발현의 공간적-시간적 조절은 Graham(1995)과 Kanegae et al.(1995)에서 밝힌 바와 같이 Cre 유전자를 보유하여 세포의 감염 또는 장기의in vivo감염, Cre 효소의 전달을 가능하게 하는 아데노바이러스 기초한 벡터로 달성할 수 있다.
전술한 DNA 구조체는 본원 발명의 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 CanIon 게놈 서열이나 CanIon cDNA 서열, 가장 바람직하게는 CanIon 게놈이나 cDNA 서열의 변형된 사본을 표적 게놈의 사전결정된 위치에 도입하여 표적 유전자의 변형된 사본 발생 또는 상동성 재조합이 일어나도록 할 만큼 상동한 다른 사본에 의한 표적 유전자 사본의 치환(적중 상동성 재조합)을 유도하는데 사용할 수 있다. 특정 구체예에서, 전술한 DNA 구조체는 적어도 1개의 이중대립인자 마커를 포함하는 CanIon 게놈 서열 또는 CanIon cDNA 서열을 도입하는데 사용할 수 있다.
핵 안티센스 DNA 구조체
본원 발명의 벡터를 함유하는 다른 조성물은 핵산 서열 SEQ ID No 4의 올리고뉴클레오티드 단편, 바람직하게는 CanIon 유전자의 개시 코돈을 포함하는 단편을 상응하는 CanIon 유전자의 발현을 저해하는 안티센스 도구로 포함한다. 본원 발명에 다른 안티센스 폴리뉴클레오티드를 이용하는 바람직하는 방법은 Sczakiel et al.(1995)에서 밝힌 과정 또는 WO 95/24223에서 밝힌 과정이다.
적절하게는, 안티센스 도구는 CanIon mRNA의 5'말단에 상보적인 폴리뉴클레오티드(15-200bp)에서 선택된다. 한 구체예에서, 원하는 표적 유전자의 상이한 부분에 상보적인 개별 안티센스 폴리뉴클레오티드의 조합을 사용한다.
본원 발명에 따른 바람직한 안티센스 폴리뉴클레오티드는 번역 개시 코돈 ATG 또는 접합 부위를 보유하는 CanIon mRNA의 서열에 상보적이다. 본원 발명에 따른 다른 바람직한 안티센스 폴리뉴클레오티드는 CanIon mRNA의 접합 부위에 상보적이다.
적절하게는, 본원 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는 Liu et al.(1994)에서 밝힌 바와 같이 자가-절단 리보자임 서열로 치환되는 3' 폴리아데닐화 신호를 갖고, 따라서 RNA 중합효소 II 전사체는 3' 말단에 poly(A)가 없고, 이들 안티센스 폴리뉴클레오티드는 핵으로 배출될 수 없다. 적절한 구체예에서, 이들 CanIon 안티센스 폴리뉴클레오티드는 Eckner et al.(1991)에서 밝힌 구조와 같이 절단된 전사체를 3'-5' 엑소뉴클레아제 분해로부터 안정화시키는 히스톤 스템-루프 구조를 리보자임 카세트에 포함한다.
올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머
CanIon 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드는 테스트 시료에서 SEQ ID No 1내지 4와 6 뉴클레오티드 서열, 이의 단편, 보체 또는 변이체의 1개이상 사본의 존재를 검출하는데 유용하다.
본원 발명의 특히 바람직한 프로브와 프라이머는 SEQ ID No 1 내지 3의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000또는 2000개 뉴클레오티드의 연속 스팬 또는 이의 보체를 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드를 보유한다. 본원 발명의 좀더 바람직한 프로브와 프라이머는 상기 연속 스팬이 A1 내지 A17에서 선택되는 이중대립인자 마커를 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드를 보유한다.
본원 발명의 다른 목적은 SEQ ID No 4의 뉴클레오티드 서열, 이의 보체 서열, 대립유전자 변이체, 단편을 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산이다. 이에 더하여, 본원 발명의 바람직한 프로브와 프라이머는 SEQ ID 4를 포함하는 정제된, 분리된, 재조합된 CanIon cDNA를 보유한다. 본원 발명의 특히 바람직한 프로브와 프라이머는 SEQ ID 4의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000개, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 6000개의 연속 뉴클레오티드 또는 이의 보체를 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드를 보유한다. 본원 발명의 좀더 바람직한 프로브와 프라이머는 SEQ ID 4의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000개, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 6000개 뉴클레오티드의 연속 스팬 또는 이의 보체를 포함하고 상기 연속 스팬이 A1 내지 A17에서 선택되는 이중대립인자 마커를 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드를 보유한다.
다른 구체예에서, 본원 발명의 프로브와 프라이머는 SEQ ID 6의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 또는 400개 뉴클레오티드의 연속 스팬 또는 이의 보체를 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드를 보유한다. 적절한 구체예에서, SEQ ID No 6의 연속 스팬은 이중대립인자 마커 A18을 포함한다.
따라서, 본원 발명은 엄격한 혼성화 조건하에 SEQ ID No 1과 3의 사람 CanIon 뉴클레오티드 서열, 이의 상보적 서열 또는 변이체와 특이적으로 혼성화되는 핵산 프로브에 관한다.
한 구체예에서, 본원 발명에는 SEQ ID No 1 내지 4와 6중 한가지의 8 내지 50개 뉴클레오티드의 연속 스팬으로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드가 포함되는데, 여기서 상기 스팬은 서열에 CanIon-관련된 이중대립인자 마커를 보유하고, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형의 이중대립인자 마커에서 선택된다. 선택적으로, 연속 스팬은 18 내지 35개 뉴클레오티드이고 이중대립인자 마커는 상기 폴리뉴클레오티드 중심으로부터 4개 뉴클레오티드 이내에 존재한다; 선택적으로, 연속 스팬은 25개 뉴클레오티드이고 이중대립인자 마커는 상기 폴리뉴클레오티드 중심에 존재한다; 선택적으로, 연속 뉴클레오티드의 3'말단은 상기 뉴클레오티드의 3'말단에 존재한다; 선택적으로, 연속 뉴클레오티드의 3'말단은 상기 뉴클레오티드의 3'말단에 존재하고 이중대립인자 마커는 상기 폴리뉴클레오티드의 3'말단에 존재한다. 적절한 구체예에서, 프로브는 다음의 서열: P1 내지 P18과 이의 상보적 서열에서 선택되는 서열로 구성된다.
다른 구체예에서, 본원 발명에는 SEQ ID No 1 내지 4의 8 내지 50개 뉴클레오티드의 연속 스팬 또는 이의 보체로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드가 포함되는데, 여기서 상기 연속 스팬의 3'말단은 상기 폴리뉴클레오티드의 3'말단에 위치하고, 상기 폴리뉴클레오티드의 3'말단은 서열에서 CanIon-관련된 이중대립인자 마커 상류의 20개 뉴클레오티드이내에 위치한다; 선택적으로, CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형의 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드의 3'말단은 서열에서 CanIon-관련된 이중대립인자 마커 상류의 1 뉴클레오티드에 위치한다; 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 다음의 서열: D1 내지 D18과 E1 내지 E18에서 선택되는 서열로 구성된다.
다른 구체예에서, 본원 발명에는 다음의 서열: B1 내지 B17과 C1 내지 C17에서 선택되는 서열로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
다른 구체예에서, 본원 발명에는 혼성화 분석, 염기서열분석, SEQ ID No 1 내지 4와 6 또는 이의 보체에서 CanIon-관련된 이중대립인자 마커에서 뉴클레오티드의 정체를 확인하기 위한 효소-기초한 미스매치 검출 방법에 사용되는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID No 1 내지 4와 6 또는 이의 보체에서 CanIon-관련된 이중대립인자 마커를 포함하는 뉴클레오티드의 분절을 증폭하는데 사용되는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본원 발명은 CanIon-관련된 이중대립인자 마커에서 뉴클레오티드의 실체를 확인에서 분석, 바람직하게는 혼성화 분석, 염기서열분석, 마이크로염기서열분석 또는 효소-기초한 미스매치 검출 분석 및 CanIon-관련된 이중대립인자 마커를 포함하는 뉴클레오티드 분절의 증폭에서 본원 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한다.
본원 발명에 따른 프로브 또는 프라이머는 8 내지 1000개의 뉴클레오티드, 좀더 구체적으로, 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 1000의 뉴클레오티드를 갖는다. 좀더 구체적으로, 이들 프로브와 프라이머의 길이는 8, 10, 15, 20 또는 30 내지 100, 바람직하게는 10 내지 50, 좀더 바람직하게는 15 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 좀더 짧은 프로브와 프라이머는 표적 핵산 서열에 대한 특이성이 결핍되는 경향이 있고, 일반적으로 주형과 안정적인 하이브리드 복합체를 형성하는데 좀더 낮은 온도를 필요로 한다. 좀더 긴 프로브와 프라이머는 만드는데 비용이 많이 들고, 때때로 자가-혼성화되어 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 특정한 분석 조건하에 프라이머와 프로브의 적합한 길이는 당업자가 경험적으로 판단할 수 있다. 적합한 프로브 또는 프라이머는 서열 리스트에서 개별 위치가 각각 표 1, 2, 3에 제시된 P1 내지 P18과 이의 상보적 서열, B1 내지 B17, C1 내지 C17, D1 내지 D18, E1 내지 E18의 뉴클레오티드 서열에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산으로 구성된다.
안정한 하이브리드의 형성은 DNA의 융점(Tm)에 의존한다. Tm은 프라이머 또는 프로브의 길이, 용액의 이온력, G+C 함량에 따라 달라진다. 프라이머 또는 프로브의 G+C 함량이 높을수록 융점이 높은데, 그 이유는 G:C 쌍은 3개의 수소 결합을 갖는 반면 A:T는 2개의 수소 결합을 갖기 때문이다. 본원 발명의 프로브에서 GC 함량은 10 내지 75%, 바람직하게는 35 내지 60%, 좀더 바람직하게는 40 내지 55%이다.
프라이머와 프로브는 임의의 적절한 방법, 예를 들면 적합한 서열의 클로닝과 제한 및 Narang et al.(1979)의 포스포디에스터 방법, Brown et al.(1979)의 포스포디에스터 방법, Beaucage et al.(1981)의 디에틸포스포라미디트 방법, EP 0 707 592에서 밝힌 고체 서포트 방법과 같은 방법에 의한 직접적인 화학적 합성으로 만들 수 있다.
검출 프로브는 일반적으로 핵산 서열 또는 하전되지 않은 핵산 유사체, 예를 들면 국제 특허 출원 WO 92/20702에 개시된 펩티드 핵산, 미국 특허 5, 185,44; 5,034,506, 5,142,047에서 기술된 모폴리노 유사체이다. 프로브는 dNTP가 추가로 부가될 수 없다는 점에서 "확장-불가능"하다. 본질적으로 유사체는 확장-불가능하고, 핵산 프로브는 3'말단을 변형시켜 하이드록실기가 더 이상 신장에 참여할 수 없도록 함으로써 확장-불가능하게 만들 수 있다. 가령, 프로브의 3'말단은 포획이나 검출 라벨로 기능화시켜 하이드록실기를 소모 또는 차단할 수 있다. 대안으로, 3'하이드록실기는 절단, 치환 또는 변형할 수 있다(U.S. Patent No. 07/049,061, filed April 19, 1993).
본원 발명의 폴리뉴클레오티드는 현미경적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단으로 탐지할 수 있는 당분야에 공지된 라벨을 통합하여 표지할 수 있다. 가령, 유용한 라벨에는 방사성 물질(예,32P,35S,3H,125I), 형광 염료(예, 5-브로모디속시우리딘, 플루레신, 아세틸아미노플루오렌, 디옥시제닌) 또는 비오틴이 포함된다. 적절하게는, 폴리뉴클레오티드는 3'와 5'말단에 표지한다. 핵산 단편의 비-방사성 표지는 프랑스 특허 No. FR-7810975, Urdea et al(1988); Sanchez-Pescador et al.(1988)에서 기술한다. 이에 더하여, 본원 발명에 따른 프로브는 신호 증폭을 가능하게 하는 구조적 특징을 가질 수 있는데, 이런 구조적 특징은 예로써 Urdea et al.(1991) 또는 EP 0 225 807 (Chiron)에서 밝힌 것과 같은 분지쇄 DNA 프로브이다.
라벨은 프라이머를 포획하여 고형 서포트에 프라이머 또는 프라이머 신장 산물, 예를 들면 증폭된 DNA의 고정을 용이하게 하는데 사용할 수 있다. 포획 라벨은 프라이머 또는 프로브에 부착되는데, 고체상 시약의 특이적 결합 구성원(예, 비오틴과 스트렙타비딘)과 결합쌍을 형성하는 특이적인 결합 구성원일 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 또는 프로브에 의해 포함되는 라벨의 종류에 따라, 표적 DNA를 포획 또는 검출하는 것이 가능하다. 게다가, 본원에 제시된 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포획 라벨로서 기능한다. 가령, 고체상 시약의 결합 구성원이 핵산 서열인 경우에, 프라이머 또는 프로브의 상보성 영역에 결합하여 상기 프라이머 또는 프로브를 고체상에 고정시키는 포획 라벨을 선택한다. 폴리뉴클레오티드 프로브 자체가 결합 구성원으로 기능하는 경우에, 이런 프로브가 표적과 상보적이지 않은 서열 또는 "꼬리"를 보유한다. 폴리뉴클레오티드 프라이머 자체가 포획 라벨로 기능하는 경우에, 프라이머의 적어도 일부는 고체상에서 핵산과 자유롭게 혼성화된다. DNA 표지 기술은 당업자에게 공지된 것이다.
본원 발명의 프로브는 다수의 목적에 유용하다. 이들은 특히, 게놈 DNA에 대한 서던 혼성화에 사용할 수 있다. 프로브는 PCR 증폭 산물을 검출하는데도 사용할 수 있다. 또한, 이들은 다른 기술을 활용하여 CanIon 유전자 또는 mRNA에서미스매치를 검출하는데 사용할 수 있다. 이들은 예로써 노던 블랏에서 CanIon 유전자의 발현을 검출하는데 사용될 수도 있다.
본원 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머, 프로브는 고체상에 쉽게 고정시킬 수 있다. 고체 서포트는 당업자에게 공지된 것으로, 여기에는 반응 트레이의 웰 벽, 테스트 튜브, 폴리스티렌 비드, 자성 비드, 니트로셀룰로오스 스트립, 막, 마이크로입자(예, 라텍스 입자), 양(또는 다른 동물) 적혈구, 두라사이트(duracyte) 등이 포함된다. 고형 서포트는 중요하지 않고 당업자가 선택할 수 있다. 따라서, 라텍스 입자, 마이크로입자, 자성이나 비-자성 비드, 막, 플라스틱 튜브, 마이크로역가 웰의 벽, 유리나 실리콘 칩, 양(또는 다른 동물) 적혈구, 두라사이트 모두 적합하다. 핵산을 고체상에 고정시키는데 적합한 방법에는 이온 결합, 소수성 결합, 공유 결합 등이 포함된다. 본원에서 고체 서포트는 불용성이거나 또는 후속 반응으로 불용화시킬 수 있는 물질을 의미한다. 고체 서포트는 포획 시약을 유인하고 고정시키는 내적 능력으로 선택할 수 있다. 대안으로, 고체상은 포획 시약을 유인하고 고정시키는 능력을 갖는 추가적인 수용체를 보유할 수 있다. 추가적인 수용체에는 포획 시약 자체 또는 포획 시약에 공액되는 하전된 물질과 관련하여 반대로 하전된 물질이 포함될 수 있다. 또 다른 대안으로, 수용체 분자는 고체 서포트에 고정되고(부착되고) 특이적인 결합 반응을 통하여 포획 시약을 고정시킬 수 있는 능력을 갖는 임의의 특이적인 결합 구성원일 수 있다. 수용체 분자는 분석의 실시에 앞서 또는 실시동안 고체 서포트 물질에 대한 포획 시약의 간접적인 결합을 가능하게 한다. 따라서, 고체상은 당업자에게 공지된 플라스틱, 파생된 플라스틱,자성이나 비-자성 물질, 테스트 튜브의 유리나 실리콘 표면, 마이크로역가 웰, 시트, 비드, 마이크로입자, 칩, 양(또는 다른 동물) 적혈구, 두라사이트 및 다른 형태일 수 있다. 본원 발명의 폴리뉴클레오티드는 고체 서포트에 개별적으로 또는 본원 발명에 따른 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 또는 25개의 개별 폴리뉴클레오티드의 집합으로 단일 고체 서포트에 고정 또는 부착시킬 수 있다. 이에 더하여, 본원 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 제외한 다른 폴리뉴클레오티드를 본원 발명에 따른 하나 또는 복수의 폴리뉴클레오티드와 동일한 고체 서포트에 부착시킬 수 있다.
결과적으로, 본원 발명은 시료에서 SEQ ID No 1 내지 4와 6, 이의 단편 또는 변이체에서 선택되는 뉴클레오티드 서열 및 이의 상보적 서열을 포함하는 핵산의 존재를 검출하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다.
a) SEQ ID No 1 내지 4와 6의 핵산, 이의 단편 또는 변이체에서 선택되는 핵산에 포함되는 뉴클레오티드 서열 및 이의 상보적 서열과 혼성화될 수 있는 핵산 프로브 또는 복수의 핵산 프로브를 분석 시료와 접촉시키고;
b) 시료에서 프로브와 핵산간에 형성된 하이브리드 복합체를 검출한다.
또한, 본원 발명은 시료에서 SEQ ID No 1 내지 4와 6, 이의 단편 또는 변이체에서 선택되는 뉴클레오티드 서열 및 이의 상보적 서열을 포함하는 핵산의 존재를 검출하는 키트에 관하는데, 상기 키트는 다음과 같이 구성된다:
a) SEQ ID No 1 내지 4와 6, 이의 단편 또는 변이체에서 선택되는 핵산에 포함되는 뉴클레오티드 서열 및 이의 상보적 서열과 혼성화될 수 있는 핵산 프로브 또는 복수의 핵산 프로브;
b) 선택적으로, 혼성화 반응을 실행하는데 필요한 시약.
이런 검출 방법과 키트의 적절한 첫 번째 구체예에서, 핵산 프로브 또는 복수의 핵산 프로브는 검출가능한 분자로 표지한다. 상기 방법과 키트의 적절한 두 번째 구체예에서, 핵산 프로브 또는 복수의 핵산 프로브는 기질에 고정된다. 세 번째 구체예에서, 핵산 프로브 또는 복수의 핵산 프로브는 P1 내지 P18과 이의 상보적 서열, B1 내지 B17, C1 내지 C17, D1 내지 D18, E1 내지 E18의 뉴클레오티드 서열, 또는 A1 내지 A18과 이의 보체에서 선택되는 이중대립인자 마커에서 선택되는 서열을 포함한다.
올리고뉴클레오티드 분석
본원 발명에 따른 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브를 포함하는 기질은 CanIon 유전자에서 표적 서열을 검출 또는 증폭하는데 사용할 수 있고, CanIon 유전자의 코딩이나 비-코딩 서열에서 돌연변이를 검출하는데 사용할 수 있다.
본원에 제시된 임의의 폴리뉴클레오티드는 고체 서포트에서 중복 지역이나 또는 무작위 위치에 부착시킬 수 있다. 대안으로, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드는 정렬된 어레이에 부착시킬 수 있는데, 여기서 각 폴리뉴클레오티드는 다른 폴리뉴클레오티드의 부착 위치와 중복되지 않는 고체상의 개별 위치에 부착된다. 적절하게는, 폴리뉴클레오티드의 이런 정렬된 어레이는 "어드레스가능(addressable)"한데, 여기서 개별 위치는 기록되고 분석 과정의 일부로서 액세스할 수 있다. 전형적으로, 어드레스가능 폴리뉴클레오티드 어레이는 상이한 공지된 위치에서 기질의표면에 결합하는 복수의 올리고뉴클레오티드프로브로 구성된다. 각 폴리뉴클레오티드의 정확한 위치에 관한 지식은 이들 "어드레스가능" 어레이가 혼성화 분석에 특히 유용하도록 한다. 당분야에 공지된 어드레스가능 어레이 기술은 본원 발명의 폴리뉴클레오티드에 활용할 수 있다. 이런 폴리뉴클레오티드 어레이의 특정 구체예는 GenechipsTM으로, 이는 US Patent 5,143,854; PCT 국제 출원 WO 90/15070과 92/10092에 전반적으로 기술되어 있다. 이들 어레이는 기계적 합성 방법 또는 광석판술과 고체상 올리고뉴클레오티드 합성의 조합을 통합하는 광 유도된 합성 방법으로 만들 수 있다(Fodor et al., 1991). 고체 서포트에 올리고뉴클레오티드 어레이의 고정은 "Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis"(VLSIPSTM) 기술의 개발로 가능하게 되었는데, 여기서 프로브는 칩의 고체 표면에 고밀도 어레이로 고정된다. VLSIPSTM기술의 예는 US Patent 5,143,854; 5,412,087; PCT 출원 WO 90/15070; WO 92/10092; WO 95/11995에서 제공하는데, 이들 문헌은 광 유도된 합성 기술과 같은 기술을 통하여 올리고뉴클레오티드 어레이를 형성하는 방법을 기술한다. 고체 서포트에 고정된 뉴클레오티드 어레이를 제공하기 위한 전략의 마련하는데 있어, 혼성화 패턴과 서열 정보를 극대화시키기 위하여 칩에 올리고뉴클레오티드 어레이를 정렬하고 전시하기 위한 추가적인 프레젠테이션 전략이 개발되었다. 이런 프리젠테이션 전략의 예는 PCT 출원 WO 94/12305; WO 94/11530; WO 97/29212; WO 97/31256에서 개시한다.
본원 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 어레이의 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브 매트릭스는 CanIon 유전자, 바람직하게는 이의 조절 영역에서 발생하는 돌연변이를 검출하는데 유용하게 사용할 수 있다. 이를 위해, 프로브는 공지된 돌연변이(예, 하나 또는 복수 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 부가)를 보유하는 유전자에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 특이적인 프로브를 설계한다. 공지된 돌연변이는 예로써 Huang et al.(1996) 또는 Samson et al.(1996)이 활용한 기술에 따라 동정된 CanIon 유전자에서 돌연변이를 의미한다.
CanIon 유전자에서 돌연변이를 검출하는데 사용되는 다른 기술은 고밀도 DNA 어레이이다. 고밀도 DNA 어레이의 단위 요소를 구성하는 각 올리고뉴클레오티드 프로브는 CanIon 게놈 DNA 또는 cDNA의 특정 서열에 대합하도록 설계한다. 따라서, 표적 유전자서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 어레이는 야생 유전자 서열과 표적 서열의 상동성을 확인하고, 이의 함량을 측정하며 표적 서열과 CanIon 유전자의 기준 야생형 유전자 서열간 차이를 검출하는데 사용한다. 이런 설계에서 4L 타일드(tiled) 어레이는 한 세트의 4개 프로브(A, C, G, T), 바람직하게는 15개-뉴클레오티드 올리고머로 실행한다. 각 세트의 4개 프로브에서, 완전 보체는 미스매치된 프로브보다 좀더 강하게 혼성화된다. 결과적으로, 길이 L의 핵산 표적은 4L 프로브를 보유하는 타일드 어레이로 돌연변이를 스캔하고, 전체 프로브 세트는 공지된 야생형 참고 서열에서 모든 가능한 돌연변이를 포함한다. 15-mer 프로브 세트 타일드 어레이의 혼성화 신호는 표적 서열에서 단일 염기 변화로 섭동한다. 결과로써, 돌연변이 위치에 인접하는 프로브에서 신호의 특징적인 소멸 또는 "푸트프린트(footprint)"가 존재한다. 이런 기술은 Chee et al.(1996)에 기술되었다.
결과적으로, 본원 발명은 적어도 하나의 전술한 폴리뉴클레오티드를 프로브와 프라이머로 포함하는 핵산 분자의 어레이에 관한다. 적절하게는, 본원 발명은 2개이상의 전술한 폴리뉴클레오티드를 프로브와 프라이머로 포함하는 핵산 분자의 어레이에 관한다.
본원 발명의 다른 목적은 P1 내지 P18, B1 내지 B17, C1 내지 C17, D1 내지 D18, E1 내지 E18, 이의 상보적 서열, 이의 적어도 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30 또는 40개의 연속 뉴클레오티드 단편 및 A1 내지 A18과 이의 보체에서 선택되는 이중대립인자 마커를 보유하는 적어도 한가지 서열에서 선택되는 서열을 1가지이상 포함하는 핵산 서열의 어레이에 관한다.
또한, 본원 발명은 P1 내지 P18, B1 내지 B17, C1 내지 C17, D1 내지 D18, E1 내지 E18, 이의 상보적 서열, 이의 적어도 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30 또는 40개의 연속 뉴클레오티드 단편 및 A1 내지 A18과 이의 보체에서 선택되는 이중대립인자 마커를 보유하는 적어도 2개의 서열에서 선택되는 서열을 2가지이상 포함하는 핵산 서열의 어레이에 관한다.
CanIon 단백질과 폴리펩티드 단편
본원에서 "CanIon 폴리펩티드"에는 본원 발명의 모든 단백질과 폴리펩티드가 포함된다. 본원 발명에 따른 폴리뉴클레오티드로 인코드되는 폴리펩티드 및 이런 폴리펩티드를 포함하는 융합 펩티드 역시 본원 발명에 포함된다. 본원 발명에는 SEQ ID No 5 서열로 구성되는 분리되거나 정제된 CanIon 단백질을 비롯하여 사람으로부터 유래된 CanIon 단백질이 포함된다.
본원 발명은 SEQ ID No 1 내지 4와 6의 뉴클레오티드 서열, 이의 상보적 서열 또는 단편에 의해 인코드되는 폴리펩티드에 관한다.
본원 발명에는 SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, 1600 또는 1700개 아미노산의 연속 스팬을 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리펩티드가 포함된다. 다른 적절한 구체예에서, 아미노산의 연속 스팬은 CanIon 단백질 서열에서 아미노산의 결실, 부가, 치환 또는 절두를 비롯한 돌연변이 또는 기능적 돌연변이의 부위를 포함한다.
적절한 구체예에서, 본원 발명에는 SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, 1600 또는 1700개 아미노산의 연속 스팬을 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리펩티드가 포함되는데, 여기서 아미노산의 연속 스팬은 아미노산 위치 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709중 적어도 1, 2, 3, 5 또는 10개를 보유한다. 적절하게는, SEQ ID No 5의 연속 스팬은 277 위치에서 알라닌 잔기; 338 위치에서 세린 잔기; 574 위치에서 발린 잔기; 678 위치에서 루이신 잔기; 680 위치에서 세린 잔기; 683 위치에서 트레오닌 잔기; 691 위치에서 히스티딘 잔기; 692 위치에서세린 잔기; 695 위치에서 알세린 잔기; 696 위치에서 알라닌 잔기; 894 위치에서 이소루이신 잔기; 1480 위치에서 리신 잔기; 1481 위치에서 아르기닌 잔기; 1483 위치에서 글리신 잔기; 1484 위치에서 발린 잔기; 1485 위치에서 이소루이신 잔기; 1630 위치에서 아스파라긴 잔기; 1631 위치에서 세린 잔기; 1632 위치에서 메티오닌 잔기; 1636 위치에서 트레오닌 잔기; 1660 위치에서 알라닌 잔기; 1667 위치에서 페닐알라닌 잔기; 1707 위치에서 트레오닌 잔기; 1709 위치에서 알라닌 잔기를 포함한다. 이들 폴리펩티드중 한가지를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 또한 제시한다.
또한, 본원 발명에는 SEQ ID No 5의 아미노산 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%의 아미노산 상동성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리펩티드가 포함된다.
CanIon 단백질은 가급적 사람이나 포유동물 조직 시료로부터 분리되거나 또는 사람이나 포유동물 유전자로부터 발현된다. 본원 발명의 CanIon 폴리펩티드는 당분야에 공지된 통상적인 방법으로 만들 수 있다. 원하는 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 임의의 사용하기 편한 숙주에 적합한 발현 벡터에 결찰시킨다. 진핵과 원핵 숙주계가 재조합 폴리펩티드를 생성하는데 사용된다. 이후, 폴리펩티드는 용해된 세포 또는 배양 배지로부터 분리하고 원하는 목적에 필요한 수준으로 정제한다. 정제는 당분야에 공지된 임의의 기술, 예를 들면 분별 추출, 염 분획, 크로마토그래피, 원심분리 등으로 실시한다.
이에 더하여, 좀더 짧은 단백질 단편은 화학적 합성으로 만든다. 대안으로,본원 발명의 단백질은 사람 또는 사람제외 동물의 세포 혹은 조직으로부터 추출한다. 단백질을 정제하는 방법을 당분야에 공지된 것으로, 여기에는 세정제나 카오트로픽(chaotropic) 약물을 이용한 입자 파괴, 분별 추출 및 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 밀도에 따른 침강, 겔 전기영동에 의한 폴리펩티드의 분리가 포함된다.
SEQ ID No 4를 비롯한 CanIon cDNA는 CanIon 단백질과 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다. 발현되는 CanIon 단백질이나 폴리펩티드를 인코드하는 핵산은 통상적인 클로닝 기술을 활용하여 발현 벡터상의 프로모터에 동작가능하게 연결시킨다. 발현 벡터에서 CanIon 삽입체는 CanIon 단백질에 대한 전체 코딩 서열 또는 이의 일부분으로 구성될 수 있다.
발현 벡터는 당분야에 공지된 포유동물, 이스트, 곤충 또는 박테리아 발현 시스템이다. 상업적으로 가용한 벡터와 발현 시스템은 Genetics Institute(Cambridge, MA), Stratagenen(La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin), Invitrogen (San Diego, California)을 비롯한 다양한 공급업체로부터 구할 수 있다. 원하는 경우, 발현을 강화하고 적절한 단백질 접힘을 촉진하기 위하여 서열의 코돈 환경과 코돈 쌍은 발현 벡터가 도입되는 특정 발현 미생물에 최적화시킨다(U.S. Patent No. 5,082,767).
한 구체예에서, cDNA의 폴리 A 신호를 통하여 CanIon cDNA의 전체 코딩 서열은 발현 벡터상의 프로모터와 동작가능하게 연결시킨다. 대안으로, CanIon 단백질의 일부분을 인코드하는 핵산에서 개시 부위로 작용하는 메티오닌이 부재하는 경우에 통상적인 기술을 활용하여 핵산의 제 1 코돈에 측부에 개시 메티오닌을 도입할 수 있다. 유사하게, CanIon cDNA로부터 유래된 삽입체에 폴리 A 신호가 부재하는 경우에, 상기 서열은 BglI과 SalI 제한 엔도뉴클레아제 효소로 pSG5(Stratagene)로부터 폴리 A 신호를 절단하고 이를 포유동물 벡터 pXT1(Stratagene)에 통합시켜 구조체에 부가할 수 있다. pXT1은 LRT 및 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 개그 유전자 일부를 포함한다. 구조체에서 LTR의 존재는 효과적이고 안정적인 트랜스펙션을 가능하게 한다. 상기 벡터는 단순 포진 티미딘 키나아제 프로모터와 선별가능 네오마이신 유전자를 보유한다. CanIon 단백질 또는 이의 일부분을 인코드하는 핵산은 SEQ ID No 5의 CanIon cDNA를 보유하고 5'프라이머에 통합된 Pst I 및 상응하는 cDNA 3' 프라이머의 5'말단에서 BglⅡ에 대한 제한 엔도뉴클레아제 서열을 보유하는 박테리아 벡터로부터, CanIon cDNA 또는 이의 일부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 PCR로 수득하는데, 여기서 CanIon 단백질 또는 이의 일부분을 인코드하는 서열은 폴리 A 신호와 관련하여 정확하게 위치하도록 담보한다. PCR 반응으로 수득된 정제된 단편은 Pst I로 절단하고 엑소뉴클레아제로 평활 말단이 되게 하며 BglⅡ로 절단하고 정제하며 폴리 A 신호를 보유하는 pXT1에 결찰시키고 BglⅡ로 절단한다.
결찰된 산물은 제품 명세서에 명시된 조건하에 리포펙틴(Life Technologies, Inc., Grand Island, New York)을 이용하여 NIH 3T3 세포로 트랜스펙션될 수 있다. 양성 형질감염체(transfectanct)는 트랜스펙션 세포를 600ug/㎖ G418(Sigma, St. Louis, Missouri)에서 배양하여 선별한다.
상기 과정은 검출가능한 표현형을 담당하는 돌연변이 CanIon 단백질 또는 이의 일부분을 발현하는데 활용할 수도 있다.
발현된 단백질은 통상적인 정제 기술, 예를 들면 황산암모늄 침전 또는 크기나 전하에 기초한 크로마토그래피 분리로 정제될 수 있다. 핵산 삽입체에 의해 인코드되는 단백질은 표준 면역크로마토그래피 기술을 활용하여 정제할 수도 있다. 이런 과정에서, 발현된 CanIon 단백질 또는 이의 일부분을 함유하는 용액, 예를 들면 세포 추출액은 CanIon 단백질 또는 이의 일부분에 대한 항체를 갖는 칼럼에 가한다. 발현된 단백질은 면역크로마토그래피 칼럼에 결합하게 된다. 이후, 칼럼은 세척하여 비-특이적으로 결합된 단백질을 제거한다. 그 다음, 특이적으로 결합된 발현된 단백질은 칼럼으로부터 방출시키고 표준 기술로 회수한다.
CanIon 단백질 또는 이의 일부분을 발현을 확인하기 위하여, CanIon 단백질 또는 이의 일부분을 인코드하는 삽입체를 포함하는 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포로부터 발현된 단백질은 삽입체가 없는 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포에서 발현된 단백질과 비교할 수 있다. 삽입체가 없는 발현 벡터를 보유하는 세포의 시료에서는 나타나지 않는 삽입체를 보유하는 발현 벡터를 보유하는 세포의 시료에서 밴드의 존재는 CanIon 단백질 또는 이의 일부분이 발현된다는 것을 암시한다. 일반적으로, 이런 밴드는 CanIon 단백질 또는 이의 일부분에서 예상되는 이동성을 갖는다. 하지만, 밴드는 글리코실레이션, 유비퀴티네이션 또는 효소적 절단과 같은 수식의 결과로 예상한 것과는 다른 이동성을 가질 수도 있다.
발현된 CanIon 단백질 또는 이의 일부분을 특이적으로 인식할 수 있는 항체는 후술한다.
항체 생산이 불가능하면, CanIon 단백질 또는 이의 일부분을 인코드하는 핵산은 키메라 폴리펩티드를 활용한 정제 계획에 사용하기 위하여 설계된 발현 벡터에 통합시킨다. 이런 전략에서 CanIon 단백질 또는 이의 일부분을 인코드하는 핵산은 키메라의 다른 절반을 인코드하는 유전자와 맞추어 삽입한다. 키메라의 다른 절반은 β-글로빈 또는 니켈 결합 폴리펩티드 인코딩 서열이다. 이후, β-글로빈 또는 여기에 부착된 니켈에 대한 항체를 갖는 크로마토그래피 매트릭스는 키메라 단백질을 정제하는데 사용한다. β-글로빈 유전자 또는 니켈 결합 폴리펩티드와 CanIon 단백질 또는 이의 일부분사이에 프로테아제 절단 부위를 조작한다. 따라서, 키메라의 두 폴리펩티드는 프로테아제 절단에 의해 서로 분리된다.
β-글로빈 키메라 단백질을 만드는데 유용한 발현 벡터는 pSG5(Stratagene)로, 이는 토끼 β-글로빈을 인코드한다. 토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 II는 발현된 전사체의 절단접합을 촉진하고, 구조체에 통합된 폴리아데닐화 신호는 발현의 수준을 증가시킨다. 이들 기술은 분자 생물학 분야의 당업자에게 공지된 것이다. 표준 방법은 Davis et al.,(1986)과 같은 방법 텍스트에 공개되어 있고, 많은 방법은 Stratagene, Life Technologies, Inc., 또는 Promega로부터 가용하다. 또한, 폴리펩티드는 In vitro ExpressTMTranslation Kit(Stratagene)과 같은 시험관내 번역 시스템을 활용하여 구조체로부터 만들 수 있다.
본원 발명의 CanIon 폴리펩티드에 결합하는 항체
CanIon 폴리펩티드 또는 전체 단백질은 발현된 CanIon 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 만드는데 사용할 수 있다.
본원 발명의 항체 조성물은 SEQ ID No 5의 CanIon 단백질에 특이적으로 또는 선택적으로 결합할 수 있다. CanIon의 제 1 변이체에 특이적으로 결합하는 항체 조성물은 ELISA, RIA 또는 다른 항체-기초된 결합 분석에서 CanIon 단백질의 전장 제 2 변이체보다 CanIon 단백질의 전장 제 1 변이체에 대하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50% 또는 100% 더 높은 결합 친화성을 보여야 한다. 적절한 구체예에서, 항체 조성물은 사람 CanIon 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다.
적절한 구체예에서, 본원 발명은 SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700 또는 1000개 아미노산의 연속 스팬을 포함하는 에피토프-포함 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 다클론이나 단클론 항체 조성물에 관한다. 적절한 구체예에서, 상기 연속 스팬은 SEQ ID No 5의 아미노산 위치 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709중 적어도 1, 2, 3, 5 또는 10개를 보유한다.
임의의 CanIon 폴리펩티드 또는 전체 단백질은 본원에서 밝힌 발현된 CanIon 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 만드는데 사용될 수 있다.
에피토프는 상기 에피토프에 독특한 공간적 입체형태를 제공하는 적게는 3개의 아미노산으로 구성된다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 6개의 이런 아미노산, 바람직하게는 적어도 8-10개의 이런 아미노산으로 구성된다. 적절한 구체예에서, 항원성 에피토프는 3 내지 50개의 아미노산으로 구성된다. 에피토프로 기능하는 단편은 임의의 통상적 수단으로 만들 수 있다. 에피토프는 디폴트 변수를 이용한 PROTEAN 컴퓨터 프로그램 (Version 4.0 Windows, DNASTAR, Inc., 1228 South Park Street Madison, WI)을 활용하여 Jameson-Wolf 항원 분석으로 확인할 수 있다.
본원 발명은 또한, 돌연변이된 CanIon 단백질의 에피토프로 구성되고 돌연변이된 CanIon 단백질에 특이적으로 결합하는 정제되거나 분리된 항체, 이의 단편이나 변이체에 관한다. 다른 적절한 구체예에서, 본원 발명은 CanIon 단백질의 10개이상 연속 아미노산으로 구성되고 형질 유발 돌연변이에 의해 인코드될 수 있는 적어도 1개의 아미노산을 보유하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체에 관한다.
항체 결합이 요구되는 것과 상이한 종류의 CanIon을 발현하는 사람제외 동물 또는 포유동물 및 CanIon을 발현하지 않는 동물(즉, CanIon 적중 동물)은 항체를 만드는데 특히 유용하다. CanIon 적중 동물은 CanIon의 단배질의 노출된 영역 대부분을 외래 항원으로 인식하고, 따라서 좀더 광범위한 CanIon 에피토프를 갖는 항체를 만들 수 있다. 게다가, 10 내지 30 아미노산을 갖는 좀더 작은 폴리펩티드는 CanIon 단백질중 임의 한가지에 대한 특이적인 결합을 달성하는데 유용할 수 있다. 이에 더하여, 이런 항원 서열과 유사한 종류의 CanIon을 생산하는 동물의 체액 면역계는 고유 CanIon와 항원 서열간의 차이를 인식하고, 항원 서열에서 독특한 부위에 대한 항체를 생산하게 된다. 이런 기술은 CanIon 단백질중 임의 한가지에 특이적으로 결합하는 항체를 수득하는데 특히 유용하다.
이런 프로토콜에 의해 만들어진 항체 제형은 생물 시료에서 항원-보유 물질의 농도를 측정하는 정량적 면역분석에 유용하다; 이들은 또한, 생물 시료에서 항원의 존재를 반-정량적으로 또는 정성적으로 확인하는 사용된다. 항체는 체내에서 단백질을 발현하는 세포를 죽이거나 또는 단백질의 수준을 감소시키는 치료요법적 조성물에 사용될 수도 있다.
본원 발명의 항체는 당분야에 공지된 방사성, 형광 또는 효소적 라벨로 표지할 수 있다.
따라서, 본원 발명은 생물 시료에서 본원 발명에 따른 CanIon 폴리펩티드의 존재를 특이적으로 검출하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
a) SEQ ID No 5의 아미노산 서열로 구성되고 CanIon 폴리펩티드, 펩티드 단편 또는 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 다클론이나 단클론 항체를 생물 시료와 접촉시키고;
b) 형성된 항원-항체 복합체를 검출한다.
또한, 본원 발명은 시료에서 본원 발명에 따른 CanIon 폴리펩티드의 시험관내 존재를 검출하는 진단 키트에 관하는데, 상기 키트는 다음과 같이 구성된다:
a) SEQ ID No 5의 아미노산 서열로 구성되고 CanIon 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 다클론이나 단클론 항체, 펩티드 단편 또는 이의 변이체;
b) 형성된 항원-항체 복합체의 검출을 가능하게 하는 시약, 상기 시약은 선택적으로 라벨을 보유하거나, 또는 특히 전술한 단클론이나 다클론 항체가 자체적으로 표지되지 않은 경우에 임의의 표지된 시약으로 자신을 인식할 수 있다.
따라서, 본원 발명은 항체 및 T-세포 항원 수용체(TCR)에 관하는데, 이는 폴리펩티드, 좀더 구체적으로 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 포함), IgA(IgA1, IgA2 포함), IgD, IgE, IgM, IgY를 포함하는 이들에 국한되지 않는 본원 발명에 따른 폴리펩티드의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 적절한 구체예에서, 항체는 본원 발명의 사람 항원 결합 항체 단편으로, 여기에는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fd, 단일-사슬 Fvs(scFv), 단일-사슬 항체, 다이설파이드-결합된 Fvs(sdFv), VL이나 VH을 포함하는 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 항체는 조류와 포유동물을 비롯한 임의의 동물로부터 유래될 수 있다. 적절하게는, 항체는 사람, 뮤린, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭으로부터 유래된다.
단일-사슬 항체를 비롯한 항원-결합 항체 단편은 가변 영역 단독으로 또는 다음 영역: 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 도메인의 전체 혹은 일부와 함께 구성될 수 있다. 본원 발명에는 가변 영역 및 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 도메인의 임의 조합 역시 포함된다. 또한, 본원 발명에는 본원 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 키메라, 인화, 사람 단클론과 다클론 항체가 포함된다. 본원 발명에는 본원 발명의 항체에 대한 항-이디오타입 항체도 포함된다.
본원 발명의 항체는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 본원 발명에 따른 폴리펩티드의 상이한 에피토프에특이적이거나 또는 본원 발명에 따른 폴리펩티드와 이질성 조성물, 예를 들면 이질성 폴리펩티드 또는 고체 서포트 물질 모두에 특이적일 수 있다(참조: WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, A. et al.(1991) J. Immunol. 147:60-69; US 특허 5,573,920, 4,474,893, 5,601,819, 4,714,681, 4,925,648; Kostelny, S.A. et al.(1992) J. Immunol. 148:1547-1553).
본원 발명의 항체는 항체에 인식되거나 또는 여기에 특이적으로 결합하는 본원 발명에 따른 폴리펩티드의 에피토프 또는 에피토프-보유 영역의 측면에서 설명한다. 본원 발명에 따른 단백질의 경우에, 항체는 본원 발명의 핵산에 의해 인코드되는 전장 단백질, 본원 발명의 핵산에 의해 인코드되는 성숙 단백질(즉, 신호 펩티드의 절단으로 생성된 단백질), 본원 발명의 핵산에 의해 인코드되는 신호 펩티드 또는 본원 발명의 임의 다른 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 이런 에피토프 또는 폴리펩티드 일부분을 보유하는 에피토프는 예로써 N-말단과 C-말단 위치, 연속 아미노산 잔기의 크기 등으로 기술할 수 있다. 본원 발명의 에피토프 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 역시 개별적으로 구별할 수 있다. 따라서, 본원 발명은 본원 발명에 따른 특정 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 이의 구별을 가능하게 하는 항체에 관한다.
본원 발명의 항체는 교차-반응성의 측면에서 기술할 수도 있다. 본원 발명에 따른 폴리펩티드의 임의 다른 유사체, 오트로그(ortholog) 또는 상동체와 특이적으로 결합하지 않는 항체는 본원 발명에 포함된다. 본원 발명의 폴리펩티드와 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만의 상동성(당분야에 공지된 방법으로 측정)을 갖는 폴리펩티드와 결합하지 않는 항체 역시 본원 발명에 포함된다. 또한, 본원 발명에는 엄격한 혼성화 조건하에 본원 발명의 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 폴리펩티드에만 결합 항체가 포함된다. 본원 발명의 항체는 결합 친화성의 측면에서 기술할 수도 있다. 바람직한 결합 친화성 항체는 분리 상수(Kd)가 5X10-6M, 10-6M, 5X10-7M, 10-7M, 5X10-8M, 10-8M, 5X10-9M, 10-9M, 5X10-10, 10-10M, 5X10-11M, 10-11M, 5X10-12M, 10-12M, 5X10-13M, 10-13M, 5X10-14M, 10-14M, 5X10-15M, 10-15M 미만인 항체이다.
본원 발명의 항체는 시험관내와 생체내 진단 방법과 치료 방법을 비롯하여 본원 발명에 따른 폴리펩티드를 정제, 검출, 표적하는 당분야에 공지된 방법에 사용된다. 가령, 항체는 생물 시료에서 본원 발명에 따른 폴리펩티드의 수준을 정량적으로, 정성적으로 측정하는 면역분석에 사용된다(Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988).
본원 발명의 항체는 단독으로 또는 다른 조성물과 함께 사용할 수 있다. 항체는 N- 또는 C-말단에서 이질성 폴리펩티드에 재조합으로 융합되거나 또는 폴리펩티드 혹은 다른 조성물에 화학적으로 공액(공유와 비-공유 공액 포함)될 수 있다. 가령, 본원 발명의 항체는 검출 분석에서 라벨로 유용한 분자 및 효과기 분자, 예를 들면 이질성 폴리펩티드, 약물 또는 독소에 재조합으로 융합되거나 또는 공액될 수 있다(WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; US Patent 5,314,995; EP 0 396387).
본원 발명의 항체는 당분야에 공지된 임의의 적절한 방법으로 만들 수 있다. 가령, 본원 발명의 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편은 동물에 투여하여 다클론 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유도하는데 사용할 수 있다. "단클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통하여 만들어진 항체에 국한되지 않는다. "항체"는 한 개이상의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 군을 의미하는데, 여기서 항체 결합 도메인은 항체 분자에서 다양한 도메인의 접힙(folding)으로 생성되고 항원의 항원 결정기 외형에 상보적인 내부 표면 형태 및 전하 분포를 갖는 3차원 결합 공간을 형성하는데, 이는 항원과의 면역학적 반응을 가능하게 한다. "단클론 항체"는 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 비롯한 단일 클론으로부터 유래된 항체를 의미하고, 이를 생산하는 방법을 의미하지 않는다. 단클론 항체는 하이브리도마 사용, 재조합, 파지 디스플레이 기술을 비롯한 당분야에 공지된 다양한 기술을 활용하여 만들 수 있다
하이브리도마 기술은 당분야에 공지된 것이다(Harlow et al.(1988); Hammerling, et. al.(1981)). Fab와 F(ab')2 단편은 예로써 파파인(Fab 단편 생성) 또는 펩신(F(ab')2 단편 생성)과 같은 효소를 이용한 단백질분해 절단으로 하이브리도마-생성된 항체로부터 만들 수 있다.
대안으로, 본원 발명의 항체는 재조합 DNA 기술 또는 당분야에 공지된 합성 화학을 적용하여 만들 수 있다. 가령, 본원 발명의 항체는 당분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법으로 만들 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능적항체 도메인은 파지 입자의 표면에 전시되고, 상기 파지 입자는 이들을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유한다. 원하는 결합 특성을 갖는 파지는 항원, 특히 고체 표면이나 비드에 결합되거나 또는 포획된 항원으로 직접 선별함으로써 레파토리 또는 조합 항체 라이브러리(예, 사람 또는 뮤린)로부터 선택된다. 전형적으로, 이들 방법에 사용되는 파지는 파지 유전자 III 또는 유전자 VII 단백질에 재조합으로 융합된 Fab, Fv 또는 다이설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 fd와 M13을 비롯한 섬유성 파지이다. 본원 발명의 항체를 만드는데 이용할 수 있는 파지 디스플레이 방법은 Brinkman U. et al.(1995); Ames, R.S. et al.(1995); Kettleborough, C.A.. et al. (1994); Persic, L. et al.(1997); Burton, D.R. et al.(1994); PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; US Patents 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743에서 개시한다.
상기 참고문헌에서 밝힌 바와 같이, 파지 선별후 파지로부터 항체 코딩 영역을 분리하는데, 이는 사람 항체 또는 임의의 다른 항원 결합 단편을 비롯하여 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 이스트, 박테리아에서 발현되는 전체 항체를 만드는데 사용할 수 있다. 가령, Fab, Fab'F(ab)2, F(ab')2 단편을 재조합으로 생산하는 기술은 당분야에 공지된 방법으로 활용할 수 있다(WO 92/22324; Mullinax, R.L. et al.(1992); Sawai, H. et al.(1995); Better, M. et al.(1988)).
단일-사슬 Fvs와 항체를 생산하는데 사용할 수 있는 기술은 U.S. Patents4,946,778과 5,258,498; Huston et al.(1991); Shu, L. et al.(1993); Skerra, A. et al.(1988)에서 제시한다. 사람에서 항체의 생체내 용도 및 시험관내 검출 분석을 비롯한 일부 용도에서는 키메라, 인화 또는 사람 항체를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다(Morrison(1985); Oi et al.,(1986); Gillies, S.D. et al.(1989); US Patent 5,807,715). 항체는 다양한 기술, 예를 들면 CDR-조직 이식(EP 0 239 400; WO 91/09967; US Patent 5,530,101; 5,585,089), 베니어링(veneering)이나 박피(resurfacing)(EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E.A.,(1991); Studnicka G.M. et al.(1994); Roguska M.A. et al.(1994)), 사슬 셔플링(shuffling)(US Patent 5,565,332)으로 인화시킬 수 있다. 사람 항체는 전술한 파지 디스플레이 방법을 비롯하여 당분야에 공지된 다양한 방법으로 만들 수 있다(US Patents 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806, 5,814,318; WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 91/10741).
또한, 본원 발명에는 본원 발명의 폴리펩티드에 재조합으로 융합된 또는 화학적으로 공액된(공유와 비-공유 공액 포함) 항체가 포함된다. 항체는 본원 발명의 폴리펩티드를 제외한 다른 항원에 특이적일 수도 있다. 가령, 항체는 본원 발명의 폴리펩티드를 특정 세포 표면 수용체에 특이적인 항체에 융합 또는 공액시킴으로써 시험관내 또는 생체내에서 본원 발명의 폴리펩티드가 특정 세포형으로 향하도록 하는데 사용할 수 있다. 본원 발명의 폴리펩티드에 융합된 또는 공액된 항체 역시 당분야에 공지된 방법으로 시험관내 면역분석 및 정제에 사용할 수 있다(Harbor et al. supra and WO 93/21232; EP 0 430 095; Naramura M. etal.(1994); US Patent 5,474,981; Gillies, S.O. et al.(1992); Fell, H.P. et al.(1991)).
또한, 본원 발명은 변이 영역을 제외한 다른 도메인에 융합된 또는 공액된 본원 발명의 폴리펩티드을 포함하는 조성물에 관한다. 가령, 본원 발명의 폴리펩티드는 항체 Fc 영역 또는 이의 일부분에 융합 또는 공액될 수 있다. 본원 발명의 폴리펩티드에 융합된 항체 일부분은 힌지 영역, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 전체 도메인의 임의 조합 또는 이들의 일부분으로 구성될 수 있다. 본원 발명의 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 반감기를 증가시키기 위하여 또는 공지된 방법을 이용한 면역 분석에 사용하기 위하여 항체 일부분과 융합 또는 공액될 수 있다. 폴리펩티드는 또한, 다합체를 형성하기 위하여 항체 일부분과 융합 또는 공액될 수 있다. 가령, 본원 발명의 폴리펩티드에 융합된 Fc 영역은 Fc 영역간 다이설파이드 결합을 통하여 이합체를 형성할 수 있다. 좀더 상등의 다합체 형태는 본원 발명의 폴리펩티드를 IgA와 IgM의 일부분에 융합시켜 만들 수 있다. 본원 발명의 폴리펩티드를 항체 일부분에 융합 또는 공액하는 방법은 당분야에 공지된 것이다(US Patents 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 5,112,946; EP 0 307 434, EP 0 367 166; WO 96/04388, WO 91/06570; Ashkenazi A. et al.(1991); Zheng, X.X. et al.(1995); Vil, H. et al.(1992)).
또한, 본원 발명은 본원 발명에 따른 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제로 작용하는 항체에 관한다. 가령, 본원 발명에는 본원 발명에 따른 폴리펩티드와 수용체/리간드 상호작용을 완전히 또는 부분적으로 파괴하는 항체가 포함된다.수용체-특이적 항체와 리간드-특이적 항체 역시 본원 발명에 포함된다. 또한, 본원 발명에는 리간드 결합을 방해하지 않으면서 수용체 활성화를 예방하는 수용체-특이적 항체가 포함된다. 수용체 활성화(즉, 신호 전달)는 당분야에 공지된 기술로 확인할 수 있다. 본원 발명에는 리간드 결합과 수용체 활성화를 모두 차단하는 수용체-특이적 항체도 포함된다. 유사하게, 본원 발명에는 리간드와 결합하여 수용체와 리간드의 결합을 차단하는 중화 항체 및 리간드와 결합하여 수용체 활성화를 차단하지만 리간드가 수용체와 결합하는 것을 차단하지는 않는 항체가 포함된다. 또한, 본원 발명에는 수용체를 활성화시키는 항체가 포함된다. 이들 항체는 리간드-매개된 수용체 활성화의 영향을 받는 생물 활성에 대한 작용제 역할을 할 수도 있다. 이런 항체는 본원에 개시된 특이적 활성을 포함하는 생물학적 활성에 대한 작용제 또는 길항제로 기술할 수 있다. 상기 항체 작용제는 당분야에 공지된 방법으로 만들 수 있다(WO 96/40281; US Patent 5,811,097; Deng B. et al.(1998); Chen, Z. et al.(1998); Harrop J.A. et al.(1998); Zhu, Z. et al.(1998); Yoon, D.Y. et al.(1998); Prat, M. et al.(1998); Pitard, V. et al.(1997); Liautard, J. et al.(1997); Carlson, N.G. et al.(1997); Taryman, R.E. et al.(1995); Muller, Y.A. et al(1998); Bartunek, P. Et al.(1996)).
전술한 바와 같이, 본원 발명에 따른 폴리펩티드의 항체는 당분야에 공지된 기술로 본원 발명의 폴리펩티드를 "모방"하는 항-이디오타입 항체를 만드는데 사용할 수 있다(Greenspan and Bona, (1989); Nissinoff, (1991)). 가령, 결합을 통하여 폴리펩티드 다합체화(multimerization) 또는 본원 발명에 따른 폴리펩티드와 리간드의 결합을 경쟁적으로 저해하는 항체는 폴리펩티드 다합체화 또는 결합 도메인을 "모방"하고 결론적으로 폴리펩티드 또는 이의 리간드와 결합하여 이들을 중화시키는 항-이디오타입 항체를 만드는데 사용할 수 있다. 이런 중화 항-이디오타입 항체는 본원 발명의 폴리펩티드에 결합시키거나 또는 이의 리간드/수용체 결합시켜 이의 생물 활성을 차단하는데 사용할 수 있다.
CanIon-관련된 이중대립인자 마커
본원 발명에 따른 이중대립인자 마커의 이점
본원 발명의 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 RFLP(제한 단편 길이 다형성) 및 VNTR(직렬 반복서열의 변이 총수) 마커와 같은 다른 유전자 마커에 비하여 다수의 중요한 이점을 제공한다.
1세대 마커는 RFLP로, 이는 제한 단편의 길이를 변화시키는 변수이다. 하지만, RFLP를 확인하고 분류하는데 이용되는 방법은 상대적으로 많은 재료, 노력, 시간을 소모시킨다. 2세대 유전자 마커는 VNTR로, 이는 미니위성(minisatellite) 또는 마이크로위성(microsatellite)으로 분류할 수 있다. 미니위성은 0.1 내지 20 Kilobase 길이의 사람 크로모좀의 영역을 따라 분포되는 5-50개 반복서열 단위에 존재하는 직렬 반복된 DNA 서열이다. 이들은 많은 가능 대립유전자를 제공하기 때문에, 이들의 정보 내용은 가치가 높다. 미니위성은 검사 개체로부터 얻은 핵산 시료에 존재하는 직렬 반복서열의 총수를 확인하는 서던 블랏을 실시하여 기록한다. 하지만, 104잠재적 VNTR만 서던 블랏팅으로 분류될 수 있다. 게다가, RELP와VNTR은 개발하고 대량으로 분석하는데 많은 비용과 시간이 소모된다.
단일 뉴클레오티드 다형성 또는 이중대립인자 마커는 RELP 및 VNTR과 동일한 방식으로 사용되면서도 다양한 이점을 제공할 수 있다. SNP는 사람 게놈에 집중적으로 위치하고 가능한 빈번한 형태의 변이이다. 대략 107개 이상의 부위가 사람 게놈의 3x109개 염기쌍을 따라 분산되어 있다. 따라서, SNP는 RFLP 또는 VNTR 마커보다 좀더 높은 빈도와 통일성으로 발생하는데, 이는 이런 마커가 관심있는 유전자 좌위에 근접하여 발견될 가능성이 좀더 높다는 것을 의미한다.
또한, 본원 발명의 이중대립인자 마커와 같은 특성화된 단일 뉴클레오티드 다형성의 다른 형태는 구별하는 것이 좀더 용이하고, 따라서 일상적인 기초하에 용이하게 분류될 수 있다. 이중대립인자 마커는 단일 뉴클레오티드 기초한 대립유전자 및 단지 2개의 공통 대립유전자를 보유하는데, 이는 매우 병렬적인 검출 및 자동화된 기록을 가능하게 한다. 본원 발명의 이중대립인자 마커는 다수 개체의 신속한 고성능 유전자형판별(genotyping)를 가능하게 한다.
이중대립인자 마커는 게놈에 집중적으로 위치하고 충분히 유익하며 대량으로 분석할 수 있다. 이런 이점의 종합적 효과로 인해 이중대립인자 마커는 유전자 연구에 극히 중요하다. 이중대립인자 마커는 가족에서 연쇄 연구, 대립유전자 공유 방법, 개체군에서 연쇄 불균형 연구 및 사례-대조 개체군 또는 형질 양성과 형질 음성 개체군의 연관 연구에 사용될 수 있다. 본원 발명의 중요한 측면은 복잡한 형질에 관여하는 유전자를 동정하는 연관 연구가 이중대립인자 마커를 통하여 실시될 수 있다는 점이다. 연관 연구는 무관한 사례-와 대조-개체군에서 마커 대립유전자의 빈도를 검사하는데, 일반적으로 다인자(polygenic) 또는 산발적 형질의 검출에 이용된다. 연관 연구는 전체 개체군에서 실시할 수 있고, 영향을 받은 가족에서 관련된 개체에 실시된 연구(연쇄 연구)로 한정되지 않는다. 상이한 유전자에서 이중대립인자 마커는 질병과의 직접적인 연관 또는 치료에 대한 반응을 병행으로 스크린할 수 있다. 이런 다중 유전자 방식은 특정 표현형, 약물 반응, 산발적 형질, 또는 복잡한 유전자 병인을 갖는 질병상태에 대한 다중적 유전자 인자의 상승적 효과를 검사하는데 필요한 통계학적 능력을 제공한다는 점에서, 사람 유전자 연구에 유력한 도구이다.
본원 발명의 후보 유전자
연관 방법을 실시하는데 상이한 방식이 이용될 수 있다: 게놈-전체 연관 연구, 후보 영역 연관 연구, 후보 유전자 연관 연구. 게놈-전체 연관 연구는 균일하게 분포하고 전체 게놈을 커버하는 유전자 마커의 스크리닝에 의존한다. 후보 유전자 방식은 관심있는 형질과 관련된 생물학적 경로에 잠재적으로 관여하는 유전자에 특이적으로 위치하는 유전자 마커의 연구에 기초한다. 본원 발명에서, CanIon이 후보 유전자이다. 이런 후보 유전자 분석은 형질의 생태에 관한 정보가 일부 가용한 경우에, 특정 형질과 관련된 유전자 및 유전자 다형성의 동정에 지름길을 제공한다. 하지만, 본원에 개시된 모든 이중대립인자 마커는 게놈-전체 연관 연구 또는 후보 영역 연관 연구의 일부로 활용될 수 있는데, 이런 활용은 본원 발명과 특허청구범위에서 특이적으로 정관한다.
CanIon-관련된 이중대립인자 마커 및 이와 관련된 폴리뉴클레오티드
본원 발명은 또한, CanIon-관련된 이중대립인자 마커에 관한다. 본원에서 "CanIon-관련된 이중대립인자 마커"는 CanIon 유전자와 연쇄 불균형인 일단의 이중대립인자 마커를 의미한다. CanIon-관련된 이중대립인자 마커에는 A1 내지 A17로 명명된 이중대립인자 마커가 포함된다.
본원 발명에 따른 이중대립인자 마커의 일부분은 표 2에 개시한다. 이들은 관련된 1 내지 4와 6에서 단일 염기 다형성으로 기술된다. 한가지 CanIon 이중대립인자 마커의 다형적 염기를 보유하는 핵산의 증폭을 가능하게 하는 프라이머쌍은 실시예 2의 표 1에 기재한다.
17개의 CanIon-관련된 이중대립인자 마커, A1 내지 A17은 CanIon의 게놈 서열에 위치한다. 이중대립인자 마커 A12와 A16은 CanIon의 엑손에 위치한다. 이중대립인자 마커 A18은 CanIon 유전자와 측면에서 접한다.
본원 발명은 또한, CanIon-관련된 이중대립인자 마커의 다형적 염기를 포함하는 정제된 및/또는 분리된 뉴클레오티드 서열에 관한다. 적절한 구체예에서, 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18, 이의 보체에서 선택된다. 상기 서열은 SEQ ID 1 내지 4와 6, 이의 변이체 또는 상보적 서열에서 선택되는 뉴클레오티드 서열의 8 내지 1000개 길이의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500, 1000개 뉴클레오티드의 연속 스팬을 보유한다. 이들 뉴클레오티드 서열은 이중대립인자 마커의 대립유전자 1 또는 2중 한가지의 다형적 염기를 포함한다. 선택적으로, 상기 대립유전인자 마커는 상기폴리뉴클레오티드의 중심으로부터 6, 5, 4, 3, 2, 1개 뉴클레오티드 이내, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 중심에 위치할 수 있다. 선택적으로, 상기 스팬의 3' 말단은 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 존재할 수 있다. 선택적으로, 이중대립인자 마커는 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 존재할 수 있다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 라벨을 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 고체 서포트에 부착될 수 있다. 다른 구체예에서, 전술한 폴리뉴클레오티드는 단독으로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
본원 발명은 또한, SEQ ID 1 내지 4 또는 이의 상보적 서열에서 선택되는 뉴클레오티드 서열의 8 내지 1000개 연속 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500, 1000개 뉴클레오티드의 연속 스팬을 포함하는 정제된 및/또는 분리된 뉴클레오티드 서열에 관한다. 상기 뉴클레오티드의 3' 말단은 서열에서 CanIon-관련된 이중대립인자 마커 이내에 또는 상기 마커의 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 또는 1000개 뉴클레오티드 상류에 위치할 수 있다. 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A17에서 선택된다; 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 말단은 서열에서 CanIon-관련된 이중대립인자 마커의 1개 뉴클레오티드 상류에 위치할 수 있다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 라벨을 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 고체 서포트에 부착될 수 있다. 다른 구체예에서, 전술한 폴리뉴클레오티드는 단독으로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
적절한 구체예에서, 표 2에 기재된 이중대립인자 마커중 한가지의 다형적 염기를 포함하는 서열은 표 1에 기재된 앰플리콘 서열의 핵산, 이의 변이체 또는 상보적 서열에서 선택되는 폴리뉴클레오티드의 연속 스팬을 보유하는, 이런 폴리뉴클레오티드로 구성되는, 이런 폴리뉴클레오티드에 포함되는, 또는 이런 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열에서 선택된다.
본원 발명은 또한, CanIon 단백질을 인코드하는 핵산에 관하는데, 상기 핵산은 A12와 A16 및 이의 보체에서 선택되는 이중대립인자 마커의 다형적 염기를 포함한다.
본원 발명에는 CanIon-관련된 이중대립인자 마커에서 한가지이상 뉴클레오티드의 실체를 확인하는데 사용되는 임의의 폴리뉴클레오티드, 또는 이런 폴리뉴클레오티드의 용도가 포함된다. 이에 더하여, CanIon-관련된 이중대립인자 마커에서 한가지이상 뉴클레오티드의 실체를 확인하는데 사용되는 본원 발명의 폴리뉴클레오티드에는 추가적인 제한없이 본원에 개시된 단독의 또는 조합된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 선택적으로 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A17과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A12와 A16과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 단독의 또는 조합된 서열을 포함한다; 선택적으로,상기 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드로 구성된다; 선택적으로, 확인은 혼성화 분석, 염기서열분석, 마이크로염기서열 분석, 또는 효소-기초된 미스매치 검출 분석으로 실시할 수 있다; 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 고체 서포트, 어레이, 또는 어드레스가능 어레이에 부착될 수 있다; 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 표지될 수 있다. 적절한 폴리뉴클레오티드는 CanIon-관련된 이중대립인자 마커에서 뉴클레오티드의 실체를 확인하기 위한 혼성화 분석에 사용될 수 있다. 다른 적합한 폴리뉴클레오티드는 CanIon-관련된 이중대립인자 마커에서 뉴클레오티드의 실체를 확인하기 위한 염기서열 분석 또는 마이크로염기서열 분석에 사용될 수 있다. 다른 적절한 폴리뉴클레오티드는 CanIon-관련된 이중대립인자 마커에서 뉴클레오티드의 실체를 확인하기 위한 효소-기초한 미스매치 검출 분석에 사용될 수 있다. 다른 적절한 폴리뉴클레오티드는 CanIon-관련된 이중대립인자 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 분절을 증폭하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 고체 서포트, 어레이, 또는 어드레스가능 어레이에 부착될 수 있다; 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 표지될 수 있다.
또한, 본원 발명에는 CanIon-관련된 이중대립인자 마커를 포함하는 뉴클레오티드를 증폭하는데 사용되는 임의의 폴리뉴클레오티드, 또는 이런 폴리뉴클레오티드의 용도가 포함된다. 이에 더하여, CanIon-관련된 이중대립인자 마커를 포함하는 뉴클레오티드의 분절을 증폭하는데 사용되는 본원 발명의 폴리뉴클레오티드에는 추가적인 제한없이 본원에 개시된 단독의 또는 조합된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 선택적으로 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A17과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A12와 A16과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 단독의 또는 조합된 서열을 포함한다; 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드로 구성된다; 선택적으로, 증폭은 PCR 또는 LCR로 실시할 수 있다; 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 고체 서포트, 어레이, 또는 어드레스가능 어레이에 부착될 수 있다; 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 표지될 수 있다.
본원 발명의 이중대립인자 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 증폭이나 염기서열 반응을 위한 프라이머는 당분야에 공지된 서열로부터 설계할 수 있다. 적절한 프라이머 세트에서 SEQ ID 1 내지 4와 6, 이의 상보적 서열 또는 변이체에서 선택되는 서열과 상동한 연속 스팬의 3' 말단은 프라이머의 3' 말단에 존재한다. 이런 형태는 프라이머의 3' 말단이 선별된 핵산 서열과 혼성화되도록 하고 증폭이나 염기서열 반응을 위한 프라이머의 효능을 극적으로 증가시킨다. 대립유전자 특이적 프라이머는 이중대립인자 마커의 다형적 염기가 연속 스팬의 3' 말단에 위치하고 연속 스팬이 프라이머의 3' 말단에 존재하도록 설계할 수 있다. 이런 대립유전자 특이적 프라이머는 이중대립인자 마커에 존재하는 대립유전자 2개중 하나를보유하는 핵산 시료와 함께 사용되면 증폭이나 염기서열 반응을 선별적으로 기폭하는 경향이 있다. 본원 발명에 따른 프라이머의 3' 말단은 상기 서열에서 또는 염기서열, 증폭, 신규한 서열이나 마커의 위치 선정에 사용하기 적합한 임의의 다른 위치에서, CanIon-관련된 이중대립인자 마커 이내에 또는 상기 마커의 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 또는 1000개 뉴클레오티드 상류에 위치할 수 있다. 따라서, 다른 일단의 적절한 증폭 프라이머는 SEQ ID 1 내지 4와 6, 이의 상보적 서열 또는 변이체에서 선택되는 서열에서 8 내지 50개 뉴클레오티드의 연속 스팬으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 여기서 상기 연속 스팬의 3' 말단은 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 위치하고, 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 말단은 서열에서 CanIon-관련된 이중대립인자 마커의 상류에 위치한다. 적절하게는, 이들 증폭 프라이머는 서열 B1 내지 B17 및 C1 내지 C17에서 선택되는 서열을 포함한다. CanIon의 이중대립인자 마커의 1개 뉴클레오티드 상류에 3'말단이 위치하는 프라이머는 마이크로염기서열 분석에 특히 유용하다. 적절한 마이크로염기서열 프라이머는 표 4에 기술한다. 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A17과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A12와 A16과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 마이크로염기서열 프라이머는 뉴클레오티드 서열 D1 내지 D18과 E1 내지 E18에서 선택된다.
본원 발명의 프로브는 당분야에 공지된 방법, 특히 본원에 개시된 마커가 존재하는 지를 검사할 수 있는 방법으로부터 설계할 수 있다. 적절한 프로브 세트는 임의 특정한 분석 조건하에 이중대립인자 마커의 한 대립유전자에는 선별적으로 결합하지만 다른 대립유전자에는 결합하지 않도록 하는 당분야에 공지된 방식으로 본원 발명의 혼성화 분석에 사용되도록 설계할 수 있다. 적절한 혼성화 프로브는 이중대립인자 마커의 대립유전자 1 또는 2중 한가지의 다형적 염기를 포함한다. 선택적으로, 상기 대립유전인자 마커는 상기 폴리뉴클레오티드의 중심으로부터 6, 5, 4, 3, 2, 1개 뉴클레오티드 이내, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 중심에 위치할 수 있다. 적절한 구체예에서, 프로브는 서열 P1 내지 P18 각각 및 이의 상보적 서열 각각에서 선택된다.
본원 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 리스트에 명시된 다형적 염기를 둘러싸는 정확한 측부 서열을 갖는 것으로 한정되지 않는다. 오히려, 이중대립인자 마커를 둘러싸는 측부 서열은 의도한 용도에 따라 얼마간 길어지거나 또는 짧아질 수 있는데, 본원 발명은 이런 서열을 구체적으로 정관한다. 연속 스팬 외부의 측부 영역은 사람 개체에서 실제로 발생하는 고유 측부 영역과는 상동하지 않아야 한다. 의도된 뉴클레오티드와 양립하는 임의 뉴클레오티드 서열의 첨가를 구체적으로 정관한다.
프라이머와 프로브는 "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머"에서 밝힌 바와 같이 표지하거나 또는 고체 서포트에 고정시킬 수 있다.
고체 서포트에 부착되는 본원 발명의 폴리뉴클레오티드에는 제한없이 본원에 개시된 단독의 또는 조합된 폴리뉴클레오티드가 포함된다: 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 고체 서포트에 개별적으로, 또는 본원 발명에 따른 적어도 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 또는 25개의 상이한 폴리뉴클레오티드의 군으로 부착될 수 있다. 선택적으로, 본원 발명에 따른 폴리뉴클레오티드가 아닌 다른 폴리뉴클레오티드가 본원 발명에 따른 폴리뉴클레오티드에서와 동일한 고체 서포트에 부착될 수 있다. 선택적으로, 다중 폴리뉴클레오티드가 고체 서포트에 부착되는 경우에, 이들은 무작위 위치에, 또는 정렬된 어레이에 부착될 수 있다. 선택적으로, 상기 정렬된 어레이는 어드레스가능할 수 있다.
또한, 본원 발명에는 CanIon-관련된 이중대립인자 마커에서 뉴클레오티드의 실체를 확인함으로써 검사 개체의 유전형분류에 필요한 모든 또는 일부 반응물과 함께 본원 발명에 따른 하나 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트가 포함된다. 상기 키트의 폴리뉴클레오티드는 고체 서포트에 부착되거나, 또는 폴리뉴클레오티드의 어레이나 어드레스가능 어레이의 일부일 수 있다. 상기 키트는 염기서열분석 방법, 마이크로염기서열분석 방법, 혼성화 분석 또는 효소-기초한 미스매치 검출 분석 방법을 비롯한 당분야에 공지된 방법으로 마커 위치에서 뉴클레오티드의 실체를 확인할 수 있다.
이중대립인자 마커의 De Novo 동정을 위한 방법
다양한 방법, 예를 들면 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화, 겔 전기영동으로 측정된 이동도에서 변화 검출 또는 증폭된 핵산의 직접 서열분석을 활용하여단일 뉴클레오티드 다형성의 게놈 단편을 스크린할 수 있다. 이중대립인자 마커를 동정하는데 적합한 방법에는 다수의 무관한 개체로부터 게놈 DNA 단편의 비교 서열분석이 포함된다.
첫 번째 구체예에서, 무관한 개체로부터 DNA 시료는 함께 모으고, 이후 관심있는 게놈 DNA을 증폭하고 서열분석한다. 이렇게 수득된 뉴클레오티드 서열은 분석하여 현저한 다형성을 동정한다. 이런 방법의 중요한 이점중의 한가지는 DNA 시료의 집합(pooling)은 DNA 증폭 반응과 염기서열 반응의 회수를 실질적으로 감소시킨다는 점이다. 게다가. 이런 방법은 이렇게 수득된 이중대립인자 마커가 연관 연구를 실시하는데 사용되는 조금 덜 일반적인 대립유전자의 충분한 빈도를 보일 만큼 민감하다.
두 번째 구체예에서, DNA 시료는 모으지 않고, 따라서 개별적으로 증폭과 서열분석한다. 일반적으로, 이런 방법은 후보 유전자내에서 연관 연구를 실시하기 위하여 이중대립인자 마커를 동정할 필요가 있는 경우에 적합하다. 적절하게는, 매우 유관한 유전자 영역, 예를 들면 프로모터 영역이나 엑손 영역은 이중대립인자 마커에 대하여 스크린할 수 있다. 이런 방법으로 얻은 이중대립인자 마커는 예로써 조금 빈도가 낮은 대립유전자의 빈도가 10% 이하이면, 연관 연구를 실시하는데 좀더 낮은 수준의 정보성(informativeness)을 보일 수 있다. 하지만, 이런 이중대립인자 마커는 연관 연구를 실시할 만큼 충분한 정보를 제공하는데, 본원 발명의 유전자 분석 연구에 조금 덜 유익한 마커를 포함시키는 것은 일부 경우에 발현빈도(penetrance)에서 드물게 나타나는 원인 돌연변이의 직접적인 동정을 가능하게 한다.
다음의 본원 발명에 따른 이중대립인자 마커의 동정에 사용되는데 적합한 방법의 다양한 파라미터를 설명한다.
게놈 DNA 서열
본원 발명의 이중대립인자 마커가 만들어지는 게놈 DNA 시료는 가급적, 공지된 인종 배경의 이질성 개체군에 상응하는 무관한 개체로부터 얻는다. DNA 시료를 얻는 개체수는 실질적으로 변화될 수 있는데, 바람직하게는 약 10 내지 1000명, 좀더 바람직하게는 50 내지 200명이다. 임의의 개체군에서 가능한 많은 마커를 동정하고 통계학적으로 유의한 결과를 발생시키는 충분한 다형적 다양성을 얻기 위하여 적어도 100명의 개체로부터 DNA 시료를 수거하는 것이 바람직하다.
분석할 게놈 DNA의 공급원과 관련하여, 제한없이 임의의 검사 시료를 사용할 수 있다. 이들 검사 시료는 본원 발명의 방법으로 검사할 수 있는 생물학적 시료를 함유하는데, 여기에는 사람과 동물 체액, 예를 들면 전체 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수, 뇨, 림프액 및 호흡기, 장, 비뇨생식기의 다양한 외부 분비물, 눈물, 타액, 우유, 백혈구, 골수종 등; 생물학적 유체, 예를 들면 세포 배양 상층액; 고정 조직 견본, 예를 들면 종양과 비-종양 조직과 림프절 조직; 골수 천자종(bone marrow aspirate)과 고정된 세포 견본이 포함된다. 본원 발명에 사용되는 게놈 DNA의 적합한 공급원은 각 공여자의 말초 정맥혈이다. 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 준비하는 기술은 당업자에게 공지된 것이다. 적절한 구체예의 상세한 내용은 실시예 1에 제시한다. 당업자는 집합된 또는 집합되지 않은 시료를 증폭할 지를 선택할수 있다.
DNA 증폭
게놈 DNA의 시료에서 이중대립인자 마커의 동정은 DNA 증폭 방법으로 이용으로 조장할 수 있다. DNA 시료는 증폭 단계를 위하여 모으거나 또는 모으지 않을 수 있다. DNA 증폭 기술은 당업자에게 공지된 것이다.
본원 발명에 사용될 수 있는 증폭 기술에는 리가아제 연쇄 반응(LCR(EP-A-320 308, WO 9320227, EP-A 439 182), 중합효소 연쇄 반응(PCR, RT-PCR), 핵산 서열 기초한 증폭(NASBA)과 같은 기술(Guatelli J.C., et al.(1990); Compton J.(1991), Q-베타 증폭(유럽 특허 출원 No 4544610), 가닥 치환 증폭(Walker et al.(1996); EP A 684 315), 표적 매개된 증폭(PCT 출원 WO 9322461)이 포함되지만, 이들에 국한되지 않는다.
LCR과 Gap LCR은 기하급수적 증폭 기술로, DNA 분자에 어닐링된 인접 프라이머를 결합시키는데 DNA 리가아제에 의존한다. 리가아제 연쇄 반응(LCR)에서 프로브 쌍이 사용되고, 여기에는 2개의 일차(제1과 제2) 프로브 및 2개의 이차(제3과 제4) 프로브가 포함되는데, 이들 모두는 표적에 대하여 과잉 몰로 사용된다. 제1 프로브는 표적 가닥의 제1 분절과 혼성화되고 제2 프로브는 표적 가닥의 제2 분절과 혼성화되는데, 제1과 제2 분절은 인접하고, 따라서 일차 프로브는 5'인산염-3'하이드록실 관계로 접하고 리가아제는 2개의 프로브를 융합된 산물을 공유 융합 또는 결찰시킬 수 있다. 이에 더하여, 제3(이차) 프로브는 제1 프로브의 일부분과 혼성화되고 제4(이차) 프로브는 유사한 접경 방식으로 제2 분절의 일부분과 혼성화된다. 물론, 표적이 처음에 이중 가닥이면, 이차 프로브는 일차적으로 표적 보체와 혼성화된다. 일차 프로브의 결찰된 가닥이 표적 가닥으로부터 분리되면, 제3과 제4 프로브와 혼성화되는데, 이들은 결찰시켜 상보적인 이차 결찰 산물을 만들 수 있다. 결찰된 산물이 표적이나 이의 보체와 기능적으로 등가라는 것을 인식하는 것이 중요하다. 혼성화와 결찰 사이클의 반복으로, 표적 서열의 증폭을 달성한다. 다중 LCR 방법 역시 보고되었다(WO 9320227). Gap LCR(GLCR)은 프로브가 인접하지 않고 2 내지 3개의 염기에 의해 분리되는 변형 LCR이다.
본원 발명에서 mRNA의 증폭을 위하여, mRNA를 cDNA를 역전사시키고 이후 이를 중합효소 연쇄 반응시키는 방법(RT-PCR), 단계에 단일 효소를 이용한 방법(미국 특허 5,322,770), 또는 비대칭 Gap LCR(RT-AGLCR)을 이용한 방법(Marsshall et al.(1994))이 활용된다. AGLCR은 RNA를 증폭할 수 있는 변형 GLCR이다.
PCR 기술은 본원 발명에 적합한 증폭 기술이다. 다양한 PCR 기술은 당분야에 공지된 것이다(White(1997); "PCR Methods and Application", 1991, Cold Spring Harbor laboratory Press). 이들 각 PCR 과정에서, 증폭되는 핵산 서열의 양면에 PCR 프라이머는 dNTP 및 열안정성 중합효소, 예를 들면 Taq 중합효소, Pfu 중합효소 또는 Vent 중합효소와 함께 적절히 준비된 핵산 시료에 첨가한다. 혼성화된 프라이머는 신장시킨다. 이후, 변성, 혼성화, 신장의 사이클을 다시 시작한다. 사이클은 여러 번 반복하여 프라이머 부위사이의 핵산 서열을 보유하는 증폭된 단편을 만든다. PCR은 미국 특허 4,683,195; 4,683,202; 4,965,188을 비롯한 여러 특허에서 좀더 상세하게 기술되어 있다.
PCR 기술은 신규한 이중대립인자 마커를 동정하는데 적합한 증폭 기술이다. 본원 발명의 목적에 적합한 PCR 반응의 전형적인 예는 실시예 2에 제시한다.
본원 발명의 한 측면은 검사 시료에서 가급적 PCR을 이용하여 사람 CanIon 유전자, 특히 SEQ ID No 1 내지 3의 게놈 서열이나 SEQ ID 4의 cDNA 서열, 이의 단편 또는 변이체의 증폭 방법이다. 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
a) 증폭되는 폴리뉴클레오티드 영역의 양면에 위치하는 전술한 증폭 프라이머 쌍을 함유하는 증폭 반응물과 검사 시료를 접촉시키고;
b) 선택적으로, 상기 증폭 산물을 검출한다.
본원 발명은 또한, 검사 시료에서 사람 CanIon 유전자, 특히 SEQ ID No 1 내지 3의 게놈 서열이나 SEQ ID 4의 cDNA 서열, 이의 단편 또는 변이체의 증폭 키트에 관한는데, 상기 키트는 다음과 같이 구성된다:
a) 증폭되는 CanIon 영역의 양면에 위치하는 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머;
b) 선택적으로, 증폭 반응을 실시하는데 필요한 반응물.
상기 증폭 방법과 키트의 한 구체예에서, 증폭 산물은 증폭된 영역과 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브와의 혼성화로 검출된다. 상기 증폭 방법과 키트의 다른 구체예에서, 프라이머는 B1 내지 B17, C1 내지 C17, D1 내지 D18, E1 내지 E18의 뉴클레오티드 서열에서 선택되는 서열을 포함한다.
본원 발명의 첫 번째 구체예에서, 이중대립인자 마커는 본 발명자들에 의해 얻어진 게놈 서열 정보를 이용하여 동정한다. 서열분석된 게놈 DNA 단편은 500 bp단편의 증폭을 위한 프라이머를 설계하는데 사용된다. 이들 500 bp 단편은 게놈 DNA로부터 증폭하고 이중대립인자 마커를 스크린한다. 모든 프라이머는 특정 표적 염기의 상류에, 염기서열 프라이머로 기능하는 공통 올리고뉴클레오티드 꼬리를 보유한다.
CanIon 유전자를 인코드하는 게놈 서열의 증폭에 적합한 프라이머는 유전자의 프로모터, 엑손, 절단접합 부위에 집중한다. 이중대립인자 마커는 유전자의 이들 기능 영역에 위치하면 돌연변이를 초래할 가능성이 높아지게 된다. 본원 발명의 적절한 증폭 프라이머는 실시예 2, 표 1에 상세하게 기술된 뉴클레오티드 서열 B1 내지 B17과 C1 내지 C17을 보유한다.
증폭된 게놈 DNA의 서열분석 및 단일 뉴클레오티드 다형성의 동정
이후, 전술된 바와 같이 만들어진 증폭 산물은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 서열분석한다. 디데옥시-매개된 방법(Sanger 방법) 또는 Maxam-Gilbert 방법을 이용하여 DNA를 서열 분석하는 방법은 당업자에게 공지된 것이다. 이런 방법은 예로써 Sambrook et al.(1989)에 개시되어 있다. 대안적 방법에는 Chee et al.(1996)에서 밝힌 바와 같은 고밀도 DNA 어레이에 혼성화가 포함된다.
적절하게는, 증폭된 DNA는 염료 종결기 사이클 서열분석 프로토콜(dye terminator cycle sequencing protocol)을 이용한 자동화 디데옥시 종결기 염기서열 반응으로 측정한다. 다형성 검색은 동일한 위치에서 발생하는 상이한 염기로부터 기인하는 전기영동 패턴에서 중첩된 피크의 존재에 기초한다. 각 디데옥시 종결기는 상이한 형광 분자로 표지되기 때문에, 이중대립인자 부위에 상응하는 2개의피크는 서열상의 동일한 위치에서 2개의 상이한 뉴클레오티드에 상응하는 차별적인 색깔을 나타낸다. 하지만, 2개 피크의 존재는 배경 소음(background noise)으로 인한 인공물(artifact)일 수 있다. 이런 인공물을 배제하기 위하여, 2개의 DNA 가닥은 서열분석하고 피크간 비교를 실시한다. 다형적 서열로 등록되기 위해서는 다형성이 양 가닥에서 모두 검출되어야 한다.
상기 과정으로 이중대립인자 마커를 보유하는 이들 증폭 산물을 확인할 수 있다. 100명 개체의 염기서열 풀에 의해 검출되는 이중대립인자 다형성 빈도의 검출 한계는 공지된 대립유전자 빈도의 염기서열 풀로 검증하는 경우에, 마이너 대립유전자에서 대략 0.1이다. 하지만, 상기 집합(pooling) 방법에 의해 검출되는 이중대립인자 다형성의 90%이상은 마이너 대립유전자에 대하여 0.25이상의 빈도를 갖는다. 따라서, 상기 방법에 의해 선별된 이중대립인자 마커는 마이너 대립유전자에서 적어도 0.1 및 메이저 대립유전자에서 0.9 이하의 빈도, 바람직하게는 마이너 대립유전자에서 적어도 0.2 및 메이저 대립유전자에서 0.8 이하의 빈도, 좀더 바람직하게는 마이너 대립유전자에서 적어도 0.3 및 메이저 대립유전자에서 0.7 이하의 빈도를 갖고, 따라서 0.18 이상, 바람직하게는 0.32 이상, 좀더 바람직하게는 0.42 이상의 이질접합성을 갖는다.
다른 구체예에서, 이중대립인자 마커는 개별 DNA 시료를 서열분석하여 검출하는데, 이런 이중대립인자 마커의 마이너 대립유전자의 빈도는 0.1 이하이다.
본원 발명에 따른 이중대립인자 마커의 검증
다형성은 양 대립유전자가 개체군에 존재하는 지를 검증함으로써 유전자 마커로서의 활용도를 평가한다. 이중대립인자 마커의 검증은 본원 발명의 방법으로 일군의 개체를 유전자형판별하여 달성한다. 마이크로염기서열분석은 대립유전자를 유전자형판별하는데 적합한 방법은 유전자형판별 단계에 의한 검증은 상기 군에서 각 개체로부터 유래된 개별 시료에서 또는 1명이상의 개체로부터 유래된 집합된 시료에서 실시할 수 있다. 상기 군은 1명의 개체가 연구중인 대립유전자에 이형접합성이면 1명의 개체일 수 있다. 적절하게는, 상기 군에는 적어도 3명의 개체, 좀더 바람직하게는 적어도 5-6명의 개체가 포함되고, 따라서 단일 검증 검사로 복수의 이중대립인자 마커를 검증할 수 있다. 하지만, 검증 검사가 소규모 군에서 실시되면 샘플링 오류로 인해 검사 개체가 2개의 대립유전자중 한가지를 보유하지 않는 경우에 가음성(false negative) 결과가 초래될 수 있다. 따라서, 검증 과정은 특정 초기 결과가 인공물이고 서열상의 특정 위치에서 이중대립인자 마커가 실제로(Bona fide) 존재한다는 것을 입증하는 데에는 그다지 효과적이지 못하다. 선택적으로, 본원 발명의 유전자형판별, 일배체형분류(haplotyping), 연관, 상호작용 연구 방법은 검증된 이중대립인자 마커로만 실시할 수도 있다.
본원 발명에 따른 이중대립인자 마커의 빈도 평가
검증된 이중대립인자 마커는 이중대립인자 마커 위치에서 최소한의 공통 대립유전자의 빈도를 측정함으로써 유전자 마커로서 이들의 활용도를 추가로 평가한다. 조금 덜 공통된 대립유전자가 빈도가 높을수록, 연관 연구와 상호작용 연구에서 이중대립인자 마커의 활용도는 더 커진다. 최소한의 공통 대립유전자의 측정은 본원 발명의 방법으로 일군의 개체를 유전자형판별하고 양 대립유전자가 존재한다는 것을 입증함으로써 달성한다. 유전자형판별 단계에 의한 빈도의 측정은 상기 군에서 각 개체로부터 유래된 개별 시료에서 또는 1명이상의 개체로부터 유래된 집합된 시료에서 실시할 수 있다. 상기 군은 전체 개체군을 대표할 수 있을 만큼 충분히 커야 한다. 적절하게는, 상기 군에는 적어도 20명의 개체, 좀더 바람직하게는 적어도 50명의 개체, 가장 바람직하게는 적어도 100명의 개체가 포함된다. 물론, 군의 규모가 더 클수록, 감소된 샘플링 오류로 인해 빈도 측정의 정확도가 커진다. 조금 덜 공통된 대립유전자의 빈도가 30% 이상인 이중대립인자 마커는 "고 품질 이중대립인자 마커"라고 한다. 선택적으로, 본원 발명의 유전자형판별, 일배체형판별(haplotyping), 연관, 상호작용 연구 방법은 고 품질 이중대립인자 마커로만 실시할 수도 있다.
이중대립인자 마커에 대하여 개체를 유전자형판별하는 방법
본원 발명의 한가지이상 이중대립인자 마커에 대하여 생물학적 시료를 유전자형판별하는 방법을 제시하는데, 이들 방법은 시험관내에서 실시한다. 이런 유전자형판별 방법은 당분야에 공지된 방법으로 CanIon 이중대립인자 마커 위치에서 뉴클레오티드의 실체를 확인하는 단계로 구성된다. 이들 방법은 연관 연구에서 사례-대조 개체군 및 임의의 형질과 연관된 것으로 알려진 이중대립인자 마커의 대립유전자의 검출에서 개체를 유전자형판별하는데 이용되는데, 여기서 개체의 게놈에 존재하는 이중대립인자 마커의 양 사본이 측정되고, 따라서 개체는 특정 대립유전자에 대하여 동형접합성 또는 이형접합성으로 분류될 수 있다.
이들 유전자형판별 방법은 단일 개체 또는 집합된 DNA 시료로부터 유래된 핵산 시료에서 실시할 수 있다.
유전자형판별은 이중대립인자 마커의 동정을 위한 전술된 방법과 유사한 방법, 또는 후술된 방법과 같은 유전자형판별 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 적절한 구체예에서, 상이한 개체로부터 증폭된 게놈 단편 단편의 서열 비교는 신규한 이중대립인자 마커를 동정하는데 이용되는 반면, 마이크로염기서열분석은 진단과 연관 연구에서 공지된 이중대립인자 마커를 유전자형판별하는데 이용된다.
한 구체예에서, 본원 발명에는 생물학적 시료에서 CanIon-관련된 이중대립인자 마커에서 뉴클레오티드 또는 이의 보체의 실체를 확인하는 유전자형판별 방법이 포함된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A17과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A12와 A16과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 생물학적 시료는 단일 개체로부터 유래된다; 선택적으로, 상기 생물학적 시료는 다중 개체로부터 유래된다; 선택적으로, 상기 이중대립인자 마커에서 뉴클레오티드의 실체는 개체의 게놈에 존재하는 이중대립인자 마커의 양 사본에서 확인된다; 선택적으로, 본원 발명의 유전자형판별 방법에는 임의의 제한없이 본원에 개시된 단독의 또는 조합된 방법이 포함된다; 선택적으로, 상기 방법은 시험관내에서 실시된다; 선택적으로, 확인 단계에 앞서 이중대립인자 마커를 보유하는 서열의 일부분을 증폭하는 단계가 추가로 포함된다. 선택적으로, 상기 증폭은 PCR, LCR, 또는 숙주 세포에서 복제 기점과 상기 단편을 포함하는 재조합 벡터의 복제로 실시한다; 선택적으로, 확인은 혼성화 분석, 염기서열분석, 마이크로염기서열분석 또는 효소-기초한 미스매치 검출 분석으로 실시한다.
유전자형판별을 위한 핵산의 공급원
정제된 또는 비-정제된 핵산의 공급원은 원하는 특이적인 핵산 서열을 보유하는 또는 보유한 것으로 생각되면 출발 핵산으로 사용될 수 있다. DNA 또는 RNA는 전술한 바와 같이 세포, 조직, 체액 등으로부터 추출할 수 있다. 본원 발명의 유전자형판별 방법에 사용되는 핵산이 임의의 포유동물 공급원으로부터 유래될 수 있다면, 핵산 시료를 채취하는 검사 대상과 개체는 사람으로 간주한다.
이중대립인자 마커를 포함하는 DNA 단편의 증폭
본원 발명의 한가지이상 대립유전자 마커를 포함하는 뉴클레오티드 분절을 증폭하기 위한 방법과 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이중대립인자 마커를 포함하는 DNA 단편의 증폭은 다양한 방법과 목적에 활용될 수 있으며, 유전자형판별에 한정되지 않는다. 하지만, 대부분의 유전자형판별 방법은 관심있는 이중대립인자 마커를 보유하는 DNA 영역의 사전 증폭을 필요로 한다. 이런 방법은 이중대립인자 마커에 걸쳐 있거나 또는 상기 부위를 보유하는 서열 및 여기에 멀리 또는 가까이 위치하는 서열의 농도나 전체 개체수를 특이적으로 증가시킨다. 진단 방법 역시 본원 발명의 이중대립인자 마커를 보유하는 DNA 분절의 증폭에 의존할 수 있다. DNA의 증폭은 당분야에 공지된 임의의 방법으로 달성할 수 있다. 증폭 기술은"DNA 증폭" 섹션에서 전술한다.
이들 증폭 방법중 일부는 단일 뉴클레오티드 다형성의 검출에 특히 적합하고, 표적 서열의 동시 증폭 및 다형적 뉴클레오티드의 동정을 가능하게 한다.
전술한 이중대립인자 마커의 동정은 적합한 올리고뉴클레오티드의 설계를 가능하게 하는데, 상기 올리고뉴클레오티드는 본원 발명의 이중대립인자 마커를 포함하는 DNA 단편을 증폭하는 프라이머로 사용될 수 있다. 증폭은 본원에서 밝힌 신규한 이중대립인자 마커를 발견되는 처음 사용된 프라이머, 또는 본원 발명의 이중대립인자 마커를 포함하는 DNA 단편의 증폭을 가능하게 하는 일단의 프라이머를 이용하여 실시할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 본원 발명의 한가지이상 이중대립인자 마커를 보유하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머를 제공한다. 적절한 증폭 프라이머는 실시예 2에 기재한다. 기재된 프라이머는 단지 예를 든 것으로, 본원 발명의 한가지이상 이중대립인자 마커를 보유하는 증폭 산물을 생산하는 다른 일단의 프라이머 역시 사용 가능하다.
프라이머의 간격은 증폭되는 분절의 길이를 결정한다. 본원 발명에서, 이중대립인자 마커를 보유하는 증폭된 분절은 적어도 25 bp 내지 35 bp 크기를 갖는다. 증폭 단편은 25-3000 bp, 바람직하게는 50-1000 bp, 좀더 바람직하게는 100-600 bp이다. 이중대립인자 마커에 대한 증폭 프라이머는 마커를 보유하는 DNA 단편의 특이적인 증폭을 가능하게 하는 임의의 서열일 수 있다. 증폭 프라이머는 "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머"에서 밝힌 바와 같이 표지되거나 또는 고체 서포트에 고정될 수 있다.
이중대립인자 마커에 대하여 DNA 시료를 유전자형판별하는 방법
이중대립인자 마커 부위에 존재하는 뉴클레오티드를 동정하기 위하여 당분야에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 검출되는 이중대립인자 마커 대립유전자가 본원 발명에서 동정되고 구체화되었기 때문에, 당업자는 다양한 기술을 활용하여 검출을 용이하게 실시할 수 있다. 많은 유전자형판별 방법은 관심있는 이중대립인자 마커를 보유하는 DNA 영역의 사전 증폭을 요구한다. 표적이나 신호의 증폭이 현재 선호되긴 하지만, 증폭을 필요로 하지 않는 초감수성 검출 방법 역시 본원 발명의 유전자형판별 방법에 포함된다. 이중대립인자 다형성을 검출하는데 사용될 수 있는 당업자에게 공지된 방법에는 통상적인 점 블랏 분석, 단일 가닥 형태 다형성 분석(SSCP)(Orita et al.(1989)), 변성 농도구배 겔 전기영동(DGGE), 헤테로이중나선 분석, 미스매치 제거 검출 및 다른 통상적인 기술(Sheffield et al.(1991), White et al.(1992), Grompe et al.(1989과 1993))과 같은 방법이 포함된다. 특정 다형적 부위에 존재하는 뉴클레오티드의 실체를 확인하는 다른 방법에서는 미국 특허 4,656,127에서 밝힌 바와 같은 전문화된 엑소뉴클레아제-저항성 뉴클레오티드 유도체를 이용한다.
적절한 방법은 염기서열 분석, 효소-기초한 미스매치 검출 분석 또는 혼성화 분석으로 이중대립인자 마커 부위에 존재하는 뉴클레오티드의 실체를 직접적으로 측정하는 단계를 포함한다. 다음은 일부 적절한 방법의 설명이다. 특히 적절한 방법은 마이크로염기서열분석 기술이다. 본원에서 "염기서열분석"은 이중나선 프라이머/주형 복합체의 중합효소 신장을 의미하는데, 여기에는 통상적인 염기서열분석과 마이크로염기서열분석이 포함된다.
1) 염기서열분석
다형적 부위에 존재하는 뉴클레오티드는 염기서열분석으로 확인할 수 있다. 적절한 구체예에서, DNA 시료는 전술한 염기서열분석에 앞서 PCR 증폭한다. DNA 염기서열분석 방법은 "증폭된 게놈 DNA의 증폭 및 단일 뉴클레오티드 다형성의 동정"에서 기술한다.
적절하게는, 증폭된 DNA는 염료-프라이머 사이클 염기서열분석 프로토콜을 이용한 자동화 디데옥시 종료기 서열분석 반응을 실시한다. 서열 분석은 이중대립인자 마커 부위에 존재하는 염기의 동정을 가능하게 한다.
2) 마이크로염기서열분석
마이크로염기서열분석 방법에서, 표적 DNA의 다형성 부위에서 뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드 프라이머 신장 반응으로 검출한다. 상기 방법에는 표적 핵산에서 관심있는 다형적 염기의 바로 상류와 혼성화되는 적합한 마이크로염기서열분석 프라이머가 관여한다. 중합효소는 다형적 부위에서 뉴클레오티드에 상보적인 1개의 단일 ddNTP(사슬 종료기)로 프라이머의 3'말단을 특이적으로 신장시키는데 사용된다. 이후, 통합된 뉴클레오티드의 실체는 임의의 적합한 방법으로 확인한다.
전형적으로, 마이크로염기서열 반응은 형광 ddNTP로 실시하고 신장된 마이크로염기서열분석 프라이머는 EP 412 883에서 밝힌 바와 같이, ABI377 염기서열분석기계에서 전기영동으로 분석하여 통합된 뉴클레오티드의 실체를 확인한다. 대안으로, 모세관 전기영동은 좀더 많은 수의 분석을 동시에 처리하는데 사용될 수 있다. 본원 발명에서 이용될 수 있는 전형적인 마이크로염기서열분석 과정의 예는 실시예 4에 제시한다.
ddNTP의 표지와 검출에 상이한 접근방식을 활용할 수 있다. 형광 공명 에너지 전달에 기초한 상동성 상 검출 방법은 Chen and Kwok(1997) 및 Chen et al.(1997)에서 기술한다. 상기 방법에서, 다형적 부위를 보유하는 증폭된 게놈 DNA 단편은 대립유전자 염료-표지된 디데옥시리보뉴클레오시드 삼인산염과 변형된 Taq 중합효소의 존재하에 5'-플루레신-표지된 프라이머와 함께 배양한다. 염료-표지된 프라이머는 주형에 존재하는 대립유전자에 특이적인 염료-종료기에 의해 1염기 신장된다. 유전자형판별 반응의 종결시점에서, 반응 혼합물에서 2가지 염료의 형광 강도는 분리 또는 정제없이 직접 분석한다. 이들 모든 단계는 동일한 튜브에서 실시할 수 있고, 형광 변화는 실시간으로 모니터할 수 있다. 대안으로, 신장된 프라이머는 MALDI-TOF 질량 분광법으로 분석할 수 있다. 다형적 부위에서 염기는 마이크로염기서열분석 프라이머에 더해진 질량에 의해 동정된다(Haff and Smirnov, 1997).
마이크로염기서열분석은 확립된 염기서열분석 방법 또는 이로부터 파생된 방법의 개발로 달성할 수 있다. 대안적 방법에는 여러 고체상 마이크로염기서열분석 기술이 포함된다. 기본 마이크로염기서열분석 프로토콜은 프라이머 또는 표적 분자가 고체 서포트에 고정이나 포획되는 이형이질성 상 분석으로 상기 방법이 실시되는 점을 제외하고, 전술한 바와 동일하다. 프라이머 분리와 종결 뉴클레오티드 첨가 분석을 단순화시키기 위하여, 올리고뉴클레오티드는 고체 서포트에 부착시키거나, 또는 친화성 분리와 중합효소 신장을 가능하게 하는 형태로 변형시킨다. 합성 올리고뉴클레오티드의 5' 말단과 내부 뉴클레오티드는 상이한 친화성 분리 방식을 가능하게 하는 다양한 방식, 예를 들면 비오틴화로 변형시킬 수 있다. 단일 친화성 기가 올리고뉴클레오티드에 사용되면, 올리고뉴클레오티드는 통합된 종료기 반응물로부터 분리할 수 있다. 이는 물리적 또는 크기 배제의 필요성을 제거한다. 1개이상의 올리고뉴클레오티드는 죵료기 반응물로부터 분리할 수 있고 1개이상의 친화성 기를 사용하면 동시에 분석할 수 있다. 이는 신장 반응당 여러 핵산 종류 또는 다른 핵산 서열 정보의 분석을 가능하게 한다. 친화성 기는 기폭 올리고뉴클레오티드에는 필요하지 않지만 주형에는 존재할 수 있다. 가령, 고정화는 비오틴화된 DNA와 스트렙타비딘-피복된 마이크로적정(microtitration) 웰 또는 아비딘-피복된 폴리스티렌 입자간 상호작용을 통하여 실시할 수 있다. 동일한 방식으로, 올리고뉴클레오티드 또는 주형은 고밀도 형식으로 고체 서포트에 부착될 수 있다. 이런 고체 상 마이크로염기서열 반응에서, 통합된 ddNTP는 방사성표지하거나(Syvanen, 1994) 또는 플루레신에 결합시킬 수 있다(Livak and Hainer, 1994). 방사성표지된 ddNTP의 검출은 신털레이션-기초한 기술을 통하여 달성할 수 있다. 플루레신-결합된 ddNTP의 검출은 알칼린 포스파타제와 공액된 항플루레신 항체의 결합 및 이후 색소(chromogenic) 기질(예, p-니트로페닐 인산염)과의 배양에 기초할 수 있다. 다른 가능한 리포터-검출쌍은 다음과 같다: 디니트로페닐(DNP)에 결합된 ddNTP 및 항-DNP 알칼린 포스파타제 공액체(Harju et al., 1993), 또는 비오틴화된 ddNTP 및 기질로 o-페닐렌디아민을 함유하는 양고추냉이 과산화효소-공액된 스트렙타비딘(째 92/15712). 다른 대안적 고체-상 마이크로염기서열분석 과정으로, Nyren et al.(1993)은 효소 발광계 무기 피로포스페이트 검출 분석(ELIDA)에 의한 DNA 중합효소 활성의 검출에 기초한 방법을 기술하였다.
Pastinen et al.(1997)에서는 단일 뉴클레오티드 다형성의 다중 검출 방법을 기술하는데, 여기서 고체 상 미니염기서열분석 원리가 올리고뉴클레오티드 어레이 포맷에 적용된다. 고체 서포트(DNA 칩)에 부착된 DNA 프로브의 고밀도 어레이는 하기에 추가로 설명한다.
한 측면에서, 본원 발명은 마이크로염기서열분석을 실시함으로써 본원 발명의 한가지이상 이중대립인자 마커를 유전자형판별하기 위한 폴리뉴클레오티드와 방법을 제공한다. 적절한 마이크로염기서열분석 프라이머에는 뉴클레오티드 서열 D1 내지 D18과 E1 내지 E18이 포함된다. 실시예 4에 기재된 마이크로염기서열분석 프라이머는 단지 예를 든 것으로, 다형적 폴리뉴클레오티드에 인접하여 3' 말단을 보유하는 임의의 프라이머를 사용할 수 있다. 유사하게, 마이크로염기서열분석은 본원 발명에 따른 임의의 이중대립인자 마커 또는 이런 마커의 조합에 대하여 실시할 수 있다. 본원 발명의 한 측면은 이중대립인자 마커 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 확인하기 위한 실시에 4에 기재된 한가지이상 마이크로염기서열분석 프라이머, 또는 적어도 8, 12, 15, 20, 25, 30, 40 또는 50개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 이의 단편을 보유하고(여기서 단편 길이는 전술한 프라이머와 일치한다) 상응하는 이중대립인자 마커의 바로 상류에 3' 말단을 보유하는 고체 서포트이다.
3) 중합효소와 리가아제에 기초한 미스매치 검출 분석
한 측면에서, 본원 발명은 중합효소 및/또는 리가아제 기초한 미스매치 검출 분석으로 생물학적 시료에서 본원 발명의 한가지이상 이중대립인자 마커의 대립유전자를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드와 방법을 제공한다. 이들 분석은 중합효소와 리가아제의 특이성에 기초한다. 중합화 반응에서는 증폭 프라이머 3' 말단의 정확한 염기 대합(paring)을 특히 엄격하게 요구하고, 표적 DNA 서열에 혼성화된 2가지 올리고뉴클레오티드의 결합은 결찰 부위 인근, 특히 3' 말단에서 미스매체에 매우 민감하다. 본원 발명의 이중대립인자 마커를 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 방법, 프라이머, 다양한 파리미터는 "이중대립인자 마커를 포함하는 DNA 단편의 증폭"에서 전술한다.
대립유전자 특이적 증폭 프라이머
이중대립인자 마커의 2가지 대립유전자간 구별 역시 대립유전자 특이적 증폭, 선별 전략으로 달성할 수 있는데, 여기서 대립유전자중 한가지는 다른 대립유전자의 증폭없이 증폭된다. 대립유전자 특이적 증폭을 위하여, 프라이머쌍중 적어도 한가지는 혼성화되고 증폭을 유도할 만큼 본원 발명에 따른 이중대립인자 마커의 다형적 염기를 포함하는 CanIon 유전자 영역과 충분히 상보적이다. 이런 프라이머는 이중대립인자 마커의 2가지 대립유전자를 구별할 수 있다.
이는 증폭 프라이머중 한가지의 3' 말단에 다형적 염기를 위치시켜 달성한다. 프라이머의 3' 말단으로부터 신장이 이루어지기 때문에, 이 위치 인근에서 미스매치는 증폭에 저해 효과를 보인다. 따라서, 적절한 증폭 조건하에 이들 프라이머는 이들 상보적 대립유전자에 증폭을 유도한다. 미스매체의 정확한 위치 및 상응하는 분석 조건을 결정하는 것은 당분의 통상적 지식에 속한다.
결찰/증폭 기초한 방법
"올리고뉴클레오티드 결찰 분석"(OLA)에서는 표적 분자의 단일 가닥의 인접 서열에 혼성화되도록 설계된 2가지 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 올리고뉴클레오티드중 한가지는 비오틴화되고, 다른 한가지는 검출가능하게 표지된다. 정확한 상보적 서열이 표적 분자에서 발견되면, 올리고뉴클레오티드는 혼성화되어 말단이 접하게 되고 포획 및 검출가능한 결찰 기질이 만들어진다. OLA는 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출할 수 있는데, Nickerson et al.(1990)에서 밝힌 바와 같이 PCR를 병행하면 유리하다. 이런 방법에서, PCR은 표적 DNA의 기하급수적 증폭을 달성하는데 사용되고, 상기 표적 DNA는 이후 OLA에 의해 검출된다.
단일 뉴클레오티드 다형성의 검출에 특히 적합한 다른 증폭 방법에는 LCR(리가아제 연쇄 반응), "DNA 증폭"에 전술된 Gap LCR(GLCR)이 포함된다. LCR에서는 2쌍의 프로브를 이용하여 특정 표적을 기하급수적으로 증폭시킨다. 올리고뉴클레오티드 각 쌍의 서열은 표적의 동일 가닥의 인접 서열과의 혼성화가 가능하도록 선별된다. 이런 혼성화는 주형-의존한 리가아제에 대한 기질을 형성한다. 본원 발명에 따라, LCR은 이중대립인자 마커 부위의 동일 가닥의 인접 서열과 원심 서열을 보유하는 올리고뉴클레오티드로 실시할 수 있다. 한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 이중대립인자 마커 부위를 보유하도록 설계된다. 이런 구체예에서, 반응조건은 표적 분자가 올리고뉴클레오티드에서 이중대립인자 마커에 상보적인 특정 뉴클레오티드를 보유하거나 또는 결핍하는 경우에만 올리고뉴클레오티드가 서로 결찰될 수 있도록 선별된다. 대안적 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 이중대립인자 마커를 보유하지 않고, 따라서 이들이 표적 분자와 혼성화될 때 "공백"이 만들어진다(WO 90/01069). 이후, 이런 공백은 상보적 dNTP(DNA 중합효소로 매개됨), 또는 다른 올리고뉴클레오티드 쌍으로 "채워진다". 따라서, 각 사이클의 종결시점에서 각 단일 가닥은 다음 사이클동안 표적으로 기능할 수 있는 보체를 보유하고 원하는 서열의 기하급수적 대립유전자-특이적 증폭이 달성된다.
리가아제/중합효소-매개된 Genetic Bit AnalysisTM은 핵산 분자의 사전선택된 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 확인하는 다른 방법이다. 이런 방법에는 사전선택된 부위에 존재하는 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오시드 삼인산염의 프라이머 분자 말단으로의 통합 단계 및 두 번째 올리고뉴클레오티드로의 후속적 결찰 단계가 포함된다. 반응은 고체상에 부착된 특정 라벨을 검출하여, 또는 용액에서 검출로 모니터한다.
4) 혼성화 분석 방법
이중대립인자 마커 부위에 존재하는 뉴클레오티드의 실체를 확인하는데 적합한 방법에는 핵산 혼성화가 포함된다. 이런 반응에 간편하게 사용될 수 있는 혼성화 프로브에는 가급적, 본원에 정의된 프로브가 포함된다. 임의의 혼성화 분석, 예를 들면 서던 혼성화, 노던 혼성화, 점 블랏 혼성화, 고체상 혼성화를 이용할 수있다(Sambrook et al., 1989).
혼성화는 상보적 염기 대합에 기인한 2가지 단일 가닥 핵산의 이중나선구조 형성을 의미한다. 혼성화는 정확하게 상보적 핵산 가닥 사이에 또는 약간의 미스매치 영역을 보유하는 핵산 가닥 사이에서 발생할 수 있다. 이중대립인자 마커의 한가지 형태에는 혼성화되지만 다른 형태에는 혼성화되지 않고, 따라서 상이한 대립유전자 형태를 구별할 수 있는 특이적인 프로브를 설계할 수 있다. 대립유전자-특이적 프로브는 종종 쌍으로 사용되는데, 이런 쌍의 한 구성원은 원형 대립유전자를 보유하는 표적 서열에 완전한 매치를 보이고, 다른 구성원은 대안적 대립유전자를 보유하는 표적 서열과 완전한 매치를 보인다. 혼성화 조건은 대립유전자간 혼성화 강도에서 현저한 차이, 바람직하게는 프로브가 대립유전자중 한가지에만 혼성화되는 이항 반응이 존재할 만큼 충분히 엄격해야 한다. 프로브가 정확하게 상보적 표적 서열에만 혼성화되는 엄격한 서열 특이적 혼성화 조건은 당분야에 공지된 것이다(Sambrook et al., 1989). 엄격한 조건은 서열 의존성으로, 개별 환경에 따라 달라진다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도와 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 5℃ 정도 낮게 선택된다. 이런 혼성화가 용액에서 실시될 수 있긴 하지만, 고체상 혼성화 분석을 이용하는 것이 바람직하다. 본원 발명의 이중대립인자 마커를 포함하는 표적 DNA는 혼성화 반응에 앞서 증폭할 수 있다. 시료에서 특정 대립유전자의 존재는 프로브와 표적 DNA간에 형성된 안정한 하이브리드 이중나선의 존부를 검출하여 확인한다. 하이브리드 이중나선의 검출은 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 하이브리드 이중나선을 검출을 가능하게 하는 표적이나 프로브에 결합된 검출가능한 라벨을 사용한 다양한 검출 분석 포맷은 당분야에 공지된 것이다. 전형적으로, 혼성화 이중나선은 혼성화되지 않은 핵산으로부터 분리하고, 이후 이중나선에 결합된 라벨은 검출한다. 당업자는 인지하는 바와 같이, 세척 단계를 활용하여 과잉 DNA 또는 프로브 및 결합되지 않은 공액체를 씻어낼 수 있다. 또한, 표준 이형이질성 분석 포맷은 프라이머와 프로브에 존재하는 라벨을 이용하여 하이브리드를 검출하는데 적합하다.
최근에 개발된 2가지 분석법은 분리 또는 세척없이 혼성화-기초된 대립유전자 구별이 가능하다(Landegren U. et al., 1998). TaqMan 분석은 축적 증폭 산물에 특이적으로 어닐링되는 DNA 프로브를 절단하는 Taq DNA 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성을 활용한다. TaqMan 프로브는 형광 에너지 전달을 통하여 상호작용하는 공여자-수용자 염료 쌍으로 표지한다. 증폭동안 진행(advancing) 중합효소에 의한 TaqMan 프로브의 절단은 켄칭(quenching) 수용자 염료로부터 공여자 염료를 분리시키고 공여자 형광을 현저하게 증가시킨다. 2가지 대립유전자 변이체를 검출하는데 필요한 모든 반응물은 반응의 시작시점에서 집합시킬 수 있고, 결과는 실시간으로 모니터한다(Livak et al., 1995). 대안적인 상동성 혼성화 기초한 과정에서, 분자 표지(molecular beacon)가 대립유전자 구별에 사용된다. 분자 표지는 상동성 용액에서 특정 핵산의 존재를 보고하는 헤어핀-형태의 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 이들이 표적에 결합하면, 내부적으로 켄칭된 형광단의 형광을 회복하는 입체형태적 재조직이 진행된다(Tyagi et al., 1998).
본원에 제시된 폴리뉴클레오티드는 생물학적 시료에서 이중대립인자 마커의검출을 위한 혼성화 분석에 사용될 수 있는 프로브를 생산하는데 이용될 수 있다. 이들 프로브는 8 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하고 본원 발명의 이중대립인자 마커를 포함하는 서열과 혼성화될 만큼 충분히 상보적이며 표적 서열에서 단지 1개의 뉴클레오티드 변이를 구별할 수 있을 만큼 충분히 특이적이라는 점으로 특징지어진다. 특히 적절한 프로브는 길이가 25개 뉴클레오티드이다. 적절하게는, 이중대립인자 마커는 폴리뉴클레오티드 프로브의 중심으로부터 4개 뉴클레오티드 이내에 위치한다. 특히 적절한 프로브에서, 이중대립인자 마커는 상기 폴리뉴클레오티드의 중심에 위치한다. 적절한 프로브는 표 1에 기재된 앰플리콘, 이의 상보적 서열 또는 이의 단편에서 선택되는 뉴클레오티드를 포함하는데, 상기 단편은 적어도 8개의 연속 뉴클레오티드, 바람직하게는 10, 15, 20개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 25, 30, 40, 47 또는 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하고 다형적 염기를 보유한다. 적절한 프로브는 P1 내지 P8 및 이의 상보적 서열에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적절한 구체예에서, 다형적 염기는 상기 폴리뉴클레오티드의 중심으로부터 5, 4, 3, 2, 1개 뉴클레오티드 이내, 좀더 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드의 중심에 위치한다.
적절하게는, 본원 발명의 프로브는 표지되거나 또는 고체 서포트에 고정된다. 라벨과 고체 서포트는 "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머"에서 추가로 설명한다. 프로브는 "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머"에서 밝힌 바와 같이 신장-불가능할 수 있다.
대립유전자 특이적 프로브에 대한 혼성화를 분석함으로써, 일정한 시료에서이중대립인자 마커 대립유전자의 존부를 검출할 수 있다. 어레이 포맷에서 고성능 병렬 혼성화는 "혼성화 분석법"에 포함되고 하기에 상술한다.
5) 올리고뉴클레오티드의 어드레스가능 어레이의 혼성화
올리고뉴클레오티드 어레이에 기초한 혼성화 분석은 완전하게 대합되고 미스매치된 표적 서열 변이체에 대한 짧은 올리고뉴클레오티드의 혼성화 안정성에서 차이에 기초한다. 다형성 정보에 대한 효과적 접근은 선택된 위치에서 고체 서포트에 부착된 올리고뉴클레오티드 프로브의 고밀도 어레이(예, 칩)를 포함하는 기본 구조를 통하여 달성한다. 각 DNA 칩은 격자-유사 패턴으로 정렬되고 동전 크기로 축소된 수천 내지 수백만개의 개별 합성 DNA 프로브를 보유할 수 있다.
칩 기술은 다양한 사례에 성공적으로 적용되었다. 가령, 돌연변이의 스크리닝은 맥주 효모균(S. cerevisiae) 변이 균주에서 BRCA1 유전자 및 HIV-1 바이러스의 프로테아제 유전자에서 실시되었다(Hacia et al., 1996; Shoemaker et al., 1996; Kozal et al., 1996). 이중대립인자 다형성을 검출하는데 사용되는 다양한 포맷의 칩은 Affymetrix(GeneChipTM), Hyseq(HyChip and HyGnostics), Protogene Laboratories에 의해 맞춤 생산될 수 있다.
일반적으로, 이들 방법에서는 표적 서열이 다형적 마커를 보유하는 개체로부터 유래된 표적 핵산 서열 분절에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브의 어레이를 이용한다. EP 785280에서는 단일 뉴클레오티드 다형성의 검출을 위한 기와(tiling) 전략을 기술한다. 간단히 말하면, 어레이는 다수의 특이적 다형성이"기와처럼 배열된다". 일반적으로, "기와"는 관심있는 표적 서열에 상보적인 서열 및 이런 서열의 사전선별된 변이, 예를 들면 기초 뉴클레오티드의 한가지이상 구성원으로 한가지이상 정해진 위치의 치환으로 구성되는 정의된 일단의 올리고뉴클레오티드 프로브의 합성을 의미한다. 기와 전략은 PCR 출원 95/11955에서 좀더 상세하게 기술한다. 특정 측면에서, 어레이는 다수의 특이적인 동정된 이중대립인자 마커 서열이 기와처럼 배열된다. 특히, 어레이는 특정 다형성을 보유하는 서열 분절을 스팬하는 다수의 프로브가 기와처럼 배열된다. 각 대립유전자에 상보적인 프로브를 담보하기 위하여, 상기 프로브는 이중대립인자 마커에서 차별되는 쌍으로 합성된다. 다형적 염기에서 차별되는 프로브 이외에, 단일치환된 프로브 역시 검출 블록에 기와처럼 배열된다. 이들 단일치환된 프로브는 다형성으로부터 양방향으로, 다른 뉴클레오티드(A, T, G, C(또는 U)에서 선택)로 치환된 일정한 수의 염기를 보유한다. 전형적으로, 기와처럼 배열되는 검출 블록에서 프로브는 이중대립인자 마커로부터 최대 5개 염기까지 서열의 치환을 보유한다. 단일치환된 프로브는 인공 교차-혼성화(cross-hybridization)로부터 실제 혼성화를 구별하는 기와처럼 배열된 어레이에 대한 내부 대조군을 제공한다. 표적 서열과의 혼성화의 완결 및 어레이의 세척 직후, 어레이는 표적 서열이 혼성화되는 위치를 스캔한다. 이후, 스캔된 어레이로부터 얻은 혼성화 데이터는 분석하여 이중대립인자 마커의 대립유전자가 시료에 존재하는 지를 확인한다. 혼성화와 스캐닝(scanning)은 PCR 출원 WO 92/10092와 WO 95/11955; 미국 특허 5,424,186에서 밝힌 바와 같이 실시할 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서 칩은 대략 15개 뉴클레오티드 길이의 핵산 단편 서열의 어레이를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 칩은 표 1에 기재된 앰플리콘, 이의 상보적 서열 또는 이의 단편에서 선택되는 서열중 적어도 한가지를 보유하는 어레이를 포함할 수 있는데, 상기 단편은 적어도 8개의 연속 뉴클레오티드, 바람직하게는 10, 15, 20개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 25, 30, 40, 47 또는 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하고 다형적 염기를 보유한다. 적절한 프로브는 P1 내지 P8 및 이의 상보적 서열에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적절한 구체예에서, 다형적 염기는 상기 폴리뉴클레오티드의 중심으로부터 5, 4, 3, 2, 1개 뉴클레오티드 이내, 좀더 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드의 중심에 위치한다. 일부 구체예에서, 칩은 본원 발명에 따른 폴리뉴클레오티드중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 이보다 많은 폴리뉴클레오티드로 구성되는 어레이를 포함한다.
고체 서포트 및 고체 서포트에 부착되는 본원 발명의 폴리뉴클레오티드는 "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머"에서 추가로 설명한다.
6) 통합 시스템
다형성을 분석하는데 사용할 수 있는 다른 기술에는 단일 기능 장치에서 PCR과 모세관 전기영동 반응과 같은 과정을 축소되고 구획한 다성분 통합 시스템이 포함된다. 이런 기술의 예는 미국 특허 5,589,136에서 개시하는데, 이는 칩에서 PCR 증폭. 및 모세관 전기영동의 통합을 기술한다.
통합 시스템은 마이크로유체 시스템을 사용하는 경우에 주로 고려할 수 있다. 이들 시스템은 마이크로칩에 포함되는 유리, 실리콘, 석영 또는 플라스틱 와이퍼에 설계된 마이크로채널의 패턴을 포함한다. 시료의 움직임은 마이크로칩의 전체 영역에 가해지는 전기력, 전기삼투력 또는 부력으로 조절하여, 회전체(moving part)가 없는 기능성 현미경적 밸브와 펌프를 만든다.
유전자형판별 이중대립인자 마커에서, 마이크로유체 시스템은 핵산 증폭, 마이크로염기서열분석, 모세관 전기영동 및 레이저-유도된 형광 검출과 같은 검출 방법을 통합할 수 있다.
본원 발명에 따른 이중대립인자 마커를 이용한 유전자 분석 방법
복합 형질의 유전자 분석에 여러 방법이 가용하다(Lander and Schork, 1994). 질병-취약성 유전자의 검색은 2가지 주요 방법으로 실시한다: 가족 연구를 활용하여 좌위와 추정 형질 좌위간 동시분리(cosegregation)의 증거를 추적하는 연쇄 방식 및 대립유전자와 대립유전자를 유발하는 형질간 통계학적으로 유의한 연관의 증거를 추적하는 연관 방식(Khoury et al., 1993). 일반적으로, 본원 발명의 이중대립인자 마커는 유전형과 표현형간 통계학적으로 유의한 상관관계를 예시하는 당분야에 공지된 방법에 사용될 수 있다. 이중대립인자 마커는 파라메트릭(parametric)과 비-파라메트릭 연쇄 분석 방법에 사용될 수 있다. 적절하게는, 본원 발명의 이중대립인자 마커는 연쇄 연구를 이용하여 검출가능한 형질과 연관된 유전자를 동정하는데 사용되는데, 이런 방식은 영향을 받은 가족의 참여를 필요로 하지 않고 복합적 형질과 산발적 형질과 연관된 유전자의 동정이 가능하다.
본원 발명의 이중대립인자 마커를 이용한 유전자 분석은 임의의 스케일로 실시할 수 있다. 본원 발명에 따른 이중대립인자의 전체 세트, 또는 후보 유전자에 상응하는 본원 발명에 따른 이중대립인자 마커의 임의 서브세트를 사용할 수 있다. 또한, 본원 발명의 이중대립인자 마커를 보유하는 유전자 마커의 임의 세트를 사용할 수도 있다. 본원 발명의 이중대립인자 마커와 함께 유전자 마커로 사용될 수 있는 일단의 이중대립인자 다형성은 WO 98/20165에서 기술한다. 전술한 바와 같이, 본원 발명의 이중대립인자 마커는 사람 게놈의 전체 또는 부분 유전자 지도에 포함될 수 있다. 이들 별개의 용도는 본원 발명 및 특허청구범위에서 특이적으로 정관한다.
연쇄 연구
연쇄 연구는 가족내 여러 세대에서 유전자 마커의 전달과 특정 형질의 전달간 상관관계를 확립하는데 기초한다. 따라서, 연쇄 연구의 목적은 가계에서 관심있는 형질로 동시분리(codegregation)를 보이는 마커 좌위를 검출하는 것이다.
파라메트릭 방법
데이터가 연속 세대로부터 가능하면, 여러 쌍의 좌위간 연쇄 정도를 연구할 수 있다. 재조합 분류(recombinant fraction)의 평가로 좌위를 정리하고 유전자 지도에 배치할 수 있다. 유전자 마커인 좌위로 유전자 지도를 확립할 수 있고, 이후 마커와 형질간 연쇄 강도를 계산할 수 있는데, 이는 이들 형질에 영향을 주는 마커와 유전자의 상대적 위치를 표시하는데 사용된다(Weir, 1996). 연쇄 분석의 고전적 방법은 홀수(lod) 스코어 방법의 대수이다(Morton, 1955; Ott, 1991). lod스코어의 계산은 질환에 대한 유전 모드의 명시를 필요로 한다(파라메트릭 방법). 일반적으로, 연쇄 연구로 동정된 후보 영역의 길이는 2 내지 20 Mb이다. 후보 영역이 전술한 바와 같이 동정되면, 추가의 마커를 이용한 재조합 개체의 분석으로 후보 영역의 상세한 설명이 가능하다. 일반적으로, 연쇄 분석 연구는 최대 5,000개 마이크로위성 마커의 이용에 기초하고, 따라서 연쇄 분석의 이론적으로 가능한 최대 분석능(resolution)은 평균 600 kb이다.
연쇄 연구는 분명한 멘델식 유전 패턴을 보이고 높은 발현빈도(penetrance)(즉, 대립유전자a의 형질 파지티브 보인자의 개체수와 개체군에서a보인자의 총 개체수간 비율)를 갖는 간단한 유전 형질의 지도를 작성하는데 성공적으로 이용되고 있다. 하지만, 파라메트릭 연쇄 분석은 많은 단점이 있다. 먼저, 이는 각 연구 형질에 적합한 유전자 모델의 선택에 대한 의존으로 제한된다. 게다가, 전술한 바와 같이 연쇄 분석을 이용하여 달성가능한 분석능(resolution)이 제한되고, 상보성 연구는 연쇄 분석을 통하여 처음에 동정된 2Mb 내지 20Mb의 분석을 정련해야 한다. 이에 더하여, 파라메트릭 연쇄 분석 방식은 복합적 유전 형질, 예를 들면 다중 유전자 및/또는 환경 인자의 복합 작용에 기인한 형질에는 적용하기 어렵다. 로드(lod) 스코어 분석에서 이들 인자를 적절히 설계하는 것은 매우 어렵다. 이런 경우에, 이런 상황에 연쇄 분석을 적용하는데 필요한 적절한 수의 가족을 확보하는데 너무 많은 노력과 비용이 소요된다(Risch and Merikangas. (1996)).
비-파라메트릭 방법
연쇄 분석을 위한 소위 비-파라메트릭 방법의 이점은 이들이 질환에 대한 유전 모드의 명시를 필요로 하지 않고 복합적 형질의 분석에 좀더 적합하다는 점이다. 비-파라메트릭 방법에서는 영향을 받은 근친이 우연히 기대되는 것보다 좀더 빈번하게 크로모좀 영역의 동일한 사본을 유전한다는 것을 보임으로써 크로모좀 영역의 유전 패턴이 무작위 만델식 분리와 일치하지 않는다는 것을 입증한다. 영향을 받은 근친은 불완전한 발현빈도 및 다인자 유전(polygenic inheritance)의 존재에서도 과도한 "대립유전자 공유(allele sharing)"를 보인다. 비-파라메트릭 연쇄 연구에서 2명의 개체에서 마커 좌위에서 일치 정도는 상태에서 동일한(IBS) 대립유전자 총수 또는 세대에서 동일한(IBD) 대립유전자 총수로 측정할 수 있다. 영향을 받은 근친 쌍 분석(affected sib pair analysis)은 공지된 특별한 사례로서, 이들 방법중 가장 간단한 형태이다.
본원 발명의 이중대립인자 마커는 파라메트릭과 비-파라메트릭 연쇄 분석에 모두 사용될 수 있다. 적절하게는, 이중대립인자 마커는 복합적 형질에 관여하는 유전자의 지도작성을 가능하게 하는 비-파라메트릭 방법에 사용될 수 있다. 본원 발명의 이중대립인자 마커는 복합적 형질에 영향을 주는 유전자의 지도를 작성하는 IBD-와 IBS-방법에 사용될 수 있다. 이런 연구에서, 고밀도의 이중대립인자 마커로 여러 인접 이중대립인자 마커 좌위를 집합시켜, 다중-대립유전자 마커에 의해 달성되는 효율을 성취할 수 있다(Zhao et al., 1998).
개체군 연관 연구
본원 발명에는 본원 발명의 이중대립인자 마커를 이용하여 CanIon 유전자가 검출가능한 형질과 연관하는 지를 확인하는 방법이 포함된다. 한 구체예에서, 본원 발명에는 이중대립인자 마커 대립유전자 또는 이중대립인자 마커 일배체형 및 형질간 연관을 검출하는 방법이 포함된다. 게다가, 본원 발명에는 본원 발명의 이중대립인자 마커와 연쇄 불균형한 형질 유발 대립유전자를 동정하는 방법이 포함된다.
전술한 바와 같이, 연관 연구를 실시하는데 대안적 방법을 이용할 수 있다: 게놈-전체 연관 연구, 후보 영역 연관 연구, 후보 유전자 연관 연구. 적절한 구체예에서, 본원 발명의 이중대립인자 마커는 후보 유전자 연관 연구를 실시하는데 사용된다. 후보 유전자 분석은 형질의 생태에 관한 정보가 일부 가용한 경우에, 특정 형질과 관련된 유전자 및 유전자 다형성의 동정에 지름길을 제공한다. 게다가, 본원 발명의 이중대립인자 마커는 게놈전체 연관 연구를 실시하기 위하여 사람 게놈의 유전자 마커의 임의 지도에 통합될 수 있다. 이중대립인자 마커의 고밀도 지도를 만드는 방법은 미국 특허 분할 출원 60/082,614에서 기술한다. 본원 발명의 이중대립인자 마커는 게놈의 특정 후보 영역(예, 특정 크로모좀 또는 특정 크로모좀 분절)의 임의 지도에 통합될 수도 있다.
전술한 바와 같이, 연관 연구는 전체 개체군에서 실시할 수 있고 영향을 받은 가족에서 관련된 개체에 실시된 연구로 한정되지 않는다. 연관 연구는 산발적 또는 다중적 형질의 분석이 가능하다는 점에서 매우 귀중하다. 게다가, 연관 연구는 연쇄 연구보다 형질 유발 대립유전자의 좀더 세밀한 유전지도작성을 가능하게 하는 소규모 유전지도작성(fine-scale mapping)에 유력한 방법이다. 가계에 기초한 연구는 종종 형질 유발 대립유전자의 위치를 정밀하게 좁힌다. 따라서, 본원발명의 이중대립인자 마커를 이용한 연관 연구는 연쇄 분석 방법으로 동정된 후보 영역에서 형질 유발 대립유전자의 위치를 정련하는데 사용될 수 있다. 관심있는 크로모좀 분절이 동정되면, 관심있는 영역에서 후보 유전자, 예를 들면 본원 발명의 후보 유전자의 존재는 형질 유발 대립유전자의 동정에 지름길을 제공할 수 있다. 본원 발명의 이중대립인자 마커는 후보 유전자가 형질과 연관한다는 것을 입증하는데 사용될 수 있다. 이런 용도는 본원에서 구체적으로 정관한다.
개체군에서 이중대립인자 마커 대립유전자 또는 이중대립인자 마커 일배체형의 빈도 측정
연관 연구는 좌위간 여러 대립유전자의 빈도간 상관관계를 탐구한다.
개체군에서 대립유전자의 빈도 측정
개체군에서 이중대립인자 마커의 대립유전자 빈도는 "이중대립인자 마커에 대하여 개체를 유전자형판별하는 방법"에서 전술한 방법, 또는 이런 의도한 목적에 적합한 유전자형판별 과정으로 측정할 수 있다. 집합된 시료 또는 개별 시료의 유전자형판별은 개체군에서 이중대립인자 마커의 빈도를 측정할 수 있다. 집합된 시료를 이용할 때 주요 장애물은 풀을 정립하는데 있어 정확한 DNA 농도를 측정하기 위한 정확도와 반복재현성이다. 개별 시료의 유전자형판별은 좀더 높은 감수성, 반복 재현성, 정확도를 제공하고, 본원 발명에 사용하기 적합한 방법이다. 적절하게는, 각 개체는 개별적으로 유전자형판별하고, 간단한 유전자 계수(conuting)를 적용하여 임의의 개체군에서 이중대립인자 마커의 대립유전자 또는 유전형의 빈도를 측정한다.
또한, 본원 발명은 개체군에서 대립유전자의 빈도를 측정하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음과 같이 구성된다: a) 본원 발명에 따른 이중대립인자 마커의 개체군으로부터 개체를 유전자형판별하고; b) 상기 개체군에서 이중대립인자 마커의 비례 표현(proportional representation)을 측정한다. 이에 더하여, 본원 발명의 개체군에서 대립유전자의 빈도를 측정하는 방법에는 제한없이 본원 발명에 개시된 단독의 또는 조합된 방법이 포함되는데, 여기서 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A17과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A12와 A16과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 개체군에서 이중대립인자 마커 대립유전자의 빈도 측정은 개체군에서 각 개체의 게놈에 존재하는 이중대립인자 마커의 양 사본에 대한 뉴클레오티드의 실체를 확인하고 상기 개체군에 대하여 CanIon-관련된 이중대립인자 마커에서 상기 뉴클레오티드의 비례 표현을 계산하여 달성할 수 있다; 선택적으로, 비례 표현 확인은 상기 개체군에서 대표적 인원수의 개체 또는 각 개체로부터 유래된 집합된 생물학적 시료에 본원의 유전자형판별 방법을 실시하고 전체와 비교된 상기 뉴클레오티드의 비례 함량을 계산하여 달성할 수 있다.
개체군에서 일배체형의 빈도 측정
이배체형 개체가 하나이상의 좌위에서 이형접합성이면 일배체형의 배우자 위상은 알지 못한다. 가족에서 가계 정보를 이용하면 배우자 위상을 추론할 수 있다(Perlin et al., 1994). 가계 정보가 가용하지 않으면 상이한 전략을 이용할 수 있다. 한가지 가능성은 분석으로부터 다중-부위 이형접합성 이배체형을 배제하고 동형접합체와 단일-부위 이형접합 개체만을 유지하는 것이지만, 이런 방식은 시료 조성에서 선입견 및 저밀도 일배체형의 과소평가를 초래할 가능성이 있다. 다른 가능성은 예로써 비대칭 PCR 증폭(Newton et al, 1989; Wu et al., 1989) 또는 제한 희석과 이후 PCR 증폭에 의한 단일 크로모좀의 분리(Ruano et al., 1990)로 독립적으로 단일 크로모좀을 조사하는 것이다. 게다가, 시료는 특정 대립유전자의 이중 PCR 증폭으로 충분히 밀접한 이중대립인자 마커에 대하여 일배체형화시킬 수 있다(Sarkar, G. and Sommer S. S., 1991). 이들 방식은 기술적 복잡성, 추가적인 비용, 대규모로 보편화의 부족 또는 가능한 선입견으로 인해 완전히 만족스럽지 못하다. 이런 어려움을 극복하기 위하여, Clark, A.G.(1990)에 의해 도입된 PCR-증폭된 DNA 유전형의 위상을 추론하는 대수를 이용할 수 있다. 간단히 말하면, 이런 원리는 분명한 개체, 다시 말하면 완전 동형접합체와 단일-부위 이형접합체를 검사함으로써 시료에 존재하는 일배체형의 예비 리스트를 기입하는 것으로 시작한다. 이후, 동일 시료에서 다른 개체는 이전에 인식된 일배체형의 가능 발생을 스크린한다. 각 파지티브 동정을 위하여, 상보적 일배체형은 모든 개체에 대한 위상 정보가 해결되거나, 또는 해결되지 않는 것으로 인식될 때까지 인식된 일배체형의 리스트에 추가한다. 상기 방법에서는 각 다중 이형접합성 개체에 단일 일배체형을 할당하는데, 여기서 1개이상의 이형접합성 부위가 존재하면 여러 일배체형이 가능하다. 대안으로, 각 개체에 일배체형을 할당하지 않고 개체군에서 일배체형 빈도를 측정하는 방법을 이용할 수 있다. 적절하게는, Hardy-Weinberg 비율(임의 교배(random mating))의 가정하에 일배체형 빈도의 최대 공산치(maximum likelihood estimate)를 결과하는 기대치-최대화(expectation-maximization)(EM) 대수에 기초한 방법이 이용된다(Exocoffier L. and Slatkin M., 1995). EM 대수는 데이터가 불명확/불완전한 경우에 유용한 일반화된 반복 최대 공산 측정 방법이다. EM 대수는 이형접합체를 일배체형으로 분석하는데 사용된다. 일배체형 측정은 "통계학적 방법"에서 상세하게 후술한다. 개체군에서 일배체형의 빈도를 측정하거나 또는 평가하는 다른 공지된 방법을 이용할 수 있다.
본원 발명에는 또한, 개체군에서 일단의 이중대립인자 마커에 대한 일배체형의 빈도를 측정하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: a) 개체군에서 각 개체에 대하여 본원 발명의 방법에 따라 적어도 1개의 CanIon-관련된 이중대립인자 마커를 유전자형판별하고; b) 상기 개체군에서 각 개체의 게놈에 존재하는 두 번째 이중대립인자 마커의 양 사본에 대하여 두 번째 이중대립인자 마커에서 뉴클레오티드의 실체를 확인함으로써 두 번째 이중대립인자 마커를 유전자형판별하며; c) a)와 b) 단계에서 확인된 뉴클레오티드의 실체에 일배체형 확인 방법을 적용하고; d) 상기 빈도의 추정값을 얻는다. 이에 더하여, 본원 발명의 일배체형의 빈도를 측정하는 방법에는 제한없이 본원 발명에 개시된 단독의 또는 조합된 방법이 포함되는데, 여기서 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A17과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A12와 A16과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 일배체형 확인 방법은 비대칭 PCR 증폭, 특정 대립유전자의 이중 PCR 증폭, Clark 대수, 또는 기대치-최대화 대수로 실시한다.
연쇄 불균형 분석
연쇄 불균형은 2개이상 좌위에서 대립유전자의 비-무작위 연관으로, 질환 형질에 관여하는 유전자의 지도 작성에 유력한 도구이다(Ajioka R.S. et al., 1997). 이중대립인자 마커는 사람 게놈에서 밀집하여 위치하고 다른 유형의 유전자 마커보다 좀더 많은 수량으로 유전자형판별될 수 있기 때문에, 연쇄 불균형에 기초한 유전자 분석에 특히 유용하다.
질환 돌연변이가 개체군에 먼저 도입되면(새로운 돌연변이 또는 돌연변이 담체의 이동으로 인해), 이는 단일 크로모좀 및 연결된 마커의 "배경"이나 "조상" 일배체형에 위치하게 된다. 결과적으로, 이들 마커와 질환 돌연변이간에는 완전 불균형이 존재한다: 질환 돌연변이는 일단의 특이적인 마커 대립유전자가 존재하는 경우에만 확인된다. 이후 세대에서 질환 돌연변이와 이들 마커다형성간에 재조합 현상이 발생하고, 불균형은 점진적으로 소멸된다. 이런 소멸의 속도는 재조합 빈도의 함수인데, 질환 유전자에 가장 가까운 마커가 좀더 멀리 떨어진 마커보다 좀더 높은 수준의 불균형을 나타낸다. 재조합으로 파괴되지 않으면 "조상" 일배체형및 상이한 좌위에서 마커 대립유전자간 연쇄 불균형은 가계뿐만 아니라 개체군을 통하여 추적할 수 있다. 일반적으로, 연쇄 불균형은 한 좌위에서 한가지 특이적 대립유전자와 두 번째 좌위에서 다른 특이적 대립유전자간 연관으로 간주된다.
질환과 마커 좌위간 불균형의 패턴이나 곡선은 질환 좌위에서 최대값을 보일 것으로 예상된다. 결과적으로, 질환 대립유전자와 밀접하게 연관된 유전자 마커간 연쇄 불균형의 총계는 질환 유전자의 위치와 관련된 귀중한 정보를 제공할 수 있다. 질환 좌위의 소규모 유전지도작성을 위하여, 연구 영역에서 마커간에 존재하는 연쇄 불균형의 패턴과 관련된 얼마간의 지식을 확보하는 것이 유리하다. 전술한 바와 같이, 연쇄 불균형 분석을 통하여 달성된 유전지도작성 분석능은 연쇄 연구에서보다 훨씬 높다. 연쇄 불균형 분석과 함께 고밀도의 이중대립인자 마커는 소규모 유전지도작성에 유력한 도구를 제공한다. 연쇄 불균형을 측정하는 다른 방법은 "통계학적 방법"에서 상세하게 후술한다.
형질-마커 연관의 개체군-기초한 사례-대조 연구
전술한 바와 같이, 동일한 크로모좀의 상이한 좌위에서 여러 쌍의 특정 대립유전자의 빈도는 무작위가 아니고, 무작위로부터 편차는 연쇄 불균형(linkage disequilibrium)이라 한다. 연관 연구는 개체군 빈도에 집중하고 연쇄 불균형 현상에 기초한다. 일정한 유전자에서 특정 대립유전자가 특정 형질을 초래하는데 직접 관여하면, 이의 빈도는 형질 네거티브 개체군 또는 무작위 대조 개체군에서 빈도와 비교하여 영향을 받은(형질 파지티브) 개체군에서 통계학적으로 증가하게 된다. 연쇄 불균형의 존재로 인하여, 형질-유발 대립유전자를 보유하는 일배체형에존재하는 모든 다른 대립유전자의 빈도 역시 형질 네거티브 개체 또는 무작위 대조군과 비교하여 형질 파지티브 개체에서 증가한다. 따라서, 형질 및 형질-유발 대립유전자와 연쇄 불균형인 임의의 대립유전자(특히, 이중대립인자 마커 대립유전자)간 연관은 특정 영역에서 형질-관련된 유전자의 존재를 암시한다. 사례-대조 개체군은 이중대립인자 마커에 대하여 유전자형판별하여 형질 유발 대립유전자에 근접하여 위치하는 연관을 확인할 수 있다. 형질과 연관된 일정한 한가지 마커와 연쇄 불균형인 임의의 마커는 형질과 연관한다. 연쇄 불균형은 형질-유발 대립유전자를 발견하기 위한 모든 가능한 기능적 다형성의 스크리닝에 대한 대안으로 한정된 유전자 다형성(특히, 이중대립인자 마커)의 사례-대조 개체군에서 상대적 빈도를 분석하는 것을 가능하게 한다. 연관 연구는 무관한 사례-대조 개체군에서 마커 대립유전자의 빈도를 비교하고, 복합적 형질의 정밀한 분석에 유력한 도구를 제공한다.
사례-대조 개체군(산입 기준)
개체군-기초한 연관 연구는 가족성 유전과는 무관하지만 사례-대조 개체군에서 특정 유전자 마커 또는 일단의 마커의 우세를 비교한다. 이들은 무관한 사례(영향을 받은 또는 형질 파지티브) 개체와 무관한 대조군(영향을 받지 않은, 형질 네거티브 또는 무작위) 개체의 비교에 기초한 사례-대조 연구이다. 적절하게는, 대조군은 영향을 받지 않은 또는 형질 네거티브 개체로 구성된다. 또한, 대조군은 사례 개체군과 인종적으로 대합된다. 이에 더하여, 대조군은 연구중인 형질에 대한 공지된 주요 혼란 인자(confusion factor)에 대한 사례-개체군에 대합된다(예,연령-의존성 형질에 대하여 연령-대합된다). 이상적으로, 2가지 시료에서 개체는 질환 상태에서만 구별되는 방식으로 쌍을 이룬다. "형질 파지티브 개체군", "사례 개체군", "영향을 받은 개체군"은 동일한 의미이다.
연관 연구를 이용한 복합적 형질의 정밀한 분석에서 중요한 단계는 사례-대조 개체군의 선택이다(Lander and Schork, 1994). 사례-대조 개체군의 선택에서 주요 단계는 일정한 형질이나 표현형의 임상적 정의이다. 임의의 유전 형질은 형질 파지티브와 형질 네거티브 군에 포함되는 개체를 신중하게 선별하고 본원에 제시된 연관 방법을 이용하여 분석할 수 있다. 일반적으로, 4가지 기준이 사용된다: 임상적 표현형, 발병 연령, 가족력, 심각도. 연속 또는 정량적 형질(예, 혈압)에 대한 선별 과정은 연구중인 형질의 표현형 분포에서 양 극단의 개체를 선별하여 중복되지 않은 표현형을 갖는 개체가 형질 파지티브와 형질 네거티브 개체군에 포함되도록 하는 단계를 포함한다. 적절하게는, 사례-대조 개체군은 표현형에서 상동한 개체군으로 구성된다. 형질 파지티브와 형질 네거티브 개체군은 각각, 연구중인 전체 개체군중 1 내지 98%, 바람직하게는 1 내지 80%, 좀더 바람직하게는 1 내지 50%, 이보다 좀더 바람직하게는 1 내지 30%, 가장 바람직하게는 1 내지 20%을 대표하는 개체의 표현형에서 상동한 개체군으로 구성되고, 선별된 개체는 중복되지 않은 표현형을 보인다. 2가지 형질 표현형간 차이가 분명할수록 이중대립인자 마커로 연관을 검출할 가능성이 높아진다. 현저하게 상이하지만 상대적으로 상동한 표현형의 선별은 연구중인 개체군의 시료 크기가 충분히 크다는 조건하에, 연과 연구에서 효율적인 비교 및 유전자 수준에서 현저한 차이의 검출을 가능하게 한다.
적절한 구체예에서, 50 내지 300명의 형질 파지티브 개체, 바람직하게는 대략 100명의 개체로 구성되는 첫 번째 군을 표현형에 따라 참여시킨다. 유사한 인원수의 대조 개체를 이런 연구에 참여시킨다.
연관 분석
본원 발명에는 또한, 유전형과 표현형간 연관을 검출하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: a) 본원 발명의 유전자형판별 방법에 따라 형질 파지티브 개체군에서 적어도 1개의 CanIon-관련된 이중대립인자 마커의 빈도를 측정하고; b) 본원 발명의 유전자형판별 방법에 따라 대조 개체군에서 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커의 빈도를 측정하고; c) 유전형과 표현형간 통계학적으로 유의한 상관관계가 존재하는 지를 측정한다. 이에 더하여, 본원 발명의 유전형과 표현형간 연관을 검출하는 방법에는 제한없이 본원 발명에 개시된 단독의 또는 조합된 방법이 포함되는데, 여기서 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A17과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A12와 A16과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 대조 개체군은 형질 네거티브 대조군, 또는 무작위 개체군일 수 있다; 선택적으로, a)와 b)의 유전자형판별 단계는 상기 개체군 각각으로부터 유래된 집합된 생물학적 시료에서 실시할 수 있다; 선택적으로, a)와 b)의 유전자형판별 단계는 상기 개체군에서 각 개체, 또는 이의 부차시료(subsample)로부터 유래된 생물학적 시료에서 개별적으로 실시한다.
후보 유전자를 보유하는 영역으로부터 유래된 이중대립인자 마커를 이용한 연관 연구를 실시하는데 일반적인 전략은 양 군에서 본원 발명의 이중대립인자 마커의 대립유전자 빈도를 측정하고 통계학적으로 비교하기 위하여 두 개체군(사례-대조 개체군)을 스캔한다.
형질과의 통계학적으로 유의한 연관이 분석된 한가지이상의 이중대립인자 마커에서 확인되면, 연관된 대립유전자가 형질을 직접적으로 유발하거나(즉, 연관된 대립유전자가 형질 유발 대립유전자이다), 또는 연관된 대립유전자가 형질 유발 대립유전자와 연쇄 불균형하다라고 추정할 수 있다. 후보 유전자 기능과 관련하여 연관된 대립유전자의 특징적인 특성은 연관된 대립유전자와 형질간 상관관계(인과 또는 연쇄 불균형)에 대한 더욱 심화된 통찰을 제공한다. 이런 증거가 후보 유전자내에서 연관된 대립유전자가 형질 유발 대립유전자가 아니고 실제 형질 유발 대립유전자와 연쇄 불균형 상태에 있음을 시사하면, 형질 유발 대립유전자는 연관된 마커의 주변을 서열분석하고 반복적인 방식으로 확인된 다형성으로 추가적인 연관 연구를 실시하여 발견할 수 있다.
일반적으로, 연관 연구는 2가지 연속 단계로 실시한다. 첫 번째 단계에서, 후보 유전자로부터 감소된 수량의 이중대립인자 마커의 빈도는 형질 파지티브와 대조 개체군에서 측정한다. 분석의 두 번째 단계에서, 일정한 형질을 주도하는 유전자 좌위의 위치는 유관한 영역으로부터 좀더 높은 밀도의 마커를 이용하여 추가로정련한다. 하지만, CanIon에서처럼 연구중인 후보 유전자의 길이가 상대적으로 짧으면, 유의한 연관을 확립하는데 단일 단계로도 충분하다.
일배체형 분석
전술한 바와 같이, 질환 대립유전자를 보유하는 크로모좀이 돌연변이 또는 이동의 결과로 개체군에서 먼저 나타나면, 변이 대립유전자는 일단의 연결된 마커: 조상 일배체형을 보유하는 크로모좀에 존재한다. 이런 일배체형은 개체군을 통하여 추적할 수 있고, 정해진 형질과의 통계학적 연관을 분석할 수 있다. 일배체형 연구라고 하는 다중-포인트 연관 연구로 단일 포인트(대립유전자) 연관 연구를 보충하면 연관 연구의 통계학적 능력이 증가한다. 따라서, 일배체형 연관 연구로 조상 보인자 일배체형의 빈도와 유형을 정의할 수 있다. 일배체형 분석은 개별 마커가 포함된 분석의 통계학적 능력을 증가시킨다는 점에서 중요하다.
일배체형 빈도 분석의 첫 번째 단계에서, 본원 발명의 동정된 이중대립인자 마커의 다양한 조합에 기초한 가능 일배체형의 빈도를 측정한다. 이후, 일배체형 빈도는 형질 파지티브와 대조 개체의 별도의 개체군에 대하여 비교한다. 통계학적으로 유의한 결과를 얻기 위하여 이런 분석이 적용되는 형질 파지티브 개체의 인원수는 일반적으로, 30 내지 300, 바람직하게는 50 내지 150이다. 동일한 고려는 본 연구에 참여한 영향을 받지 않은 개체(또는 무작위 대조)의 인원수에도 적용된다. 상기 첫 번째 분석의 결과는 사례-대조 개체군에서 일배체형 빈도를 제공하는데, 각 평가된 일배체형 빈도에서 p-값과 교차비(odd ratio)를 계산한다. 통계학적으로 유의한 연관이 확인되면, 연구중인 형질로 영향을 받는 일정한 일배체형을 보유하는 개체에 대한 비교위험도(relative risk)를 근사할 수 있다.
본원 발명의 다른 구체예에는 일배체형과 표현형간 연관을 검출하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: a) 일배체형의 빈도를 측정하기 위한 본원 발명의 방법에 따라 형질 파지티브 개체군에서 적어도 1개의 일배체형의 빈도를 측정하고; b) 일배체형의 빈도를 측정하기 위한 본원 발명의 방법에 따라 대조 개체군에서 상기 일배체형의 빈도를 측정하고; c) 일배체형과 표현형간 통계학적으로 유의한 연관이 존재하는 지를 측정한다. 이에 더하여, 본원 발명의 일배체형과 표현형간 연관을 검출하는 방법에는 제한없이 본원 발명에 개시된 단독의 또는 조합된 방법이 포함되는데, 여기서 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A1 내지 A17과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 CanIon-관련된 이중대립인자 마커는 A12와 A16과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커에서 선택된다; 선택적으로, 상기 대조 개체군은 형질 네거티브 대조군, 또는 무작위 개체군일 수 있다; 선택적으로, 상기 대조 개체군은 형질 네거티브 개체군, 또는 무작위 개체군이다. 선택적으로, 상기 방법에는 c) 단계에 앞서 형질 파지티브와 대조 개체군에서 표현형을 확인하는 단계가 추가로 포함된다.
상호작용 분석
본원 발명의 이중대립인자 마커는 다인자 상호작용에 기인하는 검출가능한형질과 연관된 이중대립인자 마커의 패턴을 확인하는 데에도 사용될 수 있다. 동일 연쇄군에 속하지 않는 좌위에서 대립유전자간 유전자 상호작용의 분석은 본원에서 밝힌 기술을 이용한 개별적인 유전자형판별을 필요로 한다. 적절한 수준의 통계학적 유의성을 갖는 선별된 일단의 이중대립인자 마커간 대립유전자 상호작용의 분석은 일배체형 분석으로 간주할 수 있다. 상호작용 분석은 첫 번째 좌위에 대한 일정한 일배체형과 관하여 사례-대조 개체군을 계층화시키고 각 부차개체군(subpopulation)에서 두 번째 좌위로 일배체형 분석을 실시하는 단계로 구성된다.
연관 연구에 이용된 통계학적 방법은 하기에 상세하게 기술한다.
연관의 존재에서 연쇄의 검사
본원 발명의 이중대립인자 마커는 TDT(전달/불균형 검사)에도 사용될 수 있다. 연쇄와 연관에 대한 TDT 검사는 개체군 계층화(stratification)의 영향을 받지 않는다. TDT는 영향을 받은 개체와 이들의 부모에 대한 데이터 또는 부모 대신에 영향을 받지 않은 근친으로부터 얻은 데이터를 필요로 한다(Spielmann S. et al., 1993; Schaid D.J. et al., 1996, Spielmann S. and Ewens W.J., 1998). 이런 통합된 검사는 개별적인 분석에 의한 가 양성 오류를 전반적으로 감소시킨다.
통계학적 방법
일반적으로, 형질과 유전형이 통계학적으로 유의한 상관관계를 보이는 지를 검사하는 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
1) 연쇄 분석에서 방법
연쇄 분석에 유용한 통계학적 방법과 컴퓨터 프로그램은 당업자에게 공지되어 있다(Terwilliger J.D. and Ott J., 1994; Ott J., 1991).
2) 개체군에서 일배체형 빈도를 측정하는 방법
전술한 바와 같이, 유전형을 스코어하는 경우에 이형접합체가 구별되지 않아 일배체형 빈도를 쉽게 추론할 수 없는 경우가 있다. 배우자 위상이 알려져 있지 않는 경우에, 일배체형 빈도는 다중좌위 유전형 데이터로부터 평가할 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 일배체형 빈도를 평가할 수 있다(Lange K., 1997; Weir, B.S., 1996). 적절하게는, 최대-공산 일배체형 빈도는 기대치-최대화(expectation-maximization)(EM) 대수(Dempster et al., 1977; Exocoffier L. and Slatkin M., 1995). 이런 과정은 배우자 위상이 알려져 있지 않은 경우에 다중-좌위 유전형 데이터로부터 일배체형 빈도의 최대-공산치를 얻기 위한 반복 과정이다. 일반적으로, 일배체형 평가는 예로써 EM-HAPLO 프로그램(Hawley M. E. et al., 19994) 또는 Arlequin 프로그램(Schneider et al., 1997)을 이용한 EM 대수를 적용하여 실시한다. EM 대수는 일반화된 반복 최대 공산 측정 방법으로, 하기에 간단하게 기술한다.
본 섹션, "개체군에서 일배체형 빈도를 측정하는 방법"에서 표현형은 미지의 일배체형 위상을 갖는 다중-좌위 유전형을 의미한다. 유전형은 공지된 일배체형 위상을 갖는 다중-좌위 유전형을 의미한다.
K마커 타입의N명의 무관한 개체의 시료를 가정한다. 관찰된 데이터는F상이한 표현형으로 분류할 수 있는 미지의 위상K-좌위 표현형이다. 또한,H가능한 일배체형을 보유한다고 가정한다(K이중대립인자 마커의 경우에, 가능 일배체형H=2 K 의 최대값을 보유한다).
C j 가능 유전형을 갖는 표현형j에서
여기서,P j 는 jth표현형의 확률이고,P(h k ,h l )는 일배체형h k 와h l 로 구성되는 ith유전형의 확률이다. 무작위 대합[즉, 하디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg Equilibrium)]하에,P(h k ,h l )는 다음과 같이 표시된다:
E-M 대수는 다음과 같은 단계로 구성된다: 먼저, 유전형 빈도는 일배체형 빈도의 일단의 초기값으로부터 추정한다. 이들 일배체형 빈도는P 1 (0),P 2 (0),P 3 (0),...,P H (0)라고 한다. 일배체형 빈도에 대한 초기값은 무작위 번호 발생기 또는 당분야에 공지된 다른 방식으로 얻을 수 있다. 최대화 단계라고 하는 두 번째 단계는 유전형 빈도에 대한 추정값을 이용하여 일배체형 빈도를 재-계산한다. 첫 번째 반복 일배체형 빈도 추정값은P 1 (1),P 2 (1),P 3 (1),...,P H (1)라고 한다. 전반적으로, sth반복에서 기대 단계는 이전 반복의 일배체형 빈도에 기초하여 각 표현형을 별개의 가능 유전형으로 정하는 확률을 계산한다:
여기서,n j 는j th표현형을 갖는 개체의 인원수이고,P(h k ,h l )( s )는 표현형j에서 유전형h k ,h i 의 확률이다. 유전자-계수(counting) 방법(Smith, Ann. Hum. Genet., 21:254-276, 1957)에 대응하는 최대화 단계에서, 일배체형 빈도는 유전형 추정값에 기초하여 재-평가한다:
여기서,δ it 는 일배체형t가l th유전형에 존재하는 발생 회수를 계산하는 지시 요소이다; it은 0, 1, 2이다.
E-M 반복은 다음의 기준에 도달하면 중단한다. 최대 공산 측정(MLE) 이론을 이용하여, 표현형j는 다항 분포(multinomial distribution)한다고 가정한다. 각 반복s에서, 우도 함수(likelihood function) L을 계산할 수 있다. 2개의 연속 반복간 로그-우도의 차이가 작은 수치, 바람직하게는 10-7이면 수렴이 달성된다.
3) 마커간 연쇄 불균형을 계산하는 방법
다양한 방법을 이용하여 임의 2개의 유전자 위치간 연쇄 불균형을 계산할 수있다. 실제로, 연쇄 불균형은 개체군으로부터 얻은 일배체형 데이터에 통계학적 연관 검사를 적용하여 측정한다.
마커 Mi에서 대립유전자(ai/bi) 및 마커 Mj에서 대립유전자(aj/bj)를 보유하는 본원 발명의 이중대립인자 마커(Mi, Mj)중 적어도 한가지를 포함하는 임의의 이중대립인자 마커쌍 사이의 연쇄 불균형은 Piazza 공식에 따라 모든 대립유전자 조합(ai,aj; ai,bj; bi,aj; bi,bj)에서 계산할 수 있다:
Δaiaj= √θ4-√(θ4+θ3)(θ4+θ2), 여기서
θ4=--= Mi에서 대립유전자 ai를 보유하지 않고 Mj에서 대립유전자 aj를 보유하지 않는 유전형의 빈도;
θ3=-+= Mi에서 대립유전자 ai를 보유하지 않고 Mj에서 대립유전자 aj를 보유하는 유전형의 빈도;
θ2=+-= Mi에서 대립유전자 ai를 보유하고 Mj에서 대립유전자 aj를 보유하지 않는 유전형의 빈도.
Weir B. S., 1996에서 밝힌 바와 같이, 델타(혼성 유전형 불균형 계수)에 대한 최대 공산치(MLE)에 따라 모든 대립유전자 조합(ai,aj; ai,bj; bi,aj; bi,bj)에서 여러 쌍의 이중대립인자 마커(Mi, Mj)간 연쇄 불균형(LD)을 계산할 수도 있다. 혼성 연쇄 불균형에 대한 MLE은 다음과 같다:
Daiaj= (2n1+ n2+ n3+ n4/2)/N-2(pr(ai). pr(aj))
여기서, n1은 Σ표현형(ai/ai, aj/aj), n2는 Σ표현형(ai/ai, aj/bj), n3은 Σ표현형(ai/bi, aj/aj), n4는 Σ표현형(ai/bi, aj/bj), N은 시료에서 개체의 인원수이다.
이 공식으로, 단지 유전형 데이터만 가용하고 일배체형 데이터가 가용하지 않은 경우에 대립유전자간 연쇄 불균형을 평가할 수 있다.
마커간 연쇄 불균형을 계산하는 다른 수단은 다음과 같다. 한 쌍의 이중대립인자 마커,Mi(a i /b i ) 및M j (a j /b j )에 대하여 Hardy-Weinberg 평형을 적합시켜, 전술한 방식에 따라 일정한 개체군에서 4가지 가능 일배체형 빈도를 평가할 수 있다.
배우자 불균형의 추정치는 다음과 같다:
Daiaj= pr(일배체형(a i ,a j ))- pr(a i ).pr(a j ).
여기서, pr(a i )은 대립유전자a i 의 확률이고 pr(a j )은 대립유전자a j 의 확률이며, pr(a i ).pr(a j )은 상기 방정식 3에서와 같이 추정한다.
한 쌍의 이중대립인자 마커에서는Mi와M j 간 연관을 설명하는 한가지 불균형 측도(measure of disequilibrium)만 필요하다.
이후, 이의 표준화된 값은 다음과 같이 계산하다:
다른 연쇄 불균형 계산 방법을 이용할 수도 있다.
적절한 예상 이형접합률(heterozygosity rate)을 갖는 일단의 이중대립인자 마커간 연쇄 불균형은 50 내지 1000명, 바람직하게는 75 내지 200명, 좀더 바람직하게는 대략 100명의 무관한 개체를 유전자형판별하여 측정할 수 있다.
4) 연관 검사
이중대립인자 마커에서 대립유전자 또는 이런 대립유전자로 구성되는 일배체형에서 표현형과 유전자간 상관관계의 통계학적 유의성을 측정하는 방법은 당분야에 공지되고 통계학적 유의성의 용인된 경계값이 요구되는 임의의 통계학적 검증으로 달성할 수 있다. 특정 방법 및 유의 경계값의 이용은 당업자에게 공지된 것이다.
연관 검사는 사례와 대조 개체군에서 이중대립인자 마커 대립유전자의 빈도를 측정하고, 통계학적 검증으로 이들 빈도를 비교하여 이들이 형질 및 연구중인 이중대립인자 마커 대립유전자간 상관관계를 암시하는 빈도의 통계학적으로 유의한 차이인 지를 확인하는 단계로 구성된다. 유사하게, 일배체형 분석은 사례와 대조 개체군에서 일정한 일단의 이중대립인자 마커에 대한 모든 가능 일배체형의 빈도를 측정하고, 통계학적 검증으로 이들 빈도를 비교하여 이들이 일배체형 및 연구중인 표현형(형질)간 통계학적으로 유의한 상관관계가 존재하는 지를 확인하는 단계로 구성된다. 유전형과 표현형간 통계학적으로 유의한 상관간계를 검증하는데 유용한 임의의 통계학적 도구를 이용할 수 있다. 적절하게는, 이용된 통계학적 검증은 1 자유도(degree of freedom)를 갖는 카이제곱검증(chi-square test)이다. P-값이 계산된다(P-값은 관찰값 이상의 통계치가 우연히 발생하는 확률이다).
통계학적 유의성
추가적인 진단 검사를 위한 파지티브 기초 또는 조기 예방 요법을 위한 예비 출발점으로서 진단 목적을 위한 유의성의 적절한 구체예에서, 이중대립인자 마커 연관과 관련된 p 값은 단일 이중대립인자 마커 분석에서 바람직하게는 1 x10-2이하, 좀더 바람직하게는 1 x10-4이하이고, 2개이상의 마커를 포함하는 일배체형 분석에서 1 x10-3이하, 바람직하게는 1 x10-6이하이다. 이들 값은 단일 또는 다중 마커 조합을 포함하는 임의의 연관 연구에 적용가능하다.
당업자는 본원 발명의 이중대립인자 마커로 연관 연구를 실시하기 위한 출발점으로 전술한 범위의 값을 이용할 수 있다. 이렇게 함으로써 본원 발명의 이중대립인자 마커 및 형질간 유의한 상관관계가 확인될 수 있는데, 이는 진단 및 약물 스크리닝 목적에 이용될 수 있다.
표현형 교환(permutation)
전술한 1단계 일배체형 분석의 통계학적 유의성을 검정하기 위하여, 추가적인 분석을 실시하는 것이 바람직한데, 여기서 사례-대조 개체로부터 얻은 유전자형판별 데이터는 수집되고 형질 표현형에 대하여 무작위화된다. 각 개체 유전자형판별 데이터는 사례-대조 개체군과 동일한 인원수의 두 군에 무작위로 할당하여, 1단계에서 얻은 데이터를 편집한다. 2단계 일배체형 분석은 가급적, 최대 비교위험도 계수를 보인 1단계 분석의 일배체형에 포함된 마커에 대하여 이들 인위적 군에서 실시한다. 적절하게는, 이 실험은 적어도 100 내지 10000회 반복한다. 이런 반복은 검사된 일배체형을 우연히 얻을 확률의 측정을 가능하게 한다.
통계학적 연관의 평가
가 양성 문제를 해결하기 위하여, 무작위 게놈 영역에서 동일한 사례-대조 개체군으로 유사한 분석을 실시할 수 있다. 무작위 영역과 후보 영역에서 결과는 미국 분할 출원 "Methods, software and apparati for identifying genomic regions harboring a gene associated with a dectable trait"(60/107,986; 1998.11.10일 출원)에서 기술한 바와 같이 비교한다.
5) 위험 인자의 평가
위험 인자(유전독성학에서 위험 인자는 마커 좌위에서 특정 대립유전자 또는 일배체형의 존부이다)와 질환간 연관은 교차비(odds ratio) 및 비교위험도(RR)로 측정한다. P(R+)가 R과 질환이 발병할 확률이고 P(R-)가 위험 인자가 없는 개체에서 확률이면, 비교위험도는 이들 2가지 확률의 비율이다:
RR= P(R+)/P(R-)
사례-대조 연구에서, 비교위험도의 직접적인 측도(measure)는 샘플링 디자인으로 인하여 얻을 수 없다. 하지만, 교차비는 낮은-발병률 질환에 대한 비교위험도의 효과적인 근사를 가능하게 하는데, 다음과 같이 계산할 수 있다:
F+는 사례에서 위험 인자에 대한 노출 빈도이고, F-는 대조에서 위험 인자에대한 노출 빈도이다. F+와 F-는 본 연구의 대립유전자 또는 일배체형 빈도를 이용하여 계산하고, 기초적인 유전 모델(우성, 열성, 부가...)에 추가적으로 의존한다.
개체군에서 일정한 위험 인자로 인한 형질을 보이는 개체의 비율을 의미하는 기여위험도(AR)를 평가할 수 있다. 이런 측정은 질환 병리 및 위험 인자의 공중 보건 영향의 측면에서 특정 인자의 역할을 정량하는데 중요하다. 이런 측정의 공중 보건 상관(relevance)은 노출이 없는 경우에 예방될 수 있는 개체군의 질환 사례의 비율을 평가하는데 있다. AR은 다음과 같이 측정한다:
AR= PE(RR-1)/(PE(PR-1)+1)
AR은 이중대립인자 마커 대립유전자 또는 이중대립인자 마커 일배체형에 대한 기여위험도이다. PE는 전체 개체군에서 대립유전자 또는 일배체형에 대한 노출 빈도이다; RR은 연구중인 형질이 전체 개체군에서 상대적으로 낮은 발병률을 갖는 경우에 교차비에 근사하는 비교위험도이다.
본원 발명의 이중대립인자 마커로 연쇄 불균형인 이중대립인자 마커의 동정
첫 번째 이중대립인자 마커가 관심있는 게놈 영역에서 동정되면, 당업자는 본원 발명의 기술적 사상을 이용하여 첫 번째 마커와 연쇄 불균형인 다른 이중대립인자 마커를 용이하게 동정할 수 있다. 전술한 바와 같이, 첫 번째 마커와 연쇄 불균형인 임의의 마커는 형질과 연관하게 된다. 따라서, 연관이 일정한 이중대립인자 마커와 형질간에 입증되면, 상기 특정 영역에서 이중대립인자 마커의 밀도를 증가시키기 위하여 이런 형질과 연관된 추가적인 이중대립인자 마커의 발견이 많은관심을 받는다. 인과 유전자 또는 돌연변이가 형질과 최대 상관관계를 보이는 마커 일단의 마커의 주변에서 발견된다.
일정한 마커와 연쇄 불균형인 추가적인 마커의 동정은 다음의 단계로 구성된다: (a) 복수의 개체로부터 첫 번째 이중대립인자 마커를 포함하는 게놈 단편을 증폭하고; (b) 첫 번째 이중대립인자 마커를 보유하는 게놈 영역에서 두 번째 이중대립인자 마커를 동정하고; (c) 첫 번째 이중대립인자 마커와 두 번째 이중대립인자 마커간 연쇄 불균형 분석을 실시하고; (d) 첫 번째 마커와 연쇄 불균형인 두 번째 이중대립인자 마커를 선별한다. (b)와 (c) 단계로 구성되는 부차조합 역시 정관한다.
이중대립인자 마커를 동정하고 연쇄 불균형 분석을 실시하는 방법은 본원에 기술되어 있어 당업자가 과도한 실험없이 실시할 수 있다. 본원 발명은 또한, 이중대립인자 마커 A1 내지 A18과 연쇄 불균형이고 일정한 형질과의 개별 연관의 측면에서 유사한 특성을 나타낼 것으로 예상되는 이중대립인자 마커에 관한다.
기능적 돌연변이의 동정
검출가능한 표현형 또는 형질을 주도하는 CanIon 유전자에서 돌연변이는 형질 파지티브와 대조 개체로부터 CanIon 유전자의 서열을 비교하여 동정할 수 있다. 파지티브 연관이 본원 발명의 이중대립인자 마커로 확인되면, 동정된 좌위는 돌연변이를 스캔할 수 있다. 적절한 구체예에서, CanIon 유전자의 엑손과 절단접합 부위와 같은 기능 영역, 프로모터 및 다른 조절 영역은 돌연변이를 스캔한다. 적절한 구체예에서, CanIon 유전자의 서열은 형질 파지티브와 대조 개체에서 비교한다.적절하게는, 형질 파지티브 개체는 형질과 연관된 것으로 보이는 일배체형을 보유하고, 형질 네거티브 개체는 형질과 연돤된 일배체형 또는 대립유전자를 보유하지 않는다. 검출가능한 형질 또는 표현형에 변형된 CanIon 기능의 다양한 발현(manifestation)이 포함된다.
돌연변이 검출 과정은 이중대립인자 마커 동정에 사용되는 것과 유사하다. 이런 돌연변이를 검출하는데 이용되는 방법은 일반적으로, 다음의 단계로 구성된다:
- 형질 파지티브 환자와 형질 네거티브 대조의 DNA 시료로부터 형질과 연관된 이중대립인자 마커 또는 이중대립인자 마커군을 포함하는 CanIon 유전자 영역의 증폭;
- 증폭된 영역의 염기서열분석;
- 형질 파지티브와 대조 개체로부터 DNA 서열의 비교;
- 형질-파지티브 환자에 특이적인 돌연변이의 확인
한 구체예에서, 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18 및 이의 보체에서 선택된다. 이후, 후보 다형성은 본원에서 밝힌 유전자형판별 과정, 바람직하게는 개별 검사 포맷에서 마이크로염기서열분석 기술로 사례와 대조의 대규모 개체군을 스크린하여 검증한다. 다형성은 사례와 대조에서 예상된 연관 결과와 일치하는 빈도로 존재하면 후보 돌연변이로 간주된다. 다형성은 검출가능한 표현형과 통계학적으로 유의한 상관관계를 보이면 후보 "형질-유발" 돌연변이로 간주된다.
유전자 진단의 방법에서 본원 발명의 이중대립인자 마커
본원 발명의 CanIon 핵산 서열과 이중대립인자는 특정 유전형의 결과로 검출가능한 형질을 발현하는 개체, 또는 유전형으로 인해 이후의 삶에서 검출가능한 형질이 발생할 위험이 높은 개체를 동정할 수 있는 진단 검사를 개발하는 데에도 사용될 수 있다. 이런 진단은 정신분열증, 양극성 장애, 다른 CNS 질환(예, 간질), 통증 질환, 심혈관 질환(예, 심장 질환, 고혈압, 부정맥) 및 다른 질환과 이상을 비롯한 다양한 질환이나 이상의 시기결정(staging), 모니터링, 예측 및/또는 예방이나 치료 요법에 사용될 수 있다.
본원 발명의 진단 기술에는 일배체형판별을 위한 개별 크로모좀의 분석이 가능한 방법, 예를 들면 가족 연구, 단순 정자 DNA 분석 또는 체세포 하이브리드를 비롯하여, 검체가 검출가능한 형질이 발현할 위험의 증가와 연관된 이중대립인자 마커 패턴을 보유하는지 또는 개체가 특정 돌연변이의 결과로 검출가능한 형질로 고생하는지를 확인하기 위한 다양한 방법을 이용할 수 있다.
본원 발명은 개체가 발병할 위험이 있는지 또는 CanIon 유전자에서 돌연변이나 다형성으로 인해 질환에 걸릴 지를 확인하는 진단 방법을 제공한다. 본원 발명은 또한, 개체가 정신분열증과 양극성 장애, 또는 당분야에 공지되거나 본원에서 밝힌 칼슘-채널 관련된 이상에 감수성을 보유하는지를 확인하는 방법을 제공한다.
이들 방법에는 개체로부터 핵산 시료를 수득하고, 상기 핵산 시료가 한 개이상의 대립유전자 또는 한 개이상의 이중대립인자 마커 일배체형을 보유하는 지를 확인 단계가 포함되는데, 이들의 존재는 형질의 발현 위험을 시사하거나 또는 개체가 특정 CanIon 다형성이나 돌연변이를 보유하는 결과로서 형질을 발현한다는 것을시사한다(형질-유발 대립유전자).
적절하게는, 이런 진단 방법에서 핵산 시료는 개체로부터 수득되고, 상기 시료는 "이중대립인자 마커에 대하여 DNA 시료를 유전자형판별하는 방법"에서 전술한 방법으로 유전자형판별한다. 진단은 단일 이중대립인자 마커 또는 이중대립인자 마커군에 기초한다.
이들 방법에서, 핵산 시료는 검체로부터 수득하고, 이중대립인자 마커 A1 내지 A18중 적어도 한가지의 이중대립인자 마커 패턴을 확인한다.
한 구체예에서, PCR 증폭은 검출가능한 표현형과 연관된 다형성이 동정된 영역을 증폭하기 위하여 핵산 시료에서 실시한다. 증폭 산물은 염기서열분석하여 개체가 검출가능한 표현형과 연관된 하나 또는 복수의 CanIon 다형성을 보유하는지를 확인한다. 증폭 산물을 만들기 위하여 사용된 프라이머에는 표 1에 기재된 프라이머가 포함된다. 대안으로, 핵산 시료는 전술한 마이크로염기서열분석 반응을 실시하여 개체가 CanIon 유전자에서 돌연변이나 다형성으로 기인한 검출가능한 표현형과 연관된 한 개이상의 CanIon 다형성을 보유하는지를 확인한다. 마이크로염기서열분석 반응에 사용된 프라이머는 표 4에 기재된 프라이머가 포함된다. 다른 구체예에서, 핵산 시료는 검출가능한 표현형과 연관된 한 개이상의 CanIon 대립유전자에 특이적으로 혼성화되는 하나 또는 복수의 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시킨다. 혼성화 분석에 사용되는 프로브에는 표 3에 기재된 프라이머가 포함된다. 다른 구체예에서, 핵산 시료는 증폭 반응에서 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드와 함께 사용되는 경우에 증폭 산물을 생산할 수 있는 두 번째 CanIon 올리고뉴클레오티드와 접촉시킨다. 증폭 반응에서 증폭 산물의 존재는 개체가 검출가능한 표현형과 연관된 한 개이상의 CanIon 대립유전자를 보유한다는 것을 암시한다.
적절한 구체예에서, A1 내지 A18 및 이의 보체에서 선택되는 한 개이상의 이중대립인자 마커에 존재하는 뉴클레오티드의 실체를 확인하는데, 검출가능한 형질은 정신분열증과 양극성 장애이다. 진단 키트는 본원 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
이들 진단 방법은 특정 환경에서 예방 치료를 시작하거나 또는 유의한 일배체형을 보유하는 개체가 경미한 증상과 같은 경고 신호를 인지할 수 있도록 하는데 이용될 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
약물에 대한 반응 또는 약물에 대한 부작용을 분석과 예측하는 진단은 특정 약물로 개체를 치료할 것인가를 결정하는데 이용될 수 있다. 가령, 진단에서 개체가 특정 약물 치료에 긍정적으로 반응할 가능성이 있는 것으로 나타나면, 이 약물은 개체에 투여될 수 있다. 반대로, 진단에서 개체가 특정 약물 치료에 부정적으로 반응할 가능성이 있는 것으로 나타나면, 다른 치료 과정을 처방할 수 있다. 부정적인 반응은 유익한 반응의 부재 또는 독성 부작용의 존재로 정의할 수 있다.
본원 발명의 마커는 임상적 약물 실험에도 이용될 수 있다. 정신분열증, 양극성 장애 또는 다른 칼슘-채널 관련된 이상을 억제하는 작용제에 반응, 또는 정신분열증, 양극성 장애 또는 다른 칼슘-채널 관련된 이상을 억제하는 작용제에 부작용을 암시하는 한 개이상의 마커는 전술한 방법으로 동정할 수 있다. 이후, 이런작용제의 임상적 실험에 잠재적 참여자를 스크린하여, 약물에 긍정적으로 반응할 가능성이 가장 높은 개체를 확인하고 부작용을 보일 가능성이 높은 개체는 배제시킨다. 이런 방식으로, 연구중에 긍정적으로 반응할 가능성이 낮은 개체의 참여로 인한 측정의 저하없이 또는 원치않는 안전 문제의 위험없이, 약물에 긍정적으로 반응하는 개체에서 치료의 유효성을 측정할 수 있다.
특히 적절한 구체예에서, 이런 진단으로 분석되는 형질은 정신분열증 또는 양극성 장애이다. 하지만, 본원 발명에는 관련된 질환, 특히 관련된 CNS 질환을 예방, 진단, 관리, 치료하는 방법에서 본원 발명의 이중대립인자 마커를 이용한 예방, 진단, 예측, 치료 방법이 포함된다. 예로써, 관련된 질환에는 정신 질환, 기분 장애, 자폐증, 약물 의존과 알코올 중독, 통증 질환, 간질, 정신 지체 및 인식 장애, 정신 장애, 불안 장애, 섭식 장애, 충동 조절 장애, 인격 장애를 비롯한 다른 정신 질환이 포함된다. 질환은 Diagnosis Statistical Manual of Mental Disorder fourth edition(DSM-Ⅳ) 분류에 따라 정의할 수 있다. 다른 질환에는 심혈관 질환, 예를 들면 협심증, 고혈압 또는 부정맥이 포함된다.
재조합 벡터
"벡터"는 환형 또는 선형 DNA 또는 RNA 분자를 의미하는데, 이는 이중-가닥 또는 단일 가닥이고 세포 숙주 또는 단세포나 다세포 숙주 미생물로 전달되는 적어도 한 개의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원 발명에는 CanIon 게놈 서열로부터 유래된 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 CanIon 게놈 서열이나 cDNA 서열로부터 유래된 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 군이 포함된다.
일반적으로, 본원 발명의 재조합 벡터는 조절 서열, 코딩 서열, 폴리뉴클레오티드 구조체, 전술한 CanIon 프라이머나 프로브를 비롯한 본원 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 좀더 구체적으로, 본원 발명의 재조합 벡터는 "CanIon 유전자의 게놈 서열" 섹션, "CanIon cDNA 서열" 섹션, "코딩 영역" 섹션, "폴리뉴클레오티드 구조체" 섹션, "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머" 섹션에서 밝힌 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
적절한 첫 번째 구체예에서, 본원 발명의 재조합 벡터는 적합한 숙주 세포에서 SEQ ID No 1 내지 3 또는 6의 CanIon 게놈 서열이나 CanIon cDNA, 예를 들면 SEQ ID No 4의 cDNA로부터 유래된 삽입된 폴리뉴클레오티드를 증폭하는데 사용되고, 상기 폴리뉴클레오티드는 재조합 벡터가 복제할 때마다 증폭된다.
적절한 두 번째 구체예에서, 본원 발명에 따른 재조합 벡터는 본원 발명의 조절 폴리뉴클레오티드나 코딩 핵산, 또는 둘 모두를 포함하는 발현 벡터로 구성된다. 특정 구체예에서, 발현 벡터는 CanIon 폴리펩티드를 발현하는데 사용되는데, 이후 상기 폴리펩티드는 정제하고 리간드 스크리닝 분석에 또는 CanIon 단백질에 대한 항체를 조성하기 위한 면역원으로 사용할 수 있다. 다른 구체예에서, 발현 벡터는 유전자도입 동물의 생성 및 유전자 요법에 사용된다. 발현은 적절한 신호가 벡터에 제공되어야 가능한데, 상기 신호에는 다양한 조절 요소, 예를 들면 숙주 세포의 유전자의 발현을 유도하는 바이러스와 포유동물로부터 유래된 인헨서/프로모터가 포함된다. 산물을 발현하는 영구적이고 안정적인 세포 클론을 확립하기 위한 가장 우세한 약물 선별 마커는 본원 발명의 발현 벡터에 포함되는데, 그 이유는 이들이 약물 선별 마커의 발현을 폴리펩티드의 발현과 연계시키는 요소이기 때문이다.
좀더 구체적으로, 본원 발명은 CanIon 단백질, 바람직하게는 SEQ ID No 5 아미노산 서열의 CanIon 단백질, 이의 변이체 또는 단편을 인코드하는 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한다.
또한, 본원 발명은 CanIon 코딩 서열의 발현에 유용한 재조합 발현 벡터에 관하는데, 여기서 상기 벡터는 SEQ ID No 4 핵산을 포함한다.
CanIon-관련된 이중대립인자 마커를 보유하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터 역시 본원 발명에 속한다. 적절한 구체예에서, 상기 이중대립인자 마커는 A1 내지 A18과 이의 보체, 또는 선택적으로 이와 연쇄 불균형의 이중대립인자 마커에서 선택된다.
본원 발명의 벡터에서 발견할 수 있는 요소중 일부는 하기 섹션에 좀더 상세하게 설명한다
또한, 본원 발명은 a) 표적 유전자의 내인성 크로모좀 DNA로 외인성(이질성) 폴리뉴클레오티드 삽입, b) 내인성 크로모좀 DNA 결실, 및/또는 c) 내인성 크로모좀 DNA의 외인성 폴리뉴클레오티드로의 치환된 척추동물 기원, 바람직하게는 포유동물 기원, 특히 사람 기원의 일차, 이차, 영속화된 상동성 재조합된 숙주 세포에 관한다. 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입, 결실 또는 치환은 표적 유전자의 코딩 서열 및/또는 조절 영역, 예를 들면 표적 유전자와 동작가능하게 연결된 프로모터와인헨서 서열에서 발생할 수 있다.
또한, 본원 발명은 시험관내 또는 생체내에서 상동성 재조합된 숙주 세포를 만드는 방법에 관하는데, 여기서 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 표적 유전자의 발현이 변화된다. 적절하게는, 이런 변형은 정상 성장 조건 또는 표적 유전자에 의해 인코드되는 폴리펩티드를 생산하는데 적합한 조건하에 표적 유전자의 발현을 유도한다. 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다: (a) 시험관내 또는 생체내에서 세포를 폴리뉴클레오티드 구조체로 트랜스펙션시키고, 상기 폴리뉴클레오티드 구조체는 (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열 및/또는 코딩 서열; (iii) 필요한 경우 트랜스펙션된 세포를 생산하기 위한 비대합된 스플라이스 공여자 부위로 구성되고; (b) 시험관내 또는 생체내에서 트랜스펙션된 세포를 상동성 재조합에 적합한 조건하에 유지시킨다.
또한, 본원 발명은 시험관내 또는 생체내 세포에서 표적 유전자의 발현을 변화시키는 방법에 관하는데, 여기서 상기 유전자는 세포에서 정상적으로 발현되지 않고, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: (a) 시험관내 또는 생체내에서 세포를 폴리뉴클레오티드 구조체로 트랜스펙션시키고, 상기 폴리뉴클레오티드 구조체는 (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열 및/또는 코딩 서열; (iii) 필요한 경우 트랜스펙션된 세포를 생산하기 위한 비대합된 스플라이스 공여자 부위로 구성되고; (b) 시험관내 또는 생체내에서 트랜스펙션된 세포를 유전자 발현에 적합한 조건하에 유지시킨다.
또한, 본원 발명은 시험관내 또는 생체내 세포에서 표적화된 내인성 유전자의 발현을 변화시켜 본원 발명에 따른 폴리펩티드를 만드는 방법에 관하는데, 여기서 상기 유전자는 세포에서 정상적으로 발현되지 않고, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: (a) 시험관내에서 세포를 폴리뉴클레오티드 구조체로 트랜스펙션시키고, 상기 폴리뉴클레오티드 구조체는 (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열 및/또는 코딩 서열; (iii) 필요한 경우 트랜스펙션된 세포를 생산하기 위한 비대합된 스플라이스 공여자 부위로 구성되고; (b) 시험관내 또는 생체내에서 트랜스펙션된 세포를 상동성 재조합에 적합한 조건하에 유지시켜 상동성 재조합된 세포를 만들고; c) 시험관내 또는 생체내에서 트랜스펙션된 세포를 유전자 발현에 적합한 조건하에 유지시켜 폴리펩티드를 생산한다.
또한, 본원 발명은 세포에서 표적화된 유전자의 발현을 변화시키는 폴리뉴클레오티드 구조체에 관하는데, 여기서 상기 유전자는 정상적으로 발현되지 않는다. 이는 폴리뉴클레오티드 구조체가 표적 세포의 크로모좀 DNA에 삽입되는 경우에 발생하는데, 여기서 폴리뉴클레오티드 구조체는 다음과 같이 구성된다: (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열 및/또는 코딩 서열; (iii) 필요한 경우, 비대합된 스플라이스-공여자 부위. 본원 발명에는 전술한 폴리뉴클레오티드 구조체도 포함되는데, 여기서 상기 구조체는 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고 크로모좀 DNA와 상동성 재조합이후 표적화된 내인성 유전자와 쌍을 이룬다.
조성물은 당분야에 공지된 방법과 기술로 생산할 수 있다(미국 특허 출원 6,054,288; 6,048,729; 6,048,724; 6,048,524; 5,994,127; 5,968,502; 5,965,125; 5,869,239; 5,817,789; 5,783,385; 5,733,761; 5,641,670; 5,580,734; PCT 출원 WO96/29411, WO 94/12650; 과학 논문 Koller et al. Proc, 1994, Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989)).
1. 본원 발명에 다른 발현 벡터의 전반적인 특징
본원 발명에 따른 재조합 벡터는 YAC(이스트 인공 크로모좀), BAC(박테리아 인공 크로모좀), 파지, 파게미드, 코스미드, 플라스미드, 또는 크로모좀, 비-크로모좀, 반-합성, 합성 DNA를 포함할 수 있는 선형 DNA 분자 등으로 구성된다.
이런 재조합 벡터는 다음과 같은 어셈블리를 포함하는 전사 단위를 포함할 수 있다:
(1) 유전자 발현에서 조절 역할을 하는 유전 요소, 예를 들면 프로모터 또는 인헨서. 인헨서는 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는 10 내지 300bp 정도의 DNA을 포함하는 cis-작용 요소이다.
(2) mRNA로 전사되고 최종적으로 폴리펩티드로 번역되는 구조 또는 코딩 서열, 상기 구조 또는 코딩 서열은 (1)에서 밝힌 조절 요소에 동작가능하게 연결된다.
(3) 적절한 전사 개시와 종결 서열. 이스트 또는 진핵 발현 시스템에 사용되는 구조 단위에는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질의 세포외 배출을 가능하게 하는 리더 서열이 포함된다. 대안으로, 재조합 단백질이 리더 또는 전달 서열없이 발현되는 경우에는 N-말단 잔기가 포함될 수 있다. 이런 잔기는 최종 산물을 제공하기 위하여 발현된 재조합 단백질로부터 후속으로 절단될 수도 또는 절단되지 않을 수도 있다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터에는 복제 기점, 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 선별 마커, 하류 구조 서열의 전사를 유도하기 위한 고도로 발현된 유전자로부터 유래된 프로모터가 포함된다. 이질성 구조 서열은 적절한 단계에서 번역 개시와 종결 서열 및 번역된 단백질의 표층공간(periplasmic space)이나 세포외 매체로의 배출을 유도할 수 있는 리더 서열로 조합된다. 벡터가 포유동물 숙주 세포에서 원하는 서열을 트랜스펙션시키고 발현하는 특정 구체예에서, 바람직한 벡터는 원하는 숙주에서 복제 기점, 적합한 프로모터, 인헨서, 임의의 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 신호, 스플라이스 공여자와 수용자 부위, 전사 종결 서열, 5'-측부 비-전사 서열을 포함한다. SV40 바이러스 게놈으로부터 유래된 DNA 서열, 예를 들면 SV40 기점, 초기 프로모터, 인헨서, 스플라이스, 폴리아데닐화 신호는 비-전사된 유전 요소를 제공하는데 사용될 수 있다.
SEQ ID No 5의 CanIon 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체의 생체내 발현은 숙주 미생물에서 고유 유전자의 발현 또는 생물학적 불활성 CanIon 단백질의 생산과 관련된 유전적 결함을 수정하는데 유용할 수 있다.
따라서, 본원 발명은 치료할 환자에 적절한 유전 물질을 도입하여 SEQ ID No 2의 CanIon 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체의 생체내 생산을 위해 설계된 재조합 발현 벡터에 관한다. 상기 유전 물질은 환자로부터 사전에 추출된 세포에 시험관내에서 도입할 수 있는데, 이후 변형된 세포는 환자의 적합한 조직에 직접 생체내 재도입할 수 있다.
2. 조절 요소
프로모터
본원 발명에 따른 발현 벡터에 사용하는데 적합한 프로모터 영역은 이질성 유전자가 발현되는 세포 숙주를 고려하여 선택한다. 관심있는 핵산 서열의 발현을 조절하는데 사용되는 프로모터는 표적 세포에서 핵산의 발현을 유도할 수만 있다면, 큰 의미를 갖지 않는다. 따라서, 사람 세포를 표적하는 경우에는 사람 세포에서 발현될 수 있는 프로모터, 예를 들면 사람이나 바이러스 프로모터에 인접하여 또는 상기 프로모터하에 핵산 코딩 영역을 위치시키는 것이 바람직하다.
적합한 프로모터는 발현을 조절할 핵산에 대하여 이질성이거나 또는 대안으로 발현되는 코딩 서열을 포함하는 고유 폴리뉴클레오티드에 대하여 내인성일 수 있다. 이에 더하여, 프로모터는 구조 프로모터/코딩 서열이 삽입되는 재조합 벡터 서열에 대하여 이질성이다.
프로모터 영역은 예로써 CAT(클로람페니콜 전이효소) 벡터, 바람직하게는 pKK232-8과 pCM7 벡터를 이용하여 임의의 원하는 유전자로부터 선택할 수 있다.
바람직한 박테리아 프로모터는 LacI, LacZ, T3이나 T7 박테리아파지 RNA 중합효소 프로모터, gpt, 람다 PR, PL, trp 프로모터(EP 0036776), 폴리헤드린 프로모터, 바쿨로바이러스로부터 유래된 p10 단백질 프로모터(Kit Novagen)(Smith et al., 1983; O'Reilly et al., 1992), 람다 PR 프로모터 또는 trc 프로모터이다.
진핵 프로모터에는 극초기 CMV, HSV 티미딘 키나아제, 초기와 후기 SV40, 레트로바이러스로부터 유래된 LTR, 생쥐 메탈로티오네인-L이 포함된다. 간편한 벡터와 프로모터의 선택은 당업자에게 자명하다.
프로모터의 선택은 유전공학 분야의 당업자에게 자명하다. 가령, Sambrook et al.(1989) 또는 Fuller et al.(1996)에서 밝힌 과정을 참조한다.
다른 조절 요소
cDNA 삽입체를 이용하는 경우에는, 유전자 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 달성하기 위하여 폴라아데닐화 신호를 포함시키는 것이 바람직하다. 폴리아데닐화 신호의 특성은 본원 발명의 성공적인 실행에 중요한 의미를 갖지 않고, 임의의 서열, 예를 들면 사람 성장 호르몬과 SV40 폴리아데닐화 신호를 사용할 수 있다. 종결자 역시 발현 카세트의 요소로 고려된다. 이들 요소는 메시지 수준을 강화시키고 카세트로부터 다른 서열로의 통독을 최소화시키는 역할을 한다.
3. 선별성 마커
이런 마커는 세포에 확인가능한 변화를 전달하여 발현 구조체를 포함하는 세포의 조기 동정을 가능하게 한다. 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 선별가능한 마커 유전자는 바람직하게는, 진핵 세포 배양액에서 다이하이드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 저항성; 맥주 효모균(S. cerevisiae)에서 TRP1; 대장균(E. coli)에서 테트라사이클린, 리팜프신 또는 앰피실린 저항성 또는 마이코박테리아(mycobacteria)에서 대한 레반 사카라제인데, 상기 후자 마커는 음성 선별 마커이다.
4. 선호되는 벡터
박테리아 벡터
박테리아에 사용되는데 유용한 발현 벡터는 선별가능한 마커 및 pBR322(ATCC37017) 유전 요소를 보유하는 상업적으로 가용한 플라스미드로부터 유래된 박테리아 복제 기점을 포함할 수 있다. 이런 상업적 벡터에는 예로써 pKK223-2(Pharmacia, Uppsala, Sweden)과 GEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)이 포함된다.
다수의 다른 적합한 벡터가 당분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 다음과 같은 박테리아 벡터가 상업적으로 가용하다: pQE70, pQE60, pQE-9(Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174 pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A(Stratagene); ptrc99a pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene); pSVK3 pBPV, pMSG, pSVL(Pharmacia); pQE-30(QIAexpress).
박테리아파지 벡터
P1 박테리아파지 벡터는 80 내지 100kb의 많은 삽입체를 포함할 수 있다.
P1 박테리아파지 벡터, 예를 들면 p158 또는 p158/neo8의 작제는 Stemberg(1992, 1994)에서 기술한다. CanIon 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 P1 클론은 40kb이상의 폴리뉴클레오티드를 삽입하는데 고려할 수 있다(Linton et al., 1993). 유전자도입 실험을 위한 P1 DNA를 만드는데 적합한 프로토콜은 McCormick et al.(1994)에서 기술한다. 간단히 말하면, P1 플라스미드를 보유하는 대장균(E. coli)(바람직하게는, NS3529)은 25㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 액체 배지에서 하룻밤동안 배양한다. P1 DNA는 Qiagen Plasmid Maxi kit(Qiagen, Chatsworth, CA USA)를 이용한 알칼리성 세포용해로 대장균(E. coli)으로부터 준비한다. P1 DNA는 2개의 Qiagen-tip 500 칼럼에서 키트에 포함된 세척과 용출 완충액을 이용하여 박테리아 용해질로부터 정제한다. 이후, 페놀/클로로포름 추출을 실시하고, 후속으로 70% 에탄올로 DNA를 침전시킨다. TE(10 mM Tris-HCL, pH 7.4, 1mM EDTA)에 DNA를 용해시킨 이후, DNA의 농도는 분광광도법으로 평가한다.
유전자도입 동물, 전형적으로 유전자도입 생쥐에서 CanIon 뉴클레오티드 서열을 보유하는 P1 클론을 발현시키는 경우에는 예로써 P1 폴리링커(SfiI, NotI 또는 SalI)내 빈도가 낮은 절단 부위에서 P1 DNA를 절단하여 P1 DNA 단편으로부터 벡터 서열을 제거하는 것이 바람직하다. 이후, P1 삽입체는 YAC로부터 DNA의 분리에서 적용된 방법(Schedl et al. 1993a; Peterson et al., 1993)으로 펄스-필드 아가로즈 겔에서 벡터 서열로부터 정제한다. 필요한 경우에, 정제된 삽입체 DNA는 Millipore Ultrafree-MC Filter Unit(Millipore Bedford, MA USA-30,000 분자량 한계)에서 농축하고, 후속으로 마이크로투석 막(type VS, 0.025 ㎛, Millipore)에서 100mM NaCl, 30μM 스페르민, 70μM 스프레미딘을 함유하는 마이크로주사 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.4, 250㎛ EDTA)에 투석한다. 정제된 P1 DNA 삽입체의 보존도(intactness)는 1% 아가로즈(Sea Kem GTG: FMC Bio-products) 펄스-필드 겔에서 전기영동 및 브롬화에티듐 염색으로 평가한다.
바쿨로바이러스 벡터
SEQ ID No 5의 CanIon 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체에 적합한 벡터는 곤충 세포와 곤충 세포주에서 증식할 수 있는 바쿨로바이러스 벡터이다. 특히 적합한 숙주 벡터 시스템은 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터 유래된 SF9 세포주(ATCC N°CRL 1711)를 트랜스펙션시키는데 사용되는 pVL1392/1393 바쿨로바이러스 전달 벡터(Pharmingen)이다.
바쿨로바이러스 발현 시스템에서 SEQ ID No 5의 CanIon 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체에 적합한 다른 벡터에는 Chai et al.(1993), Vlasak et al.(1983), Lenhard et al.(1996)에서 밝힌 벡터가 포함된다.
바이러스 벡터
특정 구체예에서, 벡터는 아데노바이러스로부터 유래된다. 본원 발명에 따른 적절한 아데노바이러스 벡터는 Feldman와 Steg(1996) 또는 Ohno et al.(1994)에서 밝힌 벡터이다. 본원 발명의 특정 구체예에 따른 다른 적절한 재조합 아데노바이러스는 2형이나 5형 사람 아데노바이러스(Ad2, Ad 5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스(French N°FR-93.05954)이다.
일반적으로, 레트로바이러스와 아데노-관련된 바이러스 벡터는 생체내에서 외인성 폴리뉴클레오티드를 사람을 비롯한 포유동물에 전달하는데 선택되는 재조합 유전자 전달 시스템이다. 이들 벡터는 유전자의 세포로의 효과적인 전달을 제공하고, 전달된 핵산은 숙주의 크로모좀 DNA에 안정적으로 통합된다.
본원 발명에 따른 레트로바이러스 시험관내 또는 생체내 유전자 전달체의 제조나 작제에 특히 적절한 레트로바이러스는 Mink-Cell 집중 유도 바이러스, 뮤린 육종 바이러스, 레티쿨로엔도텔리오시스 바이러스, 라우스 육종 바이러스에서 선택되는 레트로바이러스이다. 특히 바람직한 뮤린 백혈병 바이러스에는 4070A와 1504A 바이러스, Abelson(ATCC No VR-999), Friend(ATCC No VR-245), Gross(ATCCNo VR-590), Rauscher(ATCC No VR-998), Moloney 뮤린 백혈병 바이러스(ATCC No VR-190; PCT 출원 WO 94/24298)가 포함된다. 특히 바람직한 라우스 육종 바이러스에는 Bryan high titer(ATCC Nos VR-334, VR-657, VR-726, VR-659, VR-728)가 포함된다. 다른 적절한 레트로바이러스 벡터는 Roth et al.(1996), PCT 출원 WO 93/25234, PCT 출원 WO 94/06920 Roux et al., 1989, Julan et al., 1992, Neda et al., 1991에서 기술한다.
본원 발명에서 또 다른 바이러스 벡터 시스템은 아데노-관련된 바이러스(AAV)로 구성된다. 아데노-관련된 바이러스는 효과적인 복제 및 생명 사이클을 위한 보조 바이러스로 다른 바이러스, 예를 들면 아데노바이러스 또는 포진 바이러스를 필요로 하는 자연 발생 결함 바이러스이다(Muzyczka et al., 1992). 이는 DNA를 비-분열 세포에 통합시키고 높은 빈도의 안정적 통합을 보이는 극소수 바이러스중 하나이다(Flotte et al., 1992; Samulski et al., 1989; McLaughlin et al., 1989). AAV의 다른 장점은 형질전환된 세포와 관련된 일차 세포(primary cell)를 형질도입하는 능력의 감소에 기인한다.
BAC 벡터
박테리아 인공 크로모좀(BAC) 클로닝 시스템(Shizuya t al., 1992)은 큰 게놈 DNA 단편(100-300kb)을 대장균(E. coli)에 안정적으로 유지시키기 위하여 개발되었다. 적절한 BAC 벡터는 Kim et al.(1996)에서 밝힌 pBeloBAC11 벡터를 포함한다. BAC 라이브러리는 벡터에서 Bam HI 또는 HindⅢ 부위로의 결찰을 허용하는 효소로 부분적으로 절단된 크기-선별된 게놈 DNA를 이용하여 상기 벡터로 준비한다.이들 클로닝 부위의 측부는 RNA 전사 또는 PCR 방법으로 최종 프로브를 만드는데 사용할 수 있는 T7과 SP6 RNA 중합효소 전사 개시 부위이다. 대장균(E. coli)에서 BAC 라이브러리의 작제이후, BAC DNA는 숙주 세포로부터 초나선 환형으로 정제된다. 이들 환형 분자를 선형으로 전환시키기에 앞서, 크기 결정 및 BAC의 수용체 세포로의 도입이 진행된다. 클로닝 부위는 2개의 NotⅠ부위가 측면에 접하는데, 이들 부위는 NotⅠ절단에 의해 클론된 분절이 벡터로부터 절단되도록 한다. 대안으로, pBeloBAC11 벡터에 포함된 DNA 삽입체는 단일 cosN 부위에서 절단을 유발하는 상업적으로 가용한 효소 람다 테르미나제(terminase)로 BAC 벡터를 처리하여 선형화시킬 수 있지만, 이런 절단 방법은 삽입체 DNA와 BAC 서열을 모두 포함하는 전장 BAC 클론을 결과한다.
5. 재조합 벡터의 전달
본원 발명에 따른 폴리뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드 구조체의 발현을 달성하기 위하여, 이들 구조체는 세포로 전달되어야 한다. 이런 전달은 세포주를 형질전환시키는 실험실 과정에서와 같이 시험관내에서, 또는 특정 질환의 치료에서와 같이 생체내외에서 달성할 수 있다.
한가지 기전은 바이러스 감염인데, 여기서 발현 구조체는 감염성 바이러스 입자에 통합된다.
본원 발명에서는 폴리뉴클레오티드를 배양된 포유동물 세포에 전달하기 위한 몇몇 비-바이러스 방법을 고려하는데, 여기에는 칼슘 포스페이트 침전(Graham et al., 1973; Chen et al., 1987), DEAE-덱스트란(Gopal, 1985),에렉트로포레이션(Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), 직접 미세주사(Harland et al., 1985), DNA-적하된 리포좀(Nicolau et al., 1982; Fraley et al., 1979), 수용체-매개된 트랜스펙션(Wu and Wu, 1987; 1988) 등이 포함된다. 이들 기술중 일부는 생체내외 용도에 성공적으로 적용될 수 있다.
발현 폴리뉴클레오티드가 세포에 전달되면, 이는 수용자 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있다. 이런 통합은 상동성 재조합을 통하여 동원(cognate)위치와 배향으로 진행되거나(유전자 치환) 또는 무작위의 비-특이적인 위치로 통합될 수 있다(유전자 보충). 다른 구체예에서, 핵산은 별도의 에피좀 DNA 분절로 세포에서 안정적으로 유지될 수도 있다. 이런 핵산 분절 또는 "에피좀"은 숙주 세포 사이클과 독립적으로 또는 이런 사이클과 동조하여 복제와 유지를 가능하게 하는 서열을 인코드한다.
특정 구체예에서, 생체내에서 단백질 또는 펩티드를 척추동물의 세포내로 전달하는 방법은 생리적으로 수용가능한 담체 및 관심있는 폴리펩티드를 동작가능하게 코딩하는 나신 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제형을 세포를 포함하는 조직의 간질성 공간에 도입하는 단계로 구성되고, 여기서 나신 폴리뉴클레오티드는 세포의 내부로 흡수되고 생리 효과를 보인다. 이는 특히 시험관내 전달에 적용할 수 있지만, 시험관내 전달에도 적용할 수 있다.
"나신" 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시험관내와 생체내에서 사용되는 조성물은 PCT 출원 WO 90/11092(Vical Inc.), PCT 출원 WO 95/11307(Institut Pasteur, INSERM, Universite d'Ottawa), Tacson et al.(1996), Huygen et al.(1996)에서 기술한다.
본원 발명의 다른 구체예에서, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드 구조체를 비롯하여 본원 발명에 따른 나신 폴리뉴클레오티드의 세포로의 전달은 입자 폭탄(바이오리스틱)으로 실시하는데, 상기 입자는 고속으로 가속되는 DNA-피복된 마이크로발사체로서, 이들 DNA가 세포막을 통과하여 세포에 진입하도록 한다(Klein et al.(1987)).
적절한 구체예에서, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드는 리포좀에 포집된다(Ghosh and Bacchawat, 1991; Wong et al., 1980; Nicolau et al., 1987).
특정 구체예에서, 본원 발명은 본원 발명에 따른 CanIon 단백질 또는 폴리펩티드의 생체내 생산을 위한 조성물을 제시한다. 상기 조성물은 생리학적으로 수용가능한 담체에 용해되고 조직에 도입되면 조직의 세포가 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하도록 하는 이런 폴리펩티드를 동작가능하게 코딩하는 나신 폴리뉴클레오티드로 구성된다.
원하는 숙주 미생물에 주사되는 벡터의 함량은 주사 부위에 따라 달라진다. 일반적으로, 동물 신체, 바람직하게는 포유동물 신체, 예를 들면 생쥐 신체에 0.1 내지 100㎍이 주사된다.
다른 구체예에서, 본원 발명에 따른 벡터는 숙주 세포, 바람직하게는 처리된 동물로부터 수거된 숙주 세포, 좀더 바람직하게는 체세포(예, 근세포)에 도입할 수 있다. 후속 단계에서, 세포는 원하는 CanIon 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 벡터로 형질전환되고, 상기 세포는 동물 신체에 재도입하여 상기 재조합 단백질을 국소적으로 또는 전신적으로 체내에 전달한다.
세포 숙주
본원 발명의 다른 목적은 본원 발명의 폴리뉴클레오티드, 특히 CanIon 조절 폴리뉴클레오티드, 또는 SEQ ID No 1 내지 4의 CanIon 폴리펩티드, 이의 단편 혹은 변이체의 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환 또는 트랜스펙션되는 숙주 세포에 관한다. 본원 발명에는 전술한 재조합 벡터로 형질전환(원핵 세포) 또는 트랜스펙션(진핵 세포)된 숙주 세포 역시 포함된다. 좀더 구체적으로, 본원 발명의 세포 숙주는 "CanIon 유전자의 게놈 서열" 섹션, "CanIon cDNA 서열" 섹션, "코딩 영역" 섹션, "폴리뉴클레오티드 구조체" 섹션, "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머" 섹션에서 밝힌 폴리뉴클레오티드를 보유할 수 있다.
본원 발명에 따른 다른 재조합 숙주 세포는 A1 내지 A18과 이의 보체에서 선택되는 상기 이중대립인자 마커를 보유하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원 발명에 따른 다른 재조합 세포 숙주는 본원에서 밝힌 임의의 벡터, 좀더 구체적으로 "재조합 벡터" 섹션에서 밝힌 임의의 벡터를 보유할 수 있다.
본원 발명의 발현 벡터에 대한 수용자로 사용하는데 적합한 숙주 세포는 다음과 같다:
a) 원핵 숙주 세포: 대장균(Escherichia coli)(I.E.DH5-α균주), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무림(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스태필로코커스(Staphylococus)와 같은 종으로부터 유래된 균주;
b) 진핵 숙주 세포: HeLa 세포(ATCC N°CCL2; N°CCL2.1; N°CCL2.2), Cv 1 세포(ATCC N°CCL70), COS 세포(ATCC N°CRL1650; N°CRL1651), Sf-9 세포(ATCC °CRL1711), C127 세포(ATCC N°CRL-1804); 3T3(ATCC N°CRL-6361), CHO(ATCC N°CCL-61), 사람 신장 293(ATCC N°45504; N°CRL-1573), BHK(ECACC N°84100501; N°84111301);
c) 다른 포유동물 숙주 세포.
포유동물, 전형적으로 사람 세포에서 CanIon 유전자 발현은 불완전하거나, 또는 대안으로 본원 발명에 따른 CanIon 폴리뉴클레오티드로 동물 세포의 게놈에서 CanIon 유전자 상대를 대체하는 게놈 서열이나 cDNA 서열의 삽입으로 진행된다. 이런 유전적 변형은 전술한 특이적인 DNA 구조체를 이용한 상동성 재조합으로 달성할 수 있다.
사용할 수 있는 세포 숙주중 한가지는 포유동물 접합자, 예를 들면 뮤린 접합자이다. 가령, 뮤린 접합자는 관심있는 정제된 DNA 분자, 예를 들면 100mM NaCl 30μM 스페르민, 70μM 스페르미딘을 함유하는 10mM Tris-HCl, pH 7.4, 250㎛ EDTA에서 1 ng/㎖(BAC 삽입체) 내지 3ng/㎕(P1 박테리오파지 삽입체) 농도 범위로 조정된 정제된 DNA 분자를 미세주사할 수 있다. 미세주사되는 DNA가 대형인 경우에는 폴리아민과 높은 염 농도를 이용하여 DNA의 물리적 파괴를 피할 수 있다(Schedl et al.(1993b)).
본원에서 밝힌 DNA 구조체를 비롯한 본원 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 배아 줄기(ES) 세포주, 바람직하게는 생쥐 ES 세포주에 도입할 수 있다. ES 세포주는 착상전 배반포의 내세포괴(inner cell mass)의 전능한 비수임된 세포로부터 유래된다. 적절한 ES 세포주는 다음과 같다: ES-E14TG2a(ATCC n°CRL-1821), ES-D3(ATCC n°CRL1934, n°CRL-11632), YS001(ATCC n°CRL-11776), 36.5(ATCC n°CRL-11116). ES 세포는 비수임된 상태로 유지하기 위하여, 배아 표현형을 보존하는데 적합한 신호를 제공하고 ES 세포 유착을 위한 매트릭스로 기능하는 성정 저해된 영양세포의 존재하에 배양한다. 적절한 영양 세포는 Abbondanzo et al.(1993)에서 밝힌 바와 같이 지속 배양되고 Robertson(1987)에서 밝힌 바와 같이 자외선 또는 Pease와 Williams(1990)가 밝힌 바와 같이 저해 농도의 LIF 존재에 의해 성장이 저해되는 거의 모든 생쥐 계통의 13일 내지 14일된 배아의 조직으로부터 확립된 원시 배아 섬유아세포이다.
숙주 세포에서 구조체는 재조합 서열에 의해 인코드되는 유전자 산물을 생산하는 통상적인 방법에 사용할 수 있다.
적합한 숙주의 형질전환 및 적절한 세포밀도까지 숙주의 배양이후, 적당한 수단, 예를 들면 온도 변화 또는 화학적 유도로 선별 프로모터를 유도하고, 세포는 추가로 일정 기간동안 배양한다.
전형적으로, 세포는 원심분리로 수거하고 물리적 또는 화학적 수단으로 파괴하며, 생성된 정제되지 않은 추출물은 추가 정제를 위해 보관한다.
단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포용해제의 이용을 비롯한 임의의 간편한 방법으로 파괴할 수 있다. 이런 방법은 당분야에 공지된 것이다.
유전자도입 동물
본원에서 "유전자도입 동물" 또는 "숙주 동물"은 게놈이 유전적으로, 인위적으로 조작되어 본원 발명에 따른 핵산중 한가지를 포함하는 동물을 의미한다. 바람직한 동물은 사람제외 동물인데, 여기에는 본원 발명에 따른 핵산의 삽입에 의해 게놈이 인위적으로, 유전적으로 변형되고Mus(예, 생쥐),Rattus(예, 쥐),Oryctogalus(예, 토끼)에서 선택되는 속(genus)에 속하는 동물이 포함된다. 한 구체예에서, 본원 발명에는 본원 발명에 따른 재조합 벡터 또는 본원 발명의 적중 벡터와의 상동성 재조합으로 파괴된 CanIon 유전자를 보유하는 사람제외 숙주 포유동물 및 동물이 포함된다.
본원 발명의 유전자도입 동물은 복수의 세포에 클론된 재조합 또는 합성 DNA 서열, 좀더 구체적으로 CanIon 코딩 서열, CanIon 조절 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 구조체 또는 본원에서 밝힌 안티센스 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 DNA 서열을 포함하는 분리되거나 정제된 핵산을 보유한다.
일반적으로, 본원 발명에 따른 유전자도입 동물은 본원에서 밝힌 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 세포 숙주를 보유한다. 특히, 본원 발명의 유전자도입 동물은 "CanIon 유전자의 게놈 서열" 섹션, "CanIon cDNA 서열" 섹션, "코딩 영역" 섹션, "폴리뉴클레오티드 구조체" 섹션, "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머" 섹션, "재조합 벡터" 섹션, "세포 숙주" 섹션에서 밝힌 폴리뉴클레오티드를 보유할 수 있다.
본원 발명에 따른 다른 유전자도입 동물은 체세포 및/또는 생식 세포에 A1내지 A18과 이의 보체에서 선택되는 상기 이중대립인자 마커를 보유하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
적절한 첫 번째 구체예에서, 이들 유전자도입 동물 특히, 고유 CanIon 단백질 또는 대안으로 돌연변이 CanIon 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 한 개 또는 수 개의 사본이 삽입된 게놈을 갖는 유전자도입 동물은 세포 분화와 관련된 다양한 병리를 연구하기 위한 훌륭한 실험 모델일 될 수 있다.
적절한 두 번째 구체예에서, 이들 유전자도입 동물은 CanIon 유전자의 조절 폴리뉴클레오티드의 조절하에 원하는 폴리펩티드를 발현하여, 궁극적으로 높은 수율로 상기 단백질 합성 및 이런 단백질의 조직 특이적 발현을 달성한다.
본원 발명에 따른 유전자도입 동물의 설계는 당분야에 공지된 통상적 기술로 만들 수 있다. 유전자도입 동물, 특히 유전자도입 생쥐의 생산과 관련하여 미국 특허 4,873,191(Oct. 10, 1989); 5,464,764(Nov 7, 1995); 5,789,215(Aug 4, 1998)를 참조할 수 있다.
본원 발명의 유전자도입 동물은 외인성 유전자 물질을 통합하는 게놈을 갖는 동물을 결과하는 과정으로 만들 수 있다. 이런 과정에는 CanIon 코딩 서열을 인코드하는 유전 물질이나 이의 일부분, CanIon 조절 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에서 밝힌 CanIon 안티센스 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 DNA 서열을 수득하는 단계가 포함된다.
본원 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드는 배아 또는 ES 줄기 세포주에 삽입한다. 이런 삽입은 에렉트로포레이션으로 실시한다(Thomas et al.(1987)). 에렉트로포레이션되는 세포는 스크리닝하여(선별가능 마커를 통한 선별, PCR 또는 서던 블랏 분석), 가급적 상동성 재조합으로 자신의 게놈에 외인성 재조합 폴리뉴클레오티드를 통합하는 양성 세포를 찾는다. 본원 발명에 따라 사용할 수 있는 양성-음성 선별 과정은 Mansour et al.(1988)에서 기술한다.
이후, 양성 세포는 분리하고 클론하며 생쥐로부터 얻은 3.5일된 배반포에 주사한다(Bradley(1987)). 이후, 배반포는 암컷 숙주 동물에 삽입하고 일정 기간 성장시킨다.
대안으로, 양성 ES 세포는 2.5 일된 8-16 세포 단계 배아(상실배)와 접촉시키고(Wood et al.(1993), Nagy et al.(1993)), ES 세포는 흡수하여 생식세포로 발달하는 세포를 비롯한 배반포의 광범위한 콜로니를 형성한다.
암컷 숙주의 후손은 검사하여 야생형 동물과 유전자도입된, 다시 말하면 삽입된 외인성 DNA를 보유하는 동물을 확인한다.
따라서, 본원 발명은 본원 발명에 다른 핵산, 재조합 발현 벡터 또는 재조합 숙주 세포를 보유하는 유전자도입 동물에 관한다.
본원 발명의 유전자도입 동물로부터 유래된 재조합 세포주
본원 발명의 다른 목적은 본원에서 밝힌 유전자도입 동물로부터 수득된 재조합 숙주 세포에 관한다. 한 구체예에서, 본원 발명에는 본원 발명에 따른 재조합 벡터 또는 적중 벡터와의 상동성 재조합으로 파괴된 CanIon 유전자를 보유하는 사람제외 숙주 포유동물 및 동물로부터 유래된 세포가 포함된다.
재조합 세포주는 본원 발명에 다른 유전자도입 동물의 임의 조직으로부터 수득되는 세포로부터 시험관내에서 예로써 SV40 거대 T 항원과 같은onc-유전자를 발현하는 벡터로 원시 세포 배양액의 트랜스펙션으로 확립할 수 있다(Chou(1989), Shay et al.(1991))
CanIon 조절물질 및 상호작용 화합물의 스크리닝 방법
다양한 구체예에서, 본원 발명은 CanIon 폴리펩티드, 채널, 폴리뉴클레오티드와 상호작용하거나, 이들과 결합하거나, 활성화시키거나 또는 이들의 발현이나 활성을 저해하는 화합물을 제공한다. 이런 화합물은 유기 또는 무기 화합물일 수 있는데, 여기에는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 뉴클레오티드, 아미노산 또는 소형 분자 저해물질이나 활성물질이 포함된다. 본원에서 밝힌 바와 같이, 이런 화합물은 다양한 질환이나 이상의 치료 또는 예방에 유용하다. 적절하게는, CanIon 활성이나 발현의 저해물질이 정신분열증 또는 양극성 장애와 같은 정신 질환의 치료 또는 예방에 사용된다.
CanIon 채널 조절물질을 스크리닝하는 방법
CanIon에 결합할 수 있는 화합물 및 CanIon 기능을 조절할 수 있는 화합물은 질환의 치료에 중요하다. 전압-개폐 이온 채널은 약리학적으로 접근가능하고 다양한 유전자에 의해 인코드되며 다중결합의 단백질 조립체로 움직이고, 따라서 높은 기능적ㆍ해부학적 특이성을 결과한다는 점에서, 일반적으로 확립된 약물 표적이다. 게다가, 하전된 전압 감수성 아미노산의 움직임에 영향을 주는 이온 채널 개폐는 입체형태에서 변화를 유도하기 때문에, 이온 채널은 예로써 전도(활성화) 또는 비-전도(불활성화) 상태의 채널에만 결합하는 상태 의존성 분자의 설계를 가능하게 한다.
이에 더하여, 다수의 칼슘 채널 조절물질이 다양한 질환과 이상의 치료 또는 예방에 효과적인 것으로 입증되었다. 가령, 칼슘 채널 저해물질은 다양한 심장 질환과 이상(예, 협심증, 부정맥, 고혈압) 및 CNS와 신경 질환(예, 편두통, 발작의 신경학적 효과, 조병, 신경이완제-유도된 지발성 운동장애, 양극성 장애, 통증, 간질 등)에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이에 더하여, 칼슘 채널 작용물질은 다양한 용도, 예를 들면 국소 마취제의 지속기간을 감소시키고 희석시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. CasIon 채널의 길항물질과 작용물질은 이들 질환과 이상의 치료 또는 예방에 유사하게 효과적이다. 가령, CanIon 길항물질은 정신분열증과 양극성 장애의 치료 또는 예방에 효과적이다.
전압 개폐 이온 채널은 활성화를 위한 작용물질 결합을 요구하지 않기 때문에, 화합물은 기능적 CanIon 채널에 대하여 스크린한다. 분석에는 고유 또는 클론된 채널을 발현하는 세포(소포 또는 막), 또는 전체 세포에 적용되는 기능적 방사성리간드 결합 분석이 포함된다. 기능적 전세 세포 분석에서는 패치 클램핑(patch clamping)과 같은 전기물리적 기술을 이용한다. 분석은 전압-개폐 채널 유형, 바람직하게는 L, N, T 유형 채널에 관계한다. 채널을 통한 동적 이온 유동은 예로써 형광, 종점 방사성추적기(end-point radiotracer), 세포 생존능 기술로 측정할 수 있다.
또한, 분석에서는 채널에 결합하고 이를 개폐하는 다양한 독소, 독액 또는 화합물을 사용할 수 있다(Denyer et al., Drug Disc. Today 3(7):323-332(1998).한 구체예에서, 본 분석에서는 예로써 파지티브 또는 네거티브 대조군으로 다수의 공지된 칼슘 채널 작용물질과 길항물질을 이용한다. 적절한 공지된 칼슘채널 길항물질의 예에는 페닐알킬아민(예, 베라파밀), 벤조티아제핀(예, 딜티아젬), 디하이드로피리딘(예, 니페디핀)이 포함되고; 칼슘 채널 작용물질에는 FPL-64176과 BAYK 8644가 포함된다; 나트륨 채널 작용물질에는 베트라초톡신이 포함되고; 나트륨 채널 길항물질에는 스피라돌린, 멕실레틴, U-54494A((+/-)-cis-3,4-디클로로-N-메틸-N-[2-(1-피롤리디닐)-사이클로헥실]-벤즈아마이드)가 포함된다. 이런 화합물은 CanIon 채널에 특이적으로 결합하거나 이를 조절하는 유도체 분자의 설계 또는 발견을 위한 출발 분자 역할을 하는 "선도" 화합물로 사용될 수도 있다.
적절한 구체예에서, 본원 발명의 분석에는 후보 물질의 스크리닝 방법이 포함되는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
a) (i) CanIon 단백질이나 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 보유하는 시료 혹은 숙주 세포, 또는 (ii) CanIon 단백질이나 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 재조합 숙주 세포를 제공하고;
b) 후보 물질을 수득하며;
c) 상기 후보 물질과 숙주 세포를 접촉시키고;
d) CanIon 활성에 대한 상기 후보 물질의 효과를 측정한다.
CanIon 활성에 대한 후보 물질 효과의 측정은 당분야에 공지된 방법으로 달성할 수 있다. 적절하게는, CanIon 활성에 대한 후보 물질의 효과는 작용물질 또는 길항물질 효과이다. 일반적으로, 이온(예, Ca2+ 또는 Na+)을 전달하는 능력이감소하면 화합물은 CanIon을 저해한다. 이온을 전달하는 능력이 증가하면 화합물은 CanIon을 촉진한다.
CanIon 활성은 임의의 적합한 수단으로 검출할 수 있다. 적절한 예에서, CanIon 활성은 신호전달 현상을 측정하여 검출한다. 신호전달 현상에 세포의 분자 특징이나 파라미터의 적절한 변화가 포함될 수 있는데, 신호전달 현상의 무제한적 예에는 이온 유동에서 변화, 예를 들면 Ca2+ 혹은 Na+의 변화나 발생, 또는 K+ 유동이나 효소 활성화가 포함된다.
한 측면에서, 이온 유동은 예로써 단일 세포 또는 막 패치에서 전체 세포 전류를 측정하는 기술을 이용하여 CanIon 채널의 전기물리적 특성을 측정하여 모니터할 수 있다. 다른 예에서, 형광이나 방사성 라벨은 공지된 CanIon-결합 화합물의 이동, 또는 세포에서 이온(예, 표지된 Ca2+ 또는 Na+) 유동을 검출하는데 사용될 수 있다. 세포의 생리학적 파라미터에 대한 지표, 예를 들면 세포 생존에 대한 형광 지표를 사용할 수 있다. 다른 예에서, 지표의 물리적 위치에서 변화는 예로써 생리학적 지표의 배출이나 흡수를 확인하는 형광 활성화된 세포 정렬(sorting)의 이용으로 확인할 수 있다.
본원 발명의 분석에 사용되는 시료는 i) CanIon 단백질이나 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포, 또는 ii) CanIon 단백질이나 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 재조합 숙주 세포를 함유한다. 적절하게는, 본원 발명의 CanIon 분석에는 기능적 CanIon 폴리펩티드를 발현하는 재조합 숙주 세포의 이용이 포함된다. 숙주 세포는 CanIon 채널의기능적 알파 아단위, 한가지이상 추가적인 이온 채널 아단위, 또는 CanIon을 포함하는 이온 채널 복합체를 발현 혹은 포함할 수 있다. 적절하게는, 낮은 내인성 이온 채널 발현을 보유하거나, 또는 낮은 배경 이온, 특히 Ca2+ 및/또는 Na+ 전도도를 갖는 숙주 세포가 사용된다.
방사성리간드 결합
한 측면에서, CanIon 채널은 CanIon의 관심 부위에 결합하고 바람직하게는 원하는 조절 효과를 보유하는 고 친화성 리간드를 동정하고 상기 표지된 리간드를 치환화는 검사 화합물의 능력을 검출하여 스크린할 수 있다. 전압 개폐(Ca2+, Na+, K+)에 사용되는 독성학적/약리학적 작용제의 목록은 Denyer et al.(supra)에서 제시한다. 일반적으로, 이런 방법은 표지된 리간드로 동일 부위에 결합하거나 또는 상기 부위에 알로스테릭하게 결합하지만 작용물질이나 길항물질 특성과 관련된 정보를 제공하지 않는 화합물을 검출하는데 적합하다.
세포 기초한 형광과 방사성 추적기 분석
다른 분석에서, CanIon 기능은 형광-이온 지표 또는 방사성표지된 이온으로 투과성 이온의 세포내 농도에서 변화를 측정하여 모니터할 수 있다.
전형적으로, Na+ 채널과 같은 이온 채널은 전압 자극(voltage stimulation)후 수초내에 불활성화된다. Ca2+ 채널은 거의 불활성화를 보이지 않고 높은 K+ 탈분극으로 개방할 수 있다. 세포 기초한 형광과 방사성 추적기 분석에서, CanIon 채널은 독소 혹은 임의의 검사 화합물 또는 높은 K+ 탈분극으로 활성화시켜, 연장된 기간(최대 수분)동안 개방시킬 수 있다.
형광 기초한 분석에서, 형광 Ca2+ 염료(Fluo-3, 칼슘 그린-1, Molecular Probes, OR, U.S.A)가 사용 가능하다. Ca2+ 채널은 등장성 용액으로 막을 탈분극시키거나, 또는 독소나 다른 화합물로 Na+ 채널을 탈분극시켜 활성화시킬 수 있는데, 세포에서 형광의 일시적 움직임은 20 내지 60초동안 측정된다. 형광 측정 시스템과 장치는 Denyer et al.(supra)에서 상세하게 기술한다. 방사성 추적기 22Na+와 14C-구아니딘은 Na+ 채널 분석에 통상적으로 사용되고 45Ca2+는 Ca2+ 채널 분석에 사용된다. Denyer et al.(supra)에서 밝힌 적절한 구체예에서, 고성능 CanIon 세포 기초한 분석에Cytostar-T 신틸레이션 마이크로플레이트(Amersham International, U.K.)가 사용된다.
추가 분석에서, 이온 채널의 Ca2+ 기능은 막 전위 지표로 막 전위를 측정하여 모니터한다. 생물학적 막의 높은 전기 저항성은 적은 이온 전류가 혈장 막을 통과하여 막 전위에 많은 변화를 유도할 수 있도록 한다. 따라서, 전압 분석은 막을 통한 전반적인 이온 유동을 검출하는데 용이하게 이용될 수 있다. 일반적으로, 세포주는 내생적 이온 채널로부터 효과가 최소화되도록 선택된다. 다양한 염료가 막 전위 지표 염료로 가용하는데, 이들은 빠른 반응 염료와 느린 반응 염료 및 FRET-기초한 전압 센서 염료로 세분된다(Auora Biosciences, CA, USA; Gonzalez et al., Drug Disc. Today 4(9): 431-439(1999).
세포 생존능
세포 생존능 분석에서, 이온 채널 활성과 이온 유동은 세포 생존능과 직접적으로 관련된다. 이온 채널 표적의 검사에 효모와 포유동물 세포 시스템이 가용하다. 가령, 이온-특이적 K+ 흡수 결핍성 맥주 효모균(Saccharomyces cerevisiae) 세포주를 이용한 효모 시스템이 사용되는데, 여기서 기능적 K+ 채널은 상기 세포주에서 발현되고, 따라서 K+ 흡수를 회복하고 세포 생존을 촉진한다(Anderson et al., Symp. Soc. Exp. Biol. 48: 85-97(1994)). Ca2+ 또는 Na+ 채널에 대한 이런 분석은 CanIon 기능을 차단할 수 있는 화합물을 동정하는데 이용될 수 있다. 포유동물 세포 시스템, 예를 들면 비색 세포 생존능 판독으로 포유동물 신경아세포종 세포를 이용한 Na+ 채널 분석 역시 가용하다. Na+ 채널로 개방물질과 Na+/K+ 펌프 저해물질로 처리된 세포는 치명적인 세포내 Na+ 과부하를 촉진한다. 채널을 차단할 수 있는 검사 화합물로 처리하면 세포 생존능이 향상되는 반면, 채널 개방을 강화시키는 화합물은 세포 사멸을 더욱 촉진한다(Manger et al., Anal. Biochem. 214: 190-194(1993)).
전기생리(electrophysiology)
전기생리학적 전압-클램핑 기술에는 한가지이상 채널을 통한 이온 전류 유동의 측정이 포함된다. 막 전압은 단일 마이크로전극으로 조절하고, 전류는 단일 세포 또는 막 패치를 통하여 측정한다(Hamil, Pfugers Arch. 391, 85-100(1981)). 따라서, 이온 전류는 관심있는 검사 화합물의 존부하에 측정할 수 있다. 대규모 화합물 스크리닝 시스템이 설계되었다(Neurosearch A/S, Glostrup, Denmark; Olesen et al., Voltage gated ion channel modulators, 7-8 December, Philadelphia PA, USA(1995); Denyer et al., supra).
CanIon 폴리펩티드와 상호작용하는 물질의 스크리닝 방법
본원 발명에서, 리간드는 CanIon 단백질, 이의 단편 또는 변이체와 결합하거나 또는 CanIon, 이의 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절할 수 있는 단백질, 펩티드, 항체 또는 임의의 화학적 합성화합물과 같은 분자를 의미한다.
본원 발명에 따른 리간드 스크리닝 방법에서, CanIon 단백질의 추정 리간드로 검사할 생물 시료 또는 정의된 분자는 상응하는 정제된 CanIon 단백질, 예를 들면 재조합 세포 숙주에 의해 생산되는 상응하는 정제된 재조합 CanIon 단백질과 접촉시켜 상기 단백질과 검사할 추정 리간드 분자간 복합체를 형성시킨다.
가령, SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 적어도 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 100개의 연속 아미노산을 포함하는 CanIon 단백질이나 이의 단편과 약물이나 소형 분자, 예를 들면 조합 화학, HPLC와 결부된 마이크로투석(Wang et al.(1997)) 또는 친화성 모세관 전기영동 방법(Bush et al.(1997))을 통하여 만들어진 분자의 복합체를 형성시킨다.
다른 방법에서, SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 적어도 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 100개의 연속 아미노산을 포함하는 CanIon 단백질이나 이의 단편과 상호작용하는 펩티드, 약물, 지방산, 리포프로테인 또는 작은 분자는 다음과 같은 분석법으로 확인할 수 있다. 결합을 검사할 분자는 검출가능한 라벨, 예를 들면 형광, 방사성 또는 효소 태그로 표지하고, 특이적인 결합이 가능한 조건하에 고정된 CanIon단백질이나 이의 단편과 접촉시킨다. 비-특이적으로 결합된 분자를 제거한 이후, 결합된 분자는 적절한 수단으로 검출한다.
본원 발명의 다른 목적은 CanIon 폴리펩티드와 상호작용하는 후보 물질을 스크리닝하는 방법과 키트에 관한다.
본원 발명은 CanIon 단백질, 이의 단편 또는 변이체와 상호작용하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제시한다. CanIon 단백질, 이의 단편 또는 변이체와 공유 또는 비-공유 결합하는 능력으로 인해, 이들 물질은 시험관내와 생체내에서 효과적으로 사용할 수 있다.
시험관내에서, 이런 상호작용 분자는 시료, 바람직하게는 생물 시료에서 CanIon 단백질의 존재를 확인하는 검출 수단으로 사용할 수 있다.
후보 물질을 스크리닝하는 방법은 다음의 단계로 구성된다.
a) SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 적어도 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 100개의 연속 아미노산을 포함하는 CanIon 단백질이나 이의 단편을 포함하는 또는 이들을 포함하는 폴리펩티드를 제공하고;
b) 후보 물질을 수득하고;
c) 상기 폴리펩티드와 후보 물질을 접촉시키고;
d) 상기 폴리펩티드와 후보 물질간에 형성된 복합체를 검출한다.
또한, 본원 발명은 CanIon 폴리펩티드와 상호작용하는 후보 물질을 스크리닝하는 키트에 관하는데, 상기 키트는 다음과 같이 구성된다.
a) SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 적어도 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 100개의 연속 아미노산을 포함하는 CanIon 단백질이나 이의 단편;
b) 선택적으로, CanIon 단백질, 이의 단편 또는 변이체와 후보 물질간에 형성된 복합체를 검출하는데 유용한 수단.
전술한 키트의 적절한 구체예에서, 검출 수단은 CanIon 단백질, 이의 단편 또는 변이체에 대한 단클론이나 다클론 항체을 포함한다.
다양한 후보 물질이나 분자는 CanIon 폴리펩티드와의 상호작용을 분석할 수 있다. 이들 물질이나 분자에는 고유 혹은 합성 유기 화합물 또는 생물 기원의 분자, 예를 들면 폴리펩티드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 후보 물질이나 분자가 폴리펩티드를 포함하는 경우에, 상기 폴리펩티드는 파지-기초된 무작위 펩티드 라이브러리에 속하는 파지 클론의 발현 산물 또는 대안으로 이중-하이브리드 스크리닝 분석을 실시하는데 적합한 벡터에 클론된 cDNA 라이브러리의 발현 산물일 수 있다.
또한, 본원 발명은 전술한 스크리닝 방법을 실행하는데 유용한 키트에 관한다. 적절하게는, 이런 키트는 CanIon 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체 및 선택적으로 CanIon 단백질, 이의 단편 또는 변이체와 후보 물질간에 형성된 복합체를 검출하는데 유용한 수단으로 구성된다. 적절한 구체예에서, 검출 수단은 CanIon 단백질, 이의 단편 또는 변이체에 대한 단클론이나 다클론 항체로 구성된다.
A. 무작위 펩티드 라이브러리로부터 수득된 후보 리간드
스크리닝 방법의 특정 구체예에서, 추정 리간드는 파지 벡터에 포함된 DNA 삽입체의 발현 산물이다(Parmley and Smith, 1988). 특히, 무작위 펩티드 파지 라이브러리가 사용된다. 무작위 DNA 삽입체는 8 내지 20개 아미노산 길이의 펩티드를 인코드한다(Oldenburg K.R. et al., 1992; Valadon P., et al., 1996; Lucas A.H., 1994; Westerink M.A.J., 1995; Felici F. et al., 1991). 이런 특정 구체예에 따라, 고정된 CanIon 단백질에 결합하는 단백질을 발현하는 재조합 파지는 유지시키고, CanIon 단백질과 재조합 파지간에 형성된 복합체는 CanIon 단백질에 대한 다클론이나 단클론 항체로 면역침전시킬 수 있다.
일단 재조합 파지에서 리간드 라이브러리가 작제되면, 파지 개체군은 고정된 CanIon 단백질과 접촉시킨다. 이후, 복합체는 세척하여 비-특이적으로 결합된 재조합 파지를 제거한다. 그 다음, CanIon 단백질에 특이적으로 결합하는 파지는 완충액(산성 pH)으로 용출하거나 또는 하이브리도마 항-CanIon에 의해 만들어진 단클론 항체로 면역침전시키고, 이런 파지 개체군은 박테리아(가령, 대장균(E. coli))의 과잉-감염(over-infection)으로 증폭시킨다. 선별 단계는 수회, 바람직하게는 2-4회 반복하여 좀더 특이적인 재조합 파지 클론을 선별한다. 최종 단계는 선별된 재조합 파지 클론에 의해 생성된 펩티드를 감염된 박테리아에서 발현과 분리로 특성화시키는 단계, 다른 숙주-벡터 시스템에서 파지 삽입체를 발현시키는 단계 또는 선별된 재조합 파지에 포함된 삽입체를 서열분석하는 단계로 구성된다.
B. 경합 실험으로 수득된 후보 리간드
대안으로, SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 적어도 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 100개의 연속 아미노산을 포함하는 CanIon 단백질이나 이의 단편과 결합하는 펩티드, 약물 또는 소형 분자들은 경합 실험으로 확인할 수 있다. 이런 분석에서, CanIon 단백질 또는 이의 단편은 표면, 예를 들면 플라스틱 평판에 고정시킨다. 펩티드, 약물 또는 소형 분자들은 CanIon 단백질 리간드로 알려진 검출가능한 라벨의 존재하에 함량을 점진적으로 증가시키면서 고정된 CanIon 단백질 또는 이의 단편과 접촉시킨다. 가령, CanIon 리간드는 형광, 방사성 또는 효소 태그로 검출가능하게 표지할 수 있다. CanIon 단백질이나 이의 단편에 결합하는 검사 분자의 능력은 검사 분자의 존재하에 결합된 검출가능하게 표지된 리간드의 함량을 측정하여 확인한다. 검사 분자가 존재하는 경우에 CanIon 단백질이나 이의 단편에 결합하는 공지된 리간드의 함량이 줄어드는데, 이는 검사 분자가 CanIon 단백질이나 이의 단편과 결합할 수 있다는 것을 암시한다.
C. 친화성 크로마토그래피에 의해 수득된 후보 리간드
SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 적어도 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 100개의 연속 아미노산을 포함하는 CanIon 단백질이나 이의 단편과 상호작용하는 단백질 또는 다른 분자는 CanIon 단백질이나 이의 단편을 보유하는 친화성 칼럼을 이용하여 발견할 수 있다. CanIon 단백질이나 이의 단편은 통상적 기술, 예를 들면 아가로즈 Affi Gel®또는 당업자에게 공지된 다른 매트릭스와 같은 적합한 칼럼 매트릭스에 대한 화학적 결합으로 칼럼에 부착시킬 수 있다. 상기 방법의 일부 구체예에서,친화성 칼럼은 CanIon 단백질이나 이의 단편이 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST)와 융합된 키메라 단백질을 함유한다. 세포 단백질의 혼합물 또는 전술한 발현된 단백질의 풀(pool)을 친화성 칼럼에 가한다. 이후, 칼럼에 부착된 CanIon 단백질이나 이의 단편과 상호작용하는 단백질 또는 다른 분자는 분리하고 Ramunsen et al.(1997)에서 밝힌 바와 같이 2-D 전기영동 겔에서 분석할 수 있다. 대안으로, 친화성 칼럼에 잔존하는 펩티드는 전기영동 기초한 방법으로 정제하고 서열분석할 수 있다. 상기 방법은 항체를 분리하거나, 파지 디스플레이 산물을 스크리닝하거나 또는 파지 디스플레이 사람 항체를 스크리닝하는데 활용할 수 있다.
D. 광학적 바이오센서 방법으로 수득된 후보 리간드
SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 적어도 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 100개의 연속 아미노산을 포함하는 CanIon 단백질이나 이의 단편과 상호작용하는 단백질은 광학적 바이오센서로 스크리닝할 수도 있다(Edwards and Leatherbarrow(1997), Szabo et al.(1995)). 이 기술은 실시간으로 분자간 상호작용의 검출이 가능하고, 표지된 라벨을 필요로 하지 않는다. 이 기술은 표면 플라스몬 공명(SPR) 현상에 기초한다. 간단히 말하면, 검사할 후보 리간드 분자는 표면(예, 카복시메틸 덱스트란 매트릭스)에 부착시킨다. 광빔은 검사 시료를 함유하지 않은 표면의 측면으로 향하고 상기 표면에 의해 반사된다. SPR 현상은 각도 및 파장과 특이적으로 연관하여 반사된 광의 밀도를 감소시킨다. 후보 리간드 물질의 결합은 표면에서 굴절율에 변화를 초래하고, 이런 변화는 SPR 신호에서 변화로 감지된다. CanIon 단백질이나 이의 단편과 상호작용할 수 있는 후보 리간드 분자 또는 물질의 스크리닝에서, CanIon 단백질이나 이의 단편은 표면에 고정시킨다. 상기 표면은 분석할 후보 물질이 통과하게 되는 세포로 구성된다. CanIon 단백질이나 이의 단편에 후보 물질의 결합은 SPR 신호의 변화로 감지된다. 검사된 후보 물질은 조합 화학으로 만들어진 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 소형 분자일 수 있다. 이 기술은 내인성 또는 재조합으로 발현된 CanIon 단백질을 보이는 진핵이나 원핵 세포 또는 지질 소포를 표면에 고정시켜 실시할 수도 있다.
상기 방법의 최대 이점은 CanIon 단백질 및 CanIon 단백질과 상호작용하는 분자간 결합 속도를 측정할 수 있다는 점이다. 따라서, 강한 또는 상대적으로 약한 결합 상수를 통하여 CanIon 단백질이나 이의 단편과 상호작용하는 리간드 분자를 특이적으로 선별하는 것이 가능하다.
E. 이중-하이브리드 스크리닝 분석을 통하여 수득된 후보 리간드
이중-하이브리드 시스템은 생체내에서 단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 것으로(Fields and Song 1989), 이스트 Gal4 단백질의 DNA 결합 도메인에 미끼 단백질의 융합에 의존한다. 이 기술은 미국 특허 5,667,973과 5,283,173(Fields et al.)에서도 기술한다.
이중-하이브리드 분석에 의한 라이브러리 스크리닝의 전반적 과정은 Harper et al.(1993), Cho et al.(1998) 또는 Fromont-Racine et al.(1997)에서 밝힌 과정으로 실시할 수 있다.
미끼 단백질이나 폴리펩티드는 SEQ ID No 5의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 적어도 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 100개의 연속 아미노산을 포함하는 CanIon 단백질이나 이의 단편으로 구성되거나 또는 이를 포함한다.
좀더 구체적으로, CanIon 단백질, 이의 단편 또는 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 GAL4 단백질의 DNA 결합 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 융합되는데, 상기 융합된 뉴클레오티드 서열은 적합한 발현 벡터, 예를 들면 pAS2 또는 pM3에 삽입한다.
이후, 특별하게 설계된 벡터에 사람 cDNA 라이브러리를 작제하여, 사람 cDNA 삽입체가 GAL4 단백질의 전사 도메인을 인코드하는 벡터상의 뉴클레오티드 서열과 융합되도록 한다. 적절하게는, 사용된 벡터는 pACT 벡터이다. 사람 cDNA 라이브러리의 뉴클레오티드 삽입체에 의해 인코드되는 폴리펩티드는 "먹이" 폴리펩티드라 한다.
세 번째 벡터는 검출가능한 마커 유전자, 예를 들면 전사 활성 도메인과 DNA 결합 도메인 모두를 포함하는 완전 Gal4 단백질의 결합에 반응하는 조절 서열의 조절하에 위치하는 베타 갈락토시다제 유전자 또는 CAT 유전자를 보유한다. 가령, 벡터 pG5EC를 사용할 수 있다.
또한, 2가지 상이한 이스트 균주가 사용된다. 예로써, 2가지 상이한 이스트 균주는 다음과 같다:
- Y190, 이의 표현형은 (MATa, Leu2-3, 112 ura3-12, trpl-901 his3-D200 ade2-101, gal4Dgall80D URA3 GAL-LacZ, LYS GAL-HIS3, cyh)이다;
- Y187, 이의 표현형은 (MATa gal4 gal80 his3 trpl-901 ade2-101 ura3-52 leu2-3, -112 URA3 GAL-lacZmet)으로, Y190의 반대 교배형(mating type)이다.
간단히 말하면, 20㎍의 pAS2/CanIon와 20㎍의 pACT-cDNA 라이브러리는 이스트 균주 Y190에 공동-형질전환시킨다. 형질전환체는 히스티딘, 루이신, 트립토판이 결핍되지만 히스티딘 합성 저해물질 3-AT(50mM)을 함유하는 최소 배지에서 성장에 대하여 선별한다. 양성 콜로니는 필터 리프트(lift) 분석으로 베타 갈락토시다제에 대하여 선별한다. 이후, 이중 양성 콜로니(His +,beta-gal +)는 히스티딘과 루이신이 결핍되지만 트립토판과 사이클로헥사미드(10mg/㎖)를 함유하는 평판에 배양하여 pAS2/CanIon 플라스미드는 없지만 pACT-cDNA 라이브러리 플라스미드는 계속 유지하는 콜로니를 선별한다. 결과의 Y190 균주는 Gal4 융합체로 CanIon 또는 무관한 대조군 단백질; 예를 들면 사이클로필린 B, 라민 또는 SNF1을 발현하는 Y187 균주와 교배시키고[Harper et al.(1993), Bram et al.(Bram RJ et al., 1993)], 필터 리프트(lift) 분석으로 베타 갈락토시다제에 대하여 선별한다. 대조군 Gal4 융합체와의 교배후beta-gal -인 이스트 클론은 가양성(false positive)이다.
본원 발명에 따른 이중-하이브리드 방법의 다른 구체예에서, CanIon, 이의 단편이나 변이체와 세포 단백질간 상호작용은 매치메이커 Hybrid System 2(Catalog No. K1604-1, Clontech)를 이용하여 평가할 수 있다. 매치메이커 Two Hybrid System 2(Catalog No. K1604-1, Clotech)에 동반된 매뉴얼에 밝힌 바와 같이, CanIon 단백질이나 이의 일부분을 인코드하는 핵산은 발현 벡터에 삽입시켜 이들이이스트 전사 활성자 GAL4의 DNA 코딩 영역을 인코드하는 DNA와 쌍을 이루게 한다. 원하는 cDNA, 바람직하게는 사람 cDNA는 두 번째 발현 벡터에 삽입시켜 이들이 GAL4의 활성화 도메인을 인코드하는 DNA와 쌍을 이루게 한다. 이중 발현 플라스미드는 이스트로 형질전환시키고, 이스트는 HIS3 유전자의 GAL4 의존성 발현뿐만 아니라 각 발현 벡터에서 선별 마커의 발현을 선별하는 선별 배지에 도말한다. 히스티딘이 결핍된 배지에서 성장할 수 있는 형질전환체는 GAL4 의존성 lacZ 발현에 대하여 스크리닝한다. 히스티딘 선별과 lacZ 분석 모두에서 양성인 세포는 CanIon과 초기에 선별된 cDNA 삽입체에 의해 인코드되는 단백질이나 펩티드간 상호작용을 보유한다.
CanIon의 조절 서열과 상호작용하는 물질을 스크리닝 하는 방법
또한, 본원 발명은 CanIon 유전자의 조절 서열, 예를 들면 프로모터 또는 인헨서 서열과 상호작용 할 수 있는 물질이나 분자를 스크리닝하는 방법에 관한다.
CanIon 유전자의 조절 서열, 좀더 구체적으로 5'와 3' 조절 영역의 폴리뉴클레오티드, 이의 단편 또는 변이체에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 본원 발명의 이중대립인자 마커중 한가지를 포함하는 변이체와 상호작용할 수 있는 단백질을 인코드하는 핵산은 Matchmaker One-Hybrid System kit(Catalog Ref. n°K1603-1, Clontech)에 동봉된 책자에 기술되어 있는 바와 같이 단일-하이브리드 시스템으로 동정할 수 있다. 간단히 말하면, 표적 뉴클레오티드 서열은 선별가능 리포터 서열의 상류에 클론시키고, 생성된 DNA 구조체는 맥주 효모균(Saccharomyces cerevisiae) 게놈에 통합시킨다. 이후, 게놈에 리포터 서열을 포함하는 이스트 세포는 CanIon 유전자의 조절 서열에 결합하는 후보 단백질을 인코드하는 cDNA와 GAL4와 같은 이스트 전사 인자의 활성자 도메인을 인코드하는 서열간 융합 분자을 포함하는 라이브러리로 형질전환시킨다. 재조합 이스트 세포는 리포터서열을 발현하는 세포를 선별하는 액체 배지에 도말한다. 이렇게 선별된 재조합 이스트 세포는 CanIon 유전자의 조절 서열에 결합할 수 있는 융합 단백질을 보유한다. 이후, 상기 융합 단백질을 인코드하는 cDNA는 서열분석하고 시험관내에서 발현이나 전사 벡터에 클론시킬 수 있다. CanIon 유전자의 표적 조절 서열에 상기 인코드된 폴리펩티드의 결합은 당업자에게 공지된 기술, 예를 들면 겔 지체 분석 또는 DNAse 보호 분석으로 확인할 수 있다.
겔 지체 분석은 CanIon 유전자의 조절 서열과 상호작용할 수 있는 후보 분자를 스크리닝하기 위하여 독립적으로 실시할 수 있다(Fried and Crothers(1981); Garner and Revzin(1981); Dent and Latchman(1993)). 이들 기술은 단백질에 결합하는 DNA 단편이 결합하지 않은 동일한 DNA 단편보다 느리게 이동한다는 원칙에 기초한다. 간단히 말하면, 표적 뉴클레오티드 서열을 표지한다. 이후, 표지된 뉴클레오티드 서열은 전사 인자를 포함하는 세포의 전체 핵 추출물 또는 검사할 상이한 후보 물질과 접촉시킨다. CanIon 유전자의 표적 조절 서열과 후보 물질이나 전사 인자간 상호작용은 겔이나 모세관 전기영동이후 이동 지체로 감지된다.
CanIon 유전자의 발현을 조절하는 리간드를 스크리닝하는 방법
본원 발명의 다른 목적은 CanIon 단백질의 발현을 조절하는 분자를 스크리닝하는 방법이다. 이런 스크리닝 방법은 다음의 단계로 구성된다:
a) 자체 프로모터의 조절하에 CanIon 단백질, 이의 단편 또는 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 트랜스펙션된 원핵이나 진핵 세포를 배양하고;
b) 배양된 세포를 검사할 분자와 접촉시키고;
c) CanIon 단백질, 이의 단편 또는 변이체의 발현을 정량한다.
한 구체예에서, CanIon 단백질, 이의 단편 또는 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 이중대립인자 마커 A12 또는 A16중 적어도 한가지의 대립유전자 및 이의 보체를 포함한다.
당업자에게 공지된 DNA 재조합 기술을 활용하여, DNA 서열을 인코드하는 CanIon 단백질은 발현 벡터에서 프로모터 서열로부터 하류에 삽입한다. 가령, CanIon 유전자의 프로모터 서열은 5'조절 영역의 핵산에 포함시킨다.
CanIon 단백질의 발현 정량은 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 달성할 수 있다. 후자의 경우에, 예로써 ELISA 또는 RIA 분석에서 생산된 CanIon 단백질의 함량을 정량하는데 다클론이나 단클론 항체를 사용할 수 있다.
적절한 구체예에서, CanIon mRNA의 정량은 CanIon에 특이적인 프라이머를 이용한 배양된 CanIon-트랜스펙션된 숙주 세포의 전체 mRNA의 역전사로 수득되는 cDNA의 정량적 PCR 증폭으로 달성한다.
또한, 본원 발명은 CanIon 유전자의 발현 수준을 증가 또는 감소시킬 수 있는 물질이나 분자를 스크리닝하는 방법에 관한다. 이런 방법으로, 당업자는 CanIon 유전자의 발현 수준에 조절 효과를 보이고 전술한 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 제약학적 조성물에 함유되는 활성 성분으로 유용한 물질을 선별할 수 있다.
따라서, 본원 발명에는 CanIon 유전자의 발현을 조절하는 후보 물질이나 분자를 스크리닝하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
- 핵산을 보유하는 재조합 세포 숙주를 제공하고, 여기서 상기 핵산은 검출가능한 단백질을 인코드하는 폴리펩티드의 상류에 위치하는 5'조절 영역의 뉴클레오티드 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함하고;
- 후보 물질을 수득하고;
- 검출가능한 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 조절하는 후보 물질의 능력을 확인한다.
다른 구체예에서, 5'조절 영역의 뉴클레오티드 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함하는 핵산에는 SEQ ID No 4의 CanIon cDNA의 5'UTR 영역, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체가 포함된다.
검출가능한 단백질을 인코드하는 적절한 폴리뉴클레오티드에는 베타 갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT)를 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
또한, 본원 발명은 전술한 스크리닝 방법을 실행하는데 유용한 키트에 관한다. 적절하게는, 이런 키트는 검출가능한 단백질 또는 CanIon 단백질, 이의 단편이나 변이체를 인코드하는 폴리펩티드의 상류에 위치하고 여기에 동작가능하게 연결된 5'조절 영역의 뉴클레오티드 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체의 발현을 가능하게 하는 재조합 벡터로 구성된다.
CanIon 유전자의 발현을 조절하는 후보 물질이나 분자를 스크리닝하는 방법의 다른 구체예에서, 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다:
a) 핵산을 보유하는 재조합 세포 숙주를 제공하고, 여기서 상기 핵산은 SEQ ID No 4의 CanIon cDNA의 5'UTR 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함하고, 상기 5'UTR 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체는 검출가능한 단백질을 인코드하는 폴리펩티드에 동작가능하게 연결되고;
b) 후보 물질을 수득하고;
c) 검출가능한 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 조절하는 후보 물질의 능력을 확인한다.
상기 스크리닝 방법의 특정 구체예에서, SEQ ID No 4의 CanIon cDNA의 5'UTR 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 전술한 CanIon 5'UTR 서열과 내인성의 프로모터 서열을 보유한다.
상기 스크리닝 방법의 다른 특정 구체예에서, SEQ ID No 4의 CanIon cDNA의 5'UTR 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 전술한 CanIon 5'UTR 서열과 외인성의 프로모터 서열을 보유한다.
다른 적절한 구체예에서, SEQ ID No 4의 CanIon cDNA의 5'UTR 서열 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는 핵산은 A12 또는 A16에서 선택되는 이중대립인자 마커 또는 이의 보체를 보유한다.
또한, 본원 발명은 CanIon 유전자의 발현을 조절하는 후보 물질을 스크리닝하는 키트에 관하는데, 상기 키트는 상기 핵산은 SEQ ID No 4의 CanIon cDNA의 5'UTR 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 보유하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 구성되고, 상기 5'UTR 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체는 검출가능한 단백질을 인코드하는 폴리펩티드에 동작가능하게 연결된다.
CanIon의 발현 수준과 패턴은 국제 특허 출원 WO 97/05277에서 밝힌 긴 프로브와의 용액 혼성화로 분석할 수 있다. 간단히 말하면, 전술한 CanIon cDNA이나 CanIon 게놈 DNA 또는 이들의 단편은 박테리오파지(T3, T7 or SP6) RNA 중합효소 프로모터에서 매우 가까운 하류의 클로닝 부위에 삽입시켜 안티센스 RNA를 만든다. 적절하게는, CanIon 삽입체는 게놈 DNA 서열 또는 cDNA 서열의 100개이상 연속 뉴클레오티드로 구성된다. 상기 플라스미드는 선형화시키고, 변형된 리보뉴클레오티드(즉, 비오틴-UTP와 DIG-UTP)을 포함하는 리보뉴클레오티드의 존재하에 전사시킨다. 과량의 이중 표지된 RNA는 관심있는 세포 또는 조직으로부터 분리된 mRNA와 용액에서 혼성화된다. 혼성화는 평균적인 엄격한 조건(40-50℃, 16시간, 80% 폼아마이드, 0.4M NaCl 완충액 pH 7.8)하에 실시한다. 혼성화되지 않은 프로브는 단일-사슬 RNA에 특이적인 리보뉴클레아제(즉, RNases CL3, T1, Phy M, U2 또는 A)로 절단하여 제거한다. 비오틴-UTP 수식의 존재는 스트렙타비딘으로 피복된 마이크로적정 평판에 하이브리드의 포획을 가능하게 한다. DIG 수식의 존재는 알칼리성 포스파타제에 결합된 항-DIG 항체를 이용한 ELISA로 하이브리드를 검출하고 정량하는 것을 가능하게 한다.
CanIon 유전자 발현의 정량적 분석은 어레이를 이용하여 실시할 수도 있다.본원에서 어레이는 mRNA 발현을 특이적으로 검출할 수 있는 충분한 길이의 핵산을 포함하는 일차원, 이차원 또는 다차원 정렬을 의미한다. 가령, 어레이는 발현 수준을 평가해야 하는 유전자로부터 유래된 복수의 핵산을 포함할 수 있다. 어레이는 CanIon 게놈 DNA, CanIon cDNA 서열, 이의 상보적 서열 또는 단편, 특히 본원 발명에 따른 이중대립인자 마커중 적어도 한가지, 바람직하게는 이중대립인자 A1 내지 A17중 적어도 한가지를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 단편은 적어도 15개의 뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 단편은 적어도 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 단편은 적어도 50개의 뉴클레오티드이다. 좀더 적절하게는, 단편은 적어도 100개의 뉴클레오티드이다. 다른 적절한 구체예에서, 단편은 100개이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 단편은 500개이상의 뉴클레오티드이다.
가령, CanIon 유전자 발현의 정량적 분석은 상보성 DNA 마이크로어레이로 실시할 수 있다(Schena et al.(1995 and 1996)). 전장 CanIon cDNA 또는 이의 단편은 PCR로 증폭하고, 고속 로봇공학을 이용하여 96-웰 마이크로역가 평판으로부터 실릴레이트 현미경 슬라이드로 정렬시킨다. 프린트된 어레이는 습한 체임버에서 배양하여 어레이 요소를 수화시키고 1분동안 0.2% SDS에서 1회, 1분동안 물에서 2회, 5분동안 소디움 보로하이드라이드 용액에서 1회 세척한다. 어레이는 95℃에서 2분동안 물에 담그고 1분동안 0.2% SDS로 이전하며 물로 2회 세척하고 대기 건조시키며 25℃에서 암실에 보관한다.
세포 또는 조직 mRNA는 분리하거나 또는 상업적으로 구입하고, 프로브는 1회의 역전사로 준비한다. 프로브는 60℃에서 14 x 14㎜ 유리 커브슬립하의 1㎠ 마이크로어레이에 6-12시간동안 혼성화시킨다. 어레이는 25℃에서 낮은 엄밀도 세척 완충액(1 x SSC/0.2% SDS)에 5분동안, 이후 실온에서 높은 엄밀도 세척 완충액(0.1 x SSC/0.2% SDS)에 10분동안 세척한다. 어레이는 맞춤 필터 세트를 갖춘 형광 레이저 스캐닝으로 0.1 x SSC에서 스캔한다. 정확한 특이적 발현 측정은 독립된 2회 혼성화의 비율을 평균하여 얻는다.
CanIon 유전자 발현의 정량 분석은 상보성 DNA 어레이에서 전장 CanIon cDNA 또는 이의 단편으로 실시할 수도 있다(Pietu et al.(1996)). 전장 CanIon cDNA 또는 이의 단편은 PCR 증폭하고 막에 스팟한다. 이후, 다양한 조직이나 세포로부터 기원한 mRNA는 방사성 뉴클레오티드로 표지한다. 통제된 조건하에 혼성화 및 세척이후, 혼성화된 mRNA는 포스포이미징(phosphoimaging) 또는 자가방사법으로 검출한다. 중복 실험을 실시하고, 이후 상이하게 발현된 mRNA의 정량 분석을 실시한다.
대안으로, CanIon 게놈 DNA, CanIon cDNA 또는 이의 단편을 이용한 발현 분석은 고밀도 뉴클레오티드 분석으로 실시할 수 있다(Lockhrt et al.(1996); Sosnowsky et al.(1997)). CanIon 게놈 DNA 혹은 CanIon cDNA 서열, 특히 본원 발명에 따른 이중대립인자 마커중 적어도 한가지를 포함하는 서열, 바람직하게는 A1 내지 A17에서 선택되는 이중대립인자 마커중 적어도 한가지를 포함하는 서열, 또는 이의 상보적 서열로부터 유래된 15-50개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 칩에서 직접 합성하거나(Lockhart et al. supra), 또는 합성하고 이후 칩에 어드레스한다(Sosnowski et al., supra). 적절하게는, 올리고뉴클레오티드 대략 20개의 뉴클레오티드이다.
적합한 화합물, 예를 들면 비오틴, 디곡시제닌 또는 형광 염료로 표지된 CanIon cDNA 프로브는 적합한 mRNA 개체군으로부터 합성하고, 이후 평균 50 내지 100개의 뉴클레오티드 크기로 무작위로 단편화시킨다. 그 다음, 상기 프로브는 칩에 혼성화시킨다. 세척(Lockhart et al., supra) 및 상이한 전기장의 적용(Sosnowsky et al., 1997)이후, 염료 또는 표지화 화합물은 검출하고 정량한다. 중복 혼성화를 실시하다. 상이한 cDNA 시료상의 동일한 표적 올리고뉴클레오티드에서 cDNA 프로브로부터 기원하는 신호의 비교 강도 분석은 CanIon mRNA의 상이한 발현을 암시한다.
CanIon 유전자의 발현을 저해하는 방법
본원 발명에 따른 다른 치료 조성물은 상응하는 CanIon 유전자의 발현을 저해하는 CanIon 뉴클레오티드 서열의 올리고뉴클레오티드 단편, 안티센스 또는 삼중 나선을 함유한다. CanIon 핵산 서열의 적합한 단편은 이중대립인자 마커 A1 내지 A17중 적어도 한가지의 대립유전자를 포함한다.
안티센스
본원 발명에 따른 안티센스 폴리뉴클레오티드를 이용하는데 적합한 방법은 Sczakiel et al.(1995)에서 밝힌 과정이다.
적절하게는, 안티센스는 CanIon mRNA의 5'말단에 상보적인 폴리뉴클레오티드(15-200bp)에서 선택된다. 다른 구체예에서, 원하는 표적 유전자의 상이한 부분에 상보적인 별개의 안티센스 폴리뉴클레오티드의 조합을 사용한다.
본원 발명에 따른 적절한 안티센스 폴리뉴클레오티드는 번역 개시 코돈 ATG 또는 절단접합 공여자나 수용자 부위를 보유하는 CanIon의 mRNA 서열에 상보적이다.
안티센스 핵산은 이중으로 CanIon mRNA의 발현을 저해하는데 충분한 안정성을 갖는 세포내 이중나선의 형성을 가능하게 하는 길이와 융점을 보유해야 한다. 유전자 요법에 사용하기 적합한 안티센스 핵산을 설계하는 전략은 Green et al., (1986); Izant and Weintraub, (1984)에서 개시한다.
일부 전략에서, 안티센스 분자는 프로모터와 관련하여 CanIon 코딩 영역의 배향을 역전시킴으로써 세포에서 정상적으로 전사되는 것과 반대의 가닥을 전사시켜 얻는다. 안티센스 분자는 시험관내 전사 시스템, 예를 들면 전사체를 얻기 위하여 T7 또는 SP6 중합효소를 이용하는 전사 시스템으로 전사시킬 수 있다. 다른 방식은 적합한 발현 벡터에서 안티센스 서열을 보유하는 DNA를 안티센스 서열에 동작가능하게 연결시켜 생체내에서 CanIon 안티센스 핵산을 전사시키는 것이다.
다른 적합한 안티센스 전략은 Rossi et al.(1991); 국제 특허 출원 WO 94/23026, WO 95/04141, WO 92/18522; 유럽 특허 출원 EP 0 572 287 A2에서 기술한다.
본원 발명에 활용되는 안티센스 기술에 대한 대안은 상보성 폴리뉴클레오티드를 통하여 표적 서열에 결합하고 표적 부위를 가수분해함으로써 상응하는 RNA를 절단하는 리보자임(즉, "해머헤드 리보자임")을 사용하는 것이다. 간단히 말하면, 해머헤드 리보자임의 사이클은 다음과 같이 구성된다: (1) 상보성 안티센스 서열을통하여 표적 RNA에 서열 특이적 결합; (2) 표적 가닥의 절단 모티프의 부위-특이적 가수분해; (3) 절단 산물의 방출, 이는 다른 촉매 사이클을 유발한다. 실제로, 장쇄 안티센스 폴리뉴클레오티드(적어도 30개 염기) 또는 긴 안티센스 팔을 갖는 리보자임이 효과적이다. 안티센스 리보자임에 적합한 전달 시스템은 이들 안티센스 리보자임을 지질친화성기에 공유 결합시키거나 또는 리포좀을 벡터로 이용하여 달성한다. 본원 발명에 따른 적절한 안티센스 리보자임 Sczakiel et al.(1995)에서 밝힌 바와 같이 준비한다.
삼중 나선 방법
CanIon 게놈 DNA는 세포내 삼중 나선 형성에 기초하여 CanIon 유전자의 발현을 저해하는 데에도 사용할 수 있다.
삼중 나선 올리고뉴클레오티드는 게놈으로부터 전사를 저해하는데 사용된다. 이들은 특정 유전자와 관련하여 세포 활성에서 변화를 연구하는데 특히 유용하다.
유사하게, CanIon 게놈 DNA의 일부분은 세포내에서 CanIon 전사를 저해하는 효과를 연구하는데 사용할 수 있다. 전통적으로, 호모퓨린 서열이 삼중 나전 전략에 가장 적합한 것으로 생각되었다. 하지만, 호모피리미딘 서열 역시 유전자 발현을 저해할 수 있다. 이런 호모피리미딘 올리고뉴클레오티드는 호모퓨린 : 호모피리미딘 서열에서 대홈(major groove)에 결합한다. 따라서, CanIon 게놈 DNA로부터 유래된 양 유형의 서열은 본원 발명의 범주에 포함된다.
삼중 나선을 이용한 유전자 요법 전략을 실행하기 위하여, CanIon 게놈 DNA 서열은 먼저 스캔하여 CanIon 발현을 저해하는 삼중-나선 기초한 전략에 사용할 수있는 10-mer 내지 20-mer 호모피리미딘 또는 호모퓨린 스트레치를 동정한다. 후보 호모피리미딘 또는 호모퓨린 스트레치의 동정이후, CanIon 발현을 저해하는 이들의 효능은 CanIon 유전자를 발현하는 조직 배양 세포에 후보 서열을 보유하는 다양한 함량의 올리고뉴클레오티드를 도입하여 평가한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 당업자에게 공지된 다양한 방법, 예를 들면 칼슘 포스페이트 침전, DEAE-덱스트란, 에렉트로포레이션, 리포좀-매개된 트랜스펙션 또는 자연적인 흡수로 세포에 도입할 수 있다.
처리된 세포는 노던 블랏팅, RNase 보호 분석, 또는 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 CanIon 유전자의 전사 수준을 모니터하는 PCR 기초한 전략과 같은 기술을 활용하여 변화된 세포 기능 또는 감소된 CanIon 발현을 모니터한다.
이후, 조직 배양 세포에서 유전자 발현을 저해하는데 효과적인 올리고뉴클레오티드는 안티센스에서 밝힌 바와 같이 시험관내 결과에 기초하여 계산된 용량에서 전술한 기술을 활용하여 생체내 도입할 수 있다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 단위의 천연(베타) 아노머(anomer)는 알파 아노머로 치환하여 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제에 좀더 저항하도록 할 수 있다. 이에 더하여, 브롬화에티듐 등과 같은 삽입성 물질을 알파 올리고뉴클레오티드의 3'말단에 부착하여 삼중 나선을 안정화시킬 수 있다. 삼중 나선 형성에 적합한 올리고뉴클레오티드의 발생에 관한 정보는 Griffin et al.(1989)을 참조한다.
제약학적 조성물과 제형
CanIon-조절 화합물
본원에 개시된 방법을 활용하여, 시험관내와 생체내에서 CanIon 활성을 선별적으로 조절하는 CanIon 작용물질이나 길항물질을 동정할 수 있다. 따라서, 본원 발명에는 환자에서 정신분열증, 양극성 장애, 또는 다른 전술한 질환이나 이상을 치료하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 CanIon-조절 화합물의 효과량을 투여하는 단계로 구성된다. 적절하게는, 상기 화합물은 선택성 CanIon 조절 화합물이다. 본원 발명의 방법으로 동정된 화합물에는 사람 CanIon 폴리펩티드에 결합 특이성을 갖는 항체가 포함된다. 또한, CanIon의 유사체가 정신분열증 또는 양극성 장애와 연관된 CanIon-매개된 활성 및 관련된 생리 이상을 조절하는데 효과적일 것으로 기대된다. 일반적으로, 중추신경계 질환에서 CanIon의 역할에 기초한 본원 발명의 분석 방법은 본원 발명의 분석 캐스케이드에 개입할 수 있는 화합물을 동정하는데 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 적절한 구체예에서, 정신분열증 또는 양극성 장애로 고생하는 환자는 CanIon 길항물질의 치료요법적 효과량을 함유하는 제약학적 조성물을 환자에 투여하여 치료한다.
징후
CanIon이 정신분열증 및 양극성 장애와 연관성을 보였다는 점에서, CanIon이 관련된 징후에는 중추신경계 질환이 포함될 수 있다. 신경계 질환은 복합적인 유전적 기초를 갖고 특정 증상을 공유할 것으로 예상된다. 특히, 본원에서 밝힌 바와 같이 징후에는 정신분열증과 다른 정신 질환, 신경퇴행성 질환, 기분 장애, 자폐증, 약물 의존과 알코올 중독, 간질, 통증 질환, 정신 지체 및 인식 장애, 정신장애, 불안 장애, 섭식 장애, 충동 조절 장애, 인격 장애를 비롯한 다른 정신 질환이 포함될 수 있다[Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders(DSM-Ⅳ)]. 이에 더하여, 협심증, 고혈압, 부정맥을 비롯한 다수의 심혈관 질환 역시 CanIon 조절물질, 바람직하게는 길항물질로 치료될 수 있다.
제약학적 제형 및 투여 경로
본원 발명의 방법을 이용하여 확인된 화합물은 정신분열증 또는 양극성 장애 관련된 질환을 치료 또는 완화하는 치료요법적 효과량으로 단독으로 또는 적합한 담체나 부형제와 혼합된 제약학적 조성물 형태로 사람 환자를 비롯한 포유동물에 투여할 수 있다. 치료요법적 효과량은 본원에서 밝힌 방법으로 증상의 완화를 결과하는데 충분한 화합물 함량을 의미한다. 적절하게는, 치료요법적 효과량은 지속적인 주기적 복용이나 투여에 적합하다. 본원 발명에 따른 화합물의 제형과 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences,"(Mack Publishing Co. Easton, PA) 최신판에서 알 수 있다.
투여 경로
적합한 투여 경로에는 지주막하, 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안구내 주사를 비롯하여 경구, 직장, 경점막 또는 장 투여; 근육내, 피하, 골수내 주사를 비롯한 장관외 전달이 포함된다. 중추신경계 질환을 치료하기 위한 약물을 투여하는데 특히 적합한 방법에는 이식된 펌프(Medtronic, Inc., Minneapolis, MN)를 통한 척수액으로 주입을 비롯한 지주막하 전달에서처럼 연장된 기간동안 화합물을 전달하는 장치의 외과적 이식이 포함된다.
조성물/제형
본원 발명에 사용되는 제약학적 조성물과 약물은 부형제와 보조제을 포함하는 하나 또는 복수의 생리학적으로 수용가능한 담체를 이용하여 통상적 방식으로 만들 수 있다.
주사용으로, 본원 발명의 약물은 수용액, 바람직하게는 생리학적 적합성 완충액( 예, 한크 용액, 링거 용액) 또는 생리 식염수 완충액(인산염 또는 중탄산염 완충액) 형태로 만들 수 있다. 경점막 투여를 위하여, 침투할 장벽에 적합한 침투탐상제(penetrant)가 제형으로 사용된다. 이런 침투탐상제는 당분야에 공지된 것이다.
경구로 복용할 수 있는 제약학적 제형에는 젤라틴으로 만들어진 푸시-핏 캡슐, 젤라틴으로 만들어진 연한 밀봉된 캡슐 및 가소제, 예를 들면 글리세롤이나 소비톨이 포함된다. 푸시-핏 캡슐은 락토오스와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제 및/또는 활석이나 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 선택적으로 안정제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연한 캡슐에서, 활성 성분은 적합한 액체, 예를 들면 지방산, 액체 파라 혹은 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 부유시킬 수 있다. 이에 더하여, 안정제를 첨가할 수도 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 이런 투여에 적합한 용량으로 제공한다.
협측 투여를 위하여, 조성물은 통상적 방식으로 만들어진 정제 또는 마름모꼴 정제 형태를 취할 수 있다.
흡입 투여를 위하여, 본원 발명에 따른 조성물은 적절한 가스 추진제, 예를들면 이산화탄소를 이용하여 가압된 팩 또는 흡입치료기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다. 흡입기 또는 취입기에 사용되는 예로써 젤라틴의 캡슐과 카트리지는 상기화합물 및 적합한 분말 염기, 예를 들면 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 만들 수 있다.
화합물은 주사, 예를 들면 거환 주사 또는 연속 주입에 의한 장관외 투여용으로 만들 수 있다. 주사용 제형은 단위 약형, 예를 들면 방부제가 첨가된 앰플 또는 다중-용도 용기로 제공할 수 있다. 이런 조성물은 현탁액, 용액 또는 수성 소포에 용해된 에멸젼과 같은 형태를 취하고, 부유제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제형화 약품을 함유할 수 있다.
장관외 투여용 제약학적 제형에는 가수성 형태의 활성 화합물의 수용액이 포함된다. 수성 현탁액은 현탁액을 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면 소디움 카복시메틸 셀룰로오스, 소비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 화합물의 용해도를 증가시키는 적합한 안정제 또는 약품을 함유할 수 있다.
대안으로, 활성 성분은 사용에 앞서 적합한 소포, 예를 들면 무-발열원 멸균수로 재구성되는 분말이나 동결건조된 형태일 수도 있다.
전술한 제형에 더하여, 화합물은 저장소 제형으로 만들 수도 있다. 이런 장기 제형은 이식(예, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사로 투여할 수 있다. 따라서, 이런 화합물은 중합성이나 소수성 물질(예, 오일에 용해된 에멀젼으로) 혹은 이온 교환 수지와 혼합하여, 또는 거의 불용성의 유도체, 예를 들면 거의 불용성염으로 만들 수 있다.
또한, 화합물은 지속-방출 시스템, 예를 들면 치료 약물을 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 이용하여 전달할 수 있다. 다양한 지속 방출 물질은 당분야에 공지된 것이다. 지속-방출 캡슐은 화학적 특성에 따라, 수주 내지 최대 100일동안 화합물을 방출할 수 있다.
치료 약물의 화학적 특성과 생물학적 안정도에 따라, 단백질 안정화의 추가적인 전략을 강구할 수도 있다.
제약학적 조성물은 적합한 고체나 겔 상 담체 또는 부형제를 함유할 수도 있다. 이런 담체 또는 부형제의 예에는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
효과량
본원 발명에 사용하기 적합한 제약학적 조성물에는 소요의 목적을 달성하기 위하여 효과량의 활성 성분을 함유하는 조성물이 포함된다. 좀더 구체적으로, 치료요법적 효과량은 치료된 개체의 기존 증상의 발생을 예방하거나 또는 이를 완화시키는데 효과적인 함량을 의미한다. 효과량의 결정은 당업자의 능력에 속한다.
본원 발명의 방법에 사용된 화합물에서, 치료요법적 효과량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 추정하고, 동물 모델에 1회 분량을 투여할 수 있다. 이런 정보는 사람에서 정확한 용량을 결정하는데 활용할 수 있다.
치료요법적 효과량은 환자에서 증상의 완화를 결과하는 화합물의 함량을 의미한다. 이런 화합물의 독성과 치료 효능은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준적인 제약학적 과정, 예를 들면 LD50(실험 개체군의 50%를 치사시키는 분량)과 ED50(개체군의 50%에 효과적인 분량)으로 결정할 수 있다. 독성과 치료 효능간 분량 비율은 치료지수로서, LD50과 ED50간 비율로 표시할 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물이 바람직하다.
이들 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 사람에서 사용되는 일정 범위의 용량을 확정하는데 활용할 수 있다. 적절하게는, 이런 화합물의 용량은 부작용이 거의 없으면서 ED50을 비롯한 순환 농도의 범위 이내가 된다. 이런 화합물의 용량은 이용된 약형 밑 투여 루트에 따라 상기 범위에서 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로, 용량은 환자의 조건에 비추어 개별 의사가 선택할 수 있다(Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1)
컴퓨터-관련된 구체예
"본원 발명의 핵산 코드"에는 a) SEQ ID No 1 내지 3의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 10000개 뉴클레오티드의 연속 스팬; b) SEQ ID No 4 또는 이의 보체의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 10000개 뉴클레오티드의 연속 스팬; c) SEQ ID No 1 내지 3의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 10000개 뉴클레오티드의 연속 스팬, 여기서 상기 연속 스팬은 A1 내지 A17에서 선택되는 이중대립인자 마커를 포함한다; d) SEQ ID No 6의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 또는 400개 뉴클레오티드의 연속 스팬; e) SEQ ID No 6의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 또는 400개 뉴클레오티드의 연속 스팬, 여기서 상기 연속 스팬은 이중대립인자 마커 A18을 포함한다; f) 전술한 뉴클레오티드 서열중 한가지에 상보적인 뉴클레오티드 서열.
"본원 발명의 핵산 코드"에는 또한, a) SEQ ID No 1 내지 3의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 10000개 뉴클레오티드의 연속 스팬; b) SEQ ID No 4의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 10000개 뉴클레오티드의 연속 스팬; c) SEQ ID No 6의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 또는 400개 뉴클레오티드의 연속 스팬; f) 전술한 뉴클레오티드 서열중 한가지에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 상동성 서열은 이들 연속 스팬과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% 또는 75% 상동성을 보유하는 서열을 의미한다. 상동성은 디폴트 파라미터 또는 변형된 파라미터를 갖는 BLASTN을 비롯한 본원에서 밝힌 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 상동성 서열에는 또한, 본원 발명의 핵산 코드에서 우리딘이 티미딘을 대체하는 RNA 서열이 포함된다. 본원 발명의 핵산 코드는 전통적인 단일문자 형식(Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rdedition), 또는 서열상의 뉴클레오티드를 기록하는 임의의 다른 형식이나 코드로 나타낼 수 있다.
"본원 발명의 폴리펩티드 코드"에는 SEQ ID No 5의 적어도 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, 1600 또는 1700개 아미노산의 연속 스팬이 포함된다. 적절한 구체예에서, 상기 연속 스팬은 SEQ ID No 5의 아미노산 위치 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709중 적어도 1, 2, 3, 5 또는 10개를 보유한다. 본원 발명의 폴리펩티드 코드는 전통적인 단일 문자 형식 또는 3문자 형식(Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rdedition), 또는 서열상의 폴리펩티드를 기록하는 임의의 다른 형식이나 코드로 나타낼 수 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 본원 발명의 핵산 코드와 폴리펩티드 코드는 컴퓨터로 판독하고 접근가능한 임의의 매체에서 저장, 기록, 처리할 수 있다. 본원에서, "기록"과 "저장"은 컴퓨터 매체에 정보를 저장하는 과정을 의미한다. 당업자는 본원 발명의 한가지이상 핵산 또는 한가지이상 폴리펩티드를 포함하는 제품을 산출하기 위하여 컴퓨터 판독가능 매체에 정보를 기록하는 공지된 방법중 한가지를 용이하게 채택할 수 있다. 본원 발명의 다른 측면은 본원 발명의 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 50개의 핵산 코드가 기록된 컴퓨터 판독가능 매체이다. 본원 발명의 다른 측면은 본원 발명의 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는50개의 폴리펩티드 코드가 기록된 컴퓨터 판독가능 매체이다.
컴퓨터 판독가능 매체에는 자성 판독가능 매체, 광학 판독가능 매체, 전기 판독가능 매체, 자성/광학 매체가 포함된다. 가령, 컴퓨터 판독가능 매체는 하드디스크, 플로피디스크, 자성 테이프, CD-ROM, 디지털 다기능 디스크(DVD), Random Access Memory(RAM), Read Only Memory(ROM) 및 당업자에게 공지된 다른 유형의 매체이다.
본원 발명의 구체예에는 본원에서 밝힌 서열 정보를 저장하고 처리하는 시스템, 특히 컴퓨터 시스템이 포함된다. 컴퓨터 시스템(100)의 한가지 예는 도 2의 블록 다이어그램에 도해한다. 본원에서 "컴퓨터 시스템"은 본원 발명에 따른 핵산 코드의 뉴클레오티드 서열 또는 본원 발명에 따른 폴리펩티드 코드의 아미노산 서열을 분석하는데 사용되는 하드웨어 성분, 소프트웨어 성분, 데이터 저장 성분을 의미한다. 한 구체예에서, 컴퓨터 시스템(100)은 Sun Enterprise 1000 서버(Sun Microsystems, Palo Alto, CA)이다. 적절하게는, 컴퓨터 시스템(100)은 서열 데이터의 처리, 접근, 조작을 위한 프로세스를 보유한다. 프로세스(105)는 임의의 공지된 중앙 처리 장치, 예를 들면 펜티엄 III(Intel Corporation), 또는 유사한 프로세스(Sun, Motorola, Compaq 또는 International Business Machines)일 수 있다.
적절하게는, 컴퓨터 시스템(100)은 프로세스(105), 데이터를 저장하는 하나이상의 내부 데이터 저장 성분(110), 데이터 저장 성분에 저장된 데이터를 회수하는 하나이상의 데이터 회수 장치로 구성되는 일반 목적의 시스템이다. 현재 가용한 컴퓨터 시스템중 한가지가 적합하다.
특정 구체예에서, 컴퓨터 시스템(100)은 주기억장치(115)(바람직하게는, RAM)에 연결된 버스에 연결되는 프로세스(105) 및 하나이상의 내부 데이터 저장 장치(110), 예를 들면 하드드라이브 및/또는 데이터를 기록하는 컴퓨터 판독가능 매체를 포함한다. 일부 구체예에서, 컴퓨터 시스템(100)은 데이터 저장 장치(110)에 저장된 데이터를 읽어들이는 하나이상의 데이터 회수 장치(118)를 추가로 포함한다.
데이터 회수 장치(118)는 예로써 플로피디스크, 컴팩 디스크 드라이브, 자성 테이프 드라이브 등일 수 있다. 일부 구체예에서, 내부 데이터 저장 장치(110)는 컨트롤 로직(control logic) 및/또는 여기에 기록된 데이터를 보유하는 플로피디스크, 컴팩 디스크, 자성 테이프 등과 같은 이동가능한 컴퓨터 판독가능 매체이다. 컴퓨터 시스템(100)은 데이터 회수 장치에 삽입되면 데이터 저장 성분으로부터 컨트롤 로직 및/또는 데이터를 읽어들이는 적합한 소프트웨어에 의해 프로그램될 수 있다.
컴퓨터 시스템(100)은 결과를 컴퓨터 사용자에게 전시하는데 사용되는 출력장치(120)를 포함한다. 컴퓨터 시스템(100)은 네트워크 또는 광역 네트워크에서 다른 컴퓨터 시스템(125a-c)과 연결하여 컴퓨터 시스템(100)에 집중된 접근을 제공할 수 있다.
본원 발명에 따른 핵산 코드의 뉴클레오티드 서열 또는 본원 발명에 따른 폴리펩티드 코드의 아미노산 서열에 접근하고 이를 처리하는 소프트웨어(예, 검색 도구, 비교 도구, 모델링 도구 등)는 실행동안 주메모리(115)에 존재할 수 있다.
일부 구체예에서, 컴퓨터 시스템(100)은 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 참고 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 본원 발명의 전술한 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드를 비교하는 서열비교기를 추가로 포함할 수 있다. "서열 비교기"는 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 데이터 저장 수단내에 저장된 펩티드, 펩티드모사체(peptidomimetics), 화학약물을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 다른 뉴클레오티드나 폴리펩티드 서열 및/또는 화합물을 비교하는 컴퓨터 시스템(100)에서 실행되는 한가지이상 프로그램을 의미한다. 가령, 서열 비교기는 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 본원 발명에 따른 핵산 코드의 뉴클레오티드 서열 또는 본원 발명에 따른 폴리펩티드 코드의 아미노산 서열과 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 참고 서열을 비교하여 상동성, 생물학적 기능에 관여하는 모티프, 또는 구조적 모티프를 동정할 수 있다. 본원 발명의 다양한 서열 비교 프로그램은 본원 발명에 구체적으로 정관한다.
도 3은 새로운 뉴클레오티드 또는 단백질과 데이터베이스상의 서열을 비교하여 새로운 뉴클레오티드와 데이터베이스상의 서열간 상동성 수준을 측정하는 프로세스(200)의 구체예를 도해하는 흐름도이다. 서열의 데이터베이스는 컴퓨터 시스템(100)에 저장된 개인 데이터베이스, 또는 인터넷을 통하여 입수가능한 GENBANK, PIR 또는 SWISSPROT와 같은 공공 데이터베이스일 수 있다.
프로세스(200)는 출발 단계(201)에 시작하여 단계(202)로 진행하는데, 여기서 비교되는 새로운 서열은 컴퓨터 시스템(100)의 기억장치에 저장된다. 전술한 바와 같이, 기억장치는 RAM 또는 내부 저장 장치를 비롯한 임의 유형의 기억장치일수 있다.
이후, 프로세스(200)는 단계(204)로 진행되는데, 여기서 데이터베이스에 저장된 첫 번째 서열이 컴퓨터의 기억장치로 판독된다. 그 다음, 단계(210)에서 비교가 실행되어 첫 번째 서열과 두 번째 서열이 동일한 지를 확인한다. 동일하지 않은 경우에도 2개의 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 비교하는 방법은 당업자에게 공지된 것이다. 가령, 2개의 검사 서열간 상동성 수준을 높이기 위하여 한 서열에 공백을 도입할 수 있다. 공백이나 다른 지형(feature)이 비교동안 서열에 도입되는 지를 조절하는 파라미터는 통상적으로, 컴퓨터 시스템의 사용자에 의해 입력된다.
두 서열의 비교가 단계(210)에서 실행되면, 결정 단계(210)에서 두 서열이 동일한 지에 대한 결정이 이루어진다. 물론, "동일"이라는 의미는 절대적으로 동일한 서열에 한정되지 않는다. 사용자에 의해 입력된 상동성 파라미터이내의 서열은 프로세스(200)에서 "동일"한 것으로 표시된다.
두 서열이 동일하다는 결정이 내려지면, 프로세스(200) 단계(214)로 진행하는데, 여기서 데이터베이스로부터 서열의 이름이 사용자에게 전시된다. 이 단계는 사용자에게 전시된 이름을 갖는 서열이 입력된 상동성 제한을 충족한다는 것을 알려준다. 저장된 서열의 이름이 사용자에게 전시되면, 프로세스(200)는 결정 단계(218)로 진행하는데, 여기서 더 많은 서열이 데이터베이스에 존재하는 지에 대한 결정이 이루어진다. 더 이상의 서열이 데이터베이스에 존재하지 않으면, 프로세스(200)는 최종 단계(220)에서 종결된다. 하지만, 더 많은 서열이 데이터베이스에 존재하면, 프로세스(200)는 단계(224)로 진행하고, 여기서 포인터가 데이터베이스상의 다음 서열로 이동하여 이를 상기 서열과 비교한다. 이런 방식으로, 새로운 서열은 정렬되고 데이터베이스상의 모든 서열과 비교된다.
결정 단계(212)에서 서열이 상동하지 않다는 결정이 내려지면, 프로세스(200)는 결정단계(218)로 즉시 진행하여 비교 데이터베이스에서 임의의 다른 서열이 가용한 지를 확인한다.
따라서, 본원 발명의 한 측면은 프로세스, 본원 발명의 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드가 저장된 데이터 저장 장치, 본원 발명의 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드와 비교되는 참고 뉴클레오티드 서열이나 폴리펩티드 서열이 회수가능하게 저장된 데이터 저장 장치, 비교를 실행하는 서열 비교기를 포함하는 컴퓨터 시스템이다. 서열 비교기는 비교된 서열간 상동성 수준을 지시하거나, 본원 발명의 핵산 코드와 폴리펩티드에서 생물학적 기능과 구조 모티프에 관여하는 모티프를 동정하거나, 또는 이들 핵산 코드와 폴리펩티드 코드와 비교된 서열에서 구조적 모티프를 동정할 수 있다. 일부 구체예에서, 데이터 저장 장치는 본원 발명의 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드중 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 50개의 서열을 저장할 수 있다.
본원 발명의 다른 측면은 본원 발명의 핵산 코드와 참고 뉴클레오티드 서열간 상동성 수준을 측정하는 방법인데, 상기 방법은 상동성 수준을 측정하는 컴퓨터 프로그램의 이용을 통하여 핵산 코드와 참고 뉴클레오티드 서열을 판독하고 상기 컴퓨터 프로그램으로 핵산 코드와 참고 뉴클레오티드 서열간 상동성을 측정하는 단계로 구성된다. 컴퓨터 프로그램은 디폴트 파라미터 또는 변형된 파라미터를 갖는 BLAST2N과 같은 본원에 명시된 프로그램을 비롯하여 상동성 수준을 측정하는 다수의 컴퓨터 프로그램중한가지일 수 있다. 상기 방법은 전술한 컴퓨터 시스템을 이용하여 실행할 수 있다. 또한, 상기 방법은 컴퓨터 프로그램의 이용을 통하여 본원 발명의 전술한 핵산 코드중 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 50개를 판독하고 핵산 코드와 참고 뉴클레오티드 서열간 상동성을 측정하여 실행할 수 있다.
도 4는 두 서열이 상동한 지를 확인하기 위한 프로세스(250)의 구체예를 예시하는 흐름도이다. 프로세스(250)는 출발 단계(252)에서 시작하여 단계(254)로 진행하고, 여기서 비교되는 첫 번째 서열은 기억장치에 저장된다. 이후, 비교되는 두 번째 서열이 단계(256)에서 기억장치에 저장된다. 그 다음, 프로세스(250)는 단계(260)로 진행하고, 여기서 첫 번째 서열에서 첫 번째 문자가 판독되고, 이후 단계(262)로 진행하고, 여기서 두 번째 서열에서 첫 번째 문자가 판독된다. 서열이 뉴클레오티드 서열이면 문자는 A, T, C, G(또는 U)가 된다. 서열이 단백질 서열이면 이는 단일 문자 아미노산 코드가 되고, 따라서 첫 번째 서열과 두 번째 서열은 용이하게 비교할 수 있다.
결정 단계(264)에서 두 문자가 동일한 지에 대한 결정이 이루어진다. 이들이 동일하면 프로세스(250)는 단계(268)로 진행하는데, 여기서 첫 번째 서열과 두 번째 서열에서 다음 문자가 판독된다. 다음 문자가 동일한 지에 대한 결정이 이루어진다. 이들이 동일하면 프로세스(250)는 두 문자가 동일하지 않을 때까지 이런 순환(loop)을 지속한다. 다음의 두 문자가 동일하지 않다는 결정이 내려지면, 프로세스(250)는 결정 단계(274)로 진행하고 판독할 더 많은 문자 또는 서열이 존재하는 지를 확인한다.
판독할 문자가 더 이상 존재하지 않으면 프로세스(250)는 단계(276)로 진행하는데, 여기서 첫 번째 서열과 두 번째 서열간 상동성 수준이 사용자에게 전시된다. 상동성 수준은 첫 번째 서열에서 전체 서열중 동일한 서열간 문자의 비율을 계산하여 측정한다. 따라서, 첫 100개의 뉴클레오티드 서열에서 모든 문자가 두 번째 서열에서 모든 문자와 정렬되면, 상동성 수준은 100%가 된다.
대안으로, 컴퓨터 프로그램은 본원 발명에 따른 핵산 코드의 뉴클레오티드 서열과 참고 뉴클레오티드 서열을 비교하여 하나이상의 위치에서 본원 발명의 핵산 코드가 참고핵산 서열과 구별되는 지를 확인하는 컴퓨터 프로그램일 수 있다. 선택적으로, 이런 프로그램은 참고 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 본원 발명의 핵산 코드에 대하여 삽입된, 결실된 또는 치환된 뉴클레오티드의 길이와 실체를 기록한다. 한 구체예에서, 컴퓨터 프로그램은 본원 발명에 따른 핵산 코드의 뉴클레오티드 서열이 참고 뉴클레오티드 서열과 비교하여 한가지이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 보유하는 지를 확인하는 프로그램일 수 있다. 이들 단일 뉴클레오티드 다형성은 각각 단일 염기 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다.
본원 발명의 다른 측면은 본원 발명의 폴리펩티드 코드와 참고 폴리펩티드 서열간 상동성 수준을 측정하는 방법인데, 상기 방법은 상동성 수준을 측정하는 컴퓨터 프로그램의 이용을 통하여 본원 발명의 폴리펩티드 코드와 참고 폴리펩티드 서열을 판독하고 상기 컴퓨터 프로그램으로 폴리펩티드 코드와 참고 폴리펩티드 서열간 상동성을 측정하는 단계로 구성된다.
따라서, 본원 발명의 다른 측면은 본원 발명의 핵산 코드가 한 개이상의 뉴클레오티드에서 참고 뉴클레오티드 서열과 구별되는 지를 확인하는 방법인데, 상기 방법은 핵산 서열간 차이를 확인하는 컴퓨터 프로그램의 이용을 통하여 핵산 코드와 참고 뉴클레오티드 서열을 판독하고 상기 컴퓨터 프로그램으로 핵산 코드와 참고 뉴클레오티드 서열간 차이를 확인하는 단계로 구성된다. 일부 구체예에서, 컴퓨터 프로그램은 단일 뉴클레오티드 다형성을 동정하는 프로그램이다. 상기 방법은 전술한 컴퓨터 시스템 및 도 4에 예시된 방법으로 실행할 수 있다. 또한, 상기 방법은 컴퓨터 프로그램의 이용을 통하여 본원 발명의 전술한 핵산 코드중 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 50개 및 참고 뉴클레오티드 서열을 판독하고 상기 컴퓨터 프로그램으로 핵산 코드와 참고 뉴클레오티드 서열간 차이를 동정하여 실행할 수 있다.
다른 구체예에서, 컴퓨터 기초한 시스템은 본원 발명에 따른 핵산 코드의 뉴클레오티드 서열 또는 본원 발명에 따른 폴리펩티드 코드의 아미노산 서열내에서 지형(feature)를 동정하는 식별기(identifier)를 추가로 포함한다.
"식별기"는 본원 발명에 따른 핵산 코드의 뉴클레오티드 서열 또는 본원 발명에 따른 폴리펩티드 코드의 아미노산 서열내에서 지형을 동정하는 한가지이상의 프로그램을 의미한다. 한 구체예에서, 식별기는 본원 발명의 cDNA 코드에서 개방해독틀을 동정하는 프로그램을 포함할 수 있다.
도 5는 서열에서 지형의 존재를 검출하기 위한 식별기 프로세스(300)의 구체예를 도해하는 흐름도이다. 프로세스(300)는 출발 단계(300)에서 시작하고 단계(304)로 진행되는데, 여기서 지형을 조사받은 첫 번째 서열은 컴퓨터 시스템(100)에서 기억장치(115)에 저장된다. 이후, 프로세스(300)는 단계(306)로 진행하는데, 여기서 서열 지형의 데이터베이스가 개방된다. 이런 데이터베이스는 각 지형의 이름과 속성의 목록을 포함한다. 가령, 지형 이름은 "개시 코돈"이고 속성은 "ATG"일 수 있다. 다른 예에서 지형 이름은 "TAATAA Box"이고 속성은 "TAATAA"이다. 이런 데이터베이스의 예는 University of Winsconsin Genetics Computer Group(www.gcg.com)에 의해 만들어진다.
지형의 데이터베이스가 단계(306)에서 개방되면 프로세스(300)는 단계(308)로 진행하는데, 여기서 첫 번째 지형이 데이터베이스로부터 판독된다. 이후, 첫 번째 지형의 속성과 첫 번째 서열의 비교는 단계(310)에서 진행된다. 그 다음, 결정 단계(316)에서 지형의 속성이 첫 번째 서열에서 발견되는 지에 대한 결정이 이루어진다. 속성이 발견되면 프로세스(300)는 단계(318)로 진행되는데, 여기서 상기 지형의 이름이 사용자에게 전시된다.
이후, 프로세스(300)는 결정 단계(320)로 진행하는데, 여기서 이동 지형(move feature)이 데이터베이스에 존재하는 지에 대한 결정이 이루어진다. 더 이상의 지형이 존재하지 않으면 프로세스(300)는 최종 단계(324)에서 종결된다. 하지만, 데이터베이스에 더 많은 지형이 존재하면 프로세스(300)는 단계(236)에서 다음 서열 지형을 판독하고 단계(310)로 복귀하는데, 여기서 다음 지형의 속성이 첫 번째 서열과 비교된다.
결정 단계(316)에서 지형 속성이 첫 번째 서열에서 발견되지 않으면 프로세스(300)는 결정 단계(320)로 직접 진행되고 데이터베이스에 더 많은 지형이 존재하는 지를 확인한다.
다른 구체예에서, 식별기는 본원 발명에 따른 폴리펩티드 코드의 3차원 구조를 측정하는 분자 모델링 프로그램을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 분자 모델링 프로그램은 공지된 3차원 단백질 구조에서 잔기의 구조적 환경을 나타내는 프로필과 가장 일치하는 표적서열을 동정한다(미국 특허 5,436,850). 다른 기술에서, 일정한 가계에서 단백질의 공지된 3차원 구조는 중첩되고, 따라서 상기 가계에서 구조적으로 보존된 영역을 정의한다. 또한, 이런 단백질 모델링 기술에서는 본원 발명에 따른 폴리펩티드 코드의 구조를 근사하는 상동성 단백질의 공지된 3차원 구조를 이용한다(미국 특허 5,557,535). 전통적인 상동성 모델링 기술은 통상적으로, 프로테아제와 항체의 모델을 확립하는데 사용되고 있다(Sowdhamini et al.,(1997)). 또한, 관심있는 단백질이 주형 단백질과 빈약한 서열 상동성을 갖는 경우에는 비교 방식으로 3차원 단백질 모델을 개발할 수 있다. 일부 경우에, 단백질은 매우 약한 서열 상동성에도 불구하고 유사한 3차원 구조로 접힌다. 가령, 많은 나선 사이토킨의 3차원 구조는 약한 서열 상동성에도 불구하고 유사한 3차원 형상(topology)으로 접힌다.
최근 스레딩(threading) 방법의 개발로 표적과 주형간 구조적 관계성(relatedness)이 서열 수준에서는 전혀 검출되지 않는 많은 경우에 유사한 접힙(folding) 패턴의 동정이 가능해졌다. Multiple Sequence Threading(MST)으로폴드(fold) 인식을 실시하는 하이브리드 방법에서 구조적 등가는 낮은 분석능 모델을 구성하는 거리 기하(distance geometry) 프로그램 DRAGON을 이용하여 스레딩 출력으로 추론하고, 전체-원자 표현은 분자 모델링 패키지, 예를 들면 QUANTA를 이용하여 구성한다.
3단계 방식에 따라, 후보 주형은 먼저 새로운 폴드 인식 프로그램 MST로 동정하는데, 상기 프로그램은 하나이상의 3-D 구조에서 다중 정렬된 서열의 동시 스레딩을 실행할 수 있다. 두 번째 단계에서, MST 출력으로부터 얻은 구조적 등가는 잔기간 거리 제한(interresidue distance restraint)으로 전환시키고 이차 구조 예측으로부터 얻은 부가적인 정보와 함께 거리 기하 프로그램 DRAGON에 넣는다. 상기 프로그램은 공평한 방식으로 제한을 통합하고 다수의 저 분석능 모델 확증을 산출한다. 세 번째 단계에서, 이들 저 분석능 모델 확증은 전체-원자 모델로 전환시키고 분자 모델링 패키지 QUANTA를 이용하여 에너지 최소화시킨다(Aszodi et al.,(1997)).
이후, 분자 모델링 분석의 결과는 본원 발명에 따른 폴리펩티드 코드의 활성을 조절하는 작용제를 동정하는 합리적 약물 설계 기술에 활용할 수 있다.
따라서, 본원 발명의 다른 측면은 본원 발명의 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드내에서 지형(feature)을 동정하는 방법인데, 상기 방법은 지형을 동정하는 컴퓨터 프로그램의 이용을 통하여 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드를 판독하고 상기 컴퓨터 프로그램으로 핵산 코드와 폴리펩티드 코드내에서 지형을 동정하는 단계로 구성된다. 한 구체예에서, 컴퓨터 프로그램은 개방해독틀을 동정하는 컴퓨터 프로그램이다. 다른 구체예에서, 컴퓨터 프로그램은 폴리펩티드 서열에서 구조 모티프를 동정한다. 또 다른 구체예에서, 컴퓨터 프로그램은 분자 모델링 프로그램이다. 상기 방법은 컴퓨터 프로그램의 이용을 통하여 단일 서열, 또는 본원 발명의 전술한 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드중 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50개를 판독하고 상기 컴퓨터 프로그램으로 핵산 코드와 폴리펩티드 코드내에서 지형을 동정하여 실행할 수 있다.
본원 발명의 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드는 다양한 데이터 프로세서 프로그램에서 다양한 포맷으로 저장 및 조작할 수 있다. 가령, 이들은 워드 프로세서, 예를 들면 마이크로소프트 워드나 워드퍼펙트에서 문서 파일로, 또는 당업자에게 익숙한 다양한 프로그램, 예를 들면 DB2, SYBASE 혹은 ORACLE에서 ASCII 파일로 저장될 수 있다. 이에 더하여, 많은 컴퓨터 프로그램과 데이터베이스가 서열 비교기, 식별기, 또는 본원 발명에 따른 핵산 코드나 폴리펩티드 코드와 비교되는 참고 뉴클레오티드나 폴리펩티드 서열의 출처로 이용될 수 있다. 다음의 리스트는 본원 발명에 따른 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드에 유용한 프로그램과 데이터베이스에 대한 안내를 제공하지만 본원 발명을 제한하지 않는다: MacPattern(EMBL), DiscoveryBase(Molecular Applications Group), GeneMine(Molecular Applications Group), Look(Molecular Applications Group), MacLook(Molecular Applications Group), BLAST와 BLAST2(NCBI), BLASTN와 BLASTX(Altschul et al, 1990), FASTA(Pearson and Lipman, 1988), FASTDB(Brutlag et al., 1990), Catalyst(Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE(Molecular SimulationsInc.), Cerius2.DBAccess(Molecular Simulations Inc.), HypoGen(Molecular Simulations Inc.), Insight II(Molecular Simulations Inc.), Discover(Molecular Simulations Inc.), CHARMm(Molecular Simulations Inc.), Felix(Molecular Simulations Inc.), DelPhi(Molecular Simulations Inc.), QuanteMM(Molecular Simulations Inc.), Homology(Molecular Simulations Inc.), Modeler(Molecular Simulations Inc.), ISIS(Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design(Molecular Simulations Inc.), WebLab(Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer(Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer(Molecular Simulations Inc.), SeqFold(Molecular Simulations Inc.), the EMBL/Swissprotein 데이터베이스, MDL Available Chemicals Directory 데이터베이스, MDL Drug Data Report 데이터베이스, Comprehensive Medicinal Chemistry 데이터베이스, Derwents's World Drug Index 데이터베이스, BioByteMasterFile 데이터베이스, Genbank 데이터베이스, Genseqn 데이터베이스. 본원의 개시를 고려하면, 많은 다른 프로그램과 데이터베이스는 당업자에게 자명하다.
상기 프로그램으로 검출할 수 있는 모티프에는 루이신 지퍼(zoppers), 나선-회전-나선 모티프, 당화 부위, 유비퀴틴화 부위, 알파 나선, 베타 시트를 인코드하는 서열; 인코드된 단백질의 분비를 지시하는 신호 펩티드를 인코드하는 신호 서열; 호메오박스(homeobox), 산성 스트레치(acidic stretch), 효소 활성 부위, 기질 결합 부위, 효소 절단 부위와 같은 전사 조절에 관여하는 서열이 포함된다.
본원에서, 다양한 간행물, 문헌, 공개된 특허 출원이 언급되었다. 이들 간행물, 특허, 공개된 특허 출원은 본원에 순전히 참고로 한다.
실시예 1: 이중대립인자 마커의 동정 - DNA 추출
공여자는 무관하고 건강하였다. 이들은 프랑스의 이질성 개체군을 대표할 만큼 충분한 다양성을 제공하였다. 100명의 개체로부터 DNA를 추출하고 이중대립인자 마커의 검출을 검사하였다.
30 ㎖ 말초 정맥혈은 EDTA의 존재하에 각 공여자로부터 채취한다. 세포(펠렛)는 2000 rpm에서 10분동안 원심분리후 수거한다. 적혈구 세포는 세포용해 용액(50 ㎖ 최종 부피: 10 mM Tris pH 7.6; 5 mM MgCl2; 10 mM NaCl)으로 용해시킨다. 세포용해 용액에 펠렛의 재부유후, 상기 용액은 상층액에 존재하는 잔류 적혈구를 제거하는데 필요한 회수로 원심분리(10 분, 2000 rpm)한다.
백혈구의 펠렛은 다음과 같이 구성되는 3.7 ㎖ 세포용해 용액으로 42℃에서 하룻밤동안 용해시킨다:
- 3 ㎖ TE 10-2(Tris-HCl 10 mM, EDTA 2 mM)/NaCl 0.4 M
- 200 ㎕ SDS 10%
- 500 ㎕ K-단백질분해효소(2 mg K-단백질분해효소/TE 10-2/NaCl 0.4 M)
단백질 추출을 위하여, 1 ㎖ 포화된 NaCl(6M)(1/3.5 v/v)를 첨가한다. 활발한 교반후, 용액은 10000 rpm에서 20분동안 원심분리한다.
DNA의 침전을 위하여, 2 내지 부피의 100% 에탄올을 상기 상층액에 첨가하고, 용액은 2000 rpm에서 30분동안 원심분리한다. DNA 용액은 70% 에탄올로 3회 세척하여 염을 제거하고 2000 rpm에서 20분동안 원심분리한다. 펠렛은 37℃에서 건조시키고 1 ㎖ TE 10-1 또는 1 ㎖ 물에 재부유시킨다. DNA 농도는 260 nm에서 OD를 측정하여 평가한다(1 단위 OD = 50 ㎍/㎖ DNA).
DNA 용액에서 단백질의 존재를 확인하기 위하여, OD 260/OD 280 비율을 측정한다. 1.8 내지 2의 OD 260/OD 280 비율을 갖는 DNA 제형만 하기 실시예에 사용한다.
풀(pooi)은 각 개체로부터 얻은 DNA의 등량을 혼합하여 구성한다.
실시예 2: 이중대립인자 마커의 동정: PCR에 의한 게놈 DNA의 증폭
실시예 1의 DNA 시료에서 특정 게놈 서열의 증폭은 앞서 수득된 DNA 풀(pool)에서 실시하였다. 이에 더하여, 50개의 개별 시료를 유사하게 증폭하였다.
PCR 분석은 다음의 프로토콜을 이용하여 실시한다:
최종 부피 25㎕
DNA 2 ng/㎕
MgCl2 2 mM
dNTP(각각) 200 μM
프라이머(각각) 2.9 ng/㎕
Ampli Taq Gold DNA 폴리머라제 0.05 unit/㎕
PCR 완충액(10x = 0.1 M TrisHCl pH 8.3 0.5M KCl)1x
첫 번째 프라이머의 각 쌍은 본원에 개시된 CanIon 유전자의 서열 정보 및 OSP 소프트웨어(Hilier & Green, 1991)를 이용하여 설계되었다. 프라이머의 첫 번째 쌍은 길이가 대략 20개 뉴클레오티드이고 표 1에서 PU와 RP로 분류된 칼럼에 개시된 서열을 갖는다.
표 1:
적절하게는, 프라이머는 서열분석에 사용되고 증폭을 목표로 하는 특정 염기의 상류에서 공통 올리고뉴클레오티드 꼬리를 보유한다.
프라이머 PU는 다음의 추가적인 PU 5' 서열: TGTAAAACGACGGCCAGT를 보유한다; 프라이머 RP는 다음의 RP 5' 서열: CAGGAAACAGCTATGACC를 보유한다. 추가적인 PU 5' 서열을 보유하는 프라이머는 SEQ ID No 7에 기술한다. 추가적인 RP 5' 서열을 보유하는 프라이머는 SEQ ID No 8에 기술한다.
이들 프라이머의 합성은 다음의 GENSET UFPS 24.1 서열합성장치에서 포스포르아미디트(phosphoramidite) 방법에 따라 실시한다.
DNA 증폭은 Genius II 서열증폭기에서 실시한다. 95℃에서 10분동안 가열한 이후, 40회 실시한다. 각 사이클은 다음과 같이 구성된다:95℃에서 30초, 54℃에서 1분, 72℃에서 30초. 최종 신장을 위하여, 72℃에서 10분으로 증폭을 종결시킨다. 수득된 증폭 산물의 함량은 형광계 및 개재제(intercalant agent) Picogreen(Molecular Probes)을 이용하여 96-웰 마이크로역가 평판에서 측정한다.
실시예 3: 이중대립인자 마커의 동정 - 증폭된 게놈 DNA의 서열분석 및 다형성의 확인
실시예 2에서 증폭된 DNA의 서열분석은 ABI 서열분석기에서 실시한다. 증폭 산물의 서열은 염료 종결기 사이클 서열분석 프로토콜(dye terminator cycle sequencing protocol)을 이용한 자동화 디데옥시 종결기 염기서열 반응으로 측정한다. 이런 염기서열 반응의 산물은 서열분석 겔에서 이동시키고, 서열은 겔 영상 분석(ABI Prism DNA 서열분석 소프트웨어(2.1.2))으로 확인한다.
서열 데이터는 추가로 평가하여 증폭된 단편내에 이중대립인자 마커의 존재를 검출한다. 다형성 검색은 전술한 바와 같이 동일한 위치에서 발생하는 상이한 염기에 기인하는 전기영동 패턴에서 중첩된 피크의 존재의 기초한다.
17개의 증폭 단편에서, 18개의 이중대립인자 마커가 검출되었다. 이들 이중대립인자 마커의 위치는 표 2에 도시한다.
표 2:
BM은 "이중대립인자 마커"를 의미한다. all1과 all2는 각각, 이중대립인자 마커의 대립유전자 1과 대립유전자 2를 의미한다.
표 3:
실시예 4: 마이크로서열분석을 통한 다형성의 검증
실시예 3에서 확인된 이중대립인자 마커는 추가로 확인하고, 이들 각각의 빈도는 마이크로서열분석으로 측정한다. 마이크로서열분석은 실시예 1에서 밝힌 각개별 DNA 시료에 대하여 실시한다.
개체의 게놈 DNA로부터 증폭은 동일한 세트의 PCR 프라이머(표 1)를 이용하여 이중대립인자 마커의 검출에서 전술한 바와 같은 PCR로 실시한다.
마이크로서열분석에 적합한 프라이머는 길이가 대략 19개 뉴클레오티드이고 고려된 다형적 염기의 바로 상류와 혼성화된다. 본원 발명에 따라 마이크로서열분석에 사용되는 프라이머는 표 4에 상세하게 기술한다.
표 4:
Mis1과 Mis2는 각각, CanIon 유전자의 비-코딩 가닥 또는 CanIon 유전자의 코딩 가닥과 혼성화되는 마이크로서열분석 프라이머를 의미한다.
마이크로염기서열 반응은 다음과 같이 실시한다:
증폭 산물의 정제이후, 마이크로서열분석 반응 혼합물은 제조업자의 권고에따라, 10 pmol 형광서열분석 올리고뉴클레오티드, 1U Thermosequenase(Amersham E79000G), 1.25㎕ Thermosequenase 완충액(260 mM Tris HCl pH 9.5, 65 mM MgCl2) 및 사용된 각 이중대립인자 마커의 다형적 위치에서 뉴클레오티드에 상보적인 2개의 적합한 형광 ddNTP(Perkin Elmer, Dye Terminator Set 401095)을 20 ㎕ 최종 부피로 첨가한다. 94℃에서 4분후, Tetrad PTC-225 서열증폭기(MJ Research)에서 55℃에서 15초, 72℃에서 5초, 94℃에서 10초의 PCR 사이클을 20회 실시한다. 이후, 통합되지 않은 염료 종료기는 에탄올 침전으로 제거한다. 시료는 포름아마이드-EDTA 적하 완충액에서 최종적으로 재부유시키고, 95℃에서 2분동안 가열한 이후 폴리아크릴아마이드 서열분석 겔에 적하시킨다. 데이터는 ABI PRISM 377 DNA 서열분석기로 수집하고 CanIonScan 소프트웨어(Perkin Elmer)로 처리한다.
겔 분석이후, 데이터는 각 증폭된 단편에 존재하는 이중대립인자 마커의 대립유전자 확인을 가능하게 하는 소프트웨어로 자동 처리한다.
상기 소프트웨어는 상기 마이크로서열분석 과정으로부터 기인한 신호의 강도가 약한지, 정상인지 또는 충만한지, 또는 이런 신호가 불명확한지와 같은 요인을 평가한다. 이에 더하여, 상기 소프트웨어는 현저한 피크를 확인한다(형태와 높이 기준에 따라). 현저한 피크중에서, 표적 부위에 상응하는 피크는 위치에 기초하여 확인한다. 2개의 현저한 피크가 동일한 위치에서 검출되면, 각 시료는 높이비(height ratio)에 기초하여 동질성 또는 이질성 유형으로 분류한다.
실시예 5
CanIon 단백질에 대한 항체 조성물의 제조
실질적으로 순수한 단백질 또는 펩티드는 CanIon 단백질이나 이의 일부를 인코드하는 발현 벡터를 포함하는 트랜스펙션 또는 형질전환된 세포로부터 분리된다. 최종 제형에서 단백질의 농도는 예로써 Amicon 필터 장치에서 농축하여 수 ㎎/㎖ 수준까지 조정한다. 이후, 상기 단백질에 대한 단클론이나 다클론 항체는 다음과 같이 만들 수 있다.
A. 하이브리도마 융합체에 의한 단클론 항체 생산
CanIon 단백질이나 이의 일부에 대한 단클론 항체는 Kohler, G. and Milstein, C.,(1975)의 전형적 방법 또는 이의 변형 방법에 따라 뮤린 하이브리도마로부터 만들 수 있다(Harlow, E. and D. Lane. 1988 참조).
간단히 말하면, 생쥐는 수주동안 수 ㎎의 CanIon 단백질이나 이의 일부분을 반복적으로 접종한다. 이후, 생쥐는 죽이고, 비장의 항체 생산 세포를 분리한다. 비장 세포는 폴리에틸렌 글리콜로 골수종 세포와 융합시키고, 과량의 융합되지 않은 세포는 아미노프테린을 함유하는 선택 배지(HAT 배지)에 성장시켜 파괴시킨다. 성공적으로 융합된 세포는 희석하고, 희석액 일부는 마이크로역가 평판의 웰에 도말하는데, 여기서 배양액의 성장이 지속된다. 항체-생산 클론은 면역분석 과정, 예를 들면 ELISA(Engvall,(1980)) 및 이의 변형 방법으로 웰의 상등액에서 항체의 검출로 동정한다. 선별된 양성 클론은 증폭시키고, 이들의 단클론 항체 산물은 수거한다. 단클론 항체 생산의 상세한 과정은 Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2에서 기술한다.
B. 면역화에 의한 다클론 항체 생산
CanIon 단백질이나 이의 일부분에서 이질성 에피토프에 대한 항체를 포함하는 다클론 항혈청은 적합한 사람제외 동물을 CanIon 단백질이나 이의 일부분으로 면역화시켜 만들 수 있는데, 이는 면역원성을 강화시키기 위하여 변화시키거나 또는 변화시키지 않을 수 있다. 적절하게는, 사람제외 동물은 생쥐, 쥐, 토끼, 염소 또는 말에서 선택되는 사람제외 포유동물이다. 대안으로, CanIon 농도가 짙은 정제되지 않은 제형이 항체를 만드는데 사용될 수 있다. 이런 단백질, 단편 또는 제형은 당분야에 공지된 적합한 어쥬번트(예, 수산화알루미늄, RIBI 등)의 존재하에 사람제외 포유동물에 도입한다. 이에 더하여, 이런 단백질, 단편 또는 제형은 항원성을 증가시키는 약품으로 사전처리할 수 있는데, 이런 약품은 당업자에게 공지된 것으로, 여기에는 메틸화된 소 혈청 알부민(mBSA), 소 혈청 알부민(BSA), B형 간염 표면 항원, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 등이 포함된다. 면역된 동물로부터 얻은 혈청은 공지된 과정에 따라 수거하고 처리하며 검사한다. 이런 혈청이 원치 않는 에피토프에 대한 다클론 항체를 함유하면, 다클론 항체는 면역친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다.
효과적인 다클론 항체 생산은 항원과 숙주 종류 모두에 관련된 다수 인자의 영향을 받는다. 또한, 숙주 동물은 접종 부위와 용량에 대하여 상이한 반응을 보이는데, 부족한 또는 과도한 용량의 항원은 저 역가 항혈청을 초래한다. 다수의 피내 부위에 투여된 소량(ng 수준)의 항원이 가장 안전한 것으로 생각된다. 다클론 항혈청을 생산하고 처리하는 기술은 당분야에 공지된 것이다(Mayer andWalker(1987)). 토끼에 대하여 효과적인 면역화 프로토콜은 Vaitukaitis, J. et al.(1971)에서 확인할 수 있다.
효능 촉진 주사는 정기적인 간격으로 제공하고, 항혈청은 예로써 공지된 농도의 항원에 대한 아가에서 이중 면역확산으로 반-정량적으로 측정하는 경우에 항체 역가 감소하기 시작하면 수거한다(Ouchterlony, O. et al.(1973)). 항체의 고원기 농도는 일반적으로 혈청 ㎖당 0.1 내지 0.2㎎(대략 12μM)이다. 항원에 대한 항혈청의 친화성은 경합 결합 곡선을 작성하여 확인한다(Fisher, D.,(1980))
단클론이나 다클론 프로토콜에 따라 만들어진 항체 제형은 생물 시료에서 항원-보유 물질의 농도를 측정하는 정량적 면역분석에 유용하다; 또한, 이들은 생물 시료에서 항원의 존재를 정성적으로 또는 정량적으로 확인하는데 사용된다. 이들 항체는 상기 단백질을 발현하는 세포를 죽이거나 또는 체내에서 상기 단백질의 수준을 감소시키는 치료 조성물에 사용할 수도 있다.
본원 발명의 적절한 구체예를 예시하였지만, 본원 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 다양한 개변이 당업자에 의해 진행될 수 있다.
참고문헌
Abbondanzo SJ et al., 1993, Methods in Enzymology, Academic Press, New York, pp 803-823
Ajioka R.S. et al.,Am. J. Hum. genet., 60:1439-1447, 1997
Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410
Altschul et al., 1993, Nature genetics 3:266-272
Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402
Ames, R.S. et al. J. Immunol. Methods 184:177-186(1995)
anderson et al., Symp. Soc. Exp. Biol. 48: 85-97 (1994)
Anton M. et al., 1995, J. Virol., 69 : 4600-4606
Araki K et al. (1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92(1):160-4.
Ashkenazi, A. et al. PNAS 88:10535-10539(1991)
Asz di et al., Proteins: Structure, Function, and genetics, Supplement 1:38-42 (1997)
Ausubel et al. (1989)Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.
Bartunek, P. et al. Cytokine 8(1):14-20 (1996)
Baubonis W. (1993)Nucleic Acids Res. 21(9):2025-9.
Beaucage et al.,Tetrahedron Lett1981, 22: 1859-1862
Better, M. et al. Science 240:1041-1043(1988)
Blouin JL et al. Nature genetics, 20: 70-73 (1998)
Bradley A., 1987, Production and analysis of chimaeric mice.In: E.J. Robertson (Ed.), Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach. IRL Press, Oxford, pp.113.
Bram RJ et al., 1993, Mol. Cell Biol., 13 : 4760-4769
Brinkman U. et al. J. Immunol. Methods 182:41-50(1995)
Brown EL, Belagaje R, Ryan MJ, Khorana HG,Methods Enzymol1979;68:109-151
Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990
Brzustowicz et al., Am. J. Hum. genet. 65:1096-1103 (1999)
Bulman et al., Hum. Mol. Gen. 6(10) 1679-1685 (1997)
Burton, D.R. et al. Advances in Immunology 57:191-280(1994)
Bush et al., 1997, J. Chromatogr., 777 : 311-328.
Carlson, N.G. et al. J. Biol. Chem. 272(17):11295-11301(1997)
Chai H. et al. (1993)Biotechnol. Appl. Biochem.18:259-273.
Chee et al. (1996)Science.274:610-614.
Chen 및 KwokNucleic Acids Research25:347-353 1997
Chen et al. (1987)Mol. Cell. Biol.7:2745-2752.
Chen et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA94/20 10756-10761,1997
Chen, Z. et al. Cancer Res. 58(16): 3668-3678(1998)
Cho RJ et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(7) : 3752-3757.
Chou J.Y., 1989, Mol. Endocrinol., 3: 1511-1514.
Clark A.G. (1990)Mol. Biol. Evol.7:111-122.
Coles R, Caswell R, Rubinsztein DC,Hum Mol genet1998;7:791-800
Compton J. (1991)Nature. 350(6313):91-92.
Davis L.G., M.D. Dibner, and J.F. Battey, Basic Methods in MolecularBiology, ed., Elsevier Press, NY, 1986
Dempster et al., (1977)J. R. Stat. Soc.,39B:1-38.
Deng, B. et al. Blood 92(6): 1981-1988(1998)
Dent DS & Latchman DS (1993) The DNA mobility shift assay. In:Transcription Factors: A Practical Approach(Latchman DS, ed.) pp1-26. Oxford: IRL Press
Denyer et al.,Drug Disc. Today 3(7): 323-332 (1998
Eckner R. et al. (1991)EMBO J.10:3513-3522.
Edwards et Leatherbarrow,Analytical Biochemistry, 246, 1-6 (1997)
Engvall, E., Meth. Enzymol. 70:419 (1980)
Excoffier L. and Slatkin M. (1995)Mol. Biol. Evol.,12(5): 921-927.
Feldman and Steg, 1996, Medecine/Sciences, synthese, 12:47-55
Felici F., 1991, J. Mol. Biol., Vol. 222:301-310
Fell, H.P. et al. J. Immunol. 146:2446-2452(1991)
Fields and Song, 1989, Nature, 340 : 245-246
Fisher, D., Chap. 42 in: Manual of Clinical Immunology, 2d Ed. (Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980)
Flotte et al. (1992)Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356.
Fodor et al. (1991)Science251:767-777.
Fraley et al. (1979)Proc. Natl. Acad. Sci. USA.76:3348-3352.
Fried M, Crothers DM,Nucleic Acids Res1981;9:6505-6525
Fromont-Racine M. et al., 1997, Nature genetics, 16(3) : 277-282.
Fuller S. A. et al. (1996)Immunology in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al.Eds, John Wiley & Sons, Inc., USA.
Furth P.A. et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci USA.91:9302-9306.
Garner MM, Revzin A,Nucleic Acids Res1981;9:3047-3060
Geysen H. Mario et al. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3998-4002
Ghosh and Bacchawat, 1991,Targeting of liposomes to hepatocytes, IN:Liver Diseases, Targeted diagnosis 및 therapy using specific receptors and ligands. Wu et al. Eds., Marcel Dekeker, New York, pp. 87-104.
Gillies, S.D. et al. J. Immunol. Methods 125:191-202(1989)
Gillies, S.O. et al. PNAS 89:1428-1432(1992)
Gonnet et al., 1992, Science 256:1443-1445
Gonzalez et al., Drug Disc. Today 4(9): 431:439 (1999)
Gopal (1985)Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190.
Gossen M. et al. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA.89:5547-5551.
Gossen M. et al. (1995)Science. 268:1766-1769.
Graham et al. (1973)Virology52:456-457.
Green et al.,Ann. Rev. Biochem. 55:569-597 (1986)
Greenspan and Bona, FASEB J. 7(5):437-444 (1989)
Griffin et al.Science245:967-971 (1989)
Grompe, M. (1993)Nature genetics.5:111-117.
Grompe, M. et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86:5855-5892.
Gu H. et al. (1993)Cell73:1155-1164.
Gu H. et al. (1994)Science265:103-106.
Guatelli J C et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA.35:273-286.
Hacia JG, Brody LC, Chee MS, Fodor SP, Collins FS,Nat genet1996;14(4):441-447
Hall L. A. and Smirnov I. P. (1997)Genome Research, 7:378-388.
Hames B.D. and Higgins S.J. (1985) Nucleic Acid hybridization: A Practical Approach. Hames and Hamill, Pfugers Arch. 391, 85-100 (1981).
Hammerling, et al., in: MONOCLONAL ANTIBODIES and TCELL HYBRIDOMAS 563681 (Elsevier, N.Y., 1981)
Harju L, Weber T, Alexandrova L, Lukin M, Ranki M, Jalanko A,Clin Chem1993;39(11Pt 1):2282-2287
Harland et al. (1985)J. Cell. Biol.101:1094-1095.
Harlow, E., and D. Lane. 1988. Antibodies A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. pp. 53-242
Harper JW et al., 1993, Cell, 75 : 805-816
Harrop, J.A. et al. J. Immunol. 161(4): 1786-1794(1998)
Hawley M.E. et al. (1994)Am. J. Phys. Anthropol.18:104.
Hell et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 747:282-293 (1994)
Henikoff and Henikoff, 1993, Proteins 17:49-61
Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402
Higgins Ed., IRL Press, Oxford.
Hillier L. and Green P.Methods Appl.,1991, 1: 124-8.
Hoess et al. (1986)Nucleic Acids Res. 14:2287-2300.
Huang L. et al. (1996)Cancer Res56(5):1137-1141.
Huston et al. Methods in Enzymology 203:46-88(1991)
Huygen et al. (1996)Nature Medicine.2(8):893-898.
Izant JG, Weintraub H,Cell1984 Apr;36(4):1007-15
Julan et al. (1992)J. Gen. Virol. 73:3251-3255.
Kanegae Y. et al.,Nucl. Acids Res.23:3816-3821 (1995).
Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2267-2268
Kettleborough, C.A. et al. Eur. J. Immunol. 24:952-958(1994)
Khoury J. et al., Fundamentals of genetic Epidemiology, Oxford University Press, NY, 1993
Kim U-J. et al. (1996)genomics34:213-218.
Klein et al. (1987)Nature. 327:70-73.
Koch, et al., J.Biol.Chem. 265 (29): 17786-17791 (1990)
Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256:495 (1975)
Koller et al. (1992)Annu. Rev. Immunol. 10:705-730.
Kozal MJ, Shah N, Shen N, Yang R, Fucini R, Merigan TC, Richman DD, Morris D, Hubbell E, Chee M, Gingeras TR, Nat Med 1996;2(7):753-759
Lander and Schork,Science,265, 2037-2048, 1994
Landegren U. et al. (1998)Genome Research, 8:769-776.
Lange K. (1997)Mathematical and Statistical Methods for genetic Analysis. Springer, New York.
Lee et al., FEBS Lett. 445 231:236 (1999).
Lenhard T. et al. (1996)gene.169:187-190.
Liautard, J. et al. Cytokinde 9(4):233-241(1997)
Lin MW et al. Hum. genet., 99(3): 417-420 (1997)
Linton M.F. et al. (1993)J. Clin. Invest.92:3029-3037.
Liu Z. et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA.91: 4528-4262.
Livak et al.,Nature genetics, 9:341-342, 1995
Livak KJ, Hainer JW,Hum Mutat1994;3(4):379-385
Lockhart et al.Nature Biotechnology14: 1675-1680, 1996
Lucas A.H., 1994, In : Development and Clinical Uses of Haempophilus bConjugate;
Manger et al., Anal. Biochem. 214: 190-194 (1993).
Mansour S.L. et al. (1988)Nature.336:348-352.
Marshall R. L. et al. (1994)PCR Methods 및 Applications.4:80-84.
McCormick et al. (1994)genet. Anal. Tech. Appl.11:158-164.
McLaughlin B.A. et al. (1996)Am. J. Hum. genet. 59:561-569.
Morena et al., Annals NY Acad. Sci. 102-117 (1999)
Mori, et al., Nature 350: 398-402 (1991)
Morrison, Science 229:1202 (1985)
Morton N.E.,Am.J. Hum.genet., 7:277-318, 1955
Muller, Y.A. et al. Structure 6(9):1153-1167(1998)
Mullinax, R.L. et al. BioTechniques 12(6):864-869(1992)
Muzyczka et al. (1992)Curr. Topics in Micro. and Immunol. 158:97-129.
Nada S. et al. (1993)Cell73:1125-1135.
Nagy A. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8424-8428.
Naramura, M. et al. Immunol. Lett. 39:91-99(1994)
Narang SA, Hsiung HM, Brousseau R,Methods Enzymol1979;68:90-98
Neda et al. (1991)J. Biol. Chem. 266:14143-14146.
Newton et al. (1989)Nucleic Acids Res.17:2503-2516.
Nickerson D.A. et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87:8923-8927.
Nicolau C. et al., 1987, Methods Enzymol., 149:157-76.
Nicolau et al. (1982)Biochim. Biophys. Acta. 721:185-190.
Nissinoff, J. Immunol. 147(8): 2429-2438 (1991).
Nyren P, Pettersson B, Uhlen M,Anal Biochem1993;208(1):171-175
O'Reilly et al. (1992)Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. W. H. Freeman and Co., New York.
Ohno et al. (1994)Science.265:781-784.
Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986)
Oldenburg K.R. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89:5393-5397.
Olesen et al.,Voltage gated ion channel modulators, 7-8 December , Philadelphia PA, USA (1995)
Orita et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86: 2776-2770.
Ott J.,Analysis of Human genetic Linkage,John Hopkins University Press,Baltimore,1991
Ouchterlony, O. et al., Chap. 19 in: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973)
Padlan E.A., Molecular Immunology 28(4/5): 489-498(1991)
Parmley and Smith, gene, 1988, 73:305-318
Pastinen et al.,Genome Research1997; 7:606-614
Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448
Pease S. ans William R.S., 1990, Exp. Cell. Res., 190: 209-211.
Perlin et al. (1994)Am. J. Hum. genet.55:777-787.
Persic, L. et al. gene 187 9-18(1997)
Peterson et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 7593-7597.
Pietu et al.Genome Research6:492-503, 1996
Pitard, V. et al. J. Immunol. Methods 205(2):177-190(1997)
Potter et al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.81(22):7161-7165.
Prat, M. et al. J. Cell. Sci. 111(Pt2): 237-247(1998)
Ramunsen et al., 1997, Electrophoresis, 18 : 588-598.
Reid L.H. et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87:4299-4303.
Risch, N. and Merikangas, K. (Science, 273:1516-1517, 1996
Robertson E., 1987, Embryo-derived stem cell lines. In: E.J. Robertson Ed.Teratocarcinomas and embrionic stem cells: a practical approach. IRL Press, Oxford, pp. 71.
Roguska M.A. et al. PNAS 91:969-973), (1994)
Rossi et al.,Pharmacol. Ther. 50:245-254, (1991)
Roth J.A. et al. (1996)Nature Medicine.2(9):985-991.
Roux et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86:9079-9083.
Ruano et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87:6296-6300.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and T. Maniatis. (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Samson M, et al. (1996)Nature, 382(6593):722-725.
Samulski et al. (1989)J. Virol. 63:3822-3828.
Sanchez-Pescador R. (1988)J. Clin. Microbiol. 26(10):1934-1938.
Sarkar, G. and Sommer S.S. (1991)Biotechniques.
Sauer B. et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85:5166-5170.
Sawai, H. et al. AJRI 34:26-34(1995)
Schedl A. et al., 1993a, Nature, 362: 258-261.
Schedl et al., 1993b, Nucleic Acids Res., 21: 4783-4787.
Schena et al.Science270:467-470, 1995
Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci U S A,.93(20):10614-10619.
Schneider et al.(1997)Arlequin: A Software For Population genetics Data Analysis.University of geneva.
Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation
Sczakiel G. et al. (1995)Trends Microbiol. 3(6):213-217.
Shay J.W. et al., 1991, Biochem. Biophys. Acta, 1072: 1-7.
Sheffield, V.C. et al. (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.49:699-706.
Shizuya et al. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:8794-8797.
Shoemaker DD, et al.,Nat genet1996;14(4):450-456
Shu, L. et al. PNAS 90:7995-7999(1993)
Skerra, A. et al. Science 240:1038-1040. (1988)
Smith (1957)Ann. Hum. genet.21:254-276.
Smith et al. (1983)Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165.
Sosnowski RG, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A1997;94:1119-1123
Sowdhamini et al., Protein Engineering 10:207, 215 (1997)
Spielmann S. and Ewens W.J.,Am. J. Hum. genet., 62:450-458, 1998
Spielmann S. et al.,Am. J. Hum. genet., 52:506-516, 1993
Sternberg N.L. (1992) Trends genet. 8:1-16.
Sternberg N.L. (1994)Mamm. Genome.5:397-404.
Stryer, L.,Biochemistry,4th edition, 1995
Studnicka G.M. et al. Protein Engineering 7(6):805-814(1994)
Syvanen AC,Clin Chim Acta1994;226(2):225-236
Szabo A. et al.Curr Opin Struct Biol5, 699-705 (1995)
Tacson et al. (1996)Nature Medicine. 2(8):888-892.
Taryman, R.E. et al. Neuron 14(4):755-762(1995)Schaid D.J. et al.,genet. Epidemiol.,13:423-450, 1996
Te Riele et al. (1990) Nature. 348:649-651.
Terlau et al., Naturwissenschaften 85: 437-444 (1998)
Terwilliger J.D. and Ott J.,Handbook of Human genetic Linkage,John Hopkins University Press,London, 1994
Thomas K.R. et al. (1986)Cell. 44:419-428.
Thomas K.R. et al. (1987)Cell. 51:503-512.
Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680
Tur-Kaspa et al. (1986)Mol. Cell. Biol.6:716-718.
Tyagi et al. (1998)Nature Biotechnology.16:49-53.
Urdea M.S. (1988)Nucleic Acids Research.11:4937-4957.
Urdea M.S. et al.(1991)Nucleic Acids Symp. Ser. 24:197-200.
Vaitukaitis, J. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991 (1971)
Valadon P., et al., 1996, J. Mol. Biol., 261:11-22.
Van der Lugt et al. (1991)gene. 105:263-267.
Vil, H. et al. PNAS 89:11337-11341(1992)
Vlasak R. et al. (1983)Eur. J. Biochem. 135:123-126.
Wabiko et al. (1986)DNA.5(4):305-314.
Walker et al. (1996)Clin. Chem.42:9-13.
Wang et al., 1997, Chromatographia, 44 : 205-208.
Weir, B.S. (1996)genetic data Analysis II: Methods for Discrete population genetic Data,Sinauer Assoc., Inc., Sunderl및, MA, U.S.A.
Westerink M.A.J., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., 92:4021-4025
White, M.B. et al. (1992)genomics.12:301-306.
White, M.B. et al. (1997)genomics.12:301-306.
Williams, et al. Science 257: 389-395 (1992)
Wong et al.gene. 10:87-94 (1980)
Wood S.A. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 4582-4585.
Wu and Wu (1987)J. Biol. Chem.262:4429-4432.
Wu and Wu (1988)Biochemistry. 27:887-892.
Wu et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86:2757.
Yagi T. et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87:9918-9922.
Yoon, D.Y. et al. J. Immunol. 160(7): 3170-3179(1998)
Zhang et al., Neuropharmacology 32 (11): 1075-1088 (1993)
Zhao et al.,Am. J. Hum. genet., 63:225-240, 1998
Zheng, X.X. et al. J. Immunol. 154:5590-5600(1995)
Zhu, Z. et al. Cancer Res. 58(15): 3209-3214(1998)
Zou Y. R. et al. (1994)Curr. Biol.4:1099-1103.
Claims (23)
- SEQ ID NO 1 내지 4 또는 6으로 도시된 뉴클레오티드 서열중 한가지, 또는 이들 서열에 상보적인 서열을 포함하는 분리된, 정제된 또는 재조합된 폴리뉴클레오티드.
- SEQ ID NO 4의 적어도 50개 뉴클레오티드의 연속 스팬(span)을 포함하는 분리된, 정제된 또는 재조합된 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 생물학적 활성 CanIon 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- SEQ ID NO 5의 아미노산 서열, 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는 사람 CanIon 폴리펩티드를 인코드하는 분리된, 정제된 또는 재조합된 폴리뉴클레오티드.
- 제 1 항 내지 3 항중 어느 한 항에 있어서, 고체 서포트에 부착되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 4 항에 따른 적어도 한가지 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 어레이.
- 제 5 항에 있어서, 어드레스(address)가능한 것을 특징으로 하는 어레이.
- 제 1 내지 4 항중 어느 항에 있어서, 라벨을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 1 항 내지 3 항중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
- 프로모터에 동작가능하게 연결되고 제 2 항 또는 3 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 8 항 또는 9 항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제 8 항 또는 9 항의 재조합 벡터를 포함하는 사람제외 숙주동물 또는 포유동물.
- 적중(knock out) 벡터와의 상동성 재조합에 의해 파괴된CanIon유전자를 포함하는 포유동물 숙주 세포 또는 사람제외 숙주 포유동물.
- SEQ ID NO 5에 도시된 아미노산 서열, 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는 분리된, 정제된 또는 재조합된 폴리펩티드.
- 폴리펩티드를 생산하는 방법에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:a) 프로모터에 동작가능하게 연결된 제 13 항의 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 개체군을 제공하고;b) 세포내에서 상기 폴리펩티드의 생산에 도움이 되는 조건하에 세포 개체군을 배양하며;c) 상기 세포 개체군으로부터 폴리펩티드를 정제한다.
- 제 13 항의 폴리펩티드에 항-CanIon 항체를 결합시키는 방법에 있어서, 항체와 폴리펩티드가 특이적으로 결합할 수 있는 조건하에 상기 항체와 상기 폴리펩티드를 접촉시키는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 세포내에서 CanIon 유전자의 발현을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:a) i) 엄격한 조건하에 제 1 항, 2 항 또는 3 항의 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 폴리뉴클레오티드; 또는 ii) 제 13 항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드와 세포 혹은 세포 추출물을 접촉시키고;b) 상기 세포 혹은 세포 추출물에서 폴리뉴클레오티드와 RNA 종간 혼성화의 존부, 또는 상기 세포 혹은 세포 추출물에서 폴리펩티드와 단백질 결합의 존부를 확인하며;여기서, 혼성화 또는 결합의 존재는 상기 CanIon 유전자가 세포내에서 발현된다는 것을 암시한다.
- 제 16 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 혼성화는 상기 프라이머 서열을 포함하는 증폭 산물의 존재를 검출하여 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 폴리펩티드는 항-CanIon 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
- CanIon 폴리펩티드의 후보 조절물질을 동정하는 방법에 있어서, 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:a) 제 13 항의 폴리펩티드와 검사 화합물을 접촉시키고;b) 상기 화합물이 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지를 확인하며;여기서, 상기 화합물이 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다는 확인은 상기 화합물이 CanIon 폴리펩티드의 후보 조절물질이라는 것을 암시한다.
- 제 19 항에 있어서, 후보 조절물질의 존재하의 CanIon 폴리펩티드의 생물활성을 측정하는 단계가 추가로 포함되고, 후보 조절물질 부재하의 활성과 비교하여 후보 조절물질 존재하의 CanIon 폴리펩티드의 생물활성 변화는 후보 조절물질이 CanIon 폴리펩티드의 조절물질이라는 것을 암시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- CanIon 폴리펩티드의 조절물질을 동정하는 방법에 있어서, 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:a) 제 13 항의 폴리펩티드와 검사 화합물을 접촉시키고;b) 상기 화합물의 존부하에 상기 폴리펩티드의 활성을 확인하며;여기서, 상기 화합물 부재하의 활성과 비교하여 상기 화합물 존재하의 활성에서 차이의 확인은 상기 화합물이 CanIon 폴리펩티드의 조절물질이라는 것을 암시한다.
- 제 20 항 또는 21 항에 있어서, 폴리펩티드는 세포 혹은 세포막에 존재하고, 생물활성은 전압-개폐 이온 채널 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제약학적 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:a) 제 19 항 내지 22 항중 어느 한 항의 방법을 이용하여 CanIon 폴리펩티드의 조절물질을 동정하고;b) 상기 조절물질과 생리학적으로 수용가능한 담체를 혼합한다.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US25131700P | 2000-12-05 | 2000-12-05 | |
| US60/251,317 | 2000-12-05 | ||
| PCT/IB2001/002798 WO2002046404A2 (en) | 2000-12-05 | 2001-12-04 | Schizophrenia-related voltage-gated ion channel gene and protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20030074643A true KR20030074643A (ko) | 2003-09-19 |
Family
ID=22951418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2003-7007511A Abandoned KR20030074643A (ko) | 2000-12-05 | 2001-12-04 | 정신분열증-관련된 전압-개폐 이온 채널 유전자와 단백질 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040091497A1 (ko) |
| EP (1) | EP1339840B1 (ko) |
| JP (1) | JP2004525614A (ko) |
| KR (1) | KR20030074643A (ko) |
| CN (1) | CN1777676A (ko) |
| AT (1) | ATE339500T1 (ko) |
| AU (2) | AU2002233573B2 (ko) |
| BR (1) | BR0115937A (ko) |
| CA (1) | CA2430712A1 (ko) |
| DE (1) | DE60123109T2 (ko) |
| EA (2) | EA008252B1 (ko) |
| ES (1) | ES2271092T3 (ko) |
| IL (1) | IL156073A0 (ko) |
| MX (1) | MXPA03005069A (ko) |
| UA (1) | UA79927C2 (ko) |
| WO (1) | WO2002046404A2 (ko) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020042100A1 (en) * | 2000-07-03 | 2002-04-11 | Chunhua Yan | Isolated human ion channel proteins, nucleic acid molecules encoding human ion channel proteins, and uses thereof |
| JPWO2002101035A1 (ja) * | 2001-05-10 | 2004-09-24 | 持田製薬株式会社 | 新規な電位依存性カチオンチャネル蛋白質 |
| US7634363B2 (en) | 2005-12-07 | 2009-12-15 | Affymetrix, Inc. | Methods for high throughput genotyping |
| WO2007100913A2 (en) * | 2006-02-28 | 2007-09-07 | The Regents Of The University Of California | Genes differentially expressed in bipolar disorder and/or schizophrenia |
| FR2906532B1 (fr) * | 2006-09-28 | 2008-12-12 | Biomerieux Sa | Nouvel oligonucleotide marque |
| US20200224214A1 (en) * | 2014-10-13 | 2020-07-16 | Dow Agrosciences Llc | Copi coatomer alpha subunit nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and hemipteran pests |
| KR102807004B1 (ko) * | 2020-01-03 | 2025-05-14 | 삼성전자주식회사 | 기판 적층 구조를 포함하는 전자 장치 |
| CN114982679B (zh) * | 2022-07-22 | 2023-08-01 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种黄鳝家系建立及优良家系选育方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6008001A (en) * | 1993-11-05 | 1999-12-28 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Diagnosis of the susceptibility of contracting schizophrenia |
| WO1999066041A1 (en) * | 1998-06-16 | 1999-12-23 | Human Genome Sciences, Inc. | 94 human secreted proteins |
| WO1999004825A1 (en) * | 1997-07-22 | 1999-02-04 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of neuropsychiatric disorders |
| JP2001525161A (ja) * | 1997-12-03 | 2001-12-11 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | 低電位で活性化されるカルシウムチャネル組成物と方法 |
| WO1999057316A1 (en) * | 1998-04-30 | 1999-11-11 | Institut Pasteur | A highly conserved polynucleotide sequence linked to a genetic predisposition to schizophrenia, a method of diagnosis, and applications thereof |
| US20020081584A1 (en) * | 1998-10-13 | 2002-06-27 | Marta Blumenfeld | Genes, proteins and biallelic markers related to central nervous system disease |
| JP2002539845A (ja) * | 1999-03-30 | 2002-11-26 | ジェンセット | 精神分裂病関連遺伝子、タンパク質およびバイアレリックマーカー |
| EP1280902A2 (en) * | 2000-04-29 | 2003-02-05 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 23949 and 32391, human ion channels and uses thereof |
| JP2004513618A (ja) * | 2000-07-07 | 2004-05-13 | インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド | 輸送体及びイオンチャネル |
-
2001
- 2001-04-12 UA UA2003076265A patent/UA79927C2/uk unknown
- 2001-12-04 AU AU2002233573A patent/AU2002233573B2/en not_active Ceased
- 2001-12-04 JP JP2002548121A patent/JP2004525614A/ja active Pending
- 2001-12-04 CA CA002430712A patent/CA2430712A1/en not_active Abandoned
- 2001-12-04 IL IL15607301A patent/IL156073A0/xx unknown
- 2001-12-04 KR KR10-2003-7007511A patent/KR20030074643A/ko not_active Abandoned
- 2001-12-04 EP EP01984902A patent/EP1339840B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-04 AT AT01984902T patent/ATE339500T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-12-04 WO PCT/IB2001/002798 patent/WO2002046404A2/en active IP Right Grant
- 2001-12-04 CN CNA018224997A patent/CN1777676A/zh active Pending
- 2001-12-04 BR BR0115937-2A patent/BR0115937A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-12-04 EA EA200500974A patent/EA008252B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-12-04 DE DE60123109T patent/DE60123109T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-04 MX MXPA03005069A patent/MXPA03005069A/es active IP Right Grant
- 2001-12-04 ES ES01984902T patent/ES2271092T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-04 AU AU3357302A patent/AU3357302A/xx active Pending
- 2001-12-04 EA EA200300642A patent/EA006367B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-12-04 US US10/433,580 patent/US20040091497A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-03-18 US US12/050,492 patent/US20080184381A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002046404A3 (en) | 2002-12-12 |
| ATE339500T1 (de) | 2006-10-15 |
| DE60123109D1 (de) | 2006-10-26 |
| JP2004525614A (ja) | 2004-08-26 |
| AU3357302A (en) | 2002-06-18 |
| AU2002233573B2 (en) | 2007-03-01 |
| CA2430712A1 (en) | 2002-06-13 |
| EA200500974A1 (ru) | 2006-02-24 |
| EP1339840A2 (en) | 2003-09-03 |
| MXPA03005069A (es) | 2003-09-05 |
| EA006367B1 (ru) | 2005-12-29 |
| BR0115937A (pt) | 2003-09-30 |
| EP1339840B1 (en) | 2006-09-13 |
| DE60123109T2 (de) | 2007-05-16 |
| UA79927C2 (en) | 2007-08-10 |
| ES2271092T3 (es) | 2007-04-16 |
| EA200300642A1 (ru) | 2003-12-25 |
| US20040091497A1 (en) | 2004-05-13 |
| EA008252B1 (ru) | 2007-04-27 |
| IL156073A0 (en) | 2003-12-23 |
| WO2002046404A9 (en) | 2002-08-15 |
| CN1777676A (zh) | 2006-05-24 |
| WO2002046404A2 (en) | 2002-06-13 |
| US20080184381A1 (en) | 2008-07-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7998671B2 (en) | Methods of detecting prostate cancer using BAP28-related biallelic markers | |
| US7449543B2 (en) | Schizophrenia related protein | |
| WO2001000803A2 (en) | Apolipoprotein a-iv-related protein: polypeptide, polynucleotide sequences and biallelic markers thereof | |
| US20080184381A1 (en) | Schizophrenia-related voltage-gated ion channel gene and protein | |
| EP1121428A2 (en) | Genes, proteins and biallelic markers related to central nervous system disease | |
| AU2001294088A1 (en) | Schizophrenia related gene and protein | |
| AU2002233573A1 (en) | Schizophrenia-related voltage-gated ion channel gene and protein | |
| JP2002539845A (ja) | 精神分裂病関連遺伝子、タンパク質およびバイアレリックマーカー | |
| US6555316B1 (en) | Schizophrenia associated gene, proteins and biallelic markers | |
| US20050158779A1 (en) | PG-3 and biallelic markers thereof | |
| AU2001235895B2 (en) | PG-3 and biallelic markers thereof | |
| WO2000063375A1 (en) | Dna encoding a kinesin-like protein (hklp) comprising biallelic markers | |
| WO2001040493A2 (en) | Schizophrenia associated gene, proteins and biallelic markers | |
| AU2001235895A1 (en) | PG-3 and biallelic markers thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20030605 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| A201 | Request for examination | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20061124 Comment text: Request for Examination of Application |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20080307 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20081008 |
|
| NORF | Unpaid initial registration fee | ||
| PC1904 | Unpaid initial registration fee |