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KR20030009502A - 가용성 ｃｔｌａ4 돌연변이 분자 및 그의 용도 - Google Patents

가용성 ｃｔｌａ4 돌연변이 분자 및 그의 용도 Download PDF

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KR20030009502A
KR20030009502A KR1020027015946A KR20027015946A KR20030009502A KR 20030009502 A KR20030009502 A KR 20030009502A KR 1020027015946 A KR1020027015946 A KR 1020027015946A KR 20027015946 A KR20027015946 A KR 20027015946A KR 20030009502 A KR20030009502 A KR 20030009502A
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mutant molecule
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로버트 제이. 피치
죠세프 알. 나에무라
피터 에스. 린슬리
유르겐 바요라트
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브리스톨-마이어스스퀴브컴파니
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Abstract

본 발명은 야생형 CTLA4 또는 돌연변이 되지 않은 CTLA4Ig보다 CD80 및(또는) CD86 항원과 더 큰 결합성으로 결합하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 제공한다. 가용성 CTLA4 분자는 S25 내지 R33 영역 및 M97 내지 G107 영역 내의 특정 아미노산 잔기가 돌연변이 되지 않은 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 제1 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 돌연변이 분자는 또한 돌연변이 분자의 용해도가 증가한 제2 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

Description

가용성 ＣＴＬＡ4 돌연변이 분자 및 그의 용도 {Soluble CTLA4 Mutant Molecules and Uses Thereof}
T-림프구와 항원 제시 세포 (APCs)사이의 항원-비특이성 세포간 상호작용은 항원에 대한 T 세포 반응을 생성하는 T 세포 동시자극 신호를 생성한다 [Jenkins and Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5: 361-367].
동시자극 신호는 항원에 대한 T 세포 반응의 크기 및 이 반응이 항원에 대한 후속적인 반응을 활성화시키는지 또는 비활성화시키는지를 결정한다 [Mueller et al. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: 445-480].
동시자극이 없을 때의 T 세포 활성은 T 세포 반응을 중지시키거나 또는 무력하게 한다 [Schwartz, R. H. (1992) 세포 71: 1065-1068]. 하나의 중요한 동시자극 신호는 항원 제시 세포 상의 B7 관련 분자와 T 세포 표면 수용체 CD28의 상호작용에 의해 제공된다 (예를 들어, 각각 B7-1 및 B7-2 또는 CD80 및 CD86으로 또한공지됨) [P. Linsley and J. Ledbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11: 191-212].
현재 CD80 (B7-1)으로 공지된 분자는 초기에는 인간 B 세포 관련 활성 항원 ([Yokochi, T. et al. (1981) J. Immunol. 128: 823-827]; [Freeman, G. J. et al. (1989) J. Immunol. 143: 2714-2722])으로 기재되었고, 그 후에 괸련된 T 세포 분자 CD28 및 CTLA4에 대한 역수용체 ([Linsley, P., et al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5031-5035]; [Linsley, P. S. et al. (1991a) J. Exp. Med. 173: 721-730]; [Linsley, P. S. et al. (1991b) J. Exp. Med. 174: 561-570])로 확인되었다.
더 최근에, CTLA4에 대한 다른 역수용체는 항원 제시 세포 ([Azuma, N. et al. (1993) Nature 366: 76-79]; [Freeman (1993a) Science 262: 909-911]; [Freeman, G. J. et al. (1993b) J. Exp. Med. 178: 2185-2192]; [Hathcock, K. L. S., et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 631-640]; [Lenschow, D. J. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11054-11058]; [Ravi-Wolf, Z., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11182-11186]; [Wu, Y. et al. (1993) J. Exp. Med. 178: 1789-1793])에서 확인되었다. 현재 CD86 [Caux, C., et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 1841-1848]으로 공지되었지만, 또한 B7-0 [Azuma et al., (1993), supra] 또는 B7-2 [Freeman et al., (1993a), 상기 문헌]로 불리는 상기 분자는 그의 세포외 영역에서 CD80으로 확인된 약 25 ％의 서열을 공유한다 ([Azuma et al., (1993), 상기 문헌]; [Freeman et al., (1993a), 상기 문헌, (1993b), 상기 문헌]). CD86-형질감염된 세포는 CD28-매개 T 세포 반응을 개시한다 ([Azuma etal., (1993), 상기 문헌]; [Freeman et al., (1993a), (1993b), 상기 문헌]).
CD80 및 CD86의 발현의 비교는 여러 연구의 주제였다 ([Azuma et al. (1993), 상기 문헌]; [Hathcock et al., (1994) 상기 문헌]; [Larsen, C. P., et al. (1994) J. Immunol. 152: 5208-5219]; [Stack, R. M., et al., (1994) J. Immunol. 152: 5723-5733]). 현재의 데이타는 CD80 및 CD86의 발현이 상이하게 조절되고, CD86 발현이 면역 반응 동안 CD80 발현에 우선하는 경향이 있음을 지시한다.
CD28 및 CTLA4의 가용성 형태는 CD28 및 CTLA4의 변이성 (v)-유사 세포외 도메인을 면역글로불린 (Ig) 일정 도메인과 융합시켜 구성하여 CD28Ig 및 CTLA4Ig을 생성하였다. CTLA4Ig는 CD28Ig보다 CD80 양성 및 CD86 양성 세포 둘다와 더 강하게 결합한다 [Linsley, P. et al. (1994) Immunity 1: 793-80]. 많은 T 세포-의존 면역 반응은 시험관내에서 및 생체내에서 CTLA4Ig에 의해 차단된다 ([Linsley, et al., (1991b), 상기 문헌]; [Linsley, P. S. et al., (1992a) Science 257: 792-795]; [Linsley, P. S. et al., (1992b) J. Exp. Med. 176: 1595-1604]; [Lenschow, D. J. et al. (1992), Science 257: 789-792]; [Tan, P. et al., (1992) J. Exp. Med. 177: 165-173]; [Turka, L. A., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11102-11105]).
피치 (Peach) 등 [J. Exp. Med. (1994) 180: 2049-2058]은 CD80에 대한 강한 결합에 중요한 CTLA4 세포외 도메인의 영역을 확인하였다. 구체적으로, 상보성 결정 영역 3 (CDR3)-유사 영역에서 헥사펩티드 모티프 (MYPPPY)는 모든 CD28 및CTLA4 집단 구성원에서 완전히 보존되는 것으로 확인되었다. CTLA4의 MYPPPY 모티프를 통한 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 및 CD28Ig의 선택된 잔기에서 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 CD80에 대한 결합을 감소시키거나 폐지하였다.
CTLA4 및 CD28의 상동 영역을 상호교환한 키메라 분자가 또한 구성되었다. 분자 HS4, HS4-A 및 HS4-B는 카르복시 말단으로 확장하여 특정 비보존 아미노산 잔기를 포함하는 부분을 또한 포함하는 CTLA4의 CDR3-유사 영역을 CD28Ig으로 이식하여 구성하였다. 상기 상동 돌연변이체는 CD28Ig 보다 CD80에 대해 더 강한 결합성을 나타냈다.
키메라 상동 돌연변이체의 다른 군에서, CD28에서 보존되지 않고 CDR3-유사 영역에 공간적으로 인접해 있을 것으로 예상되는 CTLA4의 CDR1-유사 영역을 HS4 및 HS4-A로 이식하였다. 상기 키메라 상동 돌연변이 분자 (HS7 및 HS8로 지시됨)는 CD28Ig보다 CD80에 대해 훨씬 더 큰 결합성을 나타냈다.
키메라 상동 돌연변이 분자는 또한 HS7 및 HS8로 CTLA4의 CDR2-유사 영역을 이식하여 생성되지만, 상기 조합은 CD80에 대한 결합성을 추가로 개선시키지 않았다. 따라서, CTLA4 및 CD28의 MYPPPY 모티프가 CD80에 대한 결합에 중요하다는 것이 결정되었지만, CTLA4의 CDR1- 및 CDR3-유사 영역의 특정 비보존 아미노산 잔기가 또한 CD80과 CTLA4의 결합성을 증가시킨다.
CTLA4Ig는 CD80-관련 T 세포 동시자극을 효과적으로 차단하지만 CD86-관련 반응을 차단하는 것 만큼 효과적이지는 않았다. 특히 야생형 CTLA4보다 CD86에 대해 더 큰 결합성을 갖는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자가 CTLA4Ig보다 항원 특이 활성 세포의 프라이밍 (priming)을 더 잘 차단할 수 있도록 구성하였다.
사전에 공지된 CTLA4의 가용성 형태보다 면역 억제 및 암 치료를 위한 더 좋은 제약 조성물을 제공하기 위해 CTLA4 분자를 개선할 필요가 있다.
발명의 요약
따라서, 본 발명은 CD80 및(또는) CD86과 결합하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 제공한다. 본 발명의 돌연변이 분자는 CD80, CD86 또는 둘다를 인지하고 결합할 수 있는 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 분자는 CTLA4보다 CD80 및(또는) CD86과 더 큰 결합성으로 결합한다.
CTLA4 돌연변이 분자의 한가지 예로는 본원에 기재된 L104EA29YIg (도 7)가 있다. CTLA4 돌연변이 분자의 다른 예로는 본원에 기재된 L104EIg (도 8)이 있다. L104EA29YIg 및 L104EIg는 CTLA4Ig보다 CD80 및 CD86과 더 강하게 결합한다.
본 출원에서는 각종 문헌이 참조되었다. 본 발명과 관련된 업계의 진술을 더 완전히 기재하고자 이 문헌의 전체 내용을 본 출원에 참고문헌으로 인용하였다.
본 발명은 야생형 CTLA4를 돌연변이체가 되게 하여 CD80 및(또는) CD86의 결합 능력을 유지시킨 가용성 CTLA4 분자의 분야에 관한 것이다.
도 1은 CD86Ig에 대한 L104EA29YIg, L104EIg 및 야생형 CTLA4Ig의 평형 결합 분석을 나타낸다.
도 2A 및 2B는 하기 실시예 2에 기재된 인간 CD80- 또는 CD86-형질감염된 CHO 세포와 L104EA29YIg, L104EIg 및 CTLA4Ig의 결합을 나타내는 FACS 분석법의 데이타를 설명한다.
도 3A 및 3B는 하기 실시예 2에 기재된 CD80-양성 및 CD86-양성 CHO 세포 증식의 억제를 도시한다.
도 4A 및 4B는 L104EA29YIg가 하기 실시예 2에 기재된 일차 및 이차 동종자극된 T 세포의 증식을 억제하는데 CTLA4Ig보다 더 효과적이라는 것을 나타낸다.
도 5A 내지 C는 L104EA29YIg가 하기 실시예 2에 기재된 동종자극된 인간 T 세포의 IL-2 (도 5A), IL-4 (도 5B) 및 γ-인터페론 (도 5C) 시토카인 생성을 억제하는데 CTLA4Ig보다 더 효과적이라는 것을 설명한다.
도 6은 L104EA29YIg가 하기 실시예 2에 기재된 식물성 혈구응집소- (PHA) 자극 원숭이 T 세포의 확장을 억제하는데 CTLA4Ig보다 더 효과적이라는 것을 설명한다.
도 7은 하기 실시예 1에 기재된 신호 펩티드; +1 위치의 메티오닌에서 개시 및 +124 위치의 아스파르트산에서 종결 또는 -1 위치의 알라닌에서 개시 및 +124 위치의 아스파르트산에서 종결하는 CTLA4의 돌연변이된 세포외 도메인; 및 Ig 영역을 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자 (L104EA29YIg)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 8은 하기 실시예 1에 기재된 신호 펩티드; +1 위치의 메티오닌에서 개시 및 +124 위치의 아스파르트산에서 종결 또는 -1 위치의 알라닌에서 개시 및 +124 위치의 아르파르트산에서 종결하는 CTLA4의 돌연변이된 세포외 도메인; 및 Ig 영역을 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자 (L104EIg)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 9는 신호 펩티드; +1 위치의 메티오닌에서 개시하여 +124 위치의 아스파르트산까지의 CTLA4 또는 -1 위치의 알라닌에서 개시하여 +124 위치의 아스파르트산까지의 CTLA4의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열; 및 Ig 영역을 갖는CTLA4Ig의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 10A 내지 C는 CTLA4Ig (레인 1), L104EIg (레인 2) 및 L104EA29YIg (레인 3A)에 대한 SDS 겔 (도 10A); 및 CTLA4Ig (도 10B) 및 L104EA29YIg (도 10C)의 크기 배제 크로마토그래프이다.
도 11A 및 11B는 NMR 분광학에 의해 측정된 용액 구조로부터 얻어진 CTLA4 세포외 Ig V-유사 폴딩의 리본 다이어그램을 나타낸다. 도 11B는 돌연변이체, L104 및 A29의 결합성을 증가시키는 위치 및 부쇄 배열을 지시하는 S25-R33 영역 및 MYPPPY 영역의 확대된 상을 나타낸다.
도 12는 L104EA29YIg 인서트를 갖는 벡터, piLN-LEA29Y의 개략도를 도시한다.
정의
본 출원에 사용된, 하기 단어 또는 구는 구체화된 의미를 갖는다.
본원에 사용된 "야생형 CTLA4"는 자연에서 발생하는, 전체 길이 CTLA4 (미국 특허 제5,434,131호, 제5,844,095호, 제5,851,795호) 또는 CD80 및(또는) CD86과 결합하고(거나) 그의 리간드의 결합으로부터 CD80 및(또는) CD86을 방해하는 그의 세포외 도메인의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 야생형 CTLA4의 세포외 도메인은 +1 위치의 메티오닌에서 개시하고 +124 위치의 아스파르트산에서 종결하거나, 야생형 CTLA4의 세포외 도메인은 -1 위치의 알라닌에서 개시하고 +124 위치의 아스파르트산에서 종결한다. 야생형 CTLA4는 N-말단 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 C-말단 세포질 도메인을 갖는 세포 표면 단백질이다. 세포외 도메인은 표적 항원, 예를 들어 CD80 및 CD86과 결합한다. 세포에서, 자연에서 발생하는, 야생형 CTLA4 단백질이 N-말단의 신호 펩티드를 포함하는 미성숙 폴리펩티드로 번역된다. 미성숙 폴리펩티드는 신호 펩티드의 절단 및 제거를 포함하는 번역후 처리를 통해 미성숙 형태의 N-말단과는 다른 새로 생성된 N-말단을 갖는 CTLA4 절단 생성물을 생성한다. 당업자는 CTLA4 절단 생성물의 새로 생성된 N-말단으로부터 하나 이상의 아미노산을 제거하는 추가의 번역후 처리가 발생할 수 있다는 것을 인지할 것이다. CTLA4 분자의 성숙한 형태는 CD80 및(또는) CD86과 결합하는 CTLA4의 세포외 도메인 또는 그의 임의의 부분을 포함한다.
"CTLA4Ig"는 Ig 테일 (tail)과 결합된 CD80 및(또는) CD86과 결합하는 야생형 CTLA4의 세포외 도메인 또는 그의 일부분을 포함하는 가용성 융합 단백질이다. 특정 실시양태는 +1 위치의 메티오닌에서 개시하고 +124 위치의 아스파르트산에서 종결; 또는 -1 위치의 알라닌에서 개시하고 +124 위치의 아스파르트산에서 종결하는 야생형 CTLA4의 세포외 도메인; 접합 아미노산 잔기 +125 위치의 글루타민; 및 +126 위치의 글루탐산에서 +357 위치의 리신을 포함하는 면역글로불린 부분을 포함한다 (도 9).
본원에 사용된, "융합 단백질"은 당업계 공지된 방법 및 미국 특허 제5,434,131호 또는 제5,637,481호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 함께 접합된 하나 이상의 아미노산 서열로 정의되었다. 따라서 접합 아미노산 서열은 하나의 융합 단백질을 형성한다.
본원에 사용된 "CTLA4 돌연변이 분자"는 유사하지만 더이상 야생형 CTLA4 분자와 동일하지 않도록 CTLA4 (바람직하게 CTLA4의 세포외 도메인)에서 하나의 돌연변이체 또는 다중 돌연변이체를 갖는 전체 길이 CTLA4 또는 그의 부분 (유도체 또는 단편)일 수 있는 분자이다. CTLA4 돌연변이 분자는 CD80 또는 CD86 또는 둘다와 결합한다. 돌연변이 CTLA4 분자는 그안에 있거나 또는 그에 결합된 생물학적 또는 화학적으로 활성인 비-CTLA4 분자를 포함할 수 있다. 돌연변이 분자는 가용성 (즉, 순환하는)이거나 또는 표면에 결합될 수 있다. CTLA4 돌연변이 분자는 CTLA4의 전체 세포외 도메인 또는 그의 부분, 예를 들어 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. CTLA4 돌연변이 분자는 합성으로 또는 재조합으로 제조할 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "돌연변이체"는 야생형 폴리펩티드의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화이다. 상기 경우, 돌연변이체는 야생형 CTLA4 세포외 도메인의 변화이다. 변화는 치환, 결실, 첨가 또는 절단을 포함하는 아미노산 변화일 수 있다. 돌연변이 분자는 하나 이상의 돌연변이체를 가질 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 돌연변이체는 당업계 잘 공지된 아미노산 서열에서 돌연변이를 일으킬 수 있거나 일으킬 수 없다. 이런 점에서, 특정 뉴클레오티드 코돈은 동일한 아미노산을 코딩한다. 예로는 아미노산, 아르기닌 (R)을 코딩하는 뉴클레오티드 코돈 CGU, CGG, CGC 및 CGA; 또는 아미노산, 아스파르트산 (D)을 코딩하는 코돈 GAU 및 GAC가 있다. 따라서, 단백질은 특정 뉴클레오티드 서열이 다르지만 여전히 동일한 서열의 단백질 분자를 코딩하는 하나 이상의 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 아미노산을 코딩하는 서열은 하기와 같다:
본원에 사용된 "CTLA4의 세포외 도메인"은 CD80 및(또는) CD86을 인지하고 결합하는 CTLA4의 부분이다. 예를 들어, CTLA4의 세포외 도메인은 +1 위치의 메티오닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함한다 (도 9). 별법으로, CTLA4의 세포외 도메인의 세포외 도메인은 -1 위치의 알라닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함한다 (도 9). 세포외 도메인은 CD80 및(또는) CD86과 결합하는 CTLA4의 단편 또는 유도체를 포함한다 .
본원에 사용된 "비-CTLA4 단백질 서열" 또는 "비-CTLA4 분자"는 CD80 및(또는) CD86과 결합하지 않고 그의 표적과 CTLA4의 결합을 방해하지 않는 임의의 분자로 정의된다. 예로는 면역글로불린 (Ig) 불변 영역 또는 그의 부분이 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, Ig 불변 영역은 경첩, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 인간 또는 원숭이 Ig 불변 영역, 예를 들어, 인간 C(감마)1이다. Ig 불변 영역을 돌연변이하여 그의 작동 기능을 감소시킬 수 있다 (미국 특허 제5,637,481호 및 제6,132,992호).
본원에 사용된 "CTLA4 돌연변이 분자의 단편"은 CTLA4 돌연변이 분자의 일부분, 바람직하게 그의 표적, 예를 들어 CD80 및(또는) CD86을 인지하고 결합하는 CTLA4 또는 그의 부분의 세포외 도메인이다.
본원에 사용된 "CTLA4 돌연변이 분자의 유도체"는 CD80 및(또는) CD86을 인지하는 CTLA4의 세포외 도메인과 70 ％ 이상의 서열 유사성 및 유사 기능을 공유하는 분자이다.
본원에 사용된, "CTLA4 분자의 부분"은 CD80 및(또는) CD86과 결합하는 CTLA4 분자의 단편 및 유도체를 포함한다.
본원에 기재된 본 발명을 더 완전히 이해시키기 위해, 하기 설명을 기재한다.
본 발명의 조성물
본 발명은 CD80 및(또는) CD86을 인지하고 결합하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 가용성 CTLA4 돌연변이체는 CD80 및(또는)CD86에 대해 CTLA4Ig보다 더 강한 결합성을 갖는다.
CTLA4 돌연변이 분자의 예로는 L104EA29YIg (도 7)가 있다. L104EA29YIg의 아미노산 서열은 -1 위치의 아미노산인 알라닌에서 개시하고 +357 위치의 아미노산인 리신에서 종결할 수 있다. 별법으로, L104EA29YIg의 아미노산 서열은 +1 위치의 아미노산인 메티오닌에서 개시하고 +357 위치의 아미노산인 리신에서 종결할 수 있다. L104EA29YIg의 CTLA4 부분은 +1 위치의 아미노산인 메티오닌에서 +124 위치의 아미노산인 아스파르트산을 포함한다. L104EA29YIg는 접합 아미노산 잔기 +125 위치의 글루타민 및 +126 위치의 글루탐산에서 +357 위치의 리신을 포함하는 면역글로불린 부분을 포함한다 (도 7). L104EA29YIg는 야생형 CTLA4Ig (이하에서 CTLA4Ig라 부름) 보다 CD80에 대해 약 2 배 더 강하게 결합하고 CD86에 대해 약 4 배 더 강하게 결합한다. 더 강한 결합은 L104EA29YIg이 면역 반응의 차단에 있어서 CTLA4Ig보다 더 효과적이게 한다.
CTLA4 돌연변이 분자는 CD80 및(또는) CD86과 결합하는 CTLA4의 적어도 세포외 도메인 또는 그의 일부분을 포함한다. CTLA4 돌연변이 분자의 세포외 부분은 +1 위치의 메티오닌에서 개시하여 +124 위치의 아스파르트산까지의 아미노산 서열을 포함한다 (도 7 또는 8). 별법으로, CTLA4의 세포외 부분은 -1 위치의 알라닌에서 개시하여 +124 위치의 아스파르트산까지의 아미노산 서열을 포함할 수 있다 (도 7 또는 8).
한 실시양태에서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 +25의 세린으로 개시하고 +33의 아르기닌으로 종결하는 아미노산 서열 영역에서 하나 이상의 돌연변이체를갖는 (S25-R33) CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 예를 들어, 야생형 CTLA4의 +29 위치의 알라닌을 티로신으로 치환할 수 있다 (코돈: UAU, UAC). 별법으로, 알라닌을 루이신 (코돈: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG), 페닐알라닌 (코돈: UUU, UUC), 트립토판 (코돈: UGG) 또는 트레오닌 (코돈: ACU, ACC, ACA, ACG)으로 치환할 수 있다. 당업자가 쉽게 이해하는 바와 같이, RNA 서열의 우라실 (U) 뉴클레오티드는 DNA 서열의 티민 (T) 뉴클레오티드에 상응한다.
다른 실시양태에서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 +97의 메티오닌으로 개시하고 +107 의 글리신으로 종결하는 (M97 내지 G107) 아미노산 서열의 영역 내에 또는 근처에 하나 이상의 돌연변이체를 갖는 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 예를 들어, 야생형 CTLA4의 +104 위치의 루이신을 글루탐산 (코돈: GAA, GAG)으로 치환할 수 있다. 상기 치환을 갖는 CTLA4 돌연변이 분자를 본원에서 L104EIg라 부른다 (도 8).
추가의 다른 실시양태에서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 S25 내지 R33 및 M97 내지 G107 영역에 하나 이상의 돌연변이체를 갖는 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 한 실시양태에서, 예를 들어, CTLA4 돌연변이 분자는 알라닌 대신에 +29 위치에 티로신 및 루이신 대신에 +104 위치에 글루탐산을 포함한다. 상기 치환을 갖는 CTLA4 돌연변이 분자를 본원에서 L104EA29YIg (도 7)라 부른다. L104EA29YIg를 코딩하는 핵산 분자는 pD16 L104EA29YIg에 포함되어 있고 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 블러버드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2000년 6월 20일 기탁되었다 (ATCC 번호 PTA-2104).pD16 L104EA29YIg 벡터는 pcDNA3 벡터 (INVITROGEN)의 유도체이다.
본 발명은 추가로 도 7 또는 8에 나타낸 바와 같이 CTLA4 돌연변이체의 세포외 도메인 또는 그의 부분(들) 및 CTLA4 돌연변이 분자의 용해도, 친화성 및(또는) 원자가를 변경하는 잔기를 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 제공한다.
본 발명의 수행에 있어서, 잔기는 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 부분일 수 있다. 생체내 용도로, 면역글로불린 불변 영역이 환자에서 해로운 면역 반응을 일으키지 않는 것이 바람직하다. 예를 들어, 임상의 프로토콜에서, 돌연변이 분자는 인간 또는 원숭이 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 면역글로불린 영역의 하나의 예로는 경첩, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 인간 C(감마)1이 있다. 다른 동종형이 가능하다. 추가로, 다른 면역글로불린 불변 영역 (바람직하게 다른 약한 또는 비-면역성 면역글로불린 불변 영역)이 가능하다.
다른 잔기는 폴리펩티드 태그를 포함한다. 적합한 태그의 예로는 p97 분자, env gpl20 분자, E7 분자 및 ova 분자가 있으나 이에 제한되지 않는다 ([Dash, B., et al. (1994) J. Gen. Virol. 75: 1389-97]; [Ikeda, T., et al. (1994) Gene 138: 193-6]; [Falk, K., et al. (1993) 세포. Immunol. 150: 447-52]; [Fujisaka, K. et al. (1994) Virology 204: 789-93]). 태그의 용도로 다른 분자가 가능하다 ([Gerard, C. et al. (1994) Neuroscience 62: 721-739]; [Byrn, R. et al. J. Virol. (1989) 63: 4370-4375]; [Smith, D. et al., (1987) Science 238: 1704-1707]; [Lasky, L., (1996) Science 233: 209-212]).
본 발명은 추가로 야생형 CTLA4와 비교되는 CD80 및(또는) CD86 항원과 더큰 반응성 있는 가용성 돌연변이체 CTLA4Ig 융합 단백질을 제공한다. 하나의 예는 도 7에 나타낸 바와 같이 L104EA29YIg이다.
다른 실시양태에서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 CTLA4 부분과 면역글로불린 부분 사이에 위치한 접합 아미노산 잔기를 포함한다. 접합 아미노산은 글루타민을 포함하는 임의의 아미노산일 수 있다. 접합 아미노산은 당업계 공지된 분자 또는 화학물질 합성에 의해 도입될 수 있다.
다른 실시양태에서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 면역글로불린 부분 (예를 들어, 경첩, CH2 및 CH3 도메인)을 포함하는데, 이 때 면역글로불린 부분의 경첩 도메인 내에서 임의의 또는 모든 시스테인 잔기, 예를 들어 +130, +136 또는 +139 위치의 시스테인을 세린으로 치환한다 (도 7 또는 8). 돌연변이 분자는 또한 도 7 또는 8에 나타낸 바와 같이 +148 위치 프롤린을 세린으로의 치환을 포함할 수 있다.
가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 돌연변이 분자의 CTLA4 부분의 세포외 도메인 N-말단에 연결된 신호 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 온코스타틴 (oncostatin) M으로부터 신호 펩티드 [Malik, et al., (1989) Molec. 세포. Biol. 9: 2847-2853] 또는 CD5 [Jones, N. H. et al., (1986) Nature 323: 346-349] 또는 임의의 세포외 단백질로부터 신호 펩티드를 포함하는 돌연변이 분자의 분비를 허용하는 임의의 서열일 수 있다.
돌연변이 분자는 CTLA4의 세포외 도메인의 N-말단에 연결된 온코스타틴 M 신호 펩티드 및 CTLA4의 세포외 도메인의 C-말단에 연결된 인간 면역글로불린 분자 (예를 들어, 경첩, CH2 및 CH3)를 포함할 수 있다. 상기 분자는 -26 위치의 메티오닌에서 -1 위치의 알라닌을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 온코스타틴 M 신호 펩티드, +1 위치의 메티오닌에서 +124 위치의 아스파르트산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 부분, 접합 아미노산 잔기 +125 위치의 글루타민 및 +126 위치의 글루탐산에서 +357 위치의 리신을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 부분을 포함한다.
본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 분자 또는 화학물질 합성 방법으로 수득할 수 있다. 분자 방법은 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 발현하고 코딩하는 핵산 분자를 사용하여 적합한 숙주 세포를 도입하는 단계; 숙주 세포가 돌연변이 분자를 발현시키는 조건하에서 도입된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 발현된 돌연변이 분자를 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 돌연변이 분자의 신호 펩티드 부분은 단백질 분자를 세포 표면에서 발현시키고 숙주 세포에 의해 분비시킨다. 번역된 돌연변이 분자는 신호 펩티드의 절단과 관련된 번역후 변형을 진행하여 CTLA4 및 면역글로불린 부분을 갖는 성숙한 단백질을 생성할 수 있다. 절단이 -1 위치의 알라닌 다음에서 발생하여 제1 아미노산으로 +1 위치의 메티오닌을 갖는 성숙한 돌연변이 분자를 생성할 수 있다 (도 7 또는 8). 별법으로, 절단이 -2 위치의 메티오닌 다음에서 발생하여, 제1 아미노산으로 -1 위치의 알라닌을 갖는 성숙한 돌연변이 분자를 생성할 수 있다.
바람직한 실시양태는 인간 면역글로불린 분자 (예를 들어, 경첩, CH2 및 CH3)의 전체 또는 부분과 연결된 인간 CTLA4의 세포외 도메인을 갖는 가용성 CTLA4돌연변이 분자이다. 상기 바람직한 분자는 +1 위치의 메티오닌에서 +124 위치의 아스파르트산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가용성 분자의 CTLA4 부분, 접합 아미노산 잔기 +125 위치의 글루타민, 및 +126 위치의 글루탐산에서 +357 위치의 리신을 포함하는 면역글로불린 부분을 포함한다. CTLA4의 세포외 도메인을 갖는 부분을 돌연변이하여 +29 위치의 알라닌을 티로신으로 치환하고 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환한다. 돌연변이 분자의 면역글로불린 부분을 돌연변이하여, +130, +136 및 +139 위치의 시스테인을 세린으로 치환하고, +148 위치의 프롤린을 세린으로 치환할 수 있다. 상기 돌연변이 분자를 본원에 L104EA29YIg로 나타낸다 (도 7).
L104EA29YIg의 다른 실시양태는 -1 위치의 알라닌에서 +124 위치의 아스파르트산을 갖는 아미노산 서열, 접합 아미노산 잔기 +125 위치의 글루타민 및 +126 위치의 글루탐산을 포함하는 (예를 들어, +126에서 +357 위치의 리신) 면역글로불린 부분을 갖는 돌연변이 분자이다. CTLA4의 세포외 도메인을 갖는 부분을 돌연변이하여 +29 위치의 알라닌을 티로신으로 치환하고 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환한다. 돌연변이 분자의 면역글로불린 부분을 돌연변이하여 +130, +136 및 +139 위치의 시스테인을 세린으로 치환하고, +148 위치의 프롤린을 세린으로 치환한다. 상기 돌연변이 분자를 본원에서 L104EA29YIg으로 나타낸다 (도 7). 신호 펩티드를 절단한 후, L104EA29YIg는 +1 위치의 메티오닌으로 개시하거나 -1 위치의 알라닌으로 개시할 수 있다.
본 발명의 다른 돌연변이 분자는 인간 면역글로불린 분자 (예를 들어, 경첩,CH2 및 CH3)와 연결된 인간 CTLA4의 세포외 도메인을 갖는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자이다. 상기 분자는 +1 위치의 메티오닌으로 개시하여 +124 위치의 아스파르트산까지의 CTLA4를 코딩하는 아미노산 서열의 부분, 접합 아미노산 잔기 +125 위치의 글루타민 및 +126 위치의 글루탐산에서 +357 위치의 리신을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 부분을 포함한다. CTLA4의 세포외 도메인을 갖는 부분을 돌연변이하여 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환한다. 돌연변이 분자의 경첩 부분을 돌연변이하여 +130, +136 및 +139 위치의 시스테인을 세린으로 치환하고, +148 위치의 프롤린을 세린으로 치환한다. 상기 돌연변이 분자를 본원에서 L104EIg로 나타낸다 (도 8).
별법으로, L104EIg의 실시양태는 인간 면역글로불린 분자 (예를 들어, 경첩, CH2 및 CH3)와 연결된 인간 CTLA4의 세포외 도메인을 갖는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자이다. 상기 바람직한 분자는 -1 위치의 알라닌으로 개시하여 +124의 아스파르트산까지의 아미노산 서열, 접합 아미노산 잔기 +125 위치의 글루타민 및 +126 위치의 글루타민에서 +357 위치의 리신을 포함하는 면역글로불린 부분을 포함하는 CTLA4 부분을 포함한다. CTLA4의 세포외 도메인을 갖는 부분을 돌연변이하여 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환한다. 돌연변이 분자의 경첩 부분을 돌연변이하여 +130, +136 및 +139 위치의 시스테인을 세린으로 치환하고, +148 위치의 프롤린을 세린으로 치환한다. 상기 돌연변이 분자를 본원에서 L104EIg으로 나타낸다 (도 8).
추가로, 본 발명은 (a) 제2 아미노산 서열과 융합된 T 세포 증식을 차단하는막 당단백질, 예를 들어, CD28, CD86, CD80, CD40 및 gp39의 제1 아미노산 서열; (b) T 세포 증식을 차단하는 돌연변이체 CTLA4의 세포외 도메인의 단편이 되는 제2 아미노산 서열, 예를 들어 메티오닌 +1 위치의 메티오닌에서 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 아미노산 분자 (도 7 또는 8); 및 (c) 확인 태그로서 작용하거나 분자의 용해도를 증가시키는 제3 아미노산 서열을 갖는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 제공한다. 예를 들어, 제3 아미노산 서열은 본래 비면역성 면역글로불린 분자의 경첩, CH2 및 CH3 영역의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 적합한 면역글로불린 분자의 예로는 인간 또는 원숭이 면역글로불린, 예를 들어, C(감마)1이 있으나 이에 제한되지 않는다. 다른 동종형이 또한 가능하다.
본 발명은 추가로 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 핵산 분자는 DNA (예를 들어, cDNA) 또는 그의 하이브리드이다. 별법으로, 핵산 분자는 RNA 또는 그의 하이브리드이다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 숙주 벡터 시스템이 또한 제공된다. 숙주 벡터 시스템은 적합한 숙주 세포 내에 본 발명의 벡터를 포함한다. 적합한 숙주 세포의 예로는 원핵 및 진핵 세포가 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 제약상 유효량을 포함하는 면역 시스템 질병 치료용의 제약 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 시스템 질병은 CD80 및(또는) CD86 양성 세포와 CD28-및(또는) CTLA4-양성 세포의 상호작용에 의해 매개된다. 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 CTLA4의 세포외 도메인에서 하나 이상의 돌연변이체를 갖는 CTLA4 분자가 바람직하다. 제약 조성물은 가용성 CTLA4 돌연변이 단백질 분자 및(또는) 핵산 분자 및(또는) 분자를 코딩하는 벡터를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 도 7 또는 8에 나타낸 바와 같이 CTLA4의 세포외 도메인의 아미노산 서열을 갖는다 (각각 L104EA29Y 또는 L104E). 훨씬 더 바람직하게, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 본원에 개시된 바와 같이 L104EA29YIg이다. 조성물은 약물 독소, 효소, 항체 또는 접합체를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
제약 조성물은 또한 바람직하게 본 발명의 분자와 함께 결합되는 경우 (예를 들어, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자, 예를 들어 L104EA29Y 또는 L104E) 분자의 활성도를 지속하고 환자의 면역 시스템과 반응하지 않는 임의의 물질을 포함하는 적합한 담체 및 보조제를 포함한다. 적합한 담체 및 보조제의 예로는 인간 혈청 알부민; 이온 교환제; 알루미나; 레시틴; 완충 물질, 예를 들어 인산염; 글리신; 소르브산; 소르브산 칼륨; 및 염 또는 전해질, 예를 들어 황산 프로타민이 있으나 이에 제한되지 않는다. 다른 예로는 임의의 표준 제약상 담체, 예를 들어 인산염 완충 염수; 물; 에멀젼, 예를 들어 오일/물 에멀젼; 및 각종 유형의 습윤제가 있다. 다른 담체는 또한 멸균 용액, 코팅된 정제 및 캡슐을 포함하는 정제를 포함할 수 있다. 일반적으로 상기 담체는 부형제, 예를 들어 녹말, 우유, 당, 특정 유형의 점토, 젤라틴, 스테아르산 또는 그의 염, 스테아르산 마그네슘 또는 스테아르산 칼슘, 활석, 식물성 지방 또는 오일, 수지, 글리콜 또는 다른 공지된 부형제를 함유한다. 상기 담체는 또한 향미 및 착색 첨가제 또는 다른 성분을 포함할 수 있다. 상기 담체를 포함하는 조성물은 잘 공지된 통상적인 방법으로 제형화한다. 상기 조성물은 또한 리포좀과 같은 각종 지질 조성물 뿐만 아니라 중합체 마이크로스피어와 같은 각종 중합 조성물 내에서 제형화할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 정맥내 (i.v.) 투여, 복강내 (i.p.) 투여, 근육내 (i.m.) 투여, 피하 투여, 경구 투여, 좌약 또는 국소 접촉으로 투여 또는 미니 삼투 펌프와 같은 서방형 장치의 착상을 포함하나 아에 제한되지 않는 통상적인 투여 방법을 사용하여 환자에게 투여할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 액체 용액 또는 현탁액, 정제, 환약, 산제, 좌약, 중합체 마이크로캡슐 또는 마이크로소포체, 리포좀 및 주사가능한 또는 주입가능한 용액을 포함하나 이에 제한되지 않는 각종 투약 형태로 존재할 수 있다. 바람직한 형태는 투여 및 치료 적용 방법에 의존한다.
본 발명의 조성물에 대한 가장 효과적인 투여 방법 및 투약 계획은 질병의 중증도 및 경과, 환자의 건강 및 치료에 대한 반응 및 치료 의사의 판단에 의존한다. 따라서, 조성물의 투여량은 각각의 환자에게 적정되어야 한다.
가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 환자에서 각각의 리간드와 결합으로부터 내인성 B7 (예를 들어, CD80 및(또는) CD86) 분자를 차단시키기에 충분한 양 및 시간 (예를 들어, 시간 길이 및(또는) 횟수)으로 환자에게 투여할 수 있다. 따라서 내인성 B7/리간드 결합의 차단은 CD28- 및(또는) CTLA4-양성 세포와 B7 양성 세포 (예를 들어, CD80- 및(또는) CD86-양성 세포) 간의 상호작용을 억제한다. 치료제의투여량은 병이 침투된 조직의 유형, 치료되는 자가면역 질병의 유형, 질병의 중증도, 환자의 건강 및 작용제의 처리에 대한 환자의 반응을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 인자에 의존한다. 따라서, 작용제의 투여량은 환자 및 투여 방법에 따라 달라질 수 있다. 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 환자/일 당 0.1 내지 20.0 mg/kg 중량, 바람직하게는 0.5 내지 10.0 mg/kg/일의 양으로 투여할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물의 투여를 다양한 시간으로 수행할 수 있다. 한가지 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 한 시간 이상 동안 투여할 수 있다. 추가로, 투여는 질병의 중증도 뿐만 아니라 당업계에서 공지된 다른 인자에 따라 반복될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 숙주 벡터 시스템의 성장을 포함하는 단백질을 생성하여 숙주에서 단백질을 생성시키고 생성된 단백질을 회수하는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 CD80- 및(또는) CD86-양성 세포와 기능적 CTLA4- 및 CD28-양성 T 세포 상호작용을 조절하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 CD80-및(또는) CD86-양성 세포와 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자와 접촉시켜 돌연변이체 CTLA4/CD80 및(또는) 돌연변이체 CTLA4/CD86 복합체, CD80 및(또는) CD86과 내인성 CTLA4 항원의 반응을 방해하는 복합체, 및(또는) CD80 및(또는) CD86과 내인성 CD28 항원의 반응을 방해하는 복합체를 형성시키는 것을 포함한다. 본 발명의 한가지 실시양태에서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 적어도 돌연변이체 CTLA4의 세포외 도메인의 일부분을 함유하는 융합 단백질이다. 다른 실시양태에서, 가용성CTLA4 돌연변이 분자는 하나 이상의 돌연변이체를 포함하는 +1 위치의 메티오닌에서 +124 위치의 아스파르트산을 갖는 아미노산 서열로부터 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 제1 아미노산 서열 및 인간 면역글로불린 감마 1 분자의 경첩, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 제2 아미노산 서열을 포함한다 (도 7 또는 8).
본 발명의 수행에 있어서, CD80- 또는 CD86-양성 세포는 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 단편 또는 유도체와 접촉한다. 별법으로, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 CTLA4 돌연변이 수용체의 세포외 도메인의 부분에 상응하는 제2 아미노산 서열 및 인간 면역글로불린 C-감마-1의 경첩, CH2 및 CH3 영역에 상응하는 제3 아미노산 서열과 융합된 CD28 수용체의 세포외 도메인의 부분에 상응하는 제1 아미노산 서열을 갖는 CD28Ig/CTLA4Ig 융합 단백질이다.
가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 생체내 억제 특성이 존재할 것으로 예상된다. T 세포/APC 세포 상호작용, 예를 들어 T 세포/B 세포 상호작용이 T 세포와 APC 세포 사이의 접촉의 결과로 발생하는 조건하에서, CD80- 및(또는) CD86-양성 세포, 예를 들어 B 세포에 반응하는 도입된 CTLA4 돌연변이 분자의 결합은 면역 반응을 조절하는 T 세포/APC 세포 상호작용을 방해, 즉 억제할 수 있다.
본 발명은 면역 반응을 하향조절하는 방법을 제공한다. 가용성 CTLA4 돌연변이 분자에 의한 면역 반응의 하향조절은 이미 진행하고 있는 면역 반응을 억제 또는 차단할 수 있거나 면역 반응의 유도를 예방하는 것과 연관될 수 있다. 본 발명의 가용성 CTLA4 분자는 T 세포 반응의 저해에 의해 또는 T 세포에서 특정 내성의 유도에 의해 또는 둘 다에 의해 활성화된 T 세포의 기능, 예를 들어 T 림프구증식 및 시토카인 분비를 억제할 수 있다.
본 발명은 추가로 면역 시스템 질병 및 내성 유도를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 면역 시스템 질병은 CD80/CD86-양성 세포와 CD28- 및(또는) CTLA4-양성 세포 상호작용에 의해 매개된다. 추가의 실시양태에서, T 세포 상호작용이 억제된다. 면역 시스템 질병은 자가면역 질환, 면역증식성 질환 및 이식 관련 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 방법은 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 환자에게 투여하여 CD80- 및(또는) CD86-양성 세포와 T 세포 상호작용을 조절하는 것을 포함한다. 별법으로, CTLA4 돌연변이 분자와 접합된 막 당단백질을 갖는 CTLA4 돌연변이 하이브리드를 투여할 수 있다. 이식 관련 장애의 예로는 이식편 대 숙주 질환 (GVHD) (예를 들어, 골수 이식의 결과일 수 있거나 또는 내성 유도를 초래할 수 있음), 이식 거부 관련 면역 장애, 만성 거부 및 실질 기관, 피부, 소도, 근육, 간세포, 신경세포를 포함하는 조직 또는 세포의 동종이식 또는 이종이식이 있다. 면역 증식성 질환의 예로는 건선; T 세포 림프종; T 세포 급성 림프모세포성 백혈병; 고환 혈관중심성 T 세포 림프종; 양성 림프구 혈관염; 및 자가면역 질환, 예를 들어 루프스 (예를 들어, 홍반성 루프스, 루프스 신염), 하시모토 갑상선염, 일차성 점액부종, 그레이브스 질환, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 애디슨 질환, 당뇨 (예를 들어. 인슐린 의존성 당뇨병, 유형 I 당뇨병), 굿파스튜어 증후군, 중증 근무력증, 천포창, 크론 질환, 교감성 안염, 자가면역 포도막염, 다발성 경화증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 감소증, 원발성 담즙성 간경변, 만성 작용 간염, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성질환 (예를 들어, 류마티스성 관절염), 다발성근염, 피부경화증 및 혼합 결합조직 질환이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 추가로 이식 조직의 수령자인 환자에 의한 실질 기관 및(또는) 조직 이식 거부를 억제하는 방법을 제공한다. 대표적으로, 조직 이식에서, 이식 거부는 T 세포에 의해 이종으로 인지된 후, 이식편을 파괴하는 면역 반응을 통해 개시된다. T 림프구 증식 및(또는) 시토카인 분비를 억제하는 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 조직 파괴를 감소시킬 수 있고 항원-특이성 T 세포 비반응성의 유도는 일반화된 면역 억제를 필요로하지 않는 장기간 이식 수용을 초래할 수 있다. 추가로, 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 코르티코스테로이드, 시클로스포린, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 아자티오프린, 타크롤리머스, 바실릭시마브 및(또는) 다른 생물제제를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 제약과 함께 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 환자에서 이식편 대 숙주 질환을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 단독으로 또는 IL-2, IL-4 또는 γ-인터페론과 반응하는 추가의 리간드와 함께 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 가용성 CTLA 돌연변이 분자를 제공자 T 세포의 동종반응을 억제하기 위해 골수 이식 수령자에게 투여할 수 있다. 별법으로, 골수 이식편 내의 제공자 T 세포를 이식 전에 세포외 수령자의 동종항원에 내성이 생기게 할 수 있다.
가용성 CTLA4 돌연변이 분자에 의한 T 세포 반응의 억제는 또한 자가면역 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 다수의 자가 면역 장애는 자가항원에 대해 반응하고 질병의 병리와 관련된 시토카인 및 자가항체의 생성을 증진시키는 T 세포의 부적절한 활성으로부터 발생한다. 자가면역 장애를 앓고 있거나 걸리기 쉬운 환자에서 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 투여는 자가반응 T 세포의 활성을 예방할 수 있고 질병 증상을 감소시키거나 제거할 수 있다. 상기 방법은 또한 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 단독 또는 추가의 IL-2, IL-4 또는 γ-인터페론과 반응하는 리간드와 함께 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 다른 면역 억제제, 예를 들어 시클로스포린 ([Mathiesen, in: "Prolonged Survival and Vascularization of Xenografted 인간 Glioblastoma 세포s in the Central Nervous System of Cyclosporin A-Treated Rats" (1989) Cancer Lett., 44: 151-156] 참조), 프레드니손, 아자티오프린 및 메토트렉사트 [R. Handschumacher "Chapter 53: Drugs Used for Immunosuppression" pages 1264-1276]와 함께 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 용도를 포함한다. 다른 면역 억제제가 가능하다. 예를 들어, 류마티스성 관절염의 치료를 위해, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 코르티코스테로이드, 비스테로이드성 항염증 약물/Cox-2 억제제, 메토트렉사트, 히드록시클로로퀸, 술파살라조피린, 금 염, 에타너셉트, 인플릭시맵, 아나킨라, 아자티오프린 및(또는) 항-TNF 같은 다른 생물제제를 포함하나 이에 제한되지 않는 제약과 함께 투여할 수 있다. 전신 홍반성 루프스의 치료를 위해, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 코르티코스테로이드, 시톡산, 아자티오프린, 히드록시클로로퀸, 마이코페놀레이트 모페틸 및(또는) 다른 생물제제를 포함하나 이에 제한되지않는 제약과 함께 투여할 수 있다. 추가로, 다발성 경화증의 치료를 위해, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 코르티코스테로이드, 인터페론 베타-1a, 인터페론 베타-1b, 글라티라머 아세테이트, 미톡산트론 염산염 및(또는) 다른 생물제제를 포함하나 이에 제한되지 않는 제약과 함께 투여할 수 있다.
가용성 CTLA4 돌연변이 분자 (바람직하게, L104EA29YIg)는 또한 면역 반응을 조절하는 하나 이상의 하기 작용제와 함께 사용할 수 있다: 가용성 gp39 (또한 CD40 리간드 (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP으로 공지됨), 가용성 CD29, 가용성 CD40, 가용성 CD80, 가용성 CD86, 가용성 CD28, 가용성 CD56, 가용성 Thy-1, 가용성 CD3, 가용성 TCR, 가용성 VLA-4, 가용성 VCAM-1, 가용성 LECAM-1, 가용성 ELAM-1, 가용성 CD44, gp39와 반응하는 항체, CD40과 반응하는 항체, B7과 반응하는 항체, CD28과 반응하는 항체, LFA-1과 반응하는 항체, LFA-2와 반응하는 항체, IL-2와 반응하는 항체, IL-12와 반응하는 항체, IFN-감마와 반응하는 항체, CD2와 반응하는 항체, CD48과 반응하는 항체, 임의의 ICAM (예를 들어, ICAM-2)과 반응하는 항체, CTLA4와 반응하는 항체, Thy-1과 반응하는 항체, CD56과 반응하는 항체, CD3과 반응하는 항체, CD29와 반응하는 항체, TCR과 반응하는 항체, VLA-4와 반응하는 항체, VCAM-1과 반응하는 항체, LECAM-1과 반응하는 항체, ELAM-1과 반응하는 항체, CD44와 반응하는 항체. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체가 바람직하다. 다른 실시양태에서, 항체 단편이 바람직하다. 당업자가 쉽게 이해하는 바와 같이, 병용은 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 및 하나의 다른 면역 억제제, 2 개의 다른 면역 억제제와 가용성 CTLA4 돌연변이 분자, 3 개의 다른 면역 억제제와가용성 CTLA4 돌연변이 분자 등을 포함할 수 있다. 최적 병용 및 투여량의 결정은 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 결정하고 최적화할 수 있다.
몇가지 구체적인 병용은 하기를 포함한다: L104EA29YIg 및 CD80 mAb; L104EA29YIg 및 CD86 mAb; L104EA29YIg, CD80 mAb 및 CD86 mAb; L104EA29YIg 및 gp39 mAb; L104EA29YIg 및 CD40 mAb; L104EA29YIg 및 CD28 mAb; L104EA29YIg, CD80 및 CD86 mAb 및 gp39 mAb; L104EA29YIg, CD80 및 CD86 mAb 및 CD40 mAb; 및 L104EA29YIg, 항-LFA1 mAb 및 항-gp39 mAb. gp39 mAb의 구체적인 예로는 MR1이 있다. 다른 병용은 당업자에 의해 쉽게 인지되고 이해될 것이다.
본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자, 예를 들어 L104EA29Y는 활성 성분 단독으로 또는 면역 조절 섭생에서 다른 약물 또는 동종이식 또는 이종이식 급성 또는 만성 거부 또는 염증성 또는 자가면역 장애 또는 내성 유도의 치료 또는 예방을 위한 다른 항염증제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 이는 칼시뉴린 억제제, 예를 들어 시클로스포린 A 또는 FK506; 면역 억제성 매크롤리드, 예를 들어 라파마이신 또는 그의 유도체, 예를 들어 40-0-(2-히드록시)에틸-라파마이신, 림프구 호밍제, 예를 들어 FTY720 또는 그의 유사체; 코르티코스테로이드; 시클로포스포아미드; 아자티오프렌; 메토트렉사트; 레플루노미드 또는 그의 유사체; 미조리빈; 마이코페놀산; 마이코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스퍼구알린 또는 그의 유사체; 면역 억제성 모노클로날 항체, 예를 들어 백혈구 수용체에 대한 모노클로날 항체, 예를 들어 MHC, CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB 또는 그의 리간드; 또는 다른 면역조절 화합물, 예를 들어 CTLA4/CD28-Ig, 또는 다른 접착 분자 억제제, 예를 들어 mAb 또는 LFA-1 길항제, 셀렉틴 길항제 및 VLA-4 길항제를 포함하는 저분자량 억제제와 함께 사용될 수 있다. 상기 화합물은 상기 기재된 징후, 예를 들어 내성의 유도에서 CD40 및 그의 리간드, 예를 들어 CD40에 대한 항체 및 CD40-L에 대한 항체를 방해하는 화합물과 병용하는 것이 특히 유용하다.
본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 다른 면역 억제/면역 조절 또는 항염증성 치료와 관련하여 투여하는 경우, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이, 동시 투여된 면역 억제, 면역 조절 또는 항염증성 화합물의 투여량은 사용된 동시-약물의 유형, 예를 들어 스테로이드 또는 시클로스포린인지, 사용된 구체적인 약물, 처리된 증상 등에 따라 물론 달라질 것이다.
선술한 바와 같이 본 발명은 추가의 측면에서 유리 형태 또는 제약상 허용가능한 염 형태의 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자, L104EA29YIg의 치료상 유효량 및 상기 지시된 면역 억제, 면역 조절 또는 항염증성 약물인 제2 약물의 동시 투여, 예를 들어 동시에 또는 연속적인 투여를 포함하는 상기 정의된 방법을 제공한다. 추가로 면역 억제, 면역 조절 또는 항염증성 약물을 포함하는 하나 이상의 제약 조성물과 동시에 또는 연속적으로 사용하기 위한 유리 형태 또는 제약상 허용가능한 염 형태의 L104EA29YIg를 포함하는 치료적 병용, 예를 들어 상기 정의된 임의의 방법용의 킷트를 제공한다. 상기 킷트는 그의 투여에 대한 설명을 포함할 수 있다.
본 발명의 분자를 생성하는 방법
CTLA4 돌연변이 분자의 발현이 원핵 세포에서 있을 수 있다. 가장 흔히 원핵 생물을 박테리아의 각종 균주로 나타낸다. 박테리아는 그램 양성 또는 그램 음성일 수 있다. 일반적으로, 대장균 (E.coli)과 같은 그램-음성 박테리아가 바람직하다. 다른 미생물 균주가 또한 사용될 수 있다.
CTLA4 돌연변이 분자를 코딩하는 서열을 대장균과 같은 원핵 세포의 이종 서열을 발현시키기 위해 설계된 벡터로 삽입할 수 있다. 상기 벡터는 일반적으로 리보좀 결합 부위 서열 및 임의의 오퍼레이터와 함께 전사 개시를 위한 프로모터를 포함하고, 베타-락타마제 (페니실리나제) 및 락토오스 (lac) 프로모터 시스템 [Chang, et al., (1977) Nature 198: 1056], 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057] 및 람다 유도된 PL프로모터 및 N-유전자 리보좀 결합 부위 [Shimatake, et al., (1981) Nature 292: 128]와 같은 일반적으로 사용되는 프로모터를 포함하는 것으로 본원에 정의된 사용된 원핵 조절 서열을 포함할 수 있다.
상기 발현 벡터는 또한 복제 원점 및 항생제에 대한 내성을 부여하는 선별가능한 마커, 예를 들어 베타-락타마제 또는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 포함할 것이고, 따라서 상기 벡터는 플라스미드를 운반하는 박테리아 및 세포에서 복제할 수 있고 항생제, 예를 들어 암피실린 또는 카나마이신 존재하에 성장시키는 경우 선별할 수 있다.
발현 플라스미드는 CaCl2-쇼크 ([Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA69: 2110] and [Sambrook et al. (eds.),"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)]) 및 전기영동을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 표준 방법을 통해 원핵 세포로 도입될 수 있다.
본 발명의 수행에 있어서, 진핵 세포가 또한 적합한 숙주 세포일 수 있다. 진핵 세포의 예로는 일차 또는 무한 증식인 임의의 동물 세포, 효모 (예를 들어, 사카로마이시즈 세레비제 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이시즈 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 및 피키아 패스토리스 (Pichia pastoris)), 및 식물 세포가 있다. 골수종, COS 및 CHO 세포는 숙주로 사용될 수 있는 동물 세포의 예이다. 특정 CHO 세포는 DG44 ([Chasin, et a;., 1986 Som. 세포. Molec. Genet. 12: 555-556]; [Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901-10909]), CHO-K1 (ATCC 제CCL-61호), CHO-K1 Tet-On 세포주 (Clontech), ECACC 85050302라 지칭된 CHO (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO 클론 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO 클론 B (GEIMG, Genova, IT), ECACC 93061607라 지칭된 CHO-K1/SF (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) 및 ECACC 92052129라 지칭된 RR-CHOK1 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대표적인 식물 세포는 담배 (식물 전체, 세포배양 또는 유합조직), 옥수수, 대두 및 벼 세포를 포함한다. 옥수수, 대두 및 벼 종자가 또한 사용가능하다.
CTLA4 돌연변이 분자를 코딩하는 핵산 서열은 또한 진핵 숙주에서 이종 서열을 발현시키기 위해 설계된 벡터로 삽입될 수 있다. 벡터의 조절 인자는 특정 진핵 숙주에 따라 달라질 수 있다.
발현 벡터에서 사용하기 위한 일반적으로 사용된 진핵 조절 서열은 포유동물 세포와 상용가능한 프로모터 및 조절 서열, 예를 들어 CMV 프로모터 (CDM8 벡터) 및 조류 육아종 바이러스 (ASV) (πLN 벡터)를 포함한다. 다른 일반적으로 사용된 프로모터는 원숭이 바이러스 (Simian Virus) 40 (SV40) [Fiers, et al., (1973) Nature 273: 113]의 초기 및 후기 프로모터 또는 폴리오마, 아데노바이러스 2 및 소 유두종 바이러스로부터 유도된 다른 바이러스 프로모터를 포함한다. 유도가능한 프로모터, 예를 들어 hMTII [Karin, et al., (1982) Nature 299: 797-802]가 또한 사용될 수 있다.
진핵 생물에서 CTLA4 돌연변이 분자를 발현하기 위한 벡터는 또한 인핸서 영역이라 불리는 서열을 운반할 수 있다. 이는 유전자 발현을 최적화하는데 중요하고 프로모터 영역의 상류 또는 하류에서 발견된다.
진핵 숙주 세포에 대한 발현 벡터의 예로는 포유동물 숙주 세포에 대한 벡터 (예를 들어, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis)); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc 벡터, pCMV 벡터, pSG5 벡터 (Stratagene)), 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, pFB 벡터 (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) 또는 그의 변형된 형태, 아데노바이러스 벡터; 아데노-관련 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 효모 벡터 (예를 들어, pESC 벡터 (Stratagene))가 있으나 이에 제한되지 않는다.
CTLA4 돌연변이 분자를 코딩하는 핵산 서열은 진핵 숙주 세포의 게놈으로 합치될 수 있고 숙주 게놈 복제와 같이 복제할 수 있다. 별법으로, CTLA4 돌연변이분자를 운반하는 벡터는 염색체외 복제를 허용하는 복제 원점을 함유할 수 있다.
사카로마이시즈 세레비제 (Saccharomyces cerevisiae)에서 핵산 서열을 발현시키기 위해, 내인성 효모 플라스미드의 복제 원점, 2 μ 고리가 사용될 수 있다 [Broach, (1983) Meth. Enz. 101: 307]. 별법으로, 자동 복제를 촉진할 수 있는 효모 게놈으로부터의 서열을 사용할 수 있다 (예를 들어, [Stinchcomb et al., (1979) Nature 282: 39)]; [Tschemper et al., (1980) Gene 10: 157]; 및 [Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101: 300] 참조).
효모 벡터에서 전사 조절 서열은 해당 효소의 합성을 위한 프로모터를 포함한다 ([Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149]; [Holland et al., (1978) Biochemist 17: 4900]). 당업계 공지된 추가의 프로모터는 CDM8 벡터에서 제공된 CMV 프로모터 [Toyama and Okayama, (1990) FEBS 268: 217-221]; 3-포스포글리세레이트 키나아제에 대한 프로모터 [Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073] 및 다른 해당 효소에 대한 프로모터를 포함한다.
다른 프로모터는 이들이 환경적 자극 또는 세포의 성장 배지에 의해 조절될 수 있기 때문에 유도가능하다. 상기 유도가능한 프로모터는 열 충격 단백질, 알코올 탈수소효소 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사 관련 효소 및 말토오스, 갈락토오스 사용과 관련된 효소에 대한 유전자의 프로모터를 포함한다.
조절 서열은 또한 코딩 서열의 3'말단에 위치할 수 있다. 이 서열은 전령 RNA를 안정화시키는데 작용할 수 있다. 상기 터미네이터는 몇가지 효모-유도된 유전자 및 포유동물 유전자에서 코딩 서열 뒤의 3' 비번역 영역에서 발견된다.
식물 및 식물 세포에 대한 대표적인 벡터는 아그로박테리움 (Agrobacterium) Ti 플라스미드, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 및 토마토 골든 모자이크 바이러스 (TGMV)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 측면은 액셀 (Axel) [U. S. Patent No. 4,399,216 issued Aug. 16,1983]에 의해 기술되었다. 포유동물 세포를 인산 칼슘의 존재하에 미량주입, 전기영동 또는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입을 포함하나 이에 제한되지 않는 방법으로 형질전환할 수 있다.
이종 DNA 서열을 식물 및 효모 게놈으로 도입하는 방법은 (1) 기계적 방법, 예를 들어 단일 세포 또는 프로토플라스트로 DNA를 미량주입, DNA 존재하에 유리 비드로 세포를 보텍싱 또는 DNA-코팅된 텅스텐 또는 금 스피어를 세포 또는 프로토플라스트로 슛팅; (2) 폴리에틸렌 글리콜 처리 또는 높은 전압 전기 펄스로 정복하여 (전기영동) 거대분자가 침투할 수 있는 세포막을 만들어 DNA를 도입; 또는 (3) 세포막과 융합된 리포좀 (cDNA 함유)의 사용을 포함한다.
CTLA4 돌연변이 분자의 발현은 당업계 공지된 방법에 의해 검출할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 분자는 쿠마시 (Coomassie) 염색 SDS-PAGE 겔 및 CTLA4에 결합하는 항체를 사용한 면역블롯팅에 의해 검출할 수 있다. 단백질 회수를 표준 단백질 정제 방법, 예를 들어 친화 크로마토그래피 또는 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 수행하여 실질적으로 순수한 생성물을 수득하였다 [R. Scopes in:"Protein Purification, Principles and Practice", Third Edition, Springer-Verlag (1994)].
본 발명은 본원에서 상기 제조한 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 추가로 제공한다.
CTLA4Ig 코돈에 기초한 돌연변이유발
한가지 실시양태에서, 부위 특이 돌연변이유발법 및 신규 스크리닝 방법을 사용하여 CD86에 대한 결합성이 개선된 CTLA4의 세포외 도메인에서의 몇가지 돌연변이체를 확인하였다. 상기 실시양태에서, 돌연변이체를 세린 25 내지 아르기닌 33, C' 가닥 (알라닌 49 및 트레오닌 51), F 가닥 (리신 93, 글루탐산 95 및 루이신 96)의 CTLA4의 세포외 도메인 영역 및 메티오닌 97 내지 티로신 102, 티로신 103 내지 글리신 107 영역 및 글루타민 111, 티로신 113 및 이소루이신 115 위치의 G 가닥의 잔기에서 수행하였다. 상기 부위는 키메라 CD28/CTLA4 융합 단백질의 연구 [Peach et al., J. Exp. Med., 1994,180: 2049-2058] 및 아미노산 잔기 부쇄가 용매 노출된 것을 예견하는 모델 및 아미노산 잔기 동일성 또는 CD28과 CTLA4 사이의 특정 위치에서 상동성의 결핍을 기준으로 선택되었다. 또한, 확인된 잔기에 대해 공간적으로 매우 근접한 (5 내지 20 옹스트롬 단위) 임의의 잔기는 본 발명의 고려된 부분이다.
CD80 및(또는) CD86에 대한 친화성과 관련하여 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 합성하고 스크리닝하기 위해, 2 단계 전략이 적용되었다. 실험은 먼저 CTLA4 세포외 부분의 특정 코돈에서 돌연변이체 라이브러리를 생성한 후 BIAcore 분석법에 의해 라이브러리를 스크리닝하여 CD80 또는 CD86에 대한 반응성과 관련있는 돌연변이체를 확인하여 수행하였다. BIAcore 분석 시스템 (Pharmacia, Piscataway,N. J.)은 검출기에 위치한 덱스트란-코팅 센서 칩과 CD80Ig 또는 CD86Ig의 공유 결합과 본질적으로 연관된 표면 플라즈몬 공명 검출기 시스템을 사용한다. 이어서 시험 분자는 센서 칩을 함유하고 있는 챔버로 주입될 수 있고 결합하는 상보적 단백질의 양은 센서 칩의 덱스트란-코팅 측면과 물리적으로 관련된 분자량의 변화 및 검출기 시스템에 의해 측정할 수 있는 분자량의 변화에 기초하여 평가될 수 있다.
본 발명의 이점
CD80 및 CD86과 결합하는 CTLA4가 빠른 "on" 속도 및 빠른 해리 ("off") 속도를 특징으로 하고, CTLA4Ig-CD86 복합체가 CTLA4Ig-CD80 복합체보다 5 내지 8 배 더 빠르게 해리하기 때문에, CD80 및(또는) CD86으로부터 CTLA4Ig의 느려진 해리 속도는 분자의 면역 억제 특성을 더 강하게 할 수 있다. 따라서, 야생형 CTLA4 또는 CTLA4Ig의 돌연변이 되지 않은 형태와 비교했을때 CD80- 또는 CD86-양성 세포에 대해 더 강한 결합성을 갖는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 야생형 CTLA4 또는 CTLA4Ig의 돌연변이 되지 않은 형태보다 더 강한 효능으로 항원 특이적 활성화된 세포의 프라이밍을 차단할 것으로 예상된다.
추가로, CTLA4Ig에 대한 생산 비용이 매우 높다. 더 강한 면역 억제 특성을 갖는 결합성이 큰 돌연변이 CTLA4Ig 분자는 돌연변이 되지 않은 CTLA4Ig보다 상당히 낮은 투여량으로 임상에서 사용되어 유사한 정도의 면역 억제를 달성할 수 있다. 따라서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자, 예를 들어, L104EA29YIg는 비용이 매우 효율적일 수 있다.
하기 실시예로 본 발명을 설명하고 동일물을 제조하고 사용하는 일반적인 기술 중 하나를 제공한다. 실시예는 임의의 방법으로 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위해 사용된 방법을 설명한다. 단일-부위 돌연변이체 L104EIg를 생성하고 CD80 및(또는) CD86에 대한 결합 역학을 시험하였다. L104EIg 뉴클레오티드 서열은 CD80 및(또는) CD86에 대한 결합 역학에 대해 시험된 이중-부위 돌연변이체 CTLA4 서열, L104EA29YIg를 생성하기 위한 주형으로 사용되었다.
CTLA4Ig 코돈에 기초한 돌연변이체:
돌연변이유발법 및 스크리닝 방법을 개발하여 CD80 및(또는) CD86 분자로부터 낮은 해리 속도 ("off" 속도)를 갖는 돌연변이 CTLA4Ig 분자를 확인하였다. 단일-부위 돌연변이체 뉴클레오티드 서열은 주형으로서 CTLA4Ig (미국특허 제5,844,095호; 제5,851,795호; 및 제5,885,796호; ATCC 수납번호 제68629호)를 사용하여 생성하였다. 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 코돈의 1 및 2 위치에 임의의 염기를 허용하지만, 3 위치에 구아닌 또는 티아민만을 허용하는 (XXG/T; 또한 NNG/T로 공지됨) 특정 cDNA 코돈의 랜덤 돌연변이유발로 설계하였다. 상기 방법에서, 아미노산을 코딩하는 특정 코돈은 랜덤하게 돌연변이되어 각각의 20 개 아미노산을 코딩할 수 있다. 이와 관련하여, XXG/T 돌연변이유발은 각각의 20 개 아미노산을 코딩하는 32 개의 가능한 코돈을 수득한다. CTLA4Ig의 -M97-G107에 매우 근접한 (도 7 또는 8 참조) 돌연변이체를 코딩하는 PCR 생성물은 SacI/XbaI으로 분해되고 유사하게 잘린 CTLA4Ig πLN 발현 벡터로 서브클로닝되었다. 상기 방법을 사용하여 단일-부위 CTLA4 돌연변이 분자 L104EIg를 생성하였다 (도 8).
CTLA4Ig의 S25 내지 R33에 근접한 돌연변이유발에서, 먼저 잠재성 NheI 제한 부위를 PCR 프라이머-특이 돌연변이유발로 상기 루프의 5'에 도입하였다. PCR 생성물을 NheI/XbaI로 분해시키고 유사하게 잘린 CTLA4Ig 또는 L104EIg 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 상기 방법을 사용하여 이중-부위 CTLA4 돌연변이 분자 L104EA29YIg를 생성하였다 (도 7). 특히, 단일-부위 CTLA4 돌연변이 분자, L104EIg를 코딩하는 핵산 분자를 주형으로 사용하여 이중-부위 CTLA4 돌연변이 분자, L104EA29YIg를 생성하였다. L104EA29YIg를 갖는 piLN 벡터를 도 12에 나타냈다.
실시예 2
하기는 CD80 및 CD86 항원에 대한 결합성이 돌연변이 되지 않은 CTLA4Ig 분자에 비해 더 높으며 실시예 1에 기재한 구조물로부터 발현된 단일 및 이중-부위 돌연변이체 CTLA4 폴리펩티드의 확인에 사용된 스크리닝 방법을 설명한다.
현행 시험관내 및 생체내 연구는 CTLA4Ig 자체는 항원 특이적 활성화된 T 세포의 프라이밍을 완전히 차단할 수 없음을 지시한다. CTLA4Ig 및 T 세포 증식의 억제를 측정하는 CD80 또는 CD86에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 사용한 시험관내 연구는 항-CD80 모노클로날 항체가 CTLA4Ig 억제를 증대시키지 않는다는 것을지시한다. 그러나, 항-CD86 모노클로날 항체는 억제를 증대시키는데, 이는 CTLA4Ig가 CD86 상호작용을 차단하는데 효과적이지 않다는 것을 지시한다. 이러한 데이타는 CD80-매개 세포간 반응의 억제에 CTLA4Ig 농도가 CD86-매개 반응보다 약 100 배 낮음을을 보여준 린슬리 (Linsley) 등의 문헌 [Immunity, (1994), 1: 793-801]에 의한 초기 발견을 지지한다. 이러한 발견을 토대로, 야생형 CTLA4보다 CD86에 대한 결합성이 더 높은 가용성 CTLA4 돌연변이 분자가 CTLA4Ig보다 항원 특이적 활성화된 세포의 프라이밍을 더 잘 차단할 수 있다는 것이 짐작된다.
이러한 목적을 위해서, 신규 스크리닝 방법을 사용하여 상기 실시예 1에 기재된 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 스크리닝하여 CTLA4의 세포외 도메인에서 CD80 및 CD86에 대한 결합성이 개선된 여러가지 돌연변이체를 확인하였다. "off" 속도는 농도에 따라 다르게 결정되는 것이 아니기 때문에, 이러한 스크리닝 전략은 "off" 속도가 분명히 느려진 돌연변이체를 단백질을 정제하거나 정량할 필요없이 직접적으로 확인할 수 있는 효과적인 방법이다 [O'Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212: 457-468].
COS 세포를 각각의 미니프렙 정제된 플라스미드 DNA로 형질감염시키고 수일동안 증식시켰다. 3 일 동안 조건화시킨 배양 배지를 가용성 CD80Ig 또는 CD86Ig로 코팅된 BIAcore 바이오센서 칩 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)에 적용하였다. 돌연변이체 단백질의 특이적 결합 및 해리를 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하였다 [O'Shannessy, D. J., et al., (1993) Anal. Biochem. 212: 457-468]. 모든 실험은 25 ℃의 BIAcore (등록상표) 또는 BIAcore 2000 (등록상표) 바이오센서에서 수행하였다. 리간드를 표준 N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)카르보디이미드 N-히드록시숙신이미드 커플링을 사용하여 연구 등급 NCM5 센서 칩 (Pharmacia)으로 고정시켰다 ([Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198 : 268-277]; [Khilko, S. N., et al. (1993) J. Biol. Chem 268: 5425-15434]).
스크리닝 방법
24 웰 조직 배양 플레이트에서 성장시킨 COS 세포를 돌연변이체 CTLA4Ig를 코딩하는 DNA로 일시적으로 형질감염시켰다. 3 일 후에, 분비된 가용성 돌연변이체 CTLA4Ig를 함유하는 배양 배지를 수집하였다.
조건화된 COS 세포 배양 배지를 CD86Ig 또는 CD80Ig로 유도된 BIAcore 바이오센서 칩에 흐르게 하고 (그린 (Greene) 등의 문헌 [1996 J. Biol. Chem. 271: 26762-26771]에 기재된 바에 따름), "off" 속도가 야생형 CTLA4Ig의 경우에 관찰된 속도보다 더 느려진 돌연변이 분자를 확인하였다. 선택된 배지 샘플에 상응하는 cDNA를 서열분석하고, DNA를 제조하여 대규모의 일시적인 COS 세포 형질감염을 수행하고, 배양 배지의 단백질 A를 정제한 후 돌연변이체 CTLA4Ig 단백질을 제조하였다.
BIAcore 분석 조건 및 평형 결합 데이타 분석을 제이. 그린 (J. Greene) 등의 문헌 [1996 J. Biol. Chem. 271: 26762-26771] 및 본원에 기재된 바와 같이 수행하였다.
BIAcore 데이타 분석
분석전에, 센서그램 (sensorgram) 기준선을 0 반응 단위로 정규화하였다.샘플을 모의 (mock)-유도된 유동 셀에 흐르게 하여 용액emf 사이의 굴절률 차이를 크게하는 백그라운드 반응 단위 (RU) 값을 결정하였다. Req대 C의 플롯으로부터 평형 해리 상수 (Kd)를 계산하였는데, 이 때 Req는 정상 상태 반응에서 모의-유도된 칩의 반응을 뺀 것이고, C는 분석물질의 몰농도이다. 결합 곡선은 상업적인 비선형 곡선-작도 소프트웨어 (Prism, GraphPAD Software)를 사용하여 분석하였다.
우선 실험 데이타를 단일 수용체와 결합한 단일 리간드에 대한 모델 (1-부위 모델, 즉 단순한 랭뮈어 시스템, A + B ↔AB)로 작도하였고, 평형 결합 상수 (Kd= [A] ·[B] / [AB])를 방정식 R = Rmax·C / (Kd+ C)로부터 계산하였다. 이어서, 데이타를 가장 간단한 리간드 결합의 2-부위 모델 (즉, 방정식 R = Rmax1·C / (Kd1+ C) + Rmax2·C / (Kd2+ C)에 기재된 2 개의 상호작용하지 않는 독립된 결합 부위를 갖는 수용체에 대해)로 작도하였다.
이러한 2가지 모델의 적합도 (goodness-of-fits)를 실험 데이타와 시각적으로 비교하여 분석하고 제곱합의 F 검증을 통해 통계적으로 분석하였다. 2-부위 모델도 유의하게 양호하게 적합하지만 (p < 0. 1), 더 단순한 1-부위 모델을 최적의 작도법으로 선택하였다.
BIA 평가 2.1 소프트웨어 (Pharmacia)를 사용하여 결합 및 해리 분석을 수행하였다. 결합 속도 상수 kon을 균일한 단일-부위 상호작용 및 평행한 2-부위 상호작용 모두를 가정할 수 있는 2 가지 방법으로 계산하였다. 단일-부위 상호작용의경우에는, kon값을 방정식 Rt= Req(1 - exp-ks(t-t0))에 따라 계산하였는데, 이 때 Rt는 주어진 시간 t에서의 반응이고; Req는 정상 상태에서의 반응이고; to는 주입 시작시의 시간이며; ks= dR/dt = kon·Ckoff이고 이 때 C는 단량체 결합 부위의 항으로 계산한 분석물질의 농도이다. 2-부위 상호작용의 경우에는, 방정식 Rt= Req1(1 - exp-ksl(t- t0)+ Req2(1 - expks2(t-t0))에 따라 kon값을 계산하였다. 각각의 모델에서, kon값을 ks대 C 플롯의 기울기에 대한 계산치 (약 70 ％ 최대 결합으로)로부터 결정하였다.
해리 데이타를 한 부위 (AB = A + B) 또는 두 부위 (AiBj= Ai + Bj) 모델에 따라 분석하고, 가장 우수한 작도 곡선으로부터 속도 상수 (koff)를 계산하였다. 2-결합 부위 모델을 사용한 경우, 잔류물이 기기의 백그라운드 (기기에 따라 2 내지 10 RU)보다 큰 경우를 제외하고는 결합 부위 모델을 사용하였다. 수용체 점유 시간의 절반을 t1/2= 0.693/koff의 식을 사용하여 계산하였다.
유동 세포계측법:
뮤린 mAb L307.4 (항-CD80)를 벡튼 디킨슨 (Becton Dickinson) 사로부터 구입하고 IT2.2 (항-B7-0 [또한 CD86으로 공지됨])를 파밍겐 (Pharmingen) (San Diego, California) 사로부터 구입하였다. 면역 염색을 위해, 1O mM EDTA를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 인큐베이션하여 CD80-양성 및(또는) CD86-양성CHO 세포를 배양 용기로부터 제거하였다. 우선 CHO 세포 (1-10 x 105)를 10 ％ 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 DMEM 중에서 mAb 또는 면역글로불린 융합 단백질을 인큐베이션한 후, 세척하고 플루오레신 이소시아네이트-접합된 염소 항-마우스 또는 항-인간 면역글로불린 제2단계 시약 (Tago, Burlingame, California)과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 최종적으로 세척하고 FACScan (Becton Dickinson)에서 분석하였다.
SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피
트리스/글리신 4 내지 20 ％ 아크릴아미드 겔 (Novex, San Diego, CA)에서 SDS-PAGE를 수행하였다. 분석용 겔을 쿠마시 블루 (Coomassie Blue)로 염색하고, 디지털 스캐닝하여 젖은 겔의 화상을 수득하였다. CTLA4Ig (25 ㎍) 및 L104EA29YIg (25 ㎍)을 1.0 ml/분의 유동 속도의 0.02 ％ NAN3를 함유하는 인산염 완충 염수 중에서 평형된 TSK-GEL G300 SWXL컬럼 (7.8 x 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA)을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다.
CTLA4X C120S 및 L104EA29YX C120S
단쇄 CTLA4XC120S를 상기에서 기재한 바와 같이 제조하였다 [Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270: 15417-15424]. 간단히, 온코스타틴 M CTLA4 (OMCTLA4) 발현 플라스미드를 주형으로 사용하였고, 전방향 프라이머, GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG를 선택하여 벡터의 서열과 매치시키며; 역방향 프라이머, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC를 사용하여 CTLA4의 세포외 도메인의 마지막 7 개 아미노산 (즉, 아미노산 118 내지 124)에 상응하고 제한 효소 부위 및 종결 코돈 (TGA)을 함유하도록 하였다. 역방향 프라이머는 C120S (120 위치에서 시스테인을 세린으로) 돌연변이체를 지정하였다. 특히, 상기 나타낸 역방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열 GCA (뉴클레오티드 34 내지 36)은 하기 뉴클레오티드 서열 중의 하나로 치환된다: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT 또는 GCT. 당업자가 이해하는 바와 같이, 뉴클레오티드 서열 GCA는 시스테인에 대한 코돈 TGC의 역방향 상보 서열이다. 유사하게, 뉴클레오티드 서열 AGA, GGA, TGA, CGA, ACT 또는 GCT는 세린에 대한 코돈의 역방향 상보 서열이다. 중합효소 연쇄 반응 생성물을 HindIII/XbaI으로 분해하고 발현 벡터 πLN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ)으로 직접적으로 서브클로닝하였다. L104EA29YXC120S를 동일한 방법으로 제조하였다. 각각의 구조물을 DNA 서열분석으로 확인하였다.
결합성이 큰 돌연변이체의 확인 및 생화학적 특성화
돌연변이유발법을 위해 24 개의 아미노산을 선택하였고, 생성된 2300 개 돌연변이 단백질을 표면 플라즈몬 공명 (SPR; 상기에 기재)에 의해 CD86Ig 결합에 대해 분석하였다. 각각의 부위에서 돌연변이유발의 두드러진 효과를 하기 표 II에 요약하였다. S25 내지 R33에서 몇몇 아미노산의 랜덤 돌연변이유발은 리간드 결합을 명백하게 변화시키지 않았다. E31 및 R33 및 잔기 M97 내지 Y102의 돌연변이유발은 리간드 결합을 명백하게 감소시켰다. 잔기 S25, A29 및 T30, K93, L96,Y103, L104 및 G105의 돌연변이유발은 "on" 및(또는) "off" 속도를 느려지게 하였다. 이 결과는 S25 내지 R33 영역의 잔기 및 M97 내지 Y102 내부 또는 근처의 잔기가 리간드 결합에 영향을 준다는 이전의 발견을 사실을 확인시킨다 [Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180: 2049-2058].
S25, T30, K93, L96, Y103 및 G105 부위를 돌연변이유발하여 몇몇 돌연변이 단백질이 CD86Ig로부터의 "off" 속도가 느려지는 것을 확인하였다. 그러나, 이런 경우에, 느린 "off" 속도는 느린 "on" 속도에 의해 절충되어 전체 결합성이 야생형 CTLA4Ig에서 나타나는 것과 명백하게 유사한 돌연변이 단백질이 생성된다. 추가로, K93의 돌연변이유발은 충분한 응집을 유발시켜 역학적 변화를 일으킨다.
L104의 랜덤 돌연변이유발 후 COS 세포 형질감염 및 CD86Ig을 고정화된 배양 배지 샘플의 SPR에 의해 스크리닝하여 "off" 속도가 야생형 CTLA4Ig보다 약 2 배 느린 돌연변이 단백질을 함유하는 6 개의 배지 샘플을 수득하였다. 상기 돌연변이체에 상응하는 cDNA를 서열분석하여, 각각이 루이신에서 글루탐산으로의 돌연변이 (L104E)를 코딩한다는 것이 밝혀졌다. 명백하게, 루이신 104를 아스파르트산로의 치환 (L104D)은 CD86Ig 결합에 영향을 미치지 않았다.
이어서 표 2에 열거된 각각의 부위에서, PCR 주형으로 야생형 CTLA4Ig 대신에 L104E를 사용하여 상기 기재한 바와 같이 돌연변이유발법을 반복하였다. 다시 고정된 CD86Ig를 사용한 SPR 분석을 통해 알라닌 29의 돌연변이유발로인해 "off" 속도가 야생형 CTLA4Ig보다 약 4 배 느린 단백질을 함유하는 6 개의 배양 배지 샘플을 확인하였다. 가장 느린 2 개는 티로신 치환체 (L104EA29Y)였고, 2 개는 루이신 (L104EA29L)였고, 1 개는 트립토판 (L104EA29W)으며 1 개는 트레오닌 (L104EA29T)였다. 명백하게, 야생형 CTLA4Ig에서 알라닌 29 단독으로 랜덤하게 돌연변이 하는 경우 느린 "off" 속도 돌연변이체가 확인되지 않았다.
정제된 L104E 및 L104EA29YIg의 상대적인 분자량 및 응집 상태를 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피로 평가하였다. L104EA29YIg (~1 ㎍; 레인 3) 및 L104EIg (~1 ㎍; 레인 2)는 환원 조건하에서 (~50 kDa; +βME; 2-머캡토에탄올 추가) 및 비환원 조건하에서(~1OO kDa; -βME) CTLA4Ig (~1 ㎍; 레인 1) 와 같이 분명히 동일한 전기영동 이동도를 갖는다 (도 1OA). 크기 배제 크로마토그래피는 이량체 CTLA4Ig (도 10B)와 같이 L104EA29YIg (도 1OC)가 분명히 동일한 이동도를 갖는다는 것을 입증하였다. 도 10B에서 더 빨리 용출되는 부피크가 분자량이 큰 응집체를 나타내는 반면 주피크는 단백질 이량체를 나타낸다. CTLA4Ig의 약 5 ％가 더 큰 분자량 응집체로서 존재하지만 L104EA29YIg 또는 L104EIg의 응집의 증거는 없다. 따라서, L104EIg 및 L104EA29YIg를 사용하여 보여진 CD86Ig에 대한 강한 결합은 돌연변이체에 의해 유도된 응집에 기여할 수 없다.
평형 및 역학 결합 분석
평형 및 역학 결합 분석을 단백질 A 정제된 CTLA4Ig, L104EIg 및 L104EA29YIg에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 수행하였다. 결과를 하기 표 I에 나타냈다. 농도 범위 (5.0 내지 200 nM)에 걸쳐 생성된 결합 곡선으로부터 관찰된 평형 해리 상수 (Kd; 표 I)를 계산하였다. L104EA29YIg는 L104EIg 또는CTLA4Ig보다 CD86Ig에 더 강하게 결합한다. L104EIg (6.06 nM) 또는 CTLA4Ig (13.9 nM)보다 낮은 L104EA29YIg의 Kd(3.21 nM)는 CD86Ig에 대한 L104EA29YIg의 결합성이 더 높다는 것을 지시한다. L104EA29YIg (3.66 nM)의 Kd가 L104EIg (4.47 nM) 또는 CTLA4Ig (6.51 nM)보다 더 낮다는 것은 CD80Ig에 대한 L104EA29YIg의 결합성이 더 높다는 것을 지시한다.
역학 결합 분석은 CD80에 결합하는 CTLA4Ig, L104EIg 및 L104EA29YIg의 상대적인 "on" 속도가 CD86Ig에 대한 "on" 속도와 유사하다는 것을 밝혀냈다 (표 I). 그러나, 이들 분자에 대한 "off" 속도는 동등하지 않았다 (표 I). CTLA4Ig과 비교하여, L104EA29YIg는 CD80Ig로부터 약 2 배 느린 "off" 속도 및 CD86Ig로부터 약 4 배 낮은 "off" 속도를 갖는다. L104E의 "off" 속도는 L104EA29YIg와 CTLA4Ig 사이의 중간치였다. 상기 돌연변이체의 도입이 "on" 속도에 유의하게 영향을 미치지 않기 때문에, L104EA29YIg로 관찰한 CD80Ig 및 CD86Ig에 대한 결합성 증가는 주로 "off" 속도의 감소에 기인하는 것으로 여겨진다.
CD86Ig 및 CD80Ig에 대한 L104EA29YIg의 결합성의 증가가 이량체와 관련된 각각의 단량체 방법에 영향을 주는 돌연변이체 때문인지 또는 각각의 단량체에 도입된 구조적 변화가 결합성을 증가시키는지를 결정하기 위해, CTLA4 및 L104EA29Y 세포외 도메인의 단쇄 구조물을 상기 기재한 바 및 린슬리 (Linsley) 등의 문헌 [(1995) J. Biol. Chem., 270: 15417-15424]과 같이 시스테인 120을 세린으로 돌연변이유발하여 제조하였다. 정제된 단백질 CTLA4XC120S및 L104EA29YXC120S를 겔 투과크로마토그래피 [Linsley et al., (1995), 상기 문헌]에 의해 단량체임을 확인한 후, 그 리간드 결합 특성을 SPR에 의해 분석하였다. CD86Ig에 대한 둘 다의 단량체 단백질의 결합 친화성이 각각의 이량체에서 보여진 것의 약 35 내지 80 배라는 결과를 얻었다 (표 I). 이는 사전에 개시된 CTLA4의 이량체가 강한 리간드 결합성을 필요함을 확인한 데이타를 입증한다 [Greene et al., (1996) J. Biol. Chem., 271: 26762-26771].
L104EA29YXC120S는 CD80Ig 및 CD86Ig 둘다에 대해 CTLA4XC120S보다 약 2 배 더 큰 친화성으로 결합하였다. 이러한 친화성 증가는 둘다의 리간드로부터 해리 속도가 약 3 배 느리기 때문이었다. 따라서, L104EA29Y에 의한 강한 리간드 결합은 이량체화된 분자에서의 구조적 변화 때문이 아니라, 각각의 단량체 쇄로 도입되는 구조적 변화가 결합성을 증가시키기 때문이었다.
결합성을 증가시키는 돌연변이체의 위치 및 구조 분석
CTLA4의 세포외 IgV-유사 도메인의 용액 구조를 최근에 NMR 분광학에 의해 측정하였다 [Metzler et al., (1997) Nature Struct. Biol., 4: 527-531]. 이는 3 차원 폴딩에서 루이신 104 및 알라닌 29의 정확한 위치를 제공하였다 (도 11A 내지 B). 루이신 104는 강하게 보존된 MYPPPY 아미노산 서열 근처에 위치한다. 알라닌 29는 MYPPPY 영역과 공간적으로 인접한 S25 내지 R33 영역의 C-말단 근처에 위치한다. 상기 두 영역 염기의 잔기 사이에 충분한 상호작용이 있는 반면, L104 및 A29 둘 다가 단백질의 연속적인 소수성 코어의 부분을 포함하지만 L104과 A29 사이의직접적인 상호작용이 분명하지는 않다. 결합성을 증가시키는 2 개의 돌연변이체의 구조적 결과를 모델링으로 평가하였다. A29Y 돌연변이체는 S25 내지 R33 영역과 MYPPPY 영역 사이의 틈에 용이하게 수용될 수 있고, MYPPPY 영역의 배열을 안정화시킬 수 있다. 야생형 CTLA4에서, L104는 MYPPPY 영역 근처에서 L96 및 V94와 광범위한 소수성 상호작용을 형성한다. 글루탐산 돌연변이체가 L104의 돌연변이체와 유사한 배열을 갖는 것은 2 가지 이유로 매우 불가능하다. 첫째로, S25 내지 R33 영역에 충분한 동요없이 구조내에 더 긴 글루탐산 측쇄를 수용하기에는 공간이 충분하지 않다. 둘째로, 글루탐산 측쇄의 음전하를 묻어버리는 에너지 비용이 클 수 있다. 대신에, 모델링 연구는 글루탐산 측쇄가 그의 전하를 용매화에 의해 안정화시킬 수 있는 표면으로 튀어나온다는 것을 예상한다. 상기 배열의 변화는 상기 영역의 다른 잔기를 최소로 왜곡시키면서 G105에 의해 용이하게 수용시킬 수 있다.
CD80 또는 CD86을 발현하는 CHO 세포에 대한 높은 결합성을 갖는 돌연변이체
안정하게 형질감염된 CD80+ 및 CD86+CHO 세포와 결합하는 CTLA4Ig 및 돌연변이 분자의 FACS 분석 (도 2)을 본원에 기재한 바와 같이 수행하였다. CD80-양성 및 CD86-양성 CHO 세포를 CTLA4Ig, L104EA29YIg 또는 L104EIg의 농도를 증가시키면서 인큐베이션한 후 세척하였다. 결합된 면역글로불린 융합 단백질을 플루오레신 이소티오시아네이트-접합된 염소 항-인간 면역글로불린을 사용하여 검출하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, CD80-양성 또는CD86-양성 CHO 세포 (1.5 x 105)를지시된 농도의 CTLA4Ig (검은 정사각형), L104EA29YIg (원) 또는 L104EIg (삼각형)로 2 시간 동안 23 ℃에서 인큐베인션하고, 세척하며 플루오레신 이소티오시아네이트-접합된 염소 항-인간 면역글로불린 항체로 인큐베이션 하였다. 총 5,000 개의 살아있는 세포의 결합을 FACScan으로 분석하고 (1 회 측정), 평균 형광 세기 (MFI)를 PC-LYSYS를 사용한 데이타 히스토그램으로부터 결정하였다. 데이타를 2 번째 단계 시약만으로 인큐베이션한 세포에서 측정된 백그라운드 형광에 대해 보정하였다 (MFI = 7). 대조군 L6 mAb (80 ㎍/ml)는 MFI < 30이었다. 이 결과는 4 개의 독립적인 실험을 나타낸다.
인간 CD80-형질감염된 CHO 세포와 L104EA29YIg, L104EIg 및 CTLA4Ig의 결합은 거의 동일하다 (도 2A). L104EA29YIg 및 L104EIg는 CTLA4Ig보다 인간 CD86으로 안정하게 형질감염된 CHO 세포와 더 강하게 결합한다 (도 2B).
기능 분석:
인간 CD4-양성 T 세포를 면역자기 음성 선택법으로 단리하였다 [Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176: 1595-1604]. 단리된 CD4-양성 T 세포를 적정한 농도의 억제제 존재하에 CD80-양성 또는 CD86-양성 CHO 세포와 함께 포볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA)로 자극하였다. CD4-양성 T 세포 (8-10 x 104/웰)를 1 nM PMA 존재 및 조사된 CHO 세포 자극제 존재 또는 부재하에 배양하였다. 증식 반응을 72 시간 배양 중 최종 7 시간 동안 [3H] 티미딘 1 μCi/웰을 첨가하여 측정하였다. CD80-양성 CHO 또는 CD86-양성 CHO, L104EA29YIg 및 CTLA4Ig에 의해 자극된 T 세포와 함께 PMA의 억제를 수행하였다. 상기 결과를 도 3에 나타냈다. L104EA29YIg는 CTLA4Ig보다 CD80-양성 PMA 처리된 CHO 세포의 증식을 더 많이 억제한다 (도 3A). L104EA29YIg는 또한 CD86-양성 PMA 처리된 CHO 세포의 증식을 억제하는데 CTLA4Ig보다 더 효과적이다 (도 3B). 그러므로, L104EA29YIg는 T 세포의 CD80- 및 CD86-매개 동시자극에 더 효능있는 억제제이다.
도 4는 상기 제조되고 추가로 CD80 및 CD86 (3.0 x 1O4/웰의 T 세포및 8.O x 103/웰의 PM)을 발현시킨 PM이라 불리는 인간 B 림프아구양 세포주 (LCL)로 동종자극된 인간 T 세포의 L104EA29YIg 및 CTLA4Ig에 의한 억제를 나타낸다. 일차 동종자극을 6 일 동안 발생시킨 후, 세포를3H-티미딘으로 7 시간 동안 처리하고, 방사선 표지의 혼입을 측정하였다.
이차 동종자극을 하기와 같이 수행하였다. 7일 동안 일차 동종자극된 T 세포를 림프구 분리 배지 (LSM) (ICN, Aurora, OH)로 수확하고 24 시간 동안 방치하였다. 이어서 T 세포를 CTLA4Ig 또는 L104EA29YIg의 적정량 존재하에 상기와 같은 비율로 PM을 첨가하여 재자극 (이차)하였다. 3 일동안 자극한 후, 상기와 같이 세포를 방사선 표지로 처리하고 수확하였다. 일차 동종자극된 T 세포에서 L104EA29YIg의 효과를 도 4A에 나타냈다. 이차 동종자극된 T 세포에서 L104EA29YIg의 효과를 도 4B에 나타냈다. L104EA29YIg는 CTLA4Ig보다 더 크게 일차 및 이차 T 세포 증식 반응 둘 다를 억제한다.
시토카인 생성을 측정하기 위해 (도 5), 한쌍의 이차 동종자극 플레이트를장치하였다. 3 일 후, 배양 배지를 제조사가 추천한 조건에서 ELISA 킷트 (Biosource,Camarillo, CA)를 사용하여 분석하였다. L104EA29YIg는 이차 동종 자극 후 T 세포 IL-2, IL-4 및 γ-IFN의 시토카인 생성을 차단하는데 CTLA4Ig보다 더 효능있는 것으로 밝혀졌다 (도 5A 내지 C).
원숭이 혼합 림프구 반응 (MLR)에서 L104EA29YIg 및 CTLA4Ig 의 효과를 도 6에 나타냈다. 2 마리 원숭이로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC'S; 각각의 원숭이로부터 3.5 x 104세포/웰)를 림프구 분리 배지 (LSM)로 정제하고 2 ㎍/ml 식물성 혈구응집소 (PHA)와 혼합하였다. 세포를 3 일동안 자극한 후 방사선 표지를 16 시간 동안 처리하고 수확하였다. L104EA29YIg는 CTLA4Ig보다 더 강하게 원숭이 T 세포 증식을 억제하였다.
평형 및 분명한 역학 상수를 하기 표에 나타낸다 (값은 3 회의 다른 실험으로부터 평균 표준 편차이다)
열거된 부위에서 CTLA4Ig의 돌연변이체에 의한 CD86Ig 결합의 효과를 상기 기재한 SPR로 측정하였다. 두드러진 효과를 "+" 표시로 지시한다.
본 발명과 관련한 당업자들에게 인지되는 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 정신 또는 본질적인 특성에 벗어나지 않으면서 상기 구체적으로 개시된 것 이외의 형태로 구체화될 수 있다. 그러므로 본 발명의 특정 실시양태는 제한없이 설명될 것이라 생각된다. 본 발명의 범위는 선술한 실시예로 제한되기 보다는 첨부한 청구항으로 설명된다.

Claims (66)

  1. (a) +29 위치의 알라닌을 티로신, 루이신, 트립토판 및 트레오닌으로 구성된 군 중에서 선택된 아미노산으로 치환하고 및 (b) +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환한 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는, CD80 및(또는) CD86과 결합하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  2. 제1항에 있어서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 용해도, 친화성 또는 원자가를 변경하는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  3. 제2항에 있어서, 아미노산 서열이 인간 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  4. 제2항에 있어서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 분비를 허용하는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  5. 제4항에 있어서, 아미노산 서열이 온코스타틴 (oncostatin) M 신호 펩티드를 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  6. 제1항에 있어서, 도 7에 나타낸 바와 같이 +1 위치의 메티오닌 및 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  7. 제1항에 있어서, 도 7에 나타낸 바와 같이 -1 위치의 알라닌 및 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  8. 제3항에 있어서, 도 7에 나타낸 바와 같이 인간 면역글로불린 불변 영역을 돌연변이하여 +130 위치의 시스테인이 세린으로 치환되었고, +136 위치의 시스테인이 세린으로 치환되었고, +139 위치의 시스테인이 세린으로 치환되었고 +148 위치의 프롤린이 세린으로 치환된 것을 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  9. 도 7에 나타낸 바와 같이 +29 위치의 알라닌을 티로신으로 치환하고 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환한 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는, CTLA4 보다 CD80 및(또는) CD86에 대해 더 강한 결합성을 갖는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자.
  10. 제9항에 있어서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 용해도, 친화성 또는 원자가를 변경하는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  11. 제10항에 있어서, 아미노산 서열이 인간 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  12. 제10항에 있어서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 분비를 허용하는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  13. 제12항에 있어서, 아미노산 서열이 온코스타틴 M 신호 펩티드를 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  14. 제9항에 있어서, 도 7에 나타낸 바와 같이 +1 위치의 메티오닌 및 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  15. 제9항에 있어서, 도 7에 나타낸 바와 같이 -1 위치의 알라닌 및 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  16. 제11항에 있어서, 도 7에 나타낸 바와 같이 인간 면역글로불린 불변 영역을 돌연변이하여 +130 위치의 시스테인이 세린으로 치환되었고, +136 위치의 시스테인이 세린으로 치환되었고, +139 위치의 시스테인이 세린으로 치환되었고 +148 위치의 프롤린이 세린으로 치환된 것을 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자.
  17. 도 8에 나타낸 바와 같이 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환한 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는, CTLA4 보다 CD80 및(또는) CD86에 대해 더 강한 결합성을 갖는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자.
  18. 제1항의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  19. 제9항의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  20. 제18항에 있어서, 도 7 또는 8에 나타낸 바와 같이 +1 위치 뉴클레오티드인 아데닌으로 개시하여 +1071의 아데닌으로 종결하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자.
  21. 제19항에 있어서, 도 7 또는 8에 나타낸 바와 같이 +1 위치 뉴클레오티드인 아데닌으로 개시하여 +1071의 아데닌으로 종결하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자.
  22. 제18항에 있어서, 도 7 또는 8에 나타낸 바와 같이 -3 의 구아니딘으로 개시하여 +1071의 아데닌으로 종결하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자.
  23. 제19항에 있어서, 도 7 또는 8에 나타낸 바와 같이 -3 의 구아니딘으로 개시하여 +1071의 아데닌으로 종결하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  25. pD16 L104EA29YIg라 지칭되고 ATCC 번호 PTA-2104로 ATCC에 기탁된 L104EA29YIg를 코딩하는 벡터.
  26. 적합한 숙주 세포에 제24항 또는 제25항의 벡터를 포함하는 숙주 벡터 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 적합한 숙주 세포가 박테리아 세포 또는 진핵 세포인 숙주 벡터 시스템.
  28. 제24항 또는 제25항의 벡터를 갖는 숙주 세포.
  29. 제28항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
  30. 제29항에 있어서, 진핵 세포가 COS 세포인 숙주 세포.
  31. 제29항에 있어서, 진핵 세포가 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포인 숙주세포.
  32. 제31항에 있어서, CHO 세포가 DG44, CHO-K1, CHO-K1 Tet-On 세포주, ECACC 85050302라 지칭된 CHO, CHO 클론 13, CHO 클론 B, CHO-K1/SF 및 RR-CHOK1으로 구성된 군 중에서 선택된 숙주 세포.
  33. 제26항의 숙주 벡터 시스템을 성장시켜 숙주 세포에서 CTLA4 돌연변이체 단백질을 생성시키고 그렇게 생성된 단백질을 회수하는 것을 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이체 단백질을 생성하는 방법.
  34. 제28항의 숙주 세포를 성장시켜 숙주 세포에서 L104EA29YIg를 생성하고 그렇게 생성된 단백질을 회수하는 것을 포함하는 L104EA29YIg를 생성하는 방법.
  35. 제33항의 방법에 의해 생성된 가용성 CTLA4 돌연변이체 단백질.
  36. 제34항의 방법에 의해 생성된 L104EA29YIg.
  37. CD80 및(또는) CD86 양성 세포를 제1항의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자와 접촉시켜 CTLA4 돌연변이 분자/CD80 또는 CTLA4 돌연변이 분자/CD86 복합체를 형성시키는데, 이 때 상기 복합체가 T 세포와 CD80 및(또는) CD86 양성 세포 사이의 상호작용을 방해하는 것임을 포함하는 CD80 및(또는) CD86 양성 세포와 T 세포 상호작용을 조절하는 방법.
  38. CD80 및(또는) CD86 양성 세포를 제9항의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자와 접촉시켜 CTLA4 돌연변이 분자/CD80 또는 CTLA4 돌연변이 분자/CD86 복합체를 형성하는데, 이 때 상기 복합체가 T 세포와 CD80 및(또는) CD86 양성 세포 사이의 상호작용을 방해하는 것임을 포함하는 CD80 및(또는) CD86 양성 세포와 T 세포 상호작용을 조절하는 방법.
  39. 제37항에 있어서, 도 8에 나타낸 바와 같이 가용성 CTLA4 돌연변이 분자가 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환한 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 방법.
  40. 제37항에 있어서, CD80 및(또는) CD86 양성 세포가 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 단편 또는 유도체와 접촉하는 방법.
  41. 제38항에 있어서, CD80 및(또는) CD86 양성 세포가 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 단편 또는 유도체와 접촉하는 방법.
  42. 제37항에 있어서, CD80 및(또는) CD86 양성 세포가 항원 제시 세포인 방법.
  43. 제38항에 있어서, CD80 및(또는) CD86 양성 세포가 항원 제시 세포인 방법.
  44. 제37항에 있어서, CD80 및 CD86 양성 세포와 CTLA4-양성 T 세포의 상호작용을 억제시키는 방법.
  45. 제38항에 있어서, CD80 및 CD86 양성 세포와 CTLA4-양성 T 세포의 상호작용을 억제시키는 방법.
  46. 제1항의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 환자에게 투여하여 CD80 및(또는) CD86 양성 세포와 T 세포 상호 작용을 조절하는 것을 포함하는 CD80 및(또는) CD86 양성 세포와 T 세포 상호작용에 의해 매개된 면역 시스템 질병을 치료하는 방법.
  47. 제9항의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 환자에게 투여하여 CD80 및(또는) CD86 양성 세포와 T 세포 상호 작용을 조절하는 것을 포함하는 CD80 및(또는) CD86 양성 세포와 T 세포 상호작용에 의해 매개된 면역 시스템 질병을 치료하는 방법.
  48. 제46항에 있어서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자가 도 8에 나타낸 바와 같이 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환한 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 T 세포 상호작용을 억제하는 방법.
  50. 제47항에 있어서, 상기 T 세포 상호작용을 억제하는 방법.
  51. 제1항의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 및 IL-4과 반응성 있는 리간드를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 이식편 대 숙주 질환을 억제하는 방법.
  52. 제9항의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 및 IL-4과 반응성 있는 리간드를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 이식편 대 숙주 질환을 억제하는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 가용성 CTLA4 돌연변이체가 도 8에 나타낸 바와 같이 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환한 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 방법.
  54. ATCC 번호 PTA-2104로 지칭된 핵산 분자에 의해 코딩된 가용성 CTLA4 돌연변이 분자.
  55. L104EA29YIg를 코딩하고 ATCC 번호 PTA-2104를 갖는 DNA 서열.
  56. 도 7의 아미노산 서열을 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자.
  57. 제56항의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 코딩하는 핵산 분자.
  58. 야생형 CTLA4보다 더 큰 결합성으로 CD86과 결합하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자.
  59. 야생형 CTLA4보다 CD80 및(또는) CD86과의 결합으로부터 더 느린 해리 속도를 갖는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자.
  60. 야생형 CTLA4보다 CD80 및(또는) CD86과의 결합으로부터 더 느린 결합 및 해리 속도를 갖는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자.
  61. ATCC 번호 PTA-2104로 지칭된 핵산 분자에 의해 코딩되고 돌연변이체 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 부분.
  62. 제61항에 있어서, Ig 테일을 추가로 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 부분.
  63. 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 코딩하고 ATCC 번호 PTA-2104를 가지며 돌연변이 CTLA4 분자의 세포외 도메인을 코딩하는 핵산 분자의 부분.
  64. 제63항에 있어서, Ig 테일을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 핵산 분자의 부분.
  65. 제약상 허용가능한 담체 및 제1항의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 포함하는 면역 시스템 질병을 치료하기 위한 제약 조성물.
  66. 제약상 허용가능한 담체 및 제9항의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 포함하는 면역 시스템 질병을 치료하기 위한 제약 조성물.
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