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KR20030016423A - 클라미디아 감염을 치료 및 진단하기 위한 화합물 및 방법 - Google Patents

클라미디아 감염을 치료 및 진단하기 위한 화합물 및 방법 Download PDF

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KR20030016423A
KR20030016423A KR10-2003-7000885A KR20037000885A KR20030016423A KR 20030016423 A KR20030016423 A KR 20030016423A KR 20037000885 A KR20037000885 A KR 20037000885A KR 20030016423 A KR20030016423 A KR 20030016423A
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KR
South Korea
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seq
sequence
trachomatis
chlamydia
amino acid
Prior art date
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Application number
KR10-2003-7000885A
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English (en)
Inventor
플링스티븐피
스케이키야서에이더블유
프로브스트페터
바티아아제이
Original Assignee
코릭사 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/620,412 external-priority patent/US6448234B1/en
Application filed by 코릭사 코포레이션 filed Critical 코릭사 코포레이션
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Abstract

클라미디아 감염을 진단 및 치료하기 위한 화합물 및 방법이 기재되어 있다. 본원에 제공된 화합물에는 클라미디아 항원의 적어도 항원성 부분을 함유하는 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열이 포함된다. 이러한 폴리펩티드 또는 DNA 서열을 포함하는 약제학적 조성물 및 백신이, 상기 폴리펩티드에 대해 유도된 항체와 함께 또한 제공된다. 당해 폴리펩티드 또는 DNA 서열과 적합한 탐지용 시약을 함유하는 진단용 키트가 환자 및 생물학적 샘플에서 클라미디아 감염을 탐지하는데 사용될 수 있다.

Description

클라미디아 감염을 치료 및 진단하기 위한 화합물 및 방법{Compounds and methods for treatment and diagnosis of Chlamydial infection}
클라미디아는 광범위한 각종의 중요한 사람 및 동물 감염에 관여하는 세포내 세균성 병원체이다. 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)는 성적으로 전염되는 질환의 원인이 되는 가장 흔한 유발균 중의 하나이고, 이는 골반 염증 질환(PID)을 유발시켜 난관 폐쇄증과 불임을 가져다 줄 수 있다. 클라미디아 트라코마티스는 또한 남성 불임증의 원인이 될 수도 있다. 1990년도 미국에서 PID를 치료하는데 드는 비용은 40억 달러인 것으로 추정되었다. 클라미디아 트라코마티스에 의한 안과 감염으로 인한 트라코마(trachoma)는 전세계적으로 예방 가능한 실명의 주 원인이다. 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumonia)는 사람에게서 급성호흡기도 감염증의 주요 원인이며, 이는 아테롬성 동맥경화증, 특히 관상 심장 질환의 발병에 특정 역할을 하는 것으로 여겨진다. 클라미디아 뉴모니아에 대한 항체 역가치가 큰 개개인은 혈청학적으로 음성인 개개인과 비교해서 관상 심장 질환에 걸릴 확률이 2배 이상인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 클라미디아 감염은 미국 뿐만 아니라 전세계적으로 건강상의 중대한 문제가 되고 있다.
클라미디아 감염은 종종 증상이 없다. 예를 들면, 여성이 PID에 대한 의학적 관심을 갖게 될때는, 이미 정상 회복이 불가능한 손상이 일어나서 불임증을 초래한다. 따라서, 당업계에서는 클라미디아 감염을 예방 및 치료하기 위한 개선된 백신 및 약제학적 조성물에 대한 필요성이 대두되고 있다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시켜 주고 기타 관련된 이점을 추가로 제공해준다.
발명의 요약
본 발명은 클라미디아 감염을 진단 및 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 국면에 있어서, 본 발명은 클라미디아 항원의 면역원성 부분 또는 이러한 항원의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 부분 및 기타 변이체는 면역원성이기 때문에, 항원-특이적 항혈청과 반응하는 상기 변이체의 능력은 실질적으로 저하되지 않는다. 특정 양태 내에서는, 상기 폴리펩티드가 (a) 서열 358-361, 366-385, 406-430, 455-489, 516-517, 523-559 및 582-596의 서열; (b) 상기 서열의 상보체; 및 (c) 고도로 엄격한 조건 하에서 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 하이브리드화되는 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서는, 본 발명의 폴리펩티드가 서열 362-365, 386-405, 431-454, 490-515, 518-522, 560-581 및 597-599에 제시된 서열 및 이들의 변이체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 단백질의 적어도 일정 부분을 포함한다.
본 발명은 추가로, 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 일정 부분(이러한 일정 부분은 클라미디아 단백질의 15개 이상의 아미노산 잔기를 암호화한다), 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
관련 국면 내에서는, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 이들 폴리뉴클레오티드 서열을 하나 이상 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 이러한 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포가 제공된다.
또 다른 국면에서는, 본 발명은 약제학적 조성물 및 백신으로서 사용하기 위해 생리학적으로 허용되는 담체 또는 면역자극제와 함께, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하거나 또는 본 발명의 폴리펩티드와 공지된 클라미디아 항원을 포함하는 융합 단백질 뿐만 아니라 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 추가로, (a) 클라미디아 단백질과 특이적으로 결합되는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합성 단편; 및 (b) 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 기타 국면 내에서는, 본 발명이 본원에 기재된 하나 이상의 클라미디아 폴리펩티드, 예를 들면, 서열 362-365,386-405, 431-454, 490-515, 518-522, 560-581 및 597-599에 따르는 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 서열 358-361, 366-385, 406-430, 455-489, 516-517, 523-559 및 582-596에 따르는 폴리뉴클레오티드, 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 하나 이상의 상기된 폴리펩티드와 본원에 정의된 바와 같은 면역 자극제를 포함하는 예방용 및 치료용 백신을, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열과 면역 자극제를 포함하는 백신과 함께 제공한다.
또 다른 국면에서는, 하나 이상의 상기 약제학적 조성물 또는 백신의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에게서 예방 면역을 유도시키는 방법이 제공된다.
추가의 국면에서는, 특정 환자로부터 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 수득하는 단계; 이러한 PBMC를 본 발명의 폴리펩티드(또는 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)와 함께 항온배양하여, 항온배양된 T 세포를 수득하는 단계; 및 상기 항온배양된 T 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 상기 환자에게서 클라미디아 감염을 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명은 부가적으로, 항원 제시(antigen presenting) 세포를 본 발명의 폴리펩티드(또는 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)와 함께 항온배양하여, 항온배양된 항원 제시 세포를 수득하는 단계; 및 이와 같이 항온배양된 항원 제시 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 클라미디아 감염을 치료하는 방법이 제공된다. 환자에게 투여하기에 앞서, 증식된 세포를 클로닝할 수 있으나, 반드시 필요한 것은 아니다. 특정 양태에서는, 항원 제시 세포가 수지상 세포, 대식구(macrophage), 단구, B 세포 및 섬유아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 함께 항온배양시킨 T 세포 또는 항원 제시 세포를 포함하는, 클라미디아 감염 치료용 조성물이 제공된다. 관련 국면 내에서는, (a) 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드를 발현하는 항원 제시 세포; 및 (b) 면역자극제를 포함하는 백신이 제공된다.
본 발명은 추가로, 기타 국면 내에서, 클라미디아 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포를 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계(이러한 접촉 단계는 상기 샘플로부터 상기 단백질을 발현하는 세포를 제거하기에 충분한 시간 및 조건 하에 수행한다)를 포함하여, 특정 생물학적 샘플로부터 클라미디아-감염된 세포를 제거하는 방법을 제공한다.
관련 국면 내에서는, 상기 언급된 바와 같이 처리된 생물학적 샘플을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에게서 클라미디아 감염 발생을 억제시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 추가 국면에서는, 환자에게서 클라미디아 감염을 탐지하는 방법 및 이를 위한 진단용 키트가 제공된다. 한 양태에서는, 상기 방법이 (a) 생물학적 샘플을 본원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드 또는 융합 단백질 접촉시키는 단계; 및 (b) 당해 폴리펩티드 또는 융합 단백질과 결합하는 결합제의 존재 여부를 상기 샘플에서 탐지함으로써 상기 생물학적 샘플 중에서의 클라미디아 감염을 탐지하는 단계를 포함한다. 적합한 생물학적 샘플에는 전혈, 담, 혈청, 혈장,타액, 뇌척수액 및 뇨가 포함된다. 한 양태에서는, 상기 진단용 키트가 본원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 탐지용 시약과 함께 포함한다. 또 다른 양태에서는, 상기 진단용 키트가 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 포함한다.
본 발명은 또한, (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 이러한 샘플을, 폴리머라제 연쇄 반응으로 둘 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머(이러한 올리고뉴클레오티드 중의 하나 이상은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적이다)와 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머의 존재 하에 증폭되는 폴리뉴클레오티드 서열을 상기 샘플 중에서 탐지하는 단계를 포함하여, 클라미디아 감염을 탐지하는 방법을 제공한다. 한 양태에서는, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머가 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 펩티드 또는 이와 하이브리드화되는 서열의 약 10개 이상의 연속되는 뉴클레오티드를 포함한다.
추가의 국면에서는, 본 발명이 (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 이러한 샘플을, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 단계; 및 (c) 이러한 올리고뉴클레오티드 프로브와 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드 서열을 상기 샘플 중에서 탐지하는 단계를 포함하여, 환자에게서 클라미디아 감염을 탐지하는 방법을 제공한다. 한 양태에서는, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브가 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 하이브리드화되는 서열의 약 15개 이상의 연속되는 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 이들 및 기타 국면은 다음의 상세한 설명을 참조로 하여 명백해질 것이다. 본원에 언급된 모든 참조문헌은 각각이 개별적으로 삽입된 경우처럼 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입된다.
서열 확인
서열 1은 씨. 트라코마티스(C. trachomatis) 클론 1-B1-66에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 2는 씨. 트라코마티스 클론 4-D7-28에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 3은 씨. 트라코마티스 클론 3-G3-10에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 4는 씨. 트라코마티스 클론 10-C10-31에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 5는 1-B1-66에 대해 예상된 아미노산 서열이다.
서열 6은 4-D7-28에 대해 예상된 아미노산 서열이다.
서열 7은 3-G3-10에 대한 제1의 예상된 아미노산 서열이다.
서열 8은 3-G3-10에 대한 제2의 예상된 아미노산 서열이다.
서열 9는 3-G3-10에 대한 제3의 예상된 아미노산 서열이다.
서열 10은 3-G3-10에 대한 제4의 예상된 아미노산 서열이다.
서열 11은 3-G3-10에 대한 제5의 예상된 아미노산 서열이다.
서열 12는 10-C10-31에 대해 예상된 아미노산 서열이다.
서열 13은 합성 펩티드 1-B1-66/48-67의 아미노산 서열이다.
서열 14는 합성 펩티드 1-B1-66/58-77의 아미노산 서열이다.
서열 15는 씨. 트라코마티스 혈청형(serovar) LGV II 클론 2C7-8에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 16은 2C7-8이 지도화되는 씨. 트라코마티스 혈청형 D 게놈의 영역으로부터의 추정상의 개방 판독 프레임의 DNA 서열이다.
서열 17은 서열 16의 DNA 서열에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
서열 18은 합성 펩티드 CtC7.8-12의 아미노산 서열이다.
서열 19는 합성 펩티드 CtC7.8-13의 아미노산 서열이다.
서열 20은 씨. 트라코마티스 혈청형 D로부터의 제2의 추정상의 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
서열 21은 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 클론 4C9-18에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 22는 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 리포아미드 데하이드로게나제와 상동성인 결정된 DNA 서열이다.
서열 23은 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 가상(Hypothetical) 단백질과 상동성인 결정된 DNA 서열이다.
서열 24는 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 우비퀴논 메틸트랜스퍼라제와 상동성인 결정된 DNA 서열이다.
서열 25는 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 클론 4C9-18#2 BL21 pLysS에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 26은 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 4C9-18#2에 대해 예상된 아미노산 서열이다.
서열 27은 씨. 뉴모니아(C. pneumonia) 균주 TWAR로부터의 Cp-SWIB에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 28은 씨. 뉴모니아 균주 TWAR로부터의 Cp-SWIB에 대해 예상된 아미노산 서열이다.
서열 29는 씨. 뉴모니아 균주 TWAR로부터의 Cp-S13(CT509)에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 30은 씨. 뉴모니아 균주 TWAR로부터의 Cp-S13에 대해 예상된 아미노산 서열이다.
서열 31은 CtC7.8-12 및 CtC7.8-13으로부터의 10량체 컨센서스(consensus) 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 32는 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 클론 2C7-8에 대해 예상된 아미노산 서열이다.
서열 33은 클론 2C7-8과 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 혈청형 D 게놈(NCBI, BLASTIN 조사)의 뉴클레오티드 597304-597145에 상응하는 DNA 서열이다.
서열 34는 서열 33의 서열에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
서열 35는 씨. 뉴마니아로부터의 C.p. SWIB Nde(5' 프라이머)에 대한 DNA 서열이다.
서열 36은 씨. 뉴마니아로부터의 C.p. SWIB EcoRI(3' 프라이머)에 대한 DNA 서열이다.
서열 37은 씨. 뉴마니아로부터의 C.p. S13 Nde(5' 프라이머)에 대한 DNA 서열이다.
서열 38은 씨. 뉴마니아로부터의 C.p. S13 EcoRI(3' 프라이머)에 대한 DNA 서열이다.
서열 39는 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 CtSwib 52-67 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 40은 씨. 뉴마니아로부터의 CpSwib 53-68 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 41은 사람 SWI 도메인으로부터의 HuSwib 288-302 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 42는 씨. 트라코마티스의 토포이소머라제-SWIB 융합물로부터의 CtSWI-T 822-837 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 43은 씨. 뉴모니아의 토포이소머라제-SWIB 융합물로부터의 CpSWI-T 828-842 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 44는 3' 말단을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19783.3,jen.seq(1>509)CTL2#11-3'에 대한 제1의 결정된 DNA 서열이다.
서열 45는 5' 말단을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19783.4,jen.seq(1>481)CTL2#11-5'에 대한 제2의 결정된 DNA 서열이다.
서열 46은 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19784CTL2_12콘센서스.seq(1>427)CTL2#12에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 47은 5' 말단을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19785.4,jen.seq(1>600)CTL2#16-5'에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 48은 3' 말단을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19786.3,jen.seq(1>600)CTL2#18-3'에 대한 제1의 결정된 DNA 서열이다.
서열 49는 5' 말단을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19786.4,jen.seq(1>600)CTL2#18-5'에 대한 제2의 결정된 DNA 서열이다.
서열 50은 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19788CTL2_21컨센서스.seq(1>406)CTL2#21에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 51은 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19790CTL2_23컨센서스.seq(1>602)CTL2#23에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 52는 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19791CTL2_24컨센서스.seq(1>145)CTL2#24에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 53은 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 CTL2#4에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 54는 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 CTL2#8b에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 55는 리포아미드 데하이드로게나제 유전자 CT557과의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 15-G1-89에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 56은 티올 특이적 산화방지제 유전자 CT603과의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 14-H1-4에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 57은 가상 단백질 CT622과의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 12-G3-83에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 58은 리포아미드 데하이드로게나제 유전자 CT557과의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 12-B3-95에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 59는 dnaK 유전자 CT396과의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 11-H4-28에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 60은 PGP6-D 독성 단백질 및 L1 리보솜 유전자 CT318과의 부분 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 11-H3-68에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 61은 말레이트 데하이드로게나제 유전자 CT376 및 글리코겐 하이드롤라제 유전자 CT042와의 부분 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 11-G3-34에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 62는 가상 단백질 CT610과의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 11-G10-46에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 63은 OMP2 유전자 CT443과의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 11-C12-91에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 64는 HAD 상위계열(superfamily) 유전자 CT103과의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 11-A3-93에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 65는 티올 특이적 산화방지제 유전자 CT603과의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 14-H1-4에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 66은 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 CtL2#9에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 67은 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 CtL2#7에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 68은 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 CtL2#6에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 69는 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 CtL2#5에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 70은 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 CtL2#2에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 71은 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 CtL2#1에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 72는 5' 말단을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 23509.2CtL2#3-5'에 대한 제1의 결정된 DNA 서열이다.
서열 73은 3' 말단을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 23509.1CtL2#3-3'에 대한 제2의 결정된 DNA 서열이다.
서열 74는 5' 말단을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 22121.2CtL2#10-5'에 대한 제1의 결정된 DNA 서열이다.
서열 75는 3' 말단을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 22121.1CtL2#10-3'에 대한 제2의 결정된 DNA 서열이다.
서열 76은 5' 말단을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19787.6CtL2#19-5'에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 77은 씨. 뉴모니애 LGV II 클론 CpS13-His에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 78은 씨. 뉴모니애 LGV II 클론 Cp_SWIB-His에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 79는 L11, L10 및 L1 리보솜 단백질과의 부분 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 23-G7-68에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 80은 pmpC 유전자와의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 22-F8-91에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 81은 CT610-CT613 유전자와의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 21-E8-95에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 82는 CT858 및 recA 유전자와의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19-F12-57에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 83은 글루타밀 tRNA 신테타제를 암호화하는 CT445 유전자와의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19-F12-53에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 84는 잠재적(cryptic) 플라스미드 유전자와의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 19-A5-54에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 85는 OppC_2 및 pmpC 유전자와의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 17-E11-72에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 86은 CT857 및 CT858 개방 판독 프레임과의 부분 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 17-C1-77에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 87은 pmpC 및 SycE 유전자, 및 CT089 ORF와의 부분 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 15-H2-76에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 88은 CT858 ORF와의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 15-A3-26에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 89는 씨. 뉴모니애 클론 Cp_SWIB-His에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 90은 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 CtL2_LPDA_FL에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 91은 씨. 뉴모니애 클론 CpS13-His에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 92는 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 CtL2_TSA_FL에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 93은 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 Ct-Swib 43-61 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 94는 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 Ct-Swib 48-67 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 95는 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 Ct-Swib 52-71 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 96은 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 Ct-Swib 58-77 펩티드에 대한아미노산 서열이다.
서열 97은 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 Ct-Swib 63-82 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 98은 씨. 트라코마티스 LGV II로부터의 Ct-Swib 51-66 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 99는 씨. 뉴모니애로부터의 Cp-Swib 52-67 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 100은 씨. 뉴모니애로부터의 Cp-Swib 37-51 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 101은 씨. 뉴모니애로부터의 Cp-Swib 32-51 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 102는 씨. 뉴모니애로부터의 Cp-Swib 37-56 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 103은 씨. 트라코마티스로부터의 Ct-Swib 36-50 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 104는 씨. 트라코마티스로부터의 Ct-S13 46-65 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 105는 씨. 트라코마티스로부터의 Ct-S13 60-80 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 106은 씨. 트라코마티스로부터의 Ct-S13 1-20 펩티드에 대한 아미노산서열이다.
서열 107은 씨. 트라코마티스로부터의 Ct-S13 46-65 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 108은 씨. 트라코마티스로부터의 Ct-S13 56-75 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 109는 씨. 뉴모니애로부터의 Cp-S13 56-75 펩티드에 대한 아미노산 서열이다.
서열 110은 가상 단백질 CT875, CT229 및 CT228에 대한 부분적 개방 판독 프레임을 함유하는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 21-G12-60에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 111은 GroEL의 CT110 ORF와의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 22-B3-53에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 112는 CT660 및 CT659 ORF와의 부분 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 22-A1-49에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 113은 CT611 및 CT610 ORF와의 부분 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 17-E2-9에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 114는 CT858 ORF와의 부분 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 17-C10-31에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 115는 dnaK-유사 유전자와의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 21-C7-8에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 116은 pmpB 유전자 CT413의 일부를 함유하는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 20-G3-45에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 117은 S1 리보솜 단백질 ORF와의 상동성을 나타내는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 18-C5-2에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 118은 CT431 및 CT430에 대한 ORF의 일부를 함유하는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 17-C5-19에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 119는 포유류 세포 내에서의 성장을 위한 플라스미드의 ORF3 및 ORF4의 부분 서열을 함유하는, 씨. 트라코마티스 LGV II 클론 16-D4-22에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 120은 씨. 트라코마티스 혈청형 LGV II Cap1 유전자 CT529에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 121은 씨. 트라코마티스 혈청형 LGV II Cap1 유전자 CT529에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 122는 씨. 트라코마티스 혈청형 E Cap1 유전자 CT529에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 123은 씨. 트라코마티스 혈청형 E Cap1 유전자 CT529에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 124는 씨. 트라코마티스 혈청형 1A Cap1 유전자 CT529에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 125는 씨. 트라코마티스 혈청형 1A Cap1 유전자 CT529에 대해 예상된완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 126은 씨. 트라코마티스 혈청형 G Cap1 유전자 CT529에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 127은 씨. 트라코마티스 혈청형 G Cap1 유전자 CT529에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 128은 씨. 트라코마티스 혈청형 F1 NII Cap1 유전자 CT529에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 129는 씨. 트라코마티스 혈청형 F1 NII Cap1 유전자 CT529에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 130은 씨. 트라코마티스 혈청형 L1 Cap1 유전자 CT529에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 131은 씨. 트라코마티스 혈청형 L1 Cap1 유전자 CT529에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 132는 씨. 트라코마티스 혈청형 L3 Cap1 유전자 CT529에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 133은 씨. 트라코마티스 혈청형 L3 Cap1 유전자 CT529에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 134는 씨. 트라코마티스 혈청형 Ba Cap1 유전자 CT529에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 135는 씨. 트라코마티스 혈청형 Ba Cap1 유전자 CT529에 대해 예상된완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 136은 씨. 트라코마티스 혈청형 MOPN Cap1 유전자 CT529에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 137은 씨. 트라코마티스 혈청형 MOPN Cap1 유전자 CT529에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 138은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 #124-139에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 139는 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 #132-147에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 140은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 #138-155에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 141은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 #146-163에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 142는 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 #154-171에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 143은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 #162-178에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 144는 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 #138-147에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 145는 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 #139-147에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 146은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 #140-147에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 147은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 #138-146에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 148은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 #138-145에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 149는 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 #F140->I에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 150은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 ##S139>Ga에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 151은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩티드 ##S139>Gb에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 152는 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 216aa ORF의 펩티드 #2 C7.8-6에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 153은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 216aa ORF의 펩티드 #2 C7.8-7에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 154는 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 216aa ORF의 펩티드 #2 C7.8-8에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 155는 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 216aa ORF의 펩티드 #2 C7.8-9에대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 156은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 216aa ORF의 펩티드 #2 C7.8-10에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 157은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 클론 2C7.8 내의 216aa ORF의 53개 아미노산 잔기 펩티드에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 158은 씨. 트라코마티스 혈청형 L2의 클론 2C7.8 내의 CT529 ORF의 52개 아미노산 잔기 펩티드에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 159는 완전한 길이의 CT529 혈청형 L2를 클로닝하기 위한 5'(정방향) 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 160은 완전한 길이의 CT529 혈청형 L2를 클로닝하기 위한 5'(역방향) 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 161은 L2 및 MOPN 이외의 혈청형에 대한 완전한 길이의 CT529를 클로닝하기 위한 5'(정방향) 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 162는 L2 및 MOPN 이외의 완전한 길이의 CT529 혈청형을 클로닝하기 위한 5'(역방향) 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 163은 완전한 길이의 CT529 혈청형 MOPN을 클로닝하기 위한 5'(정방향) 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 164는 완전한 길이의 CT529 혈청형 MOPN을 클로닝하기 위한 5'(역방향) 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 165는 pBIB-KS에 대한 5'(정방향) 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 166은 pBIB-KS에 대한 5'(역방향) 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 167은 혈청형 L2로부터의 9량체 에피토프 펩티드 Cap1#139-147에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 168은 혈청형 D로부터의 9량체 에피토프 펩티드 Cap1#139-147에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 169는 씨. 트라코마티스 pmpI(CT874) 유전자에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 170은 씨. 트라코마티스 pmpG 유전자에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 171은 씨. 트라코마티스 pmpE 유전자에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 172는 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 173은 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 174는 씨. 트라코마티스 pmpB 유전자에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 175는 씨. 트라코마티스 pmpI 유전자에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 176은 씨. 트라코마티스 pmpG 유전자에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 177은 씨. 트라코마티스 pmpE 유전자에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 178는 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 179는 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 180은 씨. 트라코마티스 pmpB 유전자에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 181은 씨. 트라코마티스 pmpI 유전자에 대해 결정된 DNA 서열 마이너스 시그날 서열이다.
서열 182는 씨. 트라코마티스 pmpG 유전자에 대한 연속적으로 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 183은 씨. 트라코마티스 pmpE 유전자에 대해 결정된 DNA 서열 마이너스 시그날 서열이다.
서열 184는 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자에 대한 카복시 말단을 나타내는 제1의 결정된 DNA 서열이다.
서열 185는 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자에 대한 아미노 말단 마이너스 시그날 서열을 나타내는 제2의 결정된 DNA 서열이다.
서열 186은 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자에 대한 카복시 말단을 나타내는 제1의 결정된 DNA 서열이다.
서열 187은 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자에 대한 아미노 말단 마이너스 시그날 서열을 나타내는 제2의 결정된 DNA 서열이다.
서열 188은 Ra12와의 융합 분자 중의 씨. 뉴모니애 혈청형 MOMPS pmp 유전자를 나타내는 결정된 DNA 서열이다.
서열 189는 씨. 트라코마티스 pmpI 유전자에 대해 예상된 아미노산 서열 마이너스 시그날 서열이다.
서열 190은 씨. 트라코마티스 pmpG 유전자에 대한 후속적으로 예상된 아미노산 서열이다.
서열 191은 씨. 트라코마티스 pmpE 유전자에 대해 예상된 아미노산 서열 마이너스 시그날 서열이다.
서열 192는 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자에 대한 카복시 말단을 나타내는 제1의 예상된 아미노산 서열이다.
서열 193은 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자에 대한 아미노 말단 마이너스 시그날 서열을 나타내는 제2의 예상된 아미노산 서열이다.
서열 194는 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자에 대한 카복시 말단을 나타내는 제1의 예상된 아미노산 서열이다.
서열 195는 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자에 대한 아미노 말단을 나타내는제2의 예상된 아미노산 서열이다.
서열 196은 Ra12와의 융합 분자 중의 씨. 뉴모니애 혈청형 MOMPS pmp 유전자를 나타내는 예상된 아미노산 서열이다.
서열 197은 SKB 백신 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자를 클로닝하기 위한 5' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 198은 SKB 백신 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자를 클로닝하기 위한 3' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 199은 SKB 백신 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자를 클로닝하기 위한 삽입 서열에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 200은 SKB 백신 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자를 클로닝하기 위한 5' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 201은 SKB 백신 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자를 클로닝하기 위한 3' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 202은 SKB 백신 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자를 클로닝하기 위한 삽입 서열에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 203은 SKB 백신 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpE 유전자를 클로닝하기 위한 5' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 204은 SKB 백신 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpE 유전자를 클로닝하기 위한 3' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 205은 SKB 백신 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpG 유전자를 클로닝하기위한 5' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 206은 SKB 백신 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpG 유전자를 클로닝하기 위한 3' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 207은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자의 아미노 말단 부분을 클로닝하기 위한 5' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 208은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자의 아미노 말단 부분을 클로닝하기 위한 3' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 209은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자의 카복시 말단 부분을 클로닝하기 위한 5' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 210은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpC 유전자의 카복시 말단 부분을 클로닝하기 위한 3' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 211은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자의 아미노 말단 부분을 클로닝하기 위한 5' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 212은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자의 아미노 말단 부분을 클로닝하기 위한 3' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 213은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자의 카복시 말단 부분을 클로닝하기 위한 5' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 214은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpD 유전자의 카복시 말단 부분을 클로닝하기 위한 3' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 215은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpE 유전자를 클로닝하기위한 5' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 216은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpE 유전자를 클로닝하기 위한 3' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 217은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpE 유전자를 클로닝하기 위한 삽입 서열에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 218은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpE 유전자를 클로닝하기 위한 삽입 서열에 대한 아미노산 서열이다.
서열 219은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpG 유전자를 클로닝하기 위한 5' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 220은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpG 유전자를 클로닝하기 위한 3' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 221은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpG 유전자를 클로닝하기 위한 삽입 서열에 대한 아미노산 서열이다.
서열 222은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpI 유전자를 클로닝하기 위한 5' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 223은 pET17b 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpI 유전자를 클로닝하기 위한 3' 올리고 프라이머에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 224는 씨. 뉴모니애 Swib 펩티드 1-20에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 225는 씨. 뉴모니애 Swib 펩티드 6-25에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 226는 씨. 뉴모니애 Swib 펩티드 12-31에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 227는 씨. 뉴모니애 Swib 펩티드 17-36에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 228는 씨. 뉴모니애 Swib 펩티드 22-41에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 229는 씨. 뉴모니애 Swib 펩티드 27-46에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 230는 씨. 뉴모니애 Swib 펩티드 42-61에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 231는 씨. 뉴모니애 Swib 펩티드 46-65에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 232는 씨. 뉴모니애 Swib 펩티드 51-70에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 233는 씨. 뉴모니애 Swib 펩티드 56-75에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 234는 씨. 뉴모니애 Swib 펩티드 61-80에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 235는 씨. 뉴모니애 Swib 펩티드 66-87에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 236는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 103-122에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 237는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 108-127에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 238는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 113-132에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 239는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 118-137에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 240는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 123-143에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 241는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 128-147에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 242는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 133-152에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 243는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 137-156에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 244는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 142-161에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 245는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 147-166에 대해 결정된 아미노산서열이다.
서열 246는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 152-171에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 247는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 157-176에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 248는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 162-181에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 249는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 167-186에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 250는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 171-190에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 251는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 171-186에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 252는 씨. 트라코마티스 OMCB 펩티드 175-186에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 253는 씨. 뉴모니애 OMCB 펩티드 185-198에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 254는 씨. 트라코마티스 TSA 펩티드 96-115에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 255는 씨. 트라코마티스 TSA 펩티드 101-120에 대해 결정된 아미노산서열이다.
서열 256는 씨. 트라코마티스 TSA 펩티드 106-125에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 257는 씨. 트라코마티스 TSA 펩티드 111-130에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 258는 씨. 트라코마티스 TSA 펩티드 116-135에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 259는 씨. 트라코마티스 TSA 펩티드 121-140에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 260는 씨. 트라코마티스 TSA 펩티드 126-145에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 261는 씨. 트라코마티스 TSA 펩티드 131-150에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 262는 씨. 트라코마티스 TSA 펩티드 136-155에 대해 결정된 아미노산 서열이다.
서열 263는 씨. 트라코마티스 CT529/Cap 1 유전자 혈청형 I에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 264는 씨. 트라코마티스 CT529/Cap 1 유전자 혈청형 I에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 265는 씨. 트라코마티스 CT529/Cap 1 유전자 혈청형 K에 대해 결정된완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 266는 씨. 트라코마티스 CT529/Cap 1 유전자 혈청형 K에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 267은 serD 중의 DNA-지시된 RNA 폴리머라제 베타 소단위체-CT315의 ORF 일부와 상동성을 나타내는 씨. 트라코마티스 클론 17-G4-36에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 268은 클론 2E10 중의 씨. 트라코마티스 CT016 유전자의 부분 서열에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 269은 클론 2E10 중의 씨. 트라코마티스 tRNA 신타제 유전자의 부분 서열에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 270은 클론 2E10 중의 씨. 트라코마티스 clpX 유전자의 부분 서열에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 271은 5' 말단을 나타내는 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-30에 대한 제1의 결정된 DNA 서열이다.
서열 272은 3' 말단을 나타내는 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-30에 대한 제2의 결정된 DNA 서열이다.
서열 273은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-28에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 274은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-27에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 275은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-26에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 276은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-24에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 277은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-23에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 278은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-21에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 279은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-18에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 280은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-17에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 281은 5' 말단을 나타내는 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-15에 대한 제1의 결정된 DNA 서열이다.
서열 282은 3' 말단을 나타내는 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-15에 대한 제2의 결정된 DNA 서열이다.
서열 283은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-13에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 284은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-10에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 285은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-8에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 286은 5' 말단을 나타내는 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-6에 대한 제1의 결정된 DNA 서열이다.
서열 287은 3' 말단을 나타내는 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-6에 대한 제2의 결정된 DNA 서열이다.
서열 288은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-5에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 289은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-2에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 290은 씨. 트라코마티스 클론 CtL2gam-1에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 291은 CT529 유전자의 씨. 뉴모니애 상동체에 대해 결정된 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 292은 CT529 유전자의 씨. 뉴모니애 상동체에 대해 예상된 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 293은 SKB 백신 벡터 중의 씨. 트라코마티스 pmpG 유전자를 클로닝하기 위한 삽입 서열에 대해 결정된 DNA 서열이다.
서열 294는 클론 CT603의 개방 판독 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 295는 클론 CT875의 제1의 개방 판독 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 296는 클론 CT875의 제2의 개방 판독 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 297는 클론 CT858의 제1의 개방 판독 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 298는 클론 CT858의 제2의 개방 판독 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 299는 클론 CT622의 개방 판독 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 300는 클론 CT610의 개방 판독 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 301는 클론 CT396의 개방 판독 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 302는 클론 CT318의 개방 판독 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 304는 변형된 N-말단 서열(6-His 태그)을 갖는 씨. 트라코마티스, 혈청형 L2 rCt529c1-125에 대한 아미노산 서열이다.
서열 305는 씨. 트라코마티스, 혈청형 L2 rCt529c1-125에 대한 아미노산 서열이다.
서열 306은 PmpA(N-말단) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 307은 PmpA(N-말단) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 308은 PmpA(N-말단) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 309은 PmpA(N-말단)의 아미노산 서열이다.
서열 310은 PmpA(C-말단) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 311은 PmpA(C-말단) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 312은 PmpA(C-말단) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 313은 PmpA(N-말단)의 아미노산 서열이다.
서열 314은 PmpF(N-말단) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 315은 PmpF(N-말단) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 316은 PmpF(N-말단) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 317은 PmpF(N-말단)의 아미노산 서열이다.
서열 318은 PmpF(C-말단) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 319은 PmpF(C-말단) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 320은 PmpF(C-말단) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 321은 PmpF(C-말단)의 아미노산 서열이다.
서열 322은 PmpH(CT412)(N-말단) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 323은 PmpH(N-말단) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 324은 PmpH(N-말단) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 325은 PmpH(N-말단)의 아미노산 서열이다.
서열 326은 PmpH(C-말단) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 327은 PmpH(C-말단) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 328은 PmpH(C-말단) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 329은 PmpH(C-말단)의 아미노산 서열이다.
서열 330은 PmpB(1) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 331은 PmpB(1) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 332은 PmpB(1) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 333은 PmpB(1)의 아미노산 서열이다.
서열 334은 PmpB(2) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 335은 PmpB(2) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 336은 PmpB(2) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 337은 PmpB(2) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 338은 PmpB(3) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 339은 PmpB(3) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 340은 PmpB(3) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 341은 PmpB(3) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 342은 PmpB(4) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 343은 PmpB(4) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 344은 PmpB(4) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 345은 PmpB(4) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 346은 PmpC(1) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 347은 PmpC(1) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 348은 PmpC(1) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 349은 PmpC(1) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 350은 PmpC(2) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 351은 PmpC(2) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 352은 PmpC(2) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 353은 PmpC(2) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 354은 PmpC(3) 융합 단백질의 합성에 사용된 센스 프라이머이다.
서열 355은 PmpC(3) 융합 단백질의 합성에 사용된 안티센스 프라이머이다.
서열 356은 PmpC(3) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 357은 PmpC(3)의 아미노산 서열이다.
서열 358은 제1의 막관통(transmembrane) 도메인이 결여된, oppA1 단백질의 DNA 서열이다.
서열 359는 CT139의 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 360는 ORF-3의 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 361는 CT611의 완전한 길이의 DNA 서열이다.
서열 362는 아미노산 22로부터 출발한 oppA1의 아미노산 서열이다.
서열 363은 CT139의 아미노산 서열이다.
서열 364은 ORF-3의 아미노산 서열이다.
서열 365은 CT611의 아미노산 서열이다.
서열 366은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT190의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0275에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 367은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT103의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0407에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 368은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT659의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0720에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 369은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT660의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0716에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 370은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT430의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0519에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 371은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT431의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0520에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 372은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT318의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0078에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 373은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT509의 클라미디아 뉴모니애상동체, CPn0628에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 374은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT414의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0540에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 375은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT413의 클라미디아 뉴모니애 상동체, pmp20에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 376은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT315의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0081에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 377은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT610의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0761에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 378은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT443의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0557에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 379은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT557의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0833에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 380은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT604의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0134에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 381은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT042의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0388에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 382은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT376의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn1028에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 383은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT734의 클라미디아 뉴모니애상동체, CPn0875에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 384은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT764의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0908에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 385은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT622의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0728에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 386은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT190의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0275에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 387은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT103의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0407에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 388은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT659의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0720에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 389은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT660의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0716에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 390은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT430의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0519에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 391은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT431의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0520에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 392은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT318의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0078에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 393은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT509의 클라미디아 뉴모니애상동체, CPn0628에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 394은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT414의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0540에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 395은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT413의 클라미디아 뉴모니애 상동체, pmp20에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 396은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT315의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0081에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 397은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT610의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0761에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 398은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT443의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0557에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 399은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT557의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0833에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 400은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT604의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0134에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 401은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT042의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0388에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 402은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT376의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn1028에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 403은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT734의 클라미디아 뉴모니애상동체, CPn0875에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 404은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT764의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0908에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 405은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT622의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0728에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 406은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT287의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 407은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT858의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 408은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT764의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 409은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT734의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 410은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT660의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 411은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT659의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 412은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT622의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 413은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT610의 완전한 길이의 혈청형D DNA 서열을 제시한다.
서열 414은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT604의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 415은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT557의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 416은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT509의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 417은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT443의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 418은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT431의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 419은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT430의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 420은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT414의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 421은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT413의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 422은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT396의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 423은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT376의 완전한 길이의 혈청형D DNA 서열을 제시한다.
서열 424은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT318의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 425은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT315의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 426은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT104의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 427은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT103의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 428은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT102의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 429은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT098의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 430은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT042의 완전한 길이의 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 431은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT858의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 432은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT764의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 433은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT734의 완전한 길이의 혈청형D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 434은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT660의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 435은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT659의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 436은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT622의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 437은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT610의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 438은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT604의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 439은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT557의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 440은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT509의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 441은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT443의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 442은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT431의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 443은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT430의 완전한 길이의 혈청형D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 444은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT414의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 445은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT413의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 446은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT396의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 447은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT376의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 448은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT318의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 449은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT315의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 450은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT104의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 451은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT103의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 452은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT102의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 453은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT098의 완전한 길이의 혈청형D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 454은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT042의 완전한 길이의 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 455는 클론 CTL2-1 및 CTL2-5에서 동정된, CT751(amn)의 CP 상동체인 CPn0894의 DNA 서열에 상응한다.
서열 456는 클론 CTL2-2에서 동정된, CT322(tuf)의 CP 상동체인 CPn0074의 DNA 서열에 상응한다.
서열 457는 클론 CTL2gam2, CTL2-3(5') 및 CTL2-4에서 동정된, CT032(metG)의 CP 상동체인 CPn0122의 DNA 서열에 상응한다.
서열 458는 클론 CTL2-3(5')(3')에서 동정된, CT031의 CP 상동체인 CPn0121의 DNA 서열에 상응한다.
서열 459는 클론 CTL2-3(3') 및 CTL2-21에서 동정된, CT030(gmK)의 CP 상동체인 CPn0120의 DNA 서열에 상응한다.
서열 460는 클론 CTL2gam5에서 동정된, CT064(lepA)의 CP 상동체인 CPn0359의 DNA 서열에 상응한다.
서열 461는 클론 CTL2-6에서 동정된, CT265(accA)의 CP 상동체인 CPn0414의 DNA 서열에 상응한다.
서열 462는 클론 CTL2-6에서 동정된, CT264(msbA)의 CP 상동체인 CPn0413의 DNA 서열에 상응한다.
서열 463는 클론 CTL2gam6(5') 및 CTL2-11(5')에서 동정된, CT256의 CP 상동체인 CPn0394의 DNA 서열에 상응한다.
서열 464는 클론 CTL2gam6(5') 및 CTL2-11(5')에서 동정된, CT257의 CP 상동체인 CPn0395의 DNA 서열에 상응한다.
서열 465는 클론 CTL2gam6(3') 및 CTL2-11(3')에서 동정된, CT384의 CP 상동체인 CPn0487의 DNA 서열에 상응한다.
서열 466는 클론 CTL2-8b에서 동정된, CT473의 CP 상동체인 CPn0592의 DNA 서열에 상응한다.
서열 467는 클론 CTL2-8b에서 동정된, CT474의 CP 상동체인 CPn0593의 DNA 서열에 상응한다.
서열 468는 클론 CTL2-8b에서 동정된, CT139(oppA1)의 CP 상동체인 CPn0197의 DNA 서열에 상응한다.
서열 469는 클론 CTL2-8b에서 동정된, CT060(flhA)의 CP 상동체인 CPn0363의 DNA 서열에 상응한다.
서열 470는 클론 CTL2gam8에서 동정된, CT242의 CP 상동체인 CPn0301의 DNA 서열에 상응한다.
서열 471는 클론 CTL2gam8에서 동정된, CT243(lpxD)의 CP 상동체인 CPn0302의 DNA 서열에 상응한다.
서열 472는 클론 CTL2-9, CTL2gam1, CTL2gam17 및 CTL2-19(5')에서 동정된, CT089(lcrE)의 CP 상동체인 CPn0324의 DNA 서열에 상응한다.
서열 473는 클론 CTL2-10(5')(3')에서 동정된, CT610의 CP 상동체인 CPn0761의 DNA 서열에 상응한다.
서열 474는 클론 CTL2-10(5')에서 동정된, CT611의 CP 상동체인 CPn0760의 DNA 서열에 상응한다.
서열 475는 클론 CTL2gam10 및 CTL2gam21에서 동정된, CT154의 CP 상동체인 CPn0329의 DNA 서열에 상응한다.
서열 476는 클론 CTL2-12에서 동정된, CT833(infC)의 CP 상동체인 CPn0990의 DNA 서열에 상응한다.
서열 477는 클론 CTL2-16(3') 및 CTL2gam15(3')에서 동정된, CT827(nrdA)의 CP 상동체인 CPn0984의 DNA 서열에 상응한다.
서열 478는 클론 CTL2-16(3') 및 CTL2gam15(3')에서 동정된, CT828(nrdB)의 CP 상동체인 CPn0985의 DNA 서열에 상응한다.
서열 479는 클론 CTL2gam18에서 동정된, CT067(ytgA)의 CP 상동체인 CPn0349의 DNA 서열에 상응한다.
서열 480는 클론 CTL2-19(5')에서 동정된, CT088(sycE)의 CP 상동체인 CPn0325의 DNA 서열에 상응한다.
서열 481는 클론 CTL2-19(5')에서 동정된, CT087(malQ)의 CP 상동체인 CPn0326의 DNA 서열에 상응한다.
서열 482는 클론 CTL2gam23에서 동정된, CT588(rbsu)의 CP 상동체인 CPn0793의 DNA 서열에 상응한다.
서열 483는 클론 CTL2gam24에서 동정된, CT199(oppB1)의 CP 상동체인CPn0199의 DNA 서열에 상응한다.
서열 484는 클론 CTL2-24에서 동정된, CT545(dnaE)의 CP 상동체인 CPn0666의 DNA 서열에 상응한다.
서열 485는 클론 CTL2gam27에서 동정된, CT288의 CP 상동체인 CPn0065의 DNA 서열에 상응한다.
서열 486는 클론 CTL2gam30(5')(3')에서 동정된, CT413(pmpB)의 CP 상동체인 CPn0444의 DNA 서열에 상응한다.
서열 487는 클론 CTL2gam15(5'), CTL2-16(5'), CTL2-18(5') 및 CTL2-23에서 동정된, CT-ORF3의 CP 상동체인 CPn-ORF5의 DNA 서열에 상응한다.
서열 488는 클론 CTL2-18(3')에서 동정된, CT-ORF4의 CP 상동체인 CPn-ORF6의 DNA 서열에 상응한다.
서열 489는 클론 CTL2-18(3')에서 동정된, CT-ORF5의 CP 상동체인 CP-ORF7의 DNA 서열에 상응한다.
서열 490는 클론 CTL2-1 및 CTL2-5에서 동정된, CT751(amn)의 CP 상동체인 CPn0894의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 491는 클론 CTL2-2에서 동정된, CT322(tuf)의 CP 상동체인 CPn0074의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 492는 클론 CTL2gam2, CTL2-3(5') 및 CTL2-4에서 동정된, CT032(metG)의 CP 상동체인 CPn0122의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 493는 클론 CTL2-3(5')(3')에서 동정된, CT031의 CP 상동체인 CPn0121의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 494는 클론 CTL2-3(3') 및 CTL2-21에서 동정된, CT030(gmK)의 CP 상동체인 CPn0120의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 495는 클론 CTL2gam5에서 동정된, CT064(lepA)의 CP 상동체인 CPn0359의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 496는 클론 CTL2-6에서 동정된, CT265(accA)의 CP 상동체인 CPn0414의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 497는 클론 CTL2-6에서 동정된, CT264(msbA)의 CP 상동체인 CPn0413의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 498는 클론 CTL2gam6(5') 및 CTL2-11(5')에서 동정된, CT256의 CP 상동체인 CPn0394의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 499는 클론 CTL2gam6(5') 및 CTL2-11(5')에서 동정된, CT257의 CP 상동체인 CPn0395의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 500는 클론 CTL2gam6(3') 및 CTL2-11(3')에서 동정된, CT384의 CP 상동체인 CPn0487의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 501는 클론 CTL2-8b에서 동정된, CT473의 CP 상동체인 CPn0592의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 502는 클론 CTL2-8b에서 동정된, CT474의 CP 상동체인 CPn0593의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 503는 클론 CTL2-8b에서 동정된, CT139(oppA1)의 CP 상동체인 CPn0197의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 504는 클론 CTL2-8b에서 동정된, CT060(flhA)의 CP 상동체인 CPn0363의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 505는 클론 CTL2gam8에서 동정된, CT242의 CP 상동체인 CPn0301의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 506는 클론 CTL2gam8에서 동정된, CT243(lpxD)의 CP 상동체인 CPn0302의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 507는 클론 CTL2-9, CTL2gam1, CTL2gam17 및 CTL2-19(5')에서 동정된, CT089(lcrE)의 CP 상동체인 CPn0324의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 508는 클론 CTL2-10(5')(3')에서 동정된, CT610의 CP 상동체인 CPn0761의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 509는 클론 CTL2-10(5')에서 동정된, CT611의 CP 상동체인 CPn0760의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 510는 클론 CTL2gam10 및 CTL2gam21에서 동정된, CT154의 CP 상동체인 CPn0329의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 511는 클론 CTL2-12에서 동정된, CT833(infC)의 CP 상동체인 CPn0990의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 512는 클론 CTL2gam15(5'), CTL2-16(5'), CTL2-18(5') 및 CTL2-23에서 동정된, CT-ORF3의 CP 상동체인 CPn-ORF5의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 513는 클론 CTL2-16(3') 및 CTL2gam15(3')에서 동정된, CT827(nrdA)의CP 상동체인 CPn0984의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 514는 클론 CTL2-16(3') 및 CTL2gam15(3')에서 동정된, CT828(nrdB)의 CP 상동체인 CPn0985의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 515는 클론 CTL2gam18에서 동정된, CT067(ytgA)의 CP 상동체인 CPn0349의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 516는 클론 CTL2-18(3')에서 동정된, CT-ORF4의 CP 상동체인 CPn-ORF6의 DNA 서열에 상응한다.
서열 517는 클론 CTL2-18(3')에서 동정된, CT-ORF5의 CP 상동체인 CP-ORF7의 DNA 서열에 상응한다.
서열 518는 클론 CTL2-19(5')에서 동정된, CT087(malQ)의 CP 상동체인 CPn0326의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 519는 클론 CTL2-19(5')에서 동정된, CT088(sycE)의 CP 상동체인 CPn0325의 DNA 서열에 상응한다.
서열 520는 클론 CTL2gam23에서 동정된, CT588(rbsu)의 CP 상동체인 CPn0793의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 521는 클론 CTL2gam24에서 동정된, CT199(oppB1)의 CP 상동체인 CPn0199의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 522는 클론 CTL2-24에서 동정된, CT545(dnaE)의 CP 상동체인 CPn0666의 아미노산 서열에 상응한다.
서열 523는 클론 CTL2gam27에서 동정된, CT288의 CP 상동체인 CPn0065의 DNA서열에 상응한다.
서열 524는 클론 CTL2gam30(5')(3')에서 동정된, CT413(pmpB)의 CP 상동체인 CPn0444의 DNA 서열에 상응한다.
서열 525는 클론 CTL2-1 및 CTL2-5로부터 동정된 CT751(amn)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 526는 클론 CTL2-2로부터 동정된 CT322(tuff)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 527는 클론 CTL2gam2, CTL2-3(5') 및 CTL2-4로부터 동정된 CT032(metG)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 528는 클론 CTL2-3(5')(3')로부터 동정된 CT031에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 529는 클론 CTL2-3(3') 및 CTL2-21로부터 동정된 CT030(gmK)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 530는 클론 CTL2gam5로부터 동정된 CT064(lepA)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을제시한다.
서열 531는 클론 CTL2-6로부터 동정된 CT265(accA)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 532는 클론 CTL2-6로부터 동정된 CT624(msbA)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 533는 클론 CTL2gam6(5') 및 CTL2-11(5')로부터 동정된 CT256에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 534는 클론 CTL2gam6(5') 및 CTL2-11(5')로부터 동정된 CT257에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 535는 클론 CTL2gam6(3') 및 CTL2-11(3')로부터 동정된 CT384에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 536는 클론 CTL2-8b로부터 동정된 CT473에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 537는 클론 CTL2-8b로부터 동정된 CT474에 대한 씨. 트라코마티스 LGVII 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 538는 클론 CTL2-8b로부터 동정된 CT139(oppA1)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 539는 클론 CTL2-8b로부터 동정된 CT060(flhA)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 540는 클론 CTL2gam8로부터 동정된 CT242에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 541는 클론 CTL2gam8로부터 동정된 CT243(lpxD)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 542는 클론 CTL2-9, CTL2gam1, CTL2gam17 및 CTL2-19(5')로부터 동정된 CT089에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 543는 클론 CTL2-10(5')(3')로부터 동정된 CT610에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 544는 클론 CTL2-10(5')로부터 동정된 CT611에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 545는 클론 CTL2gam10 및 CTL2gam21로부터 동정된 CT154에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 546는 클론 CTL2-12로부터 동정된 CT833(infC)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 547는 클론 CTL2-16(3') 및 CTL2gam15(3')로부터 동정된 CT827(nrdA)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 548는 클론 CTL2-16(3') 및 CTL2gam15(3')로부터 동정된 CT828(nrdB)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 549는 클론 CTL2gam18로부터 동정된 CT067(ytgA)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 550는 클론 CTL2-19(5')로부터 동정된 CT088(sycE)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 551는 클론 CTL2-19(5')로부터 동정된 CT087에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 552는 클론 CTL2gam23로부터 동정된 CT588(rsbu)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 553는 클론 CTL2gam24로부터 동정된 CT199(oppB1)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 554는 클론 CTL2-4로부터 동정된 CT545(dnaE)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 555는 클론 CTL2gam27로부터 동정된 CT288에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 556는 클론 CTL2gam30(5')(3')로부터 동정된 CT413(pmpB)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 557는 클론 CTL2gam15(5'), CTL2-16(5'), CTL2-18(5') 및 CTL2-23로부터 동정된 CT-ORF3에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 558는 클론 CTL2-18(3')로부터 동정된 CT-ORF4에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 559는 클론 CTL2-18(3')로부터 동정된 CT-ORF5에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 560는 클론 CTL2-1 및 CTL2-5로부터 동정된 CT751(amn)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 561는 클론 CTL2-2로부터 동정된 CT322(tuff)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 562는 클론 CTL2gam2, CTL2-3(5') 및 CTL2-4로부터 동정된 CT032(metG)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 563는 클론 CTL2-3(5')(3')로부터 동정된 CT031에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 564는 클론 CTL2-3(3') 및 CTL2-21로부터 동정된 CT030(gmK)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 565는 클론 CTL2gam5로부터 동정된 CT064(lepA)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 566는 클론 CTL2-6로부터 동정된 CT265(accA)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 567는 클론 CTL2-6로부터 동정된 CT624(msbA)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 568는 클론 CTL2gam6(5') 및 CTL2-11(5')로부터 동정된 CT256에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 569는 클론 CTL2gam6(5') 및 CTL2-11(5')로부터 동정된 CT257에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 570는 클론 CTL2gam6(3') 및 CTL2-11(3')로부터 동정된 CT384에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 571는 클론 CTL2-8b로부터 동정된 CT473에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 572는 클론 CTL2-8b로부터 동정된 CT474에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 573는 클론 CTL2-8b로부터 동정된 CT139(oppA1)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 574는 클론 CTL2-8b로부터 동정된 CT060(flhA)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 575는 클론 CTL2gam8로부터 동정된 CT242에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 576는 클론 CTL2gam8로부터 동정된 CT243(lpxD)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 577는 클론 CTL2-9, CTL2gam1, CTL2gam17 및 CTL2-19(5')로부터 동정된CT089에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 578는 클론 CTL2-10(5')(3')로부터 동정된 CT610에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 579는 클론 CTL2-10(5')로부터 동정된 CT611에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 580는 클론 CTL2gam10 및 CTL2gam21로부터 동정된 CT154에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 581는 클론 CTL2-12로부터 동정된 CT833(infC)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D 아미노산 서열을 제시한다.
서열 582는 클론 CTL2gam15(5'), CTL2-16(5'), CTL2-18(5') 및 CTL2-23로부터 동정된 CT-ORF3에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 583는 클론 CTL2-16(3') 및 CTL2gam15(3')로부터 동정된 CT827(nrdA)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 584는 클론 CTL2-16(3') 및 CTL2gam15(3')로부터 동정된 CT828(nrdB)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 585는 클론 CTL2gam18로부터 동정된 CT067(ytgA)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 586는 클론 CTL2-18(3')로부터 동정된 pCT-ORF4에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 587는 클론 CTL2-18(3')로부터 동정된 CT-ORF5에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 588는 클론 CTL2-19(5')로부터 동정된 CT087에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 589는 클론 CTL2-19(5')로부터 동정된 CT088(sycE)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 590는 클론 CTL2gam23로부터 동정된 CT588(rsbu)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 591는 클론 CTL2gam24로부터 동정된 CT199(oppB1)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 592는 클론 CTL2-4로부터 동정된 CT545(dnaE)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 593는 클론 CTL2gam27로부터 동정된 CT288에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 594는 클론 CTL2gam30(5')(3')로부터 동정된 CT413(pmpB)에 대한 씨. 트라코마티스 LGV II 서열과 상동성인 완전한 길이의 씨. 트라코마티스 혈청형 D DNA 서열을 제시한다.
서열 595은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT102의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0406에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 596은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT098의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0315에 대한 DNA 서열을 제시한다.
서열 597은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT102의 클라미디아 뉴모니애 상동체, CPn0406에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 598은 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT098의 클라미디아 뉴모니애상동체, CPn0315에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열 599은 클라미디아 트라코마티스 혈청형 D CT287 단백질에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
본 발명은 일반적으로, 클라미디아 감염(Chlamydial infection)을 탐지 및 치료하는 것에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 클라미디아(Chlamydia) 항원을 포함하는 폴리펩티드, 및 클라미디아 감염의 혈청진단(serodiagnosis) 및 치료를 위한 상기 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
도 1은 클론 4C9-18#2를 발현하는 표적 세포에 의해 활성화된 클라미디아-특이적 T 세포주로부터의 INF-γ의 유도를 도시한 것이다.
도 2는 코작(Kosak) 해독 개시 부위와 정지 코돈을 함유하도록 변형된 레트로바이러스성 벡터 pBIB-KS1,2,3을 도시한 것이다.
도 3은 클라미디아 펩티드 CtC7.8-12(서열 18) 및 CtC7.8-13(서열 19)로 펄스된 P815 세포의 크로뮴 방출 검정에서의 특이적 용해율을 도시한 것이다.
도 4는 씨. 트라코마티스 SWIB 단백질로 면역시킨 C57B1/6 마우스에서의 항체 이소형(isotype) 역가치를 도시한 것이다.
도 5는 씨. 트라코마티스 SWIB 단백질로 면역시킨 C3H 마우스로부터의 비장 세포에서의 클라미디아-특이적 T-세포 증식성 반응을 도시한 것이다.
도 6은 씨. 뉴모니애로부터의 SWIB 및 S13 유전자를 분리하기 위해 사용되었던 씨. 뉴모니애로부터 고안된 5' 및 3' 프라이머 서열을 도시한 것이다.
도 7A 및 7B는 클라미디아 단백질을 발현하는 단구-유도된 수지상 세포에 의한 활성화시 씨. 트라코마티스 및 씨. 뉴모니애와 교차 반응할 수 있는 사람 항-클라미디아 T-세포주(TCL-8)로부터의 IFN-γ의 유도를 도시한 것이다.
도 8은 T-세포주 TCL 8 EB/DC를 이용하여 클라미디아 리보솜 S13 단백질 중의 T 세포 에피토프를 동정하는 것을 도시한 것이다.
도 9A 및 9B는 씨. 트라코마티스 SWIB 단백질에 대해서가 아니라, 씨. 뉴모니애 SWIB 단백질에 대한, 씨. 뉴모니애-감염된 수지상 세포에 대해 생성된 CP-21 T-세포의 증식성 반응을 도시한 것이다.
도 10은 자각 증상이 없는 공여체로부터의 1차적인 T-세포주(TCT-10 EB)의 씨. 트라코마티스-특이적 SWIB 증식성 반응을 도시한 것이다.
도 11은 항원 특이적 T-세포주(TCL-10 EB)를 이용하여 씨. 트라코마티스 SWIB 중의 T-세포 에피토프를 동정하는 것을 도시한 것이다.
도 12는 CT 특이적 항원 CT622, CT875 및 CT EB에 대해 두 환자로부터 생성된 1차적인 T 세포주의 씨. 트라코마티스-특이적 증식성 반응을 도시한 것이다.
앞서 인지된 바와 같이, 본 발명은 일반적으로, 클라미디아 감염을 진단 및 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 한 국면에 있어서, 본 발명의 조성물은 클라미디아 항원 또는 이의 변이체의 적어도 하나의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
특정 양태에 있어서, 본 발명에는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 분자, 이러한 뉴클레오티드 서열의 상보체 및 이러한 서열의 변이체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 항원의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩티드가기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 완전한 길이의 단백질(즉, 항원)을 포함한 어떠한 길이의 아미노산 쇄도 포괄하는데, 이러한 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결된다. 따라서, 본 발명의 항원 중의 하나의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩티드는 전적으로 면역원성 부분만으로 구성되거나 부가의 서열을 함유할 수 있다. 이러한 부가의 서열은 본래의 클라미디아 항원로부터 유도될 수 있거나 이종일 수 있으며, 이러한 서열은 면역원성일 수 있다(그러나, 반드시 그럴 필요는 없다).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 가닥 또는 이중 가닥 중합체를 의미하고, 이에는 센스 및 안티-센스 쇄 모두의 DNA 및 상응하는 RNA 분자(HnRNA 및 mRNA 분자를 포함함), 및 cDNA, 게놈 DNA 및 재조합 DNA 뿐만 아니라 완전히 또는 부분적으로 합성된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. HnRNA 분자는 인트론을 함유하고 일반적으로 1 대 1 방식으로 DNA 분자에 상응한다. mRNA 분자는 인트론을 절제시킨 DNA 및 HnRNA 분자에 상응한다. 폴리뉴클레오티드는 전체 유전자 또는 이의 일부분으로 이루어질 수 있다. 작동 가능한 안티-센스 폴리뉴클레오티드는 상응하는 폴리뉴클레오티드의 단편을 포함할 수 있으므로, "폴리뉴클레오티드"의 정의에는 이러한 작동 가능한 안티-센스 단편 모두가 포함된다.
항원의 "면역원성 부분"은 클라미디아-감염된 개개인으로부터 수득된 혈청과 반응할 수 있는 특정 부분이다(즉, 이는 본원에 기재된 대표적인 ELISA 검정에서,감염되지 않은 개개인으로부터의 혈청으로 수득된 흡광도 보다 높은 적어도 3개의 표준 편차를 지닌, 감염된 개개인으로부터의 혈청을 이용한 흡광 판독치를 생성시킨다). 이러한 면역원성 부분은 일반적으로, 약 5개 이상, 보다 바람직하게는 약 10개 이상, 가장 바람직하게는 약 20개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 공지된 서열의 항원의 면역원성 부분을 제조 및 동정하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 문헌[참조: Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., Raven Press, 1993, pp.243-247] 및 이에 인용된 참조문헌에 요약된 방법이 포함된다. 이러한 기술에는 항원-특이적 항체, 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력을 알아보기 위해 폴리펩티드를 스크리닝하는 것이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 항혈청 및 항체는 이들이 항원과 특이적으로 결합되는 경우(즉, 이들이 ELISA 또는 기타 면역검정에서 단백질과 반응하고, 관련되지 않은 단백질과는 탐지 가능한 수준으로 반응하지 않을 경우)에 "항원 특이적"이다. 이러한 항혈청 및 항체는 널리 공지된 기술을 사용하고, 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 본래의 클라미디아 단백질의 면역원성 부분은 완전한 길이의 폴리펩티드의 반응성 보다 실질적으로 덜하지 않는 수준으로 상기 항혈청 및/또는 T-세포와 반응하는 부분이다(예를 들면, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 검정으로 이루어짐). 이러한 면역원성 부분은 상기 검정 내에서 완전한 길이의 폴리펩티드의 반응성과 유사하거나 이보다 큰 수준으로 반응할 수 있다. 이러한 스크린은 일반적으로, 당업자에게 널리 공지된 방법, 예를 들면, 문헌[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드를 고체 지지체 상에 고정화시킬 수 있고, 이를 환자 혈청과 접촉시켜 이러한 혈청 내의 항체가 상기 고정화된 폴리펩티드와 결합할 수 있게 한다. 결합되지 않은 혈청을 제거한 다음, 예를 들면,125I-표지된 단백질 A를 사용하여 결합된 항체를 탐지할 수 있다.
본 발명에 의해 고려된 항원의 면역원성 부분의 예에는 서열 9, 10, 18, 19, 31, 39, 93-96, 98, 100-102, 106, 108, 138-140, 158, 167, 168, 246, 247 및 254-256에 제시된 T 세포 자극성 에피토프가 포함된다. 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 클라미디아 항원의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩티드는 일반적으로, 단독으로 사용되거나 조합하여 사용되어 환자에게서 클라미디아 감염을 탐지할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 또한, 상기 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 분자의 변이체도 포괄한다. 이러한 변이체에는 본 발명의 서열의 천연 대립유전자 변이체가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 변이체에는 기타 클라미디아 혈청형, 예를 들면, 혈청형 D, E 및 F 뿐만 아니라 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 분자와 상동성을 나타내는 몇몇 LGV 혈청형이 포함된다. 바람직하게는, 이러한 혈청형 상동체는 본원에 기재된 상응하는 폴리펩티드 서열(들)과 95 내지 99%의 상동성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 폴리펩티드 "변이체"는 보존적 치환 및/또는 변형을 지니고 있다는 점에서만 해당 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드이며, 이로써 이러한 폴리펩티드의 항원성은 보유된다. 바람직한 양태에서는, 변이체 폴리펩티드가 5개 이하의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해서만, 동정된 서열과 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로, 상기 폴리펩티드 서열 중의 하나를 변형시킨 다음, 예를 들어, 본원에 기재된 대표적인 과정을 사용하여, 상기와 같이 변형된 폴리펩티드의 항원성을 평가함으로써 동정할 수 있다. 달리 말하면, 항원-특이적 항혈청과 반응하는 변이체의 능력은 본래의 단백질에 비해 증진되거나 변하지 않을 수 있거나, 또는 본래의 단백질에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만 정도 저하될 수 있다. 이러한 변이체는 일반적으로, 상기 폴리펩티드 서열 중의 하나를 변형시킨 다음, 이와 같이 변형된 폴리펩티드와, 본원에 기재된 바와 같은 항원 특이적 항체 또는 항혈청과의 반응성을 평가함으로써 동정할 수 있다. 바람직한 변이체에는 하나 이상의 부분, 예를 들면, N-말단 리더 서열 또는 막관통 도메인을 제거시킨 변이체가 포함된다. 기타 바람직한 변이체에는 작은 부분(예를 들면, 1-30 아미노산, 바람직하게는 5-15 아미노산)을 성숙한 단백질의 N- 및/또는 C-말단으로부터 제거시킨 변이체가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "보존적 치환"은 하나의 아미노산을 유사한 특성을 지니고 있는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것이어서, 펩티드 화학 분야의 숙련인은 이러한 폴리펩티드의 2차 구조와 수치료 성질이 실질적으로 변화되지 않는다고 예상할 것이다. 아미노산 치환은 일반적으로, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질에 있어서의 유사성에 근거하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 음전하를 띤 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되고;양전하를 띤 아미노산에는 리신 및 아르기닌이 포함되며; 유사한 친수성 값을 갖는 전하를 띠지 않는 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산에는 루이신, 이소루이신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신이 포함된다. 보존적 변화를 나타낼 수 있는 기타 그룹의 아미노산에는 다음이 포함된다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his. 변이체는 또한, 비-보존적 변화를 가질 수도 있다. 바람직한 양태에서는, 변이체 폴리펩티드는 5개 이하의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킴으로써 본래의 서열과 상이하다. 변이체는 또한, 예를 들면, 해당 폴리펩티드의 면역원성, 2차 구조 및 수치료 성질에 최소한의 영향을 미치는 아미노산을 결실 또는 부가함으로써 변형시킬 수 있다. 변이체는 또한, 해당 폴리펩티드의 항원성, 2차 구조 및 수치료 성질에 대해 최소한의 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 부가를 포함한 기타 변형을 나타낼 수도 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 단백질의 전이를 해독과 함께 또는 해독 후에 지시하는 단백질의 N-말단에서 시그날(또는 리더) 서열과 접합시킬 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 또한, 폴리펩티드(예를 들면, 폴리-His)의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해서 또는 고체 지지체에 대한 폴리펩티드의 결합을 증진시키기 위해 링커 또는 기타 서열에 접합시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드를 면역글로불린 Fc 영역에 접합시킬 수도 있다.
폴리뉴클레오티드 "변이체"는 암호화된 폴리펩티드의 면역원성이 본래의 단백질에 비해 감소되지 않으면서 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 치환 또는 부가를지니고 있다는 점에서 본 발명에 제시된 뉴클레오티드 서열과 상이한 서열이다. 암호화된 폴리펩티드의 면역원성에 대한 효과는 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들면, 문헌[참조: Adelman et al.,DNA, 2:183, 1983]에 교시된 바와 같은 올리고뉴클레오티드-지시된 부위-특이적 돌연변이유발과 같은 표준 돌연변이유발 기술을 사용하여 용이하게 도입할 수 있다. 뉴클레오티드 변이체는 다음에 논의된 바와 같은 천연의 대립유전자성 변이체이거나, 천연이 아닌 변이체일 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 폴리펩티드에는 본원에 구체적으로 제시된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상동성인 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 변이체가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 "실질적인 상동성"은 적당히 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 적당히 엄격한 조건에 적합한 것에는 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서 예비 세척하고; 50 내지 65℃에서 5X SSC를 사용하여 밤새 하이브리드화시키거나, 또는 교차-종 상동성의 경우에는 45℃에서 0.5X SSC를 사용하여 하이브리드화시킨 다음; 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각을 사용하여 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것이 포함된다. 이와 같이 폴리뉴클레오티드 서열을 하이브리드화하는 것 역시 본 발명의 범위 내에 속하는데, 암호 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 본 발명의 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열도 마찬가지이다.
2개의 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은, 이들이 다음에 기재된 바와 같이 최대의 상응을 위해 정렬될 때 상기 두 서열 내의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 동일한 경우에 "동일한" 것으로 간주된다. 두 서열 간의 비교는 전형적으로, 서열 유사성을 지닌 국부 영역을 동정하여 이를 비교해주는 비교 창을 통하여 상기 서열들을 비교함으로써 수행한다. 본원에 사용된 바와 같은 "비교 창"은 두 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 한 서열을 동일한 수의 연속된 위치의 기준 서열과 비교할 수 있는, 약 20개 이상, 통상적으로 30 내지 약 75개, 40 내지 약 50개의 연속된 위치의 세그먼트를 지칭한다.
비교를 위해 서열을 최적으로 정렬하는 것은 디폴트 파라미터를 사용하여, 바이오인포매틱스 소프트웨어의 레이저진(Lasergene) 스위트(suite) 내의 메그알린(Megalign) 프로그램(공급처: DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 프로그램은 다음 참조 문헌에 기재된 몇몇 정렬 도식을 포함한다[참조: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships; Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Proteins Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645Methods in Enzymologyvol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M.(1989) Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputerCABIOS5:151-153; Myers, E.W. and Muller W. (1988) Optimal alignments in linear spaceCABIOS4:11-17; Robinson, E.D. (1971)Comb. Theor 11: 105; Santou, N. Nes, M. (1987) The neighbor joining method. A new method for reconstructingphylogenetic treesMol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973)Numerical Taxonomy - the Principles and Practice fo Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banksProc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730].
또 다른 한편, 비교를 위한 서열이 최적 정렬은, 문헌[참조: Smith and Waterman (1981)Add. APL. Math.2:482]의 국부 동일성 알고리듬; 문헌[참조: Needleman and Wunshc (1970)J. Mol. Biol.48:443]의 동일성 정렬 알고리듬; 문헌[참조: Pearson and Lipman (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:2444]의 유사성 방법에 대한 조사; 이들 알고리듬의 컴퓨터 이행[Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(GCG)(575 Science Dr., Madison, WI)의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA]; 또는 검사에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성과 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리듬의 한 가지 예시적 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리듬인데, 이는 각각 문헌[참조: Altschul et al. (1977)Nucl. Acids Res.25:3389-3402; and Altschul et al. (1990)J. Mol. Biol.215:403-410]에 기재되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은, 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 서열 동일성을 결정하기 위해, 본원에 기재된 파라미터를 사용할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 다음 공급처[National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)]로부터 입수 가능하다. 한 가지 예에서는, 뉴클레오티드 서열의 경우에는, 파라미터 M(정합 잔기 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 >0이다) 및 N(부정합 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 <0이다)을 사용하여, 누적 스코어를 산정할 수 있다. 아미노산 서열의 경우에는, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 산정할 수 있다. 누적 정렬 스코어가 이의 최대 달성치로부터 양 X 정도로 떨어지거나; 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 정렬의 축적으로 인해, 누적 스코어가 0 이하로 되거나; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달하게 되면, 각 방향으로의 워드 히트(word hit)의 확장을 중지한다. BLAST 알고리듬 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정해준다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 워드길이(W), 10의 기대값(E) 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스[참조: Henikoff and Henikoff (1989)Proc.Natl. Acad. Sci. USA89:10915] 정렬, 50의 (B), 10의 기대값(E), M=5, N=-4 및 양 쇄에 대한 비교치를 이용한다.
바람직하게는, "서열 동일성 %"은 최적으로 정렬된 두 서열을 20개 이상 위치의 비교 창을 통해 비교함으로써 결정하는데, 여기서 상기 비교 창 내의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 일정 부분은, 두 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열(부가물 또는 결실물을 포함하지 않음)과 비교해서 20% 이하, 통상적으로 5 내지 15% 또는 10 내지 12%의 부가물 또는 결실물(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 이러한 비율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양 서열에 존재하는 위치의 수를 결정하여, 정합된 위치의 수를 산출하고; 이와 같이 산출된 정합된 위치의 수를 기준 서열 내의 위치 총 수(즉, 창 크기)로 나눈 다음; 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 %을 산출함으로써 산정한다.
따라서, 본 발명은, 본원에 기재된 서열과 상당한 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열, 예를 들면, 본원에 기재된 방법(예: 다음에 기재된 바와 같은, 표준 파라미터를 사용하는 BLAST 분석)을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교한 서열 동일성이 50% 이상, 바람직하게는 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 제공한다. 당업자는 이들 값을 적당히 조정하여, 코돈 축퇴성(codon degeneracy), 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치 등을 고려하여 두 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질의 상응하는 동일성을 결정할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
부가의 양태에서는, 본 발명이 본원에 기재된 하나 이상의 서열과 동일하거나 이에 상보성인 서열의 연속되는 각종 길이의 연장물을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 의해 포괄된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 본원에 기재된 하나 이상의 서열의 약 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 또는 1000개 이상의 연속되는 뉴클레오티드 뿐만 아니라 이들 사이의 모든 중간 길이의 뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 맥락에서 "중간 길이"란 인용된 값 사이의 모든 길이, 예를 들면, 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23 등; 30, 31, 32등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등(200-500, 500-1,000 사이의 모든 정수 등을 포함함)를 의미한다는 것을 용이하게 인지할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편은 그 자체의 암호화 서열의 길이와 상관없이, 기타 DNA 서열, 예를 들면, 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 부가의 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 기타 암호화 세그먼트 등과 조합할 수 있기 때문에, 이들의 전반적인 길이가 상당히 다양할 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 핵산 단편을 이용할 수 있다는 것이 고려되는데, 총 길이는 바람직하게는 제조의 용이성 및 의도하는 재조합 DNA 프로토콜에서의 용도에 따라서 제한된다. 예를 들면, 총 길이가 약 10,000, 약 5000, 약 3000, 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50개 등(모든 중간 길이 포함) 염기쌍인 것으로 예시되는 DNA 세그먼트가 본 발명의 수 많은 이행에 유용한 것으로 고려된다.
또한, 본 발명의 범위 내에는, 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 유전자의 대립유전자가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 "대립유전자" 또는 "대립유전자성 서열"은 해당 핵산 서열에서 하나 이상의 돌연변이로부터 비롯될 수 있는 유전자의 대체 형태이다. 대립유전자는 이의 구조 또는 기능이 변하거나 변하지 않을 수 있는 변형된 mRNA 또는 폴리펩티드를 가져다줄 수 있다. 소정의 어떠한 유전자도 대립유전자 형태를 전혀 가지지 않거나, 1개 가지거나 또는 많이 가질 수 있다. 대립유전자를 유발시키는 통상의 돌연변이적 변화는 일반적으로, 뉴클레오티드의 천연의 결실, 부가 또는 치환에서 비롯된다. 이들 유형의 변화 각각은 소정의 서열 내에서 1회 이상 단독으로 발생되거나 다른 변화와 조합해서 발생될 수 있다.
특정 양태에서는, 본 발명이 (a) 서열 358-361, 407-430, 525-559 및 582-598로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열; (b) 이러한 DNA 서열의 상보체; 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 실질적으로 상동성인 DNA 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 클라미디아 항원(또는 이러한 항원의 변이체)의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 다음의 실시예에 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 몇몇 클라미디아 항원은 클라미디아 트라코마티스 및 클라미디아 뉴모니애 감염된 단구-유래된 수지상 세포 모두를 인식하는 T 세포주를 인식하는데, 이는 이들이 클라미디아 트라코마티스 및 클라미디아 뉴모니애에 의해 공유된 면역반응성 에피토프를 나타낼 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 항원은 씨. 트라코마티스 생식기 감염과 씨. 뉴모니애 감염 모두에 대한 백신에 사용할 수 있다. 교차 반응성의 정도를 결정하기 위해 클라미디아 트라코마티스 및 클라미디아 뉴모니애로부터 이들 클라미디아 항원의 성상을 추가로 확인하는 것이 실시예 6에 제시되어 있다. 부가적으로, 실시예 4에는 클라미디아-특이적인 쥐의(murine) CD8+T 세포주를 자극할 수 있는 단백질(서열 17-19 및 32)을 암호화하는 씨. 트라코마티스로부터 분리된 cDNA 단편(서열 15, 16 및 33)이 기재되어 있다.
일반적으로, 클라미디아 항원, 및 이러한 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 각종 과정을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 클라미디아 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 다음에 기재된 바와 같이 클라미디아-특이적 T 세포주로 스크리닝함으로써 클라미디아 게놈 또는 cDNA 발현 라이브러리로부터 분리할 수 있고, 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 서열화할 수 있다. 부가적으로, 폴리뉴클레오티드는 클라미디아-관련 발현(즉, 본원에 제공된 대표적인 검정을 이용하여 결정된 바와 같이, 대조군에서 보다 클라미디아 감염된 세포에서 2배 이상 많이 나타나는 발현)을 알아보기 위해 cDNA의 마이크로어레이(microarray)를 스크리닝함으로써, 다음에 보다 상세히 기재되는 바와 같이 동정할 수 있다. 이러한 스크린은 신테니(Synteni) 마이크로어레이(Palo Alto CA)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라서 수행할 수 있고, 본질적으로 문헌[참조: Schena et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:10614-10619, 1996 and Heller et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA94:2150-2155, 1997]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 또 다른 한편으론, 본원에 기재된 단백질을 발현하는 세포로부터 제조된 cDNA로부터 폴리펩티드를 증폭시킬 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통하여 증폭시킬 수 있다. 이러한 접근 방법의 경우에는, 본원에 제공된 서열을 기준으로 하여 서열-특이적 프라이머를 고안할 수 있고, 이는 구입하거나 합성할 수 있다.
항원은, 이러한 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 벡터 내로 삽입하고, 상기 항원을 적당한 숙주에서 발현시킴으로써, 다음에 기재되는 바와 같이 재조합적으로 생성시킬 수 있다. 항원을 대상으로 하여, 다음에 기재된 바와 같이 클라미디아 감염된 개개인으로부터 수득된 혈청과 반응하는 능력과 같은 목적하는 특성에 대해 평가할 수 있으며, 예를 들어, 전통적인 에드만 화학을 사용하여 서열화할 수 있다[참조: Edman and Berg,Eur. J. Biochem.80:116-132, 1967].
항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 분리된 항원의 부분 아미노산서열로부터 유도된 축퇴성 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해, 적당한 클라미디아 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 이러한 스크린에 사용하기 위한 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열을 고안 및 합성할 수 있고, 이러한 스크린은, 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY(및 이에 인용된 참조문헌)]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 당해 분야에 널리 공지된 방법에서 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 또한 수행하여, cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 핵산 프로브를 분리시킬 수도 있다. 이어서, 이와 같이 분리된 프로브를 사용하여 라이브러리 스크린을 수행할 수 있다.
증폭된 부분을 사용하여, 널리 공지된 기술을 이용하여 적합한 라이브러리(예: 클라미디아 cDNA 라이브러리)로부터 완전한 길이의 유전자를 분리시킬 수 있다. 이러한 기술 내에서는, 증폭에 적합한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머를 사용하여, 라이브러리(cDNA 또는 게놈)를 스크리닝한다. 바람직하게는, 라이브러리가 보다 큰 분자를 포함하도록 이를 크기-선별한다. 유전자의 5' 및 상류 영역을 동정하는 데에는, 무작위로 프라이밍된 라이브러리가 바람직할 수도 있다. 인트론을 수득하고 5' 서열을 연장시키는 데에는 게놈 라이브러리가 바람직하다.
하이브리드화 기술의 경우에는, 널리 공지된 서열을 사용하여 부분 서열을표지시킬 수 있다(예를 들면, 니크(nick)-해독시키거나32P로 말단-표지시킴). 이어서, 변성된 세균성 콜로니를 함유하는 필터[또는 파아지 플라크를 함유하는 론(lawn)]를 상기와 같이 표지된 프로브와 하이브리드화시킴으로써, 세균성 또는 박테리오파아지 라이브러리를 스크리닝한다[참조: Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989]. 하이브리드화되는 콜로니 또는 플라크를 선별 및 확장하고, 추가의 분석을 위해 DNA를 분리시킨다. cDNA 클론을, 예를 들면, 상기 부분 서열로부터의 프라이머 및 벡터로부터의 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 분석하여 부가의 서열량을 결정할 수 있다. 제한 지도 및 부분 서열을 생성시켜 하나 이상의 중복 클론을 동정할 수 있다. 이어서, 일련의 결실 클론을 생성시키는 것을 포함할 수 있는 표준 기술을 사용하여 완전한 서열을 결정할 수 있다. 이어서, 이로써 생성된 중복 서열을 단일 연속 서열 내로 어셈블리시킨다. 널리 공지된 기술을 사용하여 적합한 단편을 연결시킴으로써, 완전한 길이의 cDNA 분자를 생성시킬 수 있다.
또 다른 한편, 부분 cDNA 서열로부터 완전한 길이의 암호화 서열을 수득하기 위한 수 많은 증폭 기술이 있다. 이러한 기술 내에서는, 증폭을 일반적으로 PCR을 통하여 수행한다. 어떠한 각종 시판용 키트를 사용해서도 증폭 단계를 수행할 수 있다. 예를 들면, 당해 분야에 널리 공지된 기술[참조: Mullis et al.,Cold Spring Harbor Symp. Quanti. Biol. 51:263, 1987; Erlich ed.,PCR Technology,Stockton Press, NY, 1989] 및 당해 분야에 널리 공지된 소프트웨어를 사용하여 프라이머를 고안할 수 있다. 프라이머는 바람직하게는, 길이가 22 내지 30개 뉴클레오티드이고, GC 함량이 50% 이상이며, 약 68 내지 72℃의 온도에서 표적 서열에 대해 어닐링시킨다. 이와 같이 증폭된 영역을 대상으로 하여, 상기 언급된 바와 같이 서열 분석할 수 있고, 중복 서열을 연속된 서열 내로 어셈블리시킨다.
이러한 증폭 기술 중의 한 가지 기술은, 제한 효소를 사용하여 유전자의 공지된 영역 내에 특정 단편을 생성시키는 역(inverse) PCR이다[참조: Triglia et al.,Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988]. 이어서, 상기 단편을 분자내 연결시킴으로써 환형으로 만들고, 이를 공지된 영역으로부터 유도된 분기성 프라이머를 이용하는 PCR용 주형으로서 사용한다. 또 다른 접근법 내에서는, 부분 서열에 인접한 서열을, 링커 서열에 대한 프라이머 및 공지된 영역에 특이적인 프라이머를 이용하여 증폭시킴으로써 회수할 수 있다. 이와 같이 증폭된 서열을 대상으로 하여, 전형적으로 상기와 동일한 링커 프라이머 및 공지된 영역에 특이적인 제2 프라이머를 이용하여 제2 라운드의 증폭을 수행한다. 공지된 서열로부터 반대 방향으로 연장을 개시하는 2개의 프라이머를 이용하는, 상기 과정에 대한 변형법이 WO 96/38591에 기재되어 있다. 부가의 기술에는 포획 PCR[참조: Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991] 및 워킹(walking) PCR[참조: Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60, 1991]이 포함된다. 전사-매개된 증폭 또는 TMA가 국제특허출원 제PCT/US91/03184호에 기재된 바와 같이, DNA, rRNA 또는 mRNA를 증폭시키는데 이용될 수 있는 또 다른 방법이다. 이러한 자가촉매적 및 등온적 비-PCR 이용 방법은 2개의 프라이머와 2개의 효소를 활용한다: RNA 폴리머라제 및 역전사효소. 하나의 프라이머는 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 함유한다. 제1 증폭에서는, 상기 프로모터-프라이머가 규정된 부위에서 표적 rRNA와 하이브리드화된다. 역전사효소는 상기 프로모터-프라이머의 3' 말단으로부터 연장함으로써 표적 rRNA의 DNA 복사물을 생성시킨다. 이로써 생성된 복합체 중의 RNA가 분해되고, 제2의 프라이머가 상기 DNA 복사물과 결합된다. 이중 가닥 DNA를 생성시키는 역전사효소에 의해 상기 프라이머의 말단으로부터 새로운 DNA 가닥이 합성된다. RNA 폴리머라제는 DNA 주형 내의 프로모터 서열을 인식하고 전사를 개시한다. 이와 같이 새로이 합성된 RNA 앰플리콘 각각이 TMA 과정에 재도입되고, RNA 앰플리콘의 지수적 증대를 유발시키는 새로운 라운드의 복제를 위한 주형으로서 제공된다. 증폭을 이용하는 기타 방법을 이용하여, 완전한 길이의 cDNA 서열을 수득할 수도 있다.
특정의 경우, 유전자 뱅크(GenBank)로부터 입수 가능한 것과 같은, 발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스에 제공된 서열을 분석함으로써 완전한 길이의 cDNA 서열을 수득하는 것이 가능한다. 중복 EST에 대한 조사는 일반적으로, 널리 공지된 프로그램(예: NCBI BLAST 조사)을 사용하여 수행할 수 있고, 이러한 EST를 사용하여 연속되는 완전한 길이의 서열을 생성시킬 수 있다. 완전한 길이의 cDNA 서열은 또한, 게놈 단편을 분석함으로써 수득할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 일반적으로, 예를 들어, 고체 상 포스포르아미다이트 화학적 합성에 의한 화학적 합성을 포함한, 당해 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 제조할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열 내의 변형은, 표준 돌연변이유발 기술, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-지시된 부위-특이적 돌연변이유발[참조: Adelman et al., DNA 2:183, 1983]을 이용하여 도입할 수도 있다. 또 다른 한편으론, 클라미디아 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 DNA 서열을 시험관내 또는 생체내에서 전사함으로써 RNA 분자를 생성시킬 수 있는데, 단 상기 DNA는 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터(예: T7 또는 SP6)를 갖는 벡터 내로 도입시킨다. 특정 부분을 이용하여, 본원에 기재된 바와 같은 암호화된 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 또는 또 다른 한편으론, 특정 부분을 환자에게 투여하여, 상기 암호화된 폴리펩티드를 생체내에서 생성시킨다(예를 들면, 항원 제시 세포, 예를 들면, 수지상 세포를, 클라미디아 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 작제물로 형질감염시키고, 이와 같이 형질감염된 세포를 상기 환자에게 투여한다).
암호화 서열에 상보적인 서열 부분(즉, 안티센스 폴리뉴클레오티드)을 프로브로서 사용하거나 또는 유전자 발현을 조정하기 위해 사용할 수도 있다. 안티센스 RNA로 전사될 수 있는 cDNA 작제물을 조직 세포 내로 도입하여 안티센스 RNA의 생성을 촉진시킬 수도 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드를 본원에 기재된 바와 같이 사용하여 클라미디아 단백질의 발현을 억제시킬 수 있다. 안티센스 기술을 사용하여, 폴리머라제, 전사 인자 또는 조절성 분자의 결합에 충분하도록 이중 나선을 개방시키는 능력을 절충시켜 주는 3중-나선 형성을 통하여 유전자 발현을 제어할 있다[참조: Gee et al., In Huber and Carr,Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co.(Mt. Kisco, NY; 1994)]. 또 다른 한편, 특정유전자의 제어 영역(예를 들면, 프로모터, 인핸서 또는 전사 개시 부위)과 하이브리드화하고 이러한 유전자의 전사를 차단시키거나; 또는 리보솜에 대한 전사체의 결합을 억제함으로써 해독을 차단시키는 안티센스 분자를 고안할 수 있다.
암호화 서열 또는 상보성 서열의 일정 부분을, 유전자 발현을 탐지하기 위한 프로브 또는 프라이머로서 고안할 수도 있다. 프로브를 각종 리포터 그룹, 예를 들면, 방사성핵종 및 효소로 표지시킬 수 있으며, 이의 길이는 바람직하게는 10개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 30개 이상의 뉴클레오티드이다. 앞서 인지된 바와 같은 프라이머는 길이가 바람직하게 22 내지 30개 뉴클레오티드이다.
어떠한 폴리뉴클레오티드도 추가로 변형시켜 생체내 안정성을 증가시킬 수 있다. 가능한 변형법에는 5' 및/또는 3' 말단에 플랭킹 서열을 부가하는 방법; 주쇄 내에 포스포디에스테라제 연결 보다는 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸을 사용하는 방법; 및/또는 비-전통적인 염기, 예를 들면, 이노신, 쿠에오신 및 위부토신(wybutosine)을 포함시킬 뿐만 아니라 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 기타 변형된 형태를 포함시키는 방법이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열은 확립된 재조합 DNA 기술을 사용하여 각종의 기타 뉴클레오티드 서열에 연결시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 파아지미드, 람다 파아지 유도체 및 코스미드(cosmid)를 포함한, 각종의 어떠한 클로닝 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 특히 관심있는 벡터에는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 서열 분석 벡터가 포함된다. 일반적으로, 벡터는 하나 이상의 유기체 내에서 작용성인 복제 기점, 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선별성 마커를 함유할 것이다. 기타 요소들은 목적하는 용도에 좌우될 것이며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
약 100개 미만의 아미노산, 일반적으로 약 50개 미만의 아미노산을 갖는 합성 폴리펩티드는 당해 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 예를 들면, 이러한 폴리펩티드는 시판되고 있는 고체 상 기술, 예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고체 상 합성법[이러한 방법에서는, 아미노산을 성장하는 아미노산 쇄에 연속해서 가한다][참조: Merrifield,J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963]을 사용하여 합성할 수 있다. 폴리펩티드 자동화 합성 장비는 공급업자[Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster, City, CA]로부터 시판중이며, 이는 제조업자의 지시에 따라서 작동될 수 있다.
상기 인지된 바와 같이, 클라미디아 항원의 면역원성 부분은 널리 공지된 기술, 예를 들면, 문헌[참조: Paul,Fundamental Immunology,3d ed., Raven Press, 1993, pp.243-247 및 이에 인용된 참조문헌]에 요약된 기술을 사용하여 제조 및 동정할 수 있다. 이러한 기술에는 면역원성을 알아보기 위해 본래의 항원의 폴리펩티드 부분을 스크리닝하는 것이 포함된다. 본원에 기재된 대표적인 ELISA가 일반적으로 상기 스크린에 이용될 수 있다. 폴리펩티드의 면역원성 부분은, 상기 대표적인 검정 내에서, 완전한 길이의 항원에 의해 생성된 것과 실질적으로 유사한 시그날을 생성시키는 부분이다. 달리 말하면, 클라미디아 항원의 면역원성 부분은본원에 기재된 바와 같은 모델 ELISA에서 완전한 길이의 항원에 의해 유도된 시그날의 약 20% 이상, 바람직하게는 약 100%를 생성시킨다.
클라미디아 항원의 일정 부분 및 기타 변이체는 합성 또는 재조합 수단에 의해 생성시킬 수 있다. 본래 항원의 변이체는 일반적으로, 표준 돌연변이유발 기술, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-지시된 부위-특이적 돌연변이유발 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 표준 기술을 사용하여 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 절편을 제거하여, 절두된(turncated) 폴리펩티드를 제조할 수도 있다.
본래 항원의 일정 부분 및/또는 변이체를 함유하는 재조합 폴리펩티드는, 당업자에게 널리 공지된 각종 기술을 사용하여 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들면, 재조합 단백질을 배양 배지 내로 분비시키는데 적합한 숙주/벡터 시스템으로부터의 상등액을 먼저, 시판용 필터를 사용하여 농축시킬 수 있다. 농축 후, 이 농축액을 친화 매트릭스 또는 이온-교환 수지와 같은 적합한 정제용 매트릭스에 적용할 수 있다. 최종적으로, 한 가지 이상의 역상 HPLC 단계를 이용하여 재조합 단백질을 추가로 정제할 수 있다.
당업자에게 공지된 각종 발현 벡터를 이용하여 본원에 기재된 바와 같은 재조합 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 발현은 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨 적당한 어떠한 숙주에서도 이루어질 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵생물 세포, 효모 세포 및 고등 진핵생물 세포가 있다. 바람직하게는, 이용된 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli), 효모 또는 포유류 세포주(예: COS 또는 CHO)이다. 이러한 방식으로 발현된 DNA 서열은 천연 항원, 천연 항원의 일정 부분 또는 이의 기타 변이체를 암호화할 수 있다.
일반적으로, 제조 방법에 상관없이, 본원에 기재된 폴리펩티드는 분리된, 실질적으로 순수한 형태로 제조된다. 바람직하게는, 당해 폴리펩티드는 순도가 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상이다.
특정의 양태 내에서는, 폴리펩티드가 본원에 기재된 바와 같은 다중의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 또는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 및 관련되지 않은 서열, 예를 들면, 공지된 클라미디아 단백질을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 융합 파트너는, 예를 들면, T 헬퍼 에피토프(면역학적 융합 파트너), 바람직하게는 사람에 의해 인식된 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 것을 도와주거나, 또는 본래의 재조합 단백질 보다 높은 수율로 단백질(발현 인핸서)을 발현시키는 것을 도와줄 수 있다. 특정의 바람직한 융합 파트너는 면역학적이면서 발현 증진성인 융합 파트너이다. 기타 융합 파트너는 해당 단백질의 용해도를 증가시키거나 해당 단백질이 목적하는 세포내 구획으로 표적화될 수 있도록 선택될 수 있다. 또한, 추가의 융합 파트너에는 단백질의 정제를 촉진시키는 친화성 태그가 포함된다. 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제하여, 예를 들어, 제1 및 제2의 폴리펩티드를 암호화하는 별개의 DNA 서열을 적당한 발현 벡터 내로 어셈블리시킬 수 있다. 제1의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 3' 말단을, 펩티드 링커를 사용하거나 사용하지 않고,제2의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단에 연결시켜, 이들 서열의 판독 프레임이 동일한 상에 있도록 하여, 상기 2개의 DNA 서열의 mRNA가 상기 제1 및 제2의 폴리펩티드 모두의 생물학적 활성을 보유하는 단일 융합 단백질로 해독될 수 있다.
펩티드 링커 서열을 사용하여, 각각의 폴리펩티드가 이의 2차 및 3차 구조로 폴딩되도록 보장해주기에 충분한 거리 정도 만큼 상기 제1 및 제2 폴리펩티드를 분리시킬 수 있다. 이러한 펩티드 링커 서열은 당해 분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 융합 단백질 내로 도입시킨다. 적합한 펩티드 링커 서열은 다음 요인들을 기준으로 하여 선택할 수 있다: (1) 가요성 확장된 입체 구조에 적응하는 이들의 능력; (2) 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 상의 작용성 에피토프와 반응할 수 있는 2차 구조에 적응하지 못하는 이들의 능력; 및 (3) 폴리펩티드 작용성 에피토프와 반응할 수도 있는 소수성 또는 전하를 띤 잔기의 결여. 바람직한 펩티드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. 기타 거의 중성인 아미노산, 예를 들면, Thr 및 Ala를 링커 서열에 사용할 수도 있다. 링커로서 유용하게 이용될 수 있는 아미노산 서열에는 문헌[참조: Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; 미국 특허 제4,935,233호 및 제4,751,180호]에 기재된 것들이 포함된다. 링커 서열은 길이가 1 내지 약 50개 아미노산일 수 있다. (경우에 따라) 펩티드 링커 서열 사용에 대한 대안책으로서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 상에 비-필수 N-말단 아미노산 영역(존재하는 경우)을 활용하여 작용성 도메인을 분리시키고 입체 간섭을 방지시킬 수 있다.
이와 같이 연결된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 해독 조절성 요소에 작동가능하게 연결된다. DNA의 발현에 관여하는 조절 요소는 제1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 5'에만 위치되어 있다. 유사하게, 말단 해독에 요구되는 정지 코돈 및 전사 종결 시그날은 제2 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 3'에만 존재한다.
본 발명의 폴리펩티드를, 관련되지 않은 면역원성 단백질과 함께 포함하는 융합 단백질이 또한 제공된다. 바람직하게는, 면역원성 단백질은 회수(recall) 반응을 유발시킬 수 있다. 이러한 단백질의 예에는 파상풍, 결핵 및 간염 단백질이 포함된다[참조: Stoute et al., New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997].
바람직한 양태 내에서는, 면역학적 융합 파트너를, 그람-음성 세균 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) B의 표면 단백질인 단백질 D로부터 유도시킨다(WO 91/18926). 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 대략 상기 단백질의 첫 번째 1/3(예를 들면, 제1 N-말단 100-110 아미노산)을 포함하고, 단백질 D 유도체를 지질화할 수 있다. 특정의 바람직한 양태 내에서는, 리포프로테인 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기가 N 말단 상에 포함되어 부가의 외인성 T-세포 에피토프를 갖는 폴리펩티드를 제공하고 이. 콜라이에서의 발현 수준을 증가시킨다(이로써 발현 인핸서로서 작용함). 상기 지질 말미(tail)는 항원 제시 세포에 대한 항원의 최적의 표시를 보장해준다. 기타 융합 파트너에는 인플루엔자 바이러스인 NS1로부터의 비-구조 단백질(헤마글루티닌)이 포함된다. T-헬퍼 에피토프를 포함하는 상이한 단편을 사용할 수도 있지만, 전형적으로, N-말단 81개 아미노산을 사용한다.
또 다른 양태에서는, 면역학적 융합 파트너가 LYTA로서 공지된 단백질, 또는이의 일정 부분(바람직하게는, C-말단 부분)이다. LYTA는 아미다제 LYTA(LytA 유전자에 의해 암호화됨; Gene 43:265-292, 1986)로서 공지된 N-아세틸-L-알라닌 아미다제를 합성시키는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된다. LYTA는 펩티도글리칸 주쇄 내의 특정 결합을 특이적으로 분해시키는 오토리신(autolysin)이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 몇몇 콜린 동족체, 예를 들면, DEAE에 대한 친화성에 관여한다. 이러한 성질은 융합 단백질의 발현에 유용한 이. 콜라이 C-LYTA 발현성 플라스미드의 개발을 이끌어내었다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 문헌에 보고되었다[참조: Biotechnology 10:795-798, 1992]. 바람직한 양태 내에서는, LYTA의 반복 서열 부분을 융합 단백질 내로 도입할 수 있다. 반복 서열 부분은 잔기 178에서 출발하는 C-말단 영역에서 발견된다. 특히 바람직한 반복 서열 부분에는 잔기 188-305가 도입되어 있다.
또 다른 양태에서는, 마이코박테륨 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)-유래된 Ra12 폴리뉴클레오티드를 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 적어도 면역원성 부분에 연결시킨다. 이들을 이종 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 증진시키는데 사용하기 위한 Ra12 조성물 및 방법이 미국 특허원 제60/158,585호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다)에 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, Ra12는 마이코박테륨 튜베르쿨로시스 MTB32A 핵산의 아서열(subsequence)인 폴리뉴클레오티드 영역을 지칭한다. MTB32A는 엠. 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 독성 및 무독성 균주 내의 유전자에 의해 암호화된32KD 분자량의 세린 프로테아제이다. MTB32A의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: 미국 특허원 제60/158,585호; Skeiky et al.,Infection and Immun.(1990) 67:3998-4007; 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 한 양태에서는, 융합 폴리펩티드를 생성하는데 사용된 Ra12 폴리펩티드가, 융합되는 이종 클라미디아 항원성 폴리펩티드의 면역원성 및/또는 발현을 증진시키는데 유효한 MTB32A 암호화 서열의 C-말단 단편을 포함한다. 또 다른 양태에서는, 상기 Ra12 폴리펩티드가 MTB32A의 아미노산 잔기 192 내지 323 중의 일부 또는 전부를 포함하는 MTB32A의 대략 14kD C-말단 단편에 상응한다.
관심있는 이종 클라미디아 폴리펩티드와 Ra12 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산은 통상적인 유전 공학 기술에 의해 용이하게 작제할 수 있다. 재조합 핵산은 바람직하게는, Ra12 폴리뉴클레오티드 서열이 선택된 이종 클라미디아 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 5'에 위치하도록 작제한다. Ra12 폴리뉴클레오티드 서열을 선택된 이종 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 3'에 위치하도록 하거나 또는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 Ra12 폴리뉴클레오티드 서열 내의 특정 부위 내로 삽입시키는 것이 적당할 수도 있다.
Ra12 또는 이의 일부 또는 기타 변이체를 암호화하는 적합한 어떠한 폴리뉴클레오티드도, 본원에 기재된 하나 이상의 클라미디아 폴리뉴클레오티드와 Ra12를 포함하는 재조합 융합 폴리뉴클레오티드를 작제하는데 사용할 수 있다. 바람직한 Ra12 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, Ra12 폴리펩티드의 일정 부분을 암호화하는, 약 15개 이상의 연속되는 뉴클레오티드, 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 약 60개 이상의 뉴클레오티드, 약 100개 이상의 뉴클레오티드, 약 200개 이상의 뉴클레오티드 또는 약 300개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
Ra12 폴리뉴클레오티드는 본래의 서열(즉, Ra12 폴리펩티드 또는 이의 부분을 암호화하는 내인성 서열)을 포함하거나 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오티드 변이체는, 암호화된 융합 폴리펩티드의 생물학적 활성이 본래의 Ra12 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드에 비해 실질적으로 저하되지 않도록, 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입물을 함유할 수 있다. 변이체는 바람직하게는, 본래의 Ra12 폴리펩티드 또는 이의 일정 부분를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성을 나타낸다.
또 다른 국면에서는, 본 발명은, 환자에게서 클라미디아 감염에 대한 보호 면역을 유도하기 위해, 하나 이상의 상기 폴리펩티드 또는 융합 단백질(또는 이러한 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 사용하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 "환자"는 모든 온혈 동물, 바람직하게는 사람을 지칭한다. 환자는 질병에 걸리거나 탐지 가능한 수준의 질병 및/또는 감염에 걸리지 않을 수 있다. 달리 말하면, 보호 면역을 유도하여 클라미디아 감염을 예방 또는 치료할 수 있다.
이러한 국면에서는, 당해 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 일반적으로, 약제학적 조성물 또는 백신 내에 존재한다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 폴리펩티드[이의 각각은 하나 이상의 상기 서열(또는 이의 변이체)을 함유할 수 있다]와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 백신은 하나 이상의 상기 폴리펩티드를 애쥬반트(adjuvant) 또는 리포솜(여기로 당해 폴리펩티드가 도입된다)과 같은 면역자극제와 함께 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물 및 백신은 기타 클라미디아 항원을, 조합 폴리펩티드 내로 도입된 상태로 함유하거나 또는 별개의 폴리펩티드 내에 존재하는 형태로 함유할 수 있다.
또 다른 한편, 백신은, 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드가 동일계에서 생성되도록 이러한 폴리펩티드 또는 융합 단백질 하나 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 이러한 백신에서는, 상기 폴리뉴클레오티드가 핵산 발현 시스템, 세균성 및 바이러스성 발현 시스템을 포함한 당업자에게 공지된 각종 전달 시스템 내에 존재할 수 있다. 적당한 핵산 발현 시스템은 환자에게서 발현에 필요한 폴리뉴클레오티드 서열(예: 적합한 프로모터 및 종결 시그날)을 함유한다. 세균성 전달 시스템은 이의 세포 표면 상에서 당해 폴리펩티드의 면역원성 부분을 발현하는 세균[예:Bacillus-Calmette-Guerrin]을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서는, 상기 폴리뉴클레오티드를 바이러스성 발현 시스템(예: 백시니아 또는 기타 폭스 바이러스(pox virus), 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입할 수 있는데, 이는 비-병원성(결함있는)의 바이러스를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 상기 발현 시스템 내로 도입시키는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Ulmer et al.,Science 259:1745-1749(1993); and Cohen,Science 259:1691-1692(1993)]에 기재된 바와 같이 "나출된(naked)" 플라스미드 벡터로서투여될 수 있다. 이러한 벡터 내로 DNA를 도입하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 레트로바이러스성 벡터는 선별 마커에 대한 유전자(형질도입된 세포의 동정 또는 선별을 도와주기 위함) 및/또는 표적화 잔기에 대한 유전자, 예를 들면, 특이적 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 암호화하는 유전자를 부가적으로 수송 또는 도입시켜, 상기 벡터가 표적 특이적이 되도록 할 수 있다. 표적화는 당업자에게 공지된 방법에 의해 특정 항체를 사용하여 달성할 수도 있다.
치료 목적의 기타 제형에는 콜로이드성 분산 시스템, 예를 들면, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미세구, 비드 및 지질계 시스템(수중유 에멀션, 마이셀, 혼합 마이셀 및 리포솜 포함)이 포함된다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기에 바람직한 콜로이드성 시스템은 리포솜(즉, 인공 막 소낭)이다. 나출된 폴리뉴클레오티드의 흡수는, 세포 내로 효율적으로 수송시켜 주는 생분해 가능한 비드 상에 및/또는 비드 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 증가시킬 수 있다.
상기 시스템의 제조 및 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다.
관련 국면에서는, 상기 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 백신을, 본 발명의 폴리펩티드 또는 공지된 클라미디아 항원과 동시에 투여하거나 이에 후속적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, "나출된" 것이거나 상기 언급된 바와 같은 전달 시스템 내에 도입된, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여한 후에 항원을 투여하여, 해당 백신의 보호 면역 효과를 증대시킬 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 클라미디아 감염을 치료하기 위한 양자(adoptive) 면역요법에 이용될 수 있다. 양자 면역요법은 능동 면역요법과 수동 면역요법으로 광범위하게 분류할 수 있다. 능동 면역요법에서는, 치료가, 면역 반응 변형제(예를 들면, 백신, 세균성 애쥬반트 및/또는 사이토킨)를 투여하여 내인성 숙주 면역 시스템을 생체내 자극하는 것에 의존한다.
수동 면역요법에서는, 치료가, 항-클라미디아 효과를 직접 또는 간접적으로 매개할 수 있고 반드시 온전한 숙주 면역 시스템에만 의존하지 않는, 정립된 면역 반응성을 나타내는 생물학적 시약(예: 효과인자 세포 또는 항체)의 전달을 포함한다. 효과인자 세포의 예로는 T 림프구(예를 들면, CD8+ 세포독성 T-림프구, CD4+ T-헬퍼), 킬러 세포(예: 천연 킬러 세포, 림포킨-활성화 킬러 세포), B 세포, 또는 본원에 기재된 항원을 발현하는 항원 제시 세포(예: 수지상 세포 및 대식구)가 있다. 본원에 기재된 폴리펩티드를 또한 사용하여, 수동 면역요법을 위한 항체 또는 항-개별특이형(idiotypic) 항체를 생성시킬 수 있다[참조: 미국 특허 제4,918,164호].
양자 면역요법에 적당한 수의 T-세포를 획득하는데 뛰어난 방법은 면역 T-세포를 시험관내에서 성장시키는 것이다. 생체내 항원 인식은 보존하면서 단일 항원-특이적 T-세포의 수를 수 십억까지 증대시키기 위한 배양 조건은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이들 시험관내 배양 조건은 전형적으로, 종종 IL-2와 같은 사이토킨 및 비-분할 영양 세포(feeder)의 존재 하에서, 항원으로 간헐적으로 자극하는 것을 이용한다. 앞서 인지된 바와 같이, 본원에 기재된 면역반응성 폴리펩티드를 사용하여, 항원-특이적 T 세포 배양물을 신속하게 증대시켜 면역요법에 충분한 수의 세포를 생성시킬 수 있다. 특히, 수지상, 대식구, 단구, 섬유아세포 또는B-세포와 같은 항원 제시 세포를 면역반응성 폴리펩티드로 펄싱하거나 또는 폴리뉴클레오티드 서열(들)을, 당해 분야에 널리 공지된 각종 표준 기술을 사용하여 항원 제시 세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 항원 제시 세포를, 발현을 증가시키기에 적당한 프로모터 영역을 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열로 형질감염 또는 형질도입할 수 있고, 이는 재조합 바이러스 또는 기타 발현 시스템의 일부로서 발현될 수 있다. 폭스 바이러스, 백시니아 바이러스 및 아데노바이러스를 포함한 몇몇 바이러스성 벡터를 사용하여 항원 제시 세포를 형질도입할 수 있고; 또한, 항원 제시 세포를, 유전자 총 기술, 지질-매개된 전달, 전기천공, 삼투압 쇽 및 미립자 전달 기전을 포함한 각종 수단에 의해 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열로 형질감염시킬 수 있는데, 이로써 당업자에 의해 결정된 바와 같은 효율적이고 허용되는 수준으로 발현된다. 배양된 T-세포가 치료에 유효하기 위해서는, 이러한 배양된 T-세포가 광범위하게 성장 및 분포될 수 있고 또한 생체내에서 장기간 생존할 수 있어야만 한다. 연구 결과, 배양된 T-세포는 생체내에서 성장하도록 유도할 수 있고, 또한 IL-2가 보충된 항원으로 반복적으로 자극함으로써 상당 수가 장기간 생존하도록 유도할 수 있다[참조: Cheever, M., et al., "Therapy With Cultured T Cells: Principles Revisited,"Immunological Review, 157:177, 1997].
본원에 기재된 폴리펩티드를 또한 이용하여, 클라미디아-반응성 T 세포를 생성 및/또는 분리시킨 다음, 이를 환자에게 투여할 수 있다. 한 기술에서는, 당해 폴리펩티드의 면역원성 부분에 상응하는 짧은 펩티드로 생체내 면역화시킴으로써 항원-특이적 T 세포주를 생성시킬 수 있다. 이로써 생성된 항원 특이적 CD8+ 또는CD4+ T 세포 클론을 상기 환자로부터 분리하고, 표준 조직 배양 기술을 사용하여 증대시킨 다음, 환자에게 다시 주입한다.
또 다른 한편, 당해 폴리펩티드의 면역원성 부분에 상응하는 펩티드를 이용하여, 자가 T 세포의 선별적인 시험관내 자극 및 증대에 의해 클라미디아 반응성 T 세포 서브세트를 생성시켜 항원 특이적 T 세포를 제공하고, 이를 연속적으로, 예를 들면, 문헌[참조: Chang et al.,Crit. Rev. Oncol. Hematol. 22(3), 213, 1996]에 기재된 바와 같이 환자에게 전달할 수 있다. 면역 시스템의 세포, 예를 들면, T 세포는 공급업자[Nexell Therapeutics, Inc.; Irvine, CA]로부터 입수 가능한 Isolex™ 시스템과 같은 시판용 세포 분리 시스템을 사용하여, 환자의 말초혈로부터 분리시킬 수 있다. 이와 같이 분리된 세포를, 미세구와 같은 전달 비히클 내에 함유된 하나 이상의 면역반응성 폴리펩티드로 자극하여 항원 특이적 T 세포를 제공한다. 이어서, 표준 기술을 사용하여 상기 항원 특이적 T 세포 집단을 증대시키고, 이 세포를 환자에게 다시 투여한다.
기타 양태에서는, 본원에 기재된 폴리펩티드에 특이적인 항체 수용체 및/또는 T 세포를 클로닝, 증대, 및 양자 면역요법에 사용하기 위해 기타 벡터 또는 효과인자 세포 내로 전달할 수 있다. 특히, T 세포를 적당한 유전자로 형질감염시켜, 세포외 인식 요소로서 클라미디아-특이적 모노클로날 항체로부터의 가변 도메인을 발현하고, T 세포 수용체 시그날 전달 쇄에 연결시키면, T 세포 활성화, 특이적 용해 및 사이토킨 방출이 일어난다. 이로써, T 세포가 MHC 독립적인 방식으로 이의 특이성을 재지시할 수 있게 된다[참조: Eshhar, Z.,Cancer ImmunolImmunology, 45(3-4):131-6, 1997 and Hwu, P., et al,Cancer Res, 55(15):3369-73, 1995]. 또 다른 양태에는, 문헌[참조: Cole, DJ, et al,Cancer Res, 55(4):748-52, 1995]에서와 같이, 클라미디아 항원 특이적 알파 및 베타 T 세포 수용체 쇄를 또 다른 T 세포 내로 형질감염시키는 것이 포함될 수 있다.
추가의 양태에서는, 유전적동계(syngeneic) 또는 자가 수지상 세포를, 본원에 기재된 폴리펩티드의 적어도 면역원성 부분에 상응하는 펩티드로 펄싱할 수 있다. 이로써 생성된 항원-특이적 수지상 세포를 환자에게 전달하거나, 또는 T 세포를 자극하는데 이용하여 항원-특이적 T 세포를 제공하고, 이를 환자에게 다시 투여할 수 있다. 항원-특이적 T 세포를 생성시키기 위해 펩티드-펄싱된 수지상 세포를 사용한 다음, 쥐 모델의 질병을 근절하기 위해 상기 항원 특이적 T 세포를 연속해서 사용하는 것이 문헌[참조: Cheever et al.,Immunological Reviews,157:177, 1997]에 의해 증명되었다. 부가적으로, 당해 폴리뉴클레오티드를 발현하는 벡터를, 환자로부터 취한 줄기 세포 내로 도입하고 동일한 환자 내로 자가 재이식하기 위하여 시험관내에서 클론으로 증식시킬 수 있다.
특정한 국면 내에서는, 본원에 기재된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, T 세포 및/또는 결합제를 약제학적 조성물 또는 면역원성 조성물(즉, 백신) 내로 도입시킬 수 있다. 또 다른 한편, 약제학적 조성물은 클라미디아 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 항원 제시 세포(예: 수지상 세포)를 포함하여, 이러한 항원 제시 세포가 클라미디아 폴리펩티드를 발현하도록 할 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 상기 화합물과 생리학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 백신은 하나 이상의상기 화합물과 면역자극제를 포함할 수 있다. 면역자극제는 외인성 항원에 대한 면역 반응을 증진 또는 증강시키는 모든 물질일 수 있다. 면역자극제의 예로는 애쥬반트, 생분해 가능한 미세구(예: 폴리락트 갈락티드) 및 리포솜[여기로 당해 화합물이 도입된다; 풀러톤(Fullerton)의 미국 특허 제4,235,877호 참조]이 있다. 백신 제제는 일반적으로, 문헌[참조: M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press(NY, 1995)]에 기재되어 있다. 본 발명의 범위 내에 속하는 약제학적 조성물 및 백신은 생물학적으로 활성이거나 불활성일 수 있는 기타 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들면, 기타 클라미디아성 항원의 하나 이상의 면역원성 부분은 당해 조성물 또는 백신 내에, 융합 폴리펩티드 내로 도입된 형태로 존재하거나 또는 별개의 화합물로서 존재할 수 있다.
약제학적 조성물 또는 백신은, 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드가 동일계(in situ)에서 생성되도록 이러한 폴리펩티드 하나 이상을 암호화하는 DNA를 함유할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 상기 DNA는 핵산 발현 시스템, 세균성 및 바이러스성 발현 시스템을 포함한 당업자에게 공지된 각종 전달 시스템 내에 존재할 수 있다. 수 많은 유전자 전달 기술이 당해 분야에 널리 공지되어 있는데, 예를 들면, 문헌[참조: Rolland,Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems15:143-198, 1998 및 이에 인용된 참조문헌]에 기재된 바와 같다. 적당한 핵산 발현 시스템은 환자에게서 발현에 필요한 DNA 서열(예: 적합한 프로모터 및 종결 시그날)을 함유한다. 세균성 전달 시스템은 이의 세포 표면 상에서 당해 폴리펩티드의 면역원성 부분을 발현하거나 또는 이러한 에피토프를 분비하는 세균[예:Bacillus-Calmette-Guerrin]을 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 양태에서는, 상기 DNA를 바이러스성 발현 시스템(예: 백시니아 또는 기타 폭스 바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 바쿨로바이러스, 토가바이러스, 박테리오파아지 등)을 사용하여 도입할 수 있는데, 이는 비-병원성(결함있는)의 복제 적격한 바이러스를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
예를 들면, 많은 바이러스성 발현 벡터가 레트로바이러스과 계열 바이러스로부터 유도된다. 이러한 계열에는 쥐의 백혈병 바이러스, 마우스 유방 종양 바이러스, 사람 거품형성(foamy) 바이러스, 라우스 육종 바이러스, 및 면역결핍증 바이러스(사람, 원숭이 및 고양이를 포함)가 포함된다. 레트로바이러스성 발현 벡터를 고안할 경우의 고려 사항이 문헌[참조: Comstock et al. (1997)]에 논의되어 있다.
우수한 쥐의 백혈병 바이러스(MLV)-이용 바이러스성 발현 벡터가 김(Kim) 등에 의해 개발되었다(1998). 이러한 MLV 벡터를 개발하는데 있어서, 김 등은 전체 gag 서열이 바로 위의 상류 영역과 함께, 바이러스 패키징 또는 유전자 발현에 상당한 영향을 미치지 않고서도 결실될 수 있다는 사실을 밝혀내었다. 추가로, 거의 전체 U3 영역이 해로운 영향 없이도 사람 사이토메갈로바이러스의 즉발 초기(immediately-early) 프로모터로 대체될 수 있다는 사실을 밝혀내었다. 부가적으로, MCR 및 내부 리보솜 도입 부위(IRES)를 불리한 효과 없이 가할 수 있었다. 이러한 관찰 내용을 근거로 하여, 김 등은 상기 언급된 특징을 하나 이상 포함하는 일련의 MLV-이용 발현 벡터를 고안하였다.
사람 거품형성 바이러스(HFV)에 관해 보다 연구함으로써, 발현 벡터로서 보다 선호되어 사용되는 특징적인 HFV가 개발되었다. 이들 특징에는 스플라이싱함으로써 pol을 발현시키는 것과 규정된 개시 코돈에서 해독을 개시하는 것이 포함된다. HFV 바이러스성 발현 벡터의 기타 국면이 문헌[참조: Bodem et al. (1997)]에 고찰되어 있다.
문헌[참조: Murakami et al. (1997)]에는 이종 유전자를 높은 수준으로 발현하기 위한 라우스 육종 바이러스(RSV)-이용 복제-적격 조류 레트로바이러스 벡터, IR1 및 IR2가 기재되어 있다. 이들 벡터에서는, 뇌심근염 바이러스(EMCV)로부터 유래된 IRES를 env 유전자와 상기 이종 유전자 사이에 삽입시킨다. IR1 벡터는 env 유전자의 하류에 존재하는 스플라이스-수용체 부위를 보유하고 있는 반면, IR2 벡터에는 그것이 결여되어 있다. 무라카미(Murakami) 등은 이들 벡터에 의해 몇몇 상이한 이종 유전자를 높은 수준으로 발현할 수 있다는 것을 밝혀내었다.
최근에, 수 많은 렌티바이러스(lentivirus)-이용 레트로바이러스성 발현 벡터가 개발되었다. 카프리(Kafri) 등(1997)은 사람 면역결핍증 바이러스(HIV)-이용 발현 벡터에 의해 간 및 근육 내로 직접 전달된 유전자의 지속적인 발현을 밝혀내었다. 이러한 시스템의 한 가지 이점은 비-분할 세포를 형질도입시키는 HIV의 고유 능력이다. 카프리 등의 바이러스는 수포성 구내염 바이러스 G 당단백질(VSVG)로 가유형(pseudotype)으로 만들었기 때문에, 이들 바이러스는 광범위한 조직과 세포 유형을 형질도입시킬 수 있다.
아데노바이러스-이용 발현 벡터가 대부분 유전자 치료법 적용 분야에 기여한다는 이점에 따라, 수 많은 아데노바이러스-이용 발현 벡터가 개발되었다. 아데노바이러스 발현 벡터 및 이러한 벡터를 사용하는 방법이 미국 특허 제5,698,202호, 제5,616,326호, 제5,585,362호 및 제5,518,913호(이들 모두가 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)을 포함한 수 많은 미국 특허의 주제이다.
또다른 아데노바이러스성 작제물이 문헌[참조: Khatri et al.(1997) and Tomanin et al.(1997)]에 기재되어 있다. 카트리(Khatri) 등의 문헌에는 신규한 양의(ovine) 아데노바이러스 발현 벡터; 및 소의 비갑개 및 토끼 신장 세포 뿐만 아니라 일정 범위의 사람 세포 유형[폐 및 포피 섬유아세포, 및 간, 전립선, 유방, 결장 및 망막 계열 포함]을 감염시키는 이들의 능력이 기재되어 있다. 토마닌(Tomanin) 등의 문헌에는 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 함유하는 아데노바이러스성 발현 벡터가 기재되어 있다. T7 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 함유하는 세포 내로 도입된 경우, 상기 벡터는 이러한 T7 프로모터로부터 유전자 발현을 유도할 수 있다. 상기 저자는 이러한 시스템이 세포독성 단백질을 암호화하는 유전자의 클로닝 및 발현에 유용할 수 있다고 제안하고 있다.
폭스바이러스는 포유류 세포에서의 이종 유전자의 발현에 광범위하게 사용되고 있다. 수 년간에 걸쳐, 상기 벡터는 이종 유전자를 높은 수준으로 발현시키고 다중 이종 유전자를 단일 분자 내로 통합시키는 것을 간단하게 하기 위해 개선되어 왔다. 세포변성 효과를 저하시키고 안전성을 증가시키기 위한 일환으로, 포유류 세포에서 부전 감염(abortive infection)을 진행하는 백시니아 바이러스 돌연변이체 및 기타 폭스바이러스는 특별한 주의를 받고 있다[참조: Oertli et al., 1997].발현 벡터로서의 폭스바이러스의 용도가 문헌[참조: Carroll and Moss(1997)]에 고찰되어 있다.
알파바이러스성 발현 벡터를 포함하는 토가바이러스성(togaviral) 발현 벡터를 사용하여, 단백질의 구조 및 기능을 연구하였으며 단백질 생성 목적에 대해 연구하였다. 토가바이러스성 발현 벡터에 대해 관심을 끌 만한 특징은 신속하고도 효율적인 유전자 발현, 광범위한 숙주 범위, 및 RNA 게놈이다[Huang, 1996]. 또한, 알파바이러스성 발현 벡터에 근거한 재조합 백신이 우수한 면역학적 기억 및 보호 효과를 나타내는 강력한 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다[Tubulekas et al., 1997]. 알파바이러스성 발현 벡터 및 이의 용도가, 예를 들어, 문헌[참조: Lundstrom(1997)]에 논의되어 있다.
한 연구에서, 리(Li)와 가로프(Garoff)(1996)는 BHK-21 세포에서 레트로바이러스성 유전자를 발현하고 레트로바이러스성 입자를 생성하기 위해 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus: SFV) 발현 벡터를 사용하였다. 이러한 방법에 의해 생성된 입자는 프로테아제 및 역전사효소 활성을 지니고 있으며 감염성이다. 더우기, 상기 바이러스 스톡에서는 헬퍼 바이러스가 전혀 검출되지 않았다. 따라서, 상기 시스템은 이를 유전자 치료법 프로토콜에 사용하는데 관심을 끌 만한 특징을 지니고 있다.
바쿨로바이러스성 발현 벡터는 전통적으로, 곤충 세포에서 이종 단백질을 발현시키기 위해 사용되어 왔다. 단백질의 예로는 포유류 케모카인 수용체[Wang et al., 1997], 리포터 단백질, 예를 들면, 녹색 형광성 단백질[Wu et al., 1997], 및FLAG 융합 단백질[Wu et al., 1997; Koh et al., 1997]이 있다. 바쿨로바이러스성 발현 벡터 기술에 있어서의 최근의 진척(이에는 비리온 디스플레이 벡터에서의 이들의 사용과 포유류 세포에서의 발현이 포함된다)이 문헌[참조: Possee(1997)]에 고찰되어 있다. 바쿨로바이러스성 발현에 관한 기타 고찰 내용이 문헌[참조: Jones and Morikawa(1996) and O'Reilly(1997)]에 기재되어 있다.
기타 적합한 바이러스성 발현 시스템은, 예를 들면, 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Fisher-Hoch et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:317-321, 1989; Flexner et al.,Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al.,Vaccine8:17-21, 1990; 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호 및 제5,017,487호; WO 89/01973; 미국 특허 제4,777,127호; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner,Biotechniques6:616-627, 1988; Rosenfeld et al.,Science252:431-434, 1991; Kolls et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:11498-11502, 1993; Guzman et al.,Circulation88:2838-2848, 1993; and Guzman et al.,Cir. Res.73:1202-1207, 1993]. DNA를 상기 발현 시스템 내로 도입시키는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 기타 시스템에서, 상기 DNA는 예를 들어, 문헌[참조: Ulmer et al.,Science259:1745-1749, 1993]에 기재되고 문헌[참조: Cohn,Science259:1691-1692, 1993]에 의해 고찰된 바와 같이, "나출된" DNA로서 도입될 수 있다. 나출된 DNA의 흡수는, 이러한 DNA를, 세포 내로 효율적으로 수송되는 생분해 가능한 비드 상으로 코팅함으로써 증가시킬 수 있다.
백신이 경우에 따라, 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 성분을 포함할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 또한, 백신이 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 약제학적으로 허용되는 염을 함유할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 이러한 염은 유기 염기(예: 1급, 2급 및 3급 아민 및 염기성 아미노산의 염) 및 무기 염기(예: 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염)을 포함한 약제학적으로 허용되는 비독성 염기로부터 제조할 수 있다. 당업자에게 공지된 적합한 어떠한 담체도 본 발명의 약제학적 조성물에 이용될 수 있긴 하지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라서 결정될 것이다. 본 발명의 조성물은, 예를 들면, 국소, 경구, 비내, 정맥내, 두개내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함한, 적당한 투여 방식을 위해 제형화할 수 있다. 비경구 투여, 예를 들면, 피하 주사인 경우에는, 담체가 바람직하게는 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충제를 포함한다. 경구 투여의 경우에는, 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 삭카린, 활석, 셀룰로즈, 글루코즈, 슈크로즈 및 탄산마그네슘과 같은 고형 담체 또는 상기 담체 중의 어떠한 것도 이용할 수 있다. 생분해 가능한 미세구(예: 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)를 또한 본 발명의 약제학적 조성물에 대한 담체로서 이용할 수 있다. 적합한 생분해 가능한 미세구는, 예를 들면, 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 기재되어 있다.
이러한 조성물은 완충제(예: 중성 완충된 식염수 또는 인산염 완충된 식염수), 탄수화물(예: 글루코즈, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들면, 글리신, 산화방지제, 정균제, 킬레이트제,예를 들면, EDTA 또는 글루타치온, 애쥬반트(예: 수산화알루미늄), 해당 제형을 수령체의 혈액과 등장성, 저장성 또는 약한 고장성이 되도록 해주는 용질, 현탁화제, 증점제 및/또는 방부제를 포함할 수도 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 제형화시킬 수 있다. 널리 공지된 기술을 사용하여 화합물을 리포솜 내에 캡슐화시킬 수도 있다.
각종의 어떠한 면역자극제도 본 발명의 백신에 이용할 수 있다. 예를 들면, 애쥬반트가 포함될 수 있다. 대부분의 애쥬반트는 항원이 신속하게 이화되지 못하도록 고안된 물질, 예를 들면, 수산화알루미늄 또는 광유, 및 면역 반응 자극제, 예를 들면, 지질 A, 보르타델라 페르튜시스(Bortadella pertussis) 또는 마이코박테륨 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래된 단백질을 함유한다. 적합한 애쥬반트는, 예를 들면, 프로인트 불완전 애쥬반트 및 완전 애쥬반트(공급처: Difco Laboratories, Detroit, MI); 머크 애쥬반트 65(공급처: Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2(공급처: SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); 수산화알루미늄 겔(알룸) 또는 알루미늄 포스페이트와 같은 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화 티로신의 불용성 현탁제; 아실화 당; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도체화된 폴리삭카라이드; 폴리포스파젠; 생분해 가능한 미세구; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼 A로서 시판중이다. GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7 또는 -12와 같은 사이토킨이 애쥬반트로서 사용될 수도 있다.
본원에 제공된 백신 내에서, 선택된 환경 하에, 애쥬반트 조성물을 주로 Th1 유형 또는 Th2 유형의 면역 반응을 유도하도록 고안할 수 있다. 높은 수준의 Th1-유형 사이토킨(예: IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포 매개된 면역 반응을 주로 유도하는 경향이 있다. 이와는 달리, 높은 수준의 Th2-유형 사이토킨(예: IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역 반응을 주로 유도하는 경향이 있다. 본원에 제공된 바와 같은 백신을 투여한 후, 환자는 Th1- 및 Th2-유형 반응을 포함하는 면역 반응을 견뎌낼 것이다. 반응이 주로 Th1-유형인 바람직한 양태 내에서는, Th1-유형 사이토킨의 수준이 Th2-유형 사이토킨의 수준 보다 훨씬 더 크게 증가할 것이다. 이들 사이토킨의 수준은 표준 검정을 사용하여 용이하게 평가할 수 있다. 사이토킨 계열에 관한 고찰은 다음 문헌을 참조하기 바란다[참조: Mosmann and Coffman,Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989].
주로 Th1-유형 반응을 유도하는데 사용하기 바람직한 애쥬반트로는, 예를 들면, 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)과 알루미늄 염과의 조합물이 있다. MPL 애쥬반트는 다음 공급처(Corixa Corporation, Seattle, WA; 미국 특허 제4,436,727호, 제4,877,611호, 제4,866,034호 및 제4,912,094호 참조)로부터 입수 가능하다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드(여기서, CpG 디뉴클레오티드는 메틸화되지 않는다)가 또한, 주로 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 널리 공지되어 있고, 예를 들면, WO 96/02555 및 WO 99/33488에 기재되어 있다. 면역자극성 DNA 서열이 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Sato et al.,Science 273:352, 1996]에 기재되어 있다. 또 다른 바람직한 애쥬반트는 단독으로 사용되거나 기타 애쥬반트와 함께 사용될 수 있는 사포닌, 바람직하게는 QS21(공급처: Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA)이다.예를 들면, 증진된 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체와의 조합물, 예를 들면, WO 94/00153에 기재된 바와 같은 3D-MPL과 QS21의 조합물, 또는 WO 96/33739에 기재된 바와 같이, QS21이 콜레스테롤로 급냉되는 덜 반응발생적(reactogenic) 조성물을 포함한다. 기타 바람직한 제형은 수중유 에멀션 및 토코페롤을 포함한다. 수중유 에멀션 중에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 효능있는 애쥬반트 제형이 WO 95/17210에 기재되어 있다.
기타 바람직한 애쥬반트로는 계류중인 미국 특허원 제08/853,826호 및 제09/074,720호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에 기재된 바와 같은, 몬타니드 ISA 720(공급처: Seppic, France), SAF(공급처: Chiron, California, United States), ISCOMS(공급처: CSL), MF-59(공급처: Chiron), SBAS 시리즈의 애쥬반트[예: SBAS-2 또는 SBAS-4(공급처: SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium)], Detox(공급처: Corixa, Corporation; Seattle, WA), RC-529(공급처: Corixa, Corporation; Seattle, WA) 및 기타 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트(AGP)가 있다.
항원, 면역자극제 및 적합한 담체 또는 부형제의 조합물을 생성시키는 것으로 널리 공지된 방법을 사용하여, 본원에 제공된 백신을 제조할 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 지속 방출형 제형[즉, 투여 후에 화합물을 서서히 방출시키는 제형, 예를 들면, 캅셀제, 스폰지 또는 겔(예를 들면, 폴리삭카라이드로 구성됨)]의 일부로서 투여할 수 있다. 이러한 제형은 일반적으로, 널리 공지된 기술[참조: Coombers et al.,Vaccine 14:1429-1438, 1996]을 사용하여 제조할 수 있고, 예를들면, 경구, 직장 또는 피하 주입하여 투여하거나 목적하는 표적 부위에 주입함으로써 투여할 수 있다. 지속 방출형 제형은 담체 매트릭스에 분산되고/되거나 속도 제어 막으로 둘러 싸인 저장기 내에 함유된, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체를 함유할 수 있다.
이러한 제형 내에 사용하기 위한 담체는 생물학적으로 적합하고, 또한 생분해 가능할 수 있는데; 바람직하게는, 상기 제형이 비교적 일정 수준의 활성 성분 방출을 제공해준다. 이러한 담체로는 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로즈, 덱스트란 등의 미세입자가 있다. 기타 지연 방출형 담체로는 비-액상 친수성 코어(예: 가교결합된 폴리삭카라이드 또는 올리고삭카라이드)와, 임의로, 인지질과 같은 양친매성 화합물을 포함하는 외부 층을 포함하는 초대형 분자 바이오벡터가 있다[참조: 미국 특허 제5,151,254호 및 PCT 공개특허공보 WO 94/20078, WO 94/23701 및 WO 96/06638]. 지속 방출형 제형 내에 함유된 활성 화합물의 양은 주입 부위, 방출 속도 및 예상 기간, 및 치료 또는 예방하고자 하는 질환의 종류에 좌우된다.
클라미디아-감염된 세포를 표적으로 하는 항원-특이적 면역 반응의 생성을 촉진시키는 각종 전달 비히클이 약제학적 조성물 및 백신 내에 이용될 수 있다. 전달 비히클로는 항원 제시 세포(APC), 예를 들면, 수지상 세포, 대식구, B 세포, 단구, 및 효율적인 APC가 되도록 조작될 수 있는 기타 세포가 있다. 이러한 세포를 유전적으로 변형시켜 항원 표시 능력을 증가시키고, T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지를 향상시키며, 항-클라미디아 효과 자체를 지니고/지니거나 수령자와 면역학적으로 적합하도록(즉, 정합된 HLA 반수형) 할 수 있으나, 반드시 필요한 것은 아니다. APC는 일반적으로, 각종의 어떠한 생체액 및 기관으로부터도 분리할 수 있고, 이는 자가, 동종이계, 유전적동계 또는 이종성 세포일 수 있다.
본 발명의 특정의 바람직한 양태는 항원 제시 세포로서 수지상 세포 또는 이의 자손을 사용한다. 수지상 세포는 고도로 효능있는 APC이고[참조: Banchereau and Steinman,Nature 392:245-251, 1998], 예방적 또는 치료학적 면역을 유도하기 위한 생리학적 애쥬반트로서 유효한 것으로 밝혀졌다[참조: Timmerman and Levy,Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999]. 일반적으로, 수지상 세포는 이의 전형적인 외관(시험관내에서 볼 수 있는 현저한 세포질 과정(수지상 결정)을 나타내는, 원위치에서 별모양을 지님), 항원을 고효율로 흡수, 프로세스 및 표시하는 능력, 및 본래의 T 세포 반응을 활성화시키는 능력을 기준으로 하여 동정할 수 있다. 수지상 세포는 물론, 생체내 또는 생체외 수지상 세포에서 통상 발견되지 않는 특이적 세포-표면 수용체 또는 리간드를 발현하도록 조작될 수 있으며, 이와 같이 변형된 수지상 세포가 본 발명에 의해 고려된다. 수지상 세포에 대한 대체물로서, 분비된 소포 항원-부하된 수지상 세포(엑소솜으로 지칭됨)가 백신 내에 사용될 수 있다[참조: Zitvogel et al.,Nature Med. 4: 594-600, 1998].
수지상 세포 및 이의 자손은 말초혈, 골수, 림프절, 비장, 피부, 제대혈 또는 기타 적합한 조직 또는 체액으로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 수지상 세포는 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFα와 같은 사이토킨의 조합물을, 말초혈로부터 수거된 단구 배양물에 가함으로써 생체외에서 분화시킬 수 있다. 또 다른 방법으로는, GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드, 및/또는 수지상 세포의 분화, 성숙 및 증식을 유도시키는 기타 화합물(들)의 조합물을 배양 배지에 가함으로써, 말초혈, 제대혈 또는 골수로부터 수거된 CD34 양성 세포를 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.
수지상 세포는 "미숙한" 세포와 "성숙한" 세포로 통상 분류되는데, 이는 널리 특징적인 두 표현형을 구별해주는 간단한 방법이다. 그러나, 이러한 명명법이 가능한 모든 분화 중간 단계를 배제하고자 한 것은 아니다. 미숙한 수지상 세포는 Fcγ수용체와 만노즈 수용체의 높은 발현과 상관있는 높은 항원 흡수 및 프로세싱 능력을 지닌 APC로서 특징지워진다. 성숙한 표현형은 전형적으로, 이들 마커는 낮은 수준으로 발현하지만, T 세포 활성화에 관여하는 세포 표면 분자, 예를 들면, 부류 I 및 부류 II MHC, 부착 분자(예: CD54 및 CD11) 및 보조자극 분자(예: CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)는 높은 수준으로 발현하는 것을 특징으로 한다.
APC는 일반적으로, 클라미디아 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(또는 이의 일정 부분 또는 기타 변이체)로 형질감염시켜, 상기 클라미디아 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 부분이 세포 표면 상에서 발현되도록 할 수 있다. 이러한 형질감염은 생체외에서 수행할 수 있으며, 이와 같이 형질감염된 세포를 포함하는 조성물 또는 백신을 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 목적에 사용할 수 있다. 또 다른 한편, 수지상 세포 또는 기타 항원 제시 세포를 표적으로 하는 유전자 전달 비히클을 환자에게 투여하면, 생체내에서 형질감염이 이루어질 수 있다. 수지상 세포의 생체내 및 생체외 형질감염은 일반적으로, 예를 들면, WO 97/24447에 기재된 바와 같이 당해 분야에 공지된 방법을 사용하거나, 또는 문헌[참조: Mahvi et al.,Immunology and Cell Biology 75:456-460, 1997]에 기재된 유전자 총 접근법을 사용하여 수행할 수 있다. 수지상 세포의 항원 부하(loading)는 수지상 세포 또는 이의 자손 세포를 클라미디아 폴리펩티드, DNA(나출된 것이거나 플라스미드 벡터 내에 함유된 것) 또는 RNA와 함께 항온배양하거나 항원-발현성 재조합 세균 또는 바이러스(예: 백시니아, 조류폭스(fowlpox), 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)와 함께 항온배양함으로써 달성할 수 있다. 부하에 앞서, 상기 폴리펩티드를 T 세포 헬퍼를 제공해주는 면역학적 파트너(예: 운반체 분자)에 공유적으로 접합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 수지상 세포를 개별적으로 또는 폴리펩티드의 존재하에, 비-접합된 면역학적 파트너로 펄싱할 수 있다.
약제학적 조성물 및 백신의 투여 경로 및 투여 횟수 뿐만 아니라 투여량은 개개인마다 상이할 것이다. 일반적으로, 당해 약제학적 조성물 및 백신은 주사(예를 들면, 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내(예를 들면, 흡인에 의함) 또는 경구 투여할 수 있다. 1 내지 3회분을 1 내지 36주 동안 투여할 수 있다. 바람직하게는, 3회분을 3 내지 4개월 간격으로 투여한 후, 부스터 백신 접종을 주기적으로 제공할 수 있다. 또 다른 프로토콜이 개개 환자에 적당할 수 있다. 적합한 투여량은 상기 언급된 바와 같이 투여될 때, 최소한 1 내지 2년 동안 환자가 클라미디아 감염에 걸리지 않도록 하기에 충분히 면역 처리된 환자에게서 면역 반응을 유발시킬 수 있는, 폴리펩티드 또는 DNA의 양이다. 일반적으로, 투여량 내에 존재하는 폴리펩티드의 양은 숙주 1kg당 약 1pg 내지 약 100mg, 전형적으로 약 10pg 내지약 1mg, 바람직하게는 약 100pg 내지 약 1㎍의 범위이다. 적합한 투여량 크기는 환자의 크기에 따라 다양할 것이지만, 전형적으로 약 0.1ml 내지 약 5ml의 범위이다.
당업자에게 공지된 적합한 어떠한 담체도 본 발명의 약제학적 조성물에 이용될 수 있긴 하지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라서 결정될 것이다. 비경구 투여, 예를 들면, 피하 주사인 경우에는, 담체가 바람직하게는 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충제를 포함한다. 경구 투여의 경우에는, 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 삭카린, 활석, 셀룰로즈, 글루코즈, 슈크로즈 및 탄산마그네슘과 같은 고형 담체 또는 상기 담체 중의 어떠한 것도 이용할 수 있다. 생분해 가능한 미세구(예: 폴리락트 갈락티드)를 또한 본 발명의 약제학적 조성물에 대한 담체로서 이용할 수 있다. 적합한 생분해 가능한 미세구는, 예를 들면, 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 기재되어 있다.
일반적으로, 적당한 투여량 및 치료 방법은 치료학적 및/또는 예방적 이점을 제공하기에 충분한 양의 활성 화합물(들)을 제공해준다. 이러한 반응은 치료되지 않은 환자와 비교해서 치료된 환자에게서 개선된 임상적 결과를 확립시킴으로써 모니터할 수 있다. 클라미디아 단백질에 대해 선재하는 면역 반응 증가는 일반적으로, 개선된 임상적 결과와 상관이 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로, 표준 증식, 세포독성 또는 사이토킨 검정을 사용하여 평가할 수 있는데, 이는 치료 전 및 후의 환자로부터 수득된 샘플을 사용하여 수행할 수 있다.
또 다른 국면에 있어서, 본 발명은 클라미디아 감염을 진단하기 위해 상기언급된 폴리펩티드를 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 국면에서는, 상기 하나 이상의 폴리펩티드를 단독으로 또는 조합하여 사용하여, 생물학적 샘플 중에서 클라미디아 감염을 탐지하는 방법이 제공된다. 명료하게 하기 위해, 용어 "폴리펩티드"는 본 발명의 진단 방법의 특정 양태를 기재하는 경우에 사용될 것이다. 그러나, 본 발명의 융합 단백질도 상기 방법에 이용될 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "생물학적 샘플"은 환자로부터 수득된 항체-함유 샘플이다. 바람직하게는, 상기 샘플이 전혈, 담, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨이다. 보다 바람직하게는, 상기 샘플이 환자로부터 수득된 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플이다. 당해 폴리펩티드는 컷-오프(cut-off) 예정치와 비교해서, 샘플 중의 폴리펩티드(들)에 대한 항체의 존재 또는 부재를 결정해주는, 다음에 기재된 바와 같은 검정에 사용한다. 이러한 항체의 존재는 클라미디아 항원에 대한 앞서의 감작화를 지시해주는데, 이는 클라미디아 감염을 지시해준다.
하나 이상의 폴리펩티드가 이용되는 양태에서는, 사용된 폴리펩티드가 바람직하게는 상보성이다(즉, 하나의 성분 폴리펩티드는, 또 다른 성분 폴리펩티드에 의해서는 감염이 탐지되지 않는 샘플 중의 감염을 탐지하는 경향이 있을 것이다). 상보성 폴리펩티드는 일반적으로, 각각의 폴리펩티드를 개별적으로 사용함으로써 동정하여, 클라미디아에 감염될 것으로 공지된 일련의 환자로부터 수득된 혈청 샘플을 평가할 수 있다. 샘플 시험이 각 폴리펩티드에 대해 양성(다음에 기재된 바와 같음)인 것으로 결정한 후에, 시험된 샘플의 대부분 또는 전부에서 감염을 탐지할 수 있는 둘 이상의 조합물을 제형화할 수 있다.
특정 샘플에서 항체를 탐지하기 위해 하나 이상의 폴리펩티드를 사용하는 것으로 당업자에게 공지된 각종 검정 포맷이 있다[참조: Harlow and Lane,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 바람직한 양태에서는, 상기 검정이, 고체 지지체 상에 고정화된 폴리펩티드를 사용하여 항체에 결합시키고 이를 상기 샘플로부터 제거하는 것을 포함한다. 이어서, 리포터 그룹을 함유하는 탐지용 시약을 사용하여, 상기와 같이 결합된 항체를 탐지할 수 있다. 적합한 탐지용 시약에는 항체/폴리펩티드 복합체와 결합되는 항체, 및 리포터 그룹으로 표지된 유리 폴리펩티드가 포함된다(예를 들면, 반-경쟁적 검정으로 수행함). 또 다른 한편, 폴리펩티드와 결합되는 항체를 리포터 그룹으로 표지시키고, 상기 샘플을 항원과 함께 항온배양한 후 고정화된 항원에 결합될 수 있게 해주는 경쟁적 검정이 이용될 수 있다. 샘플 성분이 상기 폴리펩티드에 대한 상기 표지된 항체의 결합을 억제하는 정도가, 상기 고정화된 폴리펩티드와 샘플 간의 반응도를 지시해준다.
고체 지지체는 상기 항원이 부착될 수 있는 것으로 당업자에게 공지된 어떠한 고체 물질일 수 있다. 예를 들면, 이러한 고체 지지체는 미세역가판 내의 시험용 웰 또는 니트로셀룰로즈 또는 기타 적합한 막일 수 있다. 또 다른 한편, 상기 지지체는 비드 또는 디스크, 예를 들면, 유리, 섬유유리, 라텍스 또는 플라스틱 물질, 예를 들면, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드일 수 있다. 상기 지지체는 또한, 예를 들면, 미국 특허 제5,359,681호에 기재된 바와 같은 섬유 광 센서 또는자기 입자일 수 있다.
당해 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 각종 기술을 사용하여 고체 지지체에 결합시킬 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "결합된"이란 흡착과 같은 비공유적 결합(예: 흡착)과 공유적 부착(이는 지지체 상에서 상기 항원과 작용성 그룹 간의 직접적인 연결일 수 있거나 가교결합제에 의한 연결일 수 있다) 모두를 지칭한다. 미세역가판 내의 웰 또는 막에의 흡착으로 결합시키는 것이 바람직하다. 이러한 경우, 흡착은 적합한 완충액 중의 폴리펩티드를 적합한 시간 동안 고체 지지체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양하지만, 전형적으로 약 1시간 내지 1일이다. 일반적으로, 플라스틱 미세역가판(예: 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)의 웰을 약 10ng 내지 약 1㎍, 바람직하게는 약 100ng 범위의 폴리펩티드와 접촉시키는 것이 적당한 양의 항원을 결합시키는데 충분하다.
폴리펩티드를 고체 지지체에 공유적 부착시키는 것은 일반적으로, 폴리펩티드 상의 지지체와 작용성 그룹(예: 하이드록실 또는 아미노 그룹) 모두와 반응하게 될 이작용성 시약을 상기 지지체와 먼저 반응시킴으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는, 벤조퀴논을 사용하거나 또는 지지체 상의 알데히드 그룹을 폴리펩티드 상의 활성 수소 및 아민으로 축합시킴으로써, 적당한 중합체 코팅을 갖는 지지체에 결합시킬 수 있다[참조: Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13].
특정 양태에서는, 상기 검정이 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA)이다. 이러한 검정은 먼저, 고체 지지체, 통상적으로는 미세역가판의 웰 상에서 고정화시킨폴리펩티드 항원을 상기 샘플과 접촉시켜 이러한 샘플 내의 폴리펩티드에 대한 항체가 상기 고정화된 폴리펩티드와 결합되도록 해줌으로써 수행할 수 있다. 이어서, 이와 같이 고정화된 폴리펩티드로부터 결합되지 않은 샘플을 제거하고, 고정화된 항체-폴리펩티드 복합체와 결합할 수 있는 탐지용 시약을 가한다. 이어서, 특이적 탐지용 시약에 적당한 방법을 사용하여, 고체 지지체에 결합되어 있는 탐지용 시약의 양을 결정한다.
보다 구체적으로 언급하면, 일단 폴리펩티드를 상기 언급된 바와 같이 지지체 상에 고정화시키면, 이러한 지지체 상의 나머지 단백질 결합 부위가 전형적으로 차단된다. 당업자에게 공지된 적합한 어떠한 차단제, 예를 들면, 소의 혈청 알부민(BSA) 또는 트윈 20™(공급처: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)도 이용할 수 있다. 이어서, 상기와 같이 고정화된 폴리펩티드를 샘플과 함께 항온배양하고, 항체가 상기 항원과 결합되도록 한다. 항온배양에 앞서, 상기 샘플을 적합한 희석제, 예를 들면, 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석시킬 수 있다. 일반적으로, 적당한 접촉 시간(즉, 항온배양 시간)은 HGE-감염된 샘플 내에 항체가 존재하는지를 탐지하기에 충분한 시간이다. 바람직한 접촉 시간은 결합된 항체와 결합되지 않은 항체 간의 평형을 가져다준 결합 수준의 약 95% 이상을 달성하기에 충분한 시간이다. 당업자는 평형을 달성하는데 필요한 시간이, 일정 시간에 걸쳐 일어나는 결합 수준을 검정함으로써 용이하게 결정될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 실온에서는 일반적으로, 약 30분 동안 항온배양하면 충분하다.
0.1% 트윈 20™을 함유하는 PBS와 같은 적당한 완충액으로 고체 지지체를 세척함으로써 결합되지 않은 샘플을 제거할 수 있다. 이어서, 탐지용 시약을 상기 고체 지지체에 가할 수 있다. 적당한 탐지용 시약은 상기 고정화된 항체-폴리펩티드 복합체와 결합하고 당해 분야에 공지된 각종의 어떠한 수단에 의해서도 탐지할 수 있는 화합물이다. 바람직하게는, 탐지용 시약은 리포터 그룹에 접합된 결합제(예: 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린, 렉틴 또는 유리 항원)를 함유한다. 바람직한 리포터 그룹에는 효소(예: 서양고추냉이 퍼옥시다제), 기질, 조인자, 억제제, 염료, 방사성핵종, 발광성 그룹, 형광성 그룹 및 바이오틴이 포함된다. 리포터 그룹에 결합제를 접합시키는 것은 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 통상의 결합제는 또한, 수 많은 공급원[예를 들면, Zymed Laboratories, San Francisco, CA and Pierce, Rockford, IL]으로부터의 각종 리포터 그룹에 접합된 채로 구입할 수 있다.
이어서, 탐지용 시약을, 결합된 항체를 탐지하기에 충분한 시간 동안 상기 고정화 항체-폴리펩티드 복합체와 함께 항온배양한다. 적당한 시간은 일반적으로, 제조업자의 지시에 따르거나 또는 일정 시간에 걸쳐 일어나는 결합 수준을 검정함으로써 결정할 수 있다. 이어서, 결합되지 않은 탐지용 시약을 제거하고, 리포터 그룹을 사용하여 결합된 탐지용 시약을 탐지한다. 리포터 그룹을 탐지하기 위해 이용되는 방법은 리포터 그룹의 종류에 의존한다. 방사성 그룹의 경우에는, 신틸레이션 계수 또는 자기방사법이 일반적으로 적당하다. 분광법을 이용하여 염료,발광성 그룹 및 형광성 그룹을 탐지할 수 있다. 상이한 리포터 그룹(통상적으로 방사성 또는 형광성 그룹 또는 효소)과 커플링된 바이오틴은 아비딘을 사용하여 탐지할 수 있다. 효소 리포터 그룹은 일반적으로, 기질을 가한 다음(일반적으로 특정 시간 동안), 이러한 반응 생성물을 분광법 또는 기타 분석법으로 탐지할 수 있다.
샘플 중의 항-클라미디아 항체의 존재 또는 부재를 결정하기 위하여, 고체 지지체에 결합된 채로 있는 리포터 그룹으로부터 탐지된 시그날을 일반적으로, 컷-오프 예정치에 상응하는 시그날과 비교한다. 한 가지 바람직한 양태에서는, 상기 컷-오프치가, 상기 고정화 항원을 감염되지 않은 환자로부터의 샘플과 함께 항온배양한 경우에 수득된 시그날 평균치이다. 일반적으로, 컷-오프 예정치 이상의 3 표준 편차인 시그날을 생성시키는 샘플은 클라미디아 감염에 대해 양성인 것으로 간주된다. 또 다른 바람직한 양태에서는, 문헌[참조: Sackett et al.,Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p.106-7]의 방법에 따라서, 리시버 오퍼레이터 곡선(Receiver Operator Curve)을 사용하여 컷-오프치를 결정한다. 간략하게 언급하면, 이 양태에서는, 진단 시험 결과에 대해 가능한 각각의 컷-오프치에 상응하는 진성 양성율(즉, 민감도)과 가성 양성율(100%-특이도) 쌍을 플롯팅함으로써 컷-오프치를 결정할 수 있다. 상단 좌측 코너에 가장 근접한 플롯 상의 컷-오프치(즉, 가장 큰 면적을 포괄하는 값)가 가장 정확한 컷-오프치이고, 이러한 방법에 의해 결정된 컷-오프치 보다 높은 시그날을 생성하는 샘플이 양성으로 간주될 수 있다. 또 다른 한편, 이러한 컷-오프치는 가성 양성율을 최소화하기 위해 플롯을 따라 좌측으로 이동할 수 있거나, 가성 음성율을 최소화하기 위해 우측으로 이동할 수 있다. 일반적으로, 이 방법에 의해 결정된 컷-오프치 보다 높은 시그날을 생성하는 샘플은 클라미디아 감염에 대해 양성인 것으로 간주한다.
관련 양태에서는, 상기 항원을 니트로셀룰로즈와 같은 막 위에 고정화시키는 신속한 통류(flow-through) 또는 스트립 시험 포맷으로 검정을 수행한다. 이러한 병류 시험에서는, 샘플이 막 내로 통과함에 따라 샘플 내의 항체가 고정화 폴리펩티드와 결합된다. 이어서, 탐지용 시약을 함유하는 용액이 막 내로 유동함에 따라 탐지용 시약(예: 단백질 A-콜로이드성 금)이 항체-폴리펩티드 복합체와 결합된다. 이어서, 결합된 탐지용 시약의 탐지를 상기 언급된 바와 같이 수행할 수 있다. 스트립 시험 포맷에서는, 폴리펩티드가 결합되는 막의 한쪽 말단을 상기 샘플 함유 용액에 함침시킨다. 이 샘플은 탐지용 시약을 함유하는 영역을 통하여 막을 따라 고정화 폴리펩티드 영역 내로 이동한다. 폴리펩티드에 탐지용 시약이 농축되어 있는 것은 샘플 중의 항-클라미디아 항체의 존재를 지시해준다. 전형적으로, 이러한 부위에 탐지용 시약이 농축되어 있는 것은 가시적으로 판독할 수 있는 라인과 같은 특정 패턴을 만든다. 이러한 패턴의 부재는 음성 결과를 지시해준다. 일반적으로, 막 위에 고정화된 폴리펩티드의 양은 상기 논의된 바와 같이, 생물학적 샘플이 ELISA에서 양성 시그날을 생성시키기에 충분할 수 있는 항체 수준을 함유하는 경우에 가시적으로 식별할 수 있는 패턴을 생성시키도록 선택한다. 바람직하게는, 막 위에 고정화된 폴리펩티드의 양은 약 25ng 내지 약 1㎍, 더욱 바람직하게는 약50ng 내지 약 500ng의 범위이다. 이러한 시험은 전형적으로 극히 소량(예: 1방울)의 환자 혈청 또는 혈액을 사용하여 수행할 수 있다.
물론, 본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용하기에 적합한 수 많은 기타 검정 프로토콜이 존재한다. 상기 기재 내용은 단지 예일 뿐이다. 상기 방법에 유용하게 이용될 수 있는 대체 검정 프로토콜의 한 예는 웨스턴 블롯(Western blot)인데, 여기서는 생물학적 샘플 내에 존재하는 단백질을 겔 상에서 분리시킨 후, 결합제에 노출시킨다. 이러한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명은 추가로, 클라미디아성 단백질과 특이적으로 결합되는 제제, 예를 들면, 항체 및 이의 항원-결합성 단편을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합성 단편은, 이것이 클라미디아 단백질과 탐지 가능한 수준(예를 들면, ELISA 내에서)으로 반응하고 유사한 조건 하에 관련되지 않은 단백질과는 탐지 가능한 수준으로 반응하지 않는 경우에, 클라미디아 단백질에 "특이적으로 결합"되는 것으로 여겨진다. 본원에 사용된 바와 같은 "결합"은 복합체가 형성되도록 2개의 별개의 분자 간의 비공유적 연합을 지칭한다. 결합 능력은, 예를 들면, 상기 복합체의 형성을 위한 결합 상수를 결정함으로써 평가할 수 있다. 이러한 결합 상수는 상기 복합체의 농도를 성분 생성물 농도로 나눈 값이다. 일반적으로, 복합체 형성을 위한 결합 상수가 약 103L/mol을 초과하는 경우에, 두 화합물은 본 발명의 맥락에서 "결합"된 것으로 간주된다. 결합 상수는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
결합제는 본원에 제공된 대표적인 검정을 사용하여, 클라미디아에 감염된 환자와 감염되지 않은 환자를 구별할 수 있게 해준다. 달리 말하면, 클라미디아 단백질과 결합되는 항체 또는 기타 결합제는 상기 질병에 걸린 환자의 약 20% 이상에서 클라미디아 감염의 존재를 지시해주는 시그날을 발생시킬 것이며, 감염되지 않은 개개인의 약 90% 이상에서는 이러한 질병의 부재를 지시해주는 음성 시그날을 발생시킬 것이다. 결합제가 이러한 요구 사항을 충족시키는지를 결정하기 위해, 클라미디아에 감염된 환자와 감염되지 않은 환자(표준 임상 시험을 이용하여 결정된 바와 같음)로부터의 생물학적 샘플(예: 혈액, 혈청, 담, 뇨 및/또는 조직 생검)을 대상으로 하여, 결합제와 결합하는 폴리펩티드의 존재를 알아보기 위해 본원에 기재된 바와 같이 검정할 수 있다. 질병에 걸린 샘플 및 질병에 걸리지 않은 샘플의 통계상 유의적 수가 검정되어야 한다는 것은 명백하다. 각각의 결합제는 상기 기준을 충족시켜야 하지만, 당업자는 결합제를 조합하여 사용하여 민감도를 개선시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다.
상기 요구 사항을 충족시키는 어떠한 제제도 결합제일 수 있다. 예를 들면, 결합제는 펩티드 성분을 갖거나 갖지 않는 리보솜, RNA 분자 또는 폴리펩티드일 수 있다. 바람직한 양태에서는, 결합제가 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 이러한 항체는 당업자에게 공지된 각종 기술에 의해 제조할 수 있다[참조: Harlow and Lane,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 항체는 본원에 기재된 바와 같은 모노클로날 항체의 생성을 포함한 세포 배양 기술에 의해, 또는 재조합 항체의 생성을 허용하기 위해, 항체 유전자를적합한 세균성 또는 포유류 세포 숙주 내로 형질감염시키는 것을 통하여 생성시킬 수 있다. 하나의 기술에서는, 당해 폴리펩티드를 포함하는 면역원을 광범위한 모든 포유류[예: 마우스, 랫트, 토끼, 양 또는 염소]에게 초기에 주입한다. 이 단계에서는, 본 발명의 폴리펩티드가 변형되지 않고서도 면역원으로서 제공될 수 있다. 또 다른 한편, 특히, 비교적 짧은 폴리펩티드의 경우에는, 이러한 폴리펩티드를 소의 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanion)과 같은 운반체 단백질에 연결시킨 경우에 뛰어난 면역 반응이 유도될 수 있다. 이러한 면역원을, 바람직하게는 하나 이상의 부스터 면역화 과정이 들어간 예정된 스케쥴에 따라서 동물 숙주에게 주사하고, 이 동물로부터 주기적으로 채혈한다. 이어서, 당해 폴리펩티드에 특이적인 폴리클로날 항체를, 예를 들면, 적합한 고체 지지체에 커플링된 폴리펩티드를 사용하여 친화 크로마토그래피함으로써 상기 항혈청으로부터 정제할 수 있다.
관심있는 항원성 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체는, 예를 들면, 문헌[참조: Kohler and Milstein,Eur. J. Immunol. 6:511-519(1976)]의 기술 및 이에 대한 개선 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 간략하게 언급하면, 이들 방법은 목적하는 특이성(즉, 관심있는 폴리펩티드와의 반응성)을 지닌 항체를 생산할 수 있는 불멸의 세포주를 제조하는 것을 포함한다. 이러한 세포주는 예를 들면, 상기 언급된 바와 같이 면역시킨 동물로부터 수득된 비장 세포로부터 생성시킬 수 있다. 이어서, 이러한 비장 세포를, 예를 들면, 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 상기 면역시킨 동물과 유전적동계인 것과 융합시킴으로써 불멸화시킨다. 각종 융합 기술을 이용할 수 있다. 예를 들면, 비장 세포와 골수종 세포를 수 분 동안 비이온성 세정제에서 함께 배합한 다음, 하이브리드 세포의 성장은 뒷받침 해주지만 골수종 세포의 성장은 뒷받침 해주지 않는 선별 배지 상에서 저밀도로 도말한다. 바람직한 선별 기술은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선별을 이용한다. 충분한 시간, 통상적으로 약 1 내지 2주 후, 하이브리드 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 선택하고, 이의 배양 상등액을 대상으로 하여, 당해 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 시험하였다. 높은 반응성과 특이성을 지닌 하이브리도마가 바람직하다.
성장하는 하이브리도마 콜로니의 상등액으로부터 모노클로날 항체를 분리할 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포주를 마우스와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복막강 내로 주사하는 것과 같은 각종 기술을 이용하여 수율을 증가시킬 수 있다. 이어서, 복수액 또는 혈액으로부터 모노클로날 항체를 수거할 수 있다. 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출과 같은 통상적인 기술에 의해 상기 항체로부터 오염물을 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를, 예를 들면, 친화 크로마토그래피 단계로 정제 공정에 사용할 수 있다.
특정 양태 내에서는, 항체의 항원 결합성 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 단편에는 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있는 Fab 단편이 포함된다. 간략하게 언급하면, 면역글로불린을 단백질 A 비드 칼럼 상에서 친화 크로마토그래피함으로써 래빗 혈청으로부터 정제할 수 있고[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988], 파파인에 의해 분해시켜 Fab 및 Fc 단편을 수득할 수 있다. 이러한 Fab 및 Fc 단편을 단백질 A 비드 칼럼 상에서 친화 크로마토그래피함으로써 분리시킬 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체를 하나 이상의 치료제에 커플링시킬 수 있다. 이와 관련하여 적합한 제제에는 방사성핵종, 분화 유도제, 약제, 독소, 및 이들의 유도체가 포함된다. 바람직한 방사성핵종에는90Y,123I,125I,131I,186Re,188Re,211At 및212Bi가 포함된다. 바람직한 약제에는 메토트렉세이트, 및 피리미딘 및 퓨린 동족체가 포함된다. 바람직한 분화 유도제에는 포르볼 에스테르 및 부티르산이 포함된다. 바람직한 독소에는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 겔로닌, 슈도모나스 외독소, 시겔라(Shigella) 독소 및 포크위드(pokeweed) 항바이러스성 단백질이 포함된다.
치료제를 적합한 모노클로날 항체에 직접 또는 간접적으로(예를 들면, 링커 그룹을 통함) 커플링시킬 수 있다(예를 들면, 공유 결합시킴). 각각이 서로 반응할 수 있는 치환체를 보유하는 경우에는, 치료제와 항체 간의 직접적인 반응이 가능하다. 예를 들면, 어느 하나의 친핵성 그룹, 예를 들면, 아미노 또는 설프하이드릴 그룹은, 다른 하나의 우수한 이탈 그룹(예: 할라이드)을 함유하는 알킬 그룹, 또는 카보닐 함유 그룹, 예를 들면, 무수물 또는 산 할라이드와 반응할 수 있다.
또 다른 한편, 치료제와 항체를 링커 그룹을 통하여 커플링시키는 것이 요망될 수도 있다. 링커 그룹은 결합 능력이 간섭받는 것을 피하기 위해 항체와 치료제 사이에 간격을 두는 스페이서로서 작용할 수 있다. 링커 그룹은 제제 또는 항체 상의 치환체의 화학적 반응성을 증가시킴으로써, 커플링 효율을 증가시키는 작용을 할 수도 있다. 화학적 반응성 증가로 인해, 가능하지 않았던, 제제 또는 제제 상의 작용성 그룹의 사용을 촉진시킬 수도 있다.
호모-작용성 및 헤테로-작용성인 각종 이작용성 또는 다작용성 시약(예를 들면, Pierce Chemical Co., Rockford, IL의 카탈로그에 기재된 것)이 링커 그룹으로서 이용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 커플링 반응은, 예를 들면, 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프하이드릴 그룹 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통하여 수행할 수 있다. 이러한 방법에 관해 기재된 수 많은 참조문헌이 있다[예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호(Rodwell et al.)].
치료제가 본 발명의 면역접합체의 항체 부분으로부터 분리될 때 보다 효능이 있는 경우에는, 세포 내로의 내재화(internalization) 동안 또는 내재화시 절단 가능한 링커 그룹을 사용하는 것이 요망될 수 있다. 수 많은 상이한 절단 가능한 링커 그룹이 보고되었다. 이들 링커 그룹으로부터 제제의 세포내 방출 기전에는 디설파이드 결합을 환원시킴으로써 절단시키는 방법[예를 들면, 미국 특허 제4,489,710호(Spitler)], 광 불안정한 결합에 조사하는 방법[예를 들면, 미국 특허 제4,625,014호(Senter et al.)], 유도체화된 아미노산 측쇄를 가수분해시키는 방법[예를 들면, 미국 특허 제4,638,045호(Kohn et al.)], 혈청 보체-매개된 가수분해 반응[예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호(Rodwell et al.)] 및 산 촉매된 가수분해 반응[예를 들면, 미국 특허 제4,569,789호(Blattler et al.)]이 포함된다.
하나 이상의 제제를 항체에 커플링시키는 것이 요망될 수 있다. 한 양태에서는, 제제의 다중 분자를 하나의 항체 분자에 커플링시킨다. 또 다른 양태에서는, 한 가지 이상의 유형의 제제를 하나의 항체에 커플링시킬 수 있다. 특정 양태에 상관없이, 하나 이상의 제제와의 면역접합체를 각종 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 제제를 항체 분자에 직접 커플링시키거나, 또는 부착용 다중 부위를 제공해주는 링커를 사용할 수 있다. 또 다른 한편으론, 담체를 사용할 수 있다.
담체는 직접적인 공유 결합 또는 링커 그룹을 통한 공유 결합을 포함한 각종 방법으로 상기 제제를 보유할 수 있다. 적합한 담체에는 단백질, 예를 들면, 알부민[참조: 미국 특허 제4,507,234호(Kato et al.)], 펩티드 및 폴리삭카라이드, 예를 들면, 아미노덱스트란[참조: 미국 특허 제4,699,784호(Shih et al.)]이 포함된다. 담체는 비공유 결합에 의해, 또는 리포솜 소낭 내에서의 캡슐화에 의해 특정 제제를 보유할 수도 있다[참조: 미국 특허 제4,429,008호 및 제4,873,008호]. 방사성핵종 제제에 특이적인 담체에는 방사성할로겐화 작은 분자 및 킬레이트화 화합물이 포함된다. 예를 들면, 미국 특허 제4,735,792호에는 대표적인 방사성할로겐화 작은 분자 및 이의 합성법이 기재되어 있다. 방사성핵종 킬레이트는 금속 또는 금속 산화물 방사성핵종을 결합시키기 위한 공여체 원자로서 질소 및 황 원자를 함유하는 것을 포함하는 킬레이트화 화합물로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,673,562호(Davison et al.)에는 대표적인 킬레이트화 화합물 및 이의 합성법이 기재되어 있다.
항체 및 면역접합체에 대한 각종 투여 경로를 이용할 수 있다. 전형적으로,투여는 적당한 방법에 의해 정맥내, 근육내, 피하, 또는 부위-특이적 영역 내로 수행될 것이다. 항체/면역접합체의 정확한 투여량은 사용된 항체, 항원 밀도, 및 항체의 소거(clearance) 속도에 따라서 다양할 것이라는 것은 명백하다.
상기 언급된 것과 유사한 검정 및 당업자에게 널리 공지된 기타 기술을 사용하여, 항체를 진단 시험에 사용하여 클라미디아 항원의 존재를 탐지함으로써, 환자에게서 클라미디아 감염을 탐지하는 방법을 제공해준다.
본 발명의 진단 시약은 상기 하나 이상의 폴리펩티드 또는 하나 이상의 이의 부분을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 이용 검정에 사용하여, 생물학적 샘플로부터 유래된 클라미디아-특이적 cDNA를 증폭시킬 수 있는데, 여기서는 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 중의 적어도 하나가 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분자에 특이적이다. 이어서, 당해 분야에 널리 공지된 기술, 예를 들면, 겔 전기영동을 이용하여, 상기와 같이 증폭된 cDNA를 탐지한다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리드화 검정에 사용하여, 생물학적 샘플 중의 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 탐지할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "DNA 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머/프로브"는 문제의 DNA 분자와 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 동일성을 나타내는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다. 본 발명의 진단 방법에 유용하게 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 프로브는 바람직하게는 약 10 내지 40개 이상의 뉴클레오티드를 갖는다. 바람직한 양태에서는, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머가, 본원에 기재된 폴리펩티드 중의 하나를 암호화하는 DNA 분자의 약 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 진단 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 프로브는, 본원에 기재된 폴리펩티드 중의 하나를 암호화하는 DNA 분자의 약 15개 이상의 연속된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. PCR-이용 검정과 하이브리드화 검정 모두에 대한 기술이 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조: Mullis et al. Ibid; Ehrlich, Ibid]. 따라서, 프라이머 또는 프로브를 사용하여 생물학적 샘플 중의 클라미디아-특이적 서열을 탐지할 수 있다. 상기 언급된 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 프로브 또는 프라이머를 단독으로 사용하거나 서로 조합하여 사용할 수 있다.
다음 실시예는 예시로써 제시된 것이며 이로써 제한되지는 않는다.
실시예 1
클라미디아 항원을 암호화하는 DNA 서열의 분리
본질적으로 문헌[참조: Sanderson et al. J. Exp. Med., 1995, 182:1751-1757]에 기재된 바와 같이 클라미디아 트라코마티스 LGV II의 게놈 DNA 라이브러리를 발현 클로닝함으로써 본 발명의 클라미디아 항원을 분리하였으며, 이는 면역반응성 T 세포주에서 IFN-γ와 PBMC 증식을 유도하는 것으로 밝혀졌다.
클라미디아 생식기 감염 병력이 없는 정상적인 공여자로부터의 PBMC를 클라미디아 트라코마티스 LGV II의 기본체(elementary body)로 자극함으로써 클라미디아-특이적 T 세포주를 생성시킨다. TCL-8로서 지칭되는 이러한 T 세포주는 클라미디아 트라코마티스 및 클라미디아 뉴모니애 감염된 단구-유도된 수지상 세포 둘다를 인식하는 것으로 밝혀졌다.
클라미디아 트라코마티스 LGV II의 무작위로 전단된 게놈 라이브러리를 람다 ZAP(Stratagene, La Jolla, CA)에서 작제하고, 증폭된 라이브러리를 30클론/웰의 밀도로 96웰 미세역가판에 도말한다. 2mM IPTG의 존재 하에 3시간 동안 재조합 단백질을 발현하도록 세균을 유도시키고, 이를 펠릿화한 다음, 200㎕의 RPMI 10% FBS에 재현탁시킨다. 상기 유도된 세균성 현탁액 10㎕을, 자가 단구-유도된 수지상 세포를 함유하는 96웰 판에 옮긴다. 2시간 동안 항온배양한 후, 수지상 세포를 세척하여 유리 이. 콜라이(E. coli)를 제거하고, 클라미디아-특이적 T 세포를 가한다. 양성의 이. 콜라이 풀에 반응하는 T 세포의 증식과 IFN-γ생성을 결정함으로써, 상기 양성의 이. 콜라이 풀을 동정한다.
4가지 양성 풀을 동정하고, 이를 붕괴시켜 삽입물 크기가 각각 481bp, 183bp, 110bp 및 1400bp인 4가지 순수한 클론(1-B1-66, 4-D7-28, 3-G3-10 및 10-C10-31로서 지칭됨)을 수득한다. 1-B1-66, 4-D7-28, 3-G3-10 및 10-C10-31에 대해 결정된 DNA 서열이 서열 1 내지 4에 각각 제시되어 있다. 클론 1-B1-66은 대략적으로, 씨. 트라코마티스 게놈(NCBI 씨. 트라코마티스 데이타베이스)의 영역 536690 내에 있다. 클론 1-B1-66 내에서, 앞서 동정된 9kDa 단백질[Stephens et al.,Genbank 수탁 번호 AE001320]을 암호화하는 개방 판독 프레임(ORF)를 동정하였으며(뉴클레오티드 115-375), 이의 서열이 서열 5에 제시되어 있다. 클론 4-D7-28은 동일한 ORF의 보다 작은 영역이다(1-B1-66의 아미노산 22-82). 클론 3-G3-10은 대략적으로, 씨. 트라코마티스 게놈의 영역 74559 내에 있다. 상기 삽입물은 게놈 내의 이의 배향에 대해 안티센스 배양으로 클로닝된다. 클론 10-C10-31은 클라미디아 트라코마티스로부터의 S13 리보솜성 단백질에 대해 앞서 공개된 서열[참조: Gu, L. et al. J. Bacteriology, 177:2594-2601, 1995]에 상응하는 개방 판독 프레임을 함유한다. 4-D7-28 및 10-C10-31에 대해 예상된 단백질 서열이 서열 6 및 12에 각각 제시되어 있다. 3-G3-10에 대해 예상된 단백질 서열이 서열 7-11에 제시되어 있다.
관련된 일련의 스크리닝 연구에서는, 부가의 T 세포주를 사용하여, 상기 언급된 클라미디아 트라코마티스 LGV II의 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 클라미디아 트라코마티스 LGV II의 기본체로 감염된 자가 단구-유도된 수지상 세포로 환자 PBMC를 자극함으로써, 클라미디아 생식기 감염된 환자로부터 클라미디아-특이적 T 세포주(TCT-1)를 유도하였다. 1256bp 삽입물을 함유하는 하나의 클론 4C9-18(서열 21)은 표준 증식 검정에 의해 측정된 바와 같이, 클라미디아-특이적 T 세포주 TCT-1로부터 특이적 면역 반응을 유발시켰다. 후속 분석 결과, 상기 클론이 다음의 3가지 공지된 서열을 함유하는 것으로 나타났다: 서열 22에 기재된, 리포아미드 데하이드로게나제(Genbank 수탁 번호 AE001326); 서열 23에 기재된, 가상 단백질 CT429(Genbank 수탁 번호 AE001316); 및 서열 24에 기재된, 우비퀴논 메틸트랜스퍼라제의 개방 판독 프레임의 일부(Genbank 수탁 번호 AE001316).
클론 4C9-18(서열 21)과 관련된 추가의 연구에서는, 씨. 트라코마티스(LGV II)로부터의 리포아미드 데하이드로게나제에 대한 완전한 길이의 아미노산 서열(서열 22)이 서열 90에 기재된 바와 같이, 클론 CtL2-LPDA-FL에서 발현되었다.
T 세포 자극성 에피토프(들)를 함유하는 개방 판독 프레임의 성상을 추가로 확인하기 위하여, 아미노 말단 상에 6X-히스티딘 태그를 암호화하는 cDNA 서열을 갖는 클론 4C9-18의 뉴클레오티드 1-695를 함유하는 DNA 단편을 pET17b 벡터(Novagen, Madison, WI)의 NdeI/EcoRI 부위 내로 서브클로닝하는데, 이는 클론 4C9-18#2 BL21 pLysS(서열 25; 서열 26에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 가짐)로서 지칭되며, 이를 이. 콜라이 내로 형질전환시킨다. 이와 같이 형질전환된 이. 콜라이를 3시간 동안 2mM IPTG로 선별적으로 유도시키면, 표준 쿠마시 염색된 SDS-PAGE에 의해 입증된 바와 같이, 클론 4C9-18#2 BL21 pLysS로부터 26kDa 단백질이 발현되었다. 클론 4C9-18#2 BL21 pLysS에 의해 암호화된 단백질의 면역원성을 결정하기 위해, 상기 26kDa 단백질을 발현하는 이. 콜라이를 1 x 104단구 유도된 수지상 세포 상으로 적정시키고 2시간 동안 항온배양한다. 상기 수지상 세포 배양물을 세척하고, 2.5 x 104T 세포(TCT-1)를 가하며, 72시간 더 항온배양하는데, 이때 배양 상등액 내의 IFN-γ의 수준을 ELISA로써 결정한다. 도 1에 도시된 바와 같이, T 세포주 TCT-1은 IFN-g에 의해 측정된 바와 같이 유도된 배양물에 반응하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 리포아미드 데하이드로게나제 서열에 대한 클라미디아-특이적 T 세포 반응을 지시해준다. 유사하게, 클론 4C9-18#2 BL21 pLysS에 의해 암호화된 단백질이 표준 증식 검정에 의해 TCT-1 T 세포주를 자극하는 것으로 밝혀졌다.
상기 언급된 CD4+ T 세포 발현 클로닝 기술을 이용하여 또 다른 클라미디아 트라코마티스 항원을 동정하기 위한 후속 연구 결과, 또 다른 클론이 생성되었다. TCT-1 및 TCL-8 클라미디아-특이적 T 세포주 뿐만 아니라 TCP-21 T 세포주를 활용하여, 클라미디아 트라코마티스 LGV II 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. 클라미디아 뉴모니애에 대한 체액성 면역 반응을 나타내는 환자로부터 TCP-21 T 세포주를 유도하였다. TCT-1 세포주는 37개의 양성 풀(pool)을 동정하였고, TCT-3 세포주는 41개의 양성 풀을 동정하였으며, TCP-21 세포주는 2개의 양성 풀을 동정하였다. 이들 양성 풀 중의 10개로부터 다음 클론을 유도하였다: TCP-21 세포주에 의해 동정된 클론 11-A3-93(서열 64)은 HAD 상위계열(CT103)과의 상동성을 나타내는 1339bp 게놈 단편이다. 동일한 클론 내의 제2의 삽입물은 상보쇄 상에 존재하는 fab I 유전자(CT104)와 상동성을 나타낸다. TCP-21 세포주를 사용하여 동정된 클론 11-C12-91(서열 63)은 OMP2 유전자(CT443)의 일부인 269bp 삽입물을 가지며, 씨. 뉴모니애의 60kDa 시스테인 풍부한 외막 단백질과 상동성을 나타낸다.
TCT-3 세포주를 사용하여 동정된 클론 11-G10-46(서열 62)은 가상 단백질 CT610과의 상동성을 나타내는 688bp 삽입물을 함유한다. TCT-3 세포주를 사용하여 동정된 클론 11-G1-34(서열 61)은 삽입물 크기가 1215bp인 2개의 부분 개방 판독 프레임(ORF)을 갖는다. 1개의 ORF는 말레이트 데하이드로게나제 유전자(CT376)와의 상동성을 나타내고, 다른 ORF는 글리코겐 하이드롤라제 유전자(CT042)와의 상동성을 나타낸다. TCT-3 세포주를 사용하여 동정된 클론 11-H3-68(서열 60)은 총 삽입물 크기가 1180bp인 2개의 ORF를 갖는다. 1개의 부분 ORF는 플라스미드-암호화된 PGP6-D 독성 단백질을 암호화하는 반면, 제2의 ORF는 L1 리보솜성 유전자(CT318)에 대한 완전한 ORF이다. TCT-3 세포주를 사용하여 동정된 클론 11-H4-28(서열 59)은 삽입물 크기가 552bp이고, dnaK 유전자(CT396)에 대한 ORF의 일부이다. TCT-1 세포주를 사용하여 동정된 클론 12-B3-95(서열 58)은 삽입물 크기가 463bp이고, 리포아미드 데하이드로게나제 유전자(CT557)에 대한 ORF의 일부이다. TCT-1 세포주를 사용하여 동정된 클론 15-G1-89 및 12-B3-95는 동일하며(각각 서열 55 및 58), 삽입물 크기가 463bp이고, 리포아미드 데하이드로게나제 유전자(CT557)에 대한 ORF의 일부이다. TCT-1 세포주를 사용하여 동정된 클론 12-G3-83(서열 57)은 삽입물 크기가 1537bp이고, 가상 단백질 CT622에 대한 ORF의 일부를 갖는다.
TCT-3 세포주를 사용하여 동정된 클론 23-G7-68(서열 79)은 950bp 삽입물을 함유하고, L11 리보솜성 ORF의 작은 부분, L1 리보솜성 단백질에 대한 전체 ORF 및 L10 리보솜성 단백질에 대한 ORF의 일부를 함유한다. 또한, 상기 클론은 환자 주 CT4, CT5, CT11, CT12 및 CHH037을 동정하였다. TCT-1 세포주를 사용하여 동정된 클론 22-F8-91(서열 80)은 395bp 삽입물을 함유하고, 상기 클론의 상보쇄 상에 pmpC ORF의 일부를 함유한다. TCT-3 세포주를 사용하여 동정된 클론 21-E8-95(서열 81)는 2,085bp 삽입물을 함유하고, CT613 ORF의 일부, CT612에 대한 완전한ORF, CT611에 대한 완전한 ORF 및 CT610에 대한 ORF의 일부를 함유한다. TCT-3 세포주를 사용하여 동정된 클론 19-F12-57(서열 82)는 405bp 삽입물을 함유하고, CT858 ORF의 일부 및 recA ORF의 작은 부분을 함유한다. TCT-3 세포주를 사용하여 동정된 클론 19-F12-53(서열 83)는 379bp 삽입물을 함유하고, 이는 글루타밀 tRNA 신테타제를 암호화하는 CT455에 대한 ORF의 일부이다. TCT-3 세포주를 사용하여 동정된 클론 19-A5-54(서열 84)는 715bp 삽입물을 함유하고, 이는 잠재적 플라스미드의 ORF3(상기 클론의 상보쇄)의 일부이다. TCT-1 세포주를 사용하여 동정된 클론 17-E11-72(서열 85)는 476bp 삽입물을 함유하고, 이는 Opp_2 및 pmpD에 대한 ORF의 일부이다. 상기 클론의 pmpD 영역은 클론 15-H2-76의 pmpD 영역에 의해 커버된다. 환자 세포주 CT3, CT1, CT4 및 CT12를 사용하여 동정된 클론 17-C1-77(서열 86)는 1551bp 삽입물을 함유하고, 이는 CT857 ORF의 일부일 뿐만 아니라 CT858 ORF의 일부이다. TCT-1 세포주를 사용하여 동정된 클론 15-H2-76(서열 87)는 3,031bp 삽입물을 함유하고, 이는 pmpD ORF의 큰 부분, CT089 ORF의 일부 뿐만 아니라 SycE에 대한 ORF의 일부를 함유한다. 클론 15-A3-26(서열 88)은 976bp 삽입물을 함유하고, 이는 CT858에 대한 ORF의 일부를 함유한다. 환자 세포주 CT8, TCT-10, CT1, CT5, CT13 및 CHH037를 사용하여 동정된 클론 17-G4-36(서열 267)은 680bp 삽입물을 함유하고, 이는 해당 플라스미드 내의 베타-gal과 동일 프레임 내에 있으며 DNA-지시된 RNA 폴리머라제 베타 소단위체(SerD 중의 CT315)에 대한 ORF의 일부와 상동성을 나타낸다.
상기 언급된 클론 중의 몇몇은 각종 다형성 막 단백질과의 상동성을 나타낸다. 클라미디아 트라코마티스의 게놈 서열은 pmp로서 지칭되는 9개의 다형성 막 단백질 유전자 계열을 함유한다. 이들 유전자는 pmpA, pmpB, pmpC, pmpD, pmpE, pmpF, pmpG, pmpH 및 pmpI로 명명된다. 이들 유전자로부터 발현된 단백질은 클라미디아 감염에 대한 보호 면역 반응을 생성시키는데 있어서 생물학적으로 관련성이 있는 것으로 여겨진다. 특히, pmpC, pmpD, pmpE 및 pmpI는 예측 가능한 시그날 펩티드를 함유하는데, 이는 이들이 외막 단백질이므로 잠재적인 면역학적 표적이라는 사실을 지시해준다.
클라미디아 트라코마티스 LGV II 혈청형 서열을 근거로 하여, pmpC, pmpD, pmpE, pmpG, pmpH 및 pmpI의 완전한 길이의 단편을 PCR 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 고안하였다. 이로써 생성된 단편을 DNA 백신 벡터 JA4304 또는 JAL(이는 변형된 링커를 갖는 JA4304이다) 내로 서브클로닝시킨다(SmithKline Beecham, London, England). 구체적으로 언급하면, 각각 서열 197 및 198에 제시된 바와 같은 5' 올리고 GAT AGG CGC GCC GCA ATC ATG AAA TTT ATG TCA GCT ACT GCT G 및 3' 올리고 CAG AAC GCG TTT AGA ATG TCA TAC GAG CAC CGC A를 사용하여, pmpC를 JAL 벡터 내로 서브클로닝시킨다. 짧은 뉴클레오티드 서열 GCAATC(서열 199)를 ATG의 상류에 삽입하여 코작(Kozak)-유사 서열을 생성시킨 후에, 당해 분야에 널리 공지된 조건 하에 상기 유전자를 PCR 증폭시키고 JAL 벡터의 5' ASCI/3' MluI 부위 내로 연결시키는 것을 완료한다. 이로써 생성된 발현 벡터는 187kD 단백질(서열 179)을 암호화하는, 가상 시그날 서열을 함유하는 5325 뉴클레오티드를 포함하는 완전한 길이의 pmpC 유전자(서열 173)를 함유하였다. 다음 올리고를 사용하여 상기 유전자를 PCR 증폭시킨 후에 JA4304 백신 벡터 내로 상기 pmpD 유전자를 서브클로닝하였다: 5' 올리고-TGC AAT CAT GAG TTC GCA GAA AGA TAT AAA AAG C (서열 200) 및 3' 올리고-CAG AGC TAG CTT AAA AGA TCA ATC GCA ATC CAG TAT TC (서열 201). 당해 분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여, 상기 유전자를 JA4304 백신 벡터의 5' 평활 HIII/3' MluI 부위에 연결시킨다. CAATC(서열 202)을 ATG의 상류에 삽입하여 코작-유사 서열을 생성시킨다. 이 클론은 코작-유사 서열의 마지막 글리신과 같이, HindIII 부위의 마지막 트레오닌이 평활화 과정으로 인해 생략된다는 점에서 독특하다. 삽입물인 4593 뉴클레오티드 단편(서열 172)은 161kD 단백질(서열 178)을 암호화하는, 가상 시그날 서열을 함유하는 pmpD에 대한 완전한 길이의 유전자이다. 5' 올리고-TGC AAT CAT GAA AAA AGC GTT TTT CTT TTT C (서열 203) 및 3' 올리고-CAG AAC GCG TCT AGA ATC GCA GAG CAA TTT C (서열 204)를 사용하여, pmpE를 JA4304 벡터 내로 서브클로닝시킨다. PCR 증폭을 수행한 후, 상기 유전자를 JA4304의 5' 평활 HIII/3' MluI 부위에 연결시킨다. 이를 촉진시키기 위해, 짧은 뉴클레오티드 서열 TGCAATC(서열 293)을 개시 코돈의 상류에 가하여 코작-유사 서열을 생성시키고 HindIII 부위를 재구성한다. 이 삽입물은 가상 시그날 서열을 함유하는 완전한 길이의 pmpE 유전자(서열 171)이다. pmpE 유전자는 105kD 단백질(서열 177)을 암호화한다. 5' 올리고-GTG CAA TCA TGA TTC CTC AAG GAA TTT ACG (서열 205) 및 3' 올리고-CAG AAC GCG TTT AGA ACC GGA CTT TAC TTC C (서열 206)을 사용하여, pmpG 유전자를 PCR 증폭시키고, JA4304 벡터 내로 서브클로닝시킨다. 유사한 클로닝 전략을 pmpI 및 pmpK 유전자에 대해 수행한다. 또한,완전한 길이의 상기 pmp 유전자 또는 이러한 유전자의 중복 단편을 PCR 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 고안하고, 이를 pET17b 벡터(Novagen, Madison, WI)에서 단백질 발현시키기 위해 서브클로닝한 다음, 발현 및 Novagen에 의해 제공된 히스티딘-니켈 크로마토그래피 방법을 활용하여 후속 정제하기 위해 이. 콜라이 BL21 pLysS 내로 형질감염시킨다. 다음에 기재된 바와 같이, 재조합 단백질을 암호화하는 몇몇 유전자는 상기 단백질의 발현을 촉진시켜 주는 본래의 시그날 서열이 결여되어 있다. 아미노 및 카복시 말단을 나타내는 2개의 중복 단편의 발현을 통하여, pmpC의 완전한 길이 단백질 발현을 달성한다. 5' 올리고-CAG ACA TAT GCA TCA CCA TCA CCA TCA CGA GGC GAG CTC GAT CCA AGA TC (서열 207) 및 3' 올리고-CAG AGG TAC CTC AGA TAG CAC TCT CTC CTA TTA AAG TAG G (서열 208)을 사용하여, 시그날 서열이 결여된 pmpC-아미노 말단 부분(서열 187; 이는 서열 195에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다)을 상기벡터의 5' NdeI/3' KPN 클로닝 부위 내로 서브클로닝시킨다. 상기 유전자의 카복시 말단 부분인 pmpC-카복시 말단 단편(서열 186; 이는 서열 194에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다)을 다음 프라이머를 사용하여, 상기 발현 벡터의 5' NdeI/3' KPN 클로닝 부위 내로 서브클로닝시킨다: 5' 올리고-CAG AGC TAG CAT GCA TCA CCA TCA CCA TCA CGT TAA GAT TGA GAA CTT CTC TGG C (서열 209) 및 3' 올리고-CAG AGG TAC CTT AGA ATG TCA TAC GAG CAC CGC AG (서열 210). pmpD를 또한 2개의 중복 단백질로서 발현시킨다. 시그날 서열이 결여된 pmpD-아미노 말단 부분(서열 185; 이는 서열 193에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다)은 pET17b의 개시 코돈을 함유하고 80kD 단백질로서 발현된다. 단백질 발현과 정제 목적을 위해, 6개의 히스티딘 태그가 개시 코돈 다음에 오고, 이는 상기 유전자의 28번째 아미노산(뉴클레오티드 84)에서 융합된다. 상기 벡터의 5' NdeI/3' KPN 클로닝 부위 내로 스플라이싱하기 위해, 다음 프라이머를 사용하였다: 5' 올리고-CAG ACA TAT GCA TCA CCA TCA CCA TCA CGG GTT AGC (서열 211) 및 3' 올리고-CAG AGG TAC CTC AGC TCC TCC AGC ACA CTC TCT TC (서열 212). pmpD-카복시 말단 부분(서열 184)이 92kD 단백질(서열 192)로서 발현된다. 발현 및 후속 정제를 위해, 추가의 메티오닌, 알라닌 및 세린이 포함되는데, 이는 개시 코돈 및 pET17b 벡터로부터의 처음 2개의 아미노산을 나타낸다. 이러한 메티오닌, 알라닌 및 세린의 6개-히스티딘 태그 하류를 상기 유전자의 691번째 아미노산(뉴클레오티드 2073)에서 융합시킨다. 5' 올리고-CAG AGC TAG CCA TCA CCA TCA CCA TCA CGG TGC TAT TTC TTG CTT ACG TGG (서열 213) 및 3' 올리고-CAG AGG TAC TTn AAA AGA TCA ATC GCA ATC CAG TAT TCG (서열 214)를 사용하여, 해당 삽입물을 발현 벡터의 5' NdeI/3' KPN 클로닝 부위 내로 서브클로닝시킨다. pmpE가 106kD 단백질로서 발현되었다(서열 183; 이는 서열 191에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다). pmpE 삽입물 또한 본래의 시그날 서열이 결여되어 있다. 다음 올리고 프라이머, 즉 5' 올리고-CAG AGG ATC CAC ATC ACC ATC ACC ATC ACG GAC TAG CTA GAG AGG TTC (서열 215) 및 3' 올리고-CAG AGA ATT CCT AGA ATC GCA GAG CAA TTT C (서열 216)를 사용하여, 당해 분야에 널리 공지된 조건 하에 상기 유전자를 PCR 증폭시키고, 이와 같이 증폭된 삽입물을 JA4304의 5' BamHI/3' EcoRI 부위에 연결시킨다. 서열 217에 제시된바와 같은 짧은 뉴클레오티드 서열을 개시 코돈의 상류에 삽입시켜, 코작-유사 서열을 생성시키고 HindIII 부위를 재구성한다. 이와 같이 발현된 단백질은 개시 코돈과 pET17b로부터의 하류 21개 아미노산, 즉 MASMTGGQQMGRDSSLVPSSDP(서열 218)을 함유한다. 또한, 6개-히스티딘 태그가 상기 언급된 서열의 상류에 포함되고, 이는 상기 유전자의 28번째 아미노산(뉴클레오티드 84)에서 융합되는데, 이는 가상 시그날 펩티드가 결여되어 있다. 서열 191에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는 서열 183에 제시된 서열은 이들 부가의 서열을 포함하지 못한다. pmpG 유전자(서열 182; 이는 서열 190에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다)를, 다음 올리고 프라이머, 즉 5' 올리고-CAG AGG TAC CGC ATC ACC ATC ACC ATC ACA TGA TTC CTC AAG GAA TTT ACG (서열 219) 및 3' 올리고-CAG AGC GGC CGC TTA GAA CCG GAC TTT ACT TCC (서열 220)을 사용하여 당해 분야에 널리 공지된 조건 하에 PCR 증폭시키고, 발현 벡터의 5' KPN/3' NotI 클로닝 부위에 연결시킨다. 이와 같이 발현된 단백질은 아미노 말단에 부가의 아미노산 서열, 즉 MASMTGGQQNGRDSSLVPHHHHHH (서열 221)을 함유하는데, 이는 pET17b 발현 벡터로부터의 부가의 서열 및 개시 코돈을 포함한다. pmpI 유전자(서열 181; 이는 서열 189에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다)를, 다음 올리고 프라이머, 즉 5' 올리고-CAG AGC TAG CCA TCA CCA TCA CCA TCA CCT CTT TGG CCA GGA TCC C (서열 222) 및 3' 올리고-CAG AAC TAG TCT AGA ACC TGT AAG TGG TCC (서열 223)을 사용하여 당해 분야에 널리 공지된 조건 하에 PCR 증폭시키고, 발현 벡터의 5' NheI/3' SpeI 클로닝 부위에 연결시킨다. 상기 95kD 발현 단백질은, 이러한 단백질의 아미노 말단에 개시 코돈 플러스 pET17b벡터의 부가의 알라닌 및 세린을 함유한다. 또한, 6개-히스티딘 태그를 상기 유전자의 21번째 아미노산에서 융합시키는데, 이는 가상 시그날 펩티드가 결여되어 있다.
TCT-3 세포주를 사용하여 동정된 클론 14H1-4(서열 56)는 TSA 유전자에 대한 완전한 ORF, 티올 특이적 산화방지제-CT603(CT603 ORF는 씨. 뉴모니애로부터의 CPn0778의 동족체이다)를 함유한다. 발현된 단백질이 부가의 메티오닌과 6x 히스티딘 태그(아미노 말단)을 보유하도록, 클론 14-H1-4 중의 TSA 개방 판독 프레임을 증폭시킨다. 이와 같이 증폭시킨 삽입물을 pET17b 벡터의 Nde/EcoRI 부위 내로 서브클로닝시킨다. 이러한 클론을 IPTG로 유도시킬 때, 22.6kDa 단백질을 Ni-NTA 아가로즈 친화 크로마토그래피로 정제한다. TSA 유전자를 암호화하는 클론 14-H1-4의 195 아미노산 ORF에 대해 결정된 아미노산 서열이 서열 65에 제시되어 있다. 추가의 분석 결과, 서열 92에 제시된 완전한 길이의 아미노산 서열을 갖는, CTL2-TSA-FL로서 지칭된, TSA 유전자에 대한 완전한 클론이 생성되었다.
추가의 연구 결과, 상기 언급된 바와 같이, TCT-1 및 TCT-3 T 세포주에 의해 동정된 10개의 추가의 클론이 생성되었다. TCT-1 세포주에 의해 동정된 클론은 16-D4-22, 17-C5-19, 18-C5-2, 20-G3-45 및 21-C7-66이고; TCT-3 세포주에 의해 동정된 클론은 17-C10-31, 17-E2-9, 22-A1-49 및 22-B3-53이다. 클론 21-G12-60은 TCT-1 및 TCT-3 T 세포주 모두에 의해 인식되었다. 또한, pmpB에 특이적인 서열을 함유하고 있는 클론 20-G3-45를 환자 세포주 CT1 및 CT4에 대해 동정하였다. TCT-1 세포주를 사용하여 동정된 클론 16-D4-22(서열 19)는 953bp 삽입물을 함유하고,이는 2개의 유전자, 즉 포유류 세포 내에서의 성장을 위한 씨. 트라코마티스 플라스미드의 개방 판독 프레임 3(ORF3) 및 ORF4를 함유한다. 클론 17-C5-19(서열 118)은 951bp 삽입물을 함유하고, 이는 clpP_1 프로테아제를 암호화하는 DT431에 대한 ORF의 일부 및 CT430(디아미노피멜레이트 에피머라제)에 대한 ORF의 일부를 함유한다. 클론 18-C5-2(서열 117)은 TCT-1 세포주를 사용하여 동정한, 446bp 삽입물을 함유하는 S1 리보솜성 단백질에 대한 ORF의 일부이다. TCT-1 세포주에 의해 동정된 클론 20-G3-45(서열 116)은 437bp 삽입물을 함유하고, 이는 pmpB 유전자(CT413)의 일부이다. TCT-1 세포주에 의해 동정된 클론 21-C7-8(서열 115)은 995bp 삽입물을 함유하고, 이는 dnaK 유사 단백질의 일부를 암호화한다. 상기 클론의 삽입물은 TCT-3 클론 11-H4-28(서열 59)의 삽입물과 중복되지 않는데, 이는 dnaK 유전자 CT396의 일부인 것으로 밝혀졌다. TCT-3 세포주에 의해 동정된 클론 17-C10-31(서열 114)는 976bp 삽입물을 함유한다. 이 클론은 IRBP 및 DHR 도메인을 함유하는 프로테아제인, CT858에 대한 ORF를 함유한다. 클론 17-E2-9(서열 113)은 1142bp 삽입물에 걸쳐 있는 2개의 유전자, 즉 CT611 및 CT610에 대한 ORF의 일부를 함유한다. TCT-3 세포주를 사용하여 동정된 클론 22-A1-49(서열 112)은 또한, 698bp 삽입물 중에 2개의 유전자를 함유한다. CT660(DNA 기라제{gyrA_2})에 대한 ORF의 일부가 상부 쇄 상에 존재하는 반면, 가상 단백질 CT659에 대한 완전한 ORF는 상보 쇄 상에 존재한다. TCT-1 세포주에 의해 동정된 클론 22-B3-53(서열 111)은 267bp 삽입물을 가지며, 이는 GroEL(CT110)에 대한 ORF의 일부를 암호화한다. TCT-1 및 TCT-3 세포주 모두에 의해 동정된 클론 21-G12-60(서열 110)은1461bp 삽입물을 함유하고, 이는 가상 단백질 CT875, CT229 및 CT228에 대한 ORF의 일부를 함유한다.
당해 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 몇몇 클라미디아-감염된 개개인으로부터 풀링된 혈청을 이용하여 람다 스크린-1 벡터(Novagen, Madison, WI)에서 클라미디아 트라코마티스(LGV II 혈청형)의 게놈 발현 라이브러리를 스크리닝함으로써, 또 다른 클라미디아 항원을 수득한다. 다음의 면역 반응성 클론을 동정하고, 클라미디아 유전자를 함유하는 삽입물을 서열 분석하였다: CTL2#1(서열 71); CTL2#2(서열 70); CTL2#3-5'(서열 72, 5' 말단을 나타내는 제1의 결정된 게놈 서열); CTL2#3-3'(서열 73, 3' 말단을 나타내는 제2의 결정된 게놈 서열); CTL2#4(서열 53); CTL2#5(서열 69); CTL2#6(서열 68); CTL2#7(서열 67); CTL2#8b(서열 54); CTL2#9(서열 66); CTL2#10-5'(서열 74, 5' 말단을 나타내는 제1의 결정된 게놈 서열); CTL2#10-3'(서열 75, 3' 말단을 나타내는 제2의 결정된 게놈 서열); CTL2#11-5'(서열 45, 5' 말단을 나타내는 제1의 결정된 게놈 서열); CTL2#11-3'(서열 44, 3' 말단을 나타내는 제2의 결정된 게놈 서열); CTL2#12(서열 46); CTL2#16-5'(서열 47); CTL2#18-5'(서열 49, 5' 말단을 나타내는 제1의 결정된 게놈 서열); CTL2#18-3'(서열 48, 3' 말단을 나타내는 제2의 결정된 게놈 서열); CTL2#19-5'(서열 76, 5' 말단을 나타내는 결정된 게놈 서열); CTL2#21(서열 50); CTL2#23(서열 51); 및 CTL2#24(서열 52).
혈청학적 발현 클로닝에 의해 또 다른 클라미디아 트라코마티스 항원을 동정하였다. 이들 연구는 상기 언급된 바와 같이, 몇몇 클라미디아-감염된 개개인으로부터 풀링된 혈청을 사용하였지만, IgG 이외에도 IgA 및 IgM 항체가 제2의 항체로서 사용되었다. 상기 방법에 의해 스크리닝된 클론은 클라미디아 감염에 대한 초기 면역 반응, 즉 점액성의 체액성 면역 반응에 의해 인식된 항원의 탐지를 증진시켜 준다. 다음의 면역 반응성 클론의 성상을 확인하고, 클라미디아 유전자를 함유하는 삽입물을 서열 분석하였다: CTL2gam-1(서열 290); CTL2gam-2(서열 289); CTL2gam-5(서열 288); CTL2gam-6-3'(서열 287, 3' 말단을 나타내는 제2의 결정된 게놈 서열); CTL2gam-6-5'(서열 286, 5' 말단을 나타내는 제1의 결정된 게놈 서열); CTL2gam-8(서열 285); CTL2gam-10(서열 284); CTL2gam-13(서열 283); CTL2gam-15-3'(서열 282, 3' 말단을 나타내는 제2의 결정된 게놈 서열); CTL2gam-15-5'(서열 281, 5' 말단을 나타내는 제1의 결정된 게놈 서열); CTL2gam-17(서열 280); CTL2gam-18(서열 279); CTL2gam-21(서열 278); CTL2gam-23(서열 277); CTL2gam-24(서열 276); CTL2gam-26(서열 275); CTL2gam-27(서열 274); CTL2gam-28(서열 273); CTL2gam-30-3'(서열 272, 3' 말단을 나타내는 제2의 결정된 게놈 서열); 및 CTL2gam-30-5'(서열 271, 5' 말단을 나타내는 제1의 결정된 게놈 서열).
실시예 2
클라미디아 트라코마티스 항원에 의한 인터페론-γ생성 및 T 세포 증식의 유도
T 세포 증식과 인터페론-γ생성을 유도하는 재조합 클라미디아 트라코마티스 항원의 능력을 다음과 같이 결정한다.
단백질을 IPTG에 의해 유도하고, Ni-NTA 아가로즈 친화 크로마토그래피로 정제한다[참조: Webb et al., J. Immunology 157:5034-5041, 1996]. 이어서, 이와 같이 정제된 폴리펩티드를 대상으로 하여, PBMC 제제에서 T 세포 증식을 유도하는 능력에 대해 스크리닝한다. T 세포가 클라미디아 항원에 반응하여 증식하는 것으로 공지된 정상 공여자로부터의 PBMC 뿐만 아니라 씨. 트라코마티스 환자로부터의 PBMC를, 10% 풀링된 사람 혈청 및 50㎍/ml 젠타마이신으로 보충된 RPMI 1640을 포함하는 배지에서 배양한다. 정제된 폴리펩티드를 0.5 내지 10㎍/ml의 농도로 이중으로 가한다. 200㎕의 용적으로 96웰 환저 판 내에서 6일 동안 배양한 후, 배지 50㎕을 각 웰로부터 꺼내어, 이를 대상으로 하여 상기 언급된 바와 같이 IFN-γ수준을 결정한다. 이어서, 상기 판을 추가로 18시간 동안 3중 수소화 티미딘 1μCi/웰로 펄싱하고, 수거한 다음, 기체 신틸레이션 계수기를 이용하여 3중수소 흡수를 결정한다. 배지 단독에서 배양된 세포에서 관찰된 증식 보다 양쪽 복제물에서 3배 이상 높은 증식을 가져다 주는 분획이 양성으로 간주된다.
효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA)을 사용하여 IFN-γ을 측정한다. ELISA 판을 실온에서 4시간 동안 PBS 중의 사람 IFN-γ(PharMingen, San Diego, CA)에 대해 유도된 마우스 모노클로날 항체로 피복시킨다. 이어서, 실온에서 1시간 동안 5%(W/V) 비-지방 분유를 함유하는 PBS로 웰을 차단시킨다. 상기 판을 PBS/0.2% TWEEN-20에서 6회 세척하고, 상기 ELISA 판에서 배양 배지 중에서 1:2로 희석된 샘플을 실온에서 밤새 항온배양한다. 상기 판을 다시 세척하고, PBS/10% 정상 염소 혈청 중에서 1:3000으로 희석된 폴리클로날 토끼 항-사람 IFN-γ혈청을 각 웰에 가한다. 이어서, 상기 판을 실온에서 2시간 동안 항온배양하고, 세척하며, 서양고추냉이 퍼옥시다제-커플링된 항-토끼 IgG(Sigma Chemical So., St. Louis, MO)을 PBS/5% 비-지방 분유 중의 1:2000 희석도로 가한다. 실온에서 2시간 더 항온배양한 후, 상기 판을 세척하고, TMB 기질을 가한다. 1N 황산을 이용하여 20분 후에 상기 반응을 중지시킨다. 기준 파장으로서 570nm을 사용하여 450nm에서 광밀도를 결정한다. 배지 단독에서 배양된 세포로부터의 평균 OD 보다 양쪽 복제물에서 2배 이상 높은 OD + 3 표준 편차를 가져다 주는 분획이 양성으로 간주된다.
상기 방법을 사용하여, 재조합 1B1-66 단백질(서열 5) 뿐만 아니라 서열 5의 아미노산 잔기 48-67(서열 13; 1-B1-66/48-67로서 지칭됨) 및 58-77(서열 14; 1B1-66/58-77로서 지칭됨) 각각에 상응하는 2개의 합성 펩티드가 씨. 트라코마티스 LGV II의 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된 클라미디아-특이적 T 세포주에서 증식 반응과 IFN-γ생성을 유도하는 것으로 밝혀졌다.
추가의 연구 결과, 리보솜성 S13 단백질 내의 씨. 트라코마티스-특이적 T 세포 에피토프를 동정하였다. 당해 분야에 널리 공지된 표준 에피토프 지도화 기술을 사용하여, 공여자 CL-8로부터의 클라미디아-특이적 T 세포주(T 세포주 TCL-8 EB/DC)를 이용하여 리보솜성 S13 단백질(rS13) 내의 2개의 T 세포 에피토프를 동정하였다. 도 8은 제1 펩티드인 rS13 1-20(서열 106)이 상응하는 씨. 뉴모니애 서열과 100% 동일하다는 것을 예시해주는데, 이는 재조합 씨. 트라코마티스- 및 씨. 뉴모니애-rS13에 대한 상기 T 세포주의 교차 반응성을 설명해준다. 제2의 펩티드 rS13 56-75(서열 108)에 대한 반응은 씨. 트라코마티스-특이적인데, 이는 상기 건강하고 자각 증상이 없는 공여자 내에서의 rS13 반응이, 씨. 뉴모니애에 대한 노출또는 기타 미생물성 감염에 의해서가 아니라 씨. 트라코마티스에 대한 노출에 의해 유발되었다는 것을 지시해준다.
실시예 1에 기재된 바와 같이, TCP-21 세포주를 사용하여 동정된 클론 11-C12-91(서열 63)은 269bp 삽입물을 갖고, 이는 OMP2 유전자(CT443)의 일부이고 OMCB로서 지칭된 씨. 뉴모니애의 60kDa 시스테인 풍부 외막 단백질과의 상동성을 나타낸다. 반응성 에피토프(들)를 추가로 규정하기 위해, 앞서 기재된 면역검정과 일련의 중복 펩티드를 사용하여, 에피토프 지도화를 수행한다. 간략하게 언급하면, 2.5 x 104TCP-21 T 세포를 1 x 104단구 유도된 수지상 세포의 존재 하에, 씨. 트라코마티스 및 씨. 뉴모니애로부터 유래된 비-감염성 기본체, 또는 씨. 트라코마티스 또는 씨. 뉴모니애 OMCB 단백질의 단백질 서열로부터 유래된 펩티드(0.1㎍/ml)로 자극함으로써, 증식 반응을 결정한다. TCP-21 T 세포는 에피토프 CT-OMCB #167-186, CT-OMCB #171-190 및 CT-OMCB #171-186에 반응하였으며, 보다 덜한 정도로는, CT-OMCB #175-186(각각 서열 249-252)에 반응하였다. 현저하게, TCP-21 T 세포주는 또한, 상동성 씨. 뉴모니애 펩티드 CP-OMCB #171-186(서열 253)에 대한 증식 반응을 제공해주었는데, 이는 씨. 트라코마티스 펩티드에 대한 반응 이상이다. 위치 2에서의 아미노산 치환(Glu를 Asp로 치환함) 및 위치 4에서의 아미노산 치환(즉, Ser를 Cys로 치환함)은 T 세포의 증식 반응을 변화시키지 못하므로, 이는 상기 에피토프가 씨. 트라코마티스와 씨.뉴모니애 간의 교차 반응성 에피토프이라는 것을 입증해준다.
상기 언급된 에피토프를 추가로 규정하기 위해, 또 다른 T 세포주인 TCT-3을 에피토프 지도화 실험에 사용한다. 씨. 트라코마티스로부터의 펩티드 만을 시험한다는 것을 제외하고는, 상기 언급된 바와 같이 면역 검정을 수행한다. 이러한 T 세포는 2개의 펩티드 CT-OMCB #152-171 및 CT-OMCB #157-176(각각 서열 246 및 247)에 대한 면역 반응을 제공해줌으로써, 씨. 트라코마티스의 시스테인 풍부한 외막 단백질 내의 추가의 면역원성 에피토프를 규정한다.
앞서 기재된 CD4 T 세포 발현 클로닝 시스템에서 TCT-3 세포주를 사용하여 클론 14-H1-4(서열 56; 서열 92에 제시된 상응하는 완전한 길이의 아미노산 서열을 갖는다)을 동정하였는데, 이는 TSA로서 지칭된 티올 특이적 산화방지제 유전자(CT603)에 대한 완전한 ORF을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 에피토프 지도화 면역 검정을 상기 언급된 바와 같이 수행하여, 해당 에피토프를 추가로 규정한다. TCT-3 T 세포주는 중복 펩티드 CT-TSA #96-115, CT-TSA #101-120 및 CT-TSA #106-125(각각 서열 254-256)에 대한 강력한 증식 반응을 나타내었는데, 이는 씨. 트라코마티스 혈청형 LGVII의 티올 특이적 산화방지제 유전자 내의 면역 반응성 에피토프를 입증해준다.
실시예 3
합성 폴리펩티드의 제조
HPTU(O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 활성화를 이용한 FMOC 화학을 사용하여, 밀리포어(Millipore) 9050 펩티드 합성기상에서 폴리펩티드를 합성할 수 있다. Gly-Cys-Gly 서열을 상기 펩티드의 아미노 말단에 부착하여 이러한 펩티드의 접합 또는 표지화 방법을 제공할 수 있다. 상기 펩티드를 고체 지지체로부터 절단시키는 것은 다음의 절단 혼합물을 사용하여 수행할 수 있다: 트리플루오로아세트산:에탄디티올:티오아니솔:물:페놀(40:1:2:2:3). 2시간 동안 절단한 후, 상기 펩티드를 차가운 메틸-t-부틸-에테르에 침전시킬 수 있다. 이어서, 펩티드 펠릿을 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 함유하는 물에 용해시키고, 동결건조시킨 후, C18 역상 HPLC함으로써 정제할 수 있다. 수(0.1% TFA 함유) 중의 0 내지 60% 아세토니트릴(0.1% TFA 함유)의 구배를 사용하여 펩티드를 용출시킨다. 순수한 분획을 동결건조시킨 후, 전기분무 질량 분광법 및 아미노산 분석에 의해 상기 펩티드의 성상을 확인할 수 있다.
실시예 4
레트로바이러스성 발현 벡터 시스템을 사용하여 클라미디아 항원을 암호화하는 DNA 서열의 분리 및 성상 확인, 및 후속 면역학적 분석
BamHI, BglII, BstYi 및 MboI 제한 효소를 사용하여 제한된 분해에 의해 클라미디아 트라코마티스 LGV II의 게놈 라이브러리를 작제한다. 이러한 제한 분해 단편을 연속해서, 레트로바이러스성 벡터 pBIB-KS1,2,3의 BamHI 부위에 연결시킨다. 코작 해독 개시 부위와 정지 코돈을 함유하도록 상기 벡터 세트를 변형시켜, 도 2에 도시된 바와 같이 짧은 DNA 게놈 단편으로부터 단백질을 발현시킬 수 있다. 80개 클론의 DNA 풀을 제조하고, 이를 문헌[참조: Pear, W.S., Scott, M.L. andNolan, G.P., Generation of High Titre, Helper-free Retroviruses by Transient Transfection. Methods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, pp. 41-57]에 기재된 바와 같이 레트로바이러스성 패키징 주 푀닉스-암포(Phoenix-Ampho) 내로 형질감염시킨다. 레트로바이러스성 형태의 클라미디아 라이브러리를 H2-Ld 발현성 P815 세포 내로 형질도입한 다음, 이를 항원 특이적 T 세포주를 자극하는 표적 세포로서 사용한다.
문헌[참조: Starnbach, M., in J. Immunol., 153:5183, 1994]에 기재된 바와 같이, 방사선 조사된 씨. 트라코마티스 감염된 J774 세포 및 방사선 조사된 유전적동계의 비장 세포로 수회 반복해서 자극함으로써, 클라미디아-특이적인 쥐의 H2d제한된 CD8+ T 세포주를 배양물에서 증대시켰다. 이러한 클라미디아-특이적 T 세포주를 사용하여, 레트로바이러스에 의해 형질도입된 P815 세포에 의해 발현된 상기 클라미디아 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. 엘리스폿(Elispot) 분석을 사용하여 IFN-γ생성을 탐지함으로써 양성 DNA 풀을 동정하였다[참조: Lalvani et al., J. Experimental Medicine 186:859-865, 1997].
2C7 및 2E10으로서 지칭된 2개의 양성 풀을 IFN-γ엘리스폿 검정에 의해 동정하였다. 풀 2C7로부터의 P815 세포의 안정한 형질도입체를 제한 희석에 의해 클로닝하고, 클라미디아-특이적 CTL 주로부터 IFN-γ생성을 유발시키는 이들의 능력에 근거하여 개개의 클론을 선별한다. 이러한 스크리닝 과정으로부터, 2C7-8, 2C7-9, 2C7-19 및 2C7-21로서 지칭된 4개의 양성 클론을 선별하였다. 유사하게,양성 풀 2E10을 추가로 스크리닝하면, 3개의 삽입물을 함유하는 추가의 양성 클론이 생긴다. 이러한 3개의 삽입물은 CT016, tRNA 신타제 및 clpX 유전자의 단편이다(각각 서열 268-270).
이들 4개의 양성 2C7 클론으로부터의 형질전환성 DNA를, pBIB-KS 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켜 클라미디아 DNA 삽입물을 선택적으로 증폭시킨다. 증폭된 삽입물을 겔 정제하고 서열 분석하였다. 하나의 면역 반응성 클론 2C7-8(서열 15; 서열 32에 제시된 예상된 아미노산 서열을 갖는다)은 클라미디아 트라코마티스 혈청형 D의 뉴클레오티드 577304-597145와의 상동성을 나타내는 160bp 단편이다(NCBI, BLASTIN 조사; 서열 33; 서열 34에 제시된 예상된 아미노산 서열을 갖는다). 바로 앞서 언급된 높은 상동성 영역으로부터의 2개의 추정상의 개방 판독 프레임 내에서의 클론 2C7-8 지도의 서열, 및 특히, 298개 아미노산 단편으로 이루어진, 이들 추정상의 개방 판독 프레임 중의 하나 내에서의 상기 클론 지도의 서열(서열 16; 이는 서열 17에 제시된 예상된 아미노산 서열을 갖는다)이 면역학적 활성을 나타내는 것으로 입증되었다.
주형으로서 정제된 씨. 트라코마티스 L2 게놈 DNA를 사용하고, ttttgaagcaggtaggtgaatatg(정방향)(서열 159) 및 ttaagaaatttaaaaaatccctta(역방향)(서열 160) 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킴으로써, 혈청형 L2로부터 298개 아미노산 단편의 완전한 길이 클로닝(CT529 및/또는 Cap1 유전자로서 지칭됨)을 수득하였다. 이러한 PCR 생성물을 겔 정제하고, 서열 분석하기 위해 pCRBlunt(Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 클로닝한 다음, 발현을 위한 pBIB-KS의유도체인 pBIB-KMS의 EcoRI 부위 내로 서브클로닝시킨다. CT529의 클라미디아 뉴모니애 상동체가 서열 291에 제시되어 있는데, 이는 서열 292에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다.
본질적으로 문헌[참조: Denamur, E., C. Sayada, A. Souriau, J. Orfila, A. Rodolakis and J. Elion. 1991, J. Gen. Microbiol. 137:2525]에 기재된 바와 같이, 105IFU를 함유하는 세균성 용해물로부터 PCR함으로써, 각종 CT529 혈청형을 함유하는 완전한 길이의 DNA를 증폭시킨다. 다음의 혈청형을 기재된 바와 같이 증폭시킨다: Ba(서열 134; 서열 135에 제시된 상응하는 예상된 아미노산 서열을 갖는다); E(BOUR) 및 E(MTW447)(서열 122; 서열 123에 제시된 상응하는 예상된 아미노산 서열을 갖는다); F(NI1)(서열 128; 서열 129에 제시된 상응하는 예상된 아미노산 서열을 갖는다); G(서열 126; 서열 127에 제시된 상응하는 예상된 아미노산 서열을 갖는다); Ia(서열 124; 서열 125에 제시된 상응하는 예상된 아미노산 서열을 갖는다); L1(서열 130; 서열 131에 제시된 상응하는 예상된 아미노산 서열을 갖는다); L3(서열 132; 서열 133에 제시된 상응하는 예상된 아미노산 서열을 갖는다); I(서열 263; 서열 264에 제시된 상응하는 예상된 아미노산 서열을 갖는다); K(서열 265; 서열 266에 제시된 상응하는 예상된 아미노산 서열을 갖는다); 및 MoPn(서열 136; 서열 137에 제시된 상응하는 예상된 아미노산 서열을 갖는다). 혈청형 L2 DNA(ORF에 대해 외부적임)에 특이적인 프라이머를 사용하고 키트[Advantage Genomic PCR 키트; Clontech, Palo Alto, CA]를 이용하여, PCR 반응을 수행한다.프라이머 서열은 5'-ggtataatatctctctaaattttg(정방향-서열 161) 및 5'-agataaaaaaggctgtttc'(역방향-서열 162)인데, 단 MoPn은 5'-ttttgaagcaggtaggtgaatatg(정방향-서열 163) 및 5'-tttacaataagaaaagctaagcactttgt(역방향-서열 164)를 요구한다. PCR 증폭된 DNA를 QIAquick PCR 정제용 키트(Qiagen, Valencia, CA)로 정제시키고, 서열 분석하기 위해 pCR2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 클로닝한다.
pBIB-KS 특이적 정방향 프라이머 5'-ccttacacagtcctgctgac(서열 165) 및 역방향 프라이머 3'-gtttccgggccctcacattg(서열 166) 모두를 사용하여 자동화 서열 분석기(ABI 377) 상에서, 면역 반응성 클론의 PCR 증폭된 삽입물로부터 유도된 DNA의 서열 분석을 수행한다. CT529 혈청형 L2를 암호화하는 PCRBlunt 클로닝된 DNA 및 CT529 혈청형 Ba, E(BOUR), E(MTW447), F(NI1), G, Ia, K, L1, L3 및 MoPn을 암호화하는 pCR2.1 클로닝된 DNA를, T7 프로모터 프라이머 및 만능 M13 정방향 및 M13 역방향 프라이머를 사용하여 서열 분석한다.
이들 2개의 추정상의 개방 판독 프레임(서열 16 및 20)이 관련 면역학적 기능을 지닌 단백질을 암호화하였는지를 결정하기 위해, 이러한 2개의 개방 판독 프레임의 일정 길이에 걸쳐 있는 중복 펩티드(17-20개 아미노산 길이)를 실시예 3에 기재된 바와 같이 합성한다. 표준 크롬 방출 검정을 활용하여, 펩티드-펄싱된 H2d제한된 표적 세포의 특이적 용해율을 결정하였다. 이러한 검정에서는, P815 세포(H2d)의 분취량을 37℃에서 1시간 동안 상기 지시된 펩티드 1㎍/ml의 존재 또는부재 하에 100μCi의51Cr로 표지시킨다. 이러한 항온배양을 수행한 후, 표지된 P815 세포를 세척하여 과량의51Cr와 펩티드를 제거하고, 연속해서 1,000개 세포/웰의 농도로 미세배양 판 내에 이중으로 도말한다. 효과인자 CTL(클라미디아-특이적 CD8 T 세포)을 지시된 효과인자:표적 비로 가한다. 4시간 동안 항온배양한 후, 상등액을 수거하고, 이러한 상등액 내로의51Cr의 방출을 알아보기 위해 감마 계수기로 측정한다. 298개 아미노산 개방 판독 프레임으로부터의 2개의 중복 펩티드는 상기 CTL 주를 특이적으로 자극하였다. 서열 138-156에 제시된 펩티드를 합성하였는데, 이는 CT529(Cap1 유전자)에 대한 혈청형 D 개방 판독 프레임 및 216개 아미노산 개방 판독 프레임의 L2 상동체의 해독을 나타낸다. 도 3에 도시된 바와 같이, 펩티드 CtC7.8-12(서열 18; 또한, Cap1 #132-147로서 지칭됨, 서열 139) 및 CtC7.8-13(서열 19; 또한, Cap1 #138-155로서 지칭됨, 서열 140)는 효과인자 대 표적 비 10:1에서 38 내지 52%의 특이적 용해율을 유발시킬 수 있었다. 현저하게, 이들 두 펩티드 간의 중복물은 예상된 H2d(Kd및 Ld) 결합성 펩티드를 함유하고 있다. 상기 중복 서열(서열 31)에 상응하는 10개 아미노산 펩티드를 합성하는데, 이는 엘리스폿 검정에 의해 항-클라미디아 CTL 주로부터 강력한 면역 반응을 발생시키는 것으로 밝혀졌다. 유의적으로, 가장 최근의 GenBank 데이타베이스 조사 결과, 이러한 유전자에 대한 단백질이 선행 분야에서는 결코 보고된 바가 없는 것으로 나타났다. 따라서, 클론 2C7-8을 암호화하는 추정상의 개방 판독 프레임(서열15)은 MHC-1 제한된 방식으로 항원 특이적 CD8+ T 세포를 자극할 수 있는 클라미디아로부터의 항원을 포괄하는 유전자를 규정하는데, 이는 상기 항원이 클라미디아에 대한 백신을 개발하는데 사용될 수 있다는 것을 입증해준다.
이들 연구 결과를 확인하고 상기 에피토프를 추가로 지도화하기 위해, 절두된 펩티드(서열 138-156)를 만들고, 이를 대상으로 하여, IFN-g ELISPOT 검정에서 T 세포에 의한 인식을 시험하였다. Ser139(Cap1 #140-147, 서열 146) 또는 Leu47(Cap1 #138-146, 서열 147)의 절두는 T-세포 인식을 못하게 한다. 이들 결과는 9량체 펩티드 Cap1 #139-147(SFIGGITYL, 서열 145)이 클라미디아-특이적 T 세포에 의해 인식된 최소한의 에피토프라는 것을 지시해준다.
씨. 트라코마티스의 선별된 혈청형로부터의 Cap1(CT529)의 서열 정렬(서열 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137 및 139)은 아미노산 차이 중의 하나가 제안된 에피토프의 위치 2에서 발견된다는 것을 보여준다. 상동성 혈청형 D 펩티드는 SIIGGITYL(서열 168)이다. 클라미디아-특이적 T 세포에 의해 인식하도록 세포를 표적시키는 SFIGGITYL 및 SIIGGITYL의 능력을 비교하였다. 각 펩티드의 일련의 희석물을 P815 세포와 함께 항온배양하고, 상기 언급된 바와 같이51Cr 방출 검정에서 T 세포에 의한 인식에 대해 시험하였다. 이러한 클라미디아-특이적 T 세포는 1nM의 최소 농도에서 혈청형 L2 펩티드와 10nM의 최소 농도에서 혈청형 D 펩티드를 인식한다.
추가의 연구 결과, Cap1 #139-147-특이적 T 세포 클론이 씨. 트라코마티스감염된 세포를 인식하는 것으로 밝혀졌다. Cap1139-147이 클라미디아 감염된 세포의 표면 상에 존재한다는 것을 확인하기 위해, Balb-3T3(H-2d) 세포를 씨. 트라코마티스 혈청형 12로 감염시키고, 이들 세포가 Cap1 #139-147 에피토프(서열 145)에 특이적인 CD8+ T 세포 클론에 의해 인식되는지를 결정하기 위해 상기 세포를 시험한다. 69 T 세포주를 제한 희석시킴으로써, Cap1 #139-147 에피토프에 특이적인 T 세포 클론을 수득한다. 이러한 T 세포 클론은 클라미디아 감염된 세포를 특이적으로 인식하였다. 이들 실험에서는, 표적 세포는 씨. 트라코마티스 감염된(양성 대조군) 또는 감염되지 않은 Balb/3T3 세포(이는 각각 30:1, 10:1 및 3:1 효과인자 대 표적 비에서 45%, 36% 및 30%의 특이적 용해율을 나타낸다); 또는 피복된 Cap1 #139-147 에피토프(서열 145) 또는 처리되지 않은 P815 세포(이는 각각 30:1, 10:1 및 3:1 효과인자 대 표적 비에서 83%, 75% 및 58%의 특이적 용해율을 나타내고; 모든 경우에 있어서 용해율이 5% 미만인 음성 대조군이다)이다. 이러한 데이터는 상기 에피토프가 감염 동안 존재한다는 것을 제시해준다.
생체내 연구는 Cap1 #139-147 에피토프 특이적 T 세포가 씨. 트라코마티스로 쥐를 감염시키는 동안 프라이밍(priming)된다는 것을 나타낸다. 씨. 트라코마티스로의 감염이 Cap1 #139-147 에피토프 특이적 T 세포 반응을 프라이밍하는지를 결정하기 위해, 마우스를 씨. 트라코마티스 혈청형 12 108IFU로 복강내 감염시킨다. 감염시킨지 2주 후에, 상기 마우스를 희생시키고, Cap1 #139-147 에피토프 펩티드로 펄싱된 방사선 조사된 유전적동계의 비장 세포 상에서 비장 세포를 자극시킨다.자극시킨지 5일 후, 상기 배양물을51Cr 방출 검정에 사용하여, 이러한 배양물 내에 Cap1 #139-147 에피토프-특이적 T 세포가 존재하는지를 결정한다. 구체적으로 언급하면, 씨. 트라코마티스 혈청형 L2 면역된 마우스, 또는 Cap1 #139-147 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있는 CD8+ T 세포 및 Cap1 #139-147 펩티드 피복된 유전적동계의 비장 세포와 함께 5일 동안 배양한 후에 PBS를 주사한 대조군 마우스로부터의 비장 세포는 각각 30:1, 10:1 및 3:1 효과인자 대 표적 비에서 73%, 60% 및 32%의 특이적 용해율을 제공해준다. 상기 대조군 마우스는 30:1 효과인자 대 표적 비에서 대략 10%의 특이적 용해율을 나타내는데, 이는 E:T 비를 낮게 함에 따라 지속적으로 저하된다. 표적 세포는 Cap1 #139-147 펩티드-피복된 또는 처리되지 않은 P815 세포이다. 이들 데이터는 Cap1 #139-147 펩티드-특이적 T 세포가, 씨. 트라코마티스로 쥐를 감염시키는 동안 프라이밍된다는 것을 제시해준다.
Ct529 국재화
Ct529(본원에서 Cap-1로 지칭됨)가 씨. 트라코마티스 감염된 세포의 봉입(inclusion) 막에 국재하고, 이것이 기본체 또는 망상체와 연합된다는 것을 입증해주는 연구를 수행하였다. 앞서 기재된 바와 같이, Cap-1은 CD8+ CTL을 자극하는 클라미디아로부터의 생성물로서 동정되었다. 이들 CTL은 쥐의 감염 모델에서 보호적이므로, Cap-1을 우수한 백신 후보로 만든다. 추가로, 이들 CTL은 MHC-1 제한되기 때문에, Cap-1 유전자는 감염된 세포의 시토졸에 접근해야만 하는데, 이는특이적 클라미디아 유전자 생성물의 독특한 특징일 수 있다. 따라서, 상기 유전자 생성물의 세포성 국재를 결정하는 것이, Cap-1을 백신 후보로서 특징화하는데 유용할 것이다. Cap-1의 세포내 국재를 탐지하기 위해, Cap-1의 N-말단 125개 아미노산을 포괄하는 재조합 폴리펩티드(서열 305; 이는 서열 304에 제시된 N-말단 6-His 태그를 포함한 아미노산 서열을 갖는다)에 대해 유도된 토끼 폴리클로날 항체를 사용하여, 클라미디아로 감염된 McCoy 세포를 염색하였다.
Cap-1의 N-말단부를 포괄하는 재조합 폴리펩티드, 즉 rCt529c1-125(서열 305)로 토끼를 과면역시킴으로써, 토끼-항-Cap-1 폴리클로날 항체를 수득한다. Cap-1의 N-말단 1-125 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 1-375를 암호화하는 pET 발현 플라스미드(상기 언급된 바와 같음)로 형질전환시킨 이. 콜라이로부터 재조합 rCt529e1-125 단백질을 수득한다. 재조합 단백질을 당해 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 Ni-NTA에 의해 정제한다. 양성 대조군 항혈청의 경우에는, 정제된 씨. 트라코마티스 기본체로 토끼를 면역시킴으로써, 기본체에 대해 유도된 폴리클로날 항혈청을 만든다(Biodesign, Sacco, Maine). Cap-1 폴리펩티드로 면역시키기에 앞서, 토끼로부터 유래된 예비-면역 혈청을 음성 대조군으로서 사용한다.
씨. 트라코마티스 혈청형 L2 또는 씨. 프시타시(C. psitacci) 균주 6BC를 106IFU(봉입체 형성 단위)/ml의 농도로 접종시킨 유리 커버슬립 상에서 성장시킨 McCoy 세포 단층 상에서 면역세포화학을 수행한다. 2시간 후, 배지를 탈기시키고, 사이클로헥스이미드(1.0㎍/ml)가 보충된 신선한 RP-10 배지로 대체시킨다. 감염된세포를 7% CO2에서 24시간 동안 항온배양하고, 이 배지를 탈기시키고 세포를 PBS로 세척한 다음 5분 동안 메탄올 고정시킴으로써 고정시킨다. 항원 염색을 위해, 고정된 세포 단층을 PBS로 세척하고, 37℃에서 2시간 동안 특이적 또는 대조군 항혈청의 1:100 희석물과 함께 항온배양한다. 세포를 PBS로 세척하고, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 항-토끼 IgG(KPL, Gaithersburg)와 함께 1시간 동안 항온배양한 다음, PBS 중의 에반스 블루(Evans blue)(0.05%)로 염색한다. 100X 대물렌즈(Zeiss epifluorescence microscope)로 형광성을 관찰하고, 사진을 찍는다(Nikon UFX-11A 카메라).
상기 연구로부터의 결과는, Cap-1가 씨. 트라코마티스 감염된 세포의 봉입 막에 국재한다는 것을 나타낸다. Cap-1 특이적 항체는 씨. 트라코마티스 감염된 세포의 봉입 막을 표지시켰지만, 이들 봉입체 내에 함유되거나 고정 과정에 의해 방출된 클라미디아 기본체는 표지시키지 못하였다. 역으로 말하면, 항-기본체 항체는 상기 봉입체 내에 있는 세균성 기본체 뿐만 아니라 고정 과정에 의해 방출된 세균성 기본체를 명백히 표지시켰다. 항-Cap-1 항체의 특이성은, 이것이 씨. 프시타시 감염된 세포를 염색시키지 못한다는 사실에 의해 입증된다. Cap-1 표지화의 특이성은 또한, 예비-면역 혈청에서의 반응성 부재로써 입증된다. 이들 결과는, Cap-1이 상기 세균으로부터 방출되고 클라미디아성 봉입 막과 연합된다는 것을 제시해준다. 따라서, Cap-1은 클라미디아에 의해 야기된 감염에 대한 백신 개발에 있어서 CD8+ T 세포를 자극하는데 유용할 수 있는 유전자 생성물이다.
클라미디아 감염에 대한 백신에 있어서 잠재적 CTL 항원으로서의 상기 Cap-1 유전자의 관련성은 다음의 부차적인 2가지 연구 시리즈로써 추가로 예시된다. 첫째, 씨. 트라코마티스의 Cap-1 CT529 #138-147 펩티드(서열 144)의 MHC-I 에피토프에 특이적인 CTL이 천연 감염 동안에 높은 빈도로 프라이밍된다는 사실이 밝혀졌다. 구체적으로 언급하면, Balb/C 마우스를 씨. 트라코마티스 혈청형 L2 106IFU와 함께 항온배양한다. 2주 후, 비장을 수거하고, Cap-1 #138-147 펩티드-펄싱된 항원 제시 세포에 반응하는 IFN-γ 분비성 세포의 수를 엘리스폿 분석으로 정량화한다. 두 실험에서는, 105비장 세포 중의 IFN-γ 분비성 세포의 수가 모든 CD8+ T 세포의 대략 1%이다. 이와 같이 MHC-1 에피토프(Cap-1 CT529 #138-147 펩티드)에 대해 CD8+ CTL이 반응하는 빈도가 높다는 것은, Cap-1이 감염에 있어서 고도로 면역원성이라는 것을 제시해준다.
두번째 시리즈로부터의 연구 결과, Cap-1 단백질이 감염시 숙주 세포의 시토졸에 대해 거의 즉시 접근 가능하다는 사실이 밝혀졌다. 이는 시간에 따른 Cap-1 CT529 #138-147 펩티드 제시화 과정으로 나타난다. 간략하게 언급하면, 3T3 세포를 다양한 기간 동안 씨. 트라코마티스 혈청형 L2로 감염시킨 다음, Cap-1 CT529 #138-147 펩티드 특이적 CTL에 의한 인식에 대해 시험한다. 이 결과는 씨. 트라코마티스 감염된 3T3 세포가, 감염시킨지 단지 2시간 후에 항원 특이적 CTL에 의한 인식에 대해 표적화되었다는 것을 보여준다. 이들 결과는 Cap-1이 망상체에 대한 씨. 트라코마티스 기본체의 개발에서 합성된 초기 단백질이라는 것을 보여준다.감염 초기에 발현된 유전자 생성물에 대해 유도된 CD8+ CTL 면역 반응은 클라미디아 감염에 대한 백신에 특히 효능이 있을 수 있다.
실시예 5
클라미디아 항원으로 면역시킨 마우스에서의 T 세포 반응 및 항체 발생
면역원성 연구를 수행하여, 몬타니드(Montanide) 애쥬반트로 제형화된 정제된 SWIB 또는 S13 단백질로 면역시킨 마우스에서의 상기 항체 및 CD8+ T 세포 반응, 또는 SWIB 또는 S13에 대한 DNA 서열을 함유하는 pcDNA-3 발현 벡터로의 DNA-이용 면역화를 결정한다. SWIB는 또한, 클론 1-B1-66(서열 1; 이는 서열 5에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다)으로서 지칭되고, S13 리보솜성 단백질은 클론 10-C10-31(서열 4; 이는 서열 12에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다)로서 지칭되기도 한다. 제1 실험에서는, 3가지 C57BL/6 마우스 그룹을 2회 면역시키고 항체 및 CD4+ T 세포 반응에 대해 모니터한다. DNA 면역화는 꼬리 기저부에서 피내적으로 수행되고 폴리펩티드 면역화는 피하 경로로써 투여된다. 면역시킨 마우스로부터의 비장 세포를 표준3H-혼입 검정한 결과, 정제된 재조합 SWIB 폴리펩티드(서열 5)로 면역시킨 그룹으로부터 강력한 증식 반응이 나타났다. 앞서 기재된 바와 같이, 사이토킨 유도 검정에 의해 추가로 분석한 결과, SWIB 폴리펩티드로 면역시킨 그룹이 측정 가능한 수준의 IFN-γ및 IL-4 반응을 유발시킨 것으로 나타났다. 상기 SWIB 폴리펩티드로 면역시킨 실험 그룹에서 우위적 항체 이소형 반응을결정하기 위한 후속 ELISA-이용 검정을 수행하였다. 도 4는 SWIB-면역된 그룹이 우위적으로 IgG1인 체액성 반응을 획득하였다는 것을 도시해준다.
제2 실험에서는, 3주 간격으로 PBS 또는 몬타니드에서 제형화시킨 10㎍의 정제된 SWIB 단백질(또한, 클론 1-B1-66으로서 지칭됨, 서열 5)로 3회 면역시키고, 세 번째 면역시킨지 2주 후에 수거한다. 당해 분야에 널리 공지된 표준 ELISA-이용 기술에 의해, SWIB 단백질에 대해 유도된 항체 역가를 측정하는데, 이는 몬타니드 애쥬반트로 제형화된 SWIB 단백질이 강력한 체액성 면역 반응을 유발시켰다는 것을 입증시켜 준다. XTT-이용 검정에 의해 T 세포 증식 반응을 결정하였다[참조: Scudiero et al., Cancer Research, 1988, 48:4827]. 도 5에 도시된 바와 같이, SWIB 폴리펩티드 플러스 몬타니드로 면역시킨 마우스로부터의 비장 세포가 항원 특이적 증식 반응을 유발시켰다. 또한, 앞서 기재된 사이토킨 유도 검정을 사용하여, 가용성 재조합 SWIB 폴리펩티드에 반응하여 IFN-γ를 분비시키는 면역시킨 동물로부터의 비장 세포의 능력을 결정한다. 몬타니드 애쥬반트로 제형화된 SWIB 폴리펩티드로 면역시킨 그룹 내의 모든 동물로부터의 비장 세포는, SWIB 클라미디아 항원에 대한 노출에 반응하여 IFN-γ를 분비시켰는데, 이는 클라미디아-특이적 면역 반응을 입증해준다.
추가의 실험에서는, C3H 마우스를, SBAS2 애쥬반트(SmithKline Beecham, London, England)로 제형화된 10㎍의 정제된 SWIB 또는 S13 단백질(씨. 트라코마티스, SWIB 단백질, 클론 1-B1-66, 서열 5, 및 S13 단백질, 클론 10-C10-31, TJDUF 4)로 꼬리 기저부에서 3가지 별도의 시점 하에 면역시킨다. 항원-특이적 항체 역가를 ELISA로써 측정하였는데, 이는 양쪽 폴리펩티드가 강력한 IgG 반응을 유도하였으며, 이들 역가 범위가 1 x 10-4또는 1 x 10-5이라는 것을 나타낸다. 이러한 반응의 IgG1 및 IgGa2 성분은 상당히 등량으로 존재한다. 면역시킨 마우스로부터 분리된 비장 세포 상에서의 표준3H-혼입 검정에 의해 결정된, 항원-특이적 T 세포 증식 반응은 SWIB에 대해 상당히 강력하고(음성 대조군 보다 50,000cpm 이상), s13에 대해서 훨씬 더 강력하다(음성 대조군 보다 100,000cpm 이상). 증식성 배양물로보터의 상등액으로부터 표준 ELISA 기술에 의해, IFN-γ생성을 검정한다. 상기 배양물을 S13 단백질로 시험관내 재자극하면, 높은 수준의 IFN-γ가 생성되었는데, 이는 음성 대조군에 대해 대략 25ng/ml 대 2ng/ml이다. SWIB 단백질로 재자극시키면, 보다 덜한 정도이긴 하지만 IFN-γ가 역시 유도되었다.
관련 양태에서는, C3H 마우스를, 10㎍의 콜레라 독소와 혼합된 10㎍의 정제된 SWIB 또는 S13 단백질(씨. 트라코마티스, SWIB 단백질, 클론 1-B1-66, 서열 5, 및 S13 단백질, 클론 10-C10-31, 서열 4)로 3가지 별도의 시점 하에 면역시킨다. 점액성 면역화는 비내 접종을 통해서이다. 항원-특이적 항체 반응을 표준 ELISA 기술로써 결정한다. 항원-특이적 IgG 항체는 SWIB-면역시킨 마우스의 혈액에 존재하며, 이의 역가는 1 x 10-3내지 1 x 10-4의 범위이지만, S13-면역시킨 동물에서는 탐지 가능하지 않다. IFNγ생성으로써 측정된 바와 같이, 분리된 비장 세포로부터의 항원-특이적 T 세포 반응은 전신 면역에 대해 바로 앞서 기재된 것과 유사한 결과를 제공해준다.
H2-Kd 제한된 CTL 에피토프로서 동정된, CT529 10량체 컨센서스 펩티드(CSFIGGITYL-서열 31)로써 규정된 CT529 혈청형 LGVII CTL 에피토프의 면역원성을 결정하기 위해 동물 연구를 수행하였다. BALB/c 마우스(그룹 당 3마리 마우스)를 각종 애쥬반트와 조합된 펩티드 25㎍으로 3회 면역시킨다. 상기 펩티드를, SKB 애쥬반트 시스템 SBAS-2", SBAS-7(SmithKline Beecham, London, England) 또는 몬타니드에서 꼬리 기저부에 전신 투여한다. 상기 펩티드를 10㎍의 콜레라 독소(CT)와 혼합하여 비내 경로로 투여한다. 실험 받은 적이 없는 마우스를 대조군으로서 사용한다. 세번째 면역시킨지 4주 후에, 비장 세포를 다음의 3가지 상이한 효과인자 대 LPS-아세포 비에서 10㎍/ml CT529 10량체 컨센서스 펩티드로 펄싱된 LPS-아세포로 재자극시킨다: 1 x 106세포/ml에서 6, 1.5 및 0.4. 2회 재자극 후, 효과인자 세포를 대상으로 하여, 표준 크롬 방출 검정을 사용하여 펩티드 펄싱된 P815 세포를 용해시키는 이들의 능력을 시험하였다. 계란 오브알부민으로부터의 비-관련성 펩티드를 음성 대조군으로서 사용하였다. 이 결과는, 상기 CT529 10량체 컨센서스 펩티드에 대해 상당한 면역 반응이 유발되었으며, 펩티드 펄싱된 표적을 용해시킬 수 있는 항원-특이적 T 세포가 상기 펩티드로의 면역화에 반응하여 유발되었다는 것을 입증해준다. 구체적으로 언급하면, 항원-특이적 용해 활성은 SBAS-7 및 CT 애쥬반트화 그룹에서 발견된 반면, 몬타니드 및 SBAS-2"는 CTL 에피토프 면역화를 애쥬반트하지 못하였다.
실시예 6
클라미디아 뉴모니애 유전자의 발현 및 성상 확인
실시예 1에 기재된 사람 T 세포주 TCL-8은 클라미디아 트라코마티스 뿐만 아니라 클라미디아 뉴모니애 감염된 단구-유도된 수지상 세포를 인식하는데, 이는 클라미디아 트라코마티스 및 뉴모니애가 교차 반응성 T 세포 에피토프를 암호화할 수 있다는 것을 제시해준다. 클라미디아 트라코마티스 LGV II 클론 1-B1-66[이는 또한, SWIB(서열 1)로서 지칭됨] 및 클론 10-C10-31[이는 또한, S13 리보솜성 단백질(서열 4)로서 지칭됨]과 상동성인 클라미디아 뉴모니애 유전자를 분리하기 위해, HeLa 229 세포를 씨. 뉴모니애 균주 TWAR(CDC/CWL-029)로 감염시킨다. 3일간 항온배양한 후, 씨. 뉴모니애-감염된 HeLa 세포를 수거하고, 세척한 다음, 200㎕ 물에 재현탁시키며, 비등 수욕에서 20분 동안 가열한다. 파쇄된 세포 현탁액 10마이크로리터를 PCR 주형으로서 사용한다.
5' 말단이 삽입된 NdeI 부위와 6X-히스티딘 태그를 갖고 3' 말단이 포함된 BamHI 부위와 정지 코돈을 갖도록, 클론 1B1-66 및 10C10-31에 대한 씨. 뉴모니애 특이적 프라이머를 고안한다(도 6). 이러한 PCR 생성물을 당해 분야에 널리 공지된 표준 기술에 의해 증폭 및 서열 분석한다. 씨. 뉴모니애 특이적 PCR 생성물을 발현 벡터 pET17B(Novagen, Madison, WI) 내로 클로닝하고, 이를 발현 및 Novagen에 의해 제공된 히스티딘-니켈 크로마토그래피 방법을 활용하는 후속 정제를 위해 이. 콜라이 BL21 pLysS 내로 형질감염시킨다. 이로써, 씨. 뉴모니애로부터 2개의 단백질이 생성되는데, 이는 CpSWIB(6X His 태그를 갖는 서열 27 및 서열 78; 이는각각 서열 28에 제공된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다)로서 지칭된 10-11 kDa 단백질, 및 CpS13(6X His 태그를 갖는 서열 29 및 서열 77; 이는 각각 서열 30 및 91에 제공된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다)로서 지칭된 15 kDa 단백질이다.
실시예 7
클라미디아 뉴모니애 항원에 의한 인터페론-γ 생성 및 T 세포 증식 유도
T 세포 증식과 인터페론-γ생성을 유도시키는 재조합 클라미디아 뉴모니애 항원의 능력을 다음과 같이 결정한다.
단백질을 IPTG에 의해 유도시키고 Ni-NTA 아가로즈 친화 크로마토그래피로 정제한다[참조: Webb et al., J. Immunology 157:5034-5041, 1996]. 이어서, 이와 같이 정제된 폴리펩티드를 대상으로 하여, PBMC 제제에서 T 세포 증식을 유도하는 능력에 대해 스크리닝한다. T 세포가 클라미디아 항원에 반응하여 증식하는 것으로 공지된 정상 공여자로부터의 PBMC 뿐만 아니라 씨. 뉴모니애 환자로부터의 PBMC를, 10% 풀링된 사람 혈청 및 50㎍/ml 젠타마이신으로 보충된 RPMI 1640을 포함하는 배지에서 배양한다. 정제된 폴리펩티드를 0.5 내지 10㎍/ml의 농도로 이중으로 가한다. 200㎕의 용적으로 96웰 환저 판 내에서 6일 동안 배양한 후, 배지 50㎕을 각 웰로부터 꺼내어, 이를 대상으로 하여 다음에 기재된 바와 같이 IFN-γ수준을 결정한다. 이어서, 상기 판을 추가로 18시간 동안 3중 수소화 티미딘 1μCi/웰로 펄싱하고, 수거한 다음, 기체 신틸레이션 계수기를 이용하여 3중수소 흡수를 결정한다. 배지 단독에서 배양된 세포에서 관찰된 증식 보다 양쪽 복제물에서 3배 이상 높은 증식을 가져다 주는 분획이 양성으로 간주된다.
효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA)을 사용하여 IFN-γ을 측정한다. ELISA 판을 실온에서 4시간 동안 PBS 중의 사람 IFN-γ(PharMingen, San Diego, CA)에 대해 유도된 마우스 모노클로날 항체로 피복시킨다. 이어서, 실온에서 1시간 동안 5%(W/V) 비-지방 분유를 함유하는 PBS로 웰을 차단시킨다. 상기 판을 PBS/0.2% TWEEN-20에서 6회 세척하고, 상기 ELISA 판에서 배양 배지 중에서 1:2로 희석된 샘플을 실온에서 밤새 항온배양한다. 상기 판을 다시 세척하고, PBS/10% 정상 염소 혈청 중에서 1:3000으로 희석된 폴리클로날 토끼 항-사람 IFN-γ혈청을 각 웰에 가한다. 이어서, 상기 판을 실온에서 2시간 동안 항온배양하고, 세척하며, 서양고추냉이 퍼옥시다제-커플링된 항-토끼 IgG(Sigma Chemical So., St. Louis, MO)을 PBS/5% 비-지방 분유 중의 1:2000 희석도로 가한다. 실온에서 2시간 더 항온배양한 후, 상기 판을 세척하고, TMB 기질을 가한다. 1N 황산을 이용하여 20분 후에 상기 반응을 중지시킨다. 기준 파장으로서 570nm을 사용하여 450nm에서 광밀도를 결정한다. 배지 단독에서 배양된 세포로부터의 평균 OD 보다 양쪽 복제물에서 2배 이상 높은 OD + 3 표준 편차를 가져다 주는 분획이 양성으로 간주된다.
씨. 트라코마티스 및 씨. 뉴모니애와 교차 반응할 수 있는 사람 항-클라미디아 T 세포주(TCL-8)를 사용하여, 상기 실시예에 언급된 발현된 단백질[즉, CpSWIB; 6X His 태그를 갖는 서열 27 및 서열 78(이는 각각 서열 28에 제공된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다), 및 CpS13로서 지칭된 15 kDa 단백질; 6X His 태그를 갖는 서열 29 및 서열 77(이는 각각 서열 30 및 91에 제공된 상응하는 아미노산 서열을갖는다)]이 씨. 트라코마티스 및 씨. 뉴모니애 모두에 공통적인 T 세포 에피토프를 보유하였는지를 결정하였다. 간략하게 언급하면, 이. 콜라이 발현성 클라미디아성 단백질을 1 x 104단구 유도된 수지상 세포 상에서 역가 측정한다. 2시간 후, 상기 수지상 세포 배양물을 세척하고, 2.5 x 104T 세포(TCL-8)를 가한 다음, 72시간 더 항온배양한다. 이어서, 배양 상등액 중의 IFN-γ의 양을 ELISA로써 결정한다. 도 7A 및 7B에 도시된 바와 같이, TCL-8 T 세포주는, IFN-γ의 항원 특이적 유도에 의해 입증된 바와 같이 씨. 트라코마티스 및 씨. 뉴모니애 모두로부터의 S13 리보솜성 단백질을 특이적으로 인식하는 반면, 씨. 트라코마티스로부터의 SWIB 단백질 만이 상기 T 세포주에 의해 인식되었다. 이들 결과를 확증하기 위해, 일련의 중복 펩티드 및 T 세포주 TCL-8로 펄싱된 표적 세포를 사용하여 에피토프 지도화함으로써, 씨. 트라코마티스 SWIB의 T 세포 에피토프를 동정하였다. 3H-티미딘 혼입 검정은 C.t.SWIB 52-67로서 지칭된, 서열 39의 펩티드가 TCL-8 주를 가장 강력히 증식시킨다는 사실을 입증시켜 주었다. 씨. 뉴모니애 서열의 SWIB에 상응하는 상동성 펩티드(서열 40), 씨. 뉴모니애(서열 43) 및 씨. 트라코마티스(서열 42)의 토포이소머라제-SWIB 융합물 뿐만 아니라 사람 SWI 도메인(서열 41)을 합성하고, 상기 검정으로 시험한다. T 세포주 TCL-8은 서열 39의 씨. 트라코마티스 펩티드 만을 인식하였으며, 상응하는 씨. 뉴모니애 펩티드(서열 40) 또는 상기 언급된 기타 상응하는 펩티드(서열 41-43)는 인식하지 못하였다.
공여자 PBMC를 각각 씨. 트라코마티스 또는 씨. 뉴모니애 감염된 단구-유도된 수지상 세포로 자극함으로써 씨. 뉴모니애에 대한 양성 혈청 역가를 갖는 공여자 CP-21로부터, 클라미디아-특이적 T 세포주를 생성시킨다. 씨. 뉴모니애에 대해 생성된 T 세포는 재조합 씨. 뉴모니애-SWIB에 대해 반응하였지만, 씨. 트라코마티스-SWIB에 대해서는 반응하지 못한 반면, 씨. 트라코마티스에 대해 생성된 T 세포는 씨. 트라코마티스 또는 씨. 뉴모니애-SWIB에 대해 반응하지 못하였다(도 9 참조). 공여자 CP-21의 씨. 뉴모니애-SWIB 특이적 면역 반응은 씨. 뉴모니애 감염을 확인시켜 주고, 이는 생체내 씨. 뉴모니애 감염 동안 씨. 뉴모니애-SWIB 특이적 T 세포의 유도를 지시해준다.
씨. 뉴모니애-SWIB에 대한 T 세포 반응을 에피토프 지도화한 결과, Cp-SWIB 특이적 T 세포가 중복 펩티드 Cp-SWIB 32-51(서열 101) 및 Cp-SWIB 37-56(서열 102)에 대해 반응하는 것으로 나타났는데, 이는 씨. 뉴모니애-SWIB 특이적 T 세포 에피토프 Cp-SWIB 37-51(서열 100)을 지시해준다.
PBMC를 씨. 트라코마티스 및 씨. 뉴모니애 각각으로부터의 비-감염성 기본체로 자극함으로써, 씨. 뉴모니애 혈청 양성 공여자이기도 한 공여자 CP1로부터 T 세포주를 생성시킨다. 특히, 씨. 트라코마티스 및 씨. 뉴모니애로부터 유래된 비-감염성 기본체 및 1 x 104단구-유도된 수지상 세포, 또는 재조합 씨. 트라코마티스 또는 씨. 뉴모니애-SWIB 단백질의 존재 하에 2.5 x 104개 T 세포를 자극함으로써, 증식 반응을 결정하였다. SWIB에 대한 T 세포 반응은, 씨. 트라코마티스-SWIB가 아니라 씨. 뉴모니애-SWIB가 씨. 뉴모니애 T 세포주에 의한 반응을 유발시켰다는점에서, CP-21로부터의 T 세포주로 수득된 데이터와 공통점이 있다. 또한, 씨. 트라코마티스 T 세포주는 씨. 트라코마티스 또는 씨. 뉴모니애 SWIB에 반응하여 증식하지는 못하였지만, 이는 CT와 CP 기본체 모두에 반응하여 증식하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, TCP-21 세포주를 사용하여 동정된 클론 11-C12-91(서열 63)은 269bp 삽입물을 갖고, 이는 OMP2 유전자(CT443)의 일부이고 OMCB로서 지칭된 씨. 뉴모니애의 60kDa 시스테인 풍부 외막과의 상동성을 나타낸다. 반응성 에피토프(들)를 추가로 규정하기 위해, 앞서 기재된 면역검정과 일련의 중복 펩티드를 사용하여, 에피토프 지도화를 수행한다. 간략하게 언급하면, 2.5 x 104개 TCP-21 T 세포를 1 x 104개 단구 유도된 수지상 세포의 존재 하에, 씨. 트라코마티스 및 씨. 뉴모니애로부터 유도된 비-감염성 기본체, 또는 씨. 트라코마티스 또는 씨. 뉴모니애 OMCB 단백질의 단백질 서열로부터 유래된 펩티드(0.1㎍/ml)로 자극함으로써, 증식 반응을 결정한다. TCP-21 T 세포는 에피토프 CT-OMCB #167-186, CT-OMCB #171-190 및 CT-OMCB #171-186에 반응하였으며, 보다 덜한 정도로는, CT-OMCB #175-186(각각 서열 249-252)에 반응하였다. 현저하게, TCP-21 T 세포주는 또한, 상동성 씨. 뉴모니애 펩티드 CP-OMCB #171-186(서열 253)에 대한 증식 반응을 제공해주었는데, 이는 씨. 트라코마티스 펩티드에 대한 반응 이상이다. 위치 2에서의 아미노산 치환(Glu를 Asp로 치환함) 및 위치 4에서의 아미노산 치환(즉, Ser를 Cys로 치환함)은 T 세포의 증식 반응을 변화시키지 못하므로, 이는 상기 에피토프가 씨. 트라코마티스와 씨.뉴모니애 간의 교차 반응성 에피토프이라는 것을 입증해준다.
실시예 8
클라미디아 항원에 대한 사람 PBMC 및 T 세포주의 면역 반응
본원에 제공된 실시예는, 씨. 트라코마티스에 감염된 일반적인 집단 중에, 씨. 트라코마티스 감염을 제어하는 보호 면역 반응이 발생된 건강한 공여자 집단이 존재한다는 것을 제시해준다. 이들 공여자는 임상적 자각 증상이 없으며, 씨. 트라코마티스에 대해 혈청 음성이다. CD4 발현 클로닝에 의해 동정된 클라미디아 항원에 대한 정상적인 공여자의 면역 반응의 성상을 확인하기 위해, 12명의 건강한 공여자로부터 수득된 PBMC를 대상으로 하여, 씨. 트라코마티스-, 씨. 뉴모니애-SWIB 및 씨. 트라코마티스-, 씨. 뉴모니애-S13을 포함한 재조합 클라미디아 항원 패널에 대해 시험하였다. 이 데이터가 다음 표 1에 요약되어 있다. 모든 공여자는 씨. 트라코마티스에 대해 혈청 음성인 반면, 6/12가 양성의 씨. 뉴모니애 역가를 갖는다. 양성 반응으로서 >4의 자극 지수를 사용하여, 대상자의 11/12가 씨. 트라코마티스 기본체에 반응하였고, 12/12가 씨. 뉴모니애 기본체에 반응하였다. 1명의 공여자 AD104는 재조합 씨. 뉴모니애-S13 단백질에 대해 반응하였지만, 재조합 씨. 트라코마티스-S13 단백질에 대해서는 반응하지 못하였는데, 이는 씨. 뉴모니애-특이적 반응을 지시해준다. 12명의 공여자 중의 3명이 씨. 트라코마티스-SWIB 특이적 반응을 나타냈지만, 씨. 뉴모니애-SWIB 특이적 반응은 나타내지 못하였는데, 이는 씨. 트라코마티스 감염을 확인시켜 준다. 씨. 트라코마티스 및 씨. 뉴모니애-S13은 8/12 공여자에서 반응을 유발시켰는데, 이는 클라미디아 감염을 제시해준다. 이들 데이터는 정상적인 연구 대상자의 PBMC에서 T 세포 반응을 유발시키는 SWIB 및 S13의 능력을 입증해준다.
CT=클라미디아 트라코마티스; CP=클라미디아 뉴모니애; EB=클라미디아 기본체; Swib=재조합 클라미디아 Swib 단백질; S13=재조합 클라미디아 S13 단백질; lpdA=재조합 클라미디아 lpdA 단백질; TSA=재조합 클라미디아 TSA 단백질. 값은 표준 증식 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 증식 반응은 3 x 105개 PBMC를, 각각의 재조합- 항원 또는 기본체(EB)로 예비 항온배양시킨 1 x 104개 단구-유도된 수지상 세포로 자극함으로써 결정한다. 마지막 18시간 동안3H-티미딘 펄싱한지 6일 후에 검정물을 수거한다.
SI: 자극 지수
+/-: SI~ 4
+: SI> 4
++: SI 10-30
+++: SI> 30
첫 번째 실험 시리즈에서는, T 세포를 앞서 기재된 바와 같은 씨. 트라코마티스 LGV II 기본체로 자극함으로써, 씨. 트라코마티스에 생식기가 노출된 병력이 있는 건강한 여성 개개인(CT-10)으로부터 T 세포를 생성시킨다. 이러한 연구 대상자가 씨. 트라코마티스에 노출된 적이 있긴 하지만, 상기 여성은 혈청변환되지 않았으며 임상적 증상을 나타내지 않았는데, 이는 공여자 CT-10이 씨. 트라코마티스에 대한 보호 면역 반응을 전개할 수도 있었다는 것을 제시해준다. 도 10에 도시된 바와 같이, 공여자 CT-10으로부터 유래된 1차적인 클라미디아-특이적 T 세포주는 씨. 트라코마티스-SWIB 재조합 단백질에 대해 반응하였지만, 씨. 트라코마티스-SWIB 재조합 단백질에 대해서는 반응하지 못하였는데, 이는 씨. 트라코마티스에 대한 CT-10의 노출을 확인시켜 준다. 씨. 트라코마티스-SWIB에 대한 T 세포 반응을 에피토프 지도화한 결과, 상기 공여자가 도 11에 도시된 바와 같이 T 세포주 TCL-8과 동일한 에피토프 Ct-SWIB 52-67(서열 39)에 대해 반응한 것으로 나타났다.
각종 씨. 트라코마티스 환자에 대한 추가의 T 세포주를 상기 언급된 바와 같이 생성시킨다. 각종의 씨. 트라코마티스 및 씨. 뉴모니애 기본체 및 재조합 단백질에 대한 환자의 임상 프로필과 증식 반응에 관한 내용이 다음과 같이 표 II에 요약되어 있다.
NGU=비-고노코쿠스성 요도염; BV=세균성 질증; CT=클라미디아 트라코마티스; CP=클라미디아 뉴모니애; EB=클라미디아 기본체; Swib=재조합 클라미디아 Swib 단백질; S13=재조합 클라미디아 S13 단백질; lpdA=재조합 클라미디아 lpdA 단백질; TSA=재조합 클라미디아 TSA 단백질.
값은 표준 증식 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 증식 반응은 3 x 105개 PBMC를, 각각의 재조합 항원 또는 기본체(EB)로 자극함으로써 결정한다. 마지막 18시간 동안3H-티미딘 펄싱한지 6일 후에 검정물을 수거한다.
SI: 자극 지수
+/-: SI~ 4
+: SI> 4
++: SI 10-30
+++: SI> 30
표 I 및 II에 요약된 바와 같이, 증상이 없는(상기 언급된 바와 같음) 연구 대상자와 씨. 트라코마티스 환자 패널을 사용하여, 이들 두 그룹으로부터 유도된 PBMC의 면역 반응에 관한 포괄적인 연구를 수행하였다. 간략하게 언급하면, 정상 공여자로부터의 PBMC 뿐만 아니라 씨. 뉴모니애 환자로부터의 PBMC를, 10% 풀링된 사람 혈청 및 50㎍/ml 젠타마이신으로 보충된 RPMI 1640을 포함하는 배지에서 배양한다. 정제된 폴리펩티드, 씨. 트라코마티스-, 씨. 뉴모니애-SWIB 및 S13 뿐만 아니라 씨. 트라코마티스 lpdA 및 TSA를 포함한 재조합 클라미디아 항원 패널을 0.5 내지 10㎍/ml의 농도로 이중으로 가한다. 200㎕의 용적으로 96웰 환저 판 내에서 6일 동안 배양한 후, 배지 50㎕을 각 웰로부터 꺼내어, 이를 대상으로 하여 다음에 기재된 바와 같이 IFN-γ수준을 결정한다. 이어서, 상기 판을 추가로 18시간 동안3중 수소화 티미딘 1μCi/웰로 펄싱하고, 수거한 다음, 기체 신틸레이션 계수기를 이용하여 3중수소 흡수를 결정한다. 배지 단독에서 배양된 세포에서 관찰된 증식 보다 양쪽 복제물에서 3배 이상 높은 증식을 가져다 주는 분획이 양성으로 간주된다.
재조합 클라미디아 항원에 대한 증식 반응은, 증상이 없는 공여자와 씨. 트라코마티스 환자의 대다수가 씨. 트라코마티스 S13 항원을 인식하였고(8/12), 씨. 트라코마티스 환자 대다수가 씨. 뉴모니애 S13 항원을 인식하였으며(8/12), 4/12 증상이 없는 공여자가 또한, 씨. 뉴모니애 S13 항원을 인식하였다. 또한, 씨. 트라코마티스 환자 12명 중의 6명 및 증상이 없는 공여자 12명 중의 4명이 씨. 트라코마티스의 lpdA 항원에 대한 증식 반응을 제공해주었다. 이들 결과는, 씨. 트라코마티스 및 씨. 뉴모니애 S13 항원, 씨. 트라코마티스 Swib 항원 및 씨. 트라코마티스 lpdA 항원이 증상이 없는 공여자에 의해 인식되었다는 것을 입증해주는데, 이는 이들 항원이 클라미디아에 대한 노출 동안에 인식되어, 이들에 대한 면역 반응을 유발시켰다는 것을 지시해준다. 이는 이들 항원이 사람 숙주에서 보호 면역을 부여해주는 역할을 할 수 있다는 것을 암시해준다. 또한, 씨. 트라코마티스 및 씨. 뉴모니애 S13 항원은 씨. 트라코마티스 환자들 중에서 동등한 수준으로 잘 인식되므로, S13 단백질 내에 씨. 트라코마티스와 씨. 뉴모니애 간에 공유된 에피토프가 있을 수 있다는 것을 지시해준다. 표 III에는 이들 결과가 요약되어 있다.
일련의 연구를 개시하여, 증상이 없는 공여자와 씨. 트라코마티스 환자로부터 생성된 단기 T 세포에 대한 세포성 면역 반응을 결정하였다. 실시예 7에 기재된 바와 같이 표준 증식 검정과 IFN-γ에 의해, 세포성 면역 반응을 측정하였다. 구체적으로 언급하면, 대다수의 항원은 클라미디아성 항원을 발현하는 단일 이. 콜라이 클론 형태이지만, 몇몇 재조합 단백질이 본 검정에 사용되기도 한다. 상기 단일 이. 콜라이 클론을 1 x 104개 단구 유도된 수지상 세포 상에서 역가 측정하고, 2시간 후, 상기 배양물을 세척하고, 2.5 x 104개 T 세포를 가한다. 앞서 기재된 바와 같이, 재조합 단백질을 이용한 검정을 수행한다. 마지막 18시간 동안 표준3H-티미딘 펄싱한지 4일 후에 증식을 결정한다. 상기 언급된 바와 같이 표준 ELISA 검정을 사용하여 4일 후에 수거된 배양 상등액으로부터, IFN-γ유도를 결정한다. 이 결과는 C.T.Swib를 제외한, 시험된 모든 씨. 트라코마티스 항원이 씨. 트라코마티스 환자로부터 유래된 하나 이상의 상이한 T 세포주로부터 증식 반응을 유도하였다는 것을 보여준다. 또한, 씨. 트라코마티스 환자와 증상이 없는 공여자 모두로부터, 다음 클라미디아 유전자, 즉 CT622, groEL, pmpD, CT610 및 rS13에 대한 증식 반응이 유발되었다.
12G3-83 클론은 또한, CT622 이외에 CT734 및 CT764에 대한 서열을 함유하므로, 이들 유전자 서열은 면역 반응성 에피토프를 가질 수도 있다. 유사하게, 클론 21G12-60은 CT875 이외에 가상 단백질 유전자 CT229 및 CT228에 대한 서열을 함유하고; 15H2-76은 또한, CT812 및 CT088로부터의 서열 뿐만 아니라 sycE 유전자와의 상동성을 나타낸다. 클론 11H3-61은 또한, PGP6-D 독성 단백질과의 상동성을 나타내는 서열을 함유한다.
실시예 9
클라미디아 항원을 사용한 보호 연구
1. SWIB
클라미디아 항원으로의 면역화가 클라미디아 접종으로부터 비롯된 생식기 질병에 영향을 미칠 수 있는지를 결정하기 위해, 마우스에서 보호 연구를 수행하였다. 2가지 모델, 즉 클라미디아 프시타시 균주(MTW447)를 함유하는 사람 분리물을 이용하는 질내 접종 모델, 및 클라미디아 트라코마티스 혈청형 F(균주 NI1)로서 동정된 사람 분리물을 포함하는 자궁내 접종 모델을 활용하였다. 양쪽 균주는 상부 생식기에 염증을 유도시키는데, 이는 여성에게서 클라미디아 트라코마티스에 의해 유발된 자궁내막염 및 난관염과 공통점이 있다. 제1 실험에서는, C3H 마우스(그룹당 4마리 마우스)를 씨. 트라코마티스 SWIB DNA(서열 1; 이는 서열 5에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다)을 함유하는 100㎍의 pcDNA-3 발현 벡터로 3회 면역시킨다. 전신 면역을 위한 접종은 꼬리 기저부에서 이루어진다. 마지막 면역시킨지 2주 후, 동물을 프로게스테론 처리하고, 질을 통하거나 자궁 내에 접종물을 주사함으로써 감염시킨다. 감염시킨지 2주 후, 상기 마우스를 희생시키고, 생식기를 절개하며, 염색한 다음, 조직 병리학에 대해 검사한다. 염증 수준에 대해 스코어를 매긴다(+ 극히 순함에서부터 +++++ 매우 심각함 까지). 각각의 단일 난관/난소에 기인한 스코어를 합하고, 이를 상기 그룹에 대한 염증 평균 스코어를 획득하기 위해 검사된 기관 수로 나눈다. 자궁 접종 모델에서는, 공(empty) 벡터가 공급된 음성 대조군-면역된 동물은 난소/난관 평균 염증 스코어 6.12와 일치되는 염증을 나타내었는데, 이는 DNA-면역된 그룹에 대한 스코어 2.62와는 대조적이다. 질 접종 및 상승 감염(ascending infection) 모델에서는, 음성 대조군-면역된 마우스가 8.37의 난소/난관 평균 염증 스코어를 나타내었으며, DNA-면역된 그룹에 대한 스코어는 5.00이다. 또한, 후자 모델에서는, 백신 접종된 마우스가 난관 폐쇄증 징후를 전혀 나타내지 않은 반면, 음성 대조군 백신 접종된 그룹은 난관 루멘에서 염증성 세포를 갖는다.
제2 실험에서는, C3H 마우스(그룹당 4마리 마우스)를, 폴리 락티드 코-글리콜리드 미세구(PLG) 내에 피포된(encapsulated) 씨. 트라코마티스 SWIB DNA(서열 1; 이는 서열 5에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다)을 함유하는 50㎍의 pcDNA-3 발현 벡터로 3회 면역시킨다. 면역은 복강내 경로로 이루어진다. 마지막 면역시킨지 2주 후, 동물을 프로게스테론 처리하고, 씨. 프시타시를 질에 접종함으로써 감염시킨다. 감염시킨지 2주 후, 상기 마우스를 희생시키고, 생식기를 절개하며, 염색한 다음, 조직 병리학에 대해 검사한다. 염증 수준은 앞서 기재된 바와 같이 스코어를 매긴다. 각각의 단일 난관/난소에 기인한 스코어을 합하고, 이를 상기 그룹에 대한 염증 평균 스코어를 획득하기 위해 검사된 기관 수로 나눈다. PLG-피포된 공(empty) 벡터가 공급된 음성 대조군-면역된 동물은 난소/난관 평균 염증 스코어 7.28과 일치되는 염증을 나타내었으며, PLG-피포된 DNA-면역된 그룹에 대한 스코어는 5.71이다. 복막 내의 염증은 백신 접종된 그룹의 경우에는 1.75이고 대조군의 경우에는 3.75이다.
제3 실험에서는, C3H 마우스(그룹당 4마리 마우스)를, 콜레라 독소(CT)와 혼합된 정제된 재조합 단백질 SWIB(서열 1; 이는 서열 5에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다) 또는 S13(서열 4; 이는 서열 12에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다) 10㎍으로 3회 면역시킨다. 이러한 제제는 20㎕ 용적으로 마취시 비내 투여한다. 마지막 면역시킨지 2주 후, 동물을 프로게스테론 처리하고, 씨. 프시타시를 질에 접종하거나 씨. 트라코마티스 혈청형 F를 자궁 내에 주사함으로써 감염시킨다. 감염시킨지 2주 후, 상기 마우스를 희생시키고, 생식기를 절개하며, 염색한 다음, 조직 병리학에 대해 검사한다. 염증 수준은 앞서 기재된 바와 같이 스코어를 매긴다. 각각의 단일 난관/난소에 기인한 스코어를 합하고, 이를 상기 그룹에 대한 염증 평균 스코어를 획득하기 위해 검사된 기관 수로 나눈다. 자궁 접종 모델에서는, 콜레라 독소 만이 공급된 음성 대조군-면역된 동물은 난소/난관 평균 염증 스코어 4.25를 나타내었고(2마리 마우스 만이 분석되었고; 나머지 2마리는 죽었다), s13 플러스 콜레라 독소-면역된 그룹에 대해서는 5.00이며, SWIB 플러스 콜레라 독소에 대해서는 1.00이다. 처리되지 않고 감염된 동물은 난소/난관 평균 염증 스코어가 7이다. 질 접종 및 상승 감염 모델에서는, 음성 대조군-면역된 마우스가 7.37의 난소/난관 평균 염증 스코어를 나타내었으며, s13 플러스 콜레라 독소-면역된 그룹에 대해서는 6.75이며, SWIB 플러스 콜레라 독소-면역된 그룹에 대해서는 5.37이다. 처리되지 않고 감염된 동물은 난소/난관 평균 염증 스코어가 8이다.
상기 언급된 3가지 실험은 SWIB-특이적 예방이 획득될 수 있다는 것을 제시해준다. 이러한 보호 효과는 동종 감염 모델에서 보다 더 두드러지지만, 씨. 프시타시로의 이종 챌린지 감염의 경우에도 여전히 존재한다.
2. CT529/Cap1
CT529/Cap1을, CD8+ CTL을 자극하는 클라미디아로부터의 생성물로서 초기에 동정하였다. 이 실시예에서, 본 발명자들은 Cap1로의 면역화가 클라미디아 감염 동물 모델에서 보호적일 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
Cap1 면역원성 단편을 전달하기 위한 재조합 백시니아 바이러스를 생성하기 위해, cap1 유전자(CT529)의 염기쌍 319-530 및 변형된 코작 서열을 함유하는 DNA 단편을, PCR™을 사용하여 씨. 트라코마티스 L2 게놈 DNA로부터 증폭시키고, pSC11ss에 연결시킨다[참조: Earl PL, Koenig, S, Moss B(1991) Biological and immunological properties of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein: analysis of proteins with truncations and deletions expressed by recombinant vaccinia vector. J. Virol. 65:31-41]. DNA를 SalI 및 StuI로 분해시킨다. pSC11ss에 연결된 cap1 유전자의 일부분은 아미노산 139-147의 앞서 동정된 CTL 에피토프를 함유하는, Cap1 단백질의 아미노산 107-176을 암호화한다. 이로써 생성된 플라스미드를 사용하여, CV-1 세포(ATCC#CCL-70; Jensen FC et al. (1964) Infection of human and simian tissue cultures with Rous Sarcoma Virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 52:53-39]를 형질감염시키고, 이를 연속해서 야생형 백시니아 바이러스로 감염시킨다. 상기 야생형 바이러스와 플라스미드 DNA 간의상동 재조합으로 인해, 재조합 백시니아 바이러스가 생성되는데, 이는 앞서 기재된 바와 같이[참조: Chakrabarti et al., Mol Cell Biol. 1985, 5(12):3403-9], 베타-갈락토시다제 발현과 티미딘 키나제의 불활성화 모두에 근거하여 선별한다. 재조합 바이러스를 3회 플라크 정제하고, 사람 TK-143B 세포에서 성장시킨 후 역가측정한다. 바이러스 제제를 37℃에서 30분 동안 동일 용량의 0.25mg/ml 트립신으로 처리하고, 마우스를 면역시키기에 앞서 PBS에서 희석시킨다. 5마리 그룹을 모든 실험 그룹과 대조군 그룹에 사용한다. 다음에 제시된 데이터는 3가지 독립적인 실험의 대표값이다.
특정 그룹의 마우스를 재조합 백시니아 106개로 복강내 면역시키고, 3주 동안 회복시켜 둔다. 음성 대조군 그룹을 완충액 단독으로 또는 야생형 백시니아로 면역시킨다. 양성 대조군으로서, 특정 그룹의 마우스를 씨. 트라코마티스 106i.f.u.로 정맥내 감염시킨다. 양성 대조군 그룹에 제공된 유기체의 수는 2주 내에 제거되는 것으로 앞서 밝혀졌다. 3주 후, 각 그룹 내의 동물을 씨. 트라코마티스 106i.f.u.로 정맥내 챌린지한다. 챌린지한지 3일 후에, 상기 마우스를 희생시키고, 비장당 i.f.u.의 수를 결정한다.
Cap1를 발현하는 백시니아 바이러스(7.1 x 104)로 면역시킨 동물의 비장에서 발견된 유기체의 평균 수는 완충액(1.8 x 105) 또는 야생형 백시니아(1.9 x 105)로 면역시킨 대조군 그룹 동물 보다 2.6배 정도 더 적다(p<0.01; Wilcoxon's-Rank Sum분석). 양성 그룹 내의 동물은 음성 대조군 그룹 내의 동물 보다 비장당 유기체의 수가 77배 정도 더 적다(2.4 x 103)(p<0.01; Wilcoxon's-Rank Sum 분석). 이들 데이터는 Cap1의 면역원성 단편으로의 면역화가 씨. 트라코마티스 감염에 대한 통계적 유의 수준의 보호를 제공해줄 수 있다는 것을 입증해준다.
실시예 10
Pmp/Ra12 융합 단백질
NotI 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 Pmp 유전자의 PCR 단편을 먼저 합성함으로써 각종 Pmp/Ra12 융합 작제물을 생성시킨다. 이어서, 각각의 PCR 단편을 pCRX1의 NotI 제한 부위에 연결시킨다. 이러한 pCRX1 벡터는 상기 융합물의 6HisRa12 부분을 함유한다. 이 융합 작제물의 Ra12 부분은 미국 특허원 제60/158,585호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에 기재된 바와 같은 마이코박테륨 튜베르쿨로시스 MTB32A의 아미노산 잔기 192-323에 상응하는 폴리펩티드를 암호화한다. 각 삽입물의 정확한 배향은 이의 제한 효소 패턴에 의해 결정하고, 이의 서열을 확인한다. 다음에 추가로 기재된 바와 같이, PmpA, PmpB, PmpC, PmpF 및 PmpH에 대한 다중 융합 단백질을 만든다:
PmpA 융합 단백질
PmpA는 982aa를 함유하는 107kD 단백질이고, 이를 혈청형 E로부터 클로닝한다. 이러한 PmpA 단백질을 2개의 중복 단편, 즉 PmpA(N-말단) 및 (C-말단) 부분으로 나눈다.
PmpA(N-말단)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCATGTTTATAACAAAGGAACTTATG (서열 306)
GAGAGCGGCCGCTTACTTAGGTGAGAAGAAGGGAGTTTC (서열 307).
이로써 생성된 융합 작제물은 PmpA의 세그먼트 1-473aa를 발현하는 66kD 단백질(619aa)을 암호화하는, 서열 308에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 309에 제시되어 있다.
PmpA(C-말단)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCCATTCTATTCATTTCTTTGATCCTG (서열 310)
GAGAGCGGCCGCTTAGAAGCCAACATAGCCTCC (서열 311).
이로써 생성된 융합 작제물은 PmpA의 세그먼트 438-982aa를 발현하는 74kD 단백질(691aa)을 암호화하는, 서열 312에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 313에 제시되어 있다.
PmpF 융합 단백질
PmpF는 1034aa를 함유하는 112kD 단백질이고, 이를 혈청형 E로부터 클로닝한다. 이러한 PmpF 단백질을 2개의 중복 단편, 즉 PmpF(N-말단) 및 (C-말단) 부분으로 나눈다.
PmpF(N-말단)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCATGATTAAAAGAACTTCTCTATCC (서열 314)
GAGAGCGGCCGCTTATAATTCTGCATCATCTTCTATGGC (서열 315).
이로써 생성된 융합 작제물은 PmpF의 세그먼트 1-499aa를 발현하는 69kD 단백질(646aa)을 암호화하는, 서열 316에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 317에 제시되어 있다.
PmpF(C-말단)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCGACATACGAACTCTGATGGG (서열 318)
GAGAGCGGCCGCTTAAAAGACCAGAGCTCCTCC (서열 319).
이로써 생성된 융합 작제물은 PmpF의 세그먼트 466-1034aa를 발현하는 77kD 단백질(715aa)을 암호화하는, 서열 320에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 321에 제시되어 있다.
PmpH 융합 단백질
PmpH는 1016aa를 함유하는 108kD 단백질이고, 이를 혈청형 E로부터 클로닝한다. 이러한 PmpH 단백질을 2개의 중복 단편, 즉 PmpH(N-말단) 및 (C-말단) 부분으로 나눈다.
PmpH(N-말단)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCATGCCTTTTTCTTTGAGATCTAC (서열 322)
GAGAGCGGCCGCTTACACAGATCCATTACCGGACTG (서열 323).
이로써 생성된 융합 작제물은 PmpH의 세그먼트 1-484aa를 발현하는 64kD 단백질(631aa)을 암호화하는, 서열 324에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 325에 제시되어 있다. 공여자 주 CHH037이 상기 단백질에 대해 반응성인 것으로 밝혀졌다.
PmpH(C-말단)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCGATCCTGTAGTACAAAATAATTCAGC (서열 326)
GAGAGCGGCCGCTTAAAAGATTCTATTCAAGCC (서열 327).
이로써 생성된 융합 작제물은 PmpH의 세그먼트 449-1016aa를 발현하는 77kD 단백질(715aa)을 암호화하는, 서열 328에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 329에 제시되어 있다. 환자 주 CT12가 상기 단백질에 반응하여 반응성인 것으로 밝혀졌다.
PmpB 융합 단백질
PmpB는 1750aa를 함유하는 183kD 단백질이고, 이를 혈청형 E로부터 클로닝한다. 이러한 PmpB 단백질을 4개의 중복 단편, 즉 PmpB(1), (2), (3) 및 (4)로 나눈다.
PmpB(1)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCATGAAATGGCTGTCAGCTACTGCG (서열 330)
GAGAGCGGCCGCTTACTTAATGCGAATTTCTTCAAG (서열 331).
이로써 생성된 융합물은 PmpB의 세그먼트 1-372aa를 발현하는 53kD 단백질(518aa)을 암호화하는, 서열 332에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합단백질의 아미노산 서열이 서열 333에 제시되어 있다.
PmpB(2)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCGGTGACCTCTCAATTCAATCTTC (서열 334)
GAGAGCGGCCGCTTAGTTCTCTGTTACAGATAAGGAGAC (서열 335).
이로써 생성된 융합물은 PmpB의 세그먼트 330-767aa를 발현하는 60kD 단백질(585aa)을 암호화하는, 서열 336에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 337에 제시되어 있다. 환자 주 CT1, CT3 및 CT4로부터 유도된 세포주는 상기 재조합 PmpB 단백질에 반응하였다.
PmpB(3)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCGACCAACTGAATATCTCTGAGAAC (서열 338)
GAGCGGCCGCTTAAGAGACTACGTGGAGTTCTG (서열 339).
이로써 생성된 융합물은 PmpB의 세그먼트 732-1236aa를 발현하는 67kD 단백질(654aa)을 암호화하는, 서열 340에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 341에 제시되어 있다.
PmpB(4)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCGGAACTATTGTGTTCTCTTCTG (서열 342)
GAGAGCGGCCGCTTAGAAGATCATGCGAGCACCGC (서열 343).
이로써 생성된 융합 작제물은 PmpB의 세그먼트 1160-1750aa를 발현하는 76kD 단백질(700aa)을 암호화하는, 서열 344에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 345에 제시되어 있다.
PmpC 융합 단백질
PmpC는 1774aa를 함유하는 187kD 단백질이고, 이를 혈청형 E/L2로부터 클로닝한다. 이러한 PmpC 단백질을 3개의 중복 단편, 즉 PmpC(1), (2) 및 (3)으로 나눈다.
PmpC(1)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCATGAAATTTATGTCAGCTACTGC (서열 346)
GAGAGCGGCCGCTTACCCTGTAATTCCAGTGATGGTC (서열 347).
이로써 생성된 융합 작제물은 PmpC의 세그먼트 1-340aa를 발현하는 51kD 단백질(487aa)을 암호화하는, 서열 348에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 349에 제시되어 있다.
PmpC(2)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCGATACACAAGTATCAGAATCACC (서열 350)
GAGAGCGGCCGCTTAAGAGGACGATGAGACACTCTCG (서열 351).
이로써 생성된 융합 작제물은 PmpC의 세그먼트 305-741aa를 발현하는 60kD 단백질(583aa)을 암호화하는, 서열 352에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 353에 제시되어 있다.
PmpC(3)은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머에 의해 각각 증폭시킨다:
GAGAGCGGCCGCTCGATCAATCTAACGAAAACACAGACG (서열 354)
GAGAGCGGCCGCTTAGACCAAAGCTCCATCAGCAAC (서열 355).
이로써 생성된 융합 작제물은 PmpC의 세그먼트 714-1250aa를 발현하는 70kD 단백질(683aa)을 암호화하는, 서열 356에 제시된 DNA 서열을 갖는다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 357에 제시되어 있다.
실시예 11
CT622의 면역원성
클라미디아 감염된 2명의 환자로부터 클라미디아-특이적 T 세포주를 생성시키고, 이러한 세포주를 CT1 및 CT3으로 명명하였다. 72시간 동안 단구-유도된 수지상 세포 감염된 씨. 트라코마티스 혈청형 E(CT1-ERB) 또는 사멸된 혈청형 E 기본체(EB)(CT1-EEB)에 대한 세포주를 생성시킨다. 일단 생성되면, 상기 주를 대상으로 하여, 증식 검정에서 상기 재조합 클라미디아-특이적 단백질인 CT622에 대해 시험한다. 2.5 x 104개 T 세포를 1 x 104개 단구-유도된 수지상 세포의 존재 하에 재조합 CT 항원(2㎍/ml) 또는 클라미디아 EB(1㎍/ml)로 자극함으로써 증식 검정을 수행한다. 이 검정물을 마지막 18시간 동안3H-티미딘 펄스와 함께 4일 동안 항온배양한다.
세포주 CT1-ERB는, CT622, CT875 및 CT EB로 자극하는 경우에 배지 대조군 보다 상당히 높은 증식 반응을 나타내었다. 세포주 CT13-EEB는 CT622, CT875 및 CT EB로 자극하는 경우에 배지 대조군 보다 상당히 높은 증식 반응을 나타내었다(도 12 참조).
실시예 12
완전한 길이의 클라미디아 트라코마티스 유전자 CT611, ORF3 및 OppA1의 클로닝 및 발현
유전자 CT611, ORF-3 및 oppA1를 함유하는 클론에 대한, 완전한 길이의 개방 판독 프레임의 재조합 단백질 발현을 수행한다. 관심있는 유전자를 함유하고 있는 클론은 4개의 ORF(CT474, CT473, CT060 및 CT139)를 암호화하는 CtL2-8(서열 285); CT610 및 CT611의 ORF를 암호화하는 CtL2-10(서열 284); 및 모두 ORF-3과 관련된 서열을 함유하고 있는, 클론 16CtL2-16(서열 47), 16-D4-22(서열 119) 및 19-A5-54(서열 84)이다. CtL2-10(Ct-610) 및 CtL2-16(ORF-3) 내의 서열이 또한, T 세포 발현 클로닝 접근법에 의해 독립적으로 동정되었다. 클론 CtL2-8이 추가로 조사되었는데, 이는 상기 클론이 혈청형 E에 대해 생성된 2개의 T 세포주에 의한 증식 반응과 IFN-감마 생성을 자극하였기 때문이다.
클론 서열의 클로닝 및 발현:
CtL2-10은 2개의 개방 판독 프레임(ORF)인 CT610 및 CT611을 암호화하는 것으로 밝혀졌고, 이들은 게놈 클론 내에서 서로 인접하여 편제된 것으로 밝혀졌다. CT610의 완전한 길이의 ORF(PQQ 합성 도메인을 함유함)를 미리 발현시켰으며, 이는 클라미디아에 대해 발생된 T 세포주의 증식 반응을 자극하는 것으로 입증되었다. 제2의 ORF인 CT611이 T 세포에 의해 또한 인식되는지를 결정하기 위해, CT611의 완전한 길이의 서열을 PCR 증폭시키고, 단백질 발현을 위해 조작한다. 뉴클레오티드 서열이 서열 361에 제시되어 있는데, 이는 서열 365에 제시된 상응하는 아미노산 서열을 갖는다.
제2의 혈청학적 클론 CtL2-8이 4개의 ORF(CT474, CT473, CT060 및 CT139)를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 가장 작은 것으로 예상된 3개의 ORF(CT474, CT473 및 CT060)에 대한 중복 펩티드는 T 세포주의 증식 반응을 자극하지 못하였다. 이는 면역자극성 항원이 4번째 ORF인 CT139에 존재한다는 것을 제시해준다. CT139의 ORF는 대략 450 뉴클레오티드이다. 완전한 길이의 뉴클레오티드 서열이 서열 359에 기재되어 있고, 완전한 길이의 아미노산 서열이 서열 363에 기재되어 있다. GenBank로부터의 아미노산 서열을 비교한 결과, 이것이 올리고 펩티드 결합성 단백질(oppA1)일 뿐만 아니라 펩티드 ABC 수송인자 계열에 속하는 것으로 밝혀졌다. 상기 단백질은 길이가 462개 아미노산이고, 예상 크기가 48.3kDa이며, 2개의 막관통 영역을 함유하는 것으로 여겨진다.
oppA1의 완전한 길이의 서열을 발현하기 위해, 아미노산 잔기 22(제1의 막관통 도메인이 결여됨)로부터 출발하여 서열을 특이적으로 증폭시킨 올리고뉴클레오티드를 고안하는데, 이의 뉴클레오티드 서열이 서열 358에 제시되어 있고, 이의 아미노산 서열이 서열 362에 제시되어 있다. 이는 이. 콜라이에서 상기 단백질을 발현시키는 것으로 나타났다.
ORF-3의 완전한 길이 클로닝 및 재조합 단백질 발현을 또한 달성하였다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 서열 360 및 364에 각각 기재되어 있다.
실시예 13
T 세포주에 의해 인식된 재조합 클라미디아성 항원
환자 T 세포주를 다음 공여자로부터 생성시킨다: CT1, CT2, CT3, CT4, CT5, CT6, CT7, CT8, CT9, CT10, CT11, CT12, CT13, CT14, CT15 및 CT16(이중 일부가 상기 논의되어 있다). 이들의 내역이 다음 표 V에 요약되어 있다:
NGU=비-고노코쿠스성 요도염; BV=세균성 질증; CT=클라미디아 트라코마티스; CP=클라미디아 뉴모니애; Eb=클라미디아 기본체; HPV=사람 유두종 바이러스; Dx=진단; PID=골반 염증 질환; LCR=리가제 연쇄 반응.
제2의 일련의 공여자로부터 PBMC를 수집하고, T 세포주를 이들의 서브세트로부터 생성시킨다. 이러한 3가지 세포주에 대한 내역이 다음 표에 요약되어 있다:
공여자 CHH011은 씨. 트라코마티스에 대해 혈청 음성인 49세의 건강한 여성 공여자이다. PBMC는, 씨. 뉴모니애 기본체와 비교해서 씨. 트라코마티스 기본체에반응하여 보다 높은 양의 IFN-감마를 생성시켰는데, 이는 씨. 트라코마티스-특이적 반응을 지시해준다. 공여자 CHH037은 씨. 트라코마티스에 대해 혈청 음성인 22세의 건강한 여성 공여자이다. PBMC는, 씨. 뉴모니애 기본체와 비교해서 씨. 트라코마티스 기본체에 반응하여 보다 높은 양의 IFN-감마를 생성시켰는데, 이는 씨. 트라코마티스-특이적 반응을 지시해준다. 공여자 CHH042은 씨. 뉴모니애에 대한 1:16의 IgG 역가를 갖는 25세의 건강한 여성 공여자이다. PBMC는, 씨. 뉴모니애 기본체와 비교해서 씨. 트라코마티스 기본체에 반응하여 보다 높은 양의 IFN-감마를 생성시켰는데, 이는 씨. 트라코마티스-특이적 반응을 지시해준다.
몇몇 클라미디아 트라코마티스 유전자에 대한 재조합 단백질을 상기 언급된 바와 같이 생성시킨다. MOMP에 대한 서열은 혈청형 F로부터 유래된다. 유전자 CT875, CT622, pmp-B-2, pmpA 및 CT529는 혈청형 E로부터 유래되고, 유전자 gro-EL. Swib, pmpD, pmpG, TSA, CT610, pmpC, pmpE, S13, lpdA, pmpI 및 pmpH-C에 대한 서열은 LII로부터 유래된다.
상기 언급된 몇몇 환자 및 공여자 주를 대상으로 하여, 재조합 클라미디아 단백질에 대해 시험하였다. 표 IV에는 이들 재조합 클라미디아 단백질에 대한 T 세포 반응 결과가 요약되어 있다:
본 발명이 명료한 이해 목적으로 예시 및 실시예를 통하여 일부 상세 내역으로 기재하긴 하였지만, 변화 및 변형이 본 발명의 범위(이는 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한된다)를 벗어나지 않고서도 수행될 수 있다.

Claims (39)

  1. 클라미디아 Cap1 단백질 또는 이의 면역원성 단편과 면역자극제를 포함하는, 면역 반응을 유도하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 면역원성 단편이 적어도, Cap1 단백질의 아미노산 139-147로 필수적으로 이루어진 CTL 에피토프를 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, Cap1 단백질이 서열 121에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열 121에 제시된 서열과 약 90% 이상의 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, Cap1 단백질 또는 이의 면역원성 단편이 서열 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137 및 139 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 면역원성 단편이 Cap1 단백질의 아미노산 107-176을 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 면역원성 단편이 서열 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133,135, 137 및 139 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 Cap1 단백질의 아미노산 107-176을 포함하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 면역원성 단편이 클라미디아-감염된 동물의 CD8+ T 세포와 면역학적으로 반응성인 조성물.
  8. 제1항에 따르는 조성물의 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 동물에게서 클라미디아-특이적 T 세포 반응을 자극하는 방법.
  9. 제1항에 따르는 조성물의 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 동물에게서 클라미디아 감염의 진행을 억제하는 방법.
  10. 클라미디아 Cap1 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드와 면역 자극제를 포함하는, 면역 반응을 유도하기 위한 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 면역원성 단편이 적어도, Cap1 단백질의 아미노산 139-147로 필수적으로 이루어진 CTL 에피토프 서열을 포함하는 조성물.
  12. 제10항에 있어서, Cap1 단백질이 서열 121에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열 121에 제시된 서열과 약 90% 이상의 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 조성물.
  13. 제10항에 있어서, Cap1 단백질 또는 이의 면역원성 단편이 서열 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137 및 139 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 조성물.
  14. 제10항에 있어서, 면역원성 단편이 Cap1 단백질의 아미노산 107-176을 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 면역원성 단편이 서열 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137 및 139 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 Cap1 단백질의 아미노산 107-176을 포함하는 조성물.
  16. 제10항에 있어서, 면역원성 단편이 클라미디아-감염된 동물의 CD8+ T 세포와 면역학적으로 반응성인 조성물.
  17. 제10항에 있어서, 분리된 폴리뉴클레오티드가 바이러스 전달 벡터 내에 작동 가능하게 연결되는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 바이러스 전달 벡터가 백시니아 바이러스 전달 벡터인 조성물.
  19. 제10항에 따르는 조성물의 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 동물에게서 클라미디아-특이적 T 세포 반응을 자극하는 방법.
  20. 제10항에 따르는 조성물의 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 동물에게서 클라미디아 감염의 진행을 억제하는 방법.
  21. 제18항에 따르는 조성물의 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 동물에게서 클라미디아 감염의 진행을 억제하는 방법.
  22. (a) 서열 358-361에 제시된 서열;
    (b) 서열 358-361에 제시된 서열의 상보체;
    (c) 서열 358-361에 제시된 서열의 20개 이상의 연속되는 잔기로 이루어진 서열;
    (d) 고도로 엄격한 조건하에, 서열 358-361에 제시된 서열과 하이브리드화하는 서열;
    (e) 서열 358-361에 제시된 서열과 95% 이상의 동일성을 나타내는 서열;
    (f) 서열 358-361에 제시된 서열과 99% 이상의 동일성을 나타내는 서열; 및
    (g) 서열 358-361에 제시된 서열의 축퇴성 변이체
    로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  23. (a) 제22항의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 서열;
    (b) 제22항의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 서열과 95% 이상의 동일성을 나타내는 서열; 및
    (c) 제22항의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 서열과 99% 이상의 동일성을 나타내는 서열
    로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  24. (a) 서열 362-365에 제시된 폴리펩티드 서열;
    (b) 서열 362-365에 제시된 서열과 95% 이상의 동일성을 나타내는 폴리펩티드 서열; 및
    (c) 서열 362-365에 제시된 서열과 99% 이상의 동일성을 나타내는 폴리펩티드 서열
    로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리펩티드 서열의 적어도 면역원성 단편을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  25. 발현 제어 서열과 작동 가능하게 연결된 제22항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  26. 제25항에 따르는 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 숙주 세포.
  27. 제23항 및 제24항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합되는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 이러한 생물학적 샘플을, 제23항 및 제24항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드와 결합하는 결합제와 접촉시키는 단계;
    (c) 상기 샘플 중에서, 상기 결합제와 결합하는 폴리펩티드의 양을 탐지하는 단계; 및
    (d) 상기 폴리펩티드의 양을 컷-오프 예정치와 비교하고, 이로부터, 상기 환자에게서 클라미디아의 존재 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는, 상기 환자에게서 클라미디아의 존재 여부를 탐지하는 방법.
  29. 제23항 또는 제24항에 따르는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  30. 고도로 엄격한 조건하에, 서열 358-361에 제시된 서열과 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드.
  31. T 세포의 자극 및/또는 증대를 허용하기에 충분한 조건 및 시간하에,
    (a) 제23항 또는 제24항에 따르는 폴리펩티드;
    (b) 제22항에 따르는 폴리뉴클레오티드; 및
    (c) 제22항에 따르는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 항원 제시 세포
    로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 성분과 T 세포를 접촉시키는 것을 포함하여, 클라미디아 단백질에 특이적인 T 세포를 자극 및/또는 증대시키는 방법.
  32. 제31항의 방법에 따라서 수득된 T 세포를 포함하는, 분리된 T 세포 집단.
  33. 생리학적으로 허용되는 담체 및 면역 자극제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제1 성분; 및
    (a) 제23항 또는 제24항에 따르는 폴리펩티드;
    (b) 제22항에 따르는 폴리뉴클레오티드;
    (c) 제27항에 따르는 항체;
    (d) 제29항에 따르는 융합 단백질;
    (e) 제32항에 따르는 T 세포 집단; 및
    (f) 제23항 또는 제24항에 따르는 폴리펩티드를 발현하는 항원 제시 세포
    로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제2 성분을 포함하는 조성물.
  34. (a) 제33항의 조성물;
    (b) 서열 407-430, 525-559 및 582-598 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    (c) 서열 431-454 및 560-581 중의 어느 하나의 폴리펩티드 서열
    로 이루어진 그룹 중에서 선택된 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 환자에게서 면역 반응을 자극하는 방법.
  35. (a) 제33항의 조성물;
    (b) 서열 407-430, 525-559 및 582-598 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    (c) 서열 431-454 및 560-581 중의 어느 하나의 폴리펩티드 서열
    로 이루어진 그룹 중에서 선택된 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 환자에게서 클라미디아 감염을 치료하는 방법.
  36. (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 이러한 생물학적 샘플을, 제30항에 따르는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계;
    (c) 상기 샘플 중에서, 상기 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드의 양을 탐지하는 단계; 및
    (d) 상기 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드의 양을 컷-오프 예정치와 비교하고, 이로부터, 상기 환자에게서 암의 존재 여부를 결정하는 단계
    를 포함하여, 상기 환자에게서 클라미디아의 존재 여부를 결정하는 방법.
  37. 제30항에 따르는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 진단용 키트.
  38. 리포터 그룹을 포함하는 탐지용 시약 및 제27항에 따르는 하나 이상의 항체를 포함하는 진단용 키트.
  39. (a) 환자로부터 분리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를,
    (i) 제23항 및 제24항 중의 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드;
    (ii) 서열 431-454 및 560-581 중의 어느 하나의 폴리펩티드 서열;
    (iii) 제22항에 따르는 폴리뉴클레오티드;
    (iv) 서열 407-430, 525-559 및 582-598 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열;
    (v) 제23항 및 제24항 중의 어느 한 항에 제시된 폴리펩티드 서열을 발현하는 항원 제시 세포; 및
    (vi) 서열 431-454 및 560-581 중의 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 발현하는 항원 제시 세포
    로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 성분과 함께 항온배양하여, T 세포를 증식시키는 단계; 및
    (b) 이와 같이 증식된 T 세포의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 상기 환자에게서 클라미디아를 치료하는 방법.
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