CN107987153A - 高亲和力的可溶性pd-1分子 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了高亲和力的可溶性PD‑1分子，具体地本发明提供了一种程序性死亡受体PD‑1分子，其在野生型PD‑1分子的基础上发生了突变，并且所述PD‑1分子与其配体PDL‑1分子的亲和力是野生型PD‑1分子与野生型PDL‑1分子的亲和力的至少2倍。同时，本发明的PD‑1分子能够有效地提高淋巴细胞的杀伤能力。另外，本发明还提供了编码本发明PD‑1分子的核酸，以及本发明PD‑1分子的复合物。本发明的PD‑1分子可以单独使用，也可与其他分子联用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及高亲和力的可溶性程序性死亡受体(Programmed Death-1,PD-1)分子能够高亲和地识别程序性死亡受体配体PDL-1(Programmed Death Ligand-1,PDL-1)分子。本发明涉及该分子的制备方法和用途。
背景技术
PD-1是在激活的T细胞和B细胞上表达的免疫抑制性受体，其配体为PDL-1或PDL-2。PD-1属于B7家族，是大小为50-55kD的Ig超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白；由胞外IgV区、跨膜区、胞内区三部分组成，通过结构和生化分析发现，由于缺少膜近端半胱氨酸残基，PD-1以单体存在(Xuewu Zhang and Almo,Immunity,2004,20,337–347)。PD-1与配体PDL-1相互作用，在免疫应答的负调控方面发挥着重要作用。许多肿瘤细胞系和肿瘤细胞高表达PDL-1分子(Konishi J et al.,Clin.Cancer Res.,2004，10(15):5094－5100)，其与淋巴细胞表面的PD-1分子结合后，削弱了机体的抗肿瘤免疫应答(Radziewicz H et al.,J Virol，2007,81(6):2545－2553)，从而导致肿瘤免疫逃逸的发生。研究发现在宫颈癌和肝癌中，有近半数的肿瘤浸润CD8+T细胞表达PD-1分子，其与肿瘤细胞表达的PDL-1结合后，可能导致CTL细胞的耗尽及凋亡(Dong H et al.,J Mol Med(Berl)，2003，81(5):281－287；Karim R etal.,Clin Cancer Res,2009,15(20):6341-6347；Zhao Q et al.,Eur J Immunol,2011,41(8):2314－2322)。
针对上述肿瘤免疫逃逸问题，阻断淋巴细胞表面的PD-1与肿瘤细胞表面的PDL-1的相互作用可使淋巴细胞的免疫性提高，因此，有助于由免疫系统清除肿瘤细胞。针对这一问题，研究人员已进行了大量研究。在侵袭性胰腺癌的鼠模型中，T.Nomi等(Clin.CancerRes.2007,13：2151-2157)证明阻断PD-1与PDL-1相互作用的治疗功效。本领域技术人员致力于研究PDL-1与PD-1的相互作用，以期找到提高淋巴细胞杀伤能力的有效途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对PDL-1分子具有较高亲和力的PD-1分子。
本发明的再一目的是提供一种上述高亲和力的PD-1分子的制备方法及用途。
在本发明的第一方面，提供了一种PD-1分子，所述PD-1分子在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中含有突变。
在另一优选例中，所述PD-1分子的氨基酸序列基于SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列，并且对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的突变或氨基酸残基的插入从而获得所述PD-1分子。
在另一优选例中，所述PD-1分子的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有至少90％(优选地，至少92％；更优选地，至少94％)的序列相同性。
在另一优选例中，所述PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的亲和力的至少2倍；优选地，至少10倍；更优选地，至少100倍；最优选地，至少200倍。
在另一优选例中，所述PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的亲和力的至少500倍；优选地，至少1000倍；更优选地，至少2000倍。
在另一优选例中，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点为30～60、和/或85～105位氨基酸残基中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
在另一优选例中，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点为31～37、40～48、56、和/或89～103位氨基酸残基中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点的数量为n，其中1≤n≤15；优选地，2≤n≤11；更优选地，2≤n≤6，如n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
在另一优选例中，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括31V、33N、35Y、37M、40S、41N、42Q、43T、48A、56P、89L、91G、92A、93I、95L、97P、98K、99A、100Q、101I、103E中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
在另一优选例中，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括91G，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
在另一优选例中，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括99A，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
在另一优选例中，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点还包括41N、42Q、43T、48A、95L、97P、98K、和/或100Q，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
在另一优选例中，突变后的PD-1分子包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：31T；33L；35N、或35M；37V、37L或37E；40A、或40T；41G、或41L；42N；43V、或43G；48G、或48S；56L；89M；91A、91S、91V或91T；92V、或92Y；93L；95W、或95F；97G；98R、98Y或98P；99P、99V、99I或99F；100S、或100W；101V；和103D；其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
在另一优选例中，突变后的PD-1分子包括91V、或91S。
在另一优选例中，突变后的PD-1分子还包括99I、或99P。
在另一优选例中，所述PD-1分子包括：91V、和99I；或
91S、98Y、和99I；或
41L、42N、43G、48S、91V、和99P；或
41G、43V、48G、91V、和99P,其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
在另一优选例中，所述PD-1分子的氨基酸序列选自SEQ ID NO.5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、或43。
在另一优选例中，所述PD-1分子是可溶的。
在另一优选例中，所述PD-1分子的C或N末端结合有偶联物。
在另一优选例中，与所述PD-1分子结合的偶联物为T细胞受体，优选地，所述T细胞受体为高亲和性T细胞受体。
本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括本发明第一方面所述的PD-1分子。
在另一优选例中，所述融合蛋白还包括IgG4。
本发明的第三方面，提供了一种多价PD-1复合物，所述多价PD-1复合物包含至少两个PD-1分子，并且其中的至少一个PD-1分子为本发明第一方面所述的PD-1分子；或者所述多价PD-1复合物包含至少一个本发明第二方面所述的融合蛋白。
本发明的第四方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的PD-1分子、本发明第二方面所述的融合蛋白、或本发明第三方面所述的多价PD-1复合物的核酸序列或其互补序列。
本发明第五方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第四方面所述的核酸分子。
本发明的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第五方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第四方面所述的核酸分子。
本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的PD-1分子、或本发明第二方面所述的融合蛋白、或本发明第三方面所述的PD-1复合物。
本发明的第八方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的PD-1分子、本发明第二方面所述的融合蛋白、或本发明第三方面所述的PD-1复合物、或本发明的第七方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述疾病为肿瘤。
本发明的第九方面，提供了本发明第一方面所述的PD-1分子、本发明第二方面所述的融合蛋白、或本发明第三方面所述的PD-1复合物的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。
本发明的第十方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的PD-1的方法，包括步骤：
(i)培养本发明第六方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的PD-1分子；
(ii)分离或纯化出所述的PD-1分子。
在本发明的第一方面，提供了一种PD-1分子，所述PD-1分子在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中含有突变。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为野生型PD-1蛋白纯化后的SDS-PAGE胶图.M，蛋白分子量Mark.
图2为野生型PDL-1分子与PD-1分子结合的BIAcore图谱。
图3为PD-1、L5B7识别H1299细胞表面PD-L1的流式检测，显示L5B7识别H1299细胞表面PDL-1的能力高于PD-1。注：A，anti-PDL-1抗体(2.5ul/样品)识别H1299细胞表面的PDL-1；B，不同浓度的PD-1、L5B7(浓度为0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml)识别H1299细胞表面的PDL-1的流式检测图，其中SA-PE的用量为0.5ul/样品；C，当浓度为0.08mg/ml时，对照组、PD-1、L5B7识别PDL-1的流式柱状图。
图4a为PD-1突变体及其突变体真核表达的示意图(PD-1-IgG4融合蛋白示意图，注：二聚体理论分子量为80kD左右，糖基化后实际分子量为125kD左右)。
图4b为48h小时后表达上清8％SDS-PAGE凝胶电泳图。注：M，蛋白分子量Mark。1、2，PD-1-IgG4、L5B7-IgG4的Non-Reducing电泳结果图；3、4，PD-1-IgG4、L5B7-IgG4的Reducing电泳结果图。
图4c为促进ImmTAC-IG4介导的杀伤的功能验证图。显示了PD-1-IgG4、L5B7-IgG4促进ImmTAC-IG4介导杀伤的LDH释放及CD25、CD107a流式检测。注：A，LDH释放，已经公式换算为杀伤比。B，当杀伤比为1:1时，杀伤反应体系中CD8T细胞的CD25、CD107a表达情况流式检测图，检测CD25、CD107a的流式抗体用量为2.5ul/样品。
具体实施方式
本发明通过广泛而深入的研究，意外地发现对PDL-1分子具有高亲和力的可溶性PD-1分子能够有效地提高淋巴细胞的杀伤能力。因此，本发明提供了一种对PDL-1的亲和力是野生型PD-1分子对PDL-1的亲和力至少两倍的可溶性高亲和力PD-1分子。
具体地，本发明中所述PD-1分子在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中含有突变。更具体地，所述PD-1分子的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有至少90％的序列相同性。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且其意图不是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
术语
野生型PD-1分子：本发明中所述的野生型PD-1分子是指野生型PD-1分子的胞外区，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.1，野生型PD-1)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTGGTGCAATTTCACTGGCTCCGAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.2)
PDL-1的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPEL(SEQ ID NO.3PDL-1)
TTTACGGTTACGGTTCCGAAAGACCTGTATGTGGTTGAATACGGCTCTAATATGACGATTGAATGCAAATTCCCGGTTGAAAAACAACTGGATCTGGCGGCCCTGATTGTGTATTGGGAAATGGAAGACAAAAACATCATCCAATTCGTGCATGGCGAAGAAGATCTGAAAGTTCAGCACAGCTCTTACCGTCAACGCGCACGTCTGCTGAAAGACCAGCTGAGCCTGGGCAATGCAGCTCTGCAGATCACGGATGTTAAACTGCAAGACGCCGGTGTCTATCGCTGCATGATTTCTTATGGCGGTGCAGACTACAAACGTATCACCGTCAAAGTGAACGCTCCGTACAACAAAATTAATCAGCGCATCCTGGTGGTTGATCCGGTTACGTCCGAACATGAACTGACCTGTCAAGCGGAAGGCTATCCGAAAGCCGAAGTCATTTGGACCAGTTCCGATCACCAGGTGCTGTCAGGTAAAACCACGACCACGAACTCGAAACGCGAAGAAAAACTGTTTAATGTCACGAGCACCCTGCGTATTAACACCACGACCAATGAAATCTTCTACTGCACCTTTCGTCGTCTGGACCCGGAAGAAAATCATACGGCGGAACTGGTTATCCCGGAACTG(SEQ ID NO.4)
PBMC：外周血单个核细胞(PBMC)是具有圆形胞核的血细胞，如淋巴细胞或单核细胞。这些血细胞是免疫系统抵抗感染并适应于入侵者的关键组分。淋巴细胞群体由T细胞(CD4和CD8阳性约75％)、B细胞和NK细胞(合并约25％)组成。
高亲和性T细胞受体：是指与其配体的亲和力较对应野生型T细胞受体与其配体亲和力提高的T细胞受体。例如，经过酵母筛选系统筛选得到稳定性提高的单链自身反应性鼠源2C TCR，其对配体的亲和力较野生型(9nM)提高了100倍左右(Holler,P.D.etal.Natl.Acad.Sci.USA.2000.97,5387-5392)。
肿瘤：指包括所有类型的癌细胞生长或致癌过程，转移性组织或恶性转化细胞、组织或器官，不管病理类型或侵染的阶段。肿瘤的实施例非限制性地包括：实体瘤，软组织瘤，和转移性病灶。实体瘤的实施例包括：不同器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤，肺鳞癌和癌症。例如：感染的前列腺，肺，乳房，淋巴，肠胃(例如：结肠)，和生殖泌尿道(例如：肾脏，上皮细胞)，咽头。肺鳞癌包括恶性肿瘤，例如，多数的结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺部的非小细胞癌，小肠癌和食道癌。上述癌症的转移性病变可同样用本发明的方法和组合物来治疗和预防。
药用载体：还称作赋形剂或稳定剂，使用剂量和浓度对其暴露的细胞或个体无毒。经常地，生理可接受载体是pH缓冲的水溶液。生理可接受载体的例子包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；络合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
发明详述
PD-1(Programmed Death-1)是在激活的T细胞和B细胞上表达的免疫抑制性受体,PDL-1为其配体。PD-1属于B7家族，是大小为50-55kD的Ig超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白；由胞外IgV区、跨膜区、胞内区三部分组成，通过结构和生化分析发现，由于缺少膜近端半胱氨酸残基，PD-1以单体存在。PD-1与其配体PDL-1(Programmed Death Ligand-1)相互作用，在免疫应答的负调控方面发挥着重要作用。本发明通过广泛而深入的研究，意外地发现对PDL-1分子具有高亲和力的可溶性PD-1分子能够有效地提高淋巴细胞的杀伤能力。因此，本发明提供了一种对PDL-1的亲和力是野生型PD-1分子对PDL-1的亲和力至少两倍的可溶性高亲和力PD-1分子。
可通过任何合适的方法测定上述PD-1分子与PDL-1的结合亲和力(与解离平衡常数KD成反比)和结合半衰期(表示为T1/2)。应了解，亲和力翻倍将导致KD减半。T1/2计算为In2除以解离速率(Koff)。因此，Koff翻倍会导致T1/2减半。优选采用相同的试验方案检测结合亲和力或结合半衰期数次，例如3次或更多，取结果的平均值。在优选的实施方式中，采用本发明实施例中的表面等离振子共振(BIAcore)方法进行这些检测。
该方法检测到本发明中野生型PD-1分子对PDL-1分子的解离平衡常数KD为2.815E-06M，其BIAcore结合图谱如图2所示。由于亲和力翻倍将导致KD减半，所以若检测到高亲和力PD-1分子对PDL-1分子的解离平衡常数KD为1.408E-06M，则说明该高亲和力PDL-1分子对PD-1分子的亲和力是野生型PD-1分子对PDL-1的亲和力的2倍。本领域技术人员熟知KD值单位间的换算关系，即1M＝1000μM，1μM＝1000nM，1nM＝1000pM。
在本发明的一个优选例中，利用本发明优选的测定亲和力的方式测得本发明PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的亲和力的至少2倍；优选地，至少10倍；更优选地，至少50倍；最优选地，至少100倍。
在另一优选例中，所述PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的亲和力的至少500倍；优选地，至少1000倍；更优选地，至少2000倍。
具体地，本发明高亲和力PD-1分子与PDL-1的亲和力KD≤1.408E-06M；优选地，1.0E-06M≤KD≤5.0E-06M；更优选地，1.0E-08M≤KD≤5.0E-07M；最优选地，1.0E-08M≤KD≤1.0E-11M。
本发明的高亲和力PD-1分子在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中含有一个或多个突变。具体地，所述PD-1分子的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有至少90％(优选地，至少92％；更优选地，至少94％)的序列相同性。
更具体地，本发明高亲和力PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括31V、33N、35Y、37M、40S、41N、42Q、43T、48A、56P、89L、91G、92A、93I、95L、97P、98K、99A、100Q、101I、103E中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
在另一优选例中，突变后的PD-1分子包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：31T；33L；35N、35M；37V、37L或37E；40A、40T；41G、41L；42N；43V、43G；48G、48S；56L；89M；91A、91S、91V或91T；92V、92Y；93L；95W、95F；97G；98R、98Y或98P；99P、99V、99I或99F；100S、100W；101V；103D其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
在另一优选例中，所述PD-1分子的氨基酸序列选自SEQ ID NO.5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、或43；
其编码核苷酸序列分别对应于：SEQ ID NO.6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、和44：
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLLWNRVSPANQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCAAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.5，L1B2)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTTCTGCTGTGGAATCGTGTGAGCCCGGCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTGCTGCAATTTCACTGGCTCCGAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.6，L1B2)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFTLLWMRLSPTNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.7，L1D3)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTACGCTGTTGTGGATGCGTCTTAGCCCGACTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTGGTGCAATTTCACTGGCTCCGAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.8，L1D3)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLLWMRESPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.9，L1G2)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTTCTGTTGTGGATGCGTGAGAGCCCGTCGAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTGGTGCAATTTCACTGGCTCCGAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.10，L1G2)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSGQGDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCSAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.11，L2B 12)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTGGGCAGGGGGATAAGCTGGCGGCGTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTAGTGCAATTTCACTGGCTCCGAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.12，L2B 12)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSGQVDKLAGFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCVAISLAPKPQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.13，L2F8)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTGGTCAGGTTGATAAGCTGGCGGGTTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTGTTGCAATTTCACTGGCTCCGAAACCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.14，L2F8)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSLNGDKLASFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCVAISLAPKPQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.15，L2F10)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTCTTAATGGTGATAAGCTGGCGTCGTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTGTTGCAATTTCACTGGCTCCGAAACCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.16，L2F10)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYMCVAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.17，L3A7)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACATGTGTGTTGCAATTTCACTGGCTCCGAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.18，L3A7)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQLGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCTAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.19，L3E3)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCTGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTACGGCTATTTCACTGGCTCCGAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.20，L3E3)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCAALSWAGKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.21，L4B3)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTGCTGCGCTGTCATGGGCTGGTAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.22，L4B3)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCSAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.23，L4C6)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTTCGGCTATTTCATTGGCTCCTAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.24，L4C6)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCVAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.25，L4C11)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTGTTGCTATTTCACTGGCTCCGAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.26，L4C11)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCSVISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.27，L4D7)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTTCGGTTATTTCATTGGCTCCTAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.28，L4D7)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCTAISWAGKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.29，L4E1)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTACTGCTATTTCATGGGCTGGGAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.30，L4E 1)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCTYISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.31，L4E8)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTACTTATATTTCACTGGCTCCTAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.32，L4E8)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCVYISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.33，L4F6)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTGTGTATATTTCACTTGCTCCGAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.34，L4F6)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCSVISFAGKAQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.35，L4H10)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTTCGGTGATTTCATTTGCTGGGAAAGCCCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.36，L4H10)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPRVSVKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.37，L5A4)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTGGTGCAATTTCACTGGCTCCGCGTGTTAGTGTTAAAGAGTCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.38，L5A4)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCSAISLAPYIQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.39，L5B7)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTAGTGCAATTTCACTGGCTCCGTATATTCAGATTAAAGAGTCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.40，L5B7)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPPFWIKDSLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.41，L5D1)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTGGTGCAATTTCACTGGCTCCGCCTTTTTGGATTAAAGATTCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.42，L5D1)
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCVAISLAPKIQIKESLRAELRVTERRAE(SEQ ID NO.43，L45)
CCTCCTACATTCTCCCCGGCACTGCTGGTTGTTACCGAAGGCGATAATGCGACCTTTACCTGTAGTTTCTCCAATACGAGCGAATCGTTTGTCCTGAACTGGTATCGTATGAGCCCGTCTAATCAGACCGATAAACTGGCGGCCTTCCCGGAAGATCGCTCTCAGCCGGGCCAAGACAGCCGTTTTCGCGTTACGCAACTGCCGAACGGTCGTGATTTCCATATGAGTGTGGTTCGCGCCCGTCGCAATGACTCCGGCACCTACCTGTGTGTTGCAATTTCACTGGCTCCGAAAATTCAAATCAAAGAATCGCTGCGTGCGGAACTGCGTGTTACCGAACGTCGTGCCGAA(SEQ ID NO.44，L45)
为获得可溶性的高亲和力PD-1分子，本发明所用的野生型PD-1分子不含跨膜区。因此，在本发明的一个优选例中，所述PD-1分子是可溶的。
可采用任何合适的方法进行突变，包括但不限于依据聚合酶链式反应(PCR)的那些、依据限制性酶的克隆或不依赖连接的克隆(LIC)方法。许多标准分子生物学教材详述了这些方法。聚合酶链式反应(PCR)诱变和依据限制性酶的克隆的更多细节可参见Sambrook和Russel l,(2001)分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)CSHL出版社。LIC方法的更多信息可见(Rashtchian,CurrOpinBiotechnol,1995,6(1):30-6)。
产生本发明的高亲和力PD-1分子的方法可以是但不限于从展示此类PD-1分子的噬菌体颗粒的多样性文库中筛选出对PD-1具有高亲和性的PD-1，如文献(Li,et al.,Nature Biotech,2005,23(3):349-354)中所述。
应理解，表达本发明野生型PD-1的基因或者表达略作修饰的本发明野生型PD-1的基因都可用来制备模板链。然后在编码该模板链的DNA中引入产生本发明的高亲和力PD-1所需的改变。
本发明的PD-1分子也可以多价复合体的形式提供。本发明的多价PD-1包含两个、三个、四个或更多个本发明PD-1分子相结合而形成的多聚物，如可以用IgG FC段制备二聚体，或p53的四聚结构域来产生四聚体，或多个本发明PD-1与另一分子结合而形成的复合物。
本发明的高亲和力PD-1分子可以单独使用，也可与偶联物以共价或其他方式结合，优选以共价方式结合。所述偶联物优选为T细胞受体，更优选地，所述T细胞受体为高亲和性T细胞受体。
本发明的高亲和力PD-1分子也可与其他分子联用，产生有效的协同作用。优选地，所述其他分子为ImmTAC或HATac。两种分子都能够重新定向T细胞，从而起到杀伤靶细胞的作用。所述ImmTAC分子是αβ恒定区之间含有人工链间二硫键的可溶性双链TCR分子与抗CD3抗体的融合分子，具体可参见文献(Joanne Oates，Bent K.Jakobsen,Novel bi-specificagents for targeted cancer thrapy.OncoImmunology,2013,2:2,e22891)。所述HATac分子是高亲和性T细胞活化芯(High Affinity T-cell activation core),其中一种形式可由疏水芯突变的α与β链可变域连接而成的可溶性单链TCR分子与抗CD3抗体的融合分子，所述可溶性单链TCR分子具体可参见专利文献WO2014/206304。
本发明还涉及编码本发明PD-1的核酸分子。本发明的核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。例如，编码本发明TCR的核酸序列可以与本发明附图中所示的核酸序列相同或是简并的变异体。举例说明“简并的变异体”的含义，如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.1的蛋白序列，但与SEQ ID NO.2的序列有差别的核酸序列。
本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明PD-1(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的核酸分子的载体，以及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有药学上可接受的载体以及本发明PD-1、或本发明PD-1复合物。
本发明还提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明PD-1、或本发明PD-1复合物、或本发明的药物组合物；尤其是，本发明的PD-1分子与其他分子联用，优选地，其他分子为ImmTAC或HATac。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)；在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。
本发明还包括对本发明PD-1略作修饰后的PD-1分子。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：本发明PD-1的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在本发明PD-1的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的PD-1分子。这种修饰可以通过将PD-1暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的PD-1。
本发明的PD-1或PD-1复合物可与药学上可接受的载体一起在药物组合物中提供。本发明的PD-1、多价PD-1复合物通常作为无菌药物组合物的一部分提供，所述组合物通常包括药学上可接受的载体。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于给予患者的所需方法)。其可采用单位剂型提供，通常在密封的容器中提供，可作为试剂盒的一部分提供。此类试剂盒(但非必需)包括使用说明书。其可包括多个所述单位剂型。此外，本发明的PD-1可以单用，也可与其他治疗剂结合或偶联在一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Pub.Co.,N.J.1991))中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药，优选为胃肠外包括皮下、肌肉内或静脉内。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有针剂、口服剂等。这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明PD-1可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明PD-1或PD-1复合物，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定，最终由医师决定合理的用量。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明获得了对PDL-1具有高亲和力的PD-1分子。
(2)本发明的高亲和力PD-1分子能够有效地提高淋巴细胞的杀伤能力。
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1 野生型PD-1的表达、复性和纯化
野生型PD-1的胞外氨基酸序列及核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和2，将携带野生型PD-1的胞外序列的目的基因经Nco Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，与经过Nco Ⅰ和Not Ⅰ双酶切的pET28a载体(Novagen)该载体经过优化后带有biotin tag标签)连接。连接产物转化至E.coli DH5α(Vazyme)，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑取阳性克隆进行PCR筛选，对阳性重组子进行测序，确定序列正确后抽提重组质粒转化至E.coli Rosetta菌株(TIANGEN)中,用于表达。
将上述含有重组质粒pET28a-PD-1的Rosetta菌落接种于含有卡那霉素的LB培养基中,37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.7mM，37℃继续培养4h。6000g离心15min收获细胞沉淀物，用BugbusterMaster Mix(Merck)裂解细胞沉淀物，6000g离心15min回收包涵体，再用Bugbuster(Merck)进行洗涤以除去细胞碎片和膜组分，6000g离心15min,收集包涵体。将包涵体溶解在缓冲液(50mMTris-HCl,200mMNaCl,2mM EDTA,6Mguanidine HCl,pH 8.1)中，高速离心去除不溶物，上清液用BCA法定量后进行分装，于-80℃保存备用。
向7mg溶解的PD-1包涵体蛋白中，加入2mL缓冲液(50mMTris-HCl,200mMNaCl,2mMEDTA,6M guanidine HCl,pH 8.1)，再加入DTT至终浓度为20mM,37℃处理1h。向100mL复性缓冲液(50mM HEPES,pH 7.5,500mM L-arginine,9mM glutathione,1mM glutathionedisulfide,24Mm NaCl,1mMKCl)中滴加上述处理后的PD-1混合液，4℃搅拌30min，然后将复性液装入截留量为3.5KD的纤维素膜透析袋,透析袋置于2L预冷的水中，4℃缓慢搅拌过夜。24小时后，将透析液换成2L预冷的缓冲液(10mMTris-HCl pH 8.5)，4℃继续透析24h，然后将透析液换成相同的新鲜缓冲液继续透析24小时，样品经0.45μm滤膜过滤，真空脱气后进样至阴离子交换柱(HiTrap Q HP,GE Healthcare).用10mMTris-HCl pH 8.5配制的0-1MNaCl线性梯度洗脱液纯化蛋白，收集的洗脱组分进行SDS-PAGE分析。根据分析结果，收集目标PD-1组分浓缩后进一步用凝胶过滤柱(Superdex 75 10/300,GE Healthcare)纯化，目标组分也进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示。
实施例2 结合表征
BIAcore分析
使用BIAcore T200实时分析系统检测野生型PD-1分子与PDL-1的结合活性。将抗链霉亲和素的抗体(GenScript)加入偶联缓冲液(10mM醋酸钠缓冲液，pH 4.77)，然后将抗体流过预先用EDC和NHS活化过的CM5芯片，使抗体固定在芯片表面，最后用乙醇胺的盐酸溶液封闭未反应的活化表面，完成偶联过程，偶联水平约为15，000RU。
使低浓度的链霉亲和素流过已包被抗体的芯片表面，然后将生物素化的PD-1流过检测通道，另一通道作为参比通道，再将0.05mM的生物素以10μL/min的流速流过芯片2min，封闭链霉亲和素剩余的结合位点。采用单循环动力学分析方法测定其亲和力，将PD-1用HEPES-EP缓冲液(10mM HEPES,150mMNaCl，3mM EDTA,0.005％P20，pH 7.4)稀释成几个不同的浓度，以30μL/min的流速，依次流过芯片表面，每次进样的结合时间为120s，最后一次进样结束后让其解离600s。每一轮测定结束后用pH 1.75的10mMGly-HCl再生芯片。利用BIAcore Evaluation软件计算动力学参数。
本实施例中所用的PDL-1的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示，其表达、复性和纯化过程与实施例1中野生型PDL-1的表达、复性和纯化过程相同。其生物素化的过程如下：
a.生物素化
用Millipore超滤管将纯化的PDL-1分子浓缩，同时将缓冲液置换为10mMTris pH8.0，然后加入生物素化试剂0.05MBicine pH 8.3、10mM ATP、10mMMgOAc、50μM D-Biotin、100μg/ml BirA酶(GST-BirA)，室温孵育混合物过夜，SDS-PAGE检测生物素化是否完全。
b.纯化生物素化后的复合物
用Millipore超滤管将生物素化标记后的PDL-1分子浓缩至500μl，采用凝胶过滤层析纯化生物素化的PDL-1，先用过滤过的PBS预平衡Superdex 7510/300凝胶过滤柱(GE通用电气公司)，再加载500μl浓缩过的生物素化PDL-1分子，然后用PBS以1ml/min流速洗脱,将收集到的组分进行SDS-PAGE分析，根据结果合并含有目标蛋白质的组分，用Millipore超滤管浓缩，BCA法(Thermo)测定蛋白质浓度，将生物素化的PDL-1分子分装保存在-80℃。
通过本实施例上述过程检测到野生型PD-1分子与PDL-1分子的结合亲和力的KD值为2.815E-06M，其BIAcore结合图谱如图2所示。
实施例3 高亲和力PD-1分子的产生
将实施例1中所述的野生型PD-1的胞外序列作为模板链，根据Li等(2005)NatureBiotech 23(3):349-354)描述的噬菌体展示和筛选方法，进行高亲和力PD-1的筛选。经过几轮筛选后的噬菌体文库均和PD-1有较强的结合信号，从中挑取单克隆，并进行序列分析。
按照实施例1中所述方法表达、复性和纯化本发明高亲和性PD-1分子，并按实施例2中所述方法测定其与PDL-1分子的亲和力。本发明中获得的高亲和力PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的亲和力至少2倍，其氨基酸序列及其与PDL-1分子的亲和力数值如下表1所示。
表1高亲和力克隆对PDL-1分子的BIAcore结果
实施例4 L5B7识别H1299细胞表面PD-L1的能力高于PD-1
Biacore结果显示，经过筛选后确实得到了亲和力提高的PD-1突变体，但这种亲和力的改变是否会影响其与生理条件下细胞表面PDL-1的结合仍需实验确认。因此，我们选用PDL-1表达阳性的H1299细胞，加入不同浓度的生物素化PD-1、L5B7蛋白，流式细胞术分析PD-1、L5B7识别细胞表面PDL-1的能力。
图3结果显示，随着加入的PD-1、L5B7蛋白浓度的升高，其对PDL-1的识别能力逐渐增强；在同一浓度条件下，L5B7蛋白识别PDL-1的能力高于PD-1，这种识别能力的改变可能是由于L5B7的亲和力较高所引起的，与生化结果一致。
实施例5 高亲和性PD-1分子双价融合蛋白产生
a表达载体构建
为了增加PD-1及其高亲和突变体在体内的稳定性及效价，真核表达采用与IgG4融合表达的形式。PD-1蛋白真核表达序列由苏州省心生物技术有限公司优化合成，与IgG4overlapPCR拼接完成后，通过EcoR Ⅰ、Nhe Ⅰ位点连接到pGZFUSE质粒载体上，并化转到Top 10菌株中(同时通过突变获得其它亲和性的突变体克隆)。按1:1000接种于200ml LB培养基中，37度过夜培养后，于第二天收菌，进行质粒大量提取。OD260/0D280测质粒浓度，调整为1mg/ml，分装后与-20度保存。大提质粒备用。融合表达蛋白示意图如图4a。
b蛋白表达
根据a构建真核表达载体，经测序正确后，融合蛋白表达使用293T贴壁细胞表达系统。转染前一天，铺对数生长期293T细胞于10cm培养皿中，第二天以质粒：lipo 2000＝1:2(体积比)的条件转染细胞，4h后更换新鲜的FreestyleTM293培养基，48h后取少量上清液跑SDS-PAGE鉴定表达情况如图4b。72小时后收上清，使用0.22μm的滤膜过滤后，稀释至20倍体积提前预冷的10mM Tris-Hcl中(PH＝8.5)，进行阴离子与分子筛纯化。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示：293T贴壁细胞表达的融合蛋白纯度很高。我们进一步纯化的目的有两个，一是置换蛋白所处溶液，防止在表达过程中或培养基本身存在的某些物质影响后续实验；二是浓缩蛋白，并进一步增加纯度，避免后续实验由于加入大量蛋白，或存在一些杂蛋白受到影响。
c融合蛋白功能鉴定
ImmTACs分子能够重定向T细胞特异性杀伤肿瘤细胞已在多篇研究中报道(Jakobsen,2013；Oates et al.,2015)。其基本原理是ImmTACs可以模拟T细胞活化发挥效应功能的关键信号，一方面通过其高亲和的特异性TCR识别肿瘤细胞表面的MHC-肽复合物，另一方面通过其anti-CD3抗体端激活T细胞活化的下游信号通路，从而定向T细胞特异性杀伤肿瘤细胞。因此，在本研究中评价PD-1/L5B7-IgG4融合蛋白的功能是通过该蛋白能否促进ImmTAC-IG4分子介导的PBMC对Mel624肿瘤细胞的杀伤过程来评价的图4c。
结果发现，当ImmTAC的浓度为10-9M，E:T＝5：1和1:1(PBMC为效应细胞，Mel62为靶细胞)时，PD-1-IgG4、L5B7-IgG4融合蛋白均可以促进ImmTAC分子定向PBMC杀伤肿瘤细胞的LDH释放，且L5B7-IgG4融合蛋白促进LDH释放高于PD-1-IgG4组；收集杀伤比为1:1时反应体系中的细胞进行流式检测发现PD-1-IgG4、L5B7-IgG4融合蛋白组CD8T细胞的CD25、CD107a的表达较未加蛋白组均上调，且L5B7-IgG4组上调的比例高于加PD-1-IgG4组，CD25从10.9％上调至13.2％，CD107a从16.9％上调至19.8％，进一步验证了LDH释放增加的结果。说明PD-1-IgG4、L5B7-IgG4融合蛋白能够促进ImmTAC分子介导的PBMC对Mel624肿瘤细胞的杀伤，与其他文献中可溶性PD-1能够促进肿瘤特异性T细胞杀伤的研究结果一致，增加其亲和性后该促进作用进一步加强。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120> 高亲和力的可溶性PD-1分子
<130> P2016-1601
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn
1 5 10 15
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
35 40 45
Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val
50 55 60
Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala
65 70 75 80
Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala
85 90 95
Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr
100 105 110
Glu Arg Arg Ala Glu
115
<210> 2
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cctcctacat tctccccggc actgctggtt gttaccgaag gcgataatgc gacctttacc 60
tgtagtttct ccaatacgag cgaatcgttt gtcctgaact ggtatcgtat gagcccgtct 120
aatcagaccg ataaactggc ggccttcccg gaagatcgct ctcagccggg ccaagacagc 180
cgttttcgcg ttacgcaact gccgaacggt cgtgatttcc atatgagtgt ggttcgcgcc 240
cgtcgcaatg actccggcac ctacctgtgt ggtgcaattt cactggctcc gaaagcccaa 300
atcaaagaat cgctgcgtgc ggaactgcgt gttaccgaac gtcgtgccga a 351
<210> 3
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
Pro Glu Leu
210
<210> 4
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tttacggtta cggttccgaa agacctgtat gtggttgaat acggctctaa tatgacgatt 60
gaatgcaaat tcccggttga aaaacaactg gatctggcgg ccctgattgt gtattgggaa 120
atggaagaca aaaacatcat ccaattcgtg catggcgaag aagatctgaa agttcagcac 180
agctcttacc gtcaacgcgc acgtctgctg aaagaccagc tgagcctggg caatgcagct 240
ctgcagatca cggatgttaa actgcaagac gccggtgtct atcgctgcat gatttcttat 300
ggcggtgcag actacaaacg tatcaccgtc aaagtgaacg ctccgtacaa caaaattaat 360
cagcgcatcc tggtggttga tccggttacg tccgaacatg aactgacctg tcaagcggaa 420
ggctatccga aagccgaagt catttggacc agttccgatc accaggtgct gtcaggtaaa 480
accacgacca cgaactcgaa acgcgaagaa aaactgttta atgtcacgag caccctgcgt 540
attaacacca cgaccaatga aatcttctac tgcacctttc gtcgtctgga cccggaagaa 600
aatcatacgg cggaactggt tatcccggaa ctg 633
<210> 5
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn
1 5 10 15
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
20 25 30
Leu Trp Asn Arg Val Ser Pro Ala Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
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cgtcgcaatg actccggcac ctacctgtgt tcggtgattt catttgctgg gaaagcccaa 300
atcaaagaat cgctgcgtgc ggaactgcgt gttaccgaac gtcgtgccga a 351
<210> 37
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 37
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1 5 10 15
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
35 40 45
Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val
50 55 60
Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala
65 70 75 80
Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala
85 90 95
Pro Arg Val Ser Val Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr
100 105 110
Glu Arg Arg Ala Glu
115
<210> 38
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cctcctacat tctccccggc actgctggtt gttaccgaag gcgataatgc gacctttacc 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
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cgtcgcaatg actccggcac ctacctgtgt ggtgcaattt cactggctcc gcctttttgg 300
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<211> 117
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<213> 人工序列
<400> 43
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Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
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cgtcgcaatg actccggcac ctacctgtgt gttgcaattt cactggctcc gaaaattcaa 300
atcaaagaat cgctgcgtgc ggaactgcgt gttaccgaac gtcgtgccga a 351
Claims (13)
1.一种PD-1分子，其特征在于，所述PD-1分子的氨基酸序列基于SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的突变从而获得所述PD-1分子；所述PD-1分子的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有至少90％的序列相同性；更优选地，所述PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的亲和力的至少2倍。
2.如权利要求1所述的PD-1分子，其特征在于，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点为第30～60、和/或85～105位氨基酸残基中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQID NO.1所示的编号。
3.如权利要求1所述的PD-1分子，其特征在于，突变的氨基酸残基位点的数量为n，其中1≤n≤15；优选地，2≤n≤11；更优选地，2≤n≤6，如n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
4.如权利要求1所述的PD-1分子，其特征在于所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括31V、33N、35Y、37M、40S、41N、42Q、43T、48A、56P、89L、91G、92A、93I、95L、97P、98K、99A、100Q、101I、和103E中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
5.如权利要求1所述的PD-1分子，其特征在于，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括91G，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号；和/或
所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括99A，其中氨基酸残基编号采用SEQ IDNO.1所示的编号；
优选地，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点还包括41N、42Q、43T、48A、95L、97P、98K、和/或100Q，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
更优选地，所述PD-1分子包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：31T；33L；35N、或35M；37V、37L或37E；40A、或40T；41G、或41L；42N；43V、或43G；48G、或48S；56L；89M；91A、91S、91V或91T；92V、或92Y；93L；95W、或95F；97G；98R、98Y或98P；99P、99V、99I或99F；100S、或100W；101V；和103D；其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号；
最优选地，所述PD-1分子的氨基酸序列选自SEQ ID NO.5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、或43。
6.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括权利要求1所述的PD-1分子。
7.一种多价PD-1复合物，其特征在于，所述多价PD-1复合物包含至少两个PD-1分子，并且其中的至少一个PD-1分子为权利要求1所述的PD-1分子；或者所述多价PD-1复合物包含至少一个权利要求6所述的融合蛋白。
8.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1所述的PD-1分子、权利要求6所述的融合蛋白、或权利要求7所述的多价PD-1复合物的核酸序列或其互补序列。
9.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求8所述的核酸分子。
10.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求9所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求8所述的核酸分子。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1所述的PD-1分子、或权利要求6所述的融合蛋白、或权利要求7所述的PD-1复合物。
12.权利要求1所述的PD-1分子、权利要求6所述的融合蛋白、或权利要求7所述的PD-1复合物的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。
13.一种制备权利要求1所述的PD-1的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)培养权利要求10所述的宿主细胞，从而表达权利要求1所述的PD-1分子；
(ii)分离或纯化出所述的PD-1分子。
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