KR20020053185A - 수식물질에 의해 수식된 단백질 변이체 및 이것의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치료용, 연구용 및 산업용 목적으로 생산되는 단백질의 안정성과 생물학적 활성을 부여하거나 또는 증진시키기 위하여 화학적 방법, 효소적 방법 또는 두 방법의 조합에 의하여 단백질을 수식시키는 것에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 무세포 단백질 생산법과 유전자 재조합 단백질 생산법을 통하여 생성되는 기존 단백질의 변이체에 폴리에틸렌글리콜과 같은 합성 고분자와 당을 포함하는 수식가능한 물질들의 단량체, 이량체, 올리고머 및 다량체를 위치선택적으로 수식함으로써 혈액 등 생체내에서의 체재기간을 증가시키고 이로써 의학적 효능 및 활성, 생물학적 효능 및 활성을 부여하거나 증진시키는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명에서는 기존의 여러 치료용 단백질을 저렴하게 대량생산할 수 있으며, 이 방법은 모든 치료용, 연구용 및 산업용 단백질의 대량생산에 적용할 수 있다.

Description

수식물질에 의해 수식된 단백질 변이체 및 이것의 제조방법 {Protein Muteins Modified By Modifying Materials And Method For Producing The Same}

본 발명은 치료용, 연구용 및 산업용 목적으로 생산되는 단백질의 안정성과생물학적 활성을 부여하거나 증진시키기 위하여 화학적 방법, 효소적 방법 또는 두 방법의 조합에 의해 단백질을 수식시키는 것에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 무세포 단백질 생산법과 유전자 재조합 단백질 생산법을 통하여 생성되는 기존 단백질의 변이체에 폴리에틸렌글리콜(PEG; 피이지)과 같은 합성 고분자 물질과 당을 포함하는 수식(modification)가능한 물질들의 단량체, 이량체, 올리고머 및 다량체를 위치선택적으로 수식함으로써 혈액 등 생체내에서의 체재기간(half-life)을 증가시키고 이로써 의학적 효능 및 활성, 생물학적 효능 및 활성을 부여하거나 증진시키는 방법 및 그로부터 제조된 단백질 변이체를 제공한다.

에리트로포이에틴(Erythropoietin: EPO) 같은 현재의 치료용 단백질은 효모세포, 동물세포 또는 식물세포 같은 진핵세포에서 주로 생산된다. 이들 단백질 중에는 대장균 등의 원핵세포에서 생산할 경우 당쇄 부가와 같은 수식(modification)이 결핍되어 치료용 목적으로 사용할 수 없게 된다. 즉, 이들 단백질의 수식이 적절히 이루어지지 않기 때문에 생체내 체재기간이 너무 짧아서 치료제로서의 효능을 상실하게 된다.

위와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 지금까지 치료용 단백질의 생체내 생물학적 활성을 증진시키려는 방법들이 다양하게 시도되었다. 이들 방법들의 주요 목적은 치료용 단백질의 크기를 증가시키는 것이었다. 즉, 피이지 같은 고분자 물질을 단백질 사슬에 부가시켜서 단백질 분자의 크기를 증가시키는 방법이다. 이들 방법 중 가장 잘 알려진 방법이 "피이지화"(PEGylation)라고 알려진 방법으로서,피이지를 단백질에 화학적으로 부가시키는 방법이다. 이 방법은 처음에는 항원성을 감소시키려는 목적으로 사용되었으나 현재는 생체내 체재기간을 증가시킴으로써 생물학적 활성을 증진시키려는 목적으로 많이 이용된다. 이러한 기존의 화학적 수식방법들에서는 단백질의 아미노산 서열을 변경시킬 필요가 없기 때문에 그 아미노산 서열이 그대로 유지된다.

그러나, 이러한 종래의 방법은 화학적 수식의 특성으로 인하여 수식물질(modifying materials)의 작용기가 접근할 수 있는 위치에 있는 비슷한 반응성을 가진 모든 아미노산을 수식하기 때문에 위치선택적으로 단백질을 수식할 수 없다는 제약이 따른다. 일반적으로 단백질에 존재하는 20개의 아미노산에는 이론적으로 반응시약(본 발명의 경우는 수식물질이 이에 해당)과 화학적으로 작용할 수 있는 13개의 작용기가 포함되어 있다. 시스틴(cystine)의 이황화결합 및 단백질 사슬에 있는 이차 아미드 결합을 포함하여 화학반응성에 따라 구별되는 14개의 상이한 그룹이 존재한다. 이들 그룹은 다음과 같다: 티오-(Cys, 또는 드물게는 셀레노-Cys), 메틸티오-(Met), 이황화결합, 일차 및 이차 히드록실(Ser, Thr), 페놀성 히드록실(Tyr), 인돌(Trp), 일차 아미노(Lys, 모든 아미노산의 N-말단), 카르복실(Asp, Glu, 모든 아미노산의 C-말단), 구아니딘(Arg), 일차 아미드(Asn, Gln), 이차 및 3차 아미드(Pro) 및 이미다졸(His).

또한, 아미드화, 인산화 등을 포함하는 번역후수식(posttranslational modification)에 의해 도입되는 작용기를 포함하기도 한다. 비록 이렇게 다양한 반응 그룹이 존재하지만, 각 그룹내의 작용기들은 비슷한 반응성을 갖고 있다. 따라서, 종래의 화학적 수식 방법을 이용하는 경우에는, 어떤 수식물질에 대하여 각 그룹내의 비슷한 반응성을 갖는 모든 작용기들이 반응함으로써 각 그룹의 모든 작용기들이 수식되는 일이 발생하게 된다. 결국, 같은 그룹에 속하는 작용기를 갖는 모든 아미노산이 아닌 일부 아미노산에 대해서 위치선택적으로 수식할 필요가 있는 경우에는 종래의 화학적 수식방법을 사용할 수 없게 된다. 바람직하게는, 최상의 단백질 수식 방법은 위치선택성이 있어야 한다. 즉, 원하는 위치에서만 선택적으로 단백질을 수식할 수 있는 새로운 수식방법이 필요한 것이다.

따라서, 본 발명은 위치선택성이 전혀 없는 종래의 수식방법과는 달리, 위치선택적으로 원하는 위치에서만 단백질을 수식시킬 수 있는 새로운 방법을 개발하고, 그러한 단백질 변이체를 생성하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 무세포 단백질 생산법에 따라 생성되는 단백질에 비천연성 아미노산을 도입시켜서 EPO 변이체를 생성하는 과정을 나타낸 도면이고;

도 2a 및 도 2b는 도 1에 나타낸 방법에 있어서, 억제성 tRNA(-CA)에 pdCpA와 아미노산의 결합체를 결합시켜서 억제 전달 RNA를 만드는 과정을 나타낸 도면이고;

도 3은 인간 EPO cDNA가 클로닝된 발현 벡터 pK7-EPO를 나타내는 도면이고;

도 4는 도 1에 나타낸 방법에 있어서, pSup-ala 플라스미드에서 tRNA(-CA)를 합성하는 과정을 나타낸 도면이고;

도 5는 위치선택적 돌연변이법을 이용하여 38번 위치에 시스테인을 도입하고 여기에 피이지(PEG)를 부가하여 피이지화된 EPO를 제조하는 과정을 나타낸 도면이다.

단백질을 위치 선택적으로 원하는 위치에서만 수식하기 위해서는, 생산되는 단백질의 특정 위치에 수식에 사용될 화학 물질과 특이적 반응성을 가진 작용기를 가진 아미노산이나 비천연성 아미노산을 도입시키는 것이 반드시 필요하다. 이런 비천연성 아미노산의 도입은 세포를 이용한 생산법에서는 몇 가지의 특이한 경우를 제외하고는 불가능할 뿐만아니라, 또한 도입 가능한 비천연성 아미노산의 종류가 매우 제한적이어서 위치선택적 단백질 수식에 이용되어질 수가 없다.

그렇지만 본 발명에서 제시되는 무세포 단백질 생산법에서는 개발자의 목적에 맞게 여러 종류의 비천연성 아미노산의 위치선택적 도입이 가능하다. 무세포 단백질 생산법은 처음 분자생물학의 연구도구 또는 숙주세포에 대한 독성으로 세포내에서 생산하기 어려운 단백질의 생산에 이용되어 왔다. 그런데 최근 반응 조건의 최적화 및 반응기의 개발 등으로 상업적으로 유용한 단백질의 새로운 생산 방법으로 대두되고 있다 (Kim, D.M. et al., Eur. J. Biochem. 239:881-886 (1996); Kigawa, T. et al., FEBS Lett. 442:15-19 (1999)). 또한, 상기에서 설명한 바와 같이, 무세포 단백질 생산법에서는 특별히 고안된 목적을 위하여 단백질에 효율적으로 비천연성 아미노산을 도입할 수 있다 (Noren, C.J. et al., Science 244:182-188 (1989)).

본 발명에서 제시되는 또 하나의 위치선택적 수식 방법은 자유 설프히드릴기(free sulfhydryl group)가 없는 단백질에 효과적으로 적용될 수 있다. 이들 단백질의 유전정보를 갖고 있는 유전자 (DNA)의 특정위치 (향후 수식을 가할 아미노산의 코오돈)를 위치선택적 돌연변이법(site-directed mutagenesis)을 이용하여 시스테인의 코오돈(codon)으로 바꾸어서 재조합 세포에서 시스테인이 들어간 구조의 단백질 변이체를 생산한다. 이렇게 도입된 시스테인의 자유로운 설프히드릴기를 수식 반응에 이용한다.

본 발명에 있어서 "단백질의 변이체의 수식체"는 미생물, 식물, 동물세포 유래의 무세포 단백질 생산법이나 유전자 재조합 단백질 생산법에서 생산된, 기존 단백질의 아미노산 서열에서 변화가 생긴 변이체와, 피이지(PEG), 단당류, 이당류, 올리고당 및 다당류 등을 포함하는 수식물질로 구성된다. 수식을 가할 자리에 해당하는 아미노산의 코오돈의 변이는 위치선택적 돌연변이법에 의해 가능하고, 비천연성 아미노산의 도입은 무세포 단백질 생산법에 의해 가능하다. 본 발명에서의 "변이체"(muteins)라 함은 기존 단백질의 일차적인 아미노산의 서열에서 변화가 생긴 것과 비천연성 아미노산이 도입된 단백질을 총칭한다. 또, 본 발명에서 "수식체"라 함은 상기의 변이체에 화학적 방법 및 효소적 방법, 또는 두 방법의 결합에 의해 수식물질을 부가한 산물을 지칭한다. 또, 본 발명에서의 "수식물질"이란 변이체에 부가될 피이지를 포함하는 천연에 존재하거나 합성된 저분자량 물질 및 고분자량 물질과 단당류, 이당류, 올리고당류 및 다당류를 포함하는 당류 등 변이체에 부가될 수 있는 모든 화학물질을 총칭한다.

치료용 단백질을 피이지 같은 수식 물질로 수식하는 것은 두 가지의 이점을 제공한다. 가장 중요한 것은 혈장 등 생체내에서의 체재기간을 증가시켜서 혈액 및 생체내조직 등에서의 생물학적 이용성을 증가시킨다는 것이다. 두 번째는, 수식물질이 비인체 단백질의 항원성 결정부를 가릴 수 있고, 또한 단백질의 면역원성을 변화시킬 수도 있다. 이들 단백질의 수식은 새로운 단백질 표면을 만들어서, 리셉터(혈장 정화(plasma clearance) 또는 면역시스템 인식에 관여하는 것과 같은 리셉터 포함)와의 상호작용이 흔히 다르게 변화될 수 있다. 많은 치료용 단백질이 합성 폴리머 등의 수식물질에 의해 수식될 수 있다. 이러한 수식 물질 중에서 폴리에틸렌글리콜(PEG; 피이지)이 가장 바람직한데, 그 이유는 상업적으로 이용가능한 분자량의 범위가 다양하고, 옥시에틸렌 골격이 친수성 성질을 갖고 있고(각 유니트 당 물 분자 2-3개가 결합가능), 메톡시폴리에틸렌글리콜로부터 단일 작용기를 갖는 유도체를 합성하는 것이 용이하다는 것이다.

피이지 등의 수식물질과 단백질의 작용기를 서로 결합시키기 위해서 여러 가지 유형의 화학적 결합이 연구되었다. 일부 폴리머(가령, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체)는 본질적으로 반응성을 갖지만, 대부분은 (처음에는) 폴리작용기를 갖는 시약에 의해 특이적으로 활성화될 것을 필요로 한다. 트리- 또는 디-할로트리아진에서 할로겐의 부분 치환은 아미노- 및 히드록실-함유 폴리머를 활성화시키는 일반적인 초기 방법이었다. 하지만, 부작용 및 트리아진 반응성에 대한 염려 때문에 상기 방법은 현재에는 일반적으로 이용되지는 않는다. 카르보닐 디이미다졸은 피이지의 히드록실기를 단백질 아미노기에 대한 양호한 반응성을 갖는 아실이미다졸로 활성화시키는 매우 효과적인 시약이다. 어떤 결합 방법은 가역적인 폴리머-단백질 결합체(예컨대, 숙시닐-피이지의 활성 에스테르)를 생성하는데, 여기서 폴리머는 가수분해에 의해 제거될 수 있다. 이황화결합 교환에 기초한 방법은 단백질-단백질 결합체를 제조하는 것이 아닌 합성 폴리머의 연결에는 널리 사용되지는 않는다. 피이지-수식된 치료용 단백질의 경우, 대개 약 60kDa 이상의 단백질 분자량을 증가시키면 혈장 정화에 대하여 상당한 효과를 나타낸다. 여기서, 효과의 크기는 수식되지 않은 단백질의 정화 메카니즘에 크게 좌우된다.

본 발명에서 이용하는 무세포 단백질 생산법에서는, 변이체 생산에 있어서 수식해야 될 위치에 해당하는 기존의 아미노산에 해당하는 DNA상의 코오돈을 위치선택적 돌연변이법으로 앰버 중단 코오돈(amber stop codon)으로 바꾼다. 이 새로운 유전자를 무세포 단백질 생산법의 주형 (template)으로 이용한다. 또, 무세포 단백질 생산시 앰버 중단 코오돈에 해당하는 안티코오돈을 가지고 있는 억제(suppressor) tRNA를 반응액에 첨가해 주어야 한다. 이 억제 tRNA는 수식물질과 특이적으로 반응할 수 있는 작용기나 당들이 미리 붙어 있는 비천연성 아미노산이 반응액 첨가 전에 미리 부착되어 있어야 한다. 이미 여러 비천연성 아미노산들이 무세포 단백질 생산법으로 성공적으로 단백질에 도입되었다 (Cornish, V.W. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34:621-633 (1995)). 이 때 비천연성 아미노산에 붙어 있는 작용기는 목적에 맞게 보호기로 보호할 수도 있고 보호기가 없어도 무방하다. 더 나아가, 이 작용기 대신에 단당류 및 이당류를 포함하는 당이 미리 붙어 있는 아미노산이나 그 유사체도 가능하다. 이렇게 무세포 단백질 생산법으로 생산된 변이체를 분리하여 화학적 및 효소적 수식법, 또는 두 방법을 결합한 방법으로 피이지, 단당류, 이당류, 올리고당 및 다당류 등을 포함하는 수식물질을 변이체에 부가시킨다.

본 발명에서 제시된 또 다른 방법은 위치선택적 돌연변이법과 재조합 세포 배양법의 결합으로 이루어진다. 이 방법은 단백질의 구조에서 자유로운 설프히드릴기가 없는 경우에 유용하다. 이 방법에서는 기존 단백질의 수식 위치에 해당하는 아미노산에 상응하는 DNA상의 코오돈을 시스테인 아미노산에 해당하는 코오돈으로 위치선택적 돌연변이법으로 바꾼다. 이 변이된 DNA로 숙주세포를 형질전환시켜 결과적으로 자유로운 설프히드릴기를 가진 시스테인이 인위적으로 도입된 변이체를 생산한다. 이 생산된 변이체를 분리하고 재폴딩(refolding) 공정을 수행한 후 밖으로 노출된 자유로운 설프히드릴기와 수식물질과의 특이적 결합을 이용하여 수식물질을 변이체의 목적한 위치에 부가한다. 이 반응은 이황화 결합, 개환 반응 등을 포함하는 화학 반응일 수도 있고 또는 효소를 이용한 당 및 당쇄 부가반응일 수도 있다.

지금까지 일반적인 치료용 단백질을 본 발명의 무세포 단백질 생산법이나 유전자 재조합 단백질 생산법에 의해 치료용 단백질을 위치특이적으로 수식시켜서 생체내에서의 체재 기간을 증가시키고 이로써 의학적, 생물학적 효능 및 활성을 부여하거나 증진시키는 방법을 설명하였다.

본 발명은 의약용, 산업용, 연구용 당단백질의 모사에 응용될 수 있으며, 기존의 당단백질의 당쇄를 대체 혹은 첨가, 위치 변화시키거나, 당단백질이 아닌 경우도 본 발명의 당쇄의 모사법을 응용하여 그 안정성이나 생물학적 안정성을 부여할 수 있으며, 새로운 형태의 단백질을 생산(이것은 신약의 개발을 의미할 수도 있다)하는데 응용 가능하다. 따라서, 성장호르몬, 혈구자극인자, 인터루킨, 인터페론, 혈소판생성자극인자(thrombopoietin, tissue plasminogen activator) 등의 단백질이 모두 포괄될 수 있다.

이하에서는, 치료용 단백질의 구체적인 예로서 에리트로포이에틴(EPO)을 본 발명의 방법을 이용하여 수식시키는 것에 대하여 상세히 설명한다. 하지만, EPO는 단지 치료용 단백질의 한 실례로서 제시된 것에 불과하며, 본 발명이 EPO에만 한정되는 것은 아니다.

에리트로포이에틴(EPO)은 만성 신장 질환을 포함한 각종 질환과 연관된 빈혈증을 치료하기 위하여 현재 널리 사용되는 치료용 당단백질이다. EPO는 포유동물 및 조류에서 적혈구 생성의 주요 조절물질이다. 특히, 이 당단백질 호르몬은 골수, 지라, 및 태아 간에서 적혈구 전구세포의 급속 생장을 촉진하며, 그후 순환계의 적혈구로 최종 분화하는데 필요하다. 현재 치료용 EPO는 동물 세포 배양에 의하여 생성된다. 대장균 같은 미생물에 의해 생성되는 EPO의 폴리펩티드는 글리칸의 결핍 때문에 치료 목적에 사용할 수가 없다. 따라서, 미생물로부터 EPO 변이체를 생성하는 방법 이외에도, 생체외 단백질 합성 및 피이지화, 또는 생체내 발현 및 피이지화의 조합 같은 수식 공정이 필요하다. 여기서 EPO 변이체는 천연 EPO와는 일차 구조가 다른 돌연변이체 단백질을 의미하는 것으로 정의한다.

발현 방법(즉, 생체내 또는 생체외)에는 관계없이, 미생물에서 유도되는 EPO 폴리펩티드의 투여는 올리고당류 부분의 결핍 때문에 열등한 생물학적 활성을 나타낸다. 이러한 EPO 폴리펩티드는 생체내 정화 시스템에 의해 정화되기 쉬우므로 치료 효과가 크게 감소된다. 본 명세서에서 EPO 폴리펩티드는 어떤 글리칸이 없이 단백질의 펩티드 부분만으로 이루어진 것을 의미하는 것으로 정의한다. 위와 같은 정화 시스템에 의한 단백질의 치료 효과 감소 문제는 EPO 변이체를 수식함으로써 감소시킬 수 있다. EPO를 피이지와 같은 수식물질로 수식함으로써 혈장 등에서의 체재기간을 증가시켜서 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다.

본 발명자는 대장균에서 유도되는 무세포 단백질 생산법, 또는 위치선택적 돌연변이법에 의해 글리코실화 부위에 변화시킨 코오돈을 갖는 EPO cDNA 플라스미드를 포함한 재조합 대장균 균주의 배양에 의하여 수식되지 않은 EPO 변이체를 생성하였다. 수식되지 않은 EPO 변이체는 당업계에서 흔히 사용되는 피이지화 방법에 의해 선택적으로 수식되었다. 물론 종래의 수식방법은 무작위적으로 단백질의 전체 아미노산을 수식하였지만, 본 발명에서는 원하는 위치의 아미노산 부위에서만수식물질에 수식되도록 하였다. 무세포 단백질 생성 또는 미생물 배양에 의하여 생성된EPO 변이체는, EPO 변이체 각 분자 당 1 내지 3 PEG 분자가 공유결합에 의하여 화학적으로 수식되었다. 피이지는 EPO 변이체의 자유 설프히드릴기에 결합되었다. EPO 폴리펩티드는 어떤 반응성(자유) 설프히드릴기를 포함하지 않는다는 것이 와일드 타입 EPO의 폴리펩티드 구조로부터 알려져있기 때문에, EPO의 원하는 위치(또는 위치들)에 자유 설프히드릴기를 도입시켰다.

EPO에 자유 설프히드릴기를 도입하기 위해서 2가지의 다른 방법을 사용하였다. 이 방법은 보호된 작용기를 갖는 비천연성 아미노산이 부착된 억제성 tRNA에 의해 중지 코오돈을 억제시키는 방법, 그리고 위치 선택적 돌연변이법을 이용하여 원하는 위치에서 시스테인을 도입하는 방법이다. 무세포 단백질 생산법에 의해 생성되는 EPO 변이체는 수식물질에 특이적으로 반응할 수 있는 작용기를 갖는 비천연성 아미노산을 도입시켰다. 이것은 무세포 단백질 생산법의 이용에 의하여 가능해졌다. 수식시킬 위치에 있는 아미노산 잔기에 해당하는 코오돈을 위치선택적 돌연변이법에 의하여 앰버(amber) 중단 코오돈으로 변화시켰다. 이는 앰버 중단 코오돈 외의 다른 중단 코오돈이나 희귀 코오돈의 프레임쉬프트(frameshift of rare codon)을 이용할 수도 있으며(Hohsaka, T. et al., J. Am. Chem. Soc. 118:9778-9779(1996)) 이는 기본적으로 모두 같은 방법을 따른다. 앰버 중단 코오돈을 포함하는 새로운 주형을 무세포 단백질 생산법에 의하여 발현시켰다. 무세포 단백질 생성 동안, 앰버 중단 코오돈이 어떤 비천연성 아미노산을 암호화하도록 앰버 중단 코오돈에 해당하는 억제성 tRNA를 반응에 포함시켰다. 상기 억제성 tRNA에는 수식물질에 특이적으로 반응성이 있는 비천연성 아미노산을 미리 부착시킨다. 발현되는 EPO 변이체를 정제하고, 그 후 피이지화 같은 화학적 수식에 의하여 수식시킨다. 단백질 내에 성공적으로 도입된 비천연성 아미노산 및 유사체의 실례들이 다수 알려져 있다(Cornish, V.W. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34:621-633 (1995)). 이때 비천연성 아미노산은 수식물질과 반응하기 전에 탈보호를 필요로 하는 보호된 작용기를 포함할 수 있고, 또는 화학적 반응을 통해서 합성 폴리머로 수식되거나 또는 화학적 반응이나 효소적 반응을 통해서 단당류, 이당류, 올리고당류 및 다당류로 수식될 수 있는 단당류를 포함할 수도 있다.

무세포 단백질 생산법 이외에 다른 방법은 위치 선택적 돌연변이법과 생체내 방법의 조합이다. 자유로운 설프히드릴기(free sulfhydryl group)가 없는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는, 수식시킬 위치에서 어떤 아미노산에 해당하는 코오돈을 시스테인 암호화 코오돈으로 전환시키도록 돌연변이시킬 수 있다. 그 결과로서, 시스테인이 도입된 폴리펩티드는 수식시킬 위치에서 자유로운 설프히드릴기를 포함할 것이다. 이 설프히드릴기를 특이적인 수식 위치로서 사용할 수 있다. 위와같은 EPO 변이체를 제조한 후 피이지화를 수행한다. 따라서, EPO 변이체는 EPO의 성숙 천연 아미노산 서열의 아미노산 중 하나가 시스테인 잔기에 의해 치환된 것이며, 치환된 시스테인 잔기를 통해서 선택된 수식물질에 결합된다. 이들 변이체는 변이체를 암호화하는 돌연변이 유전자의 숙주 발현을 통해서 만들어지며, 이 돌연변이 유전자는 위치 선택적 돌연변이법에 의하여 모 단백질의 유전자로부터 변화된다.

무세포 단백질 생산법과 피이지화의 조합을 통해서 피이지화된 EPO 변이체를 제조하는 방법은 실시예 1에서 상세히 설명된다. 그리고, 생체내 발현과 피이지화의 조합을 통해서 피이지화된 EPO 변이체를 제조하는 방법은 실시예 2에서 상세히 설명된다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 무세포 단백질 생산법을 이용한 피이지화 에리트로포이에틴(EPO) 변이체의 생산

무세포 단백질 생산법을 이용한 비천연성 아미노산의 도입 방법에서는 주형으로 사용되는 DNA에 앰버 중단 코오돈의 도입이 필요하다. 이 앰버 중단 코오돈에 해당하는 tRNA가 무세포 단백질 생산법의 반응액에는 존재하지 않으므로 이 DNA를 주형으로 하여 전사된 앰버 코오돈이 포함된 tRNA의 번역은 앰버 중단 코오돈에서 멈추게 된다. 하지만 도입된 앰버 중단 코오돈에 상응하는 억제 tRNA (suppressor tRNA)를 무세포 단백질 생산법의 반응액에 첨가하여 앰버 중단 코오돈이 존재하는 RNA를 번역하는 경우 앰버 중단 코오돈에서 번역이 중단되지 않고 전체 길이의 완전한 단백질이나 폴리펩티드가 합성될 수 있음이 알려져 있다 (Noren, CJ. et al., Science 244:182-188(1989)).

도 1은 본 실시예의 무세포 단백질 생산법에 따라 생성되는 단백질에 비천연성 아미노산을 도입시켜서 EPO 변이체를 생성하는 과정을 도식적으로 나타내고 있다.

본 발명에서는 상기 사실을 이용하여 기존의 치료용으로 사용되는 EPO의 DNA의 특정 위치를 위치 선택적 돌연변이법을 이용하여 앰버 중단 코오돈으로 치환하였다. 이러한 변형 DNA를 포함하는 플라스미드를 무세포 단백질 생산계에서 번역하였으며, 이때 작용기를 미리 보호한 비천연성 아미노산을 장착한 tRNA를 함께 첨가하였다. T7 전사효소에 의해 이 플라스미드가 전사되고 이어 번역되면서 향후 단백질 수식에 이용할 아미노산에 해당하는 코오돈의 위치에 도입되었던 앰버 중단 코오돈이 비천연성 아미노산으로 번역되며 번역 중단이 억제되었다. 항원-항체 반응을 이용하여 생산된 EPO의 변이체를 분리하여 비천연성 아미노산의 작용기에 붙어 있던 보호기를 제거하여 자유 설프히드릴기를 재생하고 이 작용기를 이후의 피이지화 반응에 사용하였다.

EPO 변이체의 38번 위치의 피이지화는 아래에 나타낸 바와 같이 수행하였다.

기존의 치료용으로 사용되는 EPO의 cDNA를 T7 프로모터와 터미네이터가 있는 원핵세포용 발현 벡터 pK7(Kim. D. M. et al., Eur. J. Biochem. 239:881-886 (1996))에 클로닝하였다(도 3). 인간 EPO cDNA가 클로닝된 발현 벡터 pK7-EPO의 구조는 도 3에 도시되어 있다. 기존의 EPO에서 아스파라진을 암호화하던 38번 코오돈을 PCR 방법에 의거한 위치선택적 돌연변이법을 이용하여 앰버 중단 코오돈으로 치환하였다. 이렇게 도입된 앰버 중단 코오돈의 억제에 사용될 억제 tRNA는 두 단계로 나누어 합성하였다. 억제 tRNA의 기본 구조는 대장균의 알라닌의 tRNA의 구조를 사용하였고 안티코오돈 부위를 앰버 중단 코오돈에 상응하게 변형하였다. 여기서 사용한 대장균의 알라닌의 tRNA 외에도 다른 tRNA도 앰버나 다른 번역 중단코오돈의 억제에 사용할 수 있다. 말단의 CA가 제거된 앰버 억제 tRNA(tRNA(-CA))를 암호화하는 합성 DNA 가닥들을 pUC19에 클로닝하여 pSup-ala 플라스미드를 제작하였다. 상기 CA는 CMP와 AMP가 인산화 결합을 통하여 붙어 있는 디뉴클레오티드이다. 제작된 플라스미드를 제한효소인FokI으로 절단하고 런-오프 전사 (run-off transcription) 방법으로 tRNA(-CA)를 합성하였다. pSup-ala 플라스미드에서 tRNA(-CA)를 합성하는 과정이 도 4에 도시되어 있다.

전사는 프로메가사의 RiboMAX 다량 RNA 제조 시스템(large scale RNA production system)을 이용하였으며, 제조사의 방법에 따랐다.

말단에 부가될 디뉴클레오티드인 pdCpA는 로버트손 등 (Robertson, SA. et al., Nucleic Acids Res. 17:9649-9660 (1989))의 방법에 따라 유기화학적 방법으로 합성하였으며, 비천연성 아미노산으로 이용될 알파-아민과 다른 작용기가 보호된 아미노산의 시아노메틸 에스테르는 다음과 같이 합성하였다.

본 실시예에서 사용한 비천연성 아미노산은 N-(4-펜테노일), S-(2-니트로벤질)시스테인이었다. pdCpA는 포스포아미다이트법을 이용하였으며, 전술한 비천연성 아미노산은 시스테인을 2-니트로벤질 클로라이드와 반응하고 이를 다시 4-펜테노산 무수물과 반응하여 합성하였다. 이 비천연성 아미노산의 활성 에스테르는 아미노산과 클로로아세토니트릴과의 반응으로 합성하였다. 테트라부틸암모늄 염 형태의 pdCpA를 N-(4-펜테노일), S-(2-니트로벤질)시스테인의 활성 에스테르로 아미노아실화하였고 이를 고성능액체크로마토그라피법(HPLC)으로 분리하였다. 산물인 pdCpA와 아미노산의 결합체를 T4 RNA 리가아제로 tRNA(-CA)에 결합하였다. 여기서요오드를 이용하여 4-펜테노일 기를 제거하여 억제 tRNA를 완성하였다. 지금까지 설명한 억제성 tRNA(-CA)에 pdCpA와 아미노산의 결합체를 결합시켜서 억제 tRNA를 만드는 과정이 도 2a 및 도 2b에 상세히 나타나 있다.

무세포 단백질 생산과 번역 중단 억제 반응은 기본적으로 김 등 (Kim, DM. et al., Eur. J. Biochem. 239:881-886 (1996))의 방법을 따랐으며, 약간의 변형된 방법을 사용하였다. 무세포 단백질 생산 반응액의 조성은 다음과 같다: 57 mM Hepes/KOH pH 8.2, 1.2 mM ATP, 각 0.85 mM의 GTP, UTP와 CTP, 150 mM 칼륨글루타메이트, 80 mM 초산암모늄, 18 mM 초산마그네슘, 0.17 mg/ml 대장균 tRNA 혼합물 (MRE 600), 34 mg/ml l-5-포르밀-5,6,7,8-테트라히드로폴산, 6.7 g/ml 환형의 플라스미드, 33 g/ml T7 전사효소, 0.3 U/ml 피루베이트 키나제, 28 mM 포스포(에놀)피루베이트, 0.1 g/ml 억제 전달 RNA, 20% (v/v) S30 추출액. 상기 반응액을 37℃에서 60분간 반응시켰다.

S-(2-니트로벤질)시스테인이 도입된 EPO의 변이체를 EPO에 대한 단일 항체를 이용하여 일반적인 방법으로 분리하였다.

재폴딩 용액 (50 mM 인산이수소나트륨, 2% (v/v) 소듐 라우릴 사르코실레이트, 40 μM 황산구리)에 투석하여 재폴딩시킨 후 EPO 변이체를 동결건조하였다. 분리한 EPO의 변이체 시료들 (1ml, 50 ㎍ 단백질, 용매는 물이나 PBS)을 파이렉스 튜브에서 320 nm의 자외선으로 조사하였다. 광화학반응(광탈보호 반응)으로 EPO의 변이체에 자유 설프히드릴기가 형성되었으며, 이 위치 (38번 시스테인)를 위치선택적으로 피이지화 하였다. 광탈보호 반응과 피이지화는 동시에 혹은 따로 수행할수 있다. EPO의 변이체와 피이지-말레이미드와의 반응은 pH 6의 50 mM 초산나트륨 완충용액에서 5 mM EDTA 존재하에 EPO 변이체와 피이지간의 분자비가 1: 5 가 되도록하여 실온에서 24시간 교반하여 수행하였다. 피이지화된 EPO 변이체의 수식체는 수식되지 않은 EPO의 변이체와 남아있는 피이지에서 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다. 분리한 피이지화된 EPO 변이체의 수식체의 생물학적 활성은 아래와 같이 측정하였다.

피이지화된 EPO 변이체의 수식체의 체외 활성은 10% 배 송아지 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지 (Kitamura, T. et al., Blood 73:375-380 (1989))에서 배양한 EPO에 의존성 생장을 보이는 인체 세포주 TF-1의 생장으로 측정하였다. 생체내 활성은 골드와이져의 방법 (Goldwasser, E.와 Gross, M., Methods in Enzymol. 37:109-121 (1975))에 따라 쥐의 혈구세포에 도입된⁵⁹Fe를 정량하여 측정하였다. 각 측정값은 평행선 분석(parallel line assay) (Dunn, CDR., Napier, JAP., Exp. Hematol. (N.Y.) 6:577-584 (1978))에 따라 결정하였다. 즉, 시료당 9번의 측정을 하였으며, 각 측정당 2번의 분석으로 생체외 활성을 측정하였으며, 체내 활성 측정을 위해서는 시료당 3번의 측정과 각 측정당 3마리의 쥐를 사용하였다. 1/500으로 희석한 피이지화된 EPO의 변이체의 수식체에 포함된 염과 같은 다른 물질들은 생물학적 활성분석에 별다른 영향을 미치지 않았다. 생물학적 활성분석에서는 The second International Reference Preparation에 따라 고순도로 정제된 재조합 인간 에리트로포이에틴 (rHuEPO)을 표준품으로 사용하였다. 생물학적 활성 측정 결과로피이지화 EPO 변이체의 수식체는 rHuEPO에 비해 생체외 활성이 2배 이상 높았으며, 피이지화 하지 않은 EPO 변이체는 rHuEPO에 비해 3배 이상의 높은 생체외 활성을 나타내었으나 생체내에서는 활성을 소실하였다. 피이지화 하지 않은 EPO의 변이체는 생체내의 정화 기작(clearance system)에 의해 소실된 것이다. 피이지화된 EPO의 변이체의 수식체는 rHuEPO에 비해 높은 생체외 활성을 보였으나 생체내 활성은 rHuEPO와 비슷하거나 약간 낮은 정도로 나타났다. 피이지화된 EPO의 변이체의 수식체의 생체내 활성에서 나타나는 약간의 실험치의 변이들은 EPO의 변이체에 부가되어 있는 피이지 분자의 수화정도에 따른 것으로 보인다.

실시예 2: 유전자 재조합 단백질 생산법을 이용한 에리트로포이에틴의 변이체의 생산 및 피이지화하는 방법

도 5에는 위치선택적 돌연변이법을 이용하여 38번 위치에 시스테인을 도입하고 여기에 피이지(PEG)를 부가하여 피이지화된 EPO를 제조하는 과정이 잘 도시되어 있다.

향후 수식할 위치에 시스테인을 도입하기 위해 QuickChange^TM위치특이적 돌연변이 유발 키트(site-directed mutagenesis Kit) (스트라타진)을 이용하여 위치선택적 돌연변이를 유도하였다. 이 때 사용한 32량체의 올리고뉴클레오티드를 아래의 서열과 같이 합성하였다.

5'-GACGCTTGAATGAGTGTATCACTGTCCCAGAC-3'

이 합성 단편은 기존의 치료용으로 사용되는 인간 EPO의 38번 아스파라진을시스테인으로 치환하도록 디자인하였다. 인간 EPO의 cDNA를 pET-16b(노바젠)에 클로닝하여 제작한 플라스미드 pET16b-hEPO를 주형으로 하여 전술한 합성 단편으로 PCR 반응시켰다. PCR 반응액 조성은 다음과 같다. 즉, 50 ㎕ 반응액당 5 ㎕의 10× PCR 완충액 (프로메가), 1 ㎕의 10 mM 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 혼합물, 50 pmol의 각 올리고뉴클레오티드, 2.5 유니트의PfuDNA 중합효소, 그리고 50 ng의 주형을 사용하였다. PCR 반응이 끝난 후 반응액을 37℃ 이하로 냉각한 후 얼음에 2분 간 두었다. 주형으로 사용된 DNA를 제거하기 위하여 37℃에서 1시간 동안DpnI 효소로 처리하였다.

DpnI으로 처리한 DNA로Epicurian ColiXL-1 Blue 슈퍼캄피턴트 세포(supercompetent cell)를 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 암피실린이 포함된 고형 배지위에 도포하고 생성된 형질전환체를 암피실린이 포함된 액체 배지에 접종하여 배양한 후 이 세포로부터 플라스미드를 추출하였다.

38번 아스파라진이 시스테인으로 치환된 EPO (이를 N38C EPO라 한다)는 대장균 BL21(DE3)에서 발현하였다. 세포를 암피실린이 포함된 NZCYM 배지를 이용해 37℃에서 600 nm에서 흡광도가 0.6에 이를 때까지 배양하고 1 mM의 이소프로필티오-β-D-갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 N38C EPO의 발현을 유도하였다. IPTG 유도 4 시간 후 5,000g로 4℃에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하고 이를 결합완충액 (5 mM 이미다졸, 0.5 M 염화나트륨, 50 mM 인산나트륨, pH 8.0)으로 재부유시켰다. 수집한 세포는 초음파를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄물을 4℃에서 7,000g로 40 분간 원심분리하고 침전물을 결합완충액에 재부유시켰다. 이를 다시 상기 조건으로원심분리하였다. 얻어진 침전물을 다시 결합완충액 (8 M 요소, 5 mM 이미다졸, 0.5 M 염화나트륨, 50 mM 인산나트륨, pH 8.0)에 재부유시켰다. 부유액을 얼음에 1시간 둔 후 4℃에서 18,000g로 40분간 원심분리하고 상등액을 0.45 ㎛의 필터로 여과하였다.

발현한 N38C EPO를 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 다음의 순서와 같이 분리하였다.

1. 변성제가 포함되어 있는 결합완충액으로 컬럼을 평형화한다.

2. 세포 파쇄물을 흘린다.

3. 결합완충액을 흘린다.

4. 세척완충액 (20 mM 이미다졸, 0.5 M 염화나트륨, 50 mM 인산나트륨, 8 M 요소, pH 8.0)을 흘린다.

5. 용출완충액 (1M 이미다졸, 0.5 M 염화나트륨, 50 mM 인산나트륨, 8 M 요소, pH 8.0)으로 용출한다.

Ni-NTA 친화 크로마토그라피를 위해 미리 EPO 변이체에 도입해 두었던 폴리히스티딘 택(tag)을 단백질 절단 효소인 Factor Xa로 절단하였다. Factor Xa의 반응은 20 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.4), 0.1 M 염화나트륨의 조건에서 수행하였고, 반응 후 폴리히스티딘 택이 잘려나간 EPO 변이체를 C18 컬럼상에서 고성능액체크로마토그라피법(HPLC)으로 분리하였다.

8M 요소가 함유된 단백질 용액에 3 mM의 디티오스레이톨을 첨가하고 이를 재폴딩 용액(50 mM 인산이수소나트륨, 2% (v/v) 소듐 라우릴 사르코실레이트, 40 μM황산구리)에 투석하면서 EPO 변이체의 재폴딩을 유도하였다. 다시 EPO 변이체가 녹아있는 완충 용액을 이 후의 피이지화 반응을 위하여 피이지화 용액(50 mM 초산나트륨, pH 6, 5 mM EDTA)으로 치환하였다. EPO의 변이체와 피이지-말레이미드와의 피이지화 반응은 pH 6의 50 mM 초산나트륨 완충용액에서 5 mM EDTA 존재하에 EPO 변이체와 피이지간의 분자비가 1: 5 가 되도록하여 실온에서 24시간 교반하여 수행하였다. 피이지화된 EPO 변이체의 수식체는 수식되지 않은 EPO의 변이체와 남아있는 피이지에서 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다. 분리한 피이지화된 EPO 변이체의 수식체의 생물학적 활성은 아래와 같이 측정하였다.

피이지화된 EPO 변이체의 수식체의 생체외 활성은 10% 배 송아지 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지 (Kitamura, T. et al., Blood 73:375-380 (1989))에서 배양한 EPO에 의존성 생장을 보이는 인체 세포 TF-1의 생장으로 측정하였다. 체내 활성은 골드와이져의 방법 (Goldwasser, E.와 Gross, M., Methods in Enzymol. 37:109-121 (1975))에 따라 쥐의 혈구세포에 도입된⁵⁹Fe를 정량하여 측정하였다. 각 측정값은 평행선 분석(parallel line assay) (Dunn, CDR., Napier, JAP., Exp. Hematol. (N.Y.) 6:577-584 (1978))에 따라 결정하였다. 즉, 시료당 9번의 측정을 하였으며, 각 측정당 2번의 분석으로 생체외 활성을 측정하였으며, 생체내 활성 측정을 위해서는 시료당 3번의 측정과 각 측정당 3마리의 쥐를 사용하였다. 1/500으로 희석한 피이지화된 EPO의 변이체의 수식체에 포함된 염과 같은 다른 물질들은 생물학적 활성 분석에 별다른 영향을 미치지 않았다. 생물학적 활성분석에서는 Thesecond International Reference Preparation에 따라 고 순도로 정제된 rHuEPO를 표준품으로 사용하였다. 생물학적 활성 측정 결과로 피이지화된 EPO 변이체의 수식체는 rHuEPO에 비해 생체외 활성이 2배 이상 높았으며, 피이지화 하지 않은 EPO 변이체는 rHuEPO에 비해 3배 이상의 높은 생체외 활성을 나타내었으나 생체내에서는 활성을 소실하였다. 피이지화 하지 않은 EPO의 변이체는 생체내의 정화 기작에 의해 소실된 것이다. 피이지화된 EPO의 변이체의 수식체는 rHuEPO에 비해 높은 생체외 활성을 보였으나 생체내 활성은 rHuEPO와 비슷하거나 약간 낮은 정도로 나타났다. 피이지화된 EPO의 변이체의 수식체의 생체내 활성에서 나타나는 약간의 실험치의 변이들은 EPO의 변이체에 부가되어 있는 피이지 분자의 수화정도에 따른 것으로 보인다.

본 발명은 치료용, 연구용 및 산업용 목적으로 생산되는 단백질의 안정성과 생물학적 활성을 부여하거나 또는 증진시키기 위하여 화학적 방법, 효소적 방법 또는 두 방법의 조합에 의하여 단백질을 수식시키는 것에 관한 것이다. 그런데, 본 발명은 종래의 단백질 수식 방법이 위치선택적으로 단백질을 수식시킬 수 없었던 것과는 달리, 본 발명의 경우에는 무세포 단백질 생산법과 유전자 재조합 단백질 생산법을 통하여 생성되는 기존 단백질의 변이체에 폴리에틸렌글리콜과 같은 합성 고분자와 당을 포함하는 수식가능한 물질들의 단량체, 이량체, 올리고머 및 다량체를 위치선택적으로 수식함으로써 혈액 등 생체내에서의 체재기간을 증가시키고 이로써 의학적 효능 및 활성, 생물학적 효능 및 활성을 부여하거나 증진시킬 수 있는효과가 있다.

따라서, 본 발명에서는 기존의 여러 치료용 단백질을 저렴하게 대량생산할 수 있으며, 이 방법은 모든 치료용, 연구용 및 산업용 단백질의 대량생산에 적용할 수 있다.

Claims (8)

1. 치료용, 연구용 및 산업용 단백질을 위치선택적으로 원하는 위치에서 수식시켜서 수식된 단백질 변이체를 생성하는 방법으로서,

   수식해야 할 위치의 아미노산에 해당하는 코오돈을 돌연변이시켜서 앰버를 포함하는 중단 코오돈이나 희귀 코오돈으로 바꾸고,

   무세포 단백질 생산시 앰버를 포함하는 중단코오돈이나 희귀 코오돈에 해당하는 안티코오돈을 갖는 억제 tRNA를 첨가하여 억제 tRNA에 부착되어 있는 비천연성 아미노산을 단백질에 도입하여 단백질 변이체를 생성하고(여기서, 비천연성 아미노산에는 수식물질이 미리 부착되어 있을 수 있다),

   생성된 단백질 변이체의 원하는 위치에 위치선택적으로 수식물질을 부가시키는 것을 포함하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 수식물질은 피이지류, 단당류, 이당류, 올리고당류 및 다당류 등 변이체에 부가될 수 있는 천연, 비천연성 물질 중에서 선택되는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질이 EPO인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 위치선택적으로 수식된 단백질 변이체.
5. 치료용, 연구용 및 산업용 단백질을 위치 선택적으로 원하는 위치에서 수식시켜서 수식된 단백질 변이체를 생성하는 방법으로서,

   수식해야 할 위치의 아미노산에 해당하는 DNA상의 코오돈을 돌연변이시켜서 시스테인 아미노산에 해당하는 코오돈으로 바꾸고,

   상기 변이된 DNA로 숙주세포를 형질전환시켜서 자유로운 설프히드릴기를 갖는 시스테인이 도입된 변이체를 생성하고,

   생성된 변이체의 자유로운 설프히드릴기에 수식물질을 결합시켜서 변이체의 원하는 위치에 수식물질을 부가시키는 것을 포함하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 수식물질은 피이지류, 단당류, 이당류, 올리고당류 및 다당류 등 변이체에 부가될 수 있는 천연, 비천연성 물질 중에서 선택되는 방법.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 단백질이 EPO인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 위치 선택적으로 수식된 단백질 변이체.