KR20010080757A

KR20010080757A - 융모막 성선자극호르몬 ｄｎａ 백신 및 방법

Info

Publication number: KR20010080757A
Application number: KR1020017007347A
Authority: KR
Inventors: 이버센패트릭엘.
Original assignee: 추후보정; 에이브이아이 바이오파마 인코포레이티드
Priority date: 1998-12-18
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2001-08-22
Also published as: CA2357726A1; JP2002534478A; US20020025939A1; WO2000041717A3; AU2056500A; WO2000041717A2; US20060121010A1; AU776795B2; EP1140154A2

Abstract

본 발명은 대상의 면역 반응 세포를 적어도 하나의 hCG 면역원성 에피토프 또는 이의 전구체를 암호화하는 핵산 구조체에 노출시키는 것에 의해서 면역 반응 세포에 의해 핵산구조체가 흡수되고 프로세싱되도록 하는 포유동물 대상의 면역치료법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 hCG-암호화 핵산 구조체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

융모막 성선자극호르몬 ＤＮＡ 백신 및 방법{CHORIONIC GONADOTROPIN DNA VACCINES AND METHODS}

예방접종은 질병 징후의 감소, 감염 인자의 수평적 전달의 방지 및 질병 사망율을 감소시키기 위한 면역 시스템의 준비 수단이다. 대상의 면역 시스템은 외부 항원에 대해 면역 반응을 일으킬 것이라는 것이 잘 알려진다. 다른곳에서 형성된 항체를 투여하는 것에 의해 동물에 면역원성을 부여하는 것이 또한 알려진다.(즉, 수동 면역)

표준 백신은 "능동" 면역원으로서 바람직한 면역 반응에 대한 카르보히드레이트, 펩티드, 폴리펩티드, 및 글리코실화된 폴리펩티드의 투여를 포함한다. 이러한 표준 면역화에 대한 대안은 대상에 항체의 수동적 투여이다.

두가지 형태의 " 예방접종" 는 관심의 항원에 대한 항체-매개 보호로 방향지워진다. 그러나, 일반적으로 결합된 체액성(항체) 및 세포-매개 면역 반응이 바람직하다.

게다가, 인간대상 치료를 위해서는 수동 면역화 과정의 사용에 심각한 제한이 있다. 이러한 제한은 항체 생산 비용 및 이러한 항체의 연속적인 투여에 대한요구로 인해 암과 같은 만성 질병의 처리에 가장 명백하다. 게다가, 다클론 또는 단일클론 항체는 일반적인 기법에 의해 쉽게 생산되지만, 생체내 송달에 안전한 항체 조성물의 생산 및 정제는 상대적으로 비용이 많이 들고 시간 소비적이다.

추가적인 어려움은 면역원이 대상의 면역 시스템에 의해 일반적으로 인지되지 않은 용해성 단백질 또는 내인성 단백질일 때 발생한다. 일반적으로, 대동맥에 직접적으로 제공되는 단백질과 같은 용해성 단백질은 순환 항체의 형태로 체액성 면역 반응을 유도한다. (Chen, CH 및 Wu, TC, 1998) 대조적으로, 세포성 면역은 일반적으로, 기생충 또는 바이러스에 의해 생산된 항원과 같은 세포내 항원에 의해 유발되고, 또한 충실성종양을 제거하기 위해 신체에 사용될 수 있다. 세포성 면역은 MHC 유형 I 항원의 구조로 항원 제공 세포의 표면에 표적 항원의 제공을 포함한다. 만약 항원이 세포에서 합성되고 유형 I 및 유형 II 분자에 의해 제공된다면, 항체 생산 및 세포 매개 면역 모두를 초래할 수 있다.(Robinson,et al., Eds., 1997).

HLA 유형 I 의 유발이 시험관내에서 순수한 용해성 단백질에 의해 CTL-매개 세포성 면역을 제한했다는 것이 보고되지는 않았지만, 생체외에서 1 차적인 CTL 의 유발은 내인성 과정의 요구없이 세포표면에 유형 I MHC 분자와 결합할 수 있는 작은(8-11mer) 합성 펩티드의 사용에 의해 달성되었다. (Stauss,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89,7871-5,1992; Carbone, et al., J. Exp. Med. 167: 1767-79, 1988).

DNA 백신은 대상의 면역 시스템에 의해 일반적으로 인지되지 않는 용해성 단백질 및 내인성 단백질에 대한 생체내에서 세포성 면역을 유발하는 수단으로서 제공되어왔다. DNA 백신에 대한 일반적인 논의에 대해서는 예를 들어, Pardoll DM 및 Beckerleg AM, Immunity, 3 : 165-169,1995; Lietner WW et al., Vaccine 18 (9-10): 765-777, 1999; 및 Lewis PJ 및 Babiuk LA, Adv Virus Res 54: 129-88,1999 참조.

일반적으로, 융모막 성선자극호르몬(CG), 예를 들어, 인간 융모막 성선자극호르몬(hCG)은 인간 태반 및 배반포의 세포에서 분비되지만, 미수정 난자에 의해서는 분비되지 않는다. 그러나, 많은 인간 암은 암화동안 어떤 시점에서 hCG 를 생산하고 보유하고/또는 분비한다. α 및/또는 β 구성단위로 구성된 hCG 는 다양한 인간 암 세포 라인의 막에서 검출되었다. (Acevedoet al., 1992). hCG 및/또는 그것의 구성단위는 인간 폐 세포에 의해 만들어지고, hCG 폴리펩티드 또는 그것의 부분은 종양세포에 대한 자가분비 성장 촉진제로서 작용한다는 것이 또한 증명되었다. (예를 들어, Riveraet al., 1989 참조.) 추가적인 참고문헌은 종양-포함 동물에서 항-hCG 항체의 활동적인 생산에 연이은 hCG 백신에 의한 자극을 개시한다. (예를 들어, U. S. 특허번호 5,762,931; 및 U. S. 특허번호 4,780,312 참조.)

본 명세서에 참고 문헌으로서 풍부하게 수록된 Stevens 에 대한 몇개의 오하이오 주 특허, 예를 들어, U. S. 특허번호 4,767,842, 4,855,285 및 5,698,201, 는 숙주에 의해 hCG 에 대한 항체 생산에 기초한 항-암 전략으로서 β-hCG/ 파상풍 변성독소 변형된 펩티드의 사용을 개시한다.

그러나, 천연의, 용해성, 융모막 성선 자극 호르몬 항원과의 직접적인 예방접종은 가장 항원 제공 유형 II MHC 경로 진입을 초래하기 쉽고, CD4+ 보조 T 세포-매개 면역 반응을 초래하기 쉽고, CD8+세포독성 T 세포-매개 세포성 면역반응을 초래하지는 않는다. 대조적으로, 대상의 면역 반응 세포에 노출되었을 때, CG-암호화 DNA 백신은 세포에 의해 흡수되고, 암호화된 항원은 세포질에 번역되어야만, 백신이 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 유형 I 경로에 진입할 수 있다. 세포내에서 기원한 단백질만이 이러한 방식으로 프로세싱된다. (McDonnell, W. etal., NEngl JMed 334: 42-45,1996).

CG-발현 종양을 가진 암 환자에게서 순환 CG 및 세포-결합 CG 의 수준을 낮추거나 제거하는 안전하고 효과적인 방법에 대한 요구가 존재한다.

CG 의 추가적이고 잘 알려진 생물학적 활성은 수정률과의 결합이다.

따라서, CG 에 대한 면역 반응을 생산하는 안전하고 효과적인 방법이 또한 수정률 조절에 유용할 수 있다.

발명의 개요

본 발명은 인간 융모막 성선 자극호르몬(hCG), 또는 이의 서브유닛을 발현하는 암의 면역학적 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 더욱이 융모막 성선자극호르몬(hCG), 또는 이의 서브유닛에 대한 면역 반응 유발에 기초한 수정률 조절 방법을 제공한다.

본 발명은 면역치료법의 효과적인 방법으로, 대상의 생체내에서 내인성 단백질, hCG 의 면역원성 에피토프에 대한 다가 면역 반응을 일으키는 새로운 방법을제공함으로써 종래 기술에 내재하던 하나 이상의 단점의 해결을 다룬다.

한 측면에서, 본 발명은 hCG-암호화 핵산 구조체 (DNA 백신) 및 암의 확산성 및/또는 진행을 감소, 방지하는 수단으로서, 포유동물대상, 구체적으로는 인간 대상의 면역 반응 세포를 이러한 핵산 구조체에 노출시킴으로써, hCG 에 대한 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 의해 제공된 "면역 반응" 은 hCG 의 하나이상의 면역원성 에피토프에 대한 체액성(항체) 및/또는 세포 매개 면역 반응일 수 있으나, 더욱 중요하게는 종양 또는 다른 악성 종양의 진행, 확산성, 및/또는 성장을 방해하는 것일 수 있다.

대부분의 경우에, 환자에게 hCG-암호화 핵산 구조체(DNA 백신)를 투여하는것은 대상의 면역 시스템에 의해 체액성 및 세포 매개 면역 모두를 유발할 것으로 기대된다.

한 측면에서, 본 발명의 DNA 백신의 투여는 주요 조직적합 복합체 유형 I (MHC-I) 제한된 hCG 펩티드에 대한 항원-특이적 세포독성 T-림프구(CTL) 매개 반응을 초래하기에 효과적이다.

다른 측면에서, 본 발명의 DNA 백신은 T 세포 매개 체액성 면역 반응을 유발하기에 효과적이어서, 하나 이상의 hCG 면역원성 에피토프에 대해 방향지워진 대상에 의한 항체 생산을 초래한다.

더이상의 측면에서, 본 발명의 DNA 백신은 대상에 T 보조 1(T_h1)및 T 보조 2(T_h2)형태 T 세포 반응 모두를 유발하기에 효과적이다.

본 발명은 대상의 생체내에서 발현을 위해 필요한 조절 서열에 조절가능하게 연결된 hCG 면역원성 펩티드, 폴리펩티드 또는 이의 전구체에 대한 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터를 포함하는, 대상에 DNA 백신을 투여하는 방법을 제공한다.

더 나은 측면에서, 본 발명은 이러한 DNA 예방접종 방법에 사용하기 위한 벡터 및 예를 들어, 암의 면역학적 치료와 같은 면역학적 치료에 유용한 이러한 DNA 백신을 포함하는 구조체를 제공한다.

DNA 백신에 의해 암호화된 바람직한 hCG 항원은 면역원성 에피토프 또는 hCG 특이적인 즉, 황체형성 호르몬(LH) 또는 여포 자극 호르몬 (FSH) 과 같은 다른 관련 화합물과 상호 반응하지 않는, hCG 의 면역원성 에피토프의 전구체이다.

DNA 백신은 1 가 또는 다가일 수 있고, 따라서, 하나 이상의 hCG 면역원성 에피토프를 암호화할 수 있다. 다가일때, DNA 백신은 바람직하게는 적어도 2 개의 hCG 면역원성 에피토프를 암호화하고, 하나 또는 그 이상의 DNA 백신은 대상에서 하나 이상의 hCG 면역원성 에피토프로 프로세싱될 수 있는 hCG 면역원성 펩티드의 전구체일 수 있다.

한 측면에서, 본 발명의 DNA 백신은 융합 폴리펩티드 또는 사이토킨을 암호화하는 제 2 의 서열과 해독틀내에서 정렬될 수 있는 hCG 면역원성 펩티드 또는 이의 전구체를 암호화하는 제 1 의 서열을 가지는 단백질 또는 면역 시스템 자극제를암호화하여, DNA 백신의 투여는 같은 숙주세포에서 hCG 면역원성 펩티드와 함께 사이토킨 또는 면역 시스템 자극제의 공-발현을 초래한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 hCG 의 β 서브유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 라이브러리의 단편을 포함하는 발현벡터를 대상에 투여하는 것에 의해 많은 hCG 면역원성 에피토프에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다. hCG β 서브유닛 발현 라이브러리를 포함하는 DNA 백신의 투여는 이러한 투여에 따른 hCG 펩티드에 대한 대상의 면역 반응을 평가하는 것에 의해 면역원성 에피토프의 확인을 허락한다.

더 나은 측면에서, 본 발명은 포유동물의 수정률의 조절에서 CG-암호화 DNA 백신의 사용을 제공한다. 방법은 대상의 면역 반응 세포를 CG-암호화 핵산 구조체에 노출시키는 것을 포함하고, 이것은 수정률과 결합된 CG 의 생물학적 활성을 중화시키는 대상에 의한 면역 반응을 초래한다.

본 발명의 이러한 목적 및 특성은 하기의 발명의 상세한 설명을 수록된 도면과 결합하여 읽을때, 더욱 완전하게 이해될 것이다.

본 발명은 융모막 성선자극호르몬(CG) 단독의 생산과 결합된 조건 또는 다른 종양 결합 항원과 조합하여 생체내 면역치료법을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 방법은 대상의 면역 반응 세포를 CG-암호화 핵산 구조체 또는 DNA 백신 단독, 또는 핵산 구조체 또는 항원과 결합된 다른 종양을 암호화하는 DNA 백신과 결합하여 노출시킴으로서 수행된다.

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도 1A 는 GenBank 기탁 번호 180437 에 제공된 대로, SEQ ID NO:14 로 명명된, 인간 융모막 성선자극호르몬(hCG) 의 β 서브유닛의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 1B 는 SEQ ID NO:1 으로 명명된, hCG 의 β 서브유닛의 잔기 109-145 (C-말단 펩티드, CTP)를 나타낸다.

도 1C 는 SEQ ID N0: 2 로 명명된, 첨가된 N-말단 메티오닌을 가진 CTP(SEQ ID NO:1) 를 나타낸다.

도 1D 는 SEQ ID NO:3 으로 명명된, hCG β 서브유닛의 아미노산 서열의 잔기 111-118 (에피토프 # 1 ) 을 나타낸다.

도 1E 는 SEQ ID NO:4 로 명명된, hCG β 서브유닛의 아미노산 서열의 잔기 133-144 (에피토프 # 2 ) 을 나타낸다.

도 1F 는 SEQ ID NO:9 로 명명된, 결합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 1G 는 SEQ ID NO:5 로 명명된, 개개 링커 링커 서열(SEQ ID NO:9) 을 가진 hCG 의 β서브유닛의 CTP 의 에피토르 #1 및 # 2 를 포함하는 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 1H 는 SEQ ID NO:6 로 명명된, 이황화 결합 결합 잔기 38 및 57 ("루프" 펩티드) 을 가진 hCG 의 β서브유닛의 아미노산 잔기 38-57 을 나타낸다.

도 1I 는 SEQ IDN NO:11 로 명명된, CTP 38-mer(SEQ ID NO:2) , 및 개재 링커 서열 (SEQ ID NO:9) 을 가진 Her-2 단백질 (SEQ ID NO:19) 의 아미노산 잔기 115-136 을 포함하는 융합 단백질의 서열을 나타낸다.

도 1J 는 SEQ ID NO:12 로 명명된 CTP 38-mer(SEQ ID NO:2) , 및 개재 결합 서열 (SEQ ID NO:9) 을 가진 Her-2 단백질 (SEQ ID NO:20) 의 아미노산 잔기 134-151 을 포함하는 융합 단백질의 서열을 나타낸다.

도 1K 는 SEQ ID NO:13 으로 명명된, CTP 38-mer(SEQ ID NO:2) , 개재 결합 서열 (SEQ ID NO:9) 을 가진 Her-2 단백질 (SEQ ID NO:21) 의 아미노산 잔기 115-136 을 포함하는 융합 단백질의 서열을 나타낸다.

도 1L 은 SEQ ID NO:19 로 명명된, Her-2 단백질의 아미노산 서열 잔기 115-136 을 나타낸다.

도 1M 은 SEQ ID NO:20 로 명명된, Her-2 단백질의 아미노산 서열 잔기 134-151 을 나타낸다.

도 1N 은 SEQ ID NO:21 로 명명된, Her-2 단백질의 아미노산 서열 잔기 376-395 을 나타낸다.

도 2A 는 SEQ IDN NO:15 로 명명된, GenBank 기탁번호 J00117, M38559 및 M54963 로 규정된 대로, 인간 융모막 성선 자극호르몬의 β 서브유닛을 암호화하는 핵산 서열을 나타낸다. 도에서, hCG 의 β 서브유닛의 에피토프 #1 에 대한 암호화 서열(SEQ ID NO: 22) 은 굵은 글씨로 표시하고, 에피토프 # 2 에 대한 암호화 서열(SEQ ID NO: 23)은 이탤릭체로 표시한다.

도 2B 는 SEQ ID NO:7 로 명명된, hCG 의 β 서브유닛의 CTP 38-mer (SEQ ID NO:2)를 암호화 하는 핵산 서열을 나타낸다. 상부 경우 문자는 벡터로부터 핵산을 나타내고, 하기 경우 문자는 DNA 합성에 의해 생산된 핵산 서열의 삽입체를 나타낸다. 단일 문자 아미노산 서열은 하기에 핵산 서열로 제공된다.

도 2C 는 SEQ ID NO:8 로 명명된, hCG 의 β 서브유닛의 잔기 38-57 (SEQ ID NO:6) 을 암호화하는 핵산 서열을 나타낸다.

도 2D 는 SEQ ID NO:10 으로 명명된, 링커 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 나타낸다.

도 2E 는 SEQ ID NO:16 으로 명명된, Her-2 단백질의 잔기 115-136 으로 구성된 융합 단백질(SEQ ID NO:11) 을 암호화하는 핵산 서열을 나타낸다.

도 2F 는 SEQ ID NO:17 로 명명된, Her-2 단백질의 잔기 134-151 를 포함하는 융합 단백질(SEQ ID NO:12 을 암호화하는 핵산 서열을 나타낸다.

도 2G 는 SEQ ID NO:18 로 명명된, Her-2 단백질의 잔기 376-395 를 포함하는 융합 단백질(SEQ ID NO:13)을 암호화하는 핵산 서열을 나타낸다.

도 3 은 플라스미드 ipCl-neo 의 도해를 나타낸다.

I. 정의

본 명세서에 사용될 때, 용어 "핵산 구조체"는 용어 "DNA 백신"과 상호 교환적으로 사용되고, (1) 완전한 길이 hCG 핵산 서열, (2) hCG β 아미노산 서열, 또는 (3) 적어도 8 개의 아미노산을 가지는 펩티드 항원을 포함하는 hCG 의 하나 이상의 면역원성 에피토프를 암호화하는 DNA 또는 RNA 를 포함한다. DNA 백신-암호화 아미노산 서열 (1) 및 (2) 는 길이, 약 8 내지 40 아미노산으로부터 면역원성 hCG 펩티드로 프로세싱될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

용어 "hCG 펩티드" 및 "hCG 에피토프"는 전체 hCG 단백질의 모든 아미노산 서열의 모두는 아니지만, 부분적으로 같은 아미노산 서열을 말하고, 예를 들어, 전체 hCG 단백질의 면역학적 활성을 보유하는 단편과 같은, 전체 hCG 단백질의 적어도 하나의 생물학적 기능 또는 활성을 보유한다.

본 명세서에 사용될 때, 용어 "hCG 면역원성 폴리펩티드" 또는 "hCG 면역원성 β 서브유닛 폴리펩티드" 또는 이의 단편은 면역적격대상의 면역 반응 세포에 노출될때, 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 유발할 수 있는, 각각 hCG 또는 hCG β 서브유닛으로부터 유도된 아미노산 서열을 말한다. 이러한 면역 반응은 유형 I 및/또는 유형 II 주조직적합성 항원 (MHC) 과 결합된 항원 프로세싱을 요구할 수 있다.

본 명세서에 사용될 때, 용어 "항원 전구체" 또는 hCG 면역원성 에피토프에 관한 "전구체" 는 대상 세포에 의해 hCG 면역원성 펩티드로 프로세싱될 수 있는 hCG 펩티드를 말한다.

본 명세서에 사용될 때, "hCG C-말단 펩티드" 또는 "hCG CTP" 는 hCG β 서브유닛의 C-말단 37 아미노산을 말한다. ("CTP 37-mer"). 어떤 경우에, hCG CTP 는 N-말단에 첨가된 메티오닌을 가진다. ("CTP 38-mer"로 명명).

hCG 에 대하여 본 명세서에 사용될 때, 용어 "루프 펩티드" 는 아미노산 38 및 57 이 이황화 결합에 의해 연결되는, hCG 의 β 서브유닛의 아미노산 38 내지 57 을 의미한다. "루프 펩티드"는 천연 서열 또는 이의 변이체로서 제공될 수 있다.

본 명세서에 사용될 때, 면역원성 hCG 에피토프에 관한 용어 "비-천연" 은 자연에서 발견될 때, 같은 hCG 면역원성 에피토프의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산이 다른 에피토프의 아미노산 서열을 의미한다. "비-천연" 아미노산 서열은 하나 이상의 " 보존적인" 또는 " 비-보존적인" 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 변이체 아미노산 서열을 가지는 hCG 면역원성 에피토프를 포함할 수있다.

본 명세서에 사용될 때, 면역원성 hCG 에피토프에 대한 암호화 서열에 관한 용어 " 비-천연" 은 자연에서 발견될 때, 같은 hCG 면역원성 에피토프에 대한 암호화 서열과 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 에피토프를 암호화하는 핵산을 의미한다. "비-천연" 핵산 서열은 일반적으로 하나 이상의 " 보존적인" 또는 "비-보전적인" 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하는 변이체 아미노산 서열을 가지는 hCG 면역원성 에피토프를 암호화한다. 더욱이, "비-천연" 핵산 서열은 천연 hCG 에피토프와 같은 아미노산 서열을 가지는 hCG 면역원성 에피토프를 암호화할 수 있으나, 유전자 코드의 축합성 때문에, 기준 폴리펩티드 서열로부터 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형된 아미노산 서열을 가진다.

본 명세서에 사용될 때, 용어 "유형 II 주조직적합성 복합체" " 유형 II MHC" 및 " 및 유형 II " 는 다양한 세포 형태에서 발현된 분자 및 T 세포에 의해 단백질 항원의 인지에서 중요한 역할을 하는 분자를 말한다. 유형 II MHC 분자는 전형적으로 약 7 내지 30 또는 그 이상의 아미노산의 펩티드에 결합하고, 항원-특이적 CD4+ T 세포에 의해 인지된 복합체를 형성한다. 이러한 펩티드/CD4+ T 세포 복합체는 면역적격 대상에서 펩티드 항원에 대한 항체 생산을 촉진시킨다.

본 명세서에 사용될 때, 용어 "면역 반응" 은 세포독성 T 세포 반응과 같은 세포성 면역 반응 및/또는 면역원성 에피토프에 대한 항체의 생산과 같은 체액성 면역 반응을 말한다.

본 명세서에 사용될 때, 용어 " 면역적격 대상" 은 면역원성 에피토프에 노출될때, 면역원성 에피토프에 대해 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 개시할 수 있는 면역 반응 세포를 가지는 대상을 말한다. 본 발명은 인간 및 다른 포유동물 대상에 유용한다.

본 명세서에 사용될 때, 용어 면역원성" 에피토프" 또는 "항원성 결정인자" 는 hCG 에 대한 T-및/또는 B-세포 매개 면역 반응을 일으킬 수 있는 hCG 아미노산 서열의 부분을 말한다. 에피토프는 특이적인 것; 즉, 특이적 hCG 에피토프에 대해 발생된 면역 반응은 다른 항원과 교차반응성을 거의 또는 전혀 보이지 않는 것이 바람직하다.

본 명세서에 사용될 때, 용어, "능동 면역화" 는 대상의 면역 반응 세포에 의해 면역 반응을 유발하는 백신의 투여를 의미한다. "능동 면역화" 는 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 대상의 면역 반응 세포를 노출시킴으로써 달성될 수 있다.

본 명세서에 사용될 때, 용어 "노출" 은 대상의 면역 반응 세포를 핵산 구조체와 접촉시키는 것을 의미한다. 이러한 "노출" 은 예를 들어, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 또는 전기천공법에 의해 숙주 세포에 구조체를 도입하여 시험관내에서 발생하거나, (Davis, L., Dibner, M., 및 Battey, I. BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986), 또는 예를 들어, 근육 또는 다른 조직에의 주입에 의해 숙주에 " 노출된" 핵산 구조체를 도입하여 생체내에서 발생할 수 있다. (Wolfet al., 1990).

본 명세서에 사용될 때, 용어 "수동 면역화" 는 면역 접근법으로 대상에 항체를 직접적으로 투여하는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용될 때, 용어 "면역 반응 세포" 는 대상 항원의 프로세싱을 할 수 있고, 유형 I 또는 유형 II MHC 와 결합하여 항원을 제공할 수 있는 대상세포를 말한다.

여기에 사용될 때, 용어 "폴리뉴클레오티드" 는 전형적인 폴리뉴클레오티드에 수소 결합을 할 수 있는 염기를 지지하는 골격을 가진 중합체 분자를 말하고, 이 경우에 중합체 골격은 중합체 분자 및 전형적인 폴리펩티드 사이에 염기 특이적 형태로 이러한 수소 결합을 허용하는 방식으로 포스포디에스테르 결합에 의해 결합된 염기를 제공한다. (예를 들어, 단일-가닥 DNA). "폴리뉴클레오티드"는 예를 들어, 포스포디아미데이트 모르폴린 (PM0) 화학을 포함하는 중합체와 같은 변형된 중합체를 포함한다.

본 명세서에 사용될 때, 용어 "재조합 핵산" 은 일반적으로는 엔도뉴클레아제에 의한 핵산의 조작으로, 자연에서 일반적으로 발견되지 않는 형태로 시험관내에서 독창적으로 형성된 핵산 서열을 말한다.

"비상동" 핵산 암호화 서열은 형질전환된 세포에 비천연적인 구조 암호화 서열이거나, 이의 단백질 산물의 개선된 성질을 위해 설계된 암호화 서열이다. 이러한 "비상동" 암호화 서열은 일반적으로, hCG 면역원성 에피토프를 암호화하는 핵산 서열에 인접한 예를 들어, CMV 즉시 초기 프로모터/인핸서와 같은 사용된 프로모터와 인접하거나, 결합하여 발견되지는 않는다.

핵산 서브유닛은 본 명세서에서 그들의 표준 염기 명명에 의해; T, 티민; A, 아데노신; C, 시토신; G, 구아닌, U, 우라실로 언급되고; 다양한 위치가 표준IUPAC 축약에 의해 언급된다: W, A 또는 T/U; R, A 또는 G; S, C 또는 G; K: G 또는 T/U (37 CFR.1.822).

핵산은 이중 가닥, 단일 가닥일 수 있고, 또는 이중 가닥 또는 단일 가닥 서열 모두의 부분을 포함할 수 있다. 단일 가닥의 묘사는 또한 다른 가닥의 서열을 한정하고 따라서, 서열의 보체를 포함한다.

여기에 사용될 때, 용어 "발현 벡터" 는 적당한 대상에서 핵산의 발현에 영향을 줄수 있는 적당한 조절 서열에 조절가능하게 연결된 상기 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체를 말한다. 이러한 조절 서열은 전사에 영향을 줄수 있는 프로모터, 이러한 전사를 조절할 수 있는 선택적인 작동유전자 서열, 적당한 mRNA 리보솜 결합 위치를 암호화하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적인 게놈 삽입일 수 있다. 일단 적당한 대상에 형질전환되면, 벡터는 대상의 게놈에 독립적으로 복제 및 기능할 수 있거나, 어떤 경우에는 게놈 그 자체에 삽입될 수 있다. 본 명세서에서, 현재에는 DNA 플라스미드 벡터가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이므로, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 예를 들어, 동등한 기능을 제공하고, 예를 들어, mRNA 전사체와 같은 당업계에서 알려진 이러한 다른 형태의 발현 벡터를 포함한다.

본 명세서에서 사용될 때, 용어 "조절가능하게 연결된" 은 두개의 핵산 또는 폴리펩티드 부위 사이의 상호관계를 개시할 때, 기능적으로 서로 관련된 것만을 의미한다. 예를 들어, 예비-서열이 신호 서열로서 기능한다면, 아마도, 신호 서열의절단을 포함하는 단백질의 완성형 형태의 분비에 참여하도록, 펩티드에 조절가능하게 연결된다. 프로모터는 그것이 서열의 전사를 조절한다면, 암호화 서열에 조절가능하게 연결되고, 리보솜 결합 위치가 번역을 허용하도록 위치한다면, 암호화서열에 조절가능하게 연결된다.

본 명세서에 사용될 때, 용어 "프로모터 서열" 은 전사를 지시하기에 충분한 최소한의 서열을 말한다. 본 발명에 또한 포함되는 것은 프로모터 서열과 인접할 수 있거나, 인접하지 않을 수 있는 인핸서 서열이다. 인핸서 서열은 프로모터-의존적인 유전자 발현에 영향을 주고, 천연 유전자의 5' 또는 3' 부위에 위치할 수 있다. 선택적으로, 발현은 세포-형태 특이적, 조직-특이적, 또는 종-특이적이다.

"조절 가능한 프로모터" 는 그것의 활성이 시스 또는 트랜스 작용인자에 의해 영향을 받는 어느 프로모터이다.

"구성적 프로모터" 는 포유동물 세포에서 클론 DNA 삽입체의 구성적 발현을 촉진하는 예를 들어, 인간 CMV 즉시 초기 인핸서/프로모터 부위와 같은, 대부분의 시기에 식물 형질전환체의 많은 또는 모든 조직에서 RNA 생산을 지시하는 어느 프로모터이다.

본 명세서에 사용될 때, 용어, "상동성" 또는 "상동물" 은 두 서열사이의 동일성의 수준, 즉 70 % 상동성은 하기에 개시된 알고리듬에 의해 결정될 때, 70 % 서열 동일성을 의미하고, 따라서, 주어진 서열의 상동물은 서열의 주어진 길이에 걸쳐, 적어도 약 70 % 또는 80 %, 바람직하게는 약 80 %, 85 %, 90 % 또는 95 % 서열 동일성을 가진다.

"핵산 서열 동일성" 은 본질적으로 하기에 따라 결정된다. 같은 길이의 두개의 폴리뉴클레오티드 서열은 서로 동일한 것은 여겨진다. 만약 서열이 LALIGN 프로그램을 사용하여 정렬될 때, 60% 이상, 바람직하게는 약 70 %, 바람직하게는 약 80 %, 더욱 바람직하게는 약 85%, 가장 바람직하게는 약 90 % 서열이 생략 매개변수 및 생략 PAM 매트릭스를 사용하여 정렬될 때 동일하게 결정된다. LALIGN 프로그램은 FASTA 버전 1.7 한벌의 서열 비교 프로그램에서 발견된다. (Pearson 및 Lipman, 1988; Pearson, 1990; VA, 칼로테스빌,조르단 홀, 박스 440, 생물화학부, William R. Pearson 으로부터 이용가능한 프로그램). 대안적으로, 생략 매개변수 및 생략 BLOSUM 62 매트릭스를 사용하여 GenBank 데이타베이스 서열 전체와 서열 동일성의 평가를 허용하는 인터넷상에서 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 에서 찾은 BLASTN 비교 프로그램의 BLAST2 버전이 사용될 수 있다.

아미노산 잔기는 그의 표준 단일 문자 표시법에 의해 A, 알라닌; C, 시스테인; D, 아스파르트산; E, 글루타민산; F, 페닐알라닌; G, 글리신; H, 히스티딘, I, 이소루신; K, 리신; L, 루신; M, 메티오닌; N, 아스파라긴; P, 프로린; Q, 글루타민; R, 아르기닌; S, 세린; T, 트레오닌; V, 발린; W, 트립토판; Y, 티로신으로 본 명세서에 언급된다.

본 명세서에서 확인된 아미노산 서열에 관한 "아미노산 잔기 동일성" 은 필요하다면, 최대 퍼센트 서열 동일성을 획득하기 위해 서열 및 도입 갭을 정렬하고, 서열 동일성의 부분으로서 어느 보존적인 치환은 고려하지 않은 후에, 예비서열에서, 천연 서열의 아미노산과 동일한 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 이러한아미노산 동일성은 오류 매개변수 없이, 상기에 기술된 대로, 인터넷상의 http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 에서 발견된, ALIGN 프로그램 또는BLASTP비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.

"기능적 등가" 는 hCG 펩티드 또는 등가의 제약학적 활성을 가지는 펩티드 를 암호화하는 핵산 서열을 의미한다. 화합물의 활성 부분을 구성하는 부분 또는 잔기는 "약물특이분자단" 으로 알려진다. 등가의 약물특이분자단은 동일한 제약학적 활성을 가질 것이다.

2 개의 핵산 단편은 (i) 예를 들어, Maniatis, et al. (1982), 320-328p, 및 382-389 에 개시된 대로, 온화한 또는 엄격한 혼성화 및 세척 조건; (ii) 기껏해야 약 25-30 % 염기쌍의 미스매치를 허용하는 감소된 엄격한 세척조건하에서, 예를 들어: 2X SSC (pH 7.0 에서, 나트륨 3.0 M NaCI 및 0.3 M 소듐 시트레이트를 포함한다), 0.1 % 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 용액, 실내 온도에서 2 회, 각 30 분; 그 다음 2X SSC, 0.1 % SDS, 37 ℃, 한번, 30 분; 그 다음 2X SSC, 실내온도에서 2 회, 각 10분; 또는 (iii) 원하는 표적 서열 또는 그것의 변이체의 특이적 증폭을 초래하는 표준 PCR 프라이밍 및 증폭 조건 (예를 들어, Saiki, et al., 1988 에 개시된대로임)하에서, 그들이 특이적으로 폴리뉴클레오티드 또는 이의 변이체에 혼성화할 수 있거나 특이적으로 폴리머아제 사슬 증폭 반응을 프라이밍을 할 수 있다면, 기준 폴리뉴클레오티드에 "선택적으로 혼성화가능한" 것으로 여겨진다.

본 명세서에 사용될 때, DNA 백신에 관한 용어 "예방접종" 은 hCG 의 하나 이상의 면역원성 에피토프에 대해 면역 반응을 유발할 목적으로, 대상에 하나 이상의 hCG 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 구조체를 투여하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용될 때, 용어 "암" 은 성장 조절의 손실을 나타내고, 세포의 비정상적으로 큰 클론을 형성하는 세포를 말한다. 암세포는 일반적으로 접촉저해를 상실하고 침입성일 수 있고/또는 전이능력을 가진다.

본 명세서에서 사용될 때, "암 치료" 는 암의 본래의 코스를 변형할 의도로 사용된 어느 조정을 의미한다. 치료는 암세포 또는 충실성 종양의 성장을 늦추거나 제거하려는 의도로, 암을 가진 것으로 진단된 대상에 대한 세포성 조성물, 화학치료제의 투여 및/또는 다른 치료를 제한없이 포함한다.

본 명세서에 사용될 때, 용어 "수정률 조절" 은 포유동물의 임신 방지를 말한다.

II.암, 수정률 및 hCG

악성 종양은 대상에 의해 외래인자로서 인지되는 단백질 항원을 발현할 수 있고, 면역 감시체계는 어떤 형태의 종양의 성장 및 확산성을 제한할 수 있지만, 면역 시스템은 치명적인 인간 암으로부터 대상을 효과적으로 보호하지 못한다. 이러한 암은 빠른 성장 및 확산성때문에 면역 시스템을 극복할 수 있고/또는 종양 세포는 면역 파괴를 피할 수 있다. 메카니즘은 본 발명의 부분은 아니지만, 이러한 회피에 대한 제안된 메카니즘은 (1) 세포독성 T 림프구(CTL)에 의한 인지을 위한 요구로서 유형 I MHC 와 프로세싱된 종양 펩티드 항원의 복합화를 거의 또는 전혀 초래하지 않는 종양 세포 표면상의 유형 I MHC 의 하류-조절 (2) 종양-특이적 CD4+ 보조 T 세포(CTL 활성에 필요한 것으로 추정되는 신호 생산)를 직접적으로 활성화시킬 수 없도록, 종양 세포에 의한 유형 II MHC 분자의 발현이 거의 또는 전혀 없어서, CTL 의 활성화 부족 (3) CD4+ 보조 T 세포의 활성화에 필요한 2 차 신호를 제공하는 공-자극 세포 마커의 부재, 및 (4) 패스-리간드와 같은 항-종양 반응을 억제하는 종양 세포에 의해 생산된 인자를 포함한다.[Abbas, AK et al., Eds., CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 3 edition, WB Saunders Co., 394-405 (1997)]

발명자들은 어떤 폴리펩티드가 인간 및 다른 포유동물 모두에서 종양세포에 대한 지지 인자이고/또는 이에서 분비된다는 것을 또한 결정했다. 이러한 지지 인자는 호르몬, 구체적으로는 융모막 성선자극호르몬(CG)에 생화학적, 생물학적 및 면역학적 유사성을 가진다. 어떤 암종은 그들의 표면상에 CG 또는 면역학적으로 유사한 물질을 유출함으로써, 대상에 내인성 물질로 형성된 것으로 나타나고, 따라서 상대적으로 비-면역원성인 표면을 대상의 면역시스템에 제공한다.

악성 암의 효과적인 치료는 종양 세포의 더이상의 확산성을 방지해야만하고, 질병으로부터 사망율을 감소시켜야만한다. 현재의 치료방법은 면역 시스템의 비-특이적 자극, 수동 면역치료법, 및 예를 들어, 죽은 종양 세포 또는 종양 세포 항원, 폴리펩티드 또는 이의 단편으로 예방접종된 능동 면역화를 포함한다.

능동 면역화 연구는 β-hCG/파상풍 변성독소 변형된 폴리펩티드가 CG-유사 물질과 결합된 악성 래트 유방 선암종 R 3230 AC 의 종양 세포의 주입으로부터 래트 보호를 제공하는 것을 나타내었다. 수동 면역화는 또한 마우스에서 루이스 폐 암종 종양, 바이러스-유발된 루케미아 및 사르코마 종양에 대한 보호를 초래했다.(예를 들어, U. S. 특허번호 5,698,201. 참조)

융모막 성선자극호르몬(CG)은 임신시에, 프로게스테론을 생산하는 황체를 유지시키는 "임신 호르몬" 이다. CG 에 대한 항체는 내인성 CG 의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다는 것을 보여주었다.

파상풍 변성독소와 화학적으로 결합된 인간 β hCG 를 포함하는 백신을 사용한 임상 시험은 인간 β hCG 에 대한 항체의 생산 및 임신의 방지를 초래했다. 예를 들어, Talwar GP et al.,Am J Reprod Immunol37 (2): 153-60,1997; Schutze MPet al., Am J Reprod Immunol Microbiol14 (3): 84-90,1987 참조.

CG DNA 백신은 인간 및 동물 모두에서 수정률 조절에 유용성이 발견된다. 이러한 수정률 조절은 재생산을 순간적으로 방해하는 수단으로서 사용될 수 있거나, 장기간 또는 연속적인 수정률 조절에 사용될 수 있다.

III.DNA 백신을 가진 면역학적치료법

종래의 백신의 몇가지 단점이 DNA 백신의 투여에 의한 소위, "유전적 면역화" 를 사용하여 극복될 수 있다(Tanget al.,1992). 이 기법은 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 간단한 핵산 구조체를 숙주의 세포에 접종시키는 단계를 포함한다. (Fynan, et al., 1993; Ulmer, et al, 1993).

DNA 백신의 생산은 간단하고 핵산 구조체는 단백질성 백신보다 더욱 안정성을 보였다. 특정 서열을 포함하는 DNA 백신에 의한 유전적 면역화는 몇가지 모델 시스템에서 가능성을 보였다. 전형적인 이용분야는 Schreurs et al., 1998, 인간 멜라닌세포 분화 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역; Davis, et al, 1993, B 형간염 표면 항원; Conry, et al, 1994, 암배항원; Xiang, et al, 1994, 래비스 바이러스 당단백질; Cox, et al, 1993,소 허피스바이러스; Ulmer et al., 1993, influenza A; 및 Johnston, SA, et al., U. S. 특허번호 5,703,057, 마이코플라스마를 포함한다.

따라서, DNA 또는 RNA 를 포함하는 핵산 구조체의 사용은 숙주가 항원과 직접적으로 제공될 때 부딪치는 몇개의 문제를 (1) 장시간 지속하는 세포성 및 체액성 면역을 초래하는 지속된 생체내 항원 발현; (2) 항원 제공 세포의 포함; 및 (3) 암호화된 항원(들)로부터 유도된 다가 에피토프에 대해 면역 반응을 일으키는 능력을 촉진하여, 극복하기 위한 가능성을 가진다.(Schreurs et al., 1998; Felgner, 1998) 게다가, DNA 백신은 천연 단백질보다 더욱 안정하고 조작이 용이하다.(Felgner, 1998). 인풀루엔자 DNA 백신으로 예방접종후 1 년이 경과한 마우스는 상동의 인풀루엔자의 치사량에 대해 완벽하게 보호됨을 개시하는 McDonnel l, W. Michael et al., N Engl J Med 334: 42-45 (1996) 참조.

최근에, 이 기법은 암 백신의 생산을 위한 암에 적용되었고, 관련 연구는 결장암 및 흑색종에 대한 항-종양 면역의 생산에 대한 적어도 3 개의 임상 프로토콜을 초래했다. (Roth, J.et al.,J Natl Cancer Inst89: 21-39,1997; Sobol R, 및 Scanlon KJ. Clinical protocols list. Cancer Gene Ther., 2: 225-34,1995). 그러나, 이 송달 방법은 DNA 를 획득할 수 있는 주입 위치 근처의 세포에 제한되고, 조직 표적화가 결핍된다. 입자 충격에 의한 DNA의 송달은 간 및 종양에서 유전자 발현을 나타낼 수 있으나, 또한 표적화의 결핍을 겪고, 조직에 접근을 허용하는 외과적 과정을 요구한다. (Nicolet CM, et al. Cancer Gene Ther 2 : 161-70,1995).

본 발명은 대상의 면역 반응 세포를 노출시키기 위한 CG-암호화 핵산 구조체를 제공함으로써, CG 에 대한 면역 반응이 다양한 항원성 CG 에피토프에 대해 개시된다. 따라서, DNA 백신의 노출은 종양 또는 악성종양의 생존 및/또느 성장을 촉진하는, CG 폴리펩티드 또는 이의 단편의 역할을 중화시키기게 효과적일 수 있다. 예를 들어, 인간 암 환자에서의 종양은 DNA 백신으로 면역화에 의해 치료될 수 있어서 숙주는 악성종양의 생존 및/또는 성장을 촉진하는 인간 CG 또는 다른 유사한 요인에 특이적인 면역 반응을 개발시킨다.

대부분의 경우에, 유형 I 분자는 세포에서 합성된 외래 단백질을 제공한다. 유형 II 에 의한 제공의 경우에, 외래 단백질은 세포에서 합성될 수 있거나 외부로부터 세포에 의해 흡수될 수 있다. (즉, 자유 단백질 또는 펩티드로 제공됨) 항원이 세포에서 합성되고 유형 I 및 유형 II 분자 모두에 의해 제공된다면, B 세포 및 세포독성 T 세포를 생산하는 양 항체가 생산된다. 그러나, 항원이 세포 외부에서 기원하고, 단지 유형 II 에 의해 발현되면, 특정 면역 반응은 T 보조 세포 및 항체 생산에 대부분 제한된다. (THE SCIENTIFIC FUTURE OF DNA FOR IMMUNIZATION, American Academy of Microbiology, Robinson, et al., Eds. 1-29,1997).

CG-암호화 핵산 구조체에 대한 면역 반응 세포의 노출에 이어서, 암호화된 항원은 세포내에서 생산되고, 부착된 표적화 서열에 의존한 암호화된 항원은 주조직적합성 복합체(MHC) 유형 I 또는 II 제공으로 방향지워질 수 있어서, 특정 항체 및/또는 CTL-매개 반응의 자극을 초래한다. 예를 들어, Tang et al., 1992; Cox etal., 1993; Fynan et al., 1993; Ulmer et al., 1993; Wang et al., 1993 and Whitton et al., 1993 참조.

IV.hCG 펩트드 및 폴리펩티드에 대한 면역 반응

실험적인 시스템에서, 사이토톡신 T 림프구(CTL) 에 특이적인 종양 항원은 종양의 제거에 가장 강력한 면역학적 메카니즘이다. CTL 은 백신과 함께 생체내에서 유발되거나 또는 시험관내에서 생산될 수 있고, 그 때, 유기물을 포함하는 종양에 재-주입된다. CTL 의 생체내 유발은 전형적으로 생존 바이러스 또는 세포와의 면역화에 의해 달성된다. (Tanaka, et al., J. Immunol., 147,3646-52,1991; Wang, et al., J. Immunol., 4685-4692,1995; Torre-Amione, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 87: 1486-90,1990.)

SV-40 라지 T 항원 및 B 형 감염 표면 항원과 같은 약간의 특별한 바이러스 단백질을 제외하고는, 분리된 또는 용해성 단백질 항원의 주입은 CTL 의 유발을 초래하지 않는다. (Schirmbeck et al., Eur. J. Immunol., 23: 1528-34,1993).

세포성 면역 반응은 펩티드 항원 또는 hCG 또는 그자체로부터 유도된 펩티드와 같은 천연 단백질에 의한 하기의 능동 면역화를 일반적으로 일으키지 않는다.

DNA 백신의 투여는 면역 시스템의 중요한 양 반응을 유발할 것으로 기대된다. 특정 벡터의 선택은 바람직한 하나 또는 양 형태의 면역 반응을 야기할 수 있다. hCG-암호화 핵산 서열의 발현이 온화하다면, 그 때, 번역된 펩티드의 분배가 MHC 1 의 경우에 항원 제공을 초래하면서 세포내로 제한될 것이다. hCG-암호화 핵산 서열의 발현이 견고하다면, 그 때, 번역화된 펩티드는 세포의 범위를 넘어서 분배될 것으로 기대되고, 뿐만 아니라 MHC 11-매개 반응을 초래하는 혈액내에 나타나다.

본 발명의 DNA 백신은 유형 I 및 유형 II MHC 항원과 결합하여 프로세싱된 항원을 발현하고, 따라서 대상에 의한 세포성 면역 반응을 자극하기에 효과적인 ,대상의 면역 반응 세포에 하기의 노출을 하는 잇점을 제공한다. (예를 들어, 천연 CTL 과 접촉할 때, 제 1 의 면역 반응).

게다가, DNA 백신은 T 보조 1 (T_h1) 및 T 보조 2 (T_h2) 편향된 반응 세포를 프라임할 수 있는 능력을 제공한다. T_h1편향된 반응은 면역글로블린 G(IgG) 의 보체-결합 아강의 증가를 지지하고, 식세포를 활성화시킨다. 대조적으로, T_h2편향된 반응은 면역글로블린 E(IgE) , IgG 의 비-보체-결합 아강의 증가를 지지하고, 비만세포와 같은 비-식세포를 활성화시킨다

DNA 백신의 근육내 식염수 주입은 T_h1편향된 반응을 유발하는 데 성공했고, 주입된 DNA 는 비장에 혈류로 이동하는 것으로 관찰되었다. 외피에 DNA 백신의 유전자 건 송달은 배액관 결절에 림프로 이동하는 트랜스펙션된 외피 랑게르한스 세포의 덕택으로 Th₂편향된 반응을 유발하는데 성공했다. (Robinson, HL and Torres, CA, 1997).

본 발명은 대상의 면역반응세포를 적어도 하나의 hCG 면역원성 에피토프 또는 이의 전구체를 암호화하는 핵산 구조체에 노출시켜서, 대상에서 hCG 에 대한 면역 반응을 일으키는 hCG DNA 백신 조성물 및 방법을 제공하며, 여기에서 핵산 구조체는 이러한 면역 반응 세포에 의해 흡수되고 프로세싱된다.

어떤 경우에, 방법은 더욱이, 하나 이상의 발현된 hCG 면역원성 에피토프에 대한 대상의 면역 반응을 검출하는 단계를 포함한다.

대상의 세포는 제 1 의 그리고 연이은 노출에서 단일 벡터 또는 암호화 서열을 사용하여(상동성 증가) 본 발명의 hCG 핵산 구조체에 노출될 수 있고, 게다가 다른 경우에 2 개의 다른 벡터 또는 암호화 서열이 사용될 수 있다. (즉, 비상동 증가).

체액성 면역 반응의 경우에, 본 발명의 방법은 hCG 에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 제공한다. 본 명세서에서 "특이적 결합" 은 항체가 적어도 10⁶-10⁸M, 바람직하게는 10⁷-10¹⁰M 의 범위로 결합 일정성을 가지고 hCG 와 결합하는 것을 의미한다.

세포성 면역 반응의 경우에, 본 발명의 방법은 유형 I MHC 와 함께 면역원성 hCG 에피토프의 발현을 제공하여, T 세포-매개 면역 반응이 일어날 수 있도록 한다.

IV.hCG DNA 백신의 제조

다양한 hCG 폴리펩티드 사슬이 재조합 DNA 기법을 통해, 세균, 효모 및 배양 포유동물 세포와 같은 숙주 세포에서 발현되었다. 예를 들어, 인간 융모막 성선자극호르몬(hCG) 의 α 및 β 서브유닛의 클론닝을 각각 개시하고 있는 Fiddes, J.C. 및 Goodman, H. M. Nature, vol. 281, pp. 351-356,1979 및 Fiddes, J. C. 및 Goodman, H. M., Nature, vol. 286, pp. 684-687,1980 참조.

DNA 백신으로 기능하는 세균 플라스미드의 제조는 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 달성된다. 일단 제조되면, 백신 플라스미드는 세균에 도입(형질전환) 된다. 세균의 성장은 많은 플라스미드 복제를 일으킨다. 플라스미드 DNA 는 훨씬 큰 세균 DNA 및 다른 세균 분순물로부터 작은 환상 플라스미드 DNA 를 분리하는, 상대적으로 간단한 기법을 사용하여 세균으로부터 정제된다. 정제된 DNA (안정한 분자)는 DNA 백신으로 사용가능한 핵산 구조체의 한 형태이다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 핵산 구조체 또는 DNA 백신은 개시 위치 및 종결위치로 둘러쌓이고, 제 1 차 전사체를 생산하도록 전사되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비상동의 hCG-암호화 핵산 구조체이다. 본 명세서에 사용될 때, "비상동의 hCG-암호화 핵산 구조체" 는 또한 적어도 두 성분 (1) 하나 이상의 hCG 면역원성 에피토프를 암호화하는 DNA ,및 (2) 전사 프로모터 성분 또는 hCG 항원-암호화 DNA 의 발현을 위해 조절 가능하게 연결된 성분을 포함하는 "hCG-암호화 핵산 구조체" 를 말한다.

본 발명의 hCG-암호화 핵산 구조체는 hCG-암호화 유전자의 발현을 위한 서열을 포함하는 벡터에 삽입된다. 이러한 hCG-암호화 핵산 구조체는 많은 알려진 방법에 의해 생산될 수 있다. 본 명세서에 사용된 모든 기법은 Maniatis et al, (1982) 분자 클론닝: 실험실내 매뉴얼 (Cold Spring Harbor Laboratory) 에 자세하게 개시되고, 특별히, 본 명세서에 참고문헌으로서 수록된다.

어떤 경우에, 비상동의 hCG-암호화 핵산 구조체는 전향 또는 역의 방향으로 hCG-암호화 핵산 구조체가 삽입되어있는, DNA 플라스미드 벡터와 같은 포유동물 세포의 트랜스펙션에 유용한 많은 벡터 중 어느 벡터로 운반된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 구조체는 예를 들어, 서열에 조절 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 많은 적당한 벡터 및 프로모터가 당업계의 당업자에게 알려지고 상업적으로 이용가능하다. 적당한 클로닝 및 원핵생물 및 진행생물 숙주와의 사용을 위한 발현 벡터는 Sambrook et al., 1989 에 개시되고, 특별히, 본 명세서에 참고문헌으로 수록된다.

하나의 바람직한 플라스미드 벡터는 세균 및 진핵생물 세포 모두를 트랜스펙션시키기 위해 사용가능한 pCI-neo 포유동물 발현 벡터이다. (Promega, Madison, WI, Figure 3) 벡터는 포유동물 유전자의 발현에 유용한 많은 프로모터의 어느것을 포함할 수 있다. 바람직한 프로모터는 포유동물 세포에서 클론된 DNA 삽입체의 구성적인 발현을 촉진하기에 유용한, 인간 시토메가로바이러스(CMV) 즉시 초기 인핸서/프로모터 부위이다. CMV 프로모터 및 인핸서는 빠르게 분열하는 세포에서 우선적으로 활성이 있는 것으로 확인되었는데, 인핸서는 핵에 존재하는 트랜스 작용인자에 의해 활성화되기 때문이다. (Ghazal P, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84: 3658-62,1987). 따라서, CMV 프로모터는 지금까지 확인된 가장 강력한 프로모터이고, 결과적으로 DNA 백신 제조에 유용하다.(Roth, J.et al., J Natl Cancer Inst89 : 21-39,1997).

발현 벡터는 선택적으로 인핸서 성분, 스플라이싱 신호, 종결 및 폴리아데닐화 신호, 바이러스 레플리콘, 세균 플라스미드 서열, 추가적인 제한 효소 위치, 다 클로닝부위, 다른 암호화 단편, 및 즉, 엑소뉴클레아제에 의한 DNA 플라스미드 벡터의 분해 감소에 효과적인 서열과 같은 추가적인 서열을 포함하여 그들의 전체적인 길이는 상당히 다양할 수 있다. 따라서, 제조의 용이성 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에 의해서 결정된 총 길이를 가지고 거의 어느 길이의 핵산 구조체도 사용될 수 있다는 것이 기대된다.

본 발명의 hCG-암호화 핵산 구조체는 생물학적으로 기능 등가의 펩티드를 포함한다. 이러한 서열은 핵산서열 및 이에 따라, 암호화된 단백질내에서 자연적으로 발생되는 것으로 알려진 코돈 축중 및 기능적 등가성의 결과로서 나타난다. 대안적으로, 기능적으로-등가의 단백질 또는 펩티드는 상호교환될 아미노산의 성질 고려에 기초하여 단백질 구조를 변화시키는 것에 의해 생산될 수 있다. 이러한 설계된 변화는 예를 들어, 단백질의 면역원성에 개선을 도입하거나 또는 분자 수준에서 활성을 검사하기 위한 돌연변이체 시험을 위해서, 부위 특이적 돌연변이유발 기법의 이용을 통해서 도입될 수 있다.

전형적인 추가 서열은 암호화 서열의 5' 에 ATG 개시 코돈, 암호화 서열의 3' 에 TAA 정지 코돈, 5'캡, 다클로닝부위로 구성된 5'UTR, 짧은 3'UTR, 약 200 뉴클레오티드의 3'폴리 A 테일, hCG 암호화 서열의 5' 에 인트론, 및 폴리 U 서열을 제한없이 포함한다.

발현 벡터는 선택 마커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 전형적인 선택 마커는 네오마이신 포스포트랜스퍼아제 및 β 락타마제를 암호화하는 유전자를 포함한다. 그러나, 벡터에서 β 락타마제 또는 네오마이신 포스포트랜스퍼아제의 존재는 대상에 의한 불필요한 면역 반응을 초래할 수 있다. 따라서, 어떤 경우에, DNA 백신으로부터 이러한 성분의 제거가 바람직하다. hCG-암호화 핵산 구조체는 이러한 구성성분을 제거하기 위해서 당업자에 의해 전형적으로 사용되는 많은 방법으로 변형될 수 있다.

대상의 면역 반응 세포에 노출될 때, 선형 핵산 구조체는 뉴클레아제, 구체적으로는 엑소뉴클레아제에 의해 공격받기 쉽다는 것이 이해될 것이다.

하나의 전형적인 변형에서, 이러한 선형 구조체의 안정성은 5'-엑소뉴클레아제에 내성을 부여하기 위해 3'-말단의 포스포디에스테르 핵산에 합성적으로 연결된 포스포디아미데이트 모르폴린 핵산으로 구성된 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용을 통해 달성될 수 있다. 이러한 선형 hCG 암호화 핵산 구조체는 핵산 구조체에 포스포디에스테르 핵산에 연결된 3'-포스포디아미데이트 모르폴린(PMO) 핵산을 가진 키메릭 인트론을 포함할 수 있다. PCR 은 CMV 즉시-초기 프로모터/인핸서, 키메릭 인트론 , ATG 번역 개시점 및 TAA 종결 코돈의 양쪽에 접한 CTP-37 삽입체, 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 증폭된 선형 DNA 서열 생산에 사용될 수 있다. 이러한 전략은 양 가닥의 5' 잔기에 엑소뉴클레아제 보호를 가진 블런트-말단, 이중 가닥 DNA 를 제공한다. 전형적인 서열은 5'-TCCATGTCGGTCCTGATGCT-3' (SEQ ID NO:24), 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드내 결합으로 구성될 때 면역 반응을 자극하는 것으로 알려진 서열 모티프; 및 5'-ACCACCC-3' (SEQ ID NO: 25), 인접한 뉴클레아제 민감성 서열을 충분히 보호해야만 하는 진핵세포 유전자 발현을방해할 수 없는 것으로 여겨지는 안티센스 샤인-달가노(Shine-Delgarno)서열을 제한없이 포함한다.

또 다른 접근은 폴리-U 서열을 포함하는 5' 비번역 부위(UTR)에 기초한다. 이 폴리-U 서열은 전사체의 3'-폴리-A 부분에 3 중 나선형 캡을 형성하도록 설계되어, 엑소뉴클레아제 활성 뿐만 아니라 엔도뉴클레아제 활성에 대해 자유 말단의 결핍으로 인한 뉴클레오티드 가수분해 공격에 대해 내성이 있는 환 DNA 를 초래한다.

더 나은 측면에서, 핵산 구조체는 대상에서 하나 이상의 면역원성 인간 융모막 성선자극호르몬 (hCG) 에피토프 또는 이의 전구체를 발현하기에 효과적인 하나 이상의 추가적인 RNA 서열에 조절가능하게 연결된 RNA 전사체를 포함한다. 이러한 RNA 전사체는 예를 들어, CTP 37-mer 삽입체(SEQ ID NO:1) 와 같은 ATG 번역 개시 코돈 및 TAA 의 양쪽에 접한 암호화 서열을 포함하는 필수 mRNA 전사체를 생산하기 위해 T7 RNA 폴리머아제를 사용하여 제조된다. 이 전사체는 5'- 캡, 1 차적으로 다중 암호화 부위로 구성된 짧은 5'-비번역 부위(UTR) 또는 짧은 3'-UTR 및 대략 200 아데노신 잔기의 단편으로 제조될 수 있다. 이러한 전사체는 당업계의 기술자에게 일반적으로 사용되는 기법에 의해 제조될 수 있고, 그것은 예를 들어, mESSAGE mMACHINE^TM(Ambion Inc., Austin, Texas)과 같이 상업적으로 이용가능하다.

이러한 전사체는 부수의 서열을 포함하지 않고 번역의 최종 전구체라는 잇점을 제공한다. 분해에 대한 보호는 전사체의 3'-말단에 혼성화가능하고 3' 에서 5' 엑소뉴클레아제 활성으로부터 보호가능하고 번역을 방해하지 않는, 폴리-T 포스포로디아미데이트 모르폴린 올리고머의 사용을 통해 달성될 수 있다. 전사체의 5'-말단은 5' 캡으로 인해 개선된 안정성을 요구하지 않을 수 있거나, AUG 위치에 있을때, 번역 억제에 효과적이지 않은 2'-0-메틸 잔기로 구성된 AUG 번역 개시 위치에서 안티센스 올리고뉴클레오티드로 안정화될 수 있다. 대안적으로, 5' 말단은 5'-엑소뉴클레아제 활성에 내성이 있는 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드에 T4 RNA 리가제 연결에 의해 보호될 수 있다.

일단 hCG-암호화 핵산 구조체가 제조되면, 구조체는 당업계에서 공지된 기법, T7 또는 T3 프라이머 위치를 사용하여, 양 방향으로부터 서열결정함으로서 올바른 삽입을 포함하는지 입증된다. 구조체가 면역원성 hCG 에피토프를 암호화한다는 기능적인 증명은 시험관내 번역에 의해 달성될 수 있다. 전형적인 방법은 래빗 망상적혈구 여액내에 플라스미드 삽입 구조체 및, 예를 들어, CTP-37-mer (SEQ ID NO:1) 와 같은 구체적인 hCG 펩티드에 특이적인 항체를 사용하는 고체 지지 hCG 항원흡착분석법(ELISA)을 사용한다. 적당한 조절인자가 올바른 hCG-암호화 핵산 암호화 서열을 가진 구조체를 양성적으로 확인하기 위해 또한 제조된다.

본 발명은 상기에 개시된 hCG-암호화 핵산 구조체 및, 이러한 구조체에 인간 대상의 면역 세포를 노출시키는 방법을 제공한다. 이러한 노출은 시험관 내 및 생체내에서 발생할 수 있고, 대상의 면역 반응 세포는 hCG -암호화 핵산 구조체 각각에 노출될 수 있거나 둘 이상의 형태의 hCG-암호화 핵산 구조체가 동시에 또는 연속적으로 세포에 제공될 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, DNA 백신은 즉, 대상의 수지상 세포에 생체외 트랜스펙션에 의해 DC 세포에 도입되고, 뒤이어 대상에트랜스펙션된 세포를 반송한다. 두개의 허피스 심플렉스 바이러스 (HSV) 단백질을 암호화하는 DNA 백신으로 시험관내에서 트랜스펙션된 DC 의 근육내 송달은 바이러스 감염에 대한 내성을 개선시키는 것을 보였다. (Manickan E et al., J. Leuk. Biol. 61 (2): 125-132,1997).

hCG-암호화 핵산 구조체 자체는 대상에 의해 제공된, 또는 핵산 구조체를 암호화하는 hCG 에 의해 제공된 전사인자를 사용하여 대상 세포에서 발현된다는 것이 이해되어야 한다.

하나 이상의 hCG 면역원성 에피토프를 암호화하는 hCG-암호화 핵산 구조체에 대상의 면역 반응 세포를 노출시키는 것은 이러한 에피토프에 유효하고 지속적인 체액성 및 세포성 면역을 유발시키는데 사용될 수 있다.

V.hCG 면역원성 에피토프 및 이에 대한 암호화 서열

"hCG 면역원성 에피토프" 또는 "hCG 에피토프" 는 hCG 에 대한 면역 반응을 유발하는 어느 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열의 결합이다. 암호화된 항원은 hCG 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. hCG 펩티드 및 폴리펩티드는 다양한 길이일 수 있고, 초기의 번역 산물보다 더 작은 단편을 생산하기 위한 통상의 숙주 세포 프로세싱을 겪을 수 있다.

hCG 펩티드 및 폴리펩티드는 글리코실화, 미리스토일화, 또는 인산화와 같은 일반적인 숙주 세포 번역후 변형을 또한 겪을 수 있다. 게다가, 발현된 hCG 펩티드 및 폴리펩티드는 세포내, 세포외, 세포-표면에 발현될 수 있고, 그들이 생산된 세포로부터 해리될 수 있다.

본 명세서에 개시된 hCG DNA 백신은 통상의 발명에서 사용될 수 있는 대표적인 형태의 DNA 백신 형태이다. 일반적으로, 암호화된 폴리펩티드 항원의 크기는 적어도 하나 이상의 hCG 면역원성 에피토프를 포함할 수 있을 정도로 커야만한다. 본 발명의 개시에 의해 기대되는 가장 작은 유용한 면역원성 에피토프 또는 단편은 일반적으로 약 8 내지 약 40, 또는 바람직하게는 더 이상의 아미노산과 유사한 서열을 가진 길이면에서 약 8 개의 접촉한 아미노산 잔기이다. 그러나, 암호화된 항원의 크기는 상대적으로 크고, hCG 폴리펩티드의 발현이 hCG 에 대한 면역 반응을 유발할 수 있도록 하나 이상의 hCG 면역원성 에피토프를 생산하도록 숙주에 의한 프로세싱을 초래하는 한, 예를 들어, 몇 백 또는 그 이상의 아미노산에 이를 수 있다.

폴리펩티드 표면상의 활성 도메인은 폴리펩티드의 제 1 의 아미노산 서열의 단일 분리된 단편을 포함할 수 있지만, 많은 예에서, 폴리펩티드의 활성 도메인의 천연적인 접힌 형태는 모 폴리펩티드의 1 차 아미노산 서열에서 둘 이상의 불연속적인 아미노산 단편을 포함한다는 것이 평가된다. 더욱이, 바람직한 면역원성 에피토프의 서열(즉, hCG 펩티드)이 알려질 때, 폴리뉴클레오티드에 대한 적당한 암호화 서열이 추론된다.

하나의 바람직한 구체예에서, hCG-암호화 핵산 구조체는 단독으로, 또는 하나 이상의 추가적인 면역원성 hCG 에피토프에 대한 암호화 서열과 결합하여, hCG 의 CTP (SEQ ID NO:2) 에 대한 암호화 서열을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, hCG-암호화 핵산 구조체는 단독으로, 또는 하나 이상의 추가적인 면역원성 hCG에피토프에 대한 암화화 서열과 함께, CTP(SEQ ID NO:2) 및 "루프" 펩티드(SEQ ID NO:6)에 대한 암호화 서열을 포함한다.

더 바람직한 구체예에서, hCG-암호화 핵산 구조체는 예를 들어, SEQ ID NO:5 로 제공된 서열을 가진 융합 단백질을 암호화하는 SEQ ID NO:10 으로 제공된 핵산 서열과 같이 각각은 그들 사이에 링커 서열을 가지고 적어도 8 아미노산을 가진, hCG 의 전체 β 서브유닛(SEQ ID NO:14)을 암호화하는 서열로부터 얻어진 둘 이상의 에피토프에 대한 암호화 서열을 포함한다.

대안적으로, 본 발명의 핵산 구조체는 예를 들어, SEQ ID NO:3 및/또는 SEQ ID NO:4 와 같은 hCG β 서브유닛의 하나 이상의 면역원성 에피토프에 대한 암호화서열을 포함한다. 하나 이상의 에피토프가 포함된다면, 그들은 단일의 핵산 구조체에 의해 암호화될 수 있거나, 각 에피토프는 동시에 또는 이시적으로 대상에 송달된, 양 핵산 구조체를 가지고 분리된 hCG-암호화 핵산 구조체에 의해 암호화 될 수 있다.

어떤 경우에, 본 발명의 핵산 구조체는 단일 면역원성 에피토프에 대한 암호화 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 핵산 구조체는 하나 이상의 hCG 면역원성 에피토프를 암호화한다. 둘 이상의 펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 각각 또는 융합 단백질로 공-발현될 수 있다. 적어도 둘 이상의 펩티드 중 하나가 hCG 면역원성 에피토프이다.

다른 경우에, β hCG 의 CTP(SEQ ID NO:2) 또는 이의 에피토프는 SEQ ID NO:3 으로 제공된 서열에 의해 증폭되고, SEQ ID NO:4 는 대상에 투여되어, 하나이상의 면역원성 에피토프에 대한 체액성 면역 반응을 초래한다. 본 명세서에 더 개시된대로, 약 10 주 후에, 본 발명의 DNA 백신을 투여한다.

더 나은 구체예에서, 본 발명의 DNA 백신은 예를 들어, GM-CSF 와 같은 사이토킨, 면역 시스템 자극제 또는 아른 암-결합 항원과 같은 다른 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 추가적인 서열과 해독틀내에서 정렬될 수 있는, hCG 면역원성 펩티드 또는 이의 전구체를 암호화하는 제 1 의 서열과 융합된 폴리펩티드에 대한 암호화 서열을 포함하여, DNA 백신의 투여는 같은 숙주 세포내에 사이토킨, 면역 시스템 자극제 또는 다른 암-결합 항원과 함께 hCG 펩티드의 공-발현을 초래한다.

본 발명에의 이용을 위한 면역 시스템 매개제는 GM-CSF, IL-4, B7.1 및 B7.2 와 같은 IL-12 및 공-촉진 분자를 포함한다. (예를 들어, Robinson, HL and Torres, CA, 1997.참조) 뮤라인 GM-CSF 를 암호화하는 DNA 백신은 마우스에서 말라리아 DNA 백신에 대한 보호 효과를 향상시키는 것을 보였다. (Weiss WR et al., J. Immunol. 161 (5) 2325-2332, 1998).

이러한 면역 반응 조절제는 hCG DNA 백신에 의해 암호화된 하나 이상의 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기 위해 종양 세포 또는 종양의 근처에 표적화될 수 있다.

전형적인 암-결합 항원은 HER-2/neu 발암성 단백질 및 이의 면역원성 에피토프를 포함한다. HER-2/neu-특이적 단일클론 항체 치료법은 동물 모델에서 악성 종양을 근절하기에 효과적이었고, 인간 HER-2/neu-과발현 암의 치료에 잇점을 보였다. (Disis ML, et al., Adv Cancer Res 71: 343-71,1997). 하나의 구체예에서, 본발명은 펩티드 사이에 링커 서열의 존재 또는 부존재로,면역원성 hCG β 서브유닛 펩티드에 융합된 면역원성 HER-2/neu 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

Her-2/hCG 융합 단백질의 전형적인 암호화 서열은 hCG CTP (SEQ ID NO: 2), 링커(SEQ ID NO: 9), 및 Her-2 단백질의 아미노산 115-136 (LAVLDNGDPLNNTTPV TGASPG, SEQ ID NO: 19) 으로 구성되는 융합 단백질(SEQ ID NO: 11)을 암호화 하는 SEQ ID NO: 16 ; hCG CTP (SEQ ID NO: 2), 링커 (SEQ ID NO: 9), 및 Her-2 단백질의 아미노산 134-151 (LPGGLRELQLRSLTEILKG, SEQ ID NO: 20)로 구성되는 융합 단백질 (SEQ ID NO:12)을 암호화하는 SEQ ID NO: 17; 및 hCG CTP (SEQ ID NO: 2), 링커 (SEQ ID NO: 9), 및 Her-2 단백질의 아미노산 367-395 (LFLPESFDGDPASNAPLQPE, SEQ ID NO: 21)로 구성되는 융합 단백질 (SEQ ID NO:13) 을 암호화하는 SEQ ID NO: 18 을 포함한다.

어떤 경우에, DNA 예방접종를 위한 핵산 구조체는 하나 이상의 CG 펩티드, 폴리펩티드 또는 이의 전구체를 암호화하는 RNA 를 포함한다.

B.변이체 또는 변형된 면역원성 hCG 펩티드

어떤 경우에, 본 발명의 hCG-암호화 핵산 구조체는 온전한 표적 단백질이 아닌, 초기 번역 또는 숙주에 의한 프로세싱 후에 표적 단백질의 단편으로 숙주 면역 시스템에 제공되는 hCG 폴리펩티드를 암호화한다. 즉, 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드는 hCG-암호화 핵산 구조체에 의해 암호화된 전체의 아미노산 서열을 가질 수도 있고 가지지 않을 수도 있다.

다른 경우에, 아미노산의 어떤 치환은 단편의 면역원성 성질에 영향을 주지않고도 가능할 수 있다. 본 명세서에 개시된 아미노산 및 핵산 서열은 추가적인 N-또는 C 말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열과 같은 추가적인 잔기를 포함할 수 있으나, 펩티드 또는 융합 단백질이 예를 들어, 면역원성과 같은 적당한 생물학적 활성을 유지하는 한, 본 명세서에 개시된 서열과 같은 것이 여전히 필수적이다는 것이 또한 이해될 것이다. 말단 서열의 첨가는 구체적으로는 예를 들어, 암호화 부위의 5' 또는 3' 부분의 어느 양쪽에 접한 다양한 비-암호 서열을 포함할 수 있거나, 즉, 인트론과 같은 다양한 내부 서열을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용된다.

변형 및 변화는 hCG 펩티드, 폴리펩티드, 이의 전구체 또는 면역원성 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 기능적인 분자를 생산할 수 있는 본 발명의 hCG 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에서 만들어질 수 있다. hCG 펩티드 또는 폴리펩티드의 아미노산은 등가의 또는 심지어 개량된 분자를 생산하는 방법으로 변화될 수 있다. 아미노산 변화는 DNA 서열의 코돈의 변화에 의해 달성될 수 있어서, 어떤 아미노산은 개선된, 또는 적어도 면역원성의 분명한 손실없이, hCG 펩티드 또는 폴리펩티드에서 다른 아미노산으로 치환된다. 그것의 생물학적 활성을 한정하는 것은 hCG 펩티드 또는 폴리펩티드의 면역원성이다. 어떤 아미노산 서열 치환은 아미노산 서열 및 그것을 암호화하는 핵산 서열에서 만들어질 수 있고, 그것은 더 큰 생물학적 이용성 또는 활성을 가진 hCG 펩티드 또는 폴리펩티드의 발현을 초래한다. 어떤 경우에, 이러한 변화는 생물학적 이용성 또는 활성의 분명한 손실 없이 예를 들어, 안정성 또는 더욱 바람직한 제약학적 성질과 같은 다른 잇점을 제공할 수 있다.

이러한 변화를 만드는 경우에, 아미노산의 수치료법 지수가 고려될 수 있다.어떤 아미노산은 유사한 수치료법 지수 또는 스코어를 가진 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 여전히 생물학적으로 기능적 등가의 단백질을 얻는다. (Kyte and Doolittle, 1982). 이러한 변화를 만드는 경우에, 아미노산의 수치료법 지수의 치환은 +/-2 범위내에 존재하는 것이 바람직하고, +/-1 범위내의 치환이 더욱 바람직하고, +/0.5 의 범위내의 치환이 특히 더 바람직하다. 같은 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 만들어질 수 있다는 것이 당업계에서 또한 이해된다. U. S. 특허번호 4,554,101. 이러한 변화에서, 아미노산의 친수성 값이 +/-2 의 범위내에 있는 치환이 바람직하고, +/-1 의 범위내에 있는 치환이 더욱 바람직하고, +/-0.5 의 범위내에 있는 치환이 가장 바람직하다.

부위-특이적 돌연변이유발 및 예를 들어, 돌연변이제로의 처리와 같은 다른 기법은 기초적인 DNA 의 특정 돌연변이유발을 통해, 생물학적으로 기능적 등가의 단백질 또는 펩티드의 제조에 유용하다. 부위-특이적 돌연변이유발 기법은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 변화를 DNA 로 도입하는 것을 허용한다. 일반적으로, 부위-특이적 돌연변이유발 기법은 다양한 공개문헌 및 예를 들어,QuickChange^TM(Stratagene, LaJolla, CA)와 같은 상업적 키트의 이용가능성에 의해 구체화된 대로 당업계에 잘 알려진다.

C.발현 라이브러리

본 발명은 또한 많은 hCG 면역원성 결정인자에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다. 라이브러리는 적어도 24 뉴클레오티드를 가지는 단편(즉, 적어도8 아미노산의 펩티드를 암호화)을 생산하기에 효과적인 방법으로 hCG의 β 서브유닛(SEQ ID NO:14)의 전체 암호화 서열을 부분적으로 분해하여 제조된다.

게놈 또는 cDNA (또는 RNA) 샘플은 물리적인 단편화, 또는 바람직하게는 약 100 내지 1,000 염기쌍에 유사한 상대적으로 작은 단편을 생산하기 위해 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 효소적인 절단에 의해 절편화된다. 본 발명의 이용에서, 각 플라스미드내의 평균 단편 크기는 적어도 24 또는 30 내지 약 100 뉴클레오티드이다. 단편화 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려지고, 즉, 다른 제한 엔도뉴클레아제 또는 결합 및 분해 시간을 사용하여 단편의 다른 혼합을 얻도록 다양화될 수 있다. 구조체는 hCG 폴리펩티드가 분비되도록 허용하는 신호 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, 각 플라스미드내의 평균 단편크기는 약 100 뉴클레오티드와 비슷하다.

DNA 의 단편화 후에, 발현 라이브러리가 준비된다. 이러한 라이브러리의 준비는 상대적으로 간단하고 공개된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 단편화된 DNA 는 표준 클로닝 벡터에 삽입되고, 프로모터의 조절하에 놓이고, 세균은 벡터로 형질전환되고, 형질전환체가 확인되고 당업계의 숙련자들에게 알려진 방법을 사용하여 플라스미드 DNA 가 분리된다.

일단 DNA 플라스미드 라이브러리가 얻어지면, 숙주는 플라스미드 라이브러리의 부분을 포함하는 DNA 백신으로 접종된다. 라이브러리는 하기에 요약된 대로, DNA 예방접종에 효과적인 것으로 알려진 몇개의 다른 방법 중 어느 하나에 의해 숙주로 접종될 수 있다.

하나 이상의 라이브러리 클론을 구성하는 DNA 백신이 DNA 예방접종에 효과적인것으로 알려진 몇개의 다른 방법에 의해 숙주에 도입된 후에, 백신에 대한 면역 반응을 평가한다.

D.DNA 백신에 대한 면역반응의 평가

이러한 분석은 숙주에 의한 항체 생산의 결정에 의해 측정된 체액성 반응 및 표준 CTL 분석법에 의해 측정된 숙주에 의한 세포성 면역 반응 모두의 평가를 포함한다. 추가적인 분석법은 보체 "분할 산물"에 대한 대상 혈액 샘플을 평가하고, 배양된 종양 세포상에서 대상 혈청의 항종양 효과를 평가하는 것에 의해 보체 활성의 측정을 포함한다.

그 때, hCG 발현 라이브러리 DNA 백신의 투여 전 및 후의, 숙주의 플라스마내에서의 항-hCG 항체 생산의 수준 및 hCG 수준의 분석은 개개의 플라스미드 또는 면역반응에 책임이 있는 플라스미드의 결합을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 그 때, 플라스미드로부터 DNA 백신을 제조하고, 보호적임을 나타냈던 플리스미드 벡터에 의해 암호화된 폴리펩티드를 확인하는 것이 가능하다.

본 발명의 발현 라이브러리 방법의 사용은 본 명세서에 참고문헌으로 수록된 Ulmeret al. 1993 에 개시된 방법과 유사한 기법을 사용한다. DNA 단편으로 구성된 발현 라이브러리는 노출 DNA 및 플라스미드 DNA를 포함하는 사실상 어느 형태로도 사용될 수 있고, 예를 들어, Fynanet al. (1993) and Tanget al(1992) 에 개시된 대로, 점액성 및 유전자 건 접종 또는 근육 또는 피부에 바늘 주사 또는 구강(비경구적인) 투여를 포함하는 다양한 방법으로 대상에 투여될 수 있다.

VI.대상에 hCG DNA 백신의 투여

본 발명의 방법에서, 대상의 면역 반응 세포는 hCG-암호화 핵산 구조체에 노출된다. 이러한 노출은 시험관 내 및 생체내에서 일어날 수 있다.

생체내에서, 투여는 보강제 또는 핵산 섭취 촉진능력 또는 면역 시스템 세포를 접종 위치에 제공하는 능력을 가진 다른 물질의 존재하에서 DNA 백신의 송달을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 면역 반응을 원하는 대상의 면역 반응 세포는 DNA 백신에 노출된다. 면역화는 펩티드, 이의 폴리펩티드 전구체 또는 융합 단백질의 형태로 hCG 항원을 암호화하는 DNA 백신에 대상의 면역 반응 세포를 연이어 노출시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 효과적인 DNA 예방접종은 백신의 투여전에 대상에서 검출된 hCG 의 수준에 비하여 대상에서 순환하는 hCG 또는 세포 표면 hCG 양의 감소를 초래한다.

노출이 생체내에서 발생할 때, 본 발명의 DNA 백신은 대상 생체내 투여전에 생리적으로 허용가능한 담체와 결합한다. DNA 백신은 경로로서, 흡입, 피내 (ID) 주사, 근육(IM) 주사, 정맥(IV) 주사, 복강내(IP) 주사, 피하(SC) 주사, 종양부근 주사, 점액성 표면에의 적용 (예를 들어, 콧구멍 또는 호흡관에 DNA 액적의 이용), 안구내 투여, 또는 유전자 건을 사용한 외피의 입자 충격을 제한없이 포함하여 투여될 수 있다. (예를 들어, Fynanet al., 1993 참조).

DNA 백신은 주사기 및 니들을 사용하여 근육 또는 피부에 식염수 용액으로 주입될 수있다. (Wolff JA, et al., Science 247: 1465 1468,1990; Raz E, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9519-9523,1994). DNA 백신은 또한 미시적인 금 비드에 핵산을 코팅하고 그때, 세포에 비드를 송달할 유전자 건을 사용하여 투여될 수 있다.(예를 들어, Johnston SA and Tang DC, Genet Eng (N Y) 15: 225-36,1993.참조) 식염수 주입은 핵산을 세포외 공간으로 송달하는 반면에, 유전자 건은 금 비드에 코팅된 핵산을 직접 세포에 송달한다. 주입 및 충격에 의한 면역 반응은 다른 양의 핵산을 요구하고, 다른 형태의 T 세포의 생산을 초래할 수 있다.

근육은 종래의 피부를 통한 직접적인 주입으로서 접근가능하고 따라서, hCG-암호화 핵산 구조체의 송달 및 발현에 유용한 위치이다. DNA 백신은 복합 및/또는 반복적인 주입에 의해 근육에 송달될 수 있다. 이 방법에서, 치료법은 장시간동안 연장될 수 있다.

근육 세포에 hCG-암호화 핵산 구조체가 주입될 때, 면역원성 폴리펩티드에 대해 선택되는 면역 반응은 hCG 펩티드 또는 폴리펩티드에 특이적인 세포성 및 체액성 면역 반응 모두를 일으키기 위해 MHC 분자 구조에 하기의 항원 제공을 초래한다. (예를 들어, Felgner, U. S. 특허번호. 5,703,055 참조)

DNA 백신은 또한 직접적인 주입, 입자 충격 또는 전기천공법에 의해 외피에 용이하게 편리하게 접근되어 송달될 수 있고, 그들의 유전자 산물을 발현할 수 있다. DNA 백신은 복합 및/또는 반복적인 투여에 의해 외피에 송달될 수 있다. 이러한 방법에서, 치료법은 장시간에 걸쳐 연장될 수 있다. 피부는 항원 제공 세포로 기능하는 랑게르한스 세포를 포함하고, hCG 펩티드 또는 폴리펩티드에 특이적인 세포성 및 체액성 면역 반응 모두를 일으키기 위해 MHC 분자 구조에 hCG 면역학적 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공할 수 있다. (Felgner, 1998). 전기천공에 의해 피부에 송달된 DNA 백신은 생체내 CTL 을 제조하는 것으로 보여졌다.(Nomura M et al., 1996).

투여를 이웃하는 종양에 제한하는 종양부근 주입, 및 복강내 주입과 같은 구획하된 투여는 모두, 예비임상 모델에서 효험을 보였다. (Wills KN, et al. Hum Gene Ther 5: 1079-88,1994).

DNA 백신은 또한 핵산-함유 코-액적, 흡입제, 좌약, 핵산 캡슐화된 중심체를 포함하는 다양한 방법에 의해 또는, 금 입자로 코팅된 DNA 를 가지고 충격에 의해 점액성 조직에 송달가능하다. 예를 들어, DNA 백신은 유전자 건에 의해, 또는 DNA 백신을 포함하는 리포좀의 투여에 의해 호흡성 점액 표면에 투여될 수 있다.(Fynanet al., 1993; Gregoriadis G et al., FEBS Lett., 402: 107-110,1997). 어떤 경우에, DNA 백신은 hCG-암호화 핵산 구조체를 포함하는 세균을 숙주에 직접 접종하는 것에 의해 도입되거나, 벡터로서 예를 들어, 아데노바이러스와 같은 다른 형태의 감염제를 사용하는 것에 의해 도입된다. DNA 백신 벡터에 대한 담체로서 구강으로 송달된 생존한 감약된Salmonella세균의 사용은, 항원 제공 세포에 대해 생체내에서의 항원 발현의 효과적인 표적화를 초래한것으로 밝혀졌다. (APCs; Paglia P et al., Blood, 92 (9): 3172-3176,1998).

종양 세포의 표적화

종양 세포는 DNA 백신 단독으로 또는 면역 반응 세포에 표적화된 DNA 백신과 결합하여 표적화 될 수 있다. 하나의 일반적인 구체예에서, 종양 세포는 면역 반응에 대한 표적으로서의 종양 세포에 하나 이상의 CTP 에피토프의 증가된 발현을 위해 ,바이러스 또는 hCG 항원, CTP 펩티드 항원 또는 이의 에피토프에 대한 유전자를 운반하는 종양-특이적인 다른 적당한 벡터와 함께 표적화된다. 종양-특이적 항원의 발현에 사용하기 위한 바이러스 벡터 시스템이 예를 들어, U. S. 특허번호 5,744,133, 및 Lan KH; et al., Gastroenterology, 111 (5): 1241-51,1996 에 개시된다.

다른 일반적인 구체예에서, CTP 펩티드(또는 이의 에피토프)를 가진 펩티드 항원 예방접종 또는 CTP-DNA 백신을 가진 예방접종과 결합하여 수행되고, 종양 세포는 바이러스 또는 종양 세포를 트랜스펙션가능하고, 트랜스펙션된 세포에서 IL-2, IL-4, or GM CSF 와 같은 면역 자극제를 발현가능한 다른 적당한 종양-특이적인 벡터와 표적화된다. 종양 세포 부위에서 면역 자극제의 분비는 종양 세포의 표면에 발현된 hCG 항원에 대한 세포독성 T 세포 반응을 향상시키는데 효과적이다.

다양한 바이러스 벡터는 종양 표적화에 이용가능하다. 파르비바이러스는 선택적으로 종양세포를 감염시키는 것으로 알려진다. 대안적으로, 바이러스는 공개된 방법에 따라, 종양 세포에서 선택적으로 복제되도록 설계될 수 있다. (예를 들어, Puhlmann M; et al., HumGene Ther, 10 (4): 649-57,1999; Noguiez-Hellin P; et al. Proc Natl Acad Sci USA, 93 (9): 4175 80,1996; and Cooper MJ, Semin Oncol 23 (1) pl72-87,1996.참조) 예를 들어, 바이러스는 돌연변이화된 키나제 또는 이러한 효소를 포함하는 세포가 빠르게 분열하는 경우에만 바이러스의 복제를 허용하는 폴리머아제 유전자를 포함하도록 변형될 수 있다. 대안적으로, 바이러스는 원하는단백질 또는 종양 세포에서만 바이러스 복제에 필요한 단백질에 반응성이 있고 발현되는 예를 들어, 종양-특이적 프로모터 부위와 같은 종양-특이적 조절 요소를 포함하도록 유전학적으로 설계될 수 있다.

하나의 바람직한 구체예에서, DNA 백신의 투여는 본 발명의 DNA 백신으로 코팅된 금 비드를 사용하여 입자 충격에 의해 달성된다. 바람직하게는, 금 용구는 직경 1 μm 내지 2 μm 이다. 코팅된 용구는 일반적으로 피내로, 근육내로, 표적 기관의 근처에 직접, 또는 입자 충격 및 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 유용한 다른 경로로 투여된다. (예를 들어, Robinson, HL and Torres, CA, Sem. Immunol. 9: 271-282,1997.참조)

DNA 백신은 생리적으로 양립가능한 어느 배지로 송달 될 수 있다. 예를 들어, 주입을 위한 식염수 및 입자 충격을 위한 금 입자는 대상에 DNA 백신의 도입에 적합하다. hCG-암호화 핵산 구조체는 활성 성분과 제약학적으로 허용가능하고 양립가능한 부형제와 혼합될 수 있다. 적당한 부형제는 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이의 결합체이다. 게다가, 원한다면, DNA 백신은 소량의 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 또는 백신의 효험을 향상시킬 수 있는 보강제를 포함할 수 있다.

DNA 백신은 투여 조제물과 양립가능한 방식으로 투여되고, 이러한 양은 결과적으로 면역원성 펩티드의 생산을 초래한다. 투여량은 예를 들어, 반응에 대한 개인 별 면역 시스템의 수용능력, 및 원하는 면역화의 정도를 포함하는 치료 대상에 의존한다. 따라서, DNA 백신의 양은 수정률 조절 이용에 비하여 암 치료적인 이용에 대해 다양할 것이다.

백신의 투여량은 또한 투여 경로 및 숙주의 크기에 의존한다. 세포 외부의 백신을 도입하는 DNA 백신의 성공적인 IM 및 ID 주입은 마우스에서 약 1 내지 100 μg DNA 를 포함한 반면에 , 성공적인 유전자 건 송달 방법은 마우스에서 약 10 ng 내지 100 μg 의 DNA 를 포함했다. 유효 투여량 범위는 마우스, 송아지 및 원숭이에서 유사했다. 초기 및 연이은 투여에 대한 적당한 방법은 또한 다양하나, 초기 투여에 이은 연이은 접종 또는 다른 투여에 의해 정형화된다. (예를 들어 Robinson, HL and Torres, 1997.참조) 합성 DNA 백신 투여 전략은 본 명세서에 제공되고, 유효 백신 투여량은 일반적으로 대상의 약 1μg/kg 내지 약 50 μg/kg 의 DNA , 바람직하게는 대상의 약 10-25 μg/kg 의 체중의 범위에 놓일 것이다. 면역 반응을 일으키기에 효과적인 DNA 의 양은 약 0.1 또는 1 ng 내지 50 μg 또는 100 μg 의 범위이다. 그러나, 예상된 대로, 이러한 투여량은 사용된 구체적인 DNA , DNA 에 의해 암호화된 구체적인 펩티드 또는 폴리펩티드, 및 접종된 대상에 따라, 당업계의 통상의 기술 가진 자에게 분명한 방식으로 다양할 것이다. 이와 마찬가지로, 백신 조성물은 예를 들어, 무란일 디펩티드와 같은 다양한 보강제 또는 인터루킨 1 또는 인터루킨 12 와 같은 다양한 사이토킨의 공투여을 포함하기 위해서 상당히 다양할 수 있다.

본 발명의 DNA 예방접종 방법에서, 핵산 구조체에 대한 노출 위치는 세포가 hCG 내지는 본 발명의 hCG 항원에 일반적으로 노출되지 않도록 하여 조절될 수 있다.

어떤 경우에, DNA 백신은 암을 가진 인간 대상에 투여된다. 이러한 경우에, DNA 백신은 대상의 암 세포로부터 해리된 hCG 항원성 에피토프와 공통적인 에피토프를 가지는, 면역원성 hCG 펩티드 또는 이의 면역원성 단편을 발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

외과 수술, 방상선 치료법, 및 화학치료법은 일반적으로 암 치료를 위한 1 차적인 방법이다. 치료법에 기초한 DNA 백신은 이들과 상승작용적인 또는 추가적인 방법으로 상호작용할 수 있다. 어떤 경우에, 암을 치료하는 개선된 방법은 예를 들어, 화학치료법과 같은 종래의 암 치료와 상당한 치료적 효과를 야기하는 hCG -암호화 DNA 백신의 투여를 결합할 것이다.

다른 경우에, DNA 백신은 수정률 조절 수단으로 포유동물 대상에 투여된다. 이러한 경우에, DNA 백신은 면역원성 hCG 펩티드 또는 이의 면역원성 단편을 발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기에서 hCG 펩디드(들) 에 대한 면역 반응은 순환하는 CG 의 수준을 조절하거나, 태반 및/또는 배반포에 대하여 세포 매개 면역 반응을 제공한다.

이러한 hCG DNA 백신-매개 수정률 조절은 일반적으로 포유동물에 이용가능하고, 인간 및 동물 모두의 치료에 유용성을 가진다. 예를 들어, DNA 백신은 무바늘 제트 주입기로 소 또는 다른 가축에 피내로 투여될 수 있다. (예를 들어,WO 98/03196 참조.)

VII.hCG-DNA 구조체로 마우스의 유전적 (DNA) 백신화

성숙한 마우스 모델은 DNA 백신에 대한 면역 반응을 결정하기 위한 편리한운반체이다.

hCG 의 전체 β 서브유닛을 암호화하는 발현 구조체로 면역화된 마우스는 인간 CG 에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응 모두를 발전시키는 것으로 증명되었다. hCG-발현 SP2/0 골수종 세포를 가진 주입전에 DNA 예방접종에 의해 이러한 마우스가 프라임되었을 때, 종양 크기면에서 눈에 띄는 감소가 증명되었다. (Geissler M, et al., Lab Invest 76 (6): 859-71,1997).

일반적으로, 핵산 구조체 또는 DNA 백신에 대한 체액성 및 세포성 면역반응은 다양한 양의 hCG-암호화 핵산 구조체와 접종된 마우스에서 평가될 수 있다. 핵산 구조체에 면역반응 세포의 하기 노출에 의해, 마우스는 방사선 면역분석법(RIA) ,효소결합 면역흡착분섭법 (ELISA) 또는 면역침전법과 같은 시험관내 결합 분석법에서 결정된 대로, hCG 의 다양한 면역원성 에피토프에 대한 항체의 존재여부가 시험될 수 있다. 이러한 기법과 분석법은 당업계에서 공지된다. 세포 매개 면역 반응은 노출된 마우스로부터 비장세포의 배양 및 표준 세포 매개 세포독성 분석법에서⁵¹Cr-표지된 hCG 에티토프-특이적 표적 세포 용해의 결정에 의해 또한 평가된다. [Wunderlich and Shearer, in Coligan et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY Wiley, New York, NY, 1: 3.11,1998].

본 발명의 DNA 백신 효험의 전형적인 결정은 하기에 따라 수행된다. hCG-암호화 및 조절 핵산 구조체가 복부 피부의 피내로 또는, 대퇴사두근에 근육내로 100 μl 용액(인산염 완충액 식염수에서 1 μg/μl 의 플라스미드) 으로 C57BL/6 마우스 또는 Abgenix xenomice 에 주입된다. 주입을 2 주 간격으로 반복한다. 게다가, 프로인드 애주번트에서 디프테이아 독성(DT) 결합 CTP-37 은 양성 조절로서 마우스에 동시에 주입된다.

그 때, hCG 및 CTP-37 에 대한 항원 특이적 체액성 면역을 예방접종된 마우스로부터의 혈청의 회수 및 분석에 의해 평가한다. 혈청을 고체-지지흡착면역분석법에서 hCG 또는 CTP-37 항원에 첨가한다.

세포 매개 면역은 외인성 IL-2 의 존재에서 7 일동안 hCG 로 재자극된 예방접종된 마우스로부터 비장의 회복에 이해 평가되고, 항원 특이적 CTL 의 존재에 대해 배양물을 평가했다.

하기의 실시예는 본 발명을 제한하는 어느 방식으로 해석되지는 않는다.

실시예 1

hCG-암호화 핵산 구조체의 제조

A.DNA 플라스미드 벡터

Promega 로부터 구입한 pCI-neo 포유동물 발현 벡터(Madison, WI, 도 3)를 양립불가능한 점착성 말단을 제공하기 위해 Nhe I (인지 서열-G-CTAGC) 및 Eco RI (인지 서열-G-AATTC) 제한 엔도뉴클레아제로 이중 분해했다. [각각, Promega cat # R6501 및 R6011]. 벡터는 또한 포유동물 세포에 대한 선택마커로서, 네오마이신 포스포트랜스퍼아제 유전자를 포함한다.

벡터의 기재 맵은 하기의 것을 포함한다:

기능 부위 뉴클레오티드

CMV 즉시 초기 인핸서 1-659

CMV 즉시 초기 프로모터 669-750

키메릭 인트론[잠재 5' 스플라이스 방지] 890-1022

T7 프로모터[시험관내 RNA 합성] 1067-1085

다클로닝부위 [삽입 위치] 1085-1137

SV40 늦은 폴리아데닐화 신호 1067-1388

[전사를 종결하고 폴리 A 첨가]

복제의 fl 개시점[세균에서 높은 복제수] 1438-1938

SV40 인핸서/프로모터 2002-2420

복제의 SV40 개시점[진핵세포 복제] 2318-2383

네오마이신 포스포트랜스퍼아제 2465-3259

합성 폴리아데닐화 신호 3323-3371

β 락타마제 [암피실린 내성 유전자] 3782-4642

B.hCG-암호화 핵산 구조체

벡터는 양립불가능한 점착성 말단을 제공하기 위해 Nhe I (인지서열-G-CTAGC) 및 EcoRI (인지서열-G-AATTC) 제한 엔도뉴클레아제로 이중 분해했다. (Promega). 그 때, NheI/EcoRI 제조된 벡터를 올리고뉴클레오티드와 결합시킨 후 연결하고 세균을 형질전환시켰다. 다양한 삽입체를 다가 에피토프가 hCG 또는 다른 종양 결합 항원으로부터 발현을 허용하도록 첨가했다.

벡터에 첨가된 hCG 암호화 서열은 N-말단에 첨가된 메티오닌을 가닌 hCG β 서브유닛의 CTP 에 대한 암호화 서열(SEQ ID NO: 7), hCG β 서브유닛의 "루프" 펩티드에 대한 암호화 서열(SEQ ID NO: 8) 및 벡터에 (SEQ ID NO: 22) 및 (SEQ ID NO: 23)로서 각각 또는 두 에피토프 사이에 링커(SEQ ID NO:10) 를 가지고 단일 삽입체로서 각기 삽입된 hCG β 서브유닛의 두 에피토프에 대한 암호화 서열을 포함한다. 다양한 전형적인 예가 표 1 에 제공된다.

hCG CTP, 링커 및 Her-2 펩티드로 구성되는 Her-2/hCG 융합 단백질을 암호화하는 서열은 Her-2 단백질의 아미노산 115-136 을 암호화하는 SEQ ID NO:16 , Her-2 단백질의 아미노산 134-151 을 암호화하는 SEQ ID NO:17 , Her-2 단백질의 아미노산 376-395 를 암호화하는 SEQ ID NO:18 을 포함하는 벡터에 또한 첨가된다.

PCR 을 플라스미드 부위의 증폭을 포함하는 선형 DNA 서열을 생산하기 위해 사용한다. 예를 들어, 플라스미드의 1388 뉴클레오티드 및 CMV 즉시-초기 프로모터/인핸서, 키메릭 인트론, ATG 번역 개시점 및 TAA 종결 코돈의 양쪽에 접한 CTP-37 삽입체, 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하는 삽입체의 약 123 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 1 내지 1511 은 DNA 프라이머 및 PCR 을 사용하여 서열결정된다.

다른 전형적인 접근법에서, T7 RNA 폴리머아제는 ATG 번역 개시점 및 TAA 종결 코돈의 양쪽에 접한 CTP-37 을 포함하는 필수적인 mRNA 전사체를 생산하기 위해 사용된다. 이 전사체는 5'캡, 1 차적으로는 다클로닝부위를 포함하는 5'-비번역 부위, 짧은 3'-UTR 및 대략 200 아데노신 잔기의 단편으로 제조된다. 안정성은 전사체의 3'-말단에 혼성화할 수 있고, 번역을 방해하지는 않을 것이나 3' 에서 5' 로의 엑소뉴클레아제 활성으로부터 보호할 수 있는 폴리-T 포스포로디아미데이트 모르폴린 올리고머의 사용으로 달성된다. 어떤 경우에, 전사체의 5'-말단은 5'-엑소뉴클레아제 활성에 내성이 있는 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드에 T4 RNA 리가제 연결에 의해 보호된다.

각각의 공개문헌, 특허 및 특허출원이 그 발명의 전체로서 참고문헌을 특이적이고 개별적으로 수록한것과 같은 의도로, 본 명세서에 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 발명의 전체로서 특별히 참고문헌으로 수록된다.

Claims

대상의 면역 반응 세포를 적어도 하나의 hCG 면역원성 에피토프, 이의 전구제 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 구조체에 노출하는 단계를 포함하고, 상기 핵산 구조체는 이러한 면역 반응 세포에 의해 흡수되고 프로세싱되는 포유동물 대상에서 hCG 에 대한 면역 반응을 유발하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 노출은 생체내에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 노출은 면역 반응을 원하는 세포에 대해 하나 이상의 hCG 펩티드 항원의 세포-표면 제공 유발에 효과적인 방식으로 대상에 상기 핵산을 도입하는 단계에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 노출은 시험관내에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 노출은 세포에서 면역 반응을 원하는 세포에 대해 하나 이상의 hCG 펩티드 항원의 세포-표면제공 유발에 효과적인 방식으로 시험관내에서 대상세포에 핵산구조체를 첨가하는 단계 및 노출된 세포를 대상에 재투여하는단계에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 노출은 대상에서 하나 이상의 hCG 면역원성 에피토프에 대한 세포성 면역 반응을 유발하기에 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 노출은 대상에서 하나 이상의 hCG 면역원성 에피토프에 대한 체액성 면역 반응을 유발하기에 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
재 1 항에 있어서, 상기 핵산 구조체는 DNA 플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산 구조체는 대상에서 상기 하나 이상의 면역원성 인간 융모막 성선자극호르몬 (hCG) 에피토프 또는 이의 전구체 발현에 효과적인 하나 이상의 추가적인 RNA 서열과 조절가능하게 연결된 RNA 전사체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산 구조체는 hCG 의 β 서브유닛(SEQ ID NO:14) 로부터 취한 적어도 8 개의 아미노산을 가진 펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산 구조체는 hCG 의 β 서브유닛 (SEQ ID NO: 14)의 아미노산 109 내지 145 (SEQ ID NO: 1), 아미노산 111 내지 118 (SEQ ID NO: 3), 아미노산 133 내지 144 (SEQ ID NO: 4),및 아미노산 38 내지 57 (SEQ ID NO: 6) 로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 hCG 면역원성 에피토프를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 SEQ ID NO: 13 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 hCG 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 포유동물 대상은 hCG 가 결직장암, 유방암, 및 폐암 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 한 형태의 암과 결합된, 인간 암 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 hCG 면역원성 에피토프는 하나 이상의 추가적인 hCG 펩티드와 함께 SEQ ID NO:2 로서 제공되는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 포유동물 대상은 인간 또는 동물이고, hCG 에 대한 상기 면역 반응은 수정률 조절에 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 각각의 펩티드는 적어도 8 개의 아미노산을 가지는, 상기 적어도 하나의 hCG 면역원성 에피토프는 hCG 의 β 서브유닛의 아미노산 109 내지 145 (SEQ ID NO:1)로부터 취한 아미노산 서열을 가지는 적어도 2 개의 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 hCG 면역원성 에피토프는 (SEQ ID NO:3) 및 (SEQ ID NO:4) 로 제공되는 서열을 가지는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산 구조체는 암호화 서열의 5' 에 ATG 시작 코돈, 암호화 서열의 3' 에 TAA 정지 코돈, 5'캡, 다클로닝부위로 구성되는 5'UTR, 짧은 3'UTR 및 약 200 뉴클레오티드의 3'폴리 A 테일로 구성되는 군으로부터 선택되는 조절 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 DNA 플라스미드 벡터는 hCG 암호화 서열의 5' 에, DNA 플라스미드 벡터의 분해 감소에 효과적인 인트론을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 인트론은 포스포디에스테르 핵산에 결합된 포스포디아미데이트 모르폴린 (PMO) 핵산을 가지는 키메릭 인트론인 것을 특징으로 하는 방법.
인간 대상에서 암을 치료하는 방법으로서,

(a) 적어도 24 뉴클레오티드를 가지는 단편의 생산에 효과적인 방식으로 hCG β 서브유닛(SEQ ID NO:14)을 암호화하는 DNA 서열을 단편화하는 단계;

(b) 단편을 대상의 면역 반응 세포에 의해 흡수 및 프로세싱 가능한 하나 이상의 발현 벡터에 삽입하는 단계;

(c) 발현 벡터를 클로닝하는 단계 및 암호화된 발현 벡터를 생산하는 단계; 및

(d) 상기 면역 반응 세포를 면역 반응 세포를 예방접종하기에 충분한 양으로 상기 암호화된 발현 벡터에 노출시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서, (e) hCG 에 대한 면역 반응에 대하여 상기 대상의 원형질 및/또는 세포를 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제약학적으로 허용가능한 담체에 적어도 하나의 hCG 면역원성 에피토프를 가지는 융합 단백질에 대한 암호화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 백신에의 사용을 위한 핵산 구조체.
제 23 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 hCG 면역원성 에피토프는 SEQ ID NO:2 및 SEQ IDN NO:6 으로 제공되는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
제 23 항에 있어서, 각각의 에피토프는 적어도 8 아미노산을 가지는, hCG 의 β 서브유닛(SEQ ID NO:14)의 아미노산 109 내지 145 로부터 취한 둘 이상의 펩티드로 구성되는 적어도 하나의 hCG 면역원성 에피토프를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
제 23 항에 있어서, 상기 구조체는 DNA 플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
제 26 항에 있어서, 상기 DNA 플라스미드 벡터의 서열은 hCG 암호화 서열의 5' 에 상기 DNA 플라스미드 벡터의 분해 감소에 효과적인 인트론을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
제 27 항에 있어서, 상기 인트론은 포스포디에스테르 핵산에 합성적으로 연결된 포스포디아미데이트 모르폴린(PMO) 핵산을 포함하는 키메릭 인트론인것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
상기의 세포를 적어도 하나의 hCG 면역원성 에피토프 또는 이의 전구체를 암호화하는 핵산 구조체에 노출하는 단계에 의해 제조되고, 상기 핵상 구조체는 이러한 면역 반응 세포에 의해 흡수되고 프로세싱되는 것을 특징으로 하는 대상 면역 반응 세포를 포함하는 DNA 백신 세포 조성물.
제 29 항에 있어서, 상기 면역 반응 세포는 면역 반응을 원하는 세포에 대해 hCG 면역원성 펩티드의 세포 표면제공을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.