KR20020089371A

KR20020089371A - 진단 및 치료용 정제된 ｃ형 간염 바이러스 외피 단백질

Info

Publication number: KR20020089371A
Application number: KR1020027011431A
Authority: KR
Inventors: 마어텐스게에르트; 보스만폰스; 부이제마리-앵게
Original assignee: 인노제네틱스 엔. 브이.
Priority date: 2001-01-11
Filing date: 2002-01-11
Publication date: 2002-11-29
Also published as: RU2313363C2; MXPA02008886A; RU2002121632A; IL151033A0; WO2002055548A8; CZ20032164A3; PL363175A1; EP1463753A2; CN1547588A; NO20024325D0; HUP0302416A2; AU2002238502B2; WO2002055548A2; WO2002055548A3; AU2002238502A1; BR0203518A; AU2002238502B9; CA2400643A1; TR200202169T1; AR032240A1

Abstract

본 발명은 재조합적으로 발현된 단백질을 분리하기 위해 형질전환된 숙주 세포를 용해시킬 때, 이황화결합 절단 또는 환원 단계가 이황화결합 절단제로써 수행되는 것을 특징으로 하는, E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 로 구성된 군으로부터 선택된 재조합 HCV 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 방법에 의해 분리된 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 조성물의 진단 및 치료용 적용에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 HCV 치료의 임상적인 유효성 및/또는 임상적인 결과를 예후 및 모니터링하기 위한 HCV E1 단백질 및 펩티드의 용도에 관한 것이다.

Description

진단 및 치료용 정제된 Ｃ형 간염 바이러스 외피 단백질 {PURIFIED HEPATITIS C VIRUS ENVELOPE PROTEINS FOR DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USE}

본 발명에 기재된 방법에 따라 세포 용해물(lysate)로부터 정제된 E2 단백질은 환자 혈청의 약 95%와 반응한다. 이 반응성은 CHO 세포로부터 분비된 E2에 대해 수득된 반응성과 유사하다 (Spaete 등, 1992). 그러나, E2의 세포내 발현된 형태는 높은 만노오스 탄수화물 모티프(motif)를 함유하기 때문에, 더욱 유사하게 천연 바이러스 외피 단백질을 닮을 수 있는 반면, CHO 세포로부터 분비된 E2 단백질은 추가로 갈락토오스 및 시알산 당 부분으로써 변형된다. E2의 아미노 말단 절반이 배큘로바이러스 시스템에서 발현될 경우에, 몇 환자군으로부터의 혈청의 단지 약 13 내지 21%가 검출될 수 있다 (Inoue 등, 1992). 이. 콜라이 (E. coli)로부터 E2의 발현 후에, HCV 혈청의 반응성은 더욱 낮아졌고, 14% (Yokosuka 등, 1992) 내지 17% (Mita 등, 1992)의 범위였다. Kohara 등 (1992) 및 Hsu 등 (1993)의 결과와 극히 대조적으로, HCV 혈청의 약 75% (및 만성 환자의 95%)는 본 발명의 정제된, 백시니아 (vaccinia)-발현된 재조합 E1 단백질을 사용할 경우 항-E1 양성이다. Kohara 등은 백시니아-바이러스 발현된 E1 단백질을 사용하고, 환자의 7 내지 23%에서 항-E1 항체를 검출한 반면, Hsu 등은 배큘로바이러스-발현된 E1을 사용하여 단지 14/50 (28%) 혈청을 검출하였다.

상기 결과는 양호한 발현 시스템뿐만 아니라 양호한 정제 절차가 외피 단백질이 환자 혈청과의 높은 반응성에 도달하는데 필요하다는 것을 보여준다. 이것은 단백질의 천연 폴딩 (folding)의 보존을 보증하는 본 발명의 적당한 발현 시스템 및/또는 정제 절차 및 오염 단백질의 제거를 보증하고, 입체형태 및 HCV 외피 단백질의 반응성을 보존하는 본 발명의 정제 절차를 사용하여 수득될 수 있다. 진단 스크리닝 분석에 필요한 정제된 HCV 외피 단백질의 양은 년간 그램의 범위이다. 백신 목적으로, 더욱 많은 양의 외피 단백질이 필요할 수 있다. 그러므로, 백시니아 바이러스 시스템이 최상의 발현 구축물을 선발하고, 제한된 스케일업에 이용될 수 있고, 높은 만노오스 탄수화물을 함유한 단일 또는 특정 올리고머외피 단백질의 대량 발현 및 정제를 몇 가지 효모 균주로부터 발현할 경우에 성취할 수 있다. 예를 들면 B형 간염의 경우, 포유동물 세포로부터 HBsAg의 제조는 효모에 의해 유도된 B형 간염 백신과 비교하여 더욱 비쌌다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 재조합 단백질이 집합체(aggregate) 대신에 오염 물질이 없는 단일 또는 특정 올리고머 재조합 단백질로서 진단 및 백신 목적으로 직접 사용가능하도록, 재조합적으로 발현된 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 새로운 정제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 HCV의 E1 및/또는 E2 도메인 유래의 입체형태적 항원결정부를 함유한 정제된 (단일 또는 특정 올리고머) 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 당단백질을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 재조합적으로 발현하는 신규 재조합 벡터 구축물뿐만 아니라, 상기 벡터 구축물로써 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 재조합 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 제조하고, 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 본 발명의 재조합 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 진단 및 면역원성 용도뿐만 아니라, 본 발명의 재조합 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질 중 어느 하나를 함유하는 진단 용도, 백신 또는 치료용 키트를 제공하는 것이다.

추가로 본 발명의 목적은 E1, E2, 및/또는 E1/E2 단백질, 또는 이의 적당한 부분의 신규 용도, HCV 감염으로 고생하는 환자의 치료 (예를 들면, 인터페론을 이용)에 대한 반응을 모니터링/예후를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 HCV 스크리닝 및 확진 항체 시험에서 본 발명의 재조합 E1, E2, 및/또는 E1/E2 단백질의 용도를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 HCV 감염의 진단 및 항체를 증가시키는데 이용될 수 있는 E1 및/또는 E2 펩티드를 제공하는 것이다. 그러한 펩티드는 또한 인간 단클론 항체를 분리하기 위해 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 재조합 단백질에 포함된 펩티드 또는 입체형태적 항원결정부에 포함된, E1 및/또는 E2 항원결정부와 특이적으로 반응하는, 단클론 항체, 더욱 구체적으로 인간 단클론 항체 또는 인간화된 (humanized) 마우스 단클론 항체를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 HCV 항원 검출용 또는 만성 HCV 감염의 치료용 항-E1 또는 항-E2 단클론 항체의 가능한 용도를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 HCV 감염으로 고생하는 환자의 치료 (예를 들면, 인터페론을 이용)에 대한 반응의 모니터링/예후용 또는 질병의 결과의 모니터링/예후용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 모든 목적은 하기에 설명된 구현예에 의해 만족될 것으로 생각된다.

정의

하기 정의는 본 발명에 사용된 상이한 용어 및 표현을 설명하기 위해 이용된다.

용어 "C형 간염 바이러스 단일 외피 단백질"은 E1 또는 E2 부위의 하나 이상의 HCV 항원결정부를 정의하는 아미노산 서열 (및/또는 아미노산 유사체)를 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 유사체 (예를 들면, 미모토프 (mimotope))를 말한다. 광의의 상기 단일 외피 단백질은 재조합적으로 발현된 외피 단백질의 단량체 또는 동형-올리고머 형태일 수 있다. 전형적으로, 항원결정부를 정의한 서열은 HCV의 E1 또는 E2 부위의 아미노산 서열에 해당한다 (동일하게 또는 항원결정부를 파괴하지 않는 천연 아미노산 잔기의 유사체의 치환을 통해). 일반적으로, 항원결정부를 정의하는 서열은 길이가 3 개 이상의 아미노산, 더욱 전형적으로 5 개 이상의 아미노산, 더욱 전형적으로 8 개 이상의 아미노산, 더 더욱 전형적으로 10 개 이상의 아미노산일 것이다. 입체형태적 항원결정부에 대해, 항원결정부를 정의하는 서열의 길이는 폭넓은 변이가 있을 수 있는데, 이는 이들 항원결정부가 항원의 3차원적인 모양 (예를 들면, 폴딩 (folding))에 의해 형성된다고 믿기 때문이다. 그리하여, 항원결정부를 정의하는 아미노산은 비교적 수가 적을 수 있으나, 폴딩을 통해 올바른 항원결정부 입체형태가 되는 분자의 길이를 따라 폭넓게 분산된다. 항원결정부를 정의하는 잔기 사이의 항원 부분은 항원결정부의 입체형태적 구조에 결정적이지 않을 수 있다. 예를 들면, 상기 개재 서열 (intervening sequence)의 삭제 또는 치환은 항원결정부 입체형태에 결정적인 서열 (예를 들면, 이황화결합, 글리코실화 자리 등에 관련된 시스테인)이 유지된다면,입체형태적 항원결정부에 영향을 주지 않을 수 있다. 입체형태적 항원결정부는 또한 동형올리고머 또는 이형올리고머의 서브유닛의 2 개 이상의 필수 부위에 의해 형성될 수 있다.

본 발명의 HCV 항원은 HCV의 E1 및/또는 E2 (외피) 도메인 유래의 입체형태적 항원결정부를 포함한다. 바이러스 외피 단백질에 해당한다고 믿어지는, E1 도메인은 현재 HCV 다중단백질의 아미노산 192-383에 놓이는 것으로 평가된다 (Hijikata 등, 1991). 포유동물 시스템 (글리코실화됨)에서 발현시킬 경우, SDS-PAGE를 통해 측정된 바와 같이 대략 35kDa의 분자량을 가지는 것으로 믿어진다. 이전에 NS1으로 일컬어진 E2 단백질은 HCV 다중단백질의 아미노산 384-809 또는 384-746 (Grakoui 등, 1993)에 놓이며, 또한 외피 단백질인 것으로 믿어진다. 백시니아 시스템 (글리코실화됨)에서 발현할 경우, 약 72kDa의 외관상의 겔 분자량을 가지는 것으로 믿어진다. 상기 단백질 종말점은 근사치인 것으로 이해된다 (예를 들면, E2의 카르복시 말단은 730-820 아미노산 부위의 어딘가에 놓일 수 있는데, 예를 들면, 아미노산 730, 735, 740, 742, 744, 745, 바람직하게는 746, 747, 748, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 809, 81O, 820에서 끝난다). E2 단백질은 또한 E1, P7 (aa 747-809), NS2 (aa 810-1026), NS4A (aa 1658-1711) 또는 NS4B (aa 1712-1972)와 함께 발현될 수 있다. 상기 다른 HCV 단백질과 함께 발현되는 것은 올바른 단백질 폴딩을 수득하는데 중요할 수 있다.

본 발명의 실시예 섹션에서 사용된 분리종(isolate)은 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 유형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로부터의 임의의HCV 분리종 또는 HCV의 임의의 다른 신규 유전형은 본 발명의 실시를 위한 E1 및/또는 E2 서열의 적당한 공급원이라고 이해된다.

본 발명에 사용된 E1 및 E2 항원은 전체 길이 바이러스 단백질, 실질적으로 이의 전체 길이 버전, 또는 이의 기능성 절편일 수 있다 (예를 들면, 항원결정부의 형성 또는 유지에 본질적인 서열이 누락되지 않은 절편). 더욱이, 본 발명의 HCV 항원은 또한 관심 있는 입체형태적 항원결정부의 형성을 차단하거나 막지 않는 다른 서열을 포함할 수 있다. 입체형태적 항원결정부의 존재 또는 부재는 관심 있는 항원을 항체 (입체형태적 항원결정부에 대한 다클론 혈청 또는 단클론 혈청)로써 스크리닝하고, 이의 반응성을 (존재한다면) 단지 선형 항원결정부를 보유하는 항원의 변성된 버전의 것과 비교함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 다클론 항체를 이용한 그러한 스크리닝에서, 다클론 혈청을 변성된 항원을 이용하여 먼저 흡착시키고, 관심 있는 항원에 항체를 보유하는지를 조사하는 것이 유리할 수 있다.

본 발명의 HCV 항원은 관심 있는 항원결정부를 제공하는 임의의 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 포유동물 또는 곤충 세포에서 재조합 세포내 발현은 천연 HCV 항원의 경우와 같이, '천연' 입체형태로 글리코실화된 E1 및/또는 E2 항원을 제공하는 바람직한 방법이다. 효모 세포 및 돌연변이 효모 균주 (예를 들면, mnn 9 돌연변이체 (Kniskern 등, 1994) 또는 바나데이트 저항성 선발에 의해 유도된 글리코실화 돌연변이체 (Ballou 등, 1991)가 분비된 높은 만노오스 유형 당의 제조에 이상적으로 적합할 수 있는 반면; 포유동물 세포로부터 분비된 단백질은 특정 진단 또는 백신 적용에 바람직하지 않을 수 있는 갈락토오스또는 시알산을 포함한 변형물을 포함할 수 있다. 그러나, 단백질에 대해 공지된 바와 같이, 다른 재조합 숙주 (예를 들면, 이. 콜라이)에서 항원을 발현시키고, 회수 후에 단백질을 재생시키는 것이 또한 특정 적용에 대해 가능하고 충분할 수 있다.

용어 '융합 폴리펩티드'는 HCV 항원이, 사슬이 자연에서 존재하지 않는, 아미노산의 단일 연속 사슬의 부분인 폴리펩티드를 의미한다. HCV 항원은 펩티드 결합에 의해 직접 서로 연결되거나 개재 아미노산 서열에 의해 분리될 수 있다. 융합 폴리펩티드는 또한 HCV에 대한 외래의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

용어 '고체상'은 개개의 HCV 항원 또는 HCV 항원으로 구성된 융합 폴리펩티드가 공유적으로 또는 소수성 흡착과 같은 비공유 수단에 의해 결합되는 고체 바디를 의미한다.

용어 '생물학적 시료'는 통상적으로 개인에 의해 생산된 항체, 더욱 구체적으로 HCV에 대한 항체를 포함하는 포유동물 (예를 들면, 유인원, 인간)의 액체 또는 조직을 의미한다. 액체 또는 조직은 또한 HCV 항원을 포함할 수 있다. 그러한 성분은 당업계에 공지되어 있고, 제한되지 않고, 혈액, 혈장, 혈청, 요, 척수액, 림프액, 호흡기관의 분비물, 장 또는 비뇨생식기관, 눈물, 침, 젖, 백혈구 및 골수종을 포함한다. 신체 성분은 생물학적 액체를 포함한다. 용어 '생물학적 액체"는 생물체로부터 수득된 액체를 말한다. 일부 생물학적 액체는 다른 산물, 예를 들면, 응고인자 (예를 들면, 인자 VIII;C), 혈청 알부민, 성장 호르몬 등의 공급원으로서 사용된다. 그러한 경우에, 생물학적 액체의 공급원이HCV와 같은 바이러스에 의한 오염이 없어야 하는 것이 중요하다.

용어 '면역학적으로 반응성인'은 의문의 항원이 HCV 감염 개인 유래의 신체 성분에 존재하는 항-HCV 항체와 특이적으로 반응하는 것을 의미한다.

용어 '면역 복합체'는 항체가 항원상의 항원결정부에 결합할 때 형성되는 조합물을 의미한다.

본원에 사용된 'E1'은 HCV 다중단백질의 처음 400 개의 아미노산 내에서 발현된 단백질 또는 폴리펩티드를 말하며, 때로는 E, ENV 또는 S 단백질로 일컬어진다. 이의 천연 형태로 그것은 막과 강하게 연결되어 발견되는 35kDa 당단백질이다. 가장 천연적인 HCV 계통에서, E1 단백질은 C (코아) 단백질에 이어 바이러스 다중단백질에서 코딩된다. E1 단백질은 전체 길이 다중단백질의 대략 아미노산 (aa) 192 내지 약 aa 383에 이른다.

본원에 사용된 용어 'E1'은 또한 천연 E1과 면역학적으로 교차 반응성인 유사체 및 절단된 형태를 포함하고, 유전형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 임의의 다른 신규로 확인된 HCV 유형 또는 서브유형의 E1 단백질을 포함한다.

본원에 사용된 'E2'는 HCV 다중단백질의 처음 900 개의 아미노산 내에서 발현된 단백질 또는 폴리펩티드를 말하며, 때로는 NS1 단백질로 일컬어진다. 이의 천연 형태로 그것은 막과 강하게 연결되어 발견되는 72kDa 당단백질이다. 가장 천연적인 HCV 계통에서, E2 단백질은 E1 단백질에 이어 바이러스 다중단백질에서 코딩된다. E2 단백질은 대략 아미노산 위치 384 내지 아미노산 위치 746에 이르고, E2의 다른 형태는 아미노산 위치 809에 이른다. 본원에 사용된 용어 'E2'는 또한 천연 E2와 면역학적으로 교차 반응성인 유사체 및 절단된 형태를 포함한다. 예를 들면, 코돈 383 내지 384 사이에 복수 코돈의 삽입뿐만 아니라, 아미노산 384-387의 삭제는 Kato 등 (1992)에 의해 보고되었다.

본원에 사용된 'E1/E2'는 하나 이상의 E1 성분 및 하나 이상의 E2 성분을 포함하는 외피 단백질의 올리고머 형태를 말한다.

용어 '특정 올리고머' E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 외피 단백질은 집합체가 아닌 재조합적으로 발현된 E1 및/또는 E2 외피 단백질의 모든 가능한 올리고머 형태를 말한다. E1 및/또는 E2 특정 올리고머 외피 단백질은 또한 동형-올리고머 E1 또는 E2 외피 단백질로서 일컬어진다 (하기 참조).

용어 '단일 또는 특정 올리고머' E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 외피 단백질은 단일 단량체 E1 또는 E2 단백질 (엄격한 의미에서의 단일)뿐만 아니라 특정 올리고머 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 재조합적으로 발현된 단백질을 말한다. 본 발명에 따른 상기 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질은 추가로 하기 식에 의해 정의될 수 있다:

(E1)_x(E2)_y

(식 중, x는 0 내지 100 사이의 수이고, y는 0 내지 100 사이의 수일 수 있는데, 단, x 및 y는 둘 다 0 이 아니다).

x가 1이고 y가 0인 경우에, 상기 외피 단백질은 단량체 E1을 포함한다.

본원에 사용된 용어 '동형-올리고머'는 하나 이상의 E1 또는 E2 단량체를 포함한 E1 및/또는 E2의 복합체, 예를 들면, E1/E1 이합체, E1/E1/E1 삼합체 또는 E1/E1/E1/E1 사합체 및 E2/E2 이합체, E2/E2/E2 삼합체 또는 E2/E2/E2/E2 사합체를 말한다. E1 오합체 및 육합체, E2 오합체 및 육합체 또는 E1 또는 E2의 임의의 고차원 동형-올리고머는 모두 상기 정의의 범주내의 '동형-올리고머'이다. 올리고머는 예를 들면 본 출원인에 의해 WO 94/25601 및 유럽특허출원 제 94870166.9호로 공개된 국제출원에 기재된 것을 포함한, C형 간염 바이러스의 상이한 유형 또는 서브유형으로부터 수득된 E1 또는 E2의 하나, 둘, 또는 수개의 상이한 단량체를 포함할 수 있다. 그러한 혼합 올리고머는 여전히 본 발명의 범주내의 동형-올리고머이고, 더욱 보편적인 HCV의 진단, 예방 또는 치료를 가능하게 할 수 있다.

본원의 단백질에 적용된 용어 '정제된'은 원하는 단백질이 조성물에서 총 단백질 성분의 35% 이상을 함유하는 조성물을 말한다. 원하는 단백질은 바람직하게는 총 단백질 성분의 40% 이상, 더욱 바람직하게는 약 50% 이상, 더욱 바람직하게는 약 60% 이상, 여전히 더욱 바람직하게는 약 70% 이상, 더 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상을 함유한다. 조성물은 본원에 사용된 순도(%)의 결정에 영향을 주지 않고, 다른 성분, 예를 들면, 탄수화물, 염, 지질, 용매 등을 포함할 수 있다. '분리된' HCV 단백질은 35% 이상 순수한 HCV 단백질 조성물을 말한다.

용어 '본질적으로 정제된 단백질'은 이들이 시험관 내 진단 방법 및 치료 화합물로서 사용될 수 있도록 정제된 단백질을 말한다. 상기 단백질은 실질적으로 세포 단백질, 벡터-유도된 단백질 또는 다른 HCV 바이러스 성분이 없다. 통상 상기 단백질은 균일하게 정제된다 (80% 이상 순수, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 97%, 더욱 바람직하게는 98%, 더욱 바람직하게는 99%, 더 더욱 바람직하게는 99.5%, 가장 바람직하게는 오염 단백질이 SDS-PAGE 및 은 염색과 같은 종래의 방법에 의해 검출되지 않아야 한다).

본 발명의 내용 내에 사용된 용어 '재조합적으로 발현된'은 본 발명의 단백질이 원핵세포, 또는 하등 또는 고등 진핵세포에서 하기에 상세히 기재된 재조합 발현 방법에 의해 제조된 사실을 말한다.

용어 '하등 진핵세포'는 효모, 곰팡이 등과 같은 숙주 세포를 말한다. 하등 진핵세포는 일반적으로 (그러나 반드시는 아님) 단세포이다. 바람직한 하등 진핵세포는 효모, 특히 사카로마이세스 (Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharamvces), 클루이베로마이세스 (Kluveromyces), 피키아 (Pichia) (예를 들면, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)), 한세눌라 (Hansenula) (예를 들면, 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha)), 야로위아 (Yarowia), 쉬바니오마이세스 (Schwaniomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomvces) 등내의 종이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 에스. 칼스베르겐시스 (S. carlsbergensis) 및 케이. 락티스 (K. lactis)가 가장 흔히 사용되는 효모 숙주이고, 편리한 곰팡이 숙주이다.

용어 '원핵세포'는 이. 콜라이 (E.coli), 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코커스 (Lactococcus), 살모넬라 (Salmonella), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 또는 스트렙토마이세스 (Streotomyces)와 같은 숙주를 말한다. 또한 상기 숙주는 본 발명내에 고려된다.

용어 '고등 진핵세포'는 고등 동물, 예를 들면, 포유동물, 파충류, 곤충 등으로부터 유래된 숙주 세포를 말한다. 현재 바람직한 고등 진핵 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 (예를 들면, CHO), 원숭이 (예를 들면, COS 및 베로 세포 (Vero cell)), 아기 햄스터 신장 (BHK), 돼지 신장 (PK15), 토끼 신장 13 세포 (RK13), 인간 골육종 세포주 143 B, 인간 세포주 HeLa 및 Hep G2와 같은 인간 간암 세포주, 및 곤충 세포주 (예를 들면, 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda))로부터 유래된다. 숙주 세포는 현탁액 또는 플라스크 배양액, 조직 배양액, 기관 배양액 등으로 제공될 수 있다. 대안적으로 숙주 세포는 또한 트랜스제닉 동물일 수 있다.

용어 '폴리펩티드'는 아미노산 중합체를 말하고, 산물의 특정 길이를 말하지 않아; 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의내에 포함된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 발현후 변형, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 말하지 않거나 배제하지 않는다. 예를 들면, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들면, 비천연 아미노산, PNA 등을 포함)를 포함한 폴리펩티드, 치환된 연결을 가진 폴리펩티드뿐만 아니라, 천연적으로 발생하는, 그리고 비천연적으로 발생하는, 당업계에 공지된 다른 변형물이 정의에 포함된다.

용어 '재조합 폴리뉴클레오티드 또는 핵산'은 원래 또는 조작에 의해, (1) 자연과 연관된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 부분과 연관되지 않고, (2) 천연적으로 연결된 것과 다른 폴리뉴클레오티드에 연결되거나, (3) 자연에서 발생하지 않는 게놈, cDNA, 반합성, 또는 합성 유래의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 말한다.

용어 '재조합 숙주 세포', '숙주 세포', '세포', 세포주', '세포 배양' 및 단세포 실체로서 배양된 미생물 또는 고등 진핵세포주를 나타내는 다른 그러한 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전달 폴리뉴클레오티드의 수용체로서 사용될 수 있거나 사용된 세포를 말하며, 트랜스펙션된 원래 세포의 자손을 포함한다. 단일 부모 세포의 자손은 천연, 우연적인, 또는 고의의 돌연변이로 인해, 원래의 부모와 형태 또는 게놈 또는 전체 DNA 보체에 있어서 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있다고 이해된다.

용어 '레플리콘(replicon)'은 세포내의 폴리뉴클레오티드 복제의 자율적 단위; 즉, 자기 조절하에 복제할 수 있는 단위로서 행동하는 임의의 유전 원소, 예를 들면, 플라스미드, 염색체, 바이러스, 코스미드 등이다.

용어 '벡터'는 원하는 개방형 해독틀의 복제 및/또는 발현을 제공하는 서열을 추가로 포함하는 레플리콘이다.

용어 '조절 서열'은 연결되는 코딩 서열을 발현시키기 위해 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 그러한 조절 서열의 성질은 숙주 생물에 따라 상이한데; 원핵세포에서는, 그러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 터미네이터를 포함하고; 진핵세포에서는, 일반적으로, 그러한 조절 서열은 프로모터, 터미네이터 및 일부의 경우에, 인핸서를 포함한다. 용어 '조절 서열'은 최소한 이의 존재가 발현에 필요한 모든 성분을 포함할 의도이며, 또한 이의 존재가 유리한 부가적인 성분, 예를 들면, 분비를 조절하는 리더(leader) 서열을 포함할 수 있다.

용어 '프로모터'는 mRNA 생산이 인접한 구조 유전자의 정상적인 전사 개시 부위에서 시작하도록 DNA 주형에 RNA 중합효소의 결합을 허용하는 일치 서열 (consensus sequence)로 구성된 핵산 서열이다.

표현 '작동가능하게 연결된'은 기재된 성분이 이들의 의도한 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병렬을 말한다. 코딩 서열에 '작동가능하게 연결된' 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 상용성인 조건하에 달성되는 그러한 방식으로 연결된다.

'개방형 해독틀' (ORF)은 폴리펩티드를 코딩하고, 정지 코돈을 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드 서열 부위이며; 이 부위는 코딩 서열의 부분 또는 전체 코딩 서열을 나타낼 수 있다.

'코딩 서열'은 적당한 조절 서열의 조절하에 위치할 때, mRNA 로 전사되고/전사되거나 폴리펩티드로 번역되는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5'-말단의 번역 개시 코돈 및 3'-말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 이에 제한되지 않고, mRNA, DNA (cDNA를 포함) 및 재조합 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본원에 사용된, '항원결정부' 또는 '항원결정자'는 면역반응성인 아미노산 서열을 의미한다. 일반적으로 항원결정부는 3 개 내지 4 개 이상의 아미노산, 더욱 통상적으로, 5 개 이상 또는 6 개 이상의 아미노산으로 구성되고, 때로는 항원결정부는 약 7 내지 8 개, 또는 약 10 개의 아미노산으로 구성된다. 본원에 사용된, 표시된 폴리펩티드의 항원결정부는 표시된 폴리펩티드 및 이의 면역학적 동등물의 항원결정부와 동일한 아미노산 서열을 갖는 항원결정부를 나타낸다. 그러한 동등물은 또한 계통, 서브유형 (=유전형), 또는 예를 들면, 현재 공지된 서열 또는 유전형 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k, 4l, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a, 8b, 9a, 9b, 1Oa, 또는 임의의 다른 신규로 정의된 HCV (서브)유형에 속하는 계통의 유형(군)-특이적 변이체를 포함한다. 항원결정부를 구성하는 아미노산은 선형 서열의 부분일 필요가 없고, 임의의 수의 아미노산에 의해 분산될 수 있어, 입체형태적 항원결정부를 형성할 수 있다는 것을 이해해야 한다.

용어 '면역원성'은 보조제의 존재 또는 부재하에, 단독으로 또는 담체와 연결될 경우에, 체액성 및/또는 세포성 반응을 야기하는 물질의 능력을 말한다. '중화'는 감염성 물질의 감염성을 부분적으로 또는 전적으로 차단하는 면역 반응을 말한다. '백신'은 부분적으로 또는 완전히 HCV에 대한 보호를 유도할 수 있는 면역원성 조성물이다. 백신은 또한 개인의 치료에 유용할 수 있는데, 이 경우에 그것은 치료용 백신으로 불린다.

용어 '치료용'은 HCV 감염을 치료할 수 있는 조성물을 말한다.

용어 '유효량'은 투여된 개인에게서 면역원성 반응을 유도하거나, 그렇지 않으면 이의 의도된 시스템에서 검출가능하게 면역반응을 하기에 (예를 들면, 면역분석법) 충분한 항원결정부를 갖는 폴리펩티드의 양을 말한다. 바람직하게는, 유효량은 상기에 정의된 바와 같이, 치료하기에 충분하다. 필요한 정확한 양은 적용에 따라 변할 것이다. 백신 적용 또는 다클론 항혈청/항체의 생성을 위해, 예를 들면, 유효량은 종, 나이 및 개인의 일반적인 상태, 치료될 상태의 심각성, 선택된 특정 폴리펩티드 및 이의 투여 방식 등에 의존하여 변할 것이다. 유효량은 비교적 크고, 중요하지 않은 범위내에 발견될 것으로 또한 믿고 있다. 적당한 유효량은 단지 통상적인 실험을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. HCV 질병의 예방용 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질의 바람직한 범위는 0.01 내지 100㎍/투여, 바람직하게는 0.1 내지 50㎍/투여이다. HCV 질병에 대한 충분한 면역 반응 및 이은 보호를 성취하기 위해 개인당 몇 번의 투여가 필요할 수 있다.

본 발명은 재조합 단백질 발현, 재조합 단백질의 정제, 합성 펩티드, HCV 감염의 진단, HCV 감염에 대한 예방 치료의 일반 분야 및 만성 간염을 가진 개인의 치료의 임상적 효율성의 예후 (豫後)/모니터링, 또는 천연 질병의 예후/모니터링에 관한 것이다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 C형 간염 바이러스 외피 단백질의 정제 방법, 진단에의 용도, 본 발명에 기재된 방법에 따라 정제된 HCV 외피 단백질의 예방 또는 치료, 질병의 모니터링, 및/또는 질병의 진단, 및/또는 질병의 치료에 대한 분석에서 단일 또는 특정 올리고머 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 외피 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 E1 및/또는 E2 외피 단백질의 항원결정부 및 이의 단클론 항체뿐만 아니라 진단, 예방 또는 치료에의 용도에 관한 것이다.

도 1: 플라스미드 pgpt ATA 18의 제한효소 지도

도 2: 플라스미드 pgs ATA 18의 제한효소 지도

도 3: 플라스미드 pMS66의 제한효소 지도

도 4: 플라스미드 pv HCV-11A의 제한효소 지도

도 5: IFN 치료에 대한 무응답자들의 항-E1 수준

도 6: IFN 치료에 대한 응답자들의 항-E1 수준

도 7: IFN 치료에 대한 완전한 반응을 보이는 환자의 항-E1 수준

도 8: IFN 치료에 대한 불완전한 응답자들의 항-E1 수준

도 9: IFN 치료에 대한 무응답자들의 항-E2 수준

도 10: IFN 치료에 대한 응답자들의 항-E2 수준

도 11: IFN 치료에 대한 불완전한 응답자들의 항-E2 수준

도 12: IFN 치료에 대한 완전한 응답자들의 항-E2 수준

도 13: 펩티드와 경쟁하는 인간 항-E1 반응성

도 14: 항-E1 단클론 항체와 펩티드의 반응성의 경쟁

도 15: IFN 치료에 대한 무응답자들의 항-E1 (항원결정부 1) 수준

도 16: IFN 치료에 대한 응답자들의 항-E1 (항원결정부 1) 수준

도 l7: IFN 치료에 대한 무응답자들의 항-E1 (항원결정부 2) 수준

도 18: IFN 치료에 대한 응답자들의 항-E1 (항원결정부 2) 수준

도 19: 항-E2 단클론 항체와 펩티드의 반응성의 경쟁

도 20: 펩티드와 경쟁하는 인간 항-E2 반응성

도 21: 본 발명의 핵산 서열. 본 발명에 따른 E1 또는 E2 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열 목록에 보여진 각각의 E1 또는 E2 단백질의 아미노산 서열로 번역될 수 있다 (서열 번호 3 내지 13, 21-31, 35 및 41-49는 잔기 번호 1로부터 시작하는 해독틀로 번역되고, 서열 번호 37-39는 잔기 번호 2로부터 시작하는 해독틀로 번역된다).

도 22: vvHCV39 (유형 1b), vvHCV40 (유형 1b), vvHCV62 (유형 3a) 및 vvHCV63 (유형 5a)로 감염된 세포 용해물의 4 가지 상이한 E1 정제의 렌틸 렉틴 크로마토그래피 용출액 분획으로부터 수득된 ELlSA 결과.

도 23: 도 22에 보여준 값에 기초하여 4 가지 상이한 E1 구축물의 렌틸 렉틴 크로마토그래피로부터 수득된 용출 프로필.

도 24: vvHCV39 (유형 1b), vvHCV40 (유형 1b), vvHCV62 (유형 3a) 및 vvHCV63 (유형 5a)로 감염된 세포 용해물의 4 가지 상이한 E1 정제의 겔 여과 크로마토그래피 후 수득된 분획으로부터 수득된 ELlSA 결과.

도 25; 유형 1b (1), 유형 3a (2) 및 유형 5a (3) (각각 vvHCV39, vvHCV62 및 vvHCV63로 감염된 RK13 세포 유래이고; 렌틸 렉틴상에서 정제되고, 실시예 5.2-5.3에서와 같이 환원됨)및 표준 (4)의 E1 단백질의 정제로부터 수득된 프로필. '1', '2' 및 '3'으로 표시된 피크는 순수한 E1 단백질 피크를 나타낸다 (도 24 참조, E1 반응성은 주로 분획 26 내지 30에 존재함).

도 26: E1 vvHCV40 (유형 1b)의 조 용해물 (레인 1), 도 25에 보여준 분획 10 내지 17을 나타내는 vvHCV40의 겔 여과의 풀(pool) 1 (레인 2), 도 25에 보여준 분획 18 내지 25를 나타내는 vvHCV40의 겔 여과의 풀 2 (레인 3) 및 E1 풀 (분획 26 내지 30)(레인 4)의 실시예 4에 기재된 SDS-PAGE의 은 염색.

도 27: E1 구축물 39 (유형 1b) 및 62 (유형 3a)의 겔 여과 분획의 스트렙트아비딘-알카리 포스파타아제 블롯. 단백질을 NEM-바이오틴으로 표지하였다. 레인 1: 시작 겔 여과 구축물 39, 레인 2: 분획 26 구축물 39, 레인 3: 분획 27 구축물 39, 레인 4: 분획 28 구축물 39, 레인 5: 분획 29 구축물 39, 레인 6: 분획 30 구축물 39, 레인 7: 분획 31 구축물 39, 레인 8: 분자량 마커, 레인 9: 시작 겔 여과 구축물 62, 레인 10: 분획 26 구축물 62, 레인 11: 분획 27 구축물 62, 레인 12: 분획 28 구축물 62, 레인 13: 분획 29 구축물 62, 레인 14: 분획 30 구축물 62, 레인 15: 분획 31 구축물 62.

도 28: 도 26과 동일한 조건하에 수행한 vvHCV-39 (E1s, 유형 1b) 및 vvHCV-62 (E1s, 유형 3a)의 겔 여과 분획의 SDS-PAGE 겔의 은 염색. 레인 1: 시작 겔 여과 구축물 39, 레인 2: 분획 26 구축물 39, 레인 3: 분획 27 구축물 39, 레인 4: 분획 28 구축물 39, 레인 5: 분획 29 구축물 39, 레인 6: 분획 30 구축물 39, 레인 7: 분획 31 구축물 39, 레인 8: 분자량 마커, 레인 9: 시작 겔 여과 구축물 62, 레인 10: 분획 26 구축물 62, 레인 11: 분획 27 구축물 62, 레인 12: 분획 28 구축물 62, 레인 13: 분획 29 구축물 62, 레인 14: 분획 30 구축물 62, 레인 15: 분획 31 구축물 62.

도 29: 정제 절차의 완전한 개관을 제공하는 항-E1 마우스 단클론 항체 5E1A10을 이용한 웨스턴 블롯 분석. 레인 1: 조 용해물, 레인 2: 렌틸 크로마토그래피의 여액, 레인 3: 렌틸 크로마토그래피 후의 Empigen BB로의 세척, 레인 4: 렌틸 크로마토그래피의 용출액, 레인 5: 렌틸 용출액의 농축 동안 여액, 레인 6: 크기 배제 크로마토그래피(겔 여과) 후의 E1의 풀.

도 30: vvHCV44로 감염된 RK13 세포 유래의 E2 단백질의 렌틸 렉틴 크로마토그래피의 OD₂₈₀프로필 (실선). 점선은 ELISA에 의해 검출되는 E2 반응성을 나타낸다 (실시예 6에서와 같이).

도 31A: E2 풀이 겔 여과 칼럼상에 즉시 적용되는 (비환원 조건) vvHCV44로 감염된 RK13 세포 유래의 E2 단백질 풀의 렌틸 렉틴 겔 여과 크로마토그래피의 OD₂₈₀프로필 (실선). 점선은 ELISA에 의해 검출되는 E2 반응성을 나타낸다 (실시예 6에서와 같이).

도 31B: E2 풀이 실시예 5.3 (환원 조건)에 따라 환원되고 차단되는, vvHCV44로 감염된 RK13 세포 유래의 E2 단백질 풀의 렌틸 렉틴 겔 여과 크로마토그래피의 OD₂₈₀프로필 (실선). 점선은 ELISA에 의해 검출되는 E2 반응성을 나타낸다 (실시예 6에서와 같이).

도 32: 도 31B에 보여준 환원 조건하에 겔 여과 후에 vvHCV44로부터 발현된 E2 단백질의 Ni²⁺-IMAC 크로마토그래피 및 ELISA 반응성.

도 33: 도 32에 보여준 Ni²⁺-IMAC 크로마토그래피의 200mM 이미다졸 용출 단계 (레인 2) 및 30mM 이미다졸 세척 (레인 1)에 의해 회수된 정제된 E2 단백질의 0.5㎍의 SDS-PAGE의 은 염색.

도 34: 이미다졸을 제거하기 위해, 도 33에 보여준 200mM 이미다졸에 의해 회수된 정제된 E2 단백질의 탈염 단계의 OD 프로필.

도 35A: LIAscan 방법에 의해 결정된, 치료 동안 및 치료 후 6 내지 12 개월의 기간에 걸쳐 NR 및 LTR에 대한 상이한 HCV 항원 (코아 1, 코아 2, E2HCVR, NS3)에 대한 항체 수준. 평균치는 열린 사각형의 곡선으로 표시한다.

도 35B: LIAscan 방법에 의해 결정된, 치료 동안 및 치료 후 6 내지 12 개월의 기간에 걸쳐 NR 및 LTR에 대한 상이한 HCV 항원 (NS4, NS5, E1 및 E2)에 대한 항체 수준. 평균치는 열린 사각형의 곡선으로 표시한다.

도 36: LTR 및 NR 군에서 평균 E1 항체 (E1Ab) 및 E2 항체 (E2Ab) 수준.

도 37; 유형 1b 및 유형 3a에 대한 무응답자들 (NR) 및 장기간 응답자들 (LTR)에 대한 평균 E1 항체 (E1Ab) 수준.

도 38: 항-E2 단클론 항체의 상대적 지도 위치.

도 39: HCV E1 외피 단백질의 부분적인 탈글리코실화. vvHCV10A-감염된 세포의 용해물을 제조자의 지시에 따라 상이한 농도의 글리코시다아제와 함께 인큐베이션하였다. 우측 판넬: 글리코펩티다아제 F (PNGase F), 좌측 판넬: 엔도글리코시다아제 H (Endo H).

도 40: HCV E2 외피 단백질의 부분적인 탈글리코실화. vvHCV64-감염된 (E2) 및 vvHCV41-감염된 (E2s) RK13 세포의 용해물을 제조자의 지시에 따라 상이한 농도의 글리코펩티다아제 F와 함께 인큐베이션하였다.

도 41: HCV E1 당단백질의 시험관 내 돌연변이유발. 돌연변이된 서열의 지도 및 새로운 제한효소 자리의 생성.

도 42A: HCV E1 당단백질의 시험관 내 돌연변이유발 (파트 1). PCR 증폭의 제 1 단계.

도 42B: HCV E1 당단백질의 시험관 내 돌연변이유발 (파트 2). 겹침(overlap) 연장 및 네스티드(nested) PCR.

도 43: HCV E1 당단백질의 시험관 내 돌연변이유발. 증폭의 제 1 단계 동안 합성된 PCR 돌연변이된 절편 (GLY-# 및 OVR-#)의 지도.

도 44A: HeLa (좌측) 및 RK13 (우측) 세포에서 발현된 웨스턴 블롯에 의한 E1 당단백질 돌연변이체의 분석. 레인 1: 야생형 VV (백시니아 바이러스), 레인 2: 최초 E1 단백질 (vvHCV-10A), 레인 3: E1 돌연변이체 Gly-1 (vvHCV-81), 레인 4: E1 돌연변이체 Gly-2 (vvHCV-82), 레인 5: E1 돌연변이체 Gly-3 (vvHCV-83), 레인 6: E1 돌연변이체 Gly-4 (vvHCV-84), 레인 7: E1 돌연변이체 Gly-5 (vvHCV-85), 레인 8: E1 돌연변이체 Gly-6 (vvHCV-86).

도 44B: PCR 증폭/제한효소에 의한 E1 글리코실화 돌연변이체 백시니아 바이러스의 분석. 레인 1: E1 (vvHCV-10A), BspE I, 레인 2: E1.GLY-l (vvHCV-8l), BspE I, 레인 4: E1 (vvHCV-1OA), Sac I, 레인 5: E1.GLY-2 (vvHCV-82), Sac I, 레인 7: E1 (vvHCV-10A), Sac I, 레인 8: E1.GLY-3 (vvHCV-83), Sac I, 레인 l0: E1 (vvHCV-10A), Stu I, 레인 11: E1.GLY-4 (vvHCV-84), Stu l, 레인 13: E1 (vvHCV-1OA), Sma I, 레인 14: E1.GLY-5 (vvHCV-85), Sma I, 레인 16: El (vvHCV-10A), Stu I, 레인 17: E1.GLY-6 (vvHCV-86), Stu I, 레인 3 - 6 - 9 - 12 - 15: 저 분자량 마커, pBluescript SK+, Msp I.

도 45: 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)에서 발현된 재조합 E2의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동. 접종물을 루신 선택 배지에서 72 시간 동안 키우고, 완전 배지에서 1/15로 희석하였다. 28℃에서 10일 배양 후에, 배지 시료를 취하였다. 스피드백으로 농축된 배양 상층액의 200㎕ 동등물을 겔 상에 적재하였다. 두 개의 독립적인 형질전환체를 분석하였다.

도 46: 글리코실화 결핍 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae) 돌연변이체에서 발현된 재조합 E2의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동. 접종물을 루신 선택 배지에서 72 시간 동안 키우고, 완전 배지에서 1/15로 희석하였다. 28℃에서10일 배양 후에, 배지 시료를 취하였다. 이온 교환 크로마토그래피로 농축된 배양 상층액의 350㎕ 동등물을 겔 상에 적재하였다. 두 개의 독립적인 형질전환체를 분석하였다.

도 47: 침팬지의 프로필 및 면역화 계획.

도 48: 3회의 면역화 후의 세포성 반응.

도 49: 반복된 E1 면역화에 세포성 반응의 진전.

도 50: NS3 면역화에 대한 세포성 반응.

도 51: 자극 지수(세포성 면역 반응)를 3㎍의 재조합 E1 또는 2㎍의 테타노스 유독소(類毒素)의 존재 또는 부재하에, 면역화 전 (0주), 세번째 면역화 후 2주(8주), 부스터 면역화 전 (26주) 및 부스터 면역화 후 2주 (28주)에 개인으로부터 추출된 PBMC (10⁵세포)를 배양하고, 배양 5일 후에 18시간의 펄스 동안 상기 세포내로 혼입된 삼중수소의 티미딘의 양을 측정함으로써 수득하였다. 자극 지수는 외피 항원을 이용하여 배양한 세포에 혼입된 티미딘 대 항원없이 배양된 것의 비율이다. 0주 및 8주의 시료를 첫번째 분석 (A)에서 측정한 반면, 26주 및 28주의 시료를 0주의 시료를 재분석한 두번째 분석 (B)에서 측정하였다. 결과를 모든 20명 (A, 실험) 또는 19명 (B, 실험) 지원자의 기하평균 자극 지수로서 표현한다.

도 52: 3㎍의 재조합 E1 (E1) 또는 2㎍의 테타노스 유독소(類毒素)(TT)의 존재하 또는 항원없이 (BI), 부스터 면역화 전 (26주) 및 부스터 면역화 후 2주 (28주)에 개인으로부터 추출된 PBMC (10⁵세포)를 배양하였다. 시토카인을 ELISA로 24시간 후 (인터루킨-5) 또는 120시간 후 (인터페론-감마)에 취한 상층액에서 측정하였다. 자극 지수는 외피 항원을 이용하여 배양한 세포의 상층액에서 측정한 시토카인 대 항원없이 배양된 것의 비율이다. 결과를 모든 19명 지원자의 분비된 pg 시토카인/ml의 기하평균으로서 표현한다. 검출한계 미만의 시토카인 양을 갖는 시료를 검출한계 값으로 지정하였다. 유사하게 분석의 선형 범위에서 극도로 높은 농도의 시토카인을 갖는 시료를 분석의 선형 범위의 한계값으로 지정하였다.

도 53: 자극 지수(세포성 면역 반응)를 펩티드의 존재 또는 부재하에, PBMC (3X10⁵세포)를 배양하고, 배양 5-6일 후에 펄스 동안 상기 세포내로 혼입된 삼중수소의 티미딘의 양을 측정함으로써 수득하였다. 자극 지수는 펩티드를 이용하여 배양한 세포에 혼입된 티미딘 대 펩티드없이 배양된 것의 비율이다. 결과를 예방접종한 사람 (상단 패널) 또는 예방접종하지 않은 또는 대조군 (하단 패널)에 대한 개인 값으로서 표현한다.

표 1: 실시예 1에 기재된 E1 단백질의 상이한 형태를 구축하기 위해 증폭에 사용된 각각의 클론 및 프라이머의 특징.

표 2: 항-E1 시험의 요약

표 3: 경쟁 연구용 합성 펩티드

표 4: 시간에 따른 외피 항체 수준의 변화

표 5: LTR 과 NR 사이의 차이

표 6: 무린 E2 단클론 항체 사이의 경쟁 실험

표 7: E1 글리코실화 돌연변이체의 구축용 프라이머

표 8: ELISA에 의한 E1 글리코실화 돌연변이체의 분석

표 9: 보조의 E1 Balb/c 마우스의 프로필

표 10: 체액성 반응: 상이한 E1-항체 수준에 필요한 면역화의 수

더욱 구체적으로, 본 발명은 재조합적으로 발현된 단백질을 분리하기 위해 형질전환된 숙주 세포를 용해시킬 때, 이황화결합 절단 또는 환원 단계가 이황화결합 절단제로써 수행되는 것을 특징으로 하는, E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 로 구성된 군으로부터 선택된 재조합 HCV 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질을 분리 또는 정제하는 방법을 고려한다.

본 발명의 상기 '단일 또는 특정 올리고머' 외피 단백질의 본질은 이들이 오염 단백질이 없고, 오염물질과 연결된 이황화결합이 없다는 것이다.

본 발명에 따른 단백질은 하등 또는 고등 진핵세포 또는 원핵세포에서 재조합적으로 발현된다. 본 발명의 재조합 단백질은 바람직하게는 글리코실화되고, 높은 만노오스 유형, 하이브리드, 또는 복잡한 글리코실화를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 단백질은 실시예 섹션에서 상세히 논의된 포유동물 세포주, 또는 실시예 섹션에서 또한 상세히 기재된 돌연변이 효모 균주와 같은 효모에서 발현된다.

본 발명에 따른 단백질은 소포체 또는 골지체와 같은 세포의 성분내에서 분비되거나 발현될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 본 발명의 단백질은 높은 만노오스 유형 글리코실화를 가지며, 포유동물 세포의 소포체 또는 골지체에서 유지되거나 효모 세포에 유지되거나 효모 세포로부터 분비되고, 바람직하게는 mnn9 돌연변이체와 같은 효모 돌연변이체 (Kniskern 등, 1994) 또는 바나데이트 저항성에 의해 선택된 돌연변이체 (Ballou 등, 1991)로부터 분비된다.

HCV 외피 단백질의 발현시, 본 발명가는 분자내 또는 분자간 이황화 브리지에 관련된 시스테인의 유리 티올기의 일부가 숙주 또는 발현 시스템에 의해 유도된 (예를 들면, 백시니아) 단백질 또는 다른 HCV 외피 단백질 (단일 또는 올리고머)의 시스테인과 반응하고, 특정 분자간 브리지를 형성한다는 것을 보여줄 수 있었다. 이것은 오염 단백질과 함께 HCV 외피 단백질의 '집합체'의 형성을 초래한다. '집합체'가 정제 후에 수득된다는 것이 WO 92/08734에서 또한 보여 주었으나, 어떤 단백질 상호작용이 관련되는지는 기재되어 있지 않았다. 특허 출원 WO 92/08734에서, 백시니아 바이러스 시스템을 이용하여 발현된 재조합 E1/E2 단백질은 집합체로서 부분적으로 정제되었고, 단지 70% 순수한 것으로 발견되어, 정제된집합체는 진단, 예방 또는 치료 목적으로 유용하지 않게 되었다.

그러므로, 본 발명의 주요 목적은 오염 단백질로부터 단일 또는 특정 올리고머 HCV 외피 단백질의 분리 및 진단, 예방 및 치료 목적의 정제된 단백질 (>95% 순수)의 용도에 있다. 상기 목적을 위해, 본 발명가들은 집합된 단백질 복합체 ('집합체')는 이황화 브리지 및 비공유 단백질-단백질 상호작용을 기초로 형성된다는 증거를 제공할 수 있었다. 그리하여, 본 발명은 특정 조건하에 이황화 결합을 선택적으로 절단하고, 진단, 예방 및 치료 적용을 매우 방해하는 오염 단백질로부터 절단된 단백질을 분리하는 수단을 제공한다. 유리 티올기는 이황화 브리지의 재형성을 막기 위해 (가역적으로 또는 비가역적으로) 차단되거나 산화되도록 방치되고, 다른 외피 단백질과 올리고머를 형성하도록 방치될 수 있다 (정의 동형-올리고머 참조). 오염 단백질의 수준의 검출이 불가능하기 때문에, 그러한 단백질 올리고머는 WO 92/08734 및 WO 94/01778에 기재된 '집합체'와 본질적으로 상이하다는 것을 이해해야 한다.

상기 이황화결합 절단은 또한 하기에 의해 성취될 수 있다:

(1) 시스테인 잔기가 시스틱산(cysteic acid)으로 변형된 시스틱산에 의한 과포름산 산화 (Moore 등, 1963).

(2) 시스테인이 S-술포-시스테인으로 변형된, Cu²⁺와 같은 적당한 산화제와 함께 예를 들면 술파이트 (SO₃ ^2-)에 의한 술피톨분해 (R-S-S-R-2R-SO₃ ^-) (Bailey 및 Cole, 1959).

(3) 방법이 물 환경에서 수행될 수 있고, 시스테인이 변형되지 않기 때문에, 메르캅탄, 예를 들면, 디티오트레이톨 (DTT), β-메르캅토-에탄올, 시스테인, 글루타티온 레드 (Red), ε-메르캅토-에틸아민, 또는 티오글리콜산 (이 중에서 DTT 및 β-메르캅토-에탄올이 통상적으로 사용된다 (Cleland, 1964))에 의한 환원이 본 발명의 바람직한 방법이다.

(4) 포스핀(예를 들면, Bu₃P)에 의한 환원 (Ruegg 및 Rudinger, 1977).

상기 모든 화합물은 본 발명에 따른 이황화 결합을 절단하는 물질 또는 수단으로서 간주된다.

본 발명의 상기 이황화 결합 절단 (또는 환원) 단계는 바람직하게는 부분적인 이황화 결합 절단 (환원) 단계 (부분적인 절단 또는 환원 조건하에 수행됨)이다.

본 발명에 따른 바람직한 이황화 결합 절단제 또는 환원제는 디티오트레이톨 (DTT)이다. 부분적인 환원은 저농도의 상기 환원제, 즉 예를 들면, 약 0.1 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20 mM, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10 mM, 바람직하게는 1 mM 초과, 2 mM 초과 또는 5 mM 초과, 더욱 바람직하게는 약 1.5 mM, 약 2.0 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM 또는 약 7.5 mM의 농도 범위의 DTT를 사용하여 수득된다.

상기 이황화 결합 절단 단계는 또한 발현 단백질을 해리할 수 있는 DecylPEG, EMPIGEN-BB, NP-40, 소듐 콜레이트, Triton X-100과 같은 적당한 세제 (절단제와 조합하여 이황화 결합을 절단하는 수단의 예로서)의 존재하에 수행될 수 있다.

상기 환원 또는 절단 단계 (바람직하게는 부분적인 환원 또는 절단 단계)는 바람직하게는 세제의 존재하에(와 함께) 수행된다. 본 발명에 따른 바람직한 세제는 Empigen-BB 이다. 사용된 세제의 양은 바람직하게는 1 내지 10%, 바람직하게는 3% 초과, 더욱 바람직하게는 약 3.5% 초과의 Empigen-BB와 같은 세제이다.

이황화 결합 절단을 수득하는 특히 바람직한 방법은 상기에 상술된 고전적인 이황화 결합 절단제와 세제 (또한 상기에 상술됨)의 조합을 이용한다. 실시예 섹션에서 고려된 바와 같이, 저농도의 DTT (1.5 내지 7.5mM) 및 약 3.5%의 Empigen-BB의 특정 조합이 재조합적으로 발현된 E1 및 E2 단백질의 정제용 환원제 및 세제의 특히 바람직한 조합으로 판명되었다. 겔 여과 크로마토그래피시, 상기 부분적인 환원은 아마도 이합체 E1 단백질의 제조 및 면역분석법에 사용시 잘못된 반응성을 야기하는 오염 단백질로부터 상기 E1 단백질의 분리를 초래하는 것으로 드러났다.

그러나, 또한 조합이 본 발명에 예시된 바람직한 조합과 동일한 목적의 이황화 브리지 절단에 도달하는 한, 시스테인을 더욱 접근가능하게 하기 위한 당업계에 공지된 임의의 환원제와 당업계에 공지된 임의의 세제 또는 다른 수단의 임의의 다른 조합이 또한 본 발명의 범위내라는 것을 이해하여야 한다.

이황화 결합을 환원하는 것을 제외하고, 본 발명에 따른 이황화 결합 절단수단은 또한 하기 유형의 반응이 일어나도록 허용하는 당업계에 공지된 임의의 이황화 브리지 교환제 (exchanging agent) (유기 또는 단백질성인 경쟁제, 예를 들면, Creighton, 1988 참조)를 포함할 수 있다.

R1 S - S R2 + R3 SH - R1 S - S R3 + R2 SH

^*R1, R2: 단백질 집합체 화합물

^*R3 SH: 경쟁제 (유기, 단백질성)

용어 '이황화 브리지 교환제'는 이황화 결합 재형성뿐만 아니라 이황화 결합 차단제를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명은 또한 하기 목록으로부터 선택된 것과 같은 당업계에 공지된 임의의 SH 기 차단제 또는 결합제의 용도를 포함한, 상기에 추가로 설명된 HCV 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질을 정제 또는 분리하는 방법에 관한 것이다:

- 글루타티온

- 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산) 또는 비스-(3-카르복시-4-니트로페닐)-디술피드 (DTNB 또는 Ellman 시약) (Elmann, 1959)

- N-에틸말레이미드 (NEM; Benesch 등, 1956)

- 단백질에 색을 제공하는 N-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로페닐) 말레이미드 또는 Tuppy's 말레이미드

- P-클로로메르큐리벤조에이트 (Grassetti 등, l969)

- 4-비닐피리딘 (Friedman 및 Krull, 1969)은 산 가수분해 반응 후에 유리될수 있다

- 아크릴로니트릴은 산 가수분해 반응 후에 유리될 수 있다 (Weil 및 Seibles, 1961)

- NEM-바이오틴 (예를 들면, Sigma B1267 로서 판매됨)

- 2,2'-디티오피리딘 (Grassetti 및 Murray, 1967)

- 4,4'-디티오피리딘 (Grassetti 및 Murray, 1967)

- 6,6'-디티오디니코틴산 (DTDNA; Brown 및 Cunnigham, 1970)

- 2,2'-디티오비스-(5'-니트로피리딘) (DTNP; 미국 특허 3597160) 또는 다른 디티오비스(헤테로시클릭 유도체) 화합물 (Grassetti 및 Murray, 1969)

인용된 문헌의 조사는 종종 술프히드릴기에 대한 상이한 시약이 동일한 단백질 또는 효소 분자의 다양한 수의 티올기와 반응할 것이라는 것을 보여준다. 티올기의 반응성에 있어서 상기 변이는 상기 기의 입체적 환경, 예를 들면, 분자의 모양 및 원자의 주변 기 및 이들의 전하뿐만 아니라, 시약 분자 또는 이온의 크기, 모양 및 전하에 기인한 것이라고 결론지을 수 있다. 종종 소듐 도데실술페이트, 우레아 또는 구아니딘 히드로클로라이드와 같은 적당한 농도의 변성제의 존재는 단백질 분자의 충분한 풀림(unfolding)을 야기하여 티올기에 대한 시약의 모두에게 동일한 접근을 허용한다. 변성제의 농도를 변화시킴으로써, 풀림의 정도가 조절될 수 있고, 이러한 방식으로 상이한 정도의 반응성을 갖는 티올기가 드러날 수 있다. 지금까지 보고된 연구의 대부분은 p-클로로메르큐리벤조에이트, N-에틸말레이미드 및 DTNB를 이용하여 행해졌지만, 다른 더욱 최근에 개발된 시약이 동일하게 유용한 것으로 판명될 것 같다. 이들의 다양한 구조때문에, 사실, 이들은 티올기의 입체적 환경의 변화에 상이하게 반응할 것 같다.

대안적으로, 유리 SH 기의 산화를 막아, E1 및 E2 (외피) 단백질의 재조합 발현 및 정제시 큰 분자간 집합체의 형성을 막는 낮은 pH (바람직하게는 pH 6 미만)와 같은 조건은 또한 본 발명의 범주내이다.

본 발명에 따른 바람직한 SH 기 차단제는 N-에틸말레이미드 (NEM)이다. 상기 SH 기 차단제는 재조합 숙주 세포의 용해 동안 및 상기 언급한 부분적인 환원 과정 후 또는 이황화 브리지를 절단하는 임의의 다른 과정 후에 투여될 수 있다. 상기 SH 기 차단제는 또한 검출가능한 표지를 제공할 수 있는 임의의 기 및/또는 고체 지지체에 상기 재조합 단백질의 고정화를 돕는 임의의 기, 예를 들면, 바이오티닐화된 NEM을 이용하여 변형될 수 있다.

시스테인 브리지 및 차단이 없는 시스테인을 절단하는 방법이 또한 Darbre (1987), Means 및 Feeney (1971), 및 Wong (1993)에 기재되어 있다.

상기에 정의된 본 발명에 따른 단일 또는 특정 올리고머 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 정제하는 방법은 추가로 하기 단계를 포함하는 특징이 있다:

- 바람직하게는 SH 기 차단제, 예를 들면, N-에틸말레이미드 (NEM) 및 아마도 적당한 세제, 바람직하게는 Empigen-BB의 존재하에, 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 를 발현하는 숙주 세포를 용해하는 단계,

- 친화성 정제, 예를 들면, 렌틸-렉틴 크로마토그래피와 같은, 렉틴-크로마토그래피, 또는 항-E1 및/또는 항-E2 특이적 단클론 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그래피에 의해, 상기 HCV 외피 단백질을 회수하는 단계에 이은,

- 바람직하게는 또한 SH 기 차단제, 예를 들면, NEM 또는 바이오틴-NEM의 존재하에, 이황화 결합 절단제, 예를 들면, DTT를 이용한 이황화 결합의 환원 또는 절단 단계, 및,

- 예를 들면, 겔 여과 (크기 배제 크로마토그래피 또는 분자체) 및 아마도 또한 추가의 Ni²⁺-IMAC 크로마토그래피 및 탈염 단계에 의해 환원된 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 외피 단백질을 회수하는 단계.

상기 언급한 회수 단계가 또한 당업자에게 공지된 임의의 다른 적당한 기술을 이용하여 수행될 수 있다는 것을 이해해야 한다.

바람직한 렉틴-크로마토그래피 시스템은 실시예 섹션에서 설명된 갈란투스 니발리스 아글루티닌 (Galanthus nivalis agglutinin: GNA)-크로마토그래피, 또는 렌즈 쿨리나리스 (Lens culinaris) 아글루티닌 (LCA) (렌틸) 렉틴 크로마토그래피를 포함한다. 다른 유용한 렉틴은 높은 만노오스 유형 당을 인지하는 것, 예를 들면, 나르시수스 슈도나르시수스 (Narcissus pseudonarcissus) 아글루티닌 (NPA), 피숨 사티붐 (Pisum sativum) 아글루티닌 (PSA), 또는 알리움 우르시눔 (Allium ursinum) 아글루티닌 (AUA)을 포함한다.

바람직하게는 상기 방법은 상기에 상술한 세포내로 생산된 단일 또는 특정 올리고머 HCV 외피 단백질을 정제하는데 유용하다.

분비된 E1 또는 E2 또는 E1/E2 올리고머에 대해, 복합체 당을 결합하는 렉틴, 예를 들면, 리시누스 코무니스 (Ricinus communis) 아글루티닌 I (RCA I)이 바람직한 렉틴이다.

본 발명은 더욱 구체적으로 상기에 정의된 방법으로 분리되거나 정제됨을 특징으로 하는, E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2로 구성된 군으로부터 선택된 본질적으로 정제된 재조합 HCV 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질을 고려한다.

본 발명은 더욱 구체적으로 백시니아와 같은 재조합 포유동물 세포로부터 발현된 재조합 외피 단백질의 정제 또는 분리에 관한 것이다.

본 발명은 또한 재조합 효모 세포로부터 발현된 재조합 외피 단백질의 정제 또는 분리에 관한 것이다.

본 발명은 동일하게 재조합 세균 (원핵세포) 세포로부터 발현된 재조합 외피 단백질의 정제 또는 분리에 관한 것이다.

본 발명은 또한 벡터 서열, 적당한 원핵세포, 진핵세포 또는 바이러스 또는 합성 프로모터 서열에 이은 본 발명의 단일 또는 특정 올리고머 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2의 발현을 허용하는 핵산 서열을 포함한 재조합 벡터를 고려한다.

특히, 본 발명은 벡터 서열, 적당한 원핵세포, 진핵세포 또는 바이러스 또는 합성 프로모터 서열에 이은 본 발명의 단일 E1 또는 E1의 발현을 허용하는 핵산 서열을 포함한 재조합 벡터를 고려한다.

특히, 본 발명은 벡터 서열, 적당한 원핵세포, 진핵세포 또는 바이러스 또는 합성 프로모터 서열에 이은 본 발명의 단일 E1 또는 E2의 발현을 허용하는 핵산 서열을 포함한 재조합 벡터를 고려한다.

벡터 서열내로 삽입된 원하는 E1 및/또는 E2 서열을 코딩하는 HCV cDNA 의 절편은 신호 서열 (signal sequence)에 첨부될 수 있다. 상기 신호 서열은 비-HCV 공급원 유래, 예를 들면, 포유동물 세포에서 발현을 위한 IgG 또는 조직 플라스미노겐 활성자 (tpa) 리더 서열, 또는 효모 세포에서 발현을 위한 α-교배 인자 서열일 수 있으나, 본 발명에 따른 특히 바람직한 구축물은 E1 및 E2 단백질의 각각의 개시점 전에 HCV 게놈에 나타나는 신호 서열을 포함한다. 벡터내로 삽입된 원하는 E1 및/또는 E2 서열을 코딩하는 HCV cDNA 의 절편은 실시예 섹션에 설명된 소수성 도메인(들), 또는 E2 과변이부위 (hypervariable region) I의 삭제물을 포함할 수 있다.

더욱 특히, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 HCV 단일 E1 단백질의 발현을 위해 HCV 다중단백질의 아미노산 위치 1 내지 192 사이의 부위에서 시작하고, 위치 250 내지 400 사이의 부위, 더욱 바람직하게는 위치 250 내지 341 사이의 부위, 더 더욱 바람직하게는 290 내지 341 사이의 부위에서 끝나는 다중단백질을 코딩하는 HCV cDNA 절편을 갖는 핵산을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 재조합 벡터는 HCV 단일 E1 단백질의 발현을 위해, 위치 117 내지 192 사이의 부위에서 시작하고, 위치 263 내지 326 사이의 임의의 부위에서 끝나는 HCV 다중단백질의 부분을 코딩하는 HCV cDNA 절편을 갖는 재조합 핵산을 포함한다. 또한 본 발명의 범주내에 첫번째 소수성 도메인이 삭제된 형태 (위치 264 내지 293 +/- 8 개의 아미노산), 5'-말단 ATG 코돈 및 3'-말단 정지 코돈이 첨가된 형태, 또는 인자 Xa 절단 자리를가지고/가지거나 3 내지 10, 바람직하게는 6 개의 히스티딘 코돈이 첨가된 형태가 있다.

더욱 특히, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 HCV 단일 E2 단백질의 발현을 위해, HCV 다중단백질의 아미노산 위치 290 내지 406 사이의 부위에서 시작하고, 위치 600 내지 820 사이의 부위에서 끝나고, 더욱 바람직하게는 위치 322 내지 406 사이의 부위에서 시작하고, 더 더욱 바람직하게는 위치 347 내지 406 사이의 부위에서 시작하고, 여전히 더 더욱 바람직하게는 위치 364 내지 406 사이의 부위에서 시작하는 다중단백질을 코딩하는 HCV cDNA 절편을 갖는 핵산을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 재조합 벡터는 HCV 단일 E2 단백질의 발현을 위해, 위치 290 내지 406 사이의 부위에서 시작하고, 위치 623, 650, 661, 673, 710, 715, 720, 746 또는 809 의 임의의 위치에서 끝나는 다중단백질을 코딩하는 HCV cDNA 절편을 갖는 재조합 핵산을 포함한다. 또한 본 발명의 범주내에 5'-말단 ATG 코돈 및 3'-말단 정지 코돈이 첨가된 형태, 또는 인자 Xa 절단 자리를 가지고/가지거나 3 내지 10, 바람직하게는 6 개의 히스티딘 코돈이 첨가된 형태가 있다.

다양한 벡터가 본 발명의 HCV 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질의 재조합 발현을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 효모와 같은 하등 진핵세포 및 글리코실화 돌연변이체 균주는 전형적으로 플라스미드를 이용하여 형질전환되거나, 재조합 바이러스를 이용하여 형질전환된다. 벡터는 독립적으로 숙주내에서 복제할 수 있거나, 숙주 세포 게놈내로 혼입될 수 있다.

고등 진핵세포는 벡터로 형질전환되거나, 재조합 바이러스, 예를 들면, 재조합 백시니아 바이러스를 이용하여 감염될 수 있다. 외래 DNA 의 백시니아 바이러스로의 삽입을 위한 기술 및 벡터가 당업계에 주지되어 있고, 예를 들면, 상동 재조합 (homologous recombination)을 이용한다. 포유동물 발현을 위해 모두 필요한, 다양한 바이러스 프로모터 서열, 아마도 터미네이터 서열 및 폴리(A)-부가 서열, 아마도 인핸서 서열 및 아마도 증폭 서열이 당업계에서 유용하다. 백시니아는 숙주 세포 단백질의 발현을 정지시키기 때문에 특히 바람직하다. 백시니아는 또한 생 재조합 백시니아 바이러스로써 면역화된 세포 또는 개인에서 HCV 의 E1 및 E2 단백질의 발현을 허용하기 때문에 매우 바람직하다. 인간의 예방접종에 대해 아비폭스 (avipox) 및 앙카라 변형된 바이러스 (Ankara Modified Virus: AMV)가 특히 유용한 벡터이다.

또한 헬퍼(helper)-독립적 바이러스 발현 벡터인, 배큘로바이러스 아우토그라파 칼리포르니카 핵 다각체병 바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: AcNPV)로부터 유도된 곤충 발현 전달 벡터가 공지되어 있다. 상기 시스템으로부터 유도된 발현 벡터는 통상 이종 유전자를 발현시키기 위해 강한 바이러스 다각체 단백질 (polyhedrin) 유전자 프로모터를 이용한다. 배큘로바이러스의 원하는 자리로 이종 DNA의 도입을 위한 상이한 벡터 및 방법이 배큘로바이러스 발현을 위해 당업자에게 유용하다. 또한 곤충 세포에 의해 인지된 번역후 변형에 대한 상이한 신호가 당업계에 공지되어 있다.

또한 집합체 형성에 관여된 시스테인 잔기가 집합체 형성을 막도록 다른 잔기에 의해 핵산 서열의 수준에서 대체되는, 정제된 재조합 단일 또는 특정 올리고머 HCV E1 또는 E2 또는 E1/E2 단백질의 생산 방법이 본 발명의 범주내에 포함되어 있다. 그러한 돌연변이된 E1 및/또는 E2 단백질을 코딩하는 핵산을 갖는 재조합 벡터에 의해 발현된 재조합 단백질이 또한 본 발명의 범주내이다.

본 발명은 또한 이들 글리코실화 자리의 하나 이상이 제거되어, 글리코실화 돌연변이체로 일컬어지는 것을 특징으로 하는 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질에 관한 것이다. 실시예 섹션에 설명된 바와 같이, 상이한 글리코실화 돌연변이체가 의문의 환자에 따른 HCV 질병을 진단하고 (스크리닝, 확인, 예후 등), 막는데 적합할 수 있다. GLY4가 결여된 E2 단백질 글리코실화 돌연변이체는 예를 들면 진단에서 특정 혈청의 반응성을 개선시킨다고 알려졌다. 상기 글리코실화 돌연변이체는 바람직하게는 본 발명에 개시된 방법에 따라 정제된다. 또한 그러한 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 글리코실화 돌연변이체를 코딩하는 핵산 인서트를 갖는 재조합 벡터뿐만 아니라 그러한 재조합 벡터로써 형질전환된 숙주 세포가 본 발명내에 고려된다.

본 발명은 또한 본 발명의 부분을 형성하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 구체적으로 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49, 또는 이의 부분으로 표시된 재조합 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기에 정의된 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 고려하는데, 상기 벡터는 상기 정의된 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 코딩하는 핵산 서열외에 상기 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 서열에 작동가능하게연결되고, HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열을 포함한다.

진핵세포 숙주는 정의 섹션에 기재된 하등 및 고등 진핵세포 숙주를 포함한다. 하등 진핵세포 숙주는 당업계에 공지된 효모 세포를 포함한다. 고등 진핵세포 숙주는 주로 당업계에 공지된 포유동물 세포주를 포함하고, HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 오바리 (CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, PK15, RK13 및 수많은 다른 세포주를 포함하여, ATCC에서 판매하는 많은 불멸 세포주를 포함한다.

본 발명은 특히 상기 정의된 재조합 벡터를 포함한 상기 정의된 숙주 세포에 의해 발현된 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질에 관한 것이다. 상기 재조합 단백질은 특히 본 발명의 방법에 따라 정제된다.

상기에 정의된 HCV 외피 단백질을 분리하거나 정제하는 바람직한 방법은 추가로 적어도 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:

- 적당한 배양 배지에서 본 발명에 따른 재조합 벡터 또는 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 HCV 외피 단백질을 발현하는 공지의 재조합 벡터로 형질전환된 상기 정의된 숙주 세포를 키우는 단계,

- 적당한 조건하에 상기에 정의된 상기 벡터 서열의 발현을 유도하는 단계, 및,

- 바람직하게는 N-에틸말레이미드 (NEM)와 같은 SH기 차단제, 및 아마도 적당한 세제, 바람직하게는 Empigen-BB의 존재하에, 상기 형질전환된 숙주 세포를 용해하는 단계,

- 친화성 정제, 예를 들면, 렉틴-크로마토그래피 또는 항-E1 및/또는 항-E2 특이적 단클론 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그래피에 의해, 상기 렉틴, 바람직하게는 렌틸-렉틴 또는 GNA를 이용하여 상기 HCV 외피 단백질을 회수하는 단계에 이은,

- 이황화 결합 절단 수단, 예를 들면, DTT를 이용하여 이전 단계의 용출액의 인큐베이션, 바람직하게는 SH 기 차단제, 예를 들면, NEM 또는 바이오틴-NEM을 이용한 인큐베이션, 및,

- 예를 들면, 겔 여과 및 아마도 또한 이은 Ni²⁺-IMAC 크로마토그래피에 이은 탈염 단계에 의해 HCV 단일 또는 특정 올리고머 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 분리하는 단계.

상기 언급한 과정의 결과, E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질은 실시예 섹션에 설명된 겔 여과 칼럼 또는 IMAC 칼럼의 틈새 부피에서 벡터-유도된 성분 및/또는 세포 성분을 포함한 큰 집합체와 상이하게 용출되는 형태로 제조될 수 있다. 이황화 브리지 절단 단계는 유리하게는 또한 숙주 및/또는 발현-시스템-유도된 단백질의 존재로 인한 잘못된 반응성을 제거한다. 세포의 용해 동안 NEM 및 적당한 세제의 존재는 이미 HCV 외피 단백질 및 오염물질간의 집합을 부분적으로 또는 완전히 막을 수 있다.

Ni²⁺-IMAC 크로마토그래피에 이은 탈염 단계는 [Janknecht 등, 1991 및Hochuli 등, 1988]에 기재된 (His)₆을 갖는 구축물에 대해 바람직하게 사용된다.

본 발명은 또한 본 발명의 HCV 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질을 사용하여, 마우스 또는 래트와 같은 작은 동물에서 단클론 항체를 생산하는 방법뿐만 아니라, 항-HCV 항체를 인지하는 인간 B-세포를 스크리닝하고 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 표 3에 열거된 하기 E1 펩티드의 하나 이상을 함유하는 조성물에 관한 것이다:

코아/E1 V1 부위의 아미노산 181 내지 200에 위치하는 E1-31 (서열 번호 56),

E1 부위의 아미노산 193 내지 212에 위치하는 E1-33 (서열 번호 57),

E1 V2 부위 (항원결정부 B)의 아미노산 205 내지 224에 위치하는 E1-35 (서열 번호 58),

E1 V2 부위 (항원결정부 B)의 아미노산 208 내지 227에 위치하는 E1-35A (서열 번호 59),

El 부위 (V1, C1, 및 V2 부위 (항원결정부 B를 포함))의 아미노산 192 내지 228에 위치하는 1bE1 (서열 번호 53),

E1 부위의 아미노산 301 내지 320에 위치하는 E1-51 (서열 번호 66),

E1 C4 부위 (항원결정부 A)의 아미노산 313 내지 332에 위치하는 E1-53 (서열 번호 67),

E1 부위의 아미노산 325 내지 344에 위치하는 E1-55 (서열 번호 68).

본 발명은 또한 표 3에 열거된 하기 E2 펩티드의 하나 이상을 함유하는 조성물에 관한 것이다:

E2 부위 (단클론 항체 2F10H1O에 의해 인지되는, 항원결정부 A, 도 19 참조)의 아미노산 위치 397 내지 416에 위치하는 Env 67 또는 E2-67 (서열 번호 72),

E2 부위 (항원결정부 A)의 아미노산 위치 409 내지 428에 위치하는 Env 69 또는 E2-69 (서열 번호 73),

E2 부위 (항원결정부 E)의 위치 583 내지 602에 위치하는 Env 23 또는 E2-23 (서열 번호 86),

E2 부위 (항원결정부 E)의 위치 595 내지 614에 위치하는 Env 25 또는 E2-25 (서열 번호 87),

E2 부위 (항원결정부 E)의 위치 607 내지 626에 위치하는 Env 27 또는 E2-27 (서열 번호 88),

E2 부위 (항원결정부 D)의 위치 547 내지 566에 위치하는 Env 17B 또는 E2-17B (서열 번호 83),

E2 부위 (단클론 항체 16A6E7에 의해 인지되는 항원결정부 C, 도 19 참조)의 위치 523 내지 542에 위치하는 Env 13B 또는 E2-13B (서열 번호 82).

본 발명은 또한 하기 E2 입체형태적 항원결정부의 하나 이상을 함유하는 조성물에 관한 것이다:

단클론 항체 15C8C1, 12D11F1 및 8G10D1H9에 의해 인지되는 항원결정부 F,

단클론 항체 9G3E6에 의해 인지되는 항원결정부 G,

단클론 항체 10D3C4 및 4H6B2에 의해 인지되는 항원결정부 H (또는 C), 또는,

단클론 항체 17F2C2에 의해 인지되는 항원결정부 I.

본 발명은 또한 펩티드 또는 단백질 조성물, 상기 정의된 임의의 폴리펩티드 또는 펩티드와 특이적으로 반응하는 상기 항체, 및 바람직하게는 단클론 항체인 상기 항체를 이용한 면역화에 의해 증가된 E1 또는 E2 특정 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 정의된 임의의 폴리펩티드 또는 펩티드와 특이적으로 반응하는 상기 항체, 및 바람직하게는 단클론 항체인 상기 항체를 이용하여, 플라스미드 또는 파아지로 가변 사슬 라이브러리 또는 당업계에 공지된 방법에 의해 인간 B-세포의 군집으로부터 스크리닝되는 E1 또는 E2 특이적 항체에 관한 것이다.

본 발명의 E1 또는 E2 특이적 단클론 항체는 동물, 특히 마우스 또는 래트의 비장 세포로부터 고전적인 방법에 따라 형성되기 쉬운 임의의 하이브리도마에 의해 제조될 수 있고, 본 발명에 따른 HCV 폴리펩티드 또는 펩티드에 대해 면역화되고, 한편으로는 상기에 정의되고, 다른 한편으로는 골육종 세포주의 세포이고, 동물의 면역화에 대해 초기에 사용된 폴리펩티드를 인지하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 능력에 의해 선발되어야 한다.

본 발명에 관여된 항체는 효소, 형광, 또는 방사성 유형의 적당한 표지에 의해 표지될 수 있다.

본 발명의 상기 바람직한 구현예에 따른 단클론 항체는 H 및 L 사슬을 코딩하는 cDNA 또는 게놈 클론 유래의 H 및 L 사슬을 코딩하는 마우스 및/또는 인간 게놈 DNA 서열의 부분은 별도로 하고, 재조합 DNA 기술을 통해 제조된 마우스 단클론 항체의 인간화된 버전일 수 있다.

대안적으로 본 발명의 상기 바람직한 구현예에 따른 단클론 항체는 인간 단클론 항체일 수 있다. 본 발명의 본 구현예에 따른 상기 항체는 또한 HCV로써 감염된 환자의 인간 말초혈 림프구로부터 유도될 수 있거나, HCV에 대해 예방접종될 수 있다. 그러한 인간 단클론 항체는 예를 들면, 중층복합면역결핍증(severe combined immune deficiency: SCID) 마우스의 인간 말초혈 림프구 (PBL) 재군집 (repopulation)을 통해 제조될 수 있다 (최근의 리뷰에 대해, Duchosal 등, 1992 참조).

본 발명은 또한 레퍼토리 클로닝 (repertoire cloning)의 방법에 의해 재조합 항체의 선발을 위한 본 발명의 단백질 또는 펩티드의 용도에 관한 것이다 (Persson 등, l991).

특정 유전형으로부터 유도된 펩티드 또는 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질에 대한 항체는 약물, 더욱 구체적으로 HCV 유전형의 검출을 위한 면역분석으로의 혼입을 위해 (HCV E1 또는 E2 항원의 존재의 검출을 위해), HCV 질병의 예후/모니터링을 위해, 또는 치료제로서 사용될 수 있다.

대안적으로, 본 발명은 또한 생물학적 시료에서 E1 또는 E2 항원의 존재를 검출하는 면역분석 키트의 제조를 위해, HCV 질병의 예후/모니터링용 키트의 제조를 위해 또는 HCV 약물의 제조를 위해 상기에 특정된 E1 또는 E2 특이적 단클론 항체의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 적어도 하기 단계를 포함하는, 생물학적 시료에 존재하는 HCV 항원의 시험관 내 진단 또는 검출 방법에 관한 것이다:

(i) 상기 생물학적 시료를, 바람직하게는 면역 복합체의 형성을 허용하는 적당한 조건하에 고정된 형태로, 상기에 정의된 임의의 E1 및/또는 E2 특이적 단클론 항체와 접촉시키는 단계,

(ii) 미결합 성분을 제거하는 단계,

(iii) 형성된 면역 복합체를 분석할 시료에 존재하는 항체에 특이적으로 결합하고, 적당한 조건하에 검출가능한 표지에 접합된, 이종 항체와 함께 인큐베이션하는 단계,

(iv) 상기 면역 복합체의 존재를 가시적으로 또는 기계적으로 검출하는 단계 (예를 들면, 농도법, 형광법, 비색법에 의해).

본 발명은 또한 하기를 함유하는, 생물학적 시료에 존재하는 HCV 항원의 시험관 내 진단용 키트에 관한 것이다:

- 바람직하게는 고체 지지체에 고정된, 상기에 정의된 하나 이상의 단클론 항체,

- 완충액 또는 상기 항체와 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항원 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충액을 제조하는데 필요한 성분,

- 이전의 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하는 수단,

- 아마도 또한 관찰된 결합 패턴으로부터 시료내에 존재하는 HCV 항원을 추정하는 자동화된 스캐닝 및 해석 장치를 포함함.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라 정제된 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 재조합 HCV 단백질을 함유하는 조성물 또는 약물로서 사용하기 위해 상기에 지정된 하나 이상의 펩티드를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 더욱 구체적으로 면역 반응을 유도하기 위해, 아마도 약학적으로 허용가능한 보조제와 함께 충분한 양의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, HCV에 대해 포유동물, 바람직하게는 인간을 면역화시키는 백신으로서 사용하기 위한, 하나 이상의 상기 지정된 외피 펩티드를 함유하는 조성물 또는 상기에 정의된 재조합 외피 단백질 조성물에 관한 것이다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 상기 기재된 백신 제조용 상기 기재된 임의의 조성물의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 기재된 E1 및/또는 E2 부위로부터 유도된 HCV 단일 또는 특정 올리고머 단백질 또는 펩티드를 함유하는, HCV에 대해 포유동물, 바람직하게는 인간을 면역화시키는 백신 조성물에 관한 것이다.

면역원성 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 조성물은 통상적으로 바람직하게는 추가로 보조제를 함유하는 약학적으로 허용가능한 담체와 조합되어, 면역원성 양의 상기 정의된 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단일 또는 특정 올리고머 단백질 또는 상기 정의된 E1 또는 E2 펩티드를 함유한다.

본 발명의 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질인 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 는 E1 또는 E2에 대한 항체의 형성이 다른 외피 단백질보다 더욱 바람직할수 있고, E2 단백질이 HCV 유형 사이에 교차 반응성이고, E1 단백질이 유형-특이적이기 때문에, 특히 유용한 백신 항원을 제공할 것으로 기대된다. 몇 개의 유전형으로부터 유도된 유형 1 E2 단백질 및 E1 단백질을 포함한 칵테일이 또한 특히 유리할 수 있다. 과량의 몰의 E1 대 E2 또는 E2 대 E1을 함유한 칵테일이 또한 특히 유용할 수 있다. 면역원성 조성물은 동물내의 항체의 생산을 유도하기 위해, 항체의 공급원을 제공하거나 보호 면역을 유도하기 위해 동물에 투여될 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 수용하는 개인에게 해로운 항체의 생산을 자체적으로 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 적당한 담체는 전형적으로 크고, 천천히 대사되는 거대분자, 예를 들면, 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체; 및 불활성 바이러스 입자이다. 적당한 담체는 당업자에게 주지되어 있다.

조성물의 효능을 증진시키는 바람직한 보조제는 이에 제한되지 않고, 하기를 포함한다: 알루미늄 히드록시드 (알룸), 미국 특허 제 4,606,918호에 기재된 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (nor-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE) 및 세균으로부터 추출된 3 가지 성분인, 2% 스쿠알렌 트윈 80 에멀션 중의 모노포스포릴 지질 A, 트리할로오스 디미콜레이트 및 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS)을 포함하는 RIBI. 임의의 3 가지 성분 MPL, TDM 또는 CWS가 또한 단독으로 또는 2개씩 조합되어 사용될 수 있다. 부가적으로, Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) 또는 SAF-1 (Syntex)와 같은 보조제가 사용될 수 있다. 추가로, 완전 프로인드 보조제 (Complete Freund's Adjuvant:CFA) 및 불완전 프로인드 보조제 (IFA)가 비인간 적용 및 연구 목적으로 사용될 수 있다.

면역원성 조성물은 전형적으로 약학적으로 허용가능한 운반체, 예를 들면, 물, 염수, 글리세롤, 에탄올 등을 함유할 수 있다. 부가적으로, 보조 물질, 예를 들면, 습윤 또는 유화제, pH 완충 물질, 보존제 등이 그러한 운반체에 포함될 수 있다.

전형적으로, 면역원성 조성물은 액체 용액 또는 현탁액인 주사제로서 제조되고; 주사 전에 액체 운반체 중의 용액, 또는 현탁액에 적당한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 증진된 보조제 효과를 위해 유화되거나 리포좀내에 둘러싸일 수 있다. E1 및 E2 단백질은 또한 사포닌과의 면역 자극 복합체, 예를 들면, Quil A (ISCOMS)내로 혼입될 수 있다.

백신으로서 사용된 면역원성 조성물은 '충분한 양' 또는 '면역학적으로 유효량'의 본 발명의 외피 단백질뿐만 아니라 필요시 임의의 다른 상기 언급된 성분을 함유한다. "면역학적으로 유효량"은 개인에게 단독 투여 또는 시리즈의 부분으로서, 상기 양의 투여가 상기 정의된 치료에 효과적이라는 것을 의미한다. 상기 양은 치료될 환자의 건강 및 육체적 상태, 치료될 개인의 분류군 (예를 들면, 비인간 영장류, 영장류 등), 항체를 합성하는 개인의 면역계의 능력, 원하는 보호의 정도, 백신의 제형, 의학적 상황의 주치의의 평가, HCV 감염 균주, 및 다른 적절한 인자에 따라 다르다. 양은 통상적인 시행착오를 통해 결정될 수 있는 비교적 폭넓은 범위에 해당할 것으로 기대된다. 통상, 양은 0.01 내지 1000㎍/투여, 더욱 특히 0.1 내지 100㎍/투여로 변할 것이다.

단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질은 또한 B형 간염 표면 항원과 유사한 방식으로, 유사한 (예를 들면, 코아, NS2, NS3, NS4 또는 NS5 부위 유래의 T 세포 항원결정부 또는 B 세포 항원결정부) 또는 이종 (비-HCV) 합텐 (hapten)을 제공하기 위한 백신 담체로서 이용될 수 있다 (유럽 특허 출원 174,444 참조). 상기 용도로, 외피 단백질은 집합체에 접합된 합텐 또는 항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 면역원성 담체를 제공한다. 항원은 종래의 화학적 방법에 의해 접합될 수 있거나, 단백질의 친수성 부위에 해당하는 위치에서 E1 및/또는 E2를 코딩하는 유전자내로 클로닝될 수 있다. 그러한 친수성 부위는 V1 부위 (아미노산 위치 191 내지 202를 포함), V2 부위 (아미노산 위치 213 내지 223을 포함), V3 부위 (아미노산 위치 230 내지 242를 포함), V4 부위 (아미노산 위치 230 내지 242를 포함), V5 부위 (아미노산 위치 294 내지 303을 포함) 및 V6 부위 (아미노산 위치 329 내지 336을 포함)를 포함한다. 합텐의 삽입을 위한 다른 유용한 위치는 소수성 부위 (대략 아미노산 위치 264 내지 293을 포함)이다. 삭제된 E1 단백질의 항혈청과의 반응성에 영향을 주지 않고 상기 부위가 삭제될 수 있다는 것을 본 발명에서 보여준다. 그러므로, 합테은 삭제 위치에서 삽입될 수 있다.

면역원성 조성물은 통상 비경구적으로, 전형적으로 주사로, 예를 들면, 피하로 또는 근육내로 투여된다. 다른 투여 방법에 적합한 부가적인 제형물은 경구 제형물 및 좌약을 포함한다. 투여 치료는 단독 투여 계획 또는 복수 투여 계획일 수 있다. 백신은 다른 면역조절제와 함께 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항체의 시험관 내 검출을 위한, 상기에 기재된 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항체의 검출을 위한, 면역분석 키트 제조용, 상기에 기재된 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 적어도 하기 단계를 포함하는, 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항체의 시험관 내 진단 방법에 관한 것이다:

(i) 바람직하게는 면역 복합체의 형성을 허용하는 적당한 조건하에 고정된 형태로, 펩티드 또는 단백질이 스트렙트아비딘 또는 아비딘 복합체를 통해 고체 지지체에 공유적으로 결합된 바이오티닐화된 펩티드 또는 단백질일 수 있는, 상기에 정의된 임의의 외피 펩티드 또는 단백질을 함유하는 조성물과 상기 생물학적 시료를 접촉하는 단계,

(ii) 미결합 성분을 제거하는 단계,

(iii) 형성된 면역 복합체를 적당한 조건하에 검출가능한 표지에 접합된, 이종 항체와 함께 인큐베이션하는 단계,

대안적으로, 본 발명은 또한 상기 개시된 재조합적으로 생산되고 정제된 단일 또는 특정 올리고머 단백질 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질이 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항체와 경쟁하기 위해 E1 및/또는 E2 펩티드와 조합되어 사용되는 경쟁 면역분석법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 하기를 함유하는, 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항체의 존재를 결정하는 키트에 관한 것이다:

- 펩티드 또는 단백질이 바람직하게는 고체 지지체, 더욱 바람직하게는 동일한 ELISA 플레이트의 상이한 미세웰상, 더 더욱 바람직하게는 하나의 동일한 막 스트립상에 고정되고, 아마도 HCV 또는 HCV의 다른 유형 유래의 다른 폴리펩티드 또는 펩티드와 조합된, 상기에 정의된 하나 이상의 펩티드 또는 단백질 조성물,

- 완충액 또는 상기 폴리펩티드 또는 펩티드와 생물학적 시료내에 존재하는 HCV에 대한 항체 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충액을 제조하는데 필요한 성분,

- 아마도 또한 관찰된 결합 패턴으로부터 시료내에 존재하는 HCV 유전형을 추정하는 자동화된 스캐닝 및 해석 장치를 포함함.

본 발명에 따른 면역 분석법은 HCV로 감염된 개인의 혈청내의 항체에 의해 인지되는 선형(펩티드의 경우) 및 입체형태적 항원결정부 (단일 또는 특정 올리고머 단백질)를 유지하는 E1 및/또는 E2 도메인 유래의 단일 또는 특정 올리고머 항원을 이용한다. 예를 들면, 단일 또는 특정 올리고머 항원, 이합체 항원뿐만 아니라, 단일 또는 특정 올리고머 항원의 조합을 사용하는 것은 본 발명의 범주내이다. 본 발명의 HCV E1 및 E2 항원은 실제로 항체를 검출하기 위해 공지된 항원을 사용하는 임의의 분석 포멧에서 사용될 수 있다. 물론, HCV 입체형태적 항원결정부를 변성시키는 포멧은 피하거나 적응되어야 한다. 상기 모든 분석의 공통적인 특징은 항원이 성분내에 존재하는 임의의 항체에 결합하도록 허용하는 조건하에, 항원이 HCV 항체를 함유하는 것으로 의심되는 신체 성분과 접촉되는 것이다. 그러한 조건은 전형적으로 과량의 항원을 사용한 생리 온도, pH 및 이온강도일 수 있다. 항원과 시료의 인큐베이션에 이어 항원으로 구성된 면역 복합체의 검출이 따른다.

면역분석의 디자인을 많이 변화시키고, 많은 포멧이 당업계에 공지되어 있다. 절차는 예를 들면, 고체 지지체 또는 면역침전법을 사용할 수 있다. 대부분의 분석법은 표지된 항체 또는 폴리펩티드의 사용이 관여되고; 표지는 예를 들면, 효소학적, 형광, 화학발광, 방사성, 또는 염료 분자일 수 있다. 면역 복합체로부터 신호를 증폭하는 분석법이 또한 공지되어 있고; 이의 예는 바이오틴 및 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 이용하는 분석법, 및 ELISA 분석과 같은 효소가 표지되고 매개된 면역분석법이다.

면역분석법은 제한되지 않고, 이질 또는 동질 포멧 및 표준 또는 경쟁형일 수 있다. 이질 포멧에서, 폴리펩티드는 전형적으로 고체 매트릭스 또는 지지체에 결합되어 인큐베이션 후 폴리펩티드로부터 시료의 분리를 용이하게 한다. 사용될 수 있는 고체 지지체의 예는 니트로셀룰로오스 (예를 들면, 막 또는 미세역가 웰 형태로), 폴리비닐 클로라이드 (예를 들면, 시이트 또는 미세역가 웰), 폴리스티렌 라텍스 (예를 들면, 비이드 또는 미세역가 플레이트), 폴리비닐리딘 플루오라이드 (Immunolon^TM으로 공지됨), 디아조화된 종이, 나일론 막, 활성화된 비이드 및 Protein A 비이드이다. 예를 들면, Dynatech Immunolon^TMl 또는 Immunlon^TM2 미세역가 플레이트 또는 0.25 인치 폴리스티렌 비이드 (Precision Plastic Ball)가 이질 포멧에서 사용될 수 있다. 항원 폴리펩티드를 포함한 고체 지지체는 전형적으로 시료로부터 이를 분리한 후, 및 결합된 항체의 검출전에 세척된다. 표준 및 경쟁 포멧 양자가 당업계에 공지되어 있다.

동질 포멧에서, 시료는 용액 중의 항원의 조합과 인큐베이션된다. 예를 들면, 그것은 형성된 임의의 항원-항체 복합체를 침전시킬 조건일 수 있다. 상기 분석법의 표준 및 경쟁 포멧 양자가 당업계에 공지되어 있다.

표준 포멧에서, 항체-항원 복합체내의 HCV 항체의 양은 직접 모니터링된다. 이것은 항-HCV 항체 상의 항원결정부를 인지하는 표지된 항-이종(anti-xenogeneic) (예를 들면, 항-인간) 항체가 복합체 형성에 기인하여 결합할 것인지를 결정함으로써 수행될 수 있다. 경쟁 포멧에서, 시료내의 HCV 항체의 양은 복합체내의 표지된 항체 (또는 다른 경쟁 리간드)의 공지된 양의 결합에 경쟁 효과를 모니터링함으로써 추론된다.

항-HCV 항체 (또는 경쟁 분석법의 경우에, 경쟁 항체의 양)를 함유하는 형성된 복합체는 포멧에 의존하여, 임의의 수 많은 공지된 기술에 의해 검출된다. 예를 들면, 복합체내의 비표지된 HCV 항체는 표지 (예를 들면, 효소 표지)와 복합된 항-이종 Ig의 접합체를 사용하여 검출될 수 있다.

면역침전 또는 응집 분석 포멧에서, HCV 항원과 항체 사이의 반응은 용액 또는 현탁액으로부터 침전되는 네트워크를 형성하고, 침전물의 가시적인 층 또는 필름을 형성한다. 어떠한 항-HCV 항체도 시료내에 존재하지 않는다면, 어떠한 가시적인 침전물도 형성되지 않는다.

현재 3가지의 특정 유형의 입자 응집반응 (PA) 분석법이 존재한다. 상기 분석법은 지지체에 코팅될 때 다양한 항원에 대한 항체의 검출을 위해 사용된다. 상기 분석법의 하나의 유형은 적혈구 세포 (RBC)에 수동적으로 흡착되는 항원 (또는 항체)에 의해 감광되는 RBC를 이용한 적혈구응집반응이다. 존재한다면, 신체 성분에 존재하는 특정 항원 항체의 첨가는 정제된 항원으로 코팅된 RBC를 응집되게 한다.

응집반응 분석법에서 잠재적인 비특이적 반응을 제거하하기 위해, 두 개의 인공 담체가 PA에서 RBC 대신에 사용될 수 있다. 상기 중에서 가장 흔한 것은 라텍스 입자이다. 그러나, 젤라틴 입자가 또한 사용될 수 있다. 상기 담체 중의 하나를 이용한 분석법은 정제된 항원으로 코팅된 입자의 수동 응집반응에 기초한다.

입체형태적 항원결정부로 구성된 본 발명의 HCV 단일 또는 특정 올리고머 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 항원은 전형적으로 상기 면역분석법에서 사용하기 위한 키트 형태로 포장될 것이다. 키트는 통상 별개의 용기에 천연 HCV 항원, 조절 항체 제형물 (양성 및/또는 음성), 분석 포멧이 동일한 것을 요구할 경우에 표지된항체 및 표지가 직접 신호를 생성하지 않는다면 신호 생성 물질 (예를 들면, 효소 기질)을 포함할 것이다. 천연 HCV 항원은 미리 고체 매트릭스에 결합될 수 있거나 매트릭스에 이의 결합을 위한 물질과 별개일 수 있다. 분석을 수행하는 지시서 (예를 들면, 문서, 테이프, CD-ROM 등)가 통상 키트에 포함될 것이다.

천연 HCV 항원을 이용하는 면역분석법은 잠재적으로 감염성인 HCV가 없는 공급원의 제조용 혈액을 스크리닝하는데 유용하다. 혈액 공급원의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다. 개인의 기증 혈액으로부터의 신체 성분, 바람직하게는 혈액 또는 혈액 성분과 본 발명의 HCV E1 및/또는 E2 단백질을 반응시켜 존재한다면, HCV 항체와 HCV 항원 사이의 면역 반응을 허용하는 단계. 반응 결과 항-HCV 항체-HCV 항원 복합체가 형성되는지를 검출하는 단계. 혈액 공급원에 기증된 혈액은 천연 HCV 항원인 E1 또는 E2에 대한 항체를 나타내지 않는 공여자 유래의 것이다.

HCV 항원에 대한 양성 반응성의 경우에, 거짓 양성의 가능성을 줄이기 위해 면역분석법을 반복하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 혈액 산물 (예를 들면, 혈액 수혈, 혈장, 인자 VIII, 면역 글로불린 등)의 제조용 혈액의 대규모 스크리닝에서, '스크리닝' 시험은 전형적으로 특이성을 희생하여 (즉, 거짓 양성이 증가됨) 민감도를 증가시키도록 (오염된 혈액이 통과되지 않도록 보증하기 위해) 포멧된다. 그리하여, '반복적으로 반응성인', 즉, 기증된 시료상의 두 번 이상의 면역분석에서 양성인 공여자를 추가로 시험하는 것을 단지 연기하는 것이 전형적이다. 그러나, HCV-양성의 확인을 위해, '확인' 시험이 전형적으로 민감도를 희생하여 특이성을 증가시키도록 (어떠한 거짓 양성 시료가 확인되지 않는 것을 보증하기 위해) 포멧된다. 그러므로, E1 및 E2 에 대해 본 발명에 기재된 정제 방법은 HCV 진단 분석에 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질을 포함하는 것이 매우 유리할 것이다.

선택된 고체상은 중합체성 또는 유리 비이드, 니트로셀룰로오스, 미세입자, 반응 접시의 미세웰, 시험관 및 자기 비이드를 포함할 수 있다. 신호 생성 화합물은 효소, 발광 화합물, 색원체, 방사성 원소 및 화학발광 화합물을 포함할 수 있다. 효소의 예는 알카리 포스파타아제, 호오스래디시 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase) 및 베타-갈락토시다아제를 포함한다. 인핸서 화합물의 예는 바이오틴, 항-바이오틴 및 아비딘을 포함한다. 막에 결합하는 인핸서 화합물의 예는 바이오틴, 항-바이오틴 및 아비딘을 포함한다. 류마티스인자(rheumatoid factor)와 유사한 물질의 효과를 차단하기 위해, 시료를 류마티스인자와 유사한 물질의 효과를 차단하기에 충분한 조건하에 둔다. 상기 조건은 시료를 다량의 항-인간 IgG와 접촉시켜, 혼합물을 형성하고, 잠시 동안 류마티스인자와 유사한 물질이 실질적으로 없는 반응 혼합 산물을 형성하기에 충분한 조건하에 인큐베이션하는 것을 포함한다.

본 발명은 추가로 하기 단계를 포함하는, HCV 질병을 시험관 내에서 모니터링하거나 HCV 감염으로 고생하는 환자의 치료 (예를 들면, 인터페론 이용)에 대한 반응을 예후하기 위한, E1 단백질, 또는 이의 부분, 더욱 구체적으로 상기에 정의된 HCV 단일 또는 특정 올리고머 E1 단백질의 용도를 고려한다:

- 면역 복합체의 형성을 허용하는 조건하에 C형 간염 감염을 갖는 환자의 생물학적 시료를 E1 단백질 또는 이의 적당한 부분과 인큐베이션하는 단계,

- 미결합 성분을 제거하는 단계,

- 상기 시료에 존재하는 항-E1 역가를 계산하는 단계 (예를 들면 (인터페론) 치료의 시작 및/또는 동안),

- 치료의 시작 및/또는 치료 과정 동안 상기 시료에서 발견된 항-E1 역가의 양에 기초하여 HCV 질병의 자연 경로를 모니터링하거나 상기 환자의 치료에 대한 반응을 예후하는 단계.

초기 항-E1 역가의 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 바람직하게는 20 배 초과의 감소를 보여주는 환자는 HCV 치료, 더욱 구체적으로 인터페론 치료에 대해 장기간의, 지속된 응답자로 결론지을 수 있었다. 항-E1 분석이 IFN 치료, 또는 일반적으로 C형 간염 바이러스 질병의 치료에 대한 장기간의 반응을 예후하는데 매우 유용할 수 있다는 것은 실시예 섹션에서 설명된다.

더욱 구체적으로 표 3에 열거된 하기 E1 펩티드는 HCV 질병을 모니터링하거나 HCV 감염으로 고생하는 환자의 인터페론 치료에 대한 반응을 예후하는데 유용하다고 밝혀졌다:

E1 부위 (V1, C1 및 V2 부위 (항원결정부 B를 포함))의 아미노산 192 내지 228에 위치하는 1bE1 (서열 번호 53),

상기 언급한 펩티드의 더 작은 절편이 또한 본 발명의 범주내에 해당한다는 것을 이해해야 한다. 상기 더 작은 절편은 화학 합성에 의해 용이하게 제조될 수 있고, 상기 및 실시예 섹션에서 상술한 분석에서 사용되는 그들의 능력에 대해 시험할 수 있다.

본 발명은 또한 하기를 함유하는, HCV 질병을 모니터링하거나 HCV 감염으로 고생하는 환자의 치료 (예를 들면 인터페론 이용)에 대한 반응을 예후하는 키트에 관한 것이다:

- 하나 이상의 E1 단백질 또는 E1 펩티드, 더욱 구체적으로 상기에 정의된 E1 단백질 또는 E1 펩티드,

- 완충액 또는 상기 단백질 또는 펩티드와 생물학적 시료내에 존재하는 항-E1 항체 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충액을 제조하는데 필요한 성분,

- 아마도 또한 치료의 진전 동안 항-E1 역가의 감소를 추정하는 자동화된 스캐닝 및 해석 장치.

항-E2 수준이 다른 HCV 항원에 대한 항체와 비교하여 감소하기 때문에, 본 발명에 따른 E2 단백질 및 펩티드가 또한 어느 정도 E1 단백질 또는 펩티드에 대해 상기에 기재된 HCV 치료를 모니터링/예후하는데 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 또한 HCV 질병을 모니터링/예후하는 시험에 사용하기 위해 적합할 수 있는 E2 부위의 특정 항원결정부를 결정하는 것이 가능할 수 있다는 것을 이해해야 한다.

본 발명은 또한 적어도 하기 단계를 포함하는, 생물학적 시료내에 존재하는 HCV의 하나 이상의 혈청학적 유형을 검출하는, 더욱 구체적으로 하나의 분석 포멧에 조합되어 검출될 상이한 유형의 HCV 항체를 검출하는 혈청형 분석에 관한 것이다:

(i) 바람직하게는 면역 복합체의 형성을 허용하는 적당한 조건하에 고정된 형태로, 하나 이상의 혈청형의 HCV 항체의 존재에 대해 분석될 생물학적 시료를, 하나 이상의 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질 조성물 또는 상기에 정의된 하나 이상의 E1 또는 E2 펩티드 조성물과 접촉시키는 단계,

(ii) 미결합 성분을 제거하는 단계,

(iii) 형성된 면역 복합체와 적당한 조건하에 검출가능한 표지에 접합된, 이종 항체와 함께 인큐베이션하는 단계,

(iv) 상기 면역 복합체의 존재를 가시적으로 또는 기계적으로 검출하는 단계 (예를 들면, 농도법, 형광법, 비색법에 의해) 및 관찰된 결합 패턴으로부터 존재하는 하나 이상의 HCV 혈청형의 존재를 추정하는 단계.

상기 방법에서 사용된 단백질 또는 펩티드 조성물은 재조합적으로 발현된 유형-특이적 외피 단백질 또는 유형-특이적 펩티드라는 것을 이해해야 한다.

본 발명은 추가로 하기를 함유하는, 생물학적 시료내에 존재하는 하나 이상의 HCV 혈청형을 밝혀내는, 더욱 구체적으로 HCV의 상기 혈청형에 대한 항체를 검출하는 키트에 관한 것이다:

- 상기에 정의된, 하나 이상의 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질 또는 E1 또는 E2 펩티드,

- 아마도 또한 관찰된 결합 패턴으로부터 존재하는 하나 이상의 혈청형의 존재를 검출하는 자동화된 스캐닝 및 해석 장치.

본 발명은 또한 고체 지지체 상에 고정화 및 역상 혼성화 분석으로의 혼입, 바람직하게는 막 스트립과 같은 고체 지지체 상에 평행선으로서 고정화, 상기 정의된 방법에 따른 HCV의 존재 또는 유전형을 결정하기 위한, 상기에 정의된 펩티드 또는 단백질 조성물의 용도에 관한 것이다. 다른 HCV 다중단백질 부위 유래의 다른 유형-특이적 항원과의 조합이 또한 본 발명의 범주내에 있다.

본 발명은 단백질과 이황화 결합 절단제 또는 환원제를 접촉시키는 것을 포함하는 재조합 방법에 의해 제조된 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질로부터 선택된 재조합 HCV 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법의 접촉은 부분적인 절단 또는 환원 조건하에 수행될 수 있다. 바람직하게는, 이황화 결합 절단제는 디티오트레이톨 (DTT), 바람직하게는 0.1 내지 50mM, 바람직하게는 0.1 내지 20mM, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 10mM의 농도이다. 대안적으로, 이황화 결합 절단제는 세제, 예를 들면 Empigen-BB (주요 성분으로서 N-도데실-N,N-디메틸글리신을 함유한 혼합물임), 바람직하게는 1 내지 10%의 농도, 더욱 바람직하게는 3.5%의 농도일 수 있다. 세제, 이황화 결합 절단제 및/또는 환원제의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이황화 결합 재형성은 SH기 차단제, 예를 들면, N-에틸말레이미드 (NEM) 또는 이의 유도체로써 막는다. 바람직한 구현예에서, 이황화 결합 재형성은 낮은 pH 조건의 사용에 의해 차단된다.

본 발명은 추가로 하기 단계를 포함하는, 추가로 본원에 기재된 방법을 제공한다: 선택적으로 N-에틸말레이미드 (NEM)와 같은 SH 차단제의 존재하에, 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 발현 숙주 세포를 용해하는 단계; 친화성 정제, 예를 들면, 렌틸-렉틴 크로마토그래피와 같은, 렉틴-크로마토그래피, 또는 항-E1 및/또는 항-E2 특이적 단클론 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그래피에 의해, 상기 HCV 외피 단백질을 회수하는 단계; 바람직하게는 SH 차단제, 예를 들면, NEM 또는 바이오틴-NEM의 존재하에, 이황화 결합 절단제, 예를 들면, DTT를 이용하여 이황화결합을 환원 또는 절단하는 단계; 및 겔 여과 및 선택적으로 부가적으로 이은 Ni-IMAC 크로마토그래피 및 탈염 단계에 의해 환원된 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 외피 단백질을 회수하는 단계.

본 발명은 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2로부터 선택된 실질적으로 분리되고/되거나 정제된, 및/또는 분리되고/되거나 정제된 재조합 HCV 단일 또는 특정 올리고머 재조합 외피 단백질을 함유한 조성물을 제공하는데, 바람직하게는 본원에 기재된 방법으로부터 분리된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 HCV 외피 단백질은 백시니아와 같은 재조합 포유동물 세포, 재조합 효모 세포에서 발현되었다.

본 발명은 작동가능한 조합으로, 벡터 서열, 원핵세포, 진핵세포 또는 바이러스 프로모터 서열 및 단일 또는 특정 올리고머 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 발현을 허용하는 핵산 서열을 포함한 재조합 벡터를 제공한다. 하나의 구현예에서, 벡터의 핵산 서열은 아미노산 위치 1 내지 192 사이의 부위에서 시작하고, 아미노산 위치 250 내지 400 사이의 부위, 더욱 바람직하게는 위치 250 내지 341 사이의 부위, 더 더욱 바람직하게는 위치 290 내지 341 사이의 부위에서 끝나는 단일 HCV E1 단백질을 코딩한다. 또 다른 구현예에서, 벡터의 핵산 서열은 아미노산 위치 117 내지 192 사이의 부위에서 시작하고, 아미노산 위치 263 내지 400 사이의 부위, 더욱 바람직하게는 위치 250 내지 326 사이의 부위에서 끝나는 단일 HCV E1 단백질을 코딩한다. 여전히 또 다른 구현예에서, 벡터의 핵산 서열은 위치 264 내지 293 ±8 개의 아미노산 사이의 첫번째 소수성 도메인의 삭제를갖는 단일 HCV E1 단백질을 코딩한다. 추가의 구현예에서, 벡터의 핵산 서열은 아미노산 위치 290 내지 406 사이의 부위에서 시작하고, 아미노산 위치 600 내지 820 사이의 부위에서 끝나고, 더욱 바람직하게는 위치 322 내지 406 사이의 부위, 더 더욱 바람직하게는 위치 347 내지 406 사이의 부위, 가장 바람직하게는 위치 364 내지 406 사이의 부위에서 시작하고; 바람직하게는 임의의 아미노산 위치 623, 650, 661, 673, 710, 715, 720, 746 또는 809에서 끝나는 단일 HCV E2 단백질을 코딩한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 벡터는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 5'-말단 ATG 코돈 및 3'-말단 정지 코돈을 포함한다. 하나의 구현예에서, 벡터는 추가로 인자 Xa 절단 자리 및/또는 코딩 부위의 3'-말단에 첨가된 3 내지 10, 바람직하게는 6 개의 히스티딘 코돈을 추가로 포함한 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 벡터는 선택적으로 E1 또는 E2 단백질에 존재하는 하나 이상의 글리코실화 자리가 핵산 수준에서 제거된 핵산 서열을 포함한다.

본 발명은 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49, 또는 이의 부분 중의 어느 하나를 포함한 핵산을 제공한다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49, 또는 이의 부분 중의 어느 하나를 포함한 핵산을 포함한 핵산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 추가로 발현되거나 본원에 기재된 벡터의 발현 산물인 재조합 HCV 외피 단백질을 포함한다.

본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는데, 여기에서 벡터는 본원에 기재된 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 코딩하는 핵산 서열에다가 숙주 세포에서 작동가능하고, HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열을 포함한다. 더욱이, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포에 의해 발현된 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 제공한다.

본 발명은 추가로 본원에 기재되고, 하기 단계를 포함한 방법을 제공한다: 적당한 배양 배지에서 본원에 기재된 재조합 벡터로 형질전환된 본원에 기재된 숙주 세포를 키우는 단계; 적당한 조건하에 본원에 기재된 벡터의 핵산 서열의 발현을 유도하는 단계; 바람직하게는 N-에틸말레이미드 (NEM)와 같은 SH기 차단제의 존재하에, 형질전환된 숙주 세포를 용해하는 단계; 친화성 정제, 예를 들면, 렉틴-크로마토그래피 또는 항-E1 및/또는 항-E2 특이적 단클론 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그래피에 의해, 상기 렉틴, 바람직하게는 렌틸-렉틴을 이용하여 HCV 외피 단백질을 회수하는 단계에 이은, 바람직하게는 SH 기 차단제, 예를 들면, NEM 또는 바이오틴-NEM의 존재하에, 이황화 결합 절단제, 예를 들면, DTT를 이용하여 이전 단계의 용출액의 인큐베이션 단계; 및 겔 여과 및 아마도 부가적인 Ni²⁺-IMAC 크로마토그래피 및 탈염 단계에 의해 HCV 단일 또는 특정 올리고머 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 분리하는 단계.

본 발명은 하나 이상의 하기 E1 및/또는 E2 펩티드를 함유한 조성물을 제공한다:

E1 부위의 아미노산 325 내지 344에 위치하는 E1-55 (서열 번호 68),

E2 부위 (항원결정부 A)의 아미노산 위치 397 내지 416에 위치하는 Env 67 또는 E2-67 (서열 번호 72),

E2 부위 (항원결정부 E)의 위치 595 내지 614에 위치하는 Env 25 또는 E2-25(서열 번호 87),

E2 부위 (항원결정부 C)의 위치 523 내지 542에 위치하는 Env 13B 또는 E2-13B (서열 번호 82).

본 발명은 하나 이상의 하기 E2 입체형태적 항원결정부를 포함하는 조성물을 제공한다:

단클론 항체 9G3E6에 의해 인지되는 항원결정부 G,

단클론 항체 10D3C4 및 4H6B2에 의해 인지되는 항원결정부 H (또는 C),

단클론 항체 17F2C2에 의해 인지되는 항원결정부 I.

본 발명은 본원에 기재된 조성물을 이용하여 면역화시 증가되는 E1 및/또는 E2 특이적 단클론 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 예를 들면, 질병의 예후/모니터링 또는 HCV 치료를 위해, HCV E1 또는 E2 항원의 존재를 검출하기 위한 면역분석 키트내로의 혼입을 위해 약물로서 사용될 수 있다. 본 발명은 HCV E1 또는 E2 항원을 검출하는 면역분석 키트의 제조를 위해, HCV 질병의 예후/모니터링용 키트의 제조를 위해 또는 HCV 약물의 제조를 위한 본원에 기재된 E1 및/또는 E2 특이적 단클론 항체의 용도를 제공한다.

본 발명은 적어도 하기 단계를 포함하는, 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항원의 시험관 내 진단 방법을 제공한다:

(i) 바람직하게는 면역 복합체의 형성을 허용하는 적당한 조건하에 고정된 형태로, 본원에 기재된 E1 및/또는 E2 특이적 단클론 항체와 상기 생물학적 시료를 접촉하는 단계,

(ii) 미결합 성분을 제거하는 단계,

(iv) 면역 복합체의 존재를 가시적으로 또는 기계적으로 검출하는 단계.

본 발명은 적어도 하기를 함유하는, 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항원의 존재를 결정하는 키트를 제공한다: 바람직하게는 고체 지지체상에 고정된 형태로, 본원에 기재된 하나 이상의 E1 및/또는 E2 특이적 단클론 항체, 완충액 또는 상기 항체와 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항원 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충액을 제조하는데 필요한 성분, 및 선택적으로 이전의 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하는 수단.

본 발명의 조성물은 약물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명은 면역 반응을 유도하기 위해, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 보조제와 함께 효과적인 양의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, HCV에 대해 포유동물, 바람직하게는 인간을 면역화시키는 백신으로서 사용하기 위한, 본원에 기재된 조성물을 제공한다.

본 발명은 면역 반응을 유도하기 위해, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 보조제와 함께 효과적인 양의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, HCV에 대해 포유동물, 바람직하게는 인간을 면역화시키는 백신 제조를 위해, 본원에 기재된 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 보조제와 함께 본원에 기재된 E1 및/또는 E2를 포함하는 효과적인 양의 조성물을 포함하는, HCV에 대해 포유동물, 바람직하게는 인간을 면역화시키는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항체의 시험관 내 검출을 위한 형태로 제공될 수 있다. 본 발명은 또한 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항체를 검출하는 면역분석 키트를 제조하는 방법 및 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항체를 진단하기 위해 본 발명의 키트를 사용하여 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 그러한 방법은 적어도 하기 단계를 포함한다:

(i) 바람직하게는 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항체와 면역 복합체의 형성을 허용하는 적당한 조건하에 고정된 형태로, 본원에 기재된 조성물과 상기 생물학적 시료를 접촉하는 단계,

(ii) 미결합 성분을 제거하는 단계,

본 발명은 하기를 함유하는, 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 항체의 존재를 결정하는 키트를 제공한다: 바람직하게는 고체 지지체상에 고정된 형태로, 본원에 기재된 하나 이상의 펩티드 또는 단백질 조성물; 완충액 또는 상기 단백질 또는 펩티드와 생물학적 시료내에 존재하는 HCV 에 대한 항체 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충액을 제조하는데 필요한 성분; 및 선택적으로 이전의 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하는 수단.

본 발명은 하기 단계를 포함하는, HCV 질병을 시험관 내에서 모니터링하거나 HCV 감염으로 고생하는 환자의 치료 (바람직하게는, 인터페론을 이용)에 대한 반응을 진단하기 위한 방법을 제공한다: 면역 복합체의 형성을 허용하는 조건하에 HCV 감염을 갖는 환자의 생물학적 시료를 E1 단백질 또는 이의 적당한 부분과 인큐베이션하는 단계; 미결합 성분을 제거하는 단계; 치료의 시작 및 치료 과정 동안 상기 시료에 존재하는 항-E1 역가를 계산하는 단계; 치료의 시작 및/또는 치료 과정 동안 상기 시료에서 발견된 항-E1 역가의 양에 기초하여 HCV 질병의 자연 경로를 모니터링하거나 상기 환자의 치료에 대한 반응을 진단하는 단계.

본 발명은 하기를 함유하는, HCV 질병을 모니터링하거나 HCV 감염으로 고생하는 환자의 치료 (특히 인터페론 이용)에 대한 반응을 예후하는 키트를 제공한다: 하나 이상의 E1 단백질 또는 E1 펩티드, 더욱 구체적으로 본원에 기재된 E1 단백질 또는 E1 펩티드; 완충액 또는 상기 단백질 또는 펩티드와 생물학적 시료내에 존재하는 항-E1 항체 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충액을 제조하는데 필요한 성분; 및 선택적으로, 이전의 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하는 수단,선택적으로, 또한 치료의 진전 동안 항-E1 역가의 감소를 추정하는 자동화된 스캐닝 및 해석 장치.

본 발명은 적어도 하기 단계를 포함하는, 생물학적 시료내에 존재하는 HCV의 하나 이상의 혈청형을 검출하는, 더욱 구체적으로 하나의 분석 포멧에 조합되어 검출될 상이한 유형의 HCV 항체를 검출하는 혈청형 분석법을 제공한다:

(i) 바람직하게는 면역 복합체의 형성을 허용하는 적당한 조건하에 고정된 형태로, 하나 이상의 혈청형의 HCV 항체의 존재에 대해 분석될 생물학적 시료를, 본원에 기재된 하나 이상의 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질 조성물 또는 본원에 기재된 하나 이상의 E1 또는 E2 펩티드 조성물과 접촉시키는 단계,

(ii) 미결합 성분을 제거하는 단계,

(iii) 형성된 면역 복합체와 적당한 조건하에 검출가능한 표지에 접합된, 이종 항체와 함께 인큐베이션하는 단계, 및 선택적으로,

본 발명은 하기를 함유하는, 생물학적 시료내에 존재하는 하나 이상의 HCV 혈청형을 밝혀내는, 더욱 구체적으로 HCV의 상기 혈청형에 대한 항체를 검출하는 키트를 제공한다: 본원에 기재된 하나 이상의 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질 또는 본원에 기재된 E1 또는 E2 펩티드; 완충액 또는 상기 단백질 또는 펩티드와 생물학적 시료내에 존재하는 항-E1 항체 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충액을 제조하는데 필요한 성분; 선택적으로, 이전의 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하는 수단, 선택적으로, 또한 관찰된 결합 패턴으로부터 존재하는 하나 이상의 혈청형의 존재를 검출하는 자동화된 스캐닝 및 해석 장치.

본 발명은 고체 지지체 상에 고정화 및 역상 혼성화 분석으로의 혼입, 바람직하게는 막 스트립과 같은 고체 지지체 상에 평행선으로서 고정화, 본원에 기재된 방법에 따른 HCV의 존재 또는 유전형을 결정하기 위한, 본원에 기재된 펩티드 또는 단백질 조성물을 제공한다.

본 발명은 치료학적 유효량의 하기를 함유하는, 치료용 백신 조성물을 제공한다:

E1 단백질 및 E2 단백질 군으로부터 선택된 하나 이상의 정제된 재조합 HCV 단일 또는 특정 올리고머 재조합 외피 단백질; 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 보조제을 함유하는 조성물. 본 발명의 백신의 HCV 외피 단백질은 선택적으로 재조합 포유동물 세포 또는 재조합 효모 세포에 의해 제조된다. 본 발명은 하나 이상의 하기 E1 및 E2 펩티드를 포함하는 치료학적 유효량의 조성물을 함유하는 치료용 백신 조성물을 제공한다:

E2 부위 (항원결정부 A)의 아미노산 위치 397 내지 418에 위치하는 Env 67 또는 E2-67 (서열 번호 72),

E2 부위 (항원결정부 D)의 위치 547 내지 586에 위치하는 Env 178 또는 E2-178 (서열 번호 83),

본 발명은 상기에 기재된 백신과 같은 본원에 기재된 조성물 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 보조제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, HCV로 감염된 인간과 같은 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 조성물의 투여 전에 곧 또는 투여에 이어 또는 투여와 함께 항바이러스 치료와 조합되거나 일시적으로 함께 투여된다.

본 발명은 E1 단백질 및 E2 단백질 군으로부터 선택된 하나 이상의 정제된 재조합 HCV 외피 단백질, 및 선택적으로 보조제를 함유하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 하기 E1 및 E2 펩티드를 포함한다:

E2 부위 (항원결정부 D)의 위치 547 내지 586에 위치하는 Env 178 또는 E2-178 (서열 번호 83), 및

E2 부위 (항원결정부 C)의 위치 523 내지 542에 위치하는 3B 또는 E2-13B (서열 번호 82).

본 발명은 정제된 재조합 HCV 단일 또는 특정 올리고머 재조합 E1 또는 E2 단백질로부터 형성된 E1/E2 복합체; 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 보조제를 함유하는 치료학적 유효량의 조성물을 포함하는 HCV-특이적 항체를 유도하는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 재조합 HCV 외피 단백질은 재조합 포유동물 세포에 의해 제조될 수 있거나 재조합 HCV 외피 단백질은 재조합 효모 세포에 의해 제조된다. 본 발명은 본원에 기재된 조성물 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 보조제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, HCV로 감염된 인간과 같은 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 E1 단백질 및 E2 단백질 군으로부터 선택된 하나 이상의 정제된 재조합 HCV 단일 또는 특정 올리고머 재조합 외피 단백질; 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 보조제를 함유하는 치료학적 유효량의 조성물을 포함하는 HCV-특이적 항체를 유도하는 치료용 조성물을 제공한다.

실시예 1: C형 간염 바이러스 E1 단백질의 클로닝 및 발현

1. 백시니아 바이러스 재조합 벡터의 구축

pgptATA18 백시니아 재조합 플라스미드는 백시니아 바이러스 13 중간 프로모터의 조절하에 이. 콜라이 (E. coli) 잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자를 포함한 부가적인 삽입을 갖는 pATA18 (Stunnenberg 등, 1988)의 변형된 버전이다 (도 1). 플라스미드 pgsATA18은 3 개의 해독틀에 정지 코돈을 포함하고, 서열 번호 1/94를 갖는 올리고뉴클레오티드 링커를 Pst I 및 HindIII-절단된 pATA18 벡터내로 삽입함으로써 구축하였다. 이것은 여분의 Pac I 제한효소 자리를 생성하였다 (도 2). 원래의 HindIII 자리는 회복되지 않았다.

서열 번호 1/94를 갖는 올리고뉴클레오티드 링커:

재조합 단백질에 융합된 조작된 히스티딘 스트레치(stetch)의 Ni²⁺킬레이트화에 의한 신속하고 효율적인 정제를 용이하게 하기 위해, 백시니아 재조합 벡터 pMS66을 부가적인 카르복시-말단 히드티딘 태그를 갖는 분비 단백질을 발현하도록 고안되었다. 평활 말단을 생성하는 3 개의 제한효소 (Sma I, Stu I 및 Pml I/Bbr PI)에 대한 단일 자리를 포함하고, 서열 번호 2/95를 갖는 올리고뉴클레오티드 링커를 임의의 cDNA의 카르복시-말단이 프로테아제 인자 Xa 절단 자리를 코딩하는 서열에 이은 6 개의 히스티딘 및 2 개의 정지 코돈을 코딩하는 핵산 서열 (신규 Pac I 제한효소 자리가 또한 3' 말단의 하류에 생성되었다)과 동일한 해독틀로 삽입될 수 있는 방식으로 합성하였다. 서열 번호 2/95를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드를 pgptATA18의 Xma I 및 Pst I 자리 사이에 도입하였다 (도 3).

서열 번호 2/95를 갖는 올리고뉴클레오티드 링커:

에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli) MC1061 (람다)내에 포함된 플라스미드 pgptATA-18을 BCCM/LMBP (Belgian Coordinated Collections of microorganisms/Laboratorium voor Moleculaire Biologie - Plasmidencollectie, Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, Belgium)의 부다페스트 협약의 명칭하에 기탁하였고, 등록번호 LMBP4486을 갖는다. 상기 기탁은 2002.01.09에 하였다.

실시예 2. HCV 재조합 플라스미드의 구축

2.1. 상이한 형태의 E1 단백질을 코딩하는 구축물

중합효소 연쇄반응 (PCR) 산물을 이전에 기재된 RNA 제조 및 이은 역전사 및 PCR에 의해 혈청 시료로부터 유도하였다 (Stuyver 등, 1993b). 표 1은 각각의 클론의 특징 및 증폭에 사용된 프라이머를 보여준다. PCR 절편을 Sma I-절단된 pSP72 (Promega) 플라스미드내로 클로닝하였다. 하기 클론을 백시니아 재조합 벡터내로의 삽입을 위해 선발하였다: 도 21에 나타낸 HCCI9A (서열 번호 3), HCCI10A (서열 번호 5), HCCI11A (서열 번호 7), HCCI12A (서열 번호 9), HCCI13A (서열 번호 11), 및 HCCI17A (서열 번호 13). E1-코딩 부위를 포함한 cDNA 절편을 각각의 pSP72 플라스미드로부터 EcoRI 및 HindIII 제한효소로 절단하고, EcoRI/HindIII-절단된 pgptATA-18 백시니아 재조합 벡터 (실시예 1에 기재됨)의 11K 백시니아 바이러스 후기 프로모터의 하류에 삽입하였다. 각각의 플라스미드를 pvHCV-9A, pvHCV-10A, pvHCV-11A, pvHCV-12A, pvHCV-13A 및 pvHCV-17A로 명명하고, 이 중에서 pvHCV-11A를 도 4에 보여준다.

2.2. E1 삭제 돌연변이체의 소수성 부위

코돈 Asp264 내지 Val287 (뉴클레오티드 790 내지 861, 소수성 도메인 I을 코딩하는 부위)의 삭제를 포함하는 클론 HCCI37은 하기와 같이 생성되었다: 2 개의 PCR 절편을 프라이머 세트 HCPr52 (서열 번호 16)/HCPr107 (서열 번호 19) 및 HCPr108 (서열 번호 20)/HCPR54 (서열 번호 18)을 이용하여 클론 HCCI1OA로부터 생성하였다. 상기 프라이머를 도 21에 보여준다. 2 개의 PCR 절편을 전기영동 후 아가로스 겔로부터 정제하고, 각각의 절편의 1ng을 프라이머 HCPr52 (서열번호 16) 및 HCPr54 (서열 번호 18)에 의해 PCR 주형으로서 사용하였다. 생성 절편을 Sma I-절단된 pSP72 벡터내로 클로닝하고, 24 개 코돈 (72 염기쌍)의 삭제 때문에 삭제를 포함한 클론을 용이하게 확인하였다. 클론 HCCI37 (서열 번호 15)을 포함한 플라스미드 pSP72HCCI37을 선발하였다. 소수성 도메인 I이 결여된 전체 길이 E1 cDNA를 포함한 재조합 백시니아 플라스미드를, 삭제 주위의 HCV 서열 (벡터 pSP72-HCCI37로부터 Xma I 및 BamHI으로 절단된 절편)을 백시니아 플라스미드 pvHCV-10A의 Xma I-BamHI 자리내로 삽입함으로써 구축하였다. 생성 플라스미드를 pvHCV-37로 명명하였다. 확인 서열결정 후에, 내부 삭제를 포함한 아미노-말단 부위를 상기 벡터 pvHCV-37로부터 분리하고 (EcoR I 및 BstE II로 절단), Eco RI 및 Bst EII-절단된 pvHCV-11A 플라스미드내로 재삽입하였다. 상기 구축물은 양자의 소수성 도메인이 삭제된 E1 단백질을 발현할 것으로 기대되고, pvHCV-38로 명명하였다. 클론 HCCI38의 E1-코딩 부위는 서열 번호 23으로 표시한다.

E1 카르복시말단의 친수성 부위 (이론적으로 아미노산 337-340까지 확장)가 구축물 pvHCV-38에 완전히 포함되지 않을 경우에, 소수성 도메인 I이 결여된 더 큰 E1 부위를 EcoR I/Bam HI 절단으로 pvHCV-37 플라스미드로부터 분리하고, EcoRI/BamHI-절단된 pgsATA-18 벡터내로 클로닝하였다. 생성 플라스미드를 pvHCV-39라 명명하고, 클론 HCCI39 (서열 번호 25)를 포함하였다. 동일한 절편을 BamHI (이 중에서 점착성 말단은 Klenow DNA 중합효소 I (Boehringer)로 채웠다) 및 이어서 EcoR I (5' 점착성 말단)으로 pvHCV-37 벡터로부터 절단하였다.상기 서열을 EcoRI 및 Bbr PI-절단된 벡터 pMS-66내로 삽입하였다. 이것은 이의 카르복시-말단에 6 개의 히스티딘 꼬리를 포함하는, 플라스미드 pvHCV-40의 클론 HCCI40 (서열 번호 27)을 생성하였다.

2.3. 다른 유전형의 E1

클론 HCCI62 (서열 번호 29)를 만성 C형 간염을 갖는 유형 3a-감염된 환자로부터 유도하고 (혈청 BR36, 클론 BR36-9-13, 서열 번호 19, WO 94/25601 및 또한 Stuyver 등, 1993a 참조), HCCI63 (서열 번호 31)을 수혈 후 간염을 갖는 유형 5a-감염된 어린이로부터 유도하였다 (혈청 BE95, 클론 PC-4-1, 서열 번호 45, WO 94/25601).

2.4. E2 구축물

HCV E2 PCR 절편 22 개를 혈청 BE11 (유전형 1b)로부터 프라이머 HCPr109 (서열 번호 33) 및 HCPr72 (서열 번호 34)에 의해 [Stuyver 등, 1993b]에 기재된 RNA 제조, 역전사 및 PCR 기술을 사용하여 수득하고, 절편을 Sma I-절단된 pSP72 벡터내로 클로닝하였다. 클론 HCCI22A (서열 번호 35)를 NcoI/AlwNI 또는 BamHI/AlwNI으로 절단하고, 절편의 점착성 말단을 평활하였다 (Klenow DNA 중합효소 I (Boehringer)를 이용하여 NcoI 및 BamHI 자리를, T4 DNA 중합효소 (Boehringer)를 이용하여 AlwNI 자리를 평활하였다). BamHI/AlwNI cDNA 절편을 이어서 EcoR I 및 Hind III 절단으로 선형화하고, 이 중에서 점착성 말단은 Klenow DNA 중합효소 (Boehringer)로 채운 백시니아 pgsATA-18 벡터내로 삽입하였다. 생성 플라스미드를 pvHCV-41으로 명명하고, 신호 서열로 이용될 수 있는 E1 단백질의 37 개의 아미노산 (Met347 내지 Gly383)을 포함한, 아미노산 Met347 내지 Gln673의 E2 부위를 코딩하였다. 동일한 HCV cDNA를 EcoR I 및 Bbr PI-절단된 벡터 pMS66내로 삽입하고, 이어서 Klenow DNA 중합효소로 평활 말단하였다. 생성 플라스미드를 pvHCV-42로 명명하고, 또한 아미노산 347 내지 683을 코딩하였다. NcoI/AlwNI 절편을 유사한 방식으로 pgsATA-18 (pvHCV-43) 또는 pMS-66 백시니아 벡터 (pvHCV-44)의 동일한 자리내로 삽입하였다. pvHCV-43 및 pvHCV-44는 HCV 다중단백질의 아미노산 364 내지 673을 코딩하였고, 이 중에서 아미노산 364 내지 383은 E2의 신호 서열을 코딩하는 E1 단백질의 천연 카르복시말단 부위로부터 유도되었고, 아미노산 384 내지 673은 성숙 E2 단백질의 천연 카르복시말단 부위로부터 유도되었다.

2.5. 재조합 HCV-백시니아 바이러스의 생성

토끼 신장 RK13 세포 (ATCC CCL 37), 인간 골육종 143B 티미딘 키나아제 결핍 (TK^-)(ATCC CRL 8303), HeLa (ATCC CCL 2) 및 Hep G2 (ATCC HB 8065) 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC, Rockville, Md, USA)으로부터 수득하였다. 세포를 10% 송아지 혈청 및 RK13 및 143 B (TK-)에 대해 Earle's 염 (EMEM) 및 Hep G2에 대해 글루코오스 (4 g/l)로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle medium: DMEM)에서 키웠다. 백시니아 바이러스 WR 계통 (Western Reserve, ATTC VR119)을 이전에 기재된 바와 같이, 통상적으로 143B 또는 RK13 세포에서 증식시켰다 (Panicali & Paoletti, 1982; Piccini 등, 1987;Mackett 등, 1982, 1984, 및 1986). 143B 세포의 합류 단층을 0.1(= 세포당 0.1 플라크 형성 단위(PFU))의 감염 배수 (multiplicity of infection) (m.o.i.)로 야생형 백시니아 바이러스로써 감염시켰다. 2시간 후에, 백시니아 재조합 플라스미드를 플라스미드 DNA 500ng을 함유한 칼슘 포스페이트 공침전물의 형태로 감염 세포내로 트랜스펙션시켜, 상동 재조합을 허용하였다 (Graham & van der Eb, l973; Mackett 등, 1985). 에셰리키아 콜라이 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (gpt) 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 선택 배지 (25 ㎍/ml 미코페놀산 (MPA), 250 ㎍/ml 잔틴 및 15 ㎍/ml 히포잔틴을 함유한 EMEM; Falkner 및 Moss, 1988; Janknecht 등, 1991)에서 인큐베이션한 토끼 신장 RK13 세포상에서 선발하였다. 단일 재조합 바이러스를 선택 배지에서 0.9% 아가로스 덮개하에 RK13 세포의 신선한 단층상에서 정제하였다. 티미딘 키나아제 결핍 (TK^-) 재조합 바이러스를 선발하고, 이어서 플라크를 25㎍/ml 5-브로모-2'-데옥시우리딘의 존재하에 인간 143B 세포 (TK^-) 의 신선한 단층상에서 정제하였다. 정제된 재조합 HCV-백시니아 바이러스 스톡을 0.05 m.o.i로 인간 143B 또는 토끼 RK13 세포를 감염시킴으로써 제조하였다 (Mackett 등, 1988). 재조합 백시니아 바이러스에서 HCV cDNA 절편의 삽입은 각각의 HCV 절편을 클로닝하기 위해 사용된 프라이머를 이용한 PCR에 의해 MPA 선발 후에 세포 용해물의 분취량 (50㎕)에서 확인되었다 (표 1 참조). 재조합 백시니아-HCV 바이러스를 백시니아 재조합 플라스미드 번호에 따라 명명하였는데, 예를 들면, 재조합 백시니아 바이러스 vvHCV-10A는 야생형 WR 계통과pvHCV-10A 플라스미드의 재조합으로부터 유도되었다.

실시예 3: 재조합 백시니아 바이러스를 이용한 세포의 감염

RK13 세포의 합류 단층을 실시예 2에 기재된 재조합 HCV-백시니아 바이러스를 이용하여 3 m.o.i. 로 감염시켰다. 감염을 위해, 세포 단층을 인산완충식염수 (phosphate-buffered saline) pH 7.4 (PBS)로 2회 세척하고, 재조합 백시니아 바이러스 스톡을 MEM 배지에서 희석하였다. 200㎕의 바이러스 용액을 m.o.i. 가 3이 되도록 10⁶개의 세포당 첨가하고, 24℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 바이러스 용액을 흡입하고, 2 m1의 완전 성장 배지 (실시예 2 참조)를 10⁶세포당 첨가하였다. 세포를 HCV 단백질의 발현이 일어나는 동안 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.

실시예 4: 웨스턴 블롯팅에 의해 재조합 단백질의 분석

감염 세포를 PBS로 2회 세척하고, 용해 완충액 (50 mM Tris.HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM MgCl₂, 1㎍/ml 아프로티닌 (Sigma, Bornem, Belgium))으로써 직접 용해하거나 50 mM Tris.HCl pH 7.5/10 mM EDTA/150 mM NaCl에서 5분 동안 인큐베이션에 의해 플라스크로부터 분리하고, 원심분리 (1000g에서 5분)로 모았다. 세포 펠렛을 이어서 10⁶세포당 200㎕ 용해 완충액 (50 mM Tris.HCl pH 8.0, 2mM EDTA, 150mM NaCl, 5mM MgCl₂, 아프로티닌, 1% Triton X-100)에서 재현탁하였다. 세포 용해물을 Eppendorf 원심분리기에서 14,000 rpm에서5분 동안 맑게 하여 불용성 찌꺼기를 제거하였다. 20㎕ 용해물의 단백질을 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리하였다. 이어서 100V 고정 전압에서 2 시간 동안 4℃로 냉각된 Hoefer HSl 전달 유닛을 사용하여, 전달 완충액 (25 mM Tris.HCl pH 8.0, 192 mM 글리신, 20% (v/v) 메탄올)에서, 단백질을 겔에서 니트로셀룰로오스 시이트 (Amersham)로 전기-전달하였다. 니트로셀룰로오스 필터를 Blotto (PBS 중의 5% (w/v) 탈지분유; Johnson 등, 1981)로 차단하고, Blotto/0.1% Tween 20으로 희석된 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 통상, 인간 음성 대조군 혈청 또는 HCV로 감염된 환자의 혈청을 200배 희석하고, 200배 희석된 야생형 백시니아 바이러스-감염된 세포 용해물과 함께 상온에서 1시간 동안 미리 인큐베이션하여 비특이적 결합을 감소시켰다. Blotto/0.1% Tween 20으로 세척 후에, 니트로셀룰로오스 필터를 Blotto/0.1% Tween 20으로 희석된 알카리 포스파타아제 기질 용액과 함께 인큐베이션하였다. PBS 중의 0.1% Tween 20으로 세척 후에, 필터를 알카리 포스파타아제 기질 용액 (100 mM Tris.HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 0.38 ㎍/ml 니트로불 테트라졸리움, 0.165 ㎍/ml 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트)과 함께 인큐베이션하였다. 전기전달을 제외한 모든 단계를 상온에서 수행하였다.

실시예 5: 재조합 E1 또는 E2 단백질의 정제

5.1. 용해 (lysis)

감염된 RK13 세포 (E1 또는 E2 구축물 보유)를 인산완충식염수(PBS)로 2회세척하고, 배양 용기로부터 10mM EDTA를 함유한 PBS에서 인큐베이션에 의해 분리하였다. 분리된 세포를 PBS로 2회 세척하고, 2mM 바이오티닐화된 N-에틸말레이미드 (바이오틴-NEM)(Sigma)를 포함한 1 ml의 용해 완충액 (50 mM Tris.HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 5mM MgCl₂, 1 ㎍/ml 아프로티닌 (Sigma, Bornem, Belgium))을 4℃에서 10⁵세포당 첨가하였다. 상기 용해물을 유형 B 다운서(douncer)로 균질화하고, 상온에서 0.5시간 동안 방치하였다. 10mM N-에틸말레이미드 (NEM, Aldrich, Bornem, Belgium)를 포함한 또 다른 5 부피의 용해 완충액을 1차 용해물에 첨가하고, 혼합물을 상온에서 15분 동안 방치하였다. 불용성 세포 찌꺼기를 용액으로부터 Beckman JA-14 로터에서 4℃, 14,000rpm (r_max에서 30100g)에서 1시간 동안 원심분리에 의해 맑게 하였다.

5.2. 렉틴 크로마토그래피

맑게 된 세포 용해물을 1ml/분의 속도로 5 칼럼 부피의 용해 완충액으로 평형화된 0.8 X 10 cm 렌틸-렉틴 Sepharose 4B 칼럼(Pharmacia)상에 1ml/분의 속도로 적재하였다. 렌틸-렉틴 칼럼을 5 내지 10 칼럼 부피의 완충액 1 (O.1M 포타슘 포스페이트 pH 7.3, 500 mM KCl, 5% 글리세롤, 1 mM 6-NH₂-헥산산, 1 mM MgCl₂, 및 1% DecylPEG (KWANT, Bedum, 네덜란드)로 세척하였다. 일부 실험에서, 칼럼을 이어서 1% DecylPEG 대신에 0.5% Empigen-BB (Calbiochem, San Diego, CA, USA)를 포함한 10 칼럼 부피의 완충액 1 로 세척하였다. 결합 물질을 용출 완충액 (10mM 포타슘 포스페이트 pH 7.3, 5% 글리세롤, 1 mM 헥산산, 1 mM MgCl₂, 0.5% Empigen-BB, 및 0.5 M α-메틸-만노피라노시드)을 적용함으로써 용출하였다. 용출된 물질을 분획화하고, 분획을 실시예 6에 기재된 ELISA에 의해 E1 또는 E2 단백질의 존재를 스크리닝하였다. 도 22는 vvHCV39 (유형 1b), vvHCV40 (유형 1b), vvHCV62 (유형 3a) 및 vvHCV63 (유형 5a)로 감염된 세포 용해물의 4 가지 상이한 E1 정제의 렌틸 렉틴 용출액 분획으로부터 수득된 ELlSA 결과를 보여준다. 도 23은 도 22에서 보여준 값으로부터 수득된 프로필을 보여준다. 상기 결과는 렉틴 친화성 칼럼이 상이한 유형의 HCV의 외피 단백질에 대해 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

5.3. 농축 및 부분적인 환원

E1- 또는 E2-양성 분획을 합하고, 4℃에서 Beckman JA-20 로터에서 3시간 동안 5,000rpm에서 원심분리에 의해 Centricon 30 kDa (Amicon)상에서 농축하였다. 일부 실험에서, E1- 또는 E2-양성 분획을 합하고, 질소 증발에 의해 농축하였다. 3.10⁸세포의 동등물을 대략 200㎕로 농축하였다. 부분적인 환원을 위해, 30% Empigen-BB (Calbiochem, San Diego, CA, USA)을 상기 200㎕에 첨가하여 3.5%의 최종 농도가 되었고, 물 중의 1M DTT를 첨가하여 1.5 내지 7.5mM의 최종 농도가 되었고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. NEM (디메틸술폭시드 중에 1M)을 이어서 첨가하여 50 mM의 최종 농도가 되었고, 유리 술프히드릴기를 차단하기 위해 37℃에서 추가의 30분 동안 반응하도록 방치하였다.

5.4. 겔 여과 크로마토그래피

Superdex-200 HR 10/20 칼럼 (Pharmacia)을 3 칼럼 부피의 PBS/3% Empigen-BB로 평형화하였다. 환원된 혼합물을 Smart System (Pharmacia)의 500㎕ 시료 루프로 주입하고, PBS/3% Empigen-BB 완충액을 겔 여과를 위해 첨가하였다. 250㎕의 분획을 Vo 내지 Vt에서 모았다. 분획을 실시예 6에 기재된 E1 또는 E2 단백질의 존재를 스크리닝하였다.

도 24는 vvHCV39 (유형 1b), vvHCV40 (유형 1b), vvHCV62 (유형 3a) 및 vvHCV63 (유형 5a)로 감염된 세포 용해물의 4 가지 상이한 E1 정제의 겔 여과 크로마토그래피 후에 수득된 분획으로부터 수득된 ELlSA 결과를 보여준다. 도 25는 유형 1b, 3a 및 5a (각각 vvHCV39, vvHCV62 및 vvHCV63로 감염된 RK13 세포 유래이고; 렌틸 렉틴상에서 정제되고, 이전의 실시예에서와 같이 환원됨)의 E1 단백질의 정제로부터 수득된 프로필을 보여준다. '1', '2' 및 '3'으로 표시된 피크는 순수한 E1 단백질 피크를 나타낸다 (E1 반응성은 주로 분획 26 내지 30에 존재함). 상기 피크는 이합체 E1 단백질에 해당하는, 대략 70kDa의 매우 유사한 분자량을 보여준다. 3 가지 프로필에서 다른 피크는 실시예 5.3.에서 나타낸 환원 단계 및 적당한 세제의 존재하에 이은 겔 여과 단계 때문에 단지 E1에서 분리될 수 있는 백시니아 바이러스 및/또는 세포 단백질을 나타낸다. 도 26에 보여준 바와 같이, 풀 1 (분획 10 내지 17을 나타냄) 및 풀 2 (분획 18 내지 25를 나타냄)는 E1 풀 (분획 26 내지 30)에 존재하지 않는 오염 단백질을 포함한다. E1 피크 분획을 실시예 4에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 상에서 수행하고, 블롯팅하였다. NEM-바이오틴으로 표지된 단백질을 도 27에 보여준 스트렙트아비딘-알카리 포스파타아제로 검출하였다. 다른 것 중에서, 겔 여과 크로마토그래피전 (레인 1)에 존재하는 29 kDa 및 45 kDa 오염 단백질은 분획 26 내지 30에서 매우 낮은 수준으로 존재한다는 것을 용이하게 관찰할 수 있다. 대략 65 kDa의 밴드는 단량체 E1 형태로 완전히 분열될 수 없는 E1 이합체 형태를 나타낸다. 유사한 결과를 단지 6 탄수화물 대신에 5 탄수화물의 존재 때문에 SDS-PAGE 상에서 더 빠른 이동성을 보여주는, 유형 3a E1 단백질에 대해 수득하였다 (레인 10 내지 15). 도 28은 도 26 과 동일한 조건에서 수행한 SDS/PAGE 겔의 은 염색을 보여준다. 정제 절차의 완전한 개관은 도 29에 제공된다.

정제된 E1 단백질의 존재를 실시예 4에 기재된 웨스턴 블롯팅에 의해 추가로 확인하였다. 이합체 E1 단백질은 집합되지 않고, 오염물질이 없는 것으로 드러났다. 상기 절차에 따라 vvHCV40-감염된 세포로부터 정제된 서브유형 1b.E1 단백질을 477 Perkins-Elmer 서열결정기에서 아미노 말단의 서열을 결정한 결과, 첫번째 잔기로서 티로신을 함유하는 것으로 드러났다. 이것은 E1 단백질이 이의 신호 서열로부터 올바른 위치 (A191 내지 Y192)에서 신호 펩티다제에 의해 절단되었다는 것을 확인하였다. 이것은 성숙 E1 단백질의 아미노 말단이 아미노산 위치 192에서 시작한다는 Hijikata 등 (1991)의 발견을 확인한다.

5.5. E2 단백질의 정제

E2 단백질 (아미노산 384 내지 673)을 실시예 5.1 내지 5.4에 나타낸 vvHCV44로 감염된 RK13 세포로부터 정제하였다. 도 30은 렌틸 렉틴 크로마토그래피의 OD₂₈₀프로필 (실선)을 보여준다. 점선은 ELISA에 의해 검출되는 E2 반응성을 나타낸다 (실시예 6 참조). 도 31은 이의 부분이 실시예 5.3.에 설명된 방법에 따라 환원되고, 차단되며, 칼럼에 즉시 적용되는, 렌틸 렉틴 E2 풀의 겔 여과 크로마토그래피로부터 수득되는 동일한 프로필을 보여준다 (도 30 참조). E2 풀의 양 부분을 별개의 겔 여과 칼럼상에서 수행하였다. 환원이 수행되지 않는다면, E2는 오염 단백질과 공유적으로 연결된 집합체를 형성한다는 것을 증명할 수 있다. 환원 및 차단 후에, 오염 단백질의 대부분은 Vo 분획으로 분리된다. E2 단백질과 함께 정제된 다른 오염 단백질은 이은 단계에서 제거될 수 있었기 때문에 더 이상 E2 단백질에 공유적으로 연결되지 않았다. 도 32는 E2 단백질 정제에 대해 수행된 부가적인 Ni²⁺-IMAC 정제 단계를 보여준다. 이 친화성 정제 단계는 vvHCV44로부터 발현된 E2 단백질에 첨가된 6 개의 히스티딘 잔기를 사용한다. 오염 단백질은 칼럼을 통과하거나 30mM 이미다졸 세척에 의해 제거할 수 있다. 도 33은 0.5㎍의 정제된 E2 단백질 및 30mM 이미다졸 세척의 은 염색된 SDS-PAGE를 보여준다. 순수한 E2 단백질은 200mM 이미다졸 용출 단계에 의해 용이하게 회수될 수 있었다. 도 34는 이미다졸을 제거하고, 원하는 완충액, 예를 들면, PBS, 카르보네이트 완충액, 염수로 전환하기 위한 부가적인 탈염 단계를 보여준다.

E1의 생산을 위한 vvHCV11A (또는 vvHCV40) 또는 vvHCV41, vvHCV42, vvHCV43, 또는 E2 단백질의 생산을 위한 vvHCV44로 감염된 RK13 세포의 약 50,000cm²으로부터 출발하여, 실시예 5.1 내지 5.5 에 기재된 절차는 대략 1.3mg의 E1 단백질 및 0.6mg의 E2 단백질의 정제를 허용한다.

분비된 E2 단백질 (세포내 형태로, 대략 30-40%, 60-70%를 구성함)은 집합체 형성의 특징이 있다는 것을 또한 주목해야 한다 (예상과 대조적으로). 동일한 문제가 분비된 E2를 정제하는데 생긴다. 분비된 E2는 상기에 개시된 바와 같이 정제될 수 있다.

실시예 6: 항-E1 또는 항-E2 항체 검출 또는 El 또는 E2 단백질 검출용 ELISA

Maxisorb 미세웰 플레이트 (Nunc, Roskilde, Denmark)를 웰 당 1 부피의 (예를 들면, 50㎕ 또는 100㎕ 또는 200㎕) PBS 중의 스트렙트아비딘 (Boehringer Mannheim) 5 ㎍/ml 용액을 이용하여 4℃에서 16시간 동안 또는 37℃에서 1시간 동안 코팅하였다. 대안적으로, 웰을 1부피의 50mM 소듐 카르보네이트 완충액 pH 9.6 중의 갈란투스 니발리스 (Galanthus nivalis) 아글루티닌 (GNA) 5 ㎍/ml을 이용하여 4℃에서 16시간 동안 또는 37℃에서 1시간 동안 코팅하였다. GNA를 이용하여 코팅한 경우에, 플레이트를 Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgium)의 세척 용액 400㎕로 2회 세척하였다. 미결합 코팅 표면을 1.5 내지 2 부피의 차단 용액 (PBS 중의 0.1% 카세인 및 0.1% NaN₃)으로 37℃에서 1시간 동안 또는 4℃에서 16시간 동안 차단하였다. 차단 용액을 흡입하였다. 정제된 E1 또는 E2를 l00-1000 ng/ml로 희석하거나 (농도를 A = 280 nm에서 측정함) 칼럼 분획을 E1 또는 E2에 대해 스크리닝하거나 (실시예 5 참조), 정제되지 않은 세포 용해물 (실시예 5.1.) 중의 E1 또는 E2를 차단 용액에서 20배 희석하고, 1 부피의 E1 또는 E2 용액을 각 웰에 첨가하고, 스트렙트아비딘- 또는 GNA-코팅된 플레이트 상에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 미세웰을 1 부피의 Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgium)의 세척 용액으로 3회 세척하였다. 혈청 시료를 20배 희석하거나 단클론 항-E1 또는 항-E2 항체를 Innotest HCV Ab III 키트의 시료 희석액 중에 20ng/ml의 농도로 희석하고, 1 부피의 용액을 37℃에서 1시간 동안 E1 또는 E2 단백질과 반응하도록 방치하였다. 미세웰을 Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgium)의 세척 용액 400㎕로 5회 세척하였다. 결합된 항체를 각 웰을 37℃에서 1시간 동안 1 부피의 Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgium)의 접합물 희석제 중에 1/80,000로 희석된 염소 항-인간 또는 항-마우스 IgG, 퍼옥시다제-접합된 이차 항체 (DAKO, Glostrup, Denmark)와 함께 인큐베이션하여 검출하고, 색 발생은 Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgium)의 세척 용액 400㎕로 플레이트를 3회 세척 후에 24℃에서 30분 동안 Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgium)의 1 부피의 기질 용액 중에 100배 희석된 Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgium)의 기질을 첨가하여 수득하였다.

실시예 7: 상이한 임상 프로필을 갖는 환자 군의 추적 (follow up)

7.1. 항-E1 및 항-E2 항체의 모니터링

현재의 C형 간염 바이러스 (HCV) 진단 분석법은 HCV 항체의 존재의 스크리닝 및 확인을 위해 개발되었다. 그러한 분석법은 질병 치료의 모니터링 또는 질병의 결과의 예후에 유용한 정보를 제공하지 못하는 것 같다. 그러나, B형 간염의 경우에, 항-외피 항체의 검출 및 정량화는 임상 세팅에서 더욱 유용한 것으로 증명될 수 있다. C형 간염 질병의 결과에 대한 예후 마커로서 항-E1 항체 역가 및 항-E2 항체 역가의 용도의 가능성을 조사하기 위해, 장기간 지속된 반응을 보이는 일련의 IFN-α처리된 환자 (치료 후 1년 이상의 기간 동안 혈액에서 정상적인 트랜스아미나아제 수준 및 HCV-RNA 시험 (5' 비코딩 부위에서 PCR)이 음성인 환자로 정의함)를 반응을 보이지 않거나 치료 말기에 재발하는 생화학적 반응을 보이는 환자와 비교하였다.

장기간 지속된 반응 (LTR, 1년 내지 3.5년까지 추적, 3명의 유형 3a 및 5명의 유형 1b)을 보이는 8명의 IFN-α처리된 환자군을 치료에 대한 불완전 반응 (NR, 1년 내지 4년까지 추적, 6명의 유형 1b 및 3명의 유형 3a)을 보여주는 9명의 환자와 비교하였다. 유형 1b(vvHCV-39, 실시예 2.5. 참조) 및 3a E1 (vvHCV-62, 실시예 2.5. 참조) 단백질을 백시니아 바이러스 시스템에 의해 발현하고 (실시예 3 및 4 참조), 균질하게 정제하였다 (실시예 5). 유형 1b C형 간염 바이러스로 감염된 환자로부터 유도된 시료를 정제된 유형 1b E1 단백질과의 반응성에 대해 시험한 반면, 유형 3a 감염 시료는 실시예 6에 기재된 ELISA로 항-유형 3a E1 항체의 반응성에 대해 시험하였다. 상이한 환자를 감염시키는 C형 간염 바이러스의 유전형을 Inno-LiPA 유전형결정 분석법 (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgium)에 의해 결정하였다. 도 5는 인터페론 치료 기간 동안 및 치료 후 추적 기간 동안 상기 환자의 항-E1 신호 대 잡음비를 보여준다. LTR 경우는 일관되게 급격하게 감소하는 항-E1 수준 (3 가지의 경우에 완전한 음성)을 보여주는 반면, NR 경우의 항-E1 수준은 대략 일정하게 유지되었다. 수득된 항-E1 데이타의 일부를 평균 S/N 비 ±SD (평균 항-E1 역가)로서 표 2에 보여준다. 항-E1 역가는 도 5, 6, 7, 및 8에 보여준 신호 대 잡음비로부터 추론될 수 있었다.

치료 말기에 이미, 2개의 군 사이에 현저한 차이가 관찰될 수 있었다. 항-E1 항체 역가는 LTR에서 6.9배 감소하였으나, NR에서는 단지 1.5배 감소하였다. 추적 말기에, 항-E1 역가는 지속된 반응을 보이는 환자에게서 22.5의 인자에 의해 감소하였고, NR에서는 경미하게 증가하였다. 그러므로, 상기 데이타에 기초하여, IFN-α치료의 모니터링 동안 항-E1 항체 수준의 감소는 치료에 대한 장기간의, 지속된 반응과 관련 있다. 항-E1 분석은 IFN 치료, 또는 일반적으로 C형 간염 질병의 치료에 대한 장기간의 반응의 예후에 대해 매우 유용할 수 있다.

상기 발견은 예기치 못하였다. 반대로, 본 발명가들은 항-E1 항체 수준이 장기간 반응을 보이는 환자에서 IFN 치료 과정 동안 증가하리라 예상하였다. B형 간염의 경우에서처럼, 바이러스는 항-HBsAg 항체로 혈청전환의 결과 제거되었다. 또한 많은 다른 바이러스 감염에서, 항-외피 항체가 증가할 경우 바이러스는 제거된다. 그러나, 본 발명의 실험에서, 항-E1 항체는 치료에 대한 장기간 반응을 보이는 환자에서 명백히 감소한 반면, 항체 수준은 무응답 환자와 대략 동일한 수준이었다. 상기 실험의 결과가 예기치 못할지라도, 상기 불명확한 발견은 HCV 감염의 임상 진단에 매우 중요하고, 유용할 수 있다. 도 9, 10, 11 및 12에 보여주는 바와 같이, 항-E2 수준은 연구된 동일한 환자에서 매우 상이하게 나타났고, 역가의 명백한 감소도 항-E1 항체에 대해 관찰되지 않았다. 도 35는 파일롯 연구의 완전한 개관을 제공한다.

표 2로부터 추론할 수 있는 바와 같이, 항-E1 역가는 치료에 대한 불완전 응답자와 비교하여 장기간 응답자에서 치료의 초기에 평균하여 2배 이상 높았다. 그러므로, 치료의 초기에 항-E1 항체의 역가를 측정하거나, 감염 과정 동안 환자를 모니터링하고, 항-E1 역가를 측정하는 것은 C형 간염의 임상 진단에 유용한 마커가 될 수 있다. 더욱이, E1 또는 E2 단백질의 더욱 정의된 부위의 용도가 실시예 7.3.에 보여준 바와 같이, 바람직하게 될 것이다.

7.2. 더 큰 그룹에서 E1 및 E2 항체의 분석

파일롯 연구로 본 발명가들은 감염이 완전히 제거된 경우에, E1 항체가 가장 급격히 변하면서, HCV 외피 단백질에 대한 항체는 종래 연구된 HCV 항원에 대한 항체보다 더욱 급격히 변한다고 결론지었다. 그러므로, 우리는 양 그룹이 각각 14명의 환자를 포함하도록, 더욱 많은 유형 1b 및 3a-감염된 LTR을 포함했고, 추가로 부합된 일련의 NR로 그룹을 보충하였다. 일부 부분적인 응답자 (PR) 및 재발하는 응답자 (RR)를 또한 분석하였다.

도 36은 LTR 및 NR 그룹에서 평균 E1 항체 (E1Ab) 및 E2 항체 (E2Ab) 수준을 나타내고, 표 4 및 5는 통계 분석을 보여준다. 상기 더 큰 그룹에서, IFN-α 치료 전의 더 높은 E1 항체 수준은 LTR 과 관련있었다 (P < 0.03). 더욱 높은E1 항체 수준이 유형 1b-감염된 환자와 비교하여 유형 3a-감염된 환자에서 관찰되므로 (도 37), 유전형을 고려하였다 (표 4). 유형 1b-감염된 그룹내에, LTR은 또한 치료의 초기에 NR보다 더욱 높은 E1 항체 수준을 가졌고 [P < 0.05]; 제한된 수의 유형 3a-감염된 NR은 통계 분석을 허용하지 않았다.

1.5년 추적 기간 동안 LTR에서 모니터링된 항체 수준 중에서, 치료 초기에 측정된 수준과 비교하여 단지 E1 항체가 급격히 제거되었다 [P = 0.0058, 치료 말기; 각각 치료 후 6개월 및 12개월에 P = 0.0047 및 P =0.0051]. 상기 제거는 유형 1- 또는 유형 3-감염된 LTR 내에 현저하게 유지되었다 (평균 P 값 < 0.05). 상기 데이타는 E1Ab 수준이 결심의 초기에 급격히 감소한다는 초기의 발견을 확인하였다. 상기 특징은 바이러스 유전형과는 무관한 것 같다. NR, PR, 또는 RR에서, 추적 기간 내내 측정된 항체의 어느 것에도 변화가 관찰되지 않았다. 치료 동안 ALT 수준의 정상화 및 HCV-RNA 음성인, 치료에 대해 양호하게 응답하는 환자에서, 지속된 응답자 (LTR) 및 재발하는 응답자 (RR) 사이에 현저한 차이가 있었다. LTR과 대조적으로, HCV-RNA의 검출을 위해 PCR 또는 다른 고전적인 기술 또는 증가된 ALT 수준에 의해 증명될 수 없는 신비한 HCV 감염의 존재를 나타내면서, RR은 임의의 감소하는 E1 항체 수준을 보여주지 않았다. 치료 동안 RR 그룹에 여전히 존재하는 미량의 바이러스 RNA는 항-E1 B 세포를 자극할 수 있는 것 같다. 그러므로, 항-E1 모니터링은 NR뿐만 아니라, RR로부터 LTR을 구분할 수 있다.

7.3. E1 단백질의 정의된 부위의 항체의 모니터링

HCV 항원을 확인하는 분자생물학적 접근이 바이러스 진단의 개발에 전례없는 돌파구를 초래하지만, λgt11 라이브러리의 면역 스크리닝의 방법은 우세하게 코아 및 비구조 부위를 통해 분산된 선형 항원결정부를 수득하였고, 외피 부위의 분석은 포유동물 세포에서 E1/E2 부위의 클로닝 및 발현을 기다려야 했다. 상기 접근은 외피 부위에 대한 항원결정부의 지도가 게놈 구조의 해석 오래 전에 이미 작성된 많은 다른 바이러스 감염과 급격히 대조된다. 그러한 항원결정부 및 해당하는 항체는 종종 백신 개발에 유용한 중화 활성을 가지고/가지거나 임상적인 또는 예후 중요성을 가진 진단 분석법의 개발을 허용한다 (예를 들면, B형 간염 표면 항원에 대한 항체). C형 간염 질병의 임상적인 진단 및 예후를 허용하는 어떠한 HCV 백신이나 시험이 현재 유용하지 않기 때문에, 면역 감시에 드러난 바이러스 외피 부위의 규명은 HCV 진단 및 예방에 새로운 방향을 모색하는데 현저히 공헌할 수 있다.

8개의 아미노산이 서로 겹치는 몇 개의 20-mer 펩티드 (표 3)를 HC-J1 서열 (Okamoto 등, 1990)에 기초하여 이전에 기재된 방법 (EP-A-0 489 968)에 따라 합성하였다. 펩티드 env35 (또한 E1-35로 일컬어짐)를 제외한 어느 것도 대략 200 HCV 경우의 혈청에서 항체를 검출할 수 없었다. 단지 2 개의 혈청이 env35 펩티드와 경미하게 반응하였다. 그러나, 실시예 6에 기재된 항-E1 ELISA 에 의해, 하기와 같이 부가적인 항원결정부를 발견하는 것은 가능하였다: 실시예 6에 기재된 항-E1 ELISA를 50 ㎍/ml의 E1 펩티드와 시료 희석제 중에 1/20 희석된 인간 혈청을 혼합함으로써 변형하였다. 도 13은 E1 펩티드의 단독 또는 혼합물의 존재하에, 재조합 E1 (vvHCV-40으로부터 발현됨) 단백질에 대한 인간 혈청의 반응성을 보여준다. 혈청의 단지 2%가 라인(Line) 면역분석 포멧에서 스트립상에 코팅된 E1 펩티드에 의해 검출될 수 있는 반면, 재조합 E1 단백질상에서 시험할 경우에 혈청의 반 이상이 동일한 펩티드에 의해 경쟁할 수 있는 항-E1 항체를 포함하였다. 정제된 E1 단백질로 주사 후에 Balb/C 마우스로부터 수득된 무린 단클론 항체의 일부는 이어서 E1에 대한 반응성에 있어서, 단일 펩티드와 경쟁하였다 (도 14). 명백히, env53 의 첨가는 실질적으로 몇 개의 혈청의 반응성에 대해 E1과 경쟁하고, env31 부위에 대한 항체가 또한 검출되었기 때문에, env53 부위는 우세한 항원결정부를 포함하였다. env53 및 env31 펩티드는 고체상에 직접 코딩될 경우에 어떠한 반응성도 보여주지 않았기 때문에, 상기 발견은 놀라웠다.

그러므로 이전에 본 출원인이 기재한 기술을 사용하여 펩티드를 합성하였다 (WO 93/18054). 하기 펩티드를 합성하고:

펩티드 env35A-바이오틴

NH₂-SNSSEAADMIMHTPGCV-GK바이오틴 (서열 번호 51)

E1 부위의 HCV 다중단백질의 아미노산 208 내지 227에 위치함

펩티드 바이오틴-env53 ('항원결정부 A')

바이오틴-GG-ITGHRMAWDMMMNWSPTTAL-COOH (서열 번호 52)

E1 부위의 HCV 다중단백질의 아미노산 313 내지 332에 위치함

펩티드 lbE1 ('항원결정부 B')

H₂N-YEVRNVSGIYHVTNDCSNSSIVYEAADMIMHTPGCGK-바이오틴 (서열 번호 53)

E1 부위의 HCV 다중단백질의 아미노산 192 내지 228에 위치함

유전형 각각 1a 및 1b 서열의 동일한 부위로부터 유도되고, 1993년 Glasgow에서 개최된 9회 국제 바이러스 학회에서 기재된 ('항원결정부 C') 펩티드 E1a-BB (바이오틴-GG-TPTVATRDGKLPATQLRRHIDLL, 서열 번호 54) 및 E1b-BB (바이오틴-GG-TPTLAARDASVPTITIRRHVDLL, 서열 번호 55)의 반응성과 비교하였다. HCV 혈청의 판넬의 반응성은 항원결정부 A, B 및 C에서 시험하고, 항원결정부 B를 또한 env35A (47개의 HCV-양성 혈청 중에서, 8개가 항원결정부 B에서 양성이고, 어느 것도 env35A와 반응하지 않았다)와 비교하였다. 항원결정부 A, B, 및 C에 대한 반응성을 실시예 6에 기재된 스트렙트아비딘-코팅된 플레이트에 결합된 바이오티닐화된 펩티드 (50 ㎍/ml)에 직접 시험하였다. 명백히, 항원결정부 A 및 B는 가장 반응성이었으나, 항원결정부 C 및 env35A-바이오틴은 덜 반응성이었다. 완전한 E1 단백질 (실시예 7.1.)에 대해 이들 반응성에 대해 모니터링된 동일한 일련의 환자를 항원결정부 A, B, 및 C에 대한 반응성에 대해 시험하였다. 항원결정부 C에 대해서는 어떠한 반응성도 관찰되지 않은 반면, 도 15, 16, 17 및 18에 보여준 바와 같이, 항원결정부 A 및 B는 혈청의 대부분과 반응하였다. 그러나, 가장 반응성인 항원결정부 (항원결정부 A)에 대한 항체는 질병의 회복이 예상되지 않는 반면, 항-1bE1 항체 (항원결정부 B)는 IFN 치료의 시작에서 장기간 응답자에서 거의 배타적으로 존재하였다. 그러므로, 항-1bE1 (항원결정부 B) 항체 및 항-env53 (항원결정부 A) 항체는 C형 간염 질병의 예후에 대한 유용한 마커로 보여진다. env53 항원결정부는 유리하게는 교차 반응성 항체 (주요 유전형 사이에서 교차 반응하는 항체)의 검출을 위해 사용될 수 있고, env53 부위에 대한 항체는 혈청 또는 간 조직에서 보편적인 E1 항원 검출에 매우 유용할 수 있다. env53 부위를 인지하는 단클론 항체는 무작위 항원결정부 라이브러리와 반응하였다. 단클론 항체 5E1A10을 이용한 면역스크리닝시 반응한 4 개의 클론에서, 서열 -GWD- 가 존재하였다. env53 부위의 모든 HCV 변이체에 존재하는 보편적인 HCV 서열과의 유사성때문에, 서열 AWD는 env53 교차 반응성 무린 항원결정부의 필수 서열을 포함하는 것으로 생각된다. env31은 명백히 또한 아미노 말단 서열 -YQVRNSTGL- (서열 번호 93)에 항원결정부를 함유할 수 있고, 진단에 유용할 수 있는 가변 부위를 포함한다. 표 3에 보여준 Env31 또는 E1-31은 펩티드 1bE1의 부분이다. 펩티드 E1-33 및 E1-51은 또한 어느 정도 무린 항체와 반응하였고, 펩티드 E1-55 (가변 부위 6 (V6)을 포함함; 아미노산 위치 329-336에 위치함)는 또한 환자 혈청의 일부와 반응하였다.

항-E2 항체는 특히 치료에 대한 장기간 반응을 보이는 환자에서, 명백히 항-E1 항체와 상이한 패턴을 따랐다. 그러므로, 항-외피 항체의감소는 재조합 E1/E2 단백질을 이용한 분석이 단일 항-E1 또는 항-E2 단백질을 이용하는 것 보다 효율적으로 측정될 수 없다는 것이 명백하다. 항-E2 반응은 명백히 동시에 두 종류의 항체를 측정하는 분석에서 항-E1 반응을 흐리게 할 것이다. 그러므로, 단일 E1 및 E2 단백질에 대한 항-외피 항체를 시험하는 능력은 유용한 것으로 보여진다.

7.4. 항-E2 항체의 지도작성

24개의 항-E2 Mab 중에서, 단지 3 개가 펩티드로 재조합 E2에 대한 반응성에 대해 경쟁할 수 있었다. 그 중에 2 개는 HVRI 부위 (펩티드 E2-67 및 E2-69, 항원결정부 A로 표시함)와 반응하였고, 하나는 펩티드 E2-13B (항원결정부 C)와 경쟁하는 항원결정부를 인지했다. 무린 항체의 대부분은 입체형태적 항-E2 항원결정부를 인지했다 (도 19). HVRI (항원결정부 A) 및 더 적은 정도로 HVRII (항원결정부 B) 및 세번째 선형 항원결정부 부위 (펩티드 E2-23, E2-25 또는 E2-27로 경쟁함, 항원결정부 E로 표시함) 및 네번째 선형 항원결정부 부위 (펩티드 E2-17B로 경쟁함, 항원결정부 D)에 대한 인간의 반응은 또한 자주 관찰될 수 있었으나, 혈청의 대부분은 입체형태적 항원결정부와 반응하였다 (도 20). 상기 입체형태적 항원결정부는 하기와 같이 이들의 상대적인 위치에 따라 분류될 수 있다: 입체형태적 항원결정부를 인지하는 하이브리도마 15C8C1, 12D11F1, 9G3E6, 8G10D1H9, 10D3C4, 4H6B2, 17F2C2, 5H6A7, 15B7A2의 상층액내의 IgG 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, 1 mg/ml 의 생성 IgG는 바이오틴의 존재하에 보레이트 완충액에서 바이오티닐화되었다. 바이오티닐화된 항체를 겔 여과 크로마토그래피에 의해 유리 바이오틴으로부터 분리하였다. 합한 바이오티닐화된 항체 분획을 100 내지 10,000배 희석하였다. 고체상에 결합된 E2 단백질을 바이오티닐화되지 않은 경쟁 항체의 양의 100배의 존재하에 바이오티닐화된 IgG 로 검출하고, 이어서 알카리 포스파타아제 표지된 스트렙트아비딘으로 검출하였다.

경쟁의 백분율을 표 6에 제공한다. 상기 결과에 기초하여, 4 개의 입체형태적 항-E2 항원결정부 부위 (항원결정부 F, G, H 및 I)를 나타낼 수 있었다 (도 38). 대안적으로, 상기 Mab는 본 연구에서 사용된 펩티드로 표시되지 않는 돌연변이 선형 항원결정부를 인지할 수 있다. Mab 4H6B2 및 10D3C4는 16A6E7의 반응성과 경쟁하였으나, 16A6E7와 달리, 펩티드 E2-13B를 인지하지 않았다. 상기 Mab는 동일한 선형 항원결정부 (항원결정부 C)의 변이체를 인지할 수 있거나 입체적으로 방해된 입체형태적 항원결정부를 인지하거나 E2-13B 부위 (항원결정부 H)에 16A6E7의 결합 후에 입체형태를 변화시킬 수 있다.

실시예 8: E1 글리코실화 돌연변이체

8.1. 서론

포유동물 세포로부터 발현되는, vvHCV10A에 의해 코딩되는 E1 단백질 및 vvHCV41 내지 44에 의해 코딩되는 E2 단백질은 각각 6 개 및 11 개 탄수화물을 포함한다. 이것은 용해물 (E1 포함)내의 단백질이 부분적으로 탈글리코실화되도록 (각각 도 39 및 40), vvHCV10A-감염된 또는 vvHCV44-감염된 RK13 세포의 용해물을 감소하는 농도의 글리코시다제 (제조자의 지시에 따라 PNGase F 또는 엔도글리코시다제 H, (Boehringer Mannhein Biochemica))와 인큐베이션함으로써 알 수 있었다.

이들 글리코실화 자리의 일부가 없는 돌연변이체는 개선된 면역 반응성을 갖는 외피 단백질의 선택을 허용할 수 있었다. 예를 들면 HIV에 대해, 특정 선택된 당-부가 모티프가 없는 gp120 단백질은 진단 또는 백신 목적에 특히 유용한 것으로 알려졌다. A/Hong Kong/3/68 (H3N2) 인플루엔자 바이러스의 도피 돌연변이체의 헴아글루티닌 단백질에 신규 올리고당 측쇄의 추가는 중화 단클론 항체와의 반응성을 막는다 (Skehel 등, 1984). 신규 글리코실화 자리를 특이자리돌연변이에 의해 인플루엔자 헴아글루티닌 단백질내로 도입할 경우, 탄수화물이 항원성의 변형제로서 이용된다는 것을 제안하면서, 극적인 항원 변화가 관찰되었다 (Gallagher 등, 1988). 또 다른 분석에서, 프렌드 무린 루케미아 바이러스 (Friend Murine Leukemia virus)의 표면 단백질 gp70의 8 개의 탄수화물-부가 모티프를 삭제하였다. 돌연변이 중에서 7 개가 바이러스 감염성에 영향을 주지 않았지만, 아미노 말단에 대해 4번째 글리코실화 신호의 돌연변이는 비감염성 표현형을 초래하였다 (Kayman 등, 1991). 더욱이, N-연결된 탄수화물 사슬의 첨가는 폴딩 중간체의 안정화 및 효율적인 폴딩, 소포체에서 잘못된 폴딩의 방지 및 분해, 올리고머화, 생물학적 활성 및 당단백질의 수송에 중요하다는 것이 당업계에 공지되어 있다 (Rose 등, 1988: Doms 등, 1993; Helenius, 1994 의 리뷰 참조).

HCV 유전형의 상이한 외피 단백질 서열의 정렬 후에, 일부는 특정 (서브)유형에 존재하지 않기 때문에, HCV 서브유형 1b E1 단백질상의 모든 6 개의 글리코실화 자리가 올바른 폴딩 및 활성에 필요하지 않다고 추리될 수 있다. 유형 1b, 6a, 7, 8 및 9에 존재하는 4번째 탄수화물 모티프 (Asn251 상의)는 오늘날 공지된 모든 다른 유형에는 존재하지 않는다. 상기 당-부가 모티프는 개선된 반응성을 갖는 유형 1b E1 단백질을 수득하도록 돌연변이될 수 있다. 또한 유형 2b 서열은 V5 부위 (Asn299 상의)에 여분의 글리코실화 자리를 보여준다. 유전형 2c에 속하는 분리종 S83조차 V1 부위 (Asn 상의)에 첫번째 탄수화물 모티프가 없는 반면, 모든 다른 분리종에는 존재한다 (Stuyver 등, 1994). 그러나, 완전히 보존된 당-부가 모티프 중에서도, 탄수화물의 존재는 폴딩에 필요하지 않을지 모르나, 면역 감시를 벗어나는데 역할을 할 수 있다. 그러므로, 올바른 폴딩 (및 반응성)에 필요하지 않은 탄수화물 부가 모티프의 확인은 명백하지 않고, 각각의 돌연변이체가 반응성에 대해 분석되고 시험되어야 한다. 글리코실화 모티프 (NXS 또는 NXT 서열)의 돌연변이유발은 코돈이 N의 경우에 N과 상이한 아미노산을 코딩하고/하거나 S 및 T의 경우에 S 또는 T와 상이한 아미노산을 코딩하는 방식으로, 코돈 N, S, 또는 T를 돌연변이시킴으로써 이루어질 수 있다. 대안적으로, NPS 또는 NPT는 탄수화물에서 자주 변형되지 않는다고 알려져 있기 때문에, X 위치는 P로 돌연변이될 수 있다. 탄수화물-부가 모티프가 폴딩 및/또는 반응성에 필요한지 아니한지를 확립한 후에, 그러한 돌연변이의 조합이 행해질 수 있다.

8.2. E1 단백질의 돌연변이유발

모든 돌연변이는 클론 HCCI10A (서열 번호 5)의 E1 서열에서 수행하였다. PCR의 제 1회는 돌연변이유발을 수득하기 위해 원하는 염기 변화를 포함한 백시니아 11K 후기 프로모터의 상류에 위치한 GPT 서열을 표적화한 센스 프라이머 'GPT' (표 7 참조) 및 안티센스 프라이머 (GLY#로 표시함, #는 글리코실화 자리의 수를 나타냄, 도 41 참조)를 사용하여 수행하였다. 6 개의 GLY# 프라이머 (각각은 제공된 글리코실화 자리에 특이적임)는 하기와 같이 고안되었다:

- N-글리코실화된 Asn (AAC 또는 AAT)를 코딩하는 코돈에서 Gln 코돈 (CAA 또는 CAG)로의 변형.

글루타민은 아스파라긴에 매우 유사하기 때문에 선택되었다 (양자의 아미노산은 중성이고, 비극성 잔기를 포함하며, 글루타민은 더 긴 측쇄 (하나 이상의 -CH₂- 기)를 갖는다).

- 신규한 단일 또는 희귀 (예를 들면, E1Gly5의 두번째 SmaI 자리) 제한효소 자리를 생성하기 위해, 글리코실화 자리의 하류에 있는 코돈의 하나 또는 몇 개에서 침묵 돌연변이의 도입. 아미노산 서열을 변형하지 않고, 상기 돌연변이는 돌연변이된 서열과 원래의 E1 서열 (pvHCV-10A) 또는 서로를 구별하는 방법을 제공할 것이다 (도 41). 이 부가적인 제한효소 자리는 또한 신규 하이브리드 (이중, 삼중 등) 글리코실화 돌연변이체의 구축에 유용할 수 있다.

- l8 개의 뉴클레오티드는 첫번째 비부합 뉴클레오티드의 5'으로 신장되고, 12 내지 16 개의 뉴클레오티드는 3' 말단으로 신장된다. 표 7은 N-연결된 글리코실화 자리의 서열과 겹치는 6 개의 GLY# 프라이머의 서열을 나타낸다.

특이자리 돌연변이유발을 위해, '잘못프라이밍' 또는 '겹침 신장' (Horton, 1993)을 사용하였다. 개념을 도 42 및 43에서 설명한다. 먼저, 두개의 별개의 절편을 각각의 돌연변이된 자리에 대해 표적 유전자로부터 증폭하였다. 5' 말단으로부터 수득된 PCR 산물 (산물 GLY#)을 5'센스 GPT 프라이머 (표 7 참조) 및 각각의 3' 안티센스 GLY# 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 두번째 절편 (산물 OVR#)을 3' 안티센스 TK_R프라이머 및 각각의 5' 센스 프라이머 (OVR# 프라이머, 표 7, 도 43 참조)를 사용하여 증폭하였다.

OVR# 프라이머는 GLY# 프라이머 서열의 부분을 표적화한다. 그러므로, PCR 산물의 두개의 군은 동일한 서열의 겹침 부위를 공유한다. 상기 중간 산물을 혼합하고 (GLV-1과 OVR-1, GLY-2와 OVR-2 등), 고온에서 녹이고, 재어닐링할 경우에, 두 개의 가닥이 서로에 대한 프라이머로서 작용하도록, 산물 GLY#의 상단 센스 가닥은 산물 OVR# (및 그 역)의 안티센스 가닥에 어닐링할 수 있다 (도 42.B. 참조). 2회의 PCR 사이클 동안 Taq 중합효소에 의해 어닐링된 겹칩의 신장으로 글리코실화 자리 번호 #를 파괴하는 돌연변이를 갖는, 전체 길이 돌연변이체 분자 E1Gly#를 수득하였다. 클로닝을 위한 충분한 양의 E1GLY# 산물을 공통 세트의 두 개의 내부 네스티드 프라이머에 의해 세번째 PCR에서 생성하였다. 상기 두 개의 신규 프라이머는 각각 백시니아 11 K 프로모터의 3' 말단 (센스 GPT-2 프라이머) 및 백시니아 티미딘 키나아제 위치의 5' 말단 (안티센스 TK_R-2 프라이머, 표 7 참조)과 겹친다. 모든 PCR 조건은 Stuyver 등 (1993)에 기재된 바와 같이 수행하였다.

상기 PCR 산물의 각각을 EcoRI/BamHI 절단에 의해 원래의 E1 서열 (pvHCV-10A)을 함유한 EcoRI/BamHI-절단된 백시니아 벡터내로 클로닝하였다.

선택된 클론을 EcoRI/BamH I 절단으로 인서트의 길이 및 각각의 신규 제한효소 자리의 존재에 대해 분석하였다. 돌연변이된 자리와 겹치는 서열을 이중가닥 서열결정에 의해 확인하였다.

8.3. E1 글리코실화 돌연변이체의 분석

실시예 8.2에 기재된 돌연변이체 E1 서열을 포함한 6 개의 플라스미드로부터 출발하여, 재조합 백시니아 바이러스를 실시예 2.5 에 기재된 야생형 백시니아 바이러스와의 재조합에 의해 생성하였다. 간단히, 175 cm²-플라스크의 서브합류 RK13 세포를 돌연변이체 E1 서열을 갖는 6 개의 재조합 백시니아 바이러스뿐만 아니라, vvHCV-10A (비돌연변이 E1 서열을 가짐) 및 야생형 백시니아 바이러스로 감염시켰다. 세포를 감염 24시간 후에 용해하고, 실시예 4에 기재된 웨스턴 블롯상에서 분석하였다 (도 44A 참조). 모든 돌연변이체는 하나의 탄수화물 부분도 첨가되지 않은 것을 확인하면서, 원래의 E1 단백질보다 SDS-PAGE 상에서 더 빠른 이동성 (대략 2 내지 3 kDa의 적은 분자량에 해당함)을 보여주었다. 재조합 바이러스를 또한 PCR 및 제한효소 분석으로 분석하여, 상이한 돌연변이체의 존재를 확인하였다. 도 44B는 모든 돌연변이체 (도 41에 보여줌)가 예상된 부가적인 제한효소 자리를 포함하고 있다는 것을 보여준다. 세포 용해물의 또 다른 부분을 사용하여 ELISA로 상이한 돌연변이체의 반응성을 시험하였다. 용해물을 20배 희석하고, 실시예 6에 기재된 렉틴 GNA로 코팅된 미세웰 플레이트에 첨가하였다. 포획된 (돌연변이체) E1 당단백질을 실시예 6에 기재된 24명의 HCV-감염된 환자의 20배 희석된 혈청과 반응하도록 방치하였다. 6 종의 돌연변이체 및 E1에 대한 신호 대 잡음비 (S/N) 값 (GLY#의 OD/야생형의 OD)을 표 8에 보여준다.표는 또한 GLY# 및 E1 단백질의 S/N 값 사이의 비를 보여준다. 환자 혈청과의 반응성의 비교를 위해 상이한 돌연변이체의 세포 용해물을 사용하는 접근은 반응성 수준보다 오히려 상이한 발현 수준의 결과라는 관찰을 초래할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 그러한 어려움은 실시예 5에 기재된 상이한 돌연변이체의 정제 및 모든 상이한 E1 단백질의 동일한 양을 시험함으로써 극복될 수 있다. 그러나, 표 5에 보여준 결과는 이미 첫번째 (GLYl), 세번째 (GLY3), 및 여섯번째 (GLY6) 글리코실화 모티프의 제거가 일부 혈청의 반응성을 감소시키는 반면, 두번째 및 다섯번째 자리의 제거는 감소시키지 않는다는 것을 나타낸다. GLY4의 제거는 특정 혈청의 반응성을 개선시키는 것 같다. 상기 데이타는 상이한 환자는 본 발명의 글리코실화 돌연변이체에 상이하게 반응한다는 것을 나타낸다. 그리하여, 그러한 돌연변이체 E1 단백질은 HCV 질병의 진단 (스크리닝, 확인, 예후 등) 및 예방에 유용할 수 있다.

실시예 9: 글리코실화 결핍 효모에서 HCV E2 단백질의 발현

클론 HCCL41에 해당하는 E2 서열은 α-교배 인자 프리/프로 신호 서열과 함께 제공되고, 효모 발현 벡터내로 삽입되고, 상기 구축물로 형질전환된 에스. 세레비지애는 성장 배지내로 E2 단백질을 분비하였다. 대부분의 글리코실화 자리는 에스. 세레비지애 균주내의 그러한 구축물의 발현시 높은 만노오스 유형 글리코실화로 변형되었다는 것이 관찰되었다 (도 45). 이것은 백신 또는 진단 목적에 바람직하지 않은, 매우 높은 수준의 이질성 및 반응성의 차폐를 초래하였다. 이 문제를 극복하기 위해, 변형된 글리코실화 경로를 가진 에스. 세레비지애 돌연변이체를 바나데이트-저항성 클론의 선발에 의해 생성하였다. 그러한 클론을 당단백질 인버타아제의 분자량 및 이질성의 분석으로 변형된 글리코실화 경로를 분석하였다. 이것은 상이한 글리코실화 결핍 에스. 세레비지애 돌연변이체를 확인하게 하였다. E2 단백질을 이어서 선발된 돌연변이체의 일부에서 발현하고, 실시예 4에 기재된 웨스턴 블롯상에, 실시예 7에 기재된 단클론 항체와 반응하도록 방치하였다 (도 46).

실시예 10. 일반적인 이용성

본 결과는 양호한 발현 시스템뿐만 아니라 양호한 정제 절차가 환자 혈청과 HCV 외피 단백질의 높은 반응성을 달성하기 위해 필요하다는 것을 보여준다. 이것은 단백질의 천연 폴딩의 보존을 보증하는 적당한 HCV 외피 단백질 발현 시스템 및/또는 정제 절차 및 오염 단백질의 제거를 보증하고, 입체형태 및 HCV 외피 단백질의 반응성을 보존하는 본 발명의 정제 절차를 사용하여 수득될 수 있다. 진단 스크리닝 분석에 필요한 정제된 HCV 외피 단백질의 양은 년간 그램 수준이다. 백신 목적으로, 더 많은 양의 외피 단백질이 필요할 수 있다. 그러므로, 백시니아 바이러스 시스템은 최적의 발현 구축물을 선발하고, 제한된 규모 증가에 사용될 수 있고, 높은 만노오스 탄수화물을 함유한 단일 또는 특정 올리고머 외피 단백질의 대량 발현 및 정제는 몇 개의 효모 균주로부터 발현될 경우에 성취될 수 있다. 예를 들면, B형 간염의 경우에, 포유동물 세포로부터 HBsAg를 제조하는 것은 효모로부터 유도된 B형 간염 백신과 비교하여 훨씬 더 비쌌다.

본 발명에 개시된 정제 방법은 또한 일반적으로 '바이러스 외피 단백질'에대해 사용될 수 있다. 예는 플라비바이러스 (Flavivirus), 신규로 발견된 GB-A, GB-B 및 GB-C 간염 바이러스, 페스티바이러스 (Pestivirus) (예를 들면, 소 바이러스 설사 바이러스 (Bovine viral Diarrhoea virus: BVDV), 돼지 콜레라 바이러스 (Hog Cholera virus: HCV), 보더 질병 바이러스 (Border Disease virus: BDV))뿐만 아니라, 덜 관련된 바이러스, 예를 들면, B형 간염 바이러스 (주로 HBsAg의 정제를 위해)로부터 유래된 것이다.

본 발명의 외피 단백질 정제 방법은 상세한 설명 섹션에서 설명된 하등 또는 고등 진핵 세포 또는 원핵세포에서 세포내뿐만 아니라 세포외로 발현된 단백질에 대해 사용될 수 있다.

실시예 11. 예방 및 치료 이용성의 증명

HCV로 만성 감염된 침팬지의 간 질병은 E1을 이용한 면역화에 의해 감소될 수 있다. 그러나, 현저한 면역 반응에 이르기 위해서는 복수 면역화가 필요하다. 당업자는 바이러스 그 자체 또는 숙주와 화합하는 면역 조절로써 바이러스 지속이 생성될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그러한 면역 조절이 HCV에 존재하는지를 분석하기 위해, 감염되지 않은 침팬지 및 만성 감염된 침팬지에서 E1 및 NS3에 대한 면역 반응을 비교하였다. 만성 감염된 동물의 낮은 반응을 예상하였기 때문에, 이 군의 동물을 하기를 포함하는 더욱 엄한 면역화 계획으로 선발하였다: 감염되지 않은 동물에 대해 사용되는 보조제인, 알룸 (alum)과 비교하여 세포성 반응 (표 9)을 유도하는 더욱 강력한 것으로 마우스에서 증명된 보조제의 사용; 및 감염되지 않은 동물에 대해 6회의 면역화에 비해 12회 면역화로 구성된 만성 감염 동물에 대한 면역 계획 (도 47).

면역화된 동물의 수가 통계 분석을 허용하지는 않지만, 하기 명확한 경향이 체액성 반응에서 검출될 수 있다 (표 10): 혈청전환을 위한 면역화의 수는 감염되지 않은 동물에서 더욱 낮고; 면역 반응의 양은 실질적으로 감염되지 않은 동물에서 많고, 2/3 감염된 동물은 12회 면역화 후에도, 10 내부 단위의 수준에 도달하지 못한다.

3회 면역화 후에, 세포성 반응의 분석은 하기를 포함하는, 더 큰 차이를 나타낸다 (도 48a-d): E1-특이적 T-세포 증식은 만성 감염된 동물에서는 거의 없는 반면, 감염되지 않은 세팅에서는 명확한 자극이 관찰될 수 있고; IL-2 측정은 만성 보균자에서 T-세포의 낮은 자극을 확인했고; 백신을 함유한 알룸-보조제에 대해 예상한 바와 같이, 감염되지 않은 동물에서 명확한 Th2 (IL-4) 반응이 유도된다.

이것은 적어도 E1 면역화가 감염되지 않은 동물에서 예방 효과를 제공한다는 것을 확인하고, E2 및/또는 E1 및 E2 단백질 및/또는 펩티드의 조합이 감염되지 않은 동물에서 유용한 치료 및/또는 예방 이점을 제공할 수 있다는 것을 제안한다.

HCV E1 항원에 대한 세포성 및 체액성 반응을 유도하는 '손상'은 하기 결과에 의해 증명된 바와 같이, 복수의 면역화에 의해 부분적으로 극복될 수 있다: 각각의 주입 후에 항체 역가의 증가가 주목되었으나, 감염되지 않은 동물에서의 수준은 2/3 동물에 미치지 못하였고; T-세포 증식 반응은 매우 낮은 상태이다 (도 49). 그러나, ELISPOT 결과는 Th2 유형 반응이 더욱 용이하게 유도된다는 것을 나타내는, IL-2의 미세한 증가 (보여주지 않음), IFN-g의 무변화 (보여주지 않음) 및 IL-4의 증가 (도 49)를 보여준다. IL-4는 감염되지 않은 동물에서 3회의 면역화 후에 도달한 수준과 비교하여 낮은 수준으로 유지된다는 것이 주목되었다.

상당히 유사한 관찰이 훨씬 더 강한 보조제 (RIBI)가 만성 침팬지에게 사용된 NS3 면역화에 대해 이루어졌다. 감염되지 않은 동물에서 알룸 제형과 비교하여 하기가 주목되었다: 유도된 항체 역가는 양 군에서 필적할만하고 (보여주지 않음); 시토카인 분비 및 T-세포 증식은 감염되지 않은 동물의 반응과 비교하여 만성 동물에서 거의 없었다 (도 49a-b).

현재 만성 보균자에서 HCV에 대한 면역 반응이 감염을 제거하기에 낮거나 적어도 불충분하다는 어떤 징조가 있었다. 상기 결과는 HCV 만성 보균자의 면역 시스템이 손상을 받을 수 있고, 이들은 감염되지 않은 상황만큼 효율적으로 HCV 항원에 대해 응답하지 못한다는 가설을 지지한다.

Wiedmann 등 (Hepatology 2000; 31: 230-234)의 연구에서, HBV에 대한 예방접종은 HCV 만성 보균자에서 덜 효과적이었는데, 이는 그러한 면역 손상이 HCV 항원에 제한되지 않는다는 것을 나타낸다. De Maria 등 (Hepatology 2000; 32: 444-445)은 상기 데이타를 확인하였고, HCV 환자에 대한 적응된 백신 투여 요법을 제안하였다. 본원에 제시된 데이타는 면역화의 수를 증가시키는 것은 진정으로 체액성 반응을 증가시킬 수 있으나, 강력한 보조제가 사용될 경우조차도, 세포성 (특히 Th1) 반응은 유도하기 어렵다는 것을 나타낸다. 면역 시스템이 더욱 응답하기 쉬운 경우에, 항바이러스 치료시에 면역화를 시작하는 것이 유리할 수 있다.

nt: 뉴클레오티드 aa: 아미노산 Kl: Klenow DNA Pol 채움

T4: T4 DNA Pol 채움 위치: HCV 다중 단백질 서열에서 아미노산 위치

nt: 뉴클레오티드 aa: 아미노산 Kl: Klenow DNA Pol 채움

LTR: 1년 이상 장기간 지속된 반응

NR: 무반응, 재발하는 반응, 또는 부분적인 반응

^*데이타를 치료 초기에서 수득된 값과 비교하였다

^**P 값 < 0.05

Balb/c 마우스에서 보조화된 E1의 프로필

	알룸	T-세포 보조제	RIBI
항체 역가 (평균±SD, n=6)	9600±101000	6200±60000	176000±149000
항체 아이소타입	IgG1	IgG1/2b	IgG1/2a
지라에서 T-세포 증식¹(n=3)	11750(2/3)	48300(3/3)	26000(3/3)
림프절에서 T-세포 증식²	특이적 자극 없음	4000	8000
시토카인 프로필 (지라)	II-4	IFN-g/II-4	IFN-g/II-4
¹3회의 s.c./i.m. 면역화 후에, 3마리의 무작위로 선발된 마우스를 별도로 분석하고, 결과를 E1 자극 (1㎍/ml)의 4일 후에 수득된 평균 비 cpm으로서 표시하고, 괄호안의 수는 기준 이상의 특이적 자극을 보이는 마우스의 수를 나타낸다²단일 내부 풋패스 (footpath) 면역화 (n=2) 후에, 결과를 E1 자극 (1㎍/ml)의 5일 후에 수득된 평균 비 cpm으로서 표시한다

체액성 반응: 상이한 E-1 항체 수준에 필요한 면역화 수

동물	상태	혈청전환¹	> 1U/ml²	> 10U/ml
마슬(Marcel)	만성	3	4	5
페기 (Peggy)	만성	3	5	>12
펨마(Femma)	만성	4	5	>12
요란(Yoran)	미감염	3	4	5
마티(Marti)	미감염	2	3	5
¹면역화 전에 어떠한 E1-항체도 존재하지 않는다면, 컷오프 수준보다 높은 ELISA 신호로서 정의되고, 다른 경우에 예비 면역화 역가의 3개의 별개의 타임 포인트보다 높은 역가의 관찰은 혈청전환의 포인트로서 고려되었다.²단위는 하기와 같이 정의된다: 인터페론 치료 전에 유전형 1b로 감염된 인간 만성 보균자의 E1 항체 수준은 환자의 50%는 <0.1 U/ml이고; 환자의 25%는 0.1 내지 1 U/ml이고 환자의 나머지 25%는 >1 U/ml이다 (n=58)

실시예 12: HCV 서브유형 1b로 만성 감염된 침팬지의 면역화

HCV 서브유형 1b 계통으로 이미 13년 이상 (면역화 전에 5015일) 감염된 침팬지 (Phil)를 상이한 계통의 유전형 1b로부터 유도되고, 아미노산 수준에서 95.1% 동일성을 갖고 (또한 이의 전체가 참고로 본원에 포함된 WO 99/67285를 참조), WO 99/67285의 실시예 1-3에 기재된 바와 같이 제조된, E1 (aa 192-326)로 예방접종하였다. 침팬지는 제조자의 절차 (Ribi Inc. Hamilton, MT)에 따라 RIBI R-730 (MPLA + TDM + CWS)와 혼합된 PBS/0.05% CHAPS 중의 50㎍ E1 각각의 총 6회 근육내 면역화를 받았다. 6회 면역화는 3주 간격의 3회의 주입 및 두 시리즈 사이가 6주의 지연 기간을 갖는 2 시리즈로 제공된다. 면역화 전에 150일에 출발하여, 면역화 기간 동안 및 면역화 후 1년까지 (그러나 하기 및 WO 99/67285 참조) 침팬지를 HCV 유도된 질병의 활성에 대한 지표인 다양한 변수를 연속적으로 모니터링하였다. 상기 변수는 혈액 화학, ALT, AST, 감마GT, 혈청내의 바이러스 적재, 간내의 바이러스 적재 및 간 조직학을 포함했다. 게다가, 면역화에 대한 면역 반응을 체액성 및 세포성 수준에서 모니터링하였다. 상기 기간 동안 동물을 또한 면역화의 역효과, 예를 들면, 행동, 임상 증상, 체중, 온도 및 국부적인 반응 (적화, 팽창, 경화)의 변화를 모니터링하였다. 그러한 효과는 검출되지 않았다.

명백히, ALT (특히 감마GT, 데이타를 보여주지 않음) 수준은 E1에 대한 항체 수준이 최대에 도달하자 곧 감소하였다 (WO 99/67285의 도 8 참조). 항체 수준이 감소하기 시작하자마자 ALT는 급격히 다시 상승하였으나, 감마GT는 항-E1이 검출가능한 한 낮은 수준으로 유지되었다.

항-E1이 검출가능하고, E2 항원이 상기 항체가 사라진 직후에 다시 상승하는 기간 동안 간내의 E2 항원은 거의 검출불가능한 수준으로 감소하였다. 간내의 검출불가능한 코아 및 E2 항원과 함께, 간의 염증은 현저하게 감소하였다 (또한 WO 99/67285의 표 3 참조). 이것은 백신이 이의 주요 표적 기관인 간으로부터 적어도 부분적으로 바이러스 항원을 제거함으로써, 간 손상의 감소를 유도한다는 주요 증거이다.

Amplicor HCV Monitor (Roche, Basel, Switzerland)로 측정한 병독혈증 (Viraemia) 수준은 전 연구 기간 동안 혈청에서 대략 불변 상태였다.

체액성 반응의 더욱 상세한 분석은 최대 종말점 역가가 14.5 X 10³(6번째 면역화 후)이고, 상기 역가는 면역화 후 1년에 검출불가능한 수준으로 감소되었다는 것을 나타냈다 (WO 99/67285의 도 8). WO 99/67285의 도 9는 펩티드로 흉내낼 수 있고, B-세포에 의해 인지되는 주요 항원결정부는 E2 (펩티드 VIV2 및 V2V3, 사용된 펩티드의 상세한 것은 WO 99/67285의 표 4 참조)의 N-말단 부위에 위치한다는 것을 보여준다. 재조합 E1에 대한 반응성이 높고 장기간 지속되기 때문에, 상기 펩티드를 인지하는 항체는 E1에 대한 총 항체 군집의 단지 부분을 나타낸다는 것을 상기 도면으로부터 추론할 수 있다. 나머지 부분은 펩티드로 흉내낼 수 없는 항원결정부, 즉, 불연속 항원결정부에 대한 것이다. 그러한 항원결정부는 완전한 E1 분자 또는 입자와 유사한 구조에 단지 존재한다. E1에 대한 그러한 면역 반응은 적어도 감염의 천연 과정에서 항-E1 항체를 상승시킨, 인간 만성 HCV보균자 (WO 96/13590, Maertens 등에게 허여) 및 침팬지(van Doorn 등, 1996)에서 통상 관찰된 것과 비교하여 독특하다. 그러한 환자에서, 항-E1은 또한 부분적으로 불연속 항원결정부에 관한 것이나 대부분은 C4 항원결정부 (환자 혈청의 ±50%), 일부분은 V1V2 (유전형에 따라 2-70%의 범위임)에 대한 것이며, V2V3에 대한 반응성은 단지 예외적으로 기록된다 (Maertens 등, 1997).

T-세포 반응성의 분석은 상기 T-세포의 자극 지수가 1에서 2.5로 상승할 때, 또한 면역 시스템의 구획이 특정 방식으로 백신에 의해 자극되고, 추적 기간 동안 다소 증가한 상태로 유지된다는 것을 나타냈다 (WO 99/67285의 도 10). 인터페론 치료에 대한 장기간 응답자에서 단지 보여진 것은 T 세포 반응성이다 (PCT/EP 94/03555, Leroux-Roels 등; Leroux-Roels 등, 1996 참조).

실시예 13: 상이한 서브유형으로 만성 HCV 보균자의 면역화

유전형 1a 유래의 HCV 로 이미 10년 이상 (면역화 전에 3809일) 감염된 침팬지 (Ton)를 유전형 1b로부터 유도되고, 아미노산 수준에서 79.3% 동일성을 갖고 (또한 WO 99/67285의 표 2 참조), 이전의 실시예에 기재된 바와 같이 제조된, E1 으로 예방접종하였다. 침팬지는 제조자의 절차 (Ribi Inc. Hamilton, MT)에 따라 RIBI R-730과 각각 혼합된 PBS/0.05% CHAPS 중의 50㎍ E1의 총 6회 근육내 면역화를 받았다. 6회 면역화는 3주 간격의 3회의 주입 및 두 시리즈 사이가 4주의 지연 기간을 갖는 2 시리즈로 제공된다. 면역화 전에 250일에 출발하여, 면역화 기간 동안 및 면역화 후 9개월까지 (그러나 하기 및 WO 99/67285 참조) 침팬지를 HCV 유도된 질병의 활성에 대한 지표인 다양한 변수를 연속적으로 모니터링하였다. 상기 변수는 혈액 화학, ALT, AST, 감마GT, 혈청내의 바이러스 적재, 간내의 바이러스 적재 및 간 조직학을 포함했다. 게다가, 면역화에 대한 면역 반응을 체액성 및 세포성 수준에서 모니터링하였다. 상기 기간 동안 동물을 또한 면역화의 역효과, 예를 들면, 행동, 임상 증상, 체중, 온도 및 국부적인 반응 (적화, 팽창, 경화)의 변화를 모니터링하였다. 그러한 효과는 검출되지 않았다.

명백히, ALT 수준 (및 감마GT 수준, 데이타를 보여주지 않음)은 E1에 대한 항체 수준이 최대에 도달하자 곧 감소하였다 (WO 99/67285의 도 11). 항체 수준이 감소하기 시작하자마자 ALT 및 감마GT는 다시 상승하였으나, ALT 및 감마GT는 완전한 추적 기간 동안 낮은 수준으로 유지되었다. 예방접종 전의 기간 (85 ±11 U/l)과 비교하여 예방접종 후에 (62 ±6 U/l) ALT 수준은 현저하게 감소하였다. 조직 손상의 마커는 혈청에서 덜 회복되었기 때문에, 상기 발견은 예방접종이 간 질병의 개선을 유도한 첫번째 징조였다.

E2 항원 수준은 항-E1이 1.0 X 10³의 역가 이상으로 유지되는 기간에 검출불가능하게 되었으나, 낮은 E1 항체 수준의 시기에 다시 검출가능하게 되었다. HCV 항원의 사라짐과 함께, 간의 염증은 적당한 만성 활성 간염에서 만성 지속 간염의 최소 형태로 현저하게 감소하였다 (WO 99/67285의 표 3). 이것은 백신이 이의 주요 표적 기관인 간으로부터 적어도 부분적으로 바이러스를 제거함으로써, 간 손상의 감소를 유도한다는 주요 증거이다.

Amplicor HCV Monitor (Roche, Basel, Switzerland)로 측정한 병독혈증(Viraemia) 수준은 전 연구 기간 동안 혈청에서 대략 유사한 수준이었다. 체액성 반응의 더욱 상세한 분석은 도달한 최대 종말점 역가가 30 x 10³(6번째 면역화 후)이고, 상기 역가는 면역화 후 9개월에 0.5 X 10³으로 감소되었다는 것을 나타냈다 (WO 99/67285의 도 11). WO 99/67285의 도 12는 펩티드로 흉내낼 수 있고, B-세포에 의해 인지되는 주요 항원결정부는 N-말단 부위 (펩티드 VIV2 및 V2V3, 사용된 펩티드의 상세한 것은 WO 99/67285의 표 4 참조)에 위치한다는 것을 보여준다. 재조합 E1에 대한 반응성이 높고 장기간 지속되기 때문에, 상기 펩티드를 인지하는 항체는 E1에 대한 총 항체 군집의 단지 부분을 나타낸다는 것을 상기 도면으로부터 추론할 수 있다. 나머지 부분은 아마도 펩티드로 흉내낼 수 없는 항원결정부, 즉, 불연속 항원결정부에 대한 것이다. 그러한 항원결정부는 완전한 E1 분자 또는 입자와 유사한 구조에 단지 존재한다. E1에 대한 그러한 면역 반응은 적어도 검출가능한 항-E1을 갖는, 인간 만성 HCV 보균자에서 통상 관찰된 것과 비교하여 독특하다. 그러한 환자에서, 항-E1은 또한 부분적으로 불연속이나, 대부분은 C4 항원결정부 (환자 혈청의 50%), 일부분은 V1V2 (유전형에 따라 2-70%의 범위임)에 대한 것이며, V2V3에 대한 반응성은 예외적으로 기록된다 (Maertens 등, 1997). 상기 침팬지를 1a 분리종으로 감염시킬 경우, 항체 반응은 또한 E1-1a 항원에 대한 교차 반응성에 대해 평가되었다. WO 99/67285의 도 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 그러한 교차 반응성 항체가 단지 총 항체 군집의 일부를 형성하질라도, 진정으로 생성된다. 간에서 바이러스 항원의 재출현과 혈청에서 검출가능한 항-1a E1 항체의 사라짐 사이의 관계가 현저하다.

T-세포 반응성의 분석은 상기 T-세포의 자극 지수가 0.5에서 5로 상승할 때,또한 면역 시스템의 구획이 특정 방식으로 백신에 의해 자극되고, 추적 기간 동안 증가한 상태로 유지된다는 것을 나타냈다 (WO 99/67285의 도 14).

실시예 14: E1으로 HCV 만성 보균자의 재부스팅(reboosting)

실시예 12 및 13에서 관찰된 E1 항체 역가가 안정되지 않고, 시간에 따라 감소하고, 1b 감염 침팬지에 대해서는 검출불가능한 수준으로 감소했기 때문에, 상기 항체 반응이 부가적인 부스팅에 의해 다시 증가될 수 있는지를 조사하였다. 양자의 침팬지를 3주 간격으로 3회의 연속적인 근육내 면역화로 다시 면역화하였다 (RIBI 보조제와 혼합된 50㎍ E1). WO 99/67285의 도 8 및 11로부터 판단될 수 있는 바와 같이, 간내의 바이러스 항원이 다시 검출 한계 미만으로 감소되면, 항-E1 반응은 정말로 부스팅될 수 있었다. 혈청내의 바이러스 적재는 Ton 에서조차 일정하였다 (WO 99/67285의 도 11). ml 당 < 10⁵게놈 동등물의 병독혈증 수준은 추적 기간 동안 처음으로 측정되었다.

이미 첫번째 시리즈의 면역화의 경우에서처럼, 서브유형 1b HCV 계통 (Phil)으로 감염된 침팬지는 서브유형 1a HCV 계통으로 감염된 침팬지보다 낮은 항-E1 역가로 응답한다는 발견은 현저하다 (첫번째 라운드에서 최대 역가는 14.5X10³에 대해 Ton에 대해 30X10³이고, 추가적인 부스팅후에 단지 Phil에 대해 1.2X10³에 대해 Ton에 대해 40X10³이다). 양 동물에 대해 유리한 효과가 유사하지만, 또 다른 서브유형 또는 유전형으로부터 유도된 E1 단백질을 갖는 만성 보균자의 면역화는 특히 높은 역가에 이를 수 있는 것이 유리하고, 숙주내에 존재하고, 감염 서브유형 또는 유전형에 의해 유도되는 기존의 특이적 면역 억제를 우회할 수 있다는 실험으로부터 결론지을 수 있었다. 대안적으로, 유사한 세팅 (1b 백신 + 1b 감염)에서 관찰되는 낮은 역가는 바이러스에 항체 집단의 결합을 나타낼 수 있다. 그러므로, 유도된 항체는 중화 능력을 가질 수 있다.

실시예 15: 침팬지에서 E1-예방접종의 예방 이용성의 증명

HCV E1s 단백질 (아미노산 192-326)을 재조합 백시니아 바이러스 HCV11B를 사용하여 베로 세포 (Vero cell)에서 발현하였다. 상기 백시니아 바이러스는 본질적으로 vvHCV11A (미국 특허 제 6,150,134호에 기재된 바와 같이, 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨)와 동일하나 RK13 에서 베로 세포로 계대되었다. 단백질을 PCT/E99/04342 (WO 99/67285)의 실시예 9에 기재된 바와 같이 (렌틸 크로마토그래피, 환원-알킬화 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해) 시스테인에 대한 알킬화제로서 요오도아세트아미드를 사용하여 정제하였다. 정제 후에, 3% empigen-BB를 PCT/E99/04342의 실시예 1에 기재된 크기 배제 크로마토그래피에 의해 3% 베타인으로 교환하였다. 상기 과정은 입자로서 E1s를 회수하게 한다. 최종적으로 물질을 0.5% 베타인 및 500㎍/ml 농도의 E1s를 함유한 PBS로 탈염하였다. 상기 E1을 동일 부피의 알히드로겔(Alhydrogel) 1.3% (Superfos, Denmark)과 혼합하고, 최종적으로 추가로 8 부피의 0.9% NaCl로 희석하여 50㎍ E1/ml 및 0.13%의 알히드로겔의 농도로 알룸-보조된 E1을 수득하였다.

HCV E2델타HVRI (아미노산 412-715)을 PCT/E99/04342의 실시예 8에 기재된 pvHCV-101과 야생형 백시니아 바이러스로부터 재조합된 재조합 백시니아 바이러스 HCV101을 사용하여 E1에 대해 기재된 베로로부터 본질적으로 발현하고 정제하였다. 또한 E2델타HVRI은 엠피젠의 베타인으로의 교환 후에 입자로서 행동한다 (동적 광산란으로 측정함).

HCV-RNA 및 HCV-항체에 대해 음성인 것으로 시험된 5마리의 침팬지를 선발하였다. 동물 중의 한 마리 (Huub)는 면역화되지 않았고, 2마리의 동물은 알룸 (마티 및 요란)으로 보조된 50㎍ E1으로 6회의 면역을 받은 반면, 나머지 2마리의 동물은 알룸 (주스트 및 칼리엔)으로 보조된 50㎍ E2델타HVRI으로 6회의 면역화를 받았다. 모든 면역화는 3주 간격으로 근육내로 투여되었다. 체액성 및 세포성 면역 반응을 면역화된 항원에 대해 각 동물에서 평가하였고, 각각의 동물에서 양자 유형의 반응을 표 11에 보여준 바와 같이 검출하였다.

항체 역가를 6회째 면역화 후 2주에 ELISA로 측정하였다. 시료의 연속적인 희석액을 인 하우스 표준 (in house standard)과 비교하였다 (1000 mU/ml의 El 또는 항-E2델타HVRI 항체를 갖는 것으로 정의된 상기 인 하우스 표준은 높은 항-외피 역가에 기초하여 선택된 HCV 만성 보균자 유래의 3개의 혈청의 혼합물이다). 세포 면역 반응을 반영하는 자극 지수는 외피 항원의 존재 또는 부재하에, 세번째 면역화 후 2주에 동물로부터 추출된 PBMC를 배양하고, 배양 5일 후에 18시간의 펄스 동안 상기 세포내로 혼입된 삼중수소의 티미딘의 양을 측정함으로써 수득하였다. 자극 지수는 외피 항원을 이용하여 배양한 세포에 혼입된 티미딘 대 항원없이 배양된 것의 비율이다. 3 초과의 자극 지수가 양성 신호로 고려된다.

	항-E1 반응	항-E2델타HVRI 반응
	항체 역가	자극 지수	항체 역가	자극 지수
요란 (Yoran)	14110	10.9
마티 (Marti)	5630	14.2
주스트 (Joost)			3210	8.5
칼리엔 (Karlien)			1770	11.2

6회 면역화의 마지막 후 3주에 대조군을 포함한 모든 동물을 100 CID (침팬지 감염성 투여량)의 유전형 1b 접종물을 이용하여 면역성 검사를 하였다 (J4.91, Dr. J. Bukh, NIH, Bethesda, Maryland가 친절하게 제공함). 백신 단백질과 J4.91 분리종 (이의 서열 정보는 등록번호 BAA01583하에 유용함) 사이의 아미노산 서열 분산은 E1s에 대해 7% (135개의 아미노산 중에 9개)이고, E2델타HVRI에 대해 11% (304개의 아미노산 중에 32개)이고; 결과적으로 상기 면역성 검사는 이질적인 것으로 고려되고, 실질적인 생활 면역성 검사를 반영한다.

모든 침팬지는 면역성 검사 후 7일에 HCV-RNA 양성이 되었고 (Monitor HCV를 이용하여 측정함, Roche, Basel, Switzerland), 첫번째 ALT 및 감마GT 피크를 35 일 및 63 일 사이에 측정하였다. 이것은 모든 침팬지가 급성 간염을 발생시켰다는 것을 증명한다. 현저하게, E1 면역화된 양자의 동물은 이들의 감염을 해결한 반면, E2델타HVRI 및 대조군 동물은 그렇지 않았다. 이것은 E1 면역화된 동물은 98일 (요란) 및 133일 (마티)에 HCV-RNA를 상실하고 (Monitor HCV로 결정함, Roche, Basel, Switzerland), 매월의 시험으로 273일까지 음성으로 존재했다는 사실에 의해 증명되었다. 모든 다른 동물들은 ALT를 이용하여 273일의 전체 추적 기간 동안 RNA-양성으로 머물러 있었고, 감마GT 값은 E1 면역화된 침팬지에 대해 정상으로 돌아오지 않고 점차 증가하였다.

결론적으로, 우리는 E1-면역화는 HCV와 관련된 주요 건강 문제인 만성 감염에 대한 진화를 막음으로써 HCV 감염의 자연사를 변화시킨다는 것을 보여주었다.

실시예 16: 침팬지에서 감염의 제거를 허용하는 유사한 E1 반응은 인간에서 유도될 수 있다

인간에서 E1 면역화의 예방 효과를 수득하기 위해, 유사한 면역 반응이 침팬지와 비교하여 인간에서 유도될 필요가 있다. 그러므로 우리는 20명의 남성 지원자를 예방접종하였는데, 여기에서 0.5ml의 0.13% 알히드로겔상에서 제형화된 20㎍ E1s의 3회 투여로, 어떠한 항-E1 반응 (체액성 또는 세포성)도 검출될 수 없었다. 모든 면역화를 3주 간격으로 근육내로 제공하였다. 표 12에서 증명한 바와 같이, 20명의 지원자 중 17명은 E1에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응이 현저하게 상승하였고, 이것은 심한 역 효과가 없었다. 단지 1명의 지원자 (대상 021)는 체액성 또는 세포성 반응이 3회의 E1 면역화 후에도 컷-오프 수준 이상이 아니었으므로, 무응답자로서 고려되어야 한다. 체액성 반응이 침팬지와 비교하여 낮다는 관찰은 20㎍을 이용한 단지 3회의 면역화가 제공되었고, 50㎍을 이용한 6회의 면역화는 제공되지 않았다는 사실에 관한 것이다.

항체 역가를 세번째 면역화 후 2주에 ELISA로 측정하였다. 시료의 연속적인 희석액을 인 하우스 표준과 비교하였다 (1000 mU/ml의 El 또는 항-E2델타HVRI 항체를 갖는 것으로 정의된 상기 인 하우스 표준은 높은 항-외피 역가에 기초하여 선택된 HCV 만성 보균자 유래의 3개의 혈청의 혼합물이다). 자극 지수 (세포성 면역 반응)는 1㎍ E1s의 존재 또는 부재하에, 세번째 면역화 후 2주에 개인으로부터 추출된 PBMC를 배양하고, 배양 5일 후에 18시간의 펄스 동안 상기 세포내로 혼입된 삼중수소의 티미딘의 양을 측정함으로써 수득하였다. 자극 지수는 외피 항원을 이용하여 배양한 세포에 혼입된 티미딘 대 항원없이 배양된 것의 비율이다. 3 초과의 자극 지수가 양성 신호로 고려된다.

대상 번호	항체 역가	자극 지수
002	1370	30.9
003	717	13.2
004	800	9.1
007	680	3.8
008	1026	3.9
009	325	4.6
010	898	7.7
011	284	4.1
012	181	3.6
013	<20	3.5
014	49	4.6
015	228	3.8
016	324	4.1
017	<20^*	6.2
018	<20	6.7
019	624	3.1
020	84	5.5
021	<20	2.1
022	226	2.7
023	163	7.6
^*ELISA 신호의 현저한 증가는 면역전의 시료와 3회의 면역 후의 시료사이에 보여지나, 역가는 매우 낮고, 정확한 측정을 허용하지 않기 때문에, 상기 개인은 면역화 후에 항-E1 양성으로 고려된다.

실시예 17: 예방접종한 건강한 지원자의 E1 반응의 부스팅

실시예 16의 20명의 지원자 중에서 19명을 26주 (즉, 세번째 면역화 후 20주)에 0.5ml의 0.13% 알히드로겔상에서 제형화된 20㎍ E1s로 한번 더 부스팅하였다. 다시 항체 역가 및 세포성 면역 반응을 상기 추가적인 면역화 후 2주에 측정하였다. 모든 개인에서 항체 역가는 20주 간격 동안 감소하였으나, 상기 추가적인 면역화에 의해 8주에 관찰된 것 이상의 수준으로 용이하게 부스팅될 수 있었다. 평균하여 항체 역가는 8주 역가와 비교하여 두배 및 26주 역가와 비교하여 7배만큼 상기 부스팅 후에 높아졌다 (표 13).

항체 역가를 세번째 면역화 후 2주 (=8주) 및 20주 (=26주) 및 또한 최종적으로 부스팅 후 2주 (=28주)에 ELISA로 측정하였다. 시료의 연속적인 희석액을 인 하우스 표준과 비교하였다 (1000 mU/ml의 El 항체를 갖는 것으로 정의된 상기 인 하우스 표준은 높은 항-외피 역가에 기초하여 선택된 HCV 만성 보균자 유래의 3개의 혈청의 혼합물이다). 정확한 비교를 위해 8주에서의 역가의 측정은 실시예 16의 표 12에서 차이를 설명한, 26주의 28개의 시료에 대해 동일한 분석을 반복하였다.

대상 번호	항체 역가
	8주	26주	28주
002	1471	443	3119
003	963	95	2355
004	1006	409	2043
007	630	65	541
008	926	81	819
009	704	77	269
010	1296	657	3773
011	253	65	368
012	254	148	760
013	36	<20	166
014	53	40	123
016	159	45	231
017	109	39	566
018	43	23	50
019	425	157	1894
020	73	33	113
021	25	<20	26
022	280	150	357
024	177	81	184
평균	467	138	936

T-세포 반응은 20주 간격후에 여전히 높은 개인의 대부분에 대해 현저하였다. 이전의 예방접종의 결과 대부분의 개인에게 존재하는 테타노스 (tetanos) 반응에 대한 정상화를 고려할 때, 자극 지수의 기하 평균의 변화는 없다. 추가의 부스팅 후에, 테타노스 반응에 대한 정상화를 고려할 때, 변화가 관찰되지 않는다 (도 51). 이것은 강한 T-보조 반응이 3회의 E1 면역화 후에 유도되었다는 것을 확인하고, 상기 면역화가 적어도 6개월의 기간 동안 추가의 부스팅을 요하지 않는 매우 양호한 T-보조 기억을 이미 유도하였다는 것을 나타낸다.

도 51에 대한 설명: 자극 지수(세포성 면역 반응)를 3㎍의 재조합 E1 또는 2㎍의 테타노스 유독소(類毒素)의 존재 또는 부재하에, 면역화 전 (0주), 세번째 면역화 후 2주(8주), 부스터 면역화 전 (26주) 및 부스터 면역화 후 2주 (28주)에 개인으로부터 추출된 PBMC (10⁵개의 세포)를 배양하고, 배양 5일 후에 18시간의 펄스 동안 상기 세포내로 혼입된 삼중수소의 티미딘의 양을 측정함으로써 수득하였다. 자극 지수는 외피 항원을 이용하여 배양한 세포에 혼입된 티미딘 대 항원없이 배양된 것의 비율이다. 0주 및 8주의 시료를 첫번째 분석 (A)에서 측정한 반면, 26주 및 28주의 시료를 0주의 시료를 재분석한 두번째 분석 (B)에서 측정하였다. 결과를 모든 20명 (A, 실험) 또는 19명 (B, 실험) 지원자의 기하평균 자극 지수로서 표현한다.

게다가, Th1 시토카인 인터페론-감마 및 Th2 시토카인 인터루킨-5를 26주 및 28주에 취한 시료의 PBMC 배양물의 상층액에서 측정하고, E1으로 재자극하였다. 도 52로부터 판단될 수 있는 바와 같이, E1 자극된 PBMC에 의해 분비된 우세한 시토카인은 인터페론-감마이다. 알룸은 Th2 유도자인 것으로 알려져 있기 때문에, 강한 Th1 치우친 반응이 알룸 보조된 E1에 대해 관찰된다는 것을 본다는 것은매우 놀랍다. 한 번 이상의 결과들은 최종 부스팅전에 (26주) 이미 매우 강한 반응이 관찰될 때, 양호한 T-세포 기억 반응이 유도된다는 것을 확인한다. 우리가 E1 자극된 세포 배양물과 0주에 추출된 시료를 이용한 상기 지원자의 비자극 세포 배양물 사이에 차이가 없다는 것을 본 추가의 실험에서와 같이 인터페론-감마 분비는 특이적인 것으로 발견되었다.

도 52에 대한 설명: 3㎍의 재조합 E1 (E1) 또는 2㎍의 테타노스 유독소(類毒素)(TT)의 존재하 또는 항원없이 (BI), 부스터 면역화 전 (26주) 및 부스터 면역화 후 2주 (28주)에 개인으로부터 추출된 PBMC (10⁵세포)를 배양하였다. 시토카인을 ELISA로 24시간 후 (인터루킨-5) 또는 120시간 후 (인터페론-감마)에 취한 상층액에서 측정하였다. 자극 지수는 외피 항원을 이용하여 배양한 세포의 상층액에서 측정한 시토카인 대 항원없이 배양된 것의 비율이다. 결과를 모든 19명 지원자의 분비된 pg 시토카인/ml의 기하평균으로서 표현한다. 검출한계 미만의 시토카인 양을 갖는 시료를 검출한계 값으로 지정하였다. 유사하게 분석의 선형 범위에서 극도로 높은 농도의 시토카인을 갖는 시료를 분석의 선형 범위의 한계값으로 지정하였다.

실시예 18: 예방접종한 건강한 지원자의 E1에 대한 세포성 반응의 미세 지도작성

E1 특이적 반응의 지도를 작성하기 위해, 표준 Fmoc 화학을 사용하여, 8개의 아미노산이 겹치고, E1s의 전체 서열을 포함하는, 일련의 20-머 펩티드를 합성하였다. 모든 펩티드를 유리 아미노 말단을 갖는 IGP 1626을 제외하고, C-말단에 아미드화하고 N-말단에 아세틸화하였다.

E1s로 예방접종하지 않은 14명의 상이한 건강한 공여자 또는 E1s로 예방접종한 10명의 공여자 유래의 PBMC를 25㎍/ml (예방접종하지 않은 사람) 또는 10㎍/ml (예방접종한 사람, 세번째 또는 부스터 주입 후에 취한 시료)의 각각의 펩티드의 존재하에 별개로 배양하였다. 도 53으로부터 판단될 수 있는 바와 같이, IGP 1627, 1629, 1630, 1631, 1633, 1635 및 1636은 모두 예방접종하지 않은 사람과 비교하여 예방접종한 사람에서 현저히 높은 반응을 유도하였다. 컷-오프로서 자극 지수 3을 사용할 경우에, 펩티드 IGP 1627, 1629, 1631 및 1635가 가장 자주 인지되었다 (즉, 시험한 예방접종한 사람의 절반 이상에 의해 인지됨). 상기 실험은 T-세포 반응이 포유동물 세포 배양으로부터 유도된 동일한 E1s뿐만 아니라 합성 펩티드에 의해서도 회복될 수 있기 때문에, 포유동물 세포 배양으로부터 유도된 E1s에 의해 유도된 T-세포 반응은 E1에 대해 특이적이라는 것을 증명한다.

게다가 이 실험은 E1에서 가장 면역원성 T-세포 도메인이 아미노산 204-223, 228-271, 276-295, 300-331, 더욱 구체적으로 아미노산 204-223, 228-247, 252-271 및 300-319 사이에 위치한다는 것을 나타낸다.

도 53에 대한 설명: 자극 지수(세포성 면역 반응)를 펩티드의 존재 또는 부재하에, PBMC (3X10⁵세포)를 배양하고, 배양 5-6일 후에 펄스 동안 상기 세포내로 혼입된 삼중수소의 티미딘의 양을 측정함으로써 수득하였다. 자극 지수는 펩티드를 이용하여 배양한 세포에 혼입된 티미딘 대 펩티드없이 배양된 것의 비율이다. 결과를 예방접종한 사람 (상단 패널) 또는 예방접종하지 않은 또는 대조군 (하단 패널)에 대한 개인 값으로서 표현한다.

그러므로, 본 발명은 또한 본 발명의 다른 E1 및 관련된 펩티드에 대해 본원에 일반적으로 기재된, 상기 펩티드를 코딩하는 동일한 핵산 서열 및 동일한 것을 포함하는 단백질을 포함하는 하기 E1 펩티드, 단백질, 조성물 및 키트 및 이들의 제조 방법 및 용도를 제공한다.

IGP 1626 E1 부위의 위치 192-211에 위치함 (서열 번호 112),

IGP 1627 E1 부위의 위치 204-223에 위치함 (서열 번호 113),

IGP 1628 E1 부위의 위치 216-235에 위치함 (서열 번호 114),

IGP 1629 E1 부위의 위치 228-247에 위치함 (서열 번호 115),

IGP 1630 E1 부위의 위치 240-259에 위치함 (서열 번호 116),

IGP 1631 E1 부위의 위치 252-271에 위치함 (서열 번호 117),

IGP 1632 E1 부위의 위치 264-283에 위치함 (서열 번호 118),

IGP 1633 E1 부위의 위치 276-295에 위치함 (서열 번호 119),

IGP 1634 E1 부위의 위치 288-307에 위치함 (서열 번호 120),

IGP 1635 E1 부위의 위치 300-319에 위치함 (서열 번호 121),

IGP 1636 E1 부위의 위치 312-331에 위치함 (서열 번호 122).

참고문헌

본원에 인용된 모든 참고문헌은 전적으로 참고로 포함된다.

Claims

치료학적 유효량의 하기를 함유하는 치료용 백신 조성물:

E1 단백질 및 E2 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정제된 재조합 HCV 단일 또는 특정 올리고머 재조합 외피 단백질; 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 보조제를 함유하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 재조합 HCV 외피 단백질이 재조합 포유동물 세포에 의해 제조되는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 재조합 HCV 외피 단백질이 재조합 효모 세포에 의해 제조되는 조성물.
하나 이상의 하기 E1 및 E2 펩티드를 함유하는 치료학적 유효량의 조성물을 함유하는 치료용 백신 조성물:

코아/E1 V1 부위의 아미노산 181 내지 200에 위치하는 E1-31 (서열 번호 56),

E1 부위의 아미노산 193 내지 212에 위치하는 E1-33 (서열 번호 57),

E1 V2 부위 (항원결정부 B)의 아미노산 205 내지 224에 위치하는 E1-35 (서열 번호 58),

E1 V2 부위 (항원결정부 B)의 아미노산 208 내지 227에 위치하는 E1-35A (서열 번호 59),

E1 부위인 V1, C1 및 V2 부위 (항원결정부 B를 포함)의 아미노산 192 내지 228에 위치하는 1bE1 (서열 번호 53),

E1 부위의 아미노산 301 내지 320에 위치하는 E1-51 (서열 번호 66),

E1 C4 부위 (항원결정부 A)의 아미노산 313 내지 332에 위치하는 E1-53 (서열 번호 67),

E1 부위의 아미노산 325 내지 344에 위치하는 E1-55 (서열 번호 68),

E2 부위 (항원결정부 A)의 아미노산 위치 397 내지 418에 위치하는 Env 67 또는 E2-67 (서열 번호 72),

E2 부위 (항원결정부 A)의 아미노산 위치 409 내지 428에 위치하는 Env 69 또는 E2-69 (서열 번호 73),

E2 부위 (항원결정부 E)의 위치 583 내지 602에 위치하는 Env 23 또는 E2-23 (서열 번호 86),

E2 부위 (항원결정부 E)의 위치 595 내지 614에 위치하는 Env 25 또는 E2-25 (서열 번호 87),

E2 부위 (항원결정부 E)의 위치 607 내지 626에 위치하는 Env 27 또는 E2-27 (서열 번호 88),

E2 부위 (항원결정부 D)의 위치 547 내지 586에 위치하는 Env 178 또는 E2-178 (서열 번호 83),

E2 부위 (항원결정부 C)의 위치 523 내지 542에 위치하는 Env 13B 또는 E2-13B (서열 번호 82),

E1 부위의 위치 192-211에 위치하는 IGP 1626 (서열 번호 112),

E1 부위의 위치 204-223에 위치하는 IGP 1627 (서열 번호 113),

E1 부위의 위치 216-235에 위치하는 IGP 1628 (서열 번호 114),

E1 부위의 위치 228-247에 위치하는 IGP 1629 (서열 번호 115),

E1 부위의 위치 240-259에 위치하는 IGP 1630 (서열 번호 116),

E1 부위의 위치 252-271에 위치하는 IGP 1631 (서열 번호 117),

E1 부위의 위치 264-283에 위치하는 IGP 1632 (서열 번호 118),

E1 부위의 위치 276-295에 위치하는 IGP 1633 (서열 번호 119),

E1 부위의 위치 288-307에 위치하는 IGP 1634 (서열 번호 120),

E1 부위의 위치 300-319에 위치하는 IGP 1635 (서열 번호 121) 및

E1 부위의 위치 312-331에 위치하는 IGP 1636 (서열 번호 122).
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 조성물 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 보조제를 투여하는 것을 포함하는 HCV로 감염된 포유동물의 치료 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
E1 단백질 및 E2 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정제된 재조합 HCV 재조합 외피 단백질 및 선택적으로 보조제를 함유하는 조성물.
하나 이상의 하기 E1 및 E2 펩티드를 함유하는 조성물:

코아/E1 V1 부위의 아미노산 181 내지 200에 위치하는 E1-31 (서열 번호 56),

E1 부위의 아미노산 193 내지 212에 위치하는 E1-33 (서열 번호 57),

E1 V2 부위 (항원결정부 B)의 아미노산 205 내지 224에 위치하는 E1-35 (서열 번호 58),

E1 V2 부위 (항원결정부 B)의 아미노산 208 내지 227에 위치하는 E1-35A (서열 번호 59),

E1 부위인 V1, C1 및 V2 부위 (항원결정부 B를 포함)의 아미노산 192 내지 228에 위치하는 1bE1 (서열 번호 53),

E1 부위의 아미노산 301 내지 320에 위치하는 E1-51 (서열 번호 66),

E1 C4 부위 (항원결정부 A)의 아미노산 313 내지 332에 위치하는 E1-53 (서열 번호 67),

E1 부위의 아미노산 325 내지 344에 위치하는 E1-55 (서열 번호 68),

E2 부위 (항원결정부 A)의 아미노산 위치 397 내지 418에 위치하는 Env 67 또는 E2-67 (서열 번호 72),

E2 부위 (항원결정부 A)의 아미노산 위치 409 내지 428에 위치하는 Env 69또는 E2-69 (서열 번호 73),

E2 부위 (항원결정부 E)의 위치 583 내지 602에 위치하는 Env 23 또는 E2-23 (서열 번호 86),

E2 부위 (항원결정부 E)의 위치 595 내지 614에 위치하는 Env 25 또는 E2-25 (서열 번호 87),

E2 부위 (항원결정부 E)의 위치 607 내지 626에 위치하는 Env 27 또는 E2-27 (서열 번호 88),

E2 부위 (항원결정부 D)의 위치 547 내지 586에 위치하는 Env 178 또는 E2-178 (서열 번호 83),

E2 부위 (항원결정부 C)의 위치 523 내지 542에 위치하는 Env 13B 또는 E2-13B (서열 번호 82),

E1 부위의 위치 192-211에 위치하는 IGP 1626 (서열 번호 112),

E1 부위의 위치 204-223에 위치하는 IGP 1627 (서열 번호 113),

E1 부위의 위치 216-235에 위치하는 IGP 1628 (서열 번호 114),

E1 부위의 위치 228-247에 위치하는 IGP 1629 (서열 번호 115),

E1 부위의 위치 240-259에 위치하는 IGP 1630 (서열 번호 116),

E1 부위의 위치 252-271에 위치하는 IGP 1631 (서열 번호 117),

E1 부위의 위치 264-283에 위치하는 IGP 1632 (서열 번호 118),

E1 부위의 위치 276-295에 위치하는 IGP 1633 (서열 번호 119),

E1 부위의 위치 288-307에 위치하는 IGP 1634 (서열 번호 120),

E1 부위의 위치 300-319에 위치하는 IGP 1635 (서열 번호 121) 및

E1 부위의 위치 312-331에 위치하는 IGP 1636 (서열 번호 122).
정제된 재조합 HCV 단일 또는 특정 올리고머 재조합 E1 또는 E2 단백질로부터 형성된 E1/E2 복합체; 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 보조제를 함유하는 치료학적 유효량의 조성물을 함유하는 HCV-특이적 항체를 유도하는 치료용 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 재조합 HCV 외피 단백질이 재조합 포유동물 세포에 의해 제조되는 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 재조합 HCV 외피 단백질이 재조합 효모 세포에 의해 제조되는 조성물.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 조성물 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 보조제를 투여하는 것을 포함하는 HCV로 감염된 포유동물의 치료 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
E1 단백질 및 E2 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정제된 재조합 HCV 단일 또는 특정 올리고머 재조합 외피 단백질; 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 보조제를 함유하는 치료학적 유효량의 조성물을 함유하는 HCV-특이적 항체를 유도하는 치료용 조성물.