KR20010013029A - 핵산을 세포로 전달하기 위한 화합물, 제조 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 핵산을 세포로 전달하기 위한 신규 화합물에 관한 것이다. 본 신규 화합물은 좀더 상세하게는 리포폴리아민 패밀리에 관한 것이고 아미딘 작용을 포함한다. 화합물은 해당 핵산을 다양한 세포 유형, 시험관내, 생체내 또는 생체외로 전달하기에 유용하다.
Description
생물학의 발전으로, 핵산을 세포로 효과적으로 전달하는 가능성이 필요하게 되었다. 이것은 예를 들면, 재조합 단백질의 생성을 위해 또는 유전자 발현의 조절, 유전자의 클로닝 또는 DNA를 수반하는 임의의 기타 조작을 연구하는 실험실에서 핵산의 시험관내 세포로의 전달을 수반할 수 있다. 이것은 또한 예를 들면, 트랜스제닉 동물의 생성, 백신의 생성, 표지 연구 또는 치료 접근을 위해 핵산의 생체내 세포로의 전달을 수반할 수 있다. 이것은 또한 골수 이식, 면역 치료 또는 후속적인 재투여의 목적으로 유전자의 유기체로부터 수집된 세포로의 전달을 수반하는 기타 방법을 포함하는 접근법에서 핵산의 생체외 세포로의 전달일 수 있다.
다양한 유형의 합성 벡터가 핵산의 세포로의 전달을 개선하기 위해서 개발되었다. 이들 벡터 중에서, 양이온성 지질은 유리한 성질을 지닌다. 이러한 벡터는 핵산과 상호작용하는 양이온성 극성 부분과 세포 침투를 촉진하는 소수성 지질 부분으로 이루어진다. 양이온성 지질의 특정 예는 특히 제조법이 특허원 EP 394 111에 기재되어 있는 일양이온성 지질(DOTMA: 리포펙틴R); 약간의 양이온성 세정제(DDAB); 리포폴리아민 및 상세하게는 디옥타데실아미도글리실 스퍼민(DOGS) 또는 팔미토일포스패티딜에탄올아민의 5-카복실스퍼밀아미드(DPPES)이다. 기타 리포폴리아민 패밀리가 본원에 참조로 인용되는 특허원 WO 97/18185에 기재된 화합물로 표현된다.
본 발명은 핵산을 세포로 전달하기 위한 신규 화합물에 관한 것이다. 이러한 신규 화합물은 좀더 상세하게는 리포폴리아민 패밀리에 관한 것이고 아민 작용성 그룹을 함유한다. 이들 화합물은 해당 핵산을 다양한 세포 유형, 시험관내, 생체내 또는 생체외에 전달하는 데에 사용될 수 있다.
도 1/15: 본 발명에 따른 화합물 1의 합성도.
도 2/15: 혈청 단백질의 부재시 및 아민-함유 동족체(RPR120535)와 비교시 본 발명에 따른 화합물 1의 NIH3T3, HepG2 및 HeLa 세포로의 형질감염의 시험관내 효능의 측정.
"아민-함유 동족체"는 아민 작용에 의해서 대체된 아미딘 및/또는 구아니딘을 제외하고 동일한 양이온성 지질을 의미하는 것으로 이해된다. 측정은 x-축에 플로팅된 상이한 전하 비에서 수행된다. 루시페라제의 발현이 y-축에 플로팅되고 웰당 RLU(상대적 광 단위)로 표현된다.
도 3/15: 혈청 단백질의 부재(백색 막대) 및 존재(흑색 막대)시, 및 아민-함유 동족체(RPR120535)와 비교시 본 발명에 따른 화합물 1의 NIH3T3, HepG2 및 HeLa 세포로의 형질감염의 시험관내 효능의 측정.
측정은 x-축에 플로팅된 상이한 전하 비에서 수행된다. 루시페라제의 발현이 y-축에 플로팅되고 웰당 RLU(상대적 광 단위)로 표현된다.
도 4/15: 혈청 단백질의 부재시 본 발명에 따른 화합물 2의 HeLa 세포로의 형질감염의 시험관내 효능의 측정. 측정은 마이셀 형태 및 중성 조지질(DOPE 및 콜레스테롤)과 배합시의 화합물 2에 대해서 수행된다.
x-축은 양이온성 지질과 DNA간에 형성된 복합체의 전하 비를 의미한다. y-축은 pg/웰(각각 100,000 세포를 함유)로 표현된 루시페라제의 발현을 의미한다.
도 5/15: 혈청 단백질의 부재시 본 발명에 따른 화합물 3의 HeLa 세포로의 형질감염의 시험관내 효능의 측정. 측정은 마이셀 형태 및 중성 조지질(DOPE 및 콜레스테롤)과 배합시의 화합물 3에 대해서 수행된다.
x-축은 양이온성 지질과 DNA간에 형성된 복합체의 전하 비를 의미한다. y-축은 pg/웰(각각 100,000 세포를 함유)로 표현된 루시페라제의 발현을 의미한다.
도 6/15: 혈청 단백질의 부재시 본 발명에 따른 화합물 5의 HeLa 세포로의 형질감염의 시험관내 효능의 측정. 측정은 마이셀 형태 및 중성 조지질(DOPE 및 콜레스테롤)과 배합시의 화합물 5에 대해서 수행된다.
x-축은 양이온성 지질과 DNA간에 형성된 복합체의 전하 비를 의미한다. y-축은 pg/웰(각각 100,000 세포를 함유)로 표현된 루시페라제의 발현을 의미한다.
도 7/15: 혈청 단백질의 부재시 본 발명에 따른 화합물 6의 HeLa 세포로의 형질감염의 시험관내 효능의 측정. 측정은 마이셀 형태 및 중성 조지질(DOPE 및 콜레스테롤)과 배합시의 화합물 6에 대해서 수행된다.
x-축은 양이온성 지질과 DNA간에 형성된 복합체의 전하 비를 의미한다. y-축은 pg/웰(각각 100,000 세포를 함유)로 표현된 루시페라제의 발현을 의미한다.
도 8/15: 아민-함유 동족체와 비교하여 화합물 2로 형성된 핵지질 복합체가 존재하는 물리화학적 상(상 A,B 또는 C)을 전하 비의 함수로서 나타내는 표.
상의 측정은 마이셀 형태 및 중성 조지질(DOPE 및 콜레스테롤)과 배합시의 화합물 2 및 이의 아민 함유 동족체에 대해서 수행된다.
표 2를 비교함으로써, 화합물의 2의 경우에 불안정한 상 B로부터 더 낮은 전하 비를 향한 이동이 관찰된다.
도 9/15: 아민-함유 동족체와 비교하여 화합물 3으로 형성된 핵지질 복합체가 존재하는 물리화학적 상(상 A,B 또는 C)을 전하 비의 함수로서 나타내는 표.
상의 측정은 마이셀 형태 및 중성 조지질(DOPE 및 콜레스테롤)과 배합시의 화합물 3 및 이의 아민 함유 동족체에 대해서 수행된다.
표 2를 비교함으로써, 화합물의 3의 경우에 불안정한 상 B로부터 더 낮은 전하 비를 향한 이동이 관찰된다.
도 10/15: 아민-함유 동족체와 비교하여 화합물 5로 형성된 핵지질 복합체가 존재하는 물리화학적 상(상 A,B 또는 C)을 전하 비의 함수로서 나타내는 표.
상의 측정은 마이셀 형태 및 중성 조지질(DOPE 및 콜레스테롤)과 배합시의 화합물 3 및 이의 아민 함유 동족체에 대해서 수행된다.
표 2를 비교함으로써, 화합물의 5의 경우에 불안정한 상 B로부터 더 낮은 전하 비를 향한 이동이 관찰된다.
도 11/15: 아민-함유 동족체와 비교하여 화합물 3으로 형성된 핵지질 복합체가 존재하는 물리화학적 상(상 A,B 또는 C)을 전하 비의 함수로서 나타내는 표.
상의 측정은 마이셀 형태 및 중성 조지질(DOPE 및 콜레스테롤)과 배합시의 화합물 6 및 이의 아민 함유 동족체에 대해서 수행된다.
표 2를 비교함으로써, 화합물의 6의 경우에 불안정한 상 B로부터 더 낮은 전하 비를 향한 이동이 관찰된다.
도 12/15: 마이셀 형태의 화합물 2, 3, 5 및 6에 대한 에티듐 브로마이드의 첨가 후 형광의 감소를 나타내는 표. DNA의 에티듐 브로마이드의 지질로의 치환은 DNA에 결합시킴을 표시하는 것이다. DNA만으로 수득된 형광이 100 %로 정의된다.
도 13/15: 콜레스테롤 존재시의 화합물 2, 3, 5 및 6에 대한 에티듐 브로마이드의 첨가 후 형광의 감소를 나타내는 표. DNA의 에티듐 브로마이드의 지질로의 치환은 DNA에 결합시킴을 표시하는 것이다. DNA만으로 수득된 형광이 100 %로 정의된다.
도 14/15: DOPE 존재시의 화합물 2, 3, 5 및 6에 대한 에티듐 브로마이드의 첨가 후 형광의 감소를 나타내는 표. DNA의 에티듐 브로마이드의 지질로의 치환은 DNA에 결합시킴을 표시하는 것이다. DNA만으로 수득된 형광이 100 %로 정의된다.
도 15/15: 플라스미드 pXL3031의 도.
약자 및 상징어
AcOEt: 에틸 아세테이트
BOC: tert-부톡시카복닐
BOP: 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트
DCC: 디사이클로헥실카보디이미드
DCU: 디사이클로헥실유레아
DIEA: N-에틸디이소프로필아민
DMAP4: 4-디메틸아미노피리딘
DMF: 디메틸포름아미드
DMSO: 디메틸 설폭사이드
DODA: 디옥타데실아민
PE: 석유 에테르
EtOH: 에탄올
NEt3: 트리에틸아민
Rf: 보유 인자
TEA: 트리에틸아민
TFA: 트리플루오로아세트산
THF: 테트라하이드로퓨란
TMS: 테트라메틸실란
UV: 자외선 조사
SPPS: 고체 상 펩티드 합성
HPLC: 고-성능 액체 크로마토그래피
Z: 벤질옥시카보닐
CIZ: p-클로로벤질옥시카보닐
화학 합성을 위한 물질 및 방법
a) 화합물
- 출발 폴리아민은 예를 들면, 시판되는 스퍼미딘, 스퍼민, 트리스-(2-아민에틸)아민, 페닐렌디아민, 디아미노에탄(프로판, 부탄, 펜탄, 헥산 등)이거나 통상적인 방법, 예를 들면, 측쇄 폴리아민을 생성하기 위해서 디아미노에탄(프로판, 부탄, 펜탄, 헥산 등), 아민, 스퍼미딘, 스퍼민과 같은 시판 아민의 시아노에틸화에 의해서 합성될 수 있다.
- 사용된 중합체는 고체상 펩티드 합성(Merrifield 합성)을 위해 시판되는 수지, 특히 수지 O-클로로트리틸 클로라이드, 수지 HMP이고, 이들은 유리산 작용성 그룹 또는 Rink형 수지를 운반하는 산물을 제공한다. 폴리아민산은 고체상에서 예비합성되고 브로모알킬 작용성 그룹 또는 ω-알데히드산을 운반하는 펩티드에서 직접 합성될 수 있다.
- 디옥타데실아민, 트리에틸아민, 트리플루오로아세트산, BOP, DMAP, 벤질 클로로포르메이트가 상업적 산물이다. NaCl 및 NaHCO3용액은 포화되고; KHSO4는 0.5 M이다.
b) 물리적 측정
양성자 NMR 스펙트럼이 Bruker 400 및 600 MHz 분광광도계에 기록된다.
질량 스펙트럼(MS)이 API-MS/III에서 수득된다.
c) 정제 및 분석 기술
a) 직접 상 크로마토그래피 조건
- 박층 크로마토그래피(TLC)는 0.2 mm 두께의 Merck 실리카 겔 판에서 수행된다. 이것은 UV(254 nm)를 사용하여 닌히드린으로 150 ℃로 가열함으로써 아민 또는 아미드를 나타내기 위해서 닌히드린의 에탄올 용액(40 mg/EtOH의 100 ml)을 분무함으로써(광 분무), 플루오레스카민으로 1급 아민을 나타내기 위해서 용액(40 mg/100 ml 아세톤)을 분무함으로써 또는 요오드로 판을 요오드 분말로 덮음으로써 전개된다.
- 직접 상 컬럼 크로마토그래피는 0.063 내지 0.200 mm 입자 크기의 Merck 60 실리카 겔에서 수행된다.
b) 분석 크로마토그래피 기술
HPLC 분석 (고 성능 액체 크로마토그래피)은 HITACHI D 2500 적분기-계산기, 오토샘플러 AS-2000A, 인텔리진 펌프 L-6200A 및 분석 분리를 위해서 220 nm로 세팅된 조절가능한 파장을 갖는 자외선-력 검출기 L-4000으로 장치된 Merck-Hitachi 장치에서 수행된다. 분석 분리를 위한 컬럼은 Perkin-Elmer의 BU-300 아쿠아포르 부틸 7 m, 300 A 300 x 4.6 mm 컬럼이다. 이동 상은 0.1 % TFA를 함유하는 탈무기수와 0.1 % TFA를 함유하는 아세토니트릴이다. 약 1 mg/ml 용액의 100 μl 루프 밸브로의 주입은 20 μl이다. 분석을 위한 유동 속도는 1 ml/분으로 세팅된다.
분리 조건:
용액 A 용액 B
HPLC를 위한 탈무기수 2500 ml 아세토니트릴 2500 ml
트리플루오로아세트산 2 ml 트리플루오로아세트산 2.5 ml
구배:
| 시간 (분) | 용매 A (%) | 용매 B (%) | 유동 속도 (ml/분) |
| 0 | 60 | 40 | 1 |
| 3 | 60 | 40 | 1 |
| 20 | 0 | 100 | 1 |
| 35 | 0 | 100 | 1 |
| 35.1 | 60 | 40 | 4 |
| 36.1 | 60 | 40 | 4 |
| 36.2 | 60 | 40 | 2 |
| 44 | 60 | 40 | 2 |
c) 예비 크로마토그래피 기술
장치를 UV 검출을 허용하는 구배 양식의 액체 상 크로마토그래피를 위해 세팅한다. 이러한 예비 쇄는 하기의 성분으로 구성된다:
펌프 A: 50 SC 헤드로 장치된 GILSON 모델 30
펌프 B: 50 SC 헤드로 장치된 GILSON 모델 303.
주입 루프: 25 SC 헤드로 장치된 GILSON 모델 303.
압력 모듈: GILSON 모델 806.
혼합기: 23 ml 헤드로 장치된 GILSON 모델 811 C.
UV 검출기: 예비 셀로 장치된 GILSON 모델 119.
분획 수집기: 21번 랙(rack)으로 장치된 GILSON 모델 202.
적분기: SHIMADZU 모델 C-R6A.
컬럼: VYDAC 모델 214 TP 1022로 시판되는 길이 25 cm 직경 2.2 cm의 스테인레스 강으로 제조된 컬럼 C4(10 mm).
정제될 산물의 용액은 15 ml/분의 유동 속도로 주입 펌프에 의해 컬럼으로 로딩되고, 용출물은 30 초 후에 튜브내 분획으로 회수된다. 검출기는 220 nm 및 235 nm의 파장으로 세팅된다.
이동 상은 하기의 방식으로 규정된다:
용액 A 용액 B
HPLC를 위한 탈무기수 2500 ml 아세토니트릴 2500 ml
트리플루오로아세트산 2 ml 트리플루오로아세트산 2.5 ml
구배:
| 시간 (분) | 용매 A (%) | 용매 B (%) | 유동 속도 (ml/분) |
| 0 | 70 | 30 | 18 |
| 10 | 70 | 30 | 18 |
| 80 | 0 | 100 | 18 |
| 120 | 0 | 100 | 18 |
d) 고체 상 펩티드 합성 기술 (SPPS)
고체 상 합성은 수공형의 SPPS 펩티드 합성을 위한 수동 반응기에서 수행되고 교반기는 Flask Shaker 모델 A5-6021이다. 폴리아민의 고체 상으로의 커플링의 변화 및 SPPS의 폴리아민의 보호의 변화는 Kaiser 시험[참조문헌: Kaiser, E., Colescolt, D.L., Bossinger, C.D. and Cook, P.I. Anal. Biochem. 34(2), 595 (1970)]에 의해서 모니터링된다.
SPPS를 위한 실시예에 사용되는 수지는 NOVABIOCHEM으로부터의 "클로로트리틸 클로라이드 수지"이다.
본 발명은 특히 유리한 성질을 지니는 핵산을 전달하기 위한 신규 유형의 제제에 관한 것이다. 좀더 상세하게는, 본 발명에 따른 화합물은 분자에 개선된 성질을 부여하는 신규 양이온성 영역을 운반하는 양이온성 지질이다. 이러한 양이온성 부분은 좀더 상세하게는 하나 이상의 아미딘 작용성 그룹을 운반하는 특정 폴리아민으로 표현된다.
본 발명의 제 1 주제는 좀더 상세하게는 화학식 1의 D, L 또는 DL 형태의 화합물, 및 이의 염에 관한 것이다.
상기식에서,
- R1, R2및 R3는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 그룹 -(CH2)q-NRR'을 의미하고, 여기에서
·q는 1 내지 6의 정수이고, q의 값은 상이한 그룹 R1, R2및 R3사이에 서로 독립적이며,
·R과 R'는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 화학식 2의 그룹을 의미하며,
r은 0 내지 6으로 다양할 수 있는 정수이며,
R5그룹은 서로 독립적으로 수소 원자 또는 탄화수소 잔기를 의미하며,
R1, R2및 R3중 적어도 하나가 화학식 2의 적어도 하나의 그룹을 포함하는 것으로 이해되며,
- m과 n은 서로 독립적으로 1 내지 6으로 다양할 수 있는 정수이며, n이 1 이상일 경우, m은 상이한 값을 지니고 R3는 화학식 1 내에서 상이한 의미를 지닐 수 있으며,
- p는 1 내지 6으로 다양할 수 있는 정수를 의미하며,
- R4는 화학식 3의 그룹을 의미하며,
여기에서,
·R7및 R8은 서로 독립적으로 수소 원자 또는 친수성 그룹을 의미하고, 그룹 R7및 R8중 적어도 하나는 수소와 상이하며,
·t는 0 내지 10 중에서 선택된 정수이며, R6, X, Y 및 s는 t가 1 이상의 정수일 경우 상이한 단위 [X-(CHR6)s-Y] 내의 상이한 의미를 지닐 수 있으며,
·X는 산소 또는 황 원자 또는 아미노 또는 알킬아미노 그룹을 의미하고, 알킬 치환체는 선형 또는 측쇄형이며 1 내지 8 개의 탄소 원자를 함유하며,
·Y는 카보닐 그룹 또는 메틸렌 그룹을 의미하며,
·R6는 수소 원자 또는 경우에 따라 치환된 천연 아미노산 측쇄를 의미하며,
·s는 1 내지 10의 다양한 정수를 의미하며, s가 1일 경우, R6는 경우에 따라 치환된 아미노산 측쇄를 의미하며, s가 1 이상일 경우, R6는 수소 원자를 의미한다.
상기에 사용된 용어 "DL 형태"란 D 및 L 형태의 임의 비율, 예를 들면, 동등 비율로의 혼합물을 의미한다.
본 발명의 목적상, "탄화수소 잔기"는 임의로 할로겐화되는 지방족 또는 방향족 알킬, 카바메이트 또는 아실 치환체를 의미하는 것으로 이해된다. 지방족 잔기 중에서, 좀더 상세하게는 임의로 할로겐화되는 사이클릭 또는 비사이클릭, 선형 또는 측쇄, 포화 또는 불포화 지방족 잔기가 언급될 수 있다. 좀더 바람직하게는, 이것은 1 내지 10 개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 잔기이다. 특히, 이것은 알카노일, 알킬 및 알킬카바메이트 치환체, 예를 들면, 포밀, 부틸, tert-부틸 또는 tert-부틸카바메이트 치환체를 의미한다. 본 발명의 변형에 있어서, R5는 tert-부틸카바메이트를 의미한다.
방향족 잔기 중에서, 좀더 상세하게는 벤질 및 이의 치환 유도체, 예를 들면, 클로로벤질, 벤질카바메이트 또는 클로로벤질카바메이트가 언급될 수 있다.
바람직하게는, R5는 tert-부틸카바메이트, 벤질카바메이트 또는 클로로벤질카바메이트를 의미한다.
본 발명의 제 1 변형에서, R5그룹 중의 하나는 수소 원자를, 다른 하나는 1 개 내지 10 개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 잔기를 의미한다.
본 발명의 제 2 변형에서, R5그룹 중의 하나는 수소 원자를, 다른 하나는 바람직하게는 벤질 및 이의 유도체 중에서 선택된 방향족 잔기를 의미한다.
본 발명의 기타 변형에서, 2 개의 R5그룹은 수소 원자를 의미한다.
유리하게도, R1, R2및/또는 R3는 수소와 상이하고 q가 2 또는 3의 값을 지니고 r이 0인 화학식 2의 화합물을 포함한다.
바람직하게는, 화학식 1의 화합물에서 m은 2, 3 및 4 중에서 선택된다.
상기에 나타낸 바와 같이, 화학식 3에서 그룹 R7및 R8중 적어도 하나는 친지성 그룹을 의미한다. 본 발명의 목적상, "친지성 그룹"은 당분야 기술자들에게 공지된 세포 침투를 촉진하는 소수성 지질 형태의 그룹을 의미하는 것으로 이해된다. 이것은 특히 바람직하게는 라멜라 또는 6각형 상, 또는 임의로 이들의 배합을 형성할 수 있는 하나 이상의 지방족 지방쇄, 스테로이드 유도체, 천연 또는 합성 지질을 의미할 수 있다. 이것은 좀더 상세하게는 임의로 할로겐화되는 5 개 내지 22 개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 측쇄, 포화 또는 불포화 지방족 라디칼을 의미할 수 있다. 이것은 또한 스테로이드 유도체 또는 그룹 (CH2)u-NH-R9(u는 2 내지 6의 정수이고 R9는 아실 라디칼, 예를 들면, 콜레스테릴 포르메이트, 아라키도닐 또는 콜산임)를 의미할 수 있다.
스테로이드 유도체의 기타 예는 특히 콜레스테롤, 콜레스탄올, 3-α-5-사이클로-5-α-콜레스탄-6-β-올, 콜산, 콜레스테릴 포르메이트, 코테스타닐 포르메이트, 3α,5-사이클로-5α-콜레스탄-6β-일 포르메이트, 콜레스테릴아민, 6-(1,5-디메틸헥실)-3a,5a-디메틸헥사데카하이드로사이클로펜타[a]사이클로프로파[2,3]-사이클로펜타[1,2-f]나프탈렌-10-일아민, 또는 콜레스타닐아민이다.
바람직하게는, 친지성 그룹은 10 개 내지 22 개의 탄소 원자, 바람직하게는 14 개, 16 개, 17 개, 18 개 또는 19 개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 라디칼이다. 특히 친지성 그룹 (CH2)13CH3, (CH2)15CH3, (CH2)16CH3, (CH2)17CH3, (CH2)18CH3및 올레일이 언급될 수 있다.
특정 양태에서, 두 그룹 R7및 R8은 상기에 정의된 바와 같은 친지성 그룹을 의미한다. 특히, 바람직한 양태에서, 각각의 그룹 R7및 R8은 5 개 내지 22 개의 탄소 원자, 훨씬 더 바람직하게는 12 개 내지 22 개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 쇄를 의미한다.
본 발명의 변형에 있어서, R6는 천연 아미노산의 측쇄를 의미한다. 특히 천연 아미노산의 측쇄는 아미디늄 단위, 예를 들면, 아르기닌의 측쇄를 함유할 수 있다. 이러한 측쇄 R6는 또한 상기에 언급된 바와 같이 1 개 내지 24 개의 탄소 원자를 함유하는 포화 또는 불포화 지방족 그룹일 수 있다. 예로서 콜레스테릴, 아라키도닐 또는 레티노일 라디칼에 의해서 치환된 아미노산 측쇄, 치환되거나 치환되지 않은 모노- 또는 폴리방향족 그룹, 예를 들면, 벤질옥시카보닐, 벤질 에스테르, 로다미닐 또는 바이오티닐유도체가 언급될 수 있다.
특히 유리한 양태에서, 청구된 화합물은 또한 이들이 연계되는 핵산의 전달을 배향할 수 있게 하는 표적화 성분을 포함한다. 이러한 표적화 성분은 바람직하게는 화학식 1의 화합물에 치환체 R6에 의해서 표시되는 아미노산 측쇄의 수준으로 혼입된다. 좀더 바람직하게는, 표적화 성분은 본 발명에 따른 화합물에 공유 또는 비공유 결합된다.
이것은 특정 세포 유형 또는 원하는 특정 조직(종양 세포, 간 세포, 조혈 세포 등)을 향해 핵산의 전달을 배향할 수 있게 하는 세포외 표적화 성분일 수 있다. 이에 관하여, 이것은 표적화된 세포 유형의 표면에 존재하는 세포 수용체를 위한 리간드, 예를 들면, 당, 폴레이트, 트랜스페린, 인슐린, 아시알로오로소뮤코이드 단백질 또는 세포외 수용체에 의해서 인식되는 여타 생활성 분자일 수 있다. 이것은 또한 특정한 우선적 세포 구획(미토콘드리아, 핵 등), 예를 들면, 형질감염된 DNA의 핵 내부로의 축적을 촉진하는 핵 편재 시그널(nls) 서열을 향해 핵산의 전달을 배향할 수 있게 하는 세포내 표적화 성분일 수 있다.
좀더 일반적으로, 본 발명이 구성 내에서 사용될 수 있는 표적화 성분에는 당, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 스테로이드 또는 지질이 포함된다. 바람직하게는, 이들은 당 및/또는 펩티드, 예를 들면, 항체 또는 항체 단편, 세포 수용체 또는 이의 단편을 위한 리간드, 수용체 또는 수용체의 단편 등이다. 특히, 이들은 생장 인자를 위한 수용체, 시토카인을 위한 수용체, 세포 렉틴을 위한 수용체 또는 인테그린과 같은 접착 단백질을 위한 수용체용 리간드일 수 있다. 또한, 트랜스페린, HDL 지질 및 LDL을 위한 수용체가 언급될 수 있다. 표적화 성분은 또한 아시알로당단백질과 같은 렉틴을 표적화할 수 있게 하는 당 또는 이뮤노글로불린 Fc 단편을 위한 수용체를 표적화할 수 있게 하는 항체 Fab 단편일 수 있다.
또한, 화학식 1의 화합물을 예를 들면, R6아미노산 측쇄 상의 바이오틴, 로다민 또는 폴레이트 유형의 마커와 결합시킴을 고려함이 가능하다. 이러한 마커는 또한 인테그린형의 접착 단백질의 제 1 및/또는 제 2 수용체를 인식하기 위한 Arg-Gly-Asp 에피토프를 함유하는 선형 또는 순환 펩티드 또는 슈도펩티드 서열일 수 있다.
본 발명에 따른 특정 패밀리는 R1이 화학식 2의 그룹을 포함하고 R2과 R3가 수소 원자인 것이다.
본 발명에 따른 제 2의 특정 패밀리는 R1, R2및 R3가 각각 화학식 2의 그룹을 포함하고 R3가 수소 원자인 것이다.
본 발명에 따른 다른 특정 패밀리는 R1과 R3가 각각 화학식 2의 그룹을 포함하고 R2가 수소 원자인 것이다.
본 발명에 따른 다른 특정 패밀리는 R1, R2및 R3가 각각 화학식 2의 그룹을 포함하는 것이다.
본 발명에 따른 화학식 1의 신규 화합물은 바람직하게는 비독성의 약학적으로 허용되는 염의 형태로 제공될 수 있다. 이들 비독성 염은 무기산(염산, 황산, 하이드로브롬산, 인산 또는 질산), 유기산(아세트산, 프로피온산, 숙신산, 말레산, 하이드록시말레산, 벤조산, 푸마르산, 메탄설폰산 또는 옥살산) 또는 무기 염기(나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드, 리튬 하이드록사이드, 칼슘 하이드록사이드) 또는 유기 염기(3급 아민, 예를 들면, 트리에틸아민, 피페리딘, 벤질아민)로 형성된 염을 포함한다.
예로서, 좀더 상세하게 하기 화학식에 의해서 정의되는 본 발명에 따른 화합물이 언급될 수 있다:
상기식에서,
R4와 R5는 상기에 정의된 바와 같다.
본 발명에 따른 핵산 전달제의 예로서, 하기 화학식의 화합물이 언급될 수 있다.
본 발명의 화합물은 다양한 방법, 특히 용액에서의 합성 및/또는 중합 지지체 상에서의 고체상 합성에 의해 제조될 수 있다.
합성의 제 1 경로에 따라서, 화학식 1의 본 발명의 화합물은 아민이 임의로 보호되는 유레아의 티오 또는 옥소 유도체를 화학식 8의 리포폴리아민과 반응시킴으로써 수득될 수 있다.
상기식에서,
R'1, R'2, R'3는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 그룹 (CH2)q-NR9R10을 의미하고, 여기에서 q는 1 내지 6으로 다양할 수 있고, 상이한 형태의 q는 서로 독립적일 수 있으며,
R9및 R10은 서로 독립적으로 수소 원자 또는 (CH2)r-NH2의 그룹을 의미하며 여기에서 r은 서로 독립적으로 1 내지 6으로 다양할 수 있으며,
m, n, p 및 R4는 상기에 정의된 바와 같다.
유레아 유도체의 작용은 일반적으로 염기의 존재하에 적합한 양성자성 또는 비양성자성 용매에서 0 ℃ 내지 100 ℃의 온도에서 수행된다.
사용되는 염기는 일반적으로 비친핵성 염기, 예를 들면, 4급 아민, 나트륨 카보네이트 또는 나트륨 바이카보네이트이다. 유리하게도, 3급 아민은 예를 들면, 트리에틸아민(TEA) 또는 N-에틸디이소프로필(DIEA)이 사용된다.
반응은 유리하게도 용매, 예를 들면, 물, 알콜(메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등), 디메틸포름아미드, 디클로로메탄, 클로로포름, 톨루엔, 탄소 테트라클로라이드, 벤젠, 아세토니트릴, N-메틸피롤리돈 등에서 수행된다. 바람직하게는, 반응 온도는 20 ℃ 내지 60 ℃, 훨씬 더 바람직하게는 30 ℃ 내지 50 ℃이다.
가장 특히 유리한 유레아 유도체는 예를 들면, O-메틸이소유레아[참조문헌: J. Med. Chem., 38(1995) 16, 3053-3061], S-메틸이소티오유레아 헤미설페이트[참조문헌: Int. J. Pept. Prot. Res., 40(1992), 119-126], 비스-Boc-티오유레아[참조문헌: Tet. Lett. 48(1993), 7677-7680], N,N'-비스(벤질옥시카보닐)-S-메틸이소티오유레아 또는 N,N'-비스(tert-부톡시카보닐)-S-메틸이소티오유레아[참조문헌: Synth. Commun., 26(1996), 2, 407-413]이다.
화학식 8의 리포폴리아민은 본 출원에 참조로 인용되는 특허원 WO97/18185에 기재된 방법에 따라서 또는 당분야 기술자들에게 공지된 여타의 유사한 방법에 의해서 수득된다.
본 발명에 따라서, 화학식 1의 전달제는 또한 화학식 9의 산간의 펩티드 커플링 및 지질 분자 R4H에 의해서 수득될 수 있다;
상기식에서,
R1, R2, R3, m, n, p 및 R4는 상기와 같이 정의된다.
펩티드 커플링은 통상적인 방법[참조문헌: Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag] 또는 당분야 기술자들에게 공지된 여타의 유사한 방법에 의해서 수행된다.
특히, 반응은 일반적으로 비친핵성 염기의 존재하에 적당한 비양성자성 용매에서 0 내지 100 ℃의 온도에서 pH가 9 내지 11로 조절되도록 수행된다.
예로서, 클로로포름, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 아세토니트릴, 디클로로메탄, 톨루엔 또는 벤젠이 용매로서 사용될 수 있다.
사용되는 친핵성 염기는 바람직하게는 아민, 칼슘 카보네이트 또는 나트륨 3급 아민이다. 훨씬 더 바람직하게는, 사용되는 염기는 3급 아민, 예를 들면, 트리에틸아민(TEA) 또는 N-에틸디이소프로필아민(DIEA)이다.
유리하게는, 반응은 0 ℃ 내지 50 ℃, 좀더 바람직하게는 10 ℃ 내지 30 ℃의 온도에서 수행된다.
R4가 상기와 같이 정의되는 화학식 R4H의 지질 분자가 화학식 10의 시판 화합물간의 펩티드 커플링 및 화학식 NHR7R8의 아민에 의해서 수득될 수 있다.
상기식에서, X, Y, s, t, R6, R7및 R8은 상기와 같이 정의된다.
펩티드 커플링은 통상적인 방법[참조문헌: Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag] 또는 당분야 기술자들에게 공지된 여타의 유사한 방법에 의해서 수행된다.
특히, 반응은 일반적으로 비친핵성 염기의 존재하에 적당한 비양성자성 용매에서 0 내지 100 ℃의 온도에서 pH가 9 내지 11로 조절되도록 수행된다.
화학식 9의 화합물이 하기와 같은 3-단계 고체 상 합성 경로에 따라서 수득될 수 있다:
- 화학식 11의 폴리아민을 화학식 12의 융합 화합물을 수득하기 위해서 중합 지지체 P에서 융합시킨다.
상기식에서, R'1, R'2, R'3, m 및 n은 상기와 같이 정의된다.
반응은 바람직하게는 0 ℃ 내지 100 ℃의 온도에서 적합한 비양성자성 용매, 예를 들면, 클로로포름, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 아세토니트릴, 톨루엔, 벤젠 등의 존재하에 수행된다. 유리하게는, 반응 온도는 실온이다.
다양한 중합 지지체가 적합하다. 시판 수지가 유리하게는 고체 상 펩티드 합성(Merrifield 합성)을 위해 선택된다. 특히, 유리산 작용을 운반하는 산물을 제공하는 O-클로로트리틸 클로라이드 수지 또는 HMP 수지 또는 Rink형의 수지가 선택될 수 있다. 폴리아미노산은 고체상에서 예비합성되고 브로모알킬 작용을 운반하는 펩티드 또는 ω-알데히드산에서 직접 합성될 수 있다.
적당한 수지의 생성에 사용되는 알킬화제는 알킬화 방법의 작용으로서 선택된다. 통상적인 알킬화를 위해서, 예를 들어 브로모아세트산 또는 ω-할로카복실산이 선택된다. 환원 알킬화를 위해서, 예를 들어 ω-알데히드카복실산, 예를 들면, 글리옥살산, 숙신산 반알데히드 등, 또는 케토산, 예를 들면, 아세토아세트산 또는 피루브산 등이 선택된다.
화학식 11의 출발 폴리아민은 시판되는, 예를 들면, 스퍼미딘, 스퍼민, 트리스(2-아미노에틸)아민, 페닐렌디아민, 디아미노에탄(프로판, 부탄, 펜탄, 헥산 등)이거나 측쇄 폴리아민을 수득하기 위해서 통상적인 방법, 예를 들면, 시판되는 아민, 예를 들면, 디아미노에탄(프로판, 부탄, 펜탄, 헥산 등) 아민, 스퍼미딘, 스퍼민의 시아노에틸화에 의해서 합성될 수 있다.
- 제 2 단계에서, 화학식 12의 융합된 화합물은 화학식 13의 융합된 폴리아미노아미딘 화합물을 수득하기 위해서 아민이 임의로 보호되는 유레아의 티오 또는 옥소 유도체와 반응한다.
상기식에서, R1, R2, R3, m, n 및 p는 상기와 같이 정의된다.
반응이 당분야 기술자들에게 공지된 방법[참조문헌: Bergeron, R. J. and McManis, Total synthesis of 15-Deoxyspergualin, J. Org. Chem., 1987, 52, 1700-1703]에 따라서 또는 유사 방법에 따라서 수행된다.
반응은 보통 -20 ℃ 내지 100 ℃의 온도에서 양성자성 또는 비양성자성 용매의 존재하에 수행된다.
예로서, 물, 알콜(메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등), 디메틸포름아미드, 디클로로메탄, 클로로포름, 방향족 용매(톨루엔, 벤젠 등), 탄소 테트라클로라이드, 아세토니트릴, N-메틸피롤리돈 등이 용매로서 사용된다.
좀더 상세하게는 유리한 유레아의 유도체는 예를 들면, O-메틸이소유레아[참조문헌: J. Med. Chem., 38(1995) 16, 3053-3061], S-메틸이소티오유레아 헤미설페이트[참조문헌: Int. J. Pept. Prot. Res., 40(1992), 119-126], 비스-Boc-티오유레아[참조문헌: Tet. Lett. 48(1993), 7677-7680], N,N'-비스(벤질옥시카보닐)-S-메틸이소티오유레아 또는 N,N'-비스(tert-부톡시카보닐)-S-메틸이소티오유레아[참조문헌: Synth. Commun., 26(1996), 2, 407-413]이다.
- 마지막으로, 최종 단계에서, 화학식 13의 융합된 폴리아미노아미딘을 상기에 정의된 화학식 9의 산을 생성하기 위해서 중합 지지체로부터 절단한다. 절단은 당분야 기술자들에게 공지된 통상의 방법에 따라서 수행된다. 특히, 절차는 나머지 분자를 분해하지 않는 약산의 작용에 의해서 수행된다. 바람직한 약산은 예를 들면, 불화 알콜, 좀더 바람직하게는 1,1,1-트리플루오로에탄-2-올이다.
화학식 13의 폴리아미노아미딘이 산, 아미노, 알킬아미노 및/또는 아미딘 작용을 함유한다고 가정하면, 경우에 따라 이들을 중합 지지체로부터 절단하기 전에 보호하는 것이 바람직하다. 보호는 이의 사용 및 제거가 나머지 분자를 변형시키지 않는 여타의 상용성 그룹에 의해서 달성될 수 있다. 특히, 절차는 문헌[참조: T.W. GREENE, Protective Groups in Organic Synthesis, A. Wiley-Interscience Publication (1981), McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press (1973)]에 기재된 방법에 따라서 수행된다.
경우에 따라 보호 라디칼의 제거는 중합 지지체로부터의 절단 후에 수득된 화학식 9의 산 간의 펩티드 커플링 및 당분야 기술자들에게 공지된 통상의 방법에 따른 화학식 R4H의 화합물에 앞서 수행된다.
예로서, 보호 그룹은 트리메틸실릴, 벤즈하이드릴, 테트라하이드로피라닐, 포르밀, 아세틸, 클로르아세틸, 트리클로로아세틸, 트리플루오로아세틸, 에톡시카보닐, tert-부톡시카보닐, 트리클로로에톡시카보닐, 벤질옥시카보닐 및 플루오레닐옥시카보닐 라디칼 등 중에서 선택될 수 있다.
당분야 기술자들에게 공지된 기타 방법, 특히 본 발명에 따른 핵산 전달제를 유발시키는 문헌[참조: Bodanski M., Principles and Practice of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag]에 기재된 방법이 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
본 발명의 다른 주제는 상기에 기재된 시제 및 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 화합물 및 핵산은 화합물의 양전하 대 핵산의 음전하의 비 R이 0.1 내지 50, 좀더 바람직하게는 0.1 내지 20이도록 하는 양으로 존재한다. 이러한 비는 사용되는 화합물, 핵산 및 원하는 적용(특히 형질감염될 세포의 유형)에 따라서 당분야 기술자들에 의해서 쉽게 조절될 수 있다.
본 발명의 목적상, "핵산"은 디옥시리보핵산과 리보핵산 모두를 의미하는 것으로 이해된다. 이들은 천연 또는 인공 서열, 특히 게놈 DNA(gDNA), 상보적 DNA(cDNA), 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열, 변형되거나 변형되지 않는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 핵산은 인간, 동물, 식물, 세균 또는 바이러스 기원 등일 수 있다. 이들은 당분야 기술자들에게 공지된 기술, 특히 라이브러리의 스크리닝, 화학적 합성, 또는 라이브러리의 스크리닝에 의해서 수득되는 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합 방법에 의해서 수득될 수 있다. 이들은 화학적으로 변형될 수 있다.
디옥시리보핵산에 관하여 좀더 상세하게는 일본쇄 또는 이본쇄, 및 짧은 올리고뉴클레오티드 또는 그 이상의 긴 서열일 수 있다. 특히, 핵산은 유리하게는 플라스미드, 벡터, 에피솜, 발현 카세트 등으로 이루어진다. 이들 디옥시리보핵산은 표적 세포, 하나 이상의 마커 유전자, 전사 또는 복제를 조절하기 위한 서열, 해당 치료 유전자, 변형되거나 변형되지 않는 안티-센스 서열, 기타 세포 성분에 결합하기 위한 영역 등에서 작용성이거나 그렇지 않은 복제 기원을 운반할 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 하나 이상의 프로모터 및 표적 세포에서 활성인 전사 종결자의 조절 하에 하나 이상의 해당 치료 유전자로 이루어진 발현 카세트를 포함한다.
본 발명의 목적상, 해당 치료 유전자는 특히 치료 효과를 갖는 단백질 산물을 암호화하는 유전자를 의미하는 것으로 이해된다. 이렇게 하여 암호화된 단백질 산물은 특히 단백질이거나 펩티드일 수 있다. 이러한 단백질 산물은 표적 세포, 즉, 표적 세포가 병리상태를 나타내지 않을 경우 표적 세포에서 정상적으로 발현되는 산물에 대해서 외생성, 상동성 또는 내생성일 수 있다. 이러한 경우에, 단백질의 발현은 예를 들면, 세포의 불충분한 발현 또는 변형으로 인하여 불활성이거나 약하게 활성인 단백질의 발현을 극복하거나 이러한 단백질을 과잉발현함을 가능하게 한다. 해당 치료 유전자는 또한 증가된 안정성, 변형된 활성 등을 갖는 세포 단백질의 돌연변이체를 암호화할 수 있다. 단백질 산물은 또한 표적 세포에 관하여 이형일 수 있다. 이러한 경우에, 발현된 단백질은 예를 들면, 세포에 부족한 활성을 보충하거나 제공하여 세포가 병리상태를 퇴치하거나 면역 반응을 자극하게 한다.
본 발명의 목적상 치료 산물 중에서, 좀더 상세하게는 효소, 혈액 유도체 호르몬, 림포카인, 인터류킨, 인터페론, TNF 등(FR 92/03120), 생장 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자(BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/플레이오트로핀 등), 아포지단백질(ApoAI, ApoAIV, ApoE 등, FR 93/05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 91/11947), 방광 섬유증과 연계된 CFTR 단백질, 종양 억제 유전자(p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등, FR 93/04745), 응고에 수반되는 인자를 암호화하는 유전자(인자 VII, VIII, IX), DNA 복구에 수반되는 유전자, 자기불활화 유전자(티미딘 키나제, 시토신 디아미나제), 헤모글로빈 또는 기타 단백질성 수송체, 대사 또는 이화 효소 등이 언급될 수 있다.
해당 치료 핵산은 또한 표적 세포의 발현이 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절함을 가능하게 하는 안티-센스 유전자 또는 서열일 수 있다. 이러한 서열은 예를 들면, 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사될 수 있고 이에 따라 특허 EP 140,308에 기재된 기술에 따른 단백질로의 이의 해독을 억제할 수 있다. 치료 유전자는 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있는 리보자임을 암호화하는 서열을 포함한다(EP 321,201).
핵산은 또한 인간 또는 동물에서 면역 반응을 생성할 수 있는 안티제닉 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 이러한 특정 양태에서, 본 발명은 백신 또는 면역치료 처치의 생성이 인간 또는 동물에, 특히 미생물, 바이러스 또는 암에 대해서 적용되도록 한다. 이것은 특히 엡스타인 바 바이러스, HIV 바이러스, 헤파티티스 B 바이러스(EP 185,573), 슈도라비즈 바이러스, "신시티아(syncitia) 형성 바이러스", 기타 바이러스에 특이적인 안티제닉 펩티드 또는 종양(EP 259,212)에 특이적인 안티제닉 펩티드를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 또한 원하는 세포 또는 기관에 해당 치료 유전자 및/또는 안티제닉 펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 허용하는 서열을 포함한다. 이들은 이러한 서열이 감염된 세포에서 작용할 수 있는 경우에 고려되는 유전자의 발현을 자연히 책임지는 서열일 수 있다. 이들은 또한 상이한 기원의 서열일 수 있다(기타 단백질의 발현 또는 합성을 책임짐). 특히, 이들은 진핵 세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 이들은 감염시키기를 원하는 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 또한, 이들은 바이러스의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이에 관하여, 예를 들면, E1A, MLP, CMV 및 RSV 유전자 등의 프로모터가 언급될 수 있다. 또한, 이러한 발현 서열은 활성화 및 조절 서열 등의 첨가에 의해서 변형될 수 있다. 이들은 또한 유도 또는 억제 프로모터를 포함할 수 있다.
또한, 핵산은 또한 특히 표적 세포의 분비 경로에서 합성된 치료 산물을 인도하는 시그널인 해당 치료 유전자의 업스트림을 함유할 수 있다. 이러한 시그널 서열은 치료 산물의 천연 시그널 서열일 수 있지만, 이것은 또한 기타 작용성 시그널 서열 또는 인공 시그널 서열일 수 있다. 핵산은 또한 합성된 치료 산물을 특정 세포 구획을 향하여 인도하는 시그널 서열을 함유할 수 있다.
기타 양태에서, 본 발명은 핵산, 상기와 같은 형질감염제(I) 및 형질감염제/핵산 복합체와 결합하고 이의 형질감염력을 개선할 수 있는 하나 이상의 보조제를 함유할 수 있다. 이러한 형태의 보조제(예를 들면, 지질, 펩티드 또는 단백질)의 존재는 유리하게는 화합물의 형질감염력을 증가시킴을 가능하게 할 수 있다.
이에 관하여, 본 발명의 조성물은 보조제로서 하나 이상의 중성 지질을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 특히 핵지질 복합체의 전하비 R이 낮을 경우 특히 유리하다. 본 출원인은 사실상 중성 지질의 첨가가 핵지질 입자의 형성을 개선하고 막을 탈안정화시킴으로써 입자의 세포로의 침투를 촉진할 수 있게 함을 예시한다.
좀더 바람직하게는, 본 발명의 구성 내에서 사용되는 중성 지질은 2 개의 지방쇄를 함유하는 지질이다. 특히 유리한 방법에서, 생리학적 조건 하에서 양쪽성이거나 이온 전하가 부족한 천연 또는 합성 지질이 사용된다. 이들은 좀더 상세하게는 디올레오일포스패티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스패티딜에탄올아민(POPE), 디-스테아로일, -팔미토일 및 -미리스토일포스패티딜에탄올아민 및 1 내지 3 회 N-메틸화된 이의 유도체; 포스패티딜 글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로사이드(예를 들면, 특히 갈락토세레브로사이드), 스핀고지질(예를 들면, 스핑고마이엘린), 또는 아시알로갱글리오사이드(예를 들면, 특히 아시알로GM1 및 GM2) 중에서 선택될 수 있다.
이러한 상이한 지질은 당분야 기술자들에게 익히 공지된 통상의 기술에 의해서 합성, 또는 기관(예를 들면, 뇌) 또는 알로부터의 추출에 의해서 수득될 수 있다. 특히, 천연 지질의 추출은 유기 용매에 의해서 수행될 수 있다(Biochemistry 참조).
좀더 최근에, 본 출원인은 보조제로서 핵산의 응축시 직접 수반되거나 되지 않는 화합물을 사용함이 또한 특히 유리함을 설명하였다(WO 96/25508). 본 발명에 따른 조성물내 이러한 화합물의 존재는 형질감염 화합물의 양을 감소시킴을 가능하게 하고 이로부터 형질감염 활성에 대한 여타의 손상 효과 없이 유익한 결과가 독성학적 관점으로부터 유발된다. 핵산의 응축에 수반되는 화합물은 직접 또는 간접적으로 핵산을 압축시키는 화합물로 정의하고자 한다. 좀더 명확하게는, 이러한 화합물은 형질감염되는 핵산의 수준에서 직접 작용할 수 있지만 이러한 핵산의 응축에 직접 수반되는 추가의 화합물의 수준에서 수반될 수 있다. 바람직하게는, 이것은 핵산의 수준에서 직접 작용한다. 예를 들면, 예비압축제는 다양이온, 예를 들면, 폴리리신일 수 있다. 바람직한 양태에 따라서, 핵산의 응축에 수반되는 이러한 시제는 전부 또는 일부로서 프로트아민, 히스톤 또는 뉴클레올린 및/또는 이들의 유도체 중 하나로부터 유도된다. 이러한 시제는 또한 전부 또는 일부의 펩티드 단위(KTPKKAKKP) 및/또는 (ATPAKKAA)로 이루어지고, 단위 수가 2 내지 10으로 다양하게 할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물의 구조에서, 이러한 단위는 연속적으로 또는 불연속적으로 반복될 수 있다. 따라서, 이들은 생화학적 성질의 결합, 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 또는 화학적 성질의 결합에 의해서 분리될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 핵산 당량당(몰/몰) 0.01 내지 20 당량, 좀더 바람직하게는 0.5 내지 5 당량을 포함한다.
특히 유리한 양태에서, 본 발명의 조성물은 또한 핵산의 전달을 배향시킴을 가능하게 하는 표적 성분을 포함한다. 이러한 표적 성분은 원하는 특정 세포 유형 또는 특정 조직(종양 세포, 간세포, 조혈 세포 등)을 향한 DNA의 전달을 배향시킴을 가능하게 하는 세포외 표적 성분일 수 있다. 이것은 또한 특정한 바람직한 세포 구획(미토콘드리아, 핵 등)을 향한 핵산의 전달을 배향시킴을 가능하게 하는 세포내 표적 성분일 수 있다. 표적 성분은 본 발명에 따른 핵산 전달제 또는 또한 상기와 같은 핵산에 결합될 수 있다.
본 발명의 구성 내에 사용될 수 있는 표적 성분 중에, 당, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 지질, 신경매개체, 호르몬, 비타민 또는 이들의 유도체가 언급될 수 있다. 바람직하게는, 이것은 당, 펩티드 또는 단백질, 예를 들면, 항체 또는 항체 단편, 세포 수용체를 위한 리간드 또는 이의 단편, 수용체(들) 단편 등이다. 특히, 이것은 생장 인자 수용체, 시토카인 수용체, 세포 렉틴 유형의 수용체를 위한 리간드, 또는 인테그린과 같은 접착 단백질용 수용체에 대한 친화력을 갖는 RGD 서열을 함유하는 리간드일 수 있다. 또한 트랜스페린, HDL 및 LDL 또는 폴레이트 수송체를 위한 수용체가 언급될 수 있다. 표적 성분은 또한 아시알로당단백질을 위한 수용체와 같은 렉틴 또는 시알라이드 루이스 X 또는 항체 Fab 단편과 같은 사이알라이드, 또는 단일쇄 항체(ScFv)를 표적화함을 가능하게 하는 당일 수 있다.
표적화 성분의 핵지질 복합체와의 배합은 당분야 기술자들에게 공지된 기술에 의해서, 예를 들면, 소수성 부분 또는 본 발명에 따른 핵산과 상호작용하는 부분 또는 본 발명에 따른 전달제 또는 핵산과 상호작용하는 그룹에 커플링함으로써 수행될 수 있다. 바람직한 양식에 따른 해당 상호작용은 이온성 또는 공유성일 수 있다.
본 발명의 주제는 핵산(좀더 일반적으로 다음이온)의 세포로의 전달을 위한 상기에 정의된 바와 같은 화합물의 용도이다.
예를 들면, 유전자의 조절, 병리 상태의 동물 모델의 생성 또는 치료법을 연구하기 위한 생체내 용도를 위해서, 본 발명에 따른 조성물은 국소, 피부, 경구, 직장, 질, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피, 기관내 또는 복막내 경로 등에 의한 투여를 위해 제형될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 주사 제형, 특히 원하는 기관으로의 직접 주사 또는 국소 경로(피부 및/또는 근육 막에서)에 의한 투여에 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성 멸균 용액이거나 특히 경우에 따라 멸균수 또는 생리 식염수의 첨가시 주사 용액의 구성을 허용하는 동결 건조 조성물일 수 있다. 주사를 위해 사용된 핵산의 용량 및 투여의 수는 다양한 파라미터, 특히 사용된 투여 양식, 관련 병리 상태, 발현될 유전자 또는 원하는 치료 기간에 따라서 변형될 수 있다. 투여 양식에 관하여 좀더 상세하게는 이것은 예를 들면, 종양 또는 순환계의 수준에서 조직으로의 직접 주사 또는 배양물 중의 세포의 치료에 이어 주사 또는 이식에 의한 생체내 재주입일 수 있다. 본 발명의 구성 내의 관련 조직 또는 순환계는 예를 들면, 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 췌장, 골수, 흉선, 심장, 임파선, 혈액, 뼈, 연골, 장, 정소, 난소, 직장, 신경계, 눈, 선, 연결 조직 등이다.
본 발명은 또한 (1) 핵산을 상기에 정의된 바와 같은 전달제와 접촉시켜 복합체를 형성하고,
(2) 세포를 (1)에서 형성된 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 핵산의 세포로의 전달 방법에 관한 것이다.
세포를 복합체와 함께 배양함으로써(시험관내 또는 생체외 사용을 위해) 또는 복합체를 기관으로 주입함으로써(생체내 사용을 위해) 복합체와 접촉시킬 수 있다. 배양은 바람직하게는 예를 들면, 106세포당 0.01 내지 1000 μg의 핵산의 존재하에 수행된다. 생체내 투여를 위해서, 예를 들면, 0.01 내지 10 mg의 핵산 용량이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 경우에, 또한 상기에 정의된 바와 같은 하나 이상의 보조제 및/또는 표적 성분, 보조제 및/또는 표적 성분이 미리 본 발명에 따른 전달제와 또는 핵산과 혼합된다.
따라서, 본 발명은 특히 핵산 전달, 특히 상기에 정의된 바와 같은 조건 하에서 화학식 1의 전달제와 배합하여 질병을 치유할 수 있는 핵산의 시험관내, 생체내 또는 생체외 투여를 포함하는 질병의 치료를 위한 유리한 방법을 제공한다. 좀더 상세하게는, 이러한 방법은 단백질 또는 핵산 산물의 결손으로부터 초래된 질병에 적용될 수 있고, 투여된 핵산은 단백질 산물을 암호화하거나 핵산 산물로 전사되거나 핵산 산물을 구성한다.
본 발명은 또한 세포의 생체내, 생체외 또는 시험관내 형질감염을 위한 본 발명에 따른 화학식 1의 전달제의 용도로 확대된다.
본 발명의 화합물은 특히 핵산의 1차 세포 또는 성립된 세포주로의 전달에 사용될 수 있다. 이들은 분화되거나 다수효능 형태(전구체)의 섬유아세포, 근육 세포, 신경 세포(뉴런, 성상세포, 신경교세포), 간세포, 조혈 세포주의 세포(림프구, CD34, 수지상 돌기 세포 등), 상피 세포 등일 수 있다.
상기의 특성 외에도, 본 발명은 또한 하기의 실시예 및 도면으로부터 나타날 기타 특성 및 장점을 포함하고, 이는 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서 본 발명을 설명하는 것으로서 고려되어야 한다.
실시예 1: 화합물 120535(이의 제조가 본원에 참조로 인용되는 특허원 WO 97/18185에 기재되어 있음)로부터의 (N-디옥타데실카바모일메틸-2-{3-[4-(3-구아니디노프로필아미노)-부틸아미노]프로필아미노}아세트아미드인 화합물 1 의 합성
합성 단계가 도 1/15에 도시되어 있다.
RPR 120535 0.784 mmol을 자기 교반기 바가 장치된 둥근 바닥 플라스크 중의 메탄올 25 ml에 용해시킨다. 트리에틸아민 TEA 10.21 mmol을 이 용액에 첨가한다. 이어서, 9 ml 물 중의 O-메틸이소유레아/황산의 용액 1.173 mmol을 혼합물 위로 서서히(5 분) 따른다. 따른 후, 불투명해진다. 혼합물을 40 ℃에서 16 시간 동안 유지시킨 다음 용액을 증발건조시킨다. 이어서 수득된 산물을 예비 HPLC에 의해서 정제한다. 해당 분획을 합하고 동결 건조시킨다. 염화 화합물 1이 0.157 mmol, 즉, 수율 20.1 %로 수득된다.
HPLC분석: Rt = 14.94 분.
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, δ(ppm)): 0.86 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.24 (mt, 60 H: 지방쇄의 중앙 (CH2)15그룹), 1.43 및 1.53 (2 mts, 2H 각각: 각 지방쇄의 1 CH2); 1.63 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2그룹); 1.81 및 1.96 (2 mts, 2H 각각: 프로필의 CH2); 2.85 내지 3.10 및 3.22 (2 mts, 총 16H: 부틸의 NCH2- 프로필의 NCH2및 지방쇄의 NCH2); 3.81 (광범위 s, 2H: NCH2CON); 4.03 (d, J = 4.5 Hz, 2H: 글리실의 CONCH2CON); 7.32 - 7.97 - 8.62 - 8.75 및 9.02 (각각 미해결 화합물 - t - t - 미해결 화합물 및 미해결 화합물: 교환가능한 양성자에 상응하는 H).
MH+= 863
실시예 2: 화합물 120527(이의 제조가 본원에 참조로 인용되는 특허원 WO 97/18185에 기재되어 있음)로부터의 (2-{2-[비스(2-구아니디노에틸)아미노]에틸아미노}-N,N-디옥타데실아세트아미드)인 화합물 2 의 합성
RPR 120527 48 μmol을 메탄올 10 ml에 용해시킨 다음 1,3-비스(tert-부톡시카보닐)-2-메틸-2-티오-슈도유레아(2.3 당량) 32 mg을 첨가한다. 반응을 HPLC에 의해서 모니터링한다. 24 시간 후, 용매를 증발시키고 1:1 용적비의 TFA/디클로로메탄 용액 20 ml를 수득된 잔사에 첨가한다. 진공 하에서 증발시킨 후, 잔사를 예비 HPLC에 의해서 정제한다. 해당 분획을 혼합하고 액체 질소에서 냉동시킨 다음 동결 건조시킨다. 이렇게 하여 화합물 2가 0.035 mmol, 즉, 수율 73 %로 수득된다.
분석 HPLC: Rt = 16.20 분.
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, δ(ppm)): 0.9 (m: 6H: CH3) 1.2 (m: 60H: CH2) 1.6 (m: 4H: CH2CH2N) 2.7-2.9 (m: 6H: CH2N(CH2)2) 3.0 (m: 2H: CH2CH2N(CH2)2) 3.2 (m: 8H: CH2N) 3.8 (m: 4H: CH2NCOCH2N).
MH+= 793
실시예 3: 화합물 122766(이의 제조가 본원에 참조로 인용되는 특허원 WO 97/18185에 기재되어 있음)으로부터의 (N-디옥타데실카바모일메틸-2-{3-[4-(3-구아니디노프로필아미노)-부틸아미노]프로필아미노}아세트아미드인 화합물 3 의 합성
RPR 122766 0.784 mmol을 자기 교반기 바가 장치된 둥근 바닥 플라스크 중의 메탄올 25 ml에 용해시킨다. 트리에틸아민 TEA 10.21 mmol을 이 용액에 첨가한다. 이어서, 9 ml 물 중의 O-메틸이소유레아/황산의 용액 1.173 mmol을 혼합물 위로 서서히(5 분) 따른다. 따른 후, 불투명해진다. 혼합물을 40 ℃에서 16 시간 동안 유지시킨 다음 용액을 증발건조시킨다. 이어서 수득된 산물을 예비 HPLC에 의해서 정제한다. 해당 분획을 합하고 동결 건조시킨다. 화합물 3이 0.2289 mmol, 즉, 수율 29 %로 수득된다.
분석 HPLC: Rt = 9.8 분.
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, δ(ppm)): 0.87 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.15 내지 1.40 (mt, 44 H: 지방쇄의 중앙 (CH2)11그룹); 1.46 및 1.55 (2 mts, 2H 각각: 각 지방쇄의 1 CH2); 1.63 (mt, 4H: 부틸의 중앙 CH2그룹); 1.81 및 1.95 (2 mts, 2H 각각: 프로필의 CH2); 2.85 내지 3.10 (mt, 10H: 부틸의 NCH2그룹- 2 개의 프로필 중 하나의 2 개의 NCH2그룹- 및 다른 한 프로필의 2 개의 NCH2중 하나); 3.15 내지 3.25 (mt, 6H: 다른 한 프로필의 다른 한 NCH2및 지방쇄의 NCH2); 3.82 (미해결 화합물, 2H: NCH2CON); 4.04 (d, J = 5 Hz, 2H: 글리실의 CONCH2CON); 7.00 내지 7.60 - 8.60 내지 8.75 및 9.00 (각각 광범위 미해결 화합물 및 2 개의 미해결 화합물, 3H - 5H 및 2H: NH3 +CF3COO-- NH2 +CF3COO-및 =NH); 7.78 (광범위 t, J = 5.5 Hz, 1H: N=CNH); 8.65 (미해결 화합물: CONH에 상응하는 1H).
MH+= 751
실시예 4: (2-{2-[비스(2-구아니디노에틸)아미노]에틸아미노}-N-디테트라데실카바모일-메틸아세트아미드)인 화합물 4 의 합성
단계 A: 트리스(아미노에틸)아민의 10 몰 과량을 디클로로메탄 50 ml에 용해시키고 용액을 브로모아세틸(클로로)트리틸 수지(브로모아세트산을 클로로트리틸 수지와 반응시킴으로써 미리 수득됨)를 함유하는 반응기로 도입한다. 반응기를 2 시간 동안 실온에서 교반시킨다. 용매를 여과시키고 수지를 디클로로메탄과 이소프로판올 50 ml로 10 회 세척한다. Kaiser 시험은 양성이다.
단계 B: 수득된 수지를 디클로로메탄에 용해된 1,3-비스(tert-부톡시카보닐) -2-메틸-e-티오슈도유레아 과량의 10 당량과 접촉시킨다. 용매를 여과시키고 수지를 디클로로메탄과 이소프로판올 50 ml로 10 회 세척한다. 저온에서의 3-분 Kaiser 시험은 음성이다.
단계 C: DIEA 50 mmol을 디클로로메탄 50 ml에 용해시키고, 혼합물을 단계 B에서 수득된 산물을 함유하는 반응기로 도입한다. 이어서, 디-tert-부틸 디카보네이트 48 mmol을 따른다. 반응기를 밤새 교반시킨다. 다음 날, Kaiser 시험은 음성이다. 용매를 여과시키고 수지를 또한 디클로로메탄과 이소프로판올 50 ml로 10 회, 에탄올 50 ml로 2 회, 에테르 50 ml로 2 회 세척한다. 이어서 수지를 질소 스트림 하에서 건조시킨다. Kaiser 시험은 여전히 음성이다.
단계 D: 단계 C에서 수득된 수지를 자기 교반기 바가 장치된 250 ml 둥근 바닥 플라스크로 도입한다. 디클로로메탄 50 ml와 1,1,1-트리플루오로에탄-2-올 25 ml로 이루어진 용액을 여기에 첨가하고 혼합물을 2 시간 동안 교반시킨다. 용액을 여과시키고 수지를 디클로로메탄 10 ml로 2 회 세척한다. 이렇게 하여 수득된 유기상을 합하고 진공 하에서 증발시킨다. 이어서 산물을 실리카 겔(용출물: 클로로포름/메탄올 8:2 용적비)에서 정제한다. 해당 분획을 합한 다음 진공 하에서 증발시켜 하기 화학식의 산물을 168 mg, 즉, 20 %의 수율로 생성한다.
TLC: Rf = 0.9.
MH+= 789.
단계 E: Boc-글리시닐-디-테트라데실아미드 9 mmol를 자기 교반기 바가 장치된 둥근 바닥 플라스크에 도입한다. 트리플루오로아세트산 30 ml를 4 ℃에서 첨가한다. 용액을 1 시간 동안 교반시키고 TFA를 진공 하에서 증발시킨다. 수득된 산물을 DMF 70 ml, 이어서 TEA 30 mmol을 첨가함으로써 재용해시키고 상기에서 수득된 산 9 mmol를 첨가한다. pH를 10으로 조정하고, BOP 33 mmol을 첨가한다. 용액을 2 시간 동안 교반시키고 TLC에 의해서 모니터링한다. 커플링 완성시, 칼륨 설페이트의 용액 700 ml를 첨가하고 산물을 에틸 아세테이트 100 ml로 3 회 추출한다. 유기 상을 칼륨 설페이트 50 ml로 3 회, 나트륨 카보네이트 50 ml로 3 회 및 나트륨 클로라이드 50 ml로 3 회 세척한다. 이어서, 이것을 마그네슘 설페이트로 건조시키고, 여과시킨 다음 진공 하에서 증발시킨다. 수득된 산물을 NMT, TLC 및 MS로 분석하고 이전의 정제과정 없이 수득된 산물에 첨가된 TFA 50 ml로 탈보호시킨다. 이어서 용액을 1시간 반 동안 교반시킨다. 마지막으로, TFA를 증발시키고 최종 산물을 반예비 HPLC로 정제한다.
화합물 4가 8.1 mmol, 즉, 이러한 최종 단계에 대해 90 %의 수율로 최종적으로 수득된다.
분석 HPLC: Rt = 11.4 분.
1H NMR (400 NHz, (CD3)2SO-d6, δ(ppm)): 0.89 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.15 내지 1.35 (mt, 44H: 지방쇄의 중앙 (CH2)11그룹); 1.45 및 1.54 (2 mts, 2H 각각: 각 지방쇄의 1 CH2); 2.65 - 2.78 - 3.06 및 3.23 (각각 t, J = 6.5 Hz - 광범위 t, J = 6.5 Hz - 미해결 화합물 및 mt, 각각 4H - 2H - 2H 및 8H: NCH2CH2N - 2 NCH2CH2NC=N 그룹 및 지방쇄의 NCH2그룹); 3.83 (광범위 s, 2H: NCH2CON); 4.04 (d, J = 5 Hz, 2H: 글리실의 CONCH2CON); 7.34 (광범위 미해결 화합물., = NH 및 NH2); 7.61 (t, J = 5.5 Hz, 2H: NH); 8.65 (t, J = 5 Hz, 1H: NH); 8.75 (미해결 화합물: NH).
MH+= 737
단계 E에 사용된 글리시닐-디-테트라데실아미드를 하기의 방법으로 미리 수득한다: BOC 치환체에 의해서 보호된 글리신 10 mmol와 디-테트라데실아민 10 mmol을 250 ml 둥근 바닥 플라스크에 도입한다. 클로로포름 100 ml를 여기에 첨가하고 혼합물을 완전한 용해가 수득될 때까지 교반시킨다. 이어서 TEA 30 mmol과 BOP 33 mmol을 첨가한다. pH를 트리에틸아민으로 10으로 유지한다. 반응물을 2 시간 동안 교반시킨다. TLC에 의해서 모니터링되는 반응의 완료시, 클로로포름을 증발시킨다. 고체를 수득하여 에틸 아세테이트 300 ml에 재용해시킨다. 이어서 유기상을 칼륨 설페이트 100 ml로 4 회, 나트륨 카보네이트 100 ml로 4 회 및 나트륨 클로라이드 100 ml로 4 회 세척한다. 이어서, 유기상을 마그네슘 설페이트로 건조시키고, 여과시키고 진공 하에서 증발시킨다. 수득된 산물을 TLC, NMR 및 MS로 분석하고 추가의 정제없이 사용한다.
실시예 5: (N-디테트라데실카바모일메틸-2-{(3-구아니디노프로필)-[4-(3-구아니디노프로필아미노)부틸]아미노}아세트아미드)인 화합물 5의 합성
절차를 출발 폴리아민으로서 스퍼민으로 출발함을 제외하고는 상기의 화합물 4에 대한 것과 동일한 방식으로 수행하여 하기의 화학식의 산을 생성한다:
수지로부터의 절단 후, 이 잔사를 실리카 겔(용출물: 클로로포름/메탄올 8:2 용적비)에서 정제한다. 해당 분획을 혼합한 다음 진공 하에서 증발시켜 분자를 0.69 mmol, 즉, 50 %의 수율로 생성한다.
TLC: Rf = 0.5.
MH+= 845.
화합물 5를 미리 합성된 산과 실시예 4에 기재된 것과 동일한 방법에 따른 글리시닐-디-테트라데실아미드간을 커플링함으로써 수득한다. 글리시닐-디-테트라데실아미드를 또한 상기와 동일한 방식으로 수득한다. 이렇게 하여 화합물 5가 0.65 mmol, 즉, 이 단계에 대한 94 %의 수율로 수득된다.
분석 HPLC: Rt = 10.1 분.
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, 393 K의 온도에서, δ(ppm)): 0.92 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.25 내지 1.45 (mt, 44H: 지방쇄의 중앙 (CH2)11그룹); 1.57 (mt, 4H: 부틸의 2 중앙 CH2그룹); 1.57 및 1.67 (2 mts, 2H 각각: 각 지방쇄의 1 CH2); 1.74 및 1.91 (2 mts, 2H 각각: 프로필의 중앙 CH2) 2.62 - 2.85 - 3.20 내지 3.35 (3 mts, 총 16H: NCH2그룹 - CH2NC=N 그룹 및 지방쇄의 NCH2그룹); 3.17 (s, 2H: NCH2CON); 4.02 (d, J = 5 Hz, 2H: 글리실의 CONCH2CON); 6.89 - 7.30 내지 7.55 및 7.65 (각각 미해결 화합물 - 광범위 미해결 화합물 및 미해결 화합물: 교환가능한 H 원자).
MH+= 845.
실시예 6: (2-{3-[{4-(비스(3-구아니디노프로필)아미노]부틸}-(3-구아니디노프로필)아미노]프로필아미노}-N-디테트라데실카바모일메틸아세트아미드)인 화합물 6의 합성
절차를 출발 폴리아민으로서 N,N-N',N'-(테트라아미노프로필)부틸렌디아민으로 출발함을 제외하고는 상기의 화합물 4 및 5에 대한 것과 동일한 방식으로 수행하여 하기의 화학식의 산을 생성한다:
수지로부터의 절단 후, 수득된 잔사를 실리카 겔(용출물: 클로로포름/메탄올 8:2 용적비)에서 정제한다. 해당 분획을 혼합한 다음 진공 하에서 증발시켜 산물을 0.099 mmol, 즉, 20 %의 수율로 생성한다.
TLC: Rf = 0.3.
MH+- 1201.
화합물 6을 미리 합성된 산과 실시예 4에 기재된 것과 동일한 방법에 따른 글리시닐-디-테트라데실아미드간을 커플링함으로써 수득한다. 글리시닐-디-테트라데실아미드를 또한 상기와 동일한 방식으로 수득한다. 이렇게 하여 화합물 6이 0.09 mmol, 즉, 이 단계에 대한 90 %의 수율로 수득된다.
분석 HPLC: Rt = 11.2 분.
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, CD3COOD-d4몇 방울의 첨가, δ(ppm)): 0.87 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.20 내지 1.40 (mt, 44H: 지방쇄의 중앙 (CH2)11그룹); 1.45 및 1.54 (2 mts, 2H 각각: 각 지방쇄의 1 CH2); 1.67 (mt, 4H: 부틸의 중앙 CH2그룹); 1.80 내지 2.10 (mt, 8H: 프로필의 중앙 CH2) 2.95 내지 3.30 (mt, 20H: 프로필의 NCH2그룹 및 부틸의 NCH2그룹); 3.15 내지 3.30 (mt, 4H: 지방산의 NCH2그룹); 3.84 (s, 2H: NCH2CON); 4.05 (s, 2H: 글리실의 CONCH2CON).
MH+= 949.
실시예 7: 유전 물질의 시험관내 형질감염을 위한 화합물 1의 사용
사용된 유전 물질:
사용된 핵산은 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 조절 하에서 루시페라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pXL2774 (WO97/10343)이다.
핵산 용액을 생리 식염수(0.15 M 나트륨 클로라이드 NaCl)에 20 μg/ml로 희석한다.
형질감염 용액 (사용하기 직전에 제조)
본 발명에 기재된 산물을 60 내지 240 μM의 농도로 물에 용해시키고 용적에 대한 용적을 DNA 용액과 혼합하며; 최종 염수 농도는 75 mM이다.
형질감염
세포를 적당한 조건 하에 24-웰 미세 플레이트(2 cm2/웰)에서 배양하고 지수 생장 상 및 50 내지 70 % 합류인 동안 형질감염시킨다.
세포를 혈청 단백질을 함유하지 않는 배지 500 μl로 2 회 세척하고 혈청 비함유 배지(혈청 부재시의 형질감염) 또는 완전 배지(혈청 존재시의 형질감염)에서 다시 생장시킨다. 형질감염 혼합물 50 μl[즉, 0.5 μg DNA/웰]를 세포[3 웰/조건 DNA 벡터]에 첨가한다. 세포를 혈청 부재시에 형질감염시킬 경우, 생장 배지를 적당량의 혈청으로 형질감염시킨 2 시간 후 보충한다.
형질감염 효율은 Promega 키트의 사용에 대해 부여된 권장에 따라서[루시페라제 분석 시스템] 루시페라제의 발현을 측정함으로써 형질감염 48 시간 후 측정한다. 형질감염 혼합물의 독성을 세포 용해물내 단백질 농도의 측정에 의해서 측정한다.
결과
화합물 1을 3 가지 상이한 세포주: NIH3T3 세포, HepG2 세포 및 HeLa 세포를 형질감염시키기 위한 DNA 벡터로서 양이온성 지질 RPR120535(TFA 염)[본원에 참조로 인용된 특허원 WO 97/18185]와 비교하여 사용한다. 이들 3 가지 세포 유형에 대해서, 현저한 독성은 제조가 실시예 1에 기재되어 있는 화합물 1에 대해 검출되지 않는다. 3 가지 세포 유형에서 화합물 1 및 비교를 위한 양이온성 지질에 대한 형질감염 효율이 도 2/15에 3 내지 12의 화합물 nmol/DNA μg 비에 대해 나타나 있다.
도 2/15로부터, 최대 형질감염 효율이 NIH3T3 세포에 있어서 6 nmol 양이온성 지질/DNA μg의 비에 대해 및 HeLa 또는 HepG2 세포에 있어서 9 nmol 양이온성 지질/DNA μg의 비에 대해 수득됨을 추론할 수 있다. 혈청 부재시 형질감염에 대해서, HeLa 또는 HepG2 세포에서 수득된 발현 수준은 비교하여 시험된 산물에 대해서 보다 화합물 1에 대해서 2 내지 4 배 더 높다.
도 3/15는 DNA와 복합된 상기와 동일한 기준 양이온성 지질(RPR120535)과 비교하여 화합물 1/DNA 복합체에 대한 형질감염 효율을 나타낸다. 백색 막대는 2 시간 동안 혈청의 부재시 핵지질 복합체에 대한 형질감염 효율을 나타낸다. 흑색 막대는 혈청의 존재시 핵지질 복합체에 대한 형질감염 효율을 나타낸다.
도 3/15로부터, 본 발명에 따른 형질감염제의 특정한 장점 중의 하나를 설명할 수 있다. 사실상, 혈청 단백질 존재시 또는 부재시의 형질감염이 본 발명의 화합물 1의 경우에 동일함이 관찰되지만, 반면에 비교를 위한 양이온성 지질로는, 혈청 단백질의 존재로 인하여 강한 억제가 관찰된다. 이것은 생체내 형질감염을 위해 특히 유리한 성질을 구성한다.
실시예 8: 유전 물질의 시험관내 형질감염을 위한 화합물 2, 3, 5 및 6의 사용
사용된 유전 물질:
사용된 핵산은 인간 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 조절 하에서 루시페라제를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pXL3031이다. 이러한 플라스미드 pXL3031이 도 15/15에 도시되어 있다. 이것은 당분야 기술자들에게 공지된 표준 프로토콜, 특히 문헌[참조: Maniatis T., Fritsch E.F. and Sambrook J., Methods in Molecular Biology: a Laboratory Manual, 1982, pp. 83-94, Cold Spring Harbor Lab., NY.]에 따라서 분리된다. 좀더 구체적으로, 사용되는 방법은 알칼리성 용해 방법 및 세슘 클로라이드 구배 정제이다.
형질감염:
세포를 24-웰 미세플레이트에서 적당한 조건 하에서 배양한다. 밤새 배양 후, 각 웰은 약 100,000 세포를 포함한다.
DMEM 0.5 ml 중의 DNA 1 μg을 함유하는 형질감염 혼합물을 혈청 부재시 각 웰에 도입한다. 형질감염 5 시간 후, 생장 배지를 적당량의 혈청(DMEM 및 태송아지 혈청, 10 %)으로 보충한다. 세포 용해물을 형질감염 24 시간 후 회수하고 형질감염 효율을 Promega 키트(루시페라제 검출 키트)의 사용에 대해 부여된 권장에 따라서 루시페라제의 활성을 측정함으로써 계산한다.
결과:
형질감염 수준이 도 4/15, 5/15, 6/15 및 7/15에 도시되어 있다.
매 시간, 형질감염 효율을 마이셀 형태의 지질에 대해서 측정하고 조지질(DOPE 또는 콜레스테롤)과 혼합한다. 이들 표로부터, 형질감염 수준이 매우 낮은 전하 비에서도 매우 높고 이로부터 유리한 결과가 독성에 대해 유발됨을 추론할 수 있다. 이것은 본 발명의 장점 중 하나를 구성한다. 사실상, 어떠한 아미딘 작용도 함유하지 않는 양이온성 지질로는, 이러한 형질감염 수준을 수득하기 위해서 일반적으로 증가된 독성을 초래하는 매우 높은 전하 비를 사용함이 종종 필요하다.
실시예 9: DNA에 대한 화합물 2, 3, 5 및 6의 친화력의 연구
사용된 핵산은 상기 실시예에 기재된 플라스미드 pXL3031이다.
복합체를 원하는 전하 비로 본 발명에서 정의된 적당량의 지질로 0.25 mg의 DNA/ml의 농도로 제조한다. 복합체를 5 % 글루코스를 함유하는 배지와 나트륨 클로라이드 20 mM 용액으로 제조한다. 핵지질 복합체 50 μl를 5 % 글루코스를 함유하는 용액 및 나트륨 클로라이드 20 mM 용액 950 μl으로 20 배 희석한다.
복합체의 크기는 Coulter N4+ 장치의 도움으로 역학적 광 산란에 의해서 유체역학 직경을 측정함으로써 측정한다.
모든 화합물에 대해서, 3 개의 개별 생리화학적 상이 전하비에 따라 설명된다:
- DNA가 양이온성 지질로 포화되지 않는, 즉, 혼합물에 존재하는 네이키드 DNA이고 DNA가 지질에 의해서 완전히 보호되지 않고 그러므로 효소에 의해 분해될 수 있음을 의미하는 상 A. 형성된 복합체는 전부 음으로 하전되고, 이는 세포막의 교차를 어렵게 한다. 따라서, DNA를 형질감염시키기 위해서 값이 이 영역에 존재하지 않는 것이 바람직하다.
- DNA가 양이온성 지질로 완전히 포화되고 복합체가 전부 중성이거나 약간 양성인 상 B. 이온 반발이 최대일 때, 이 상은 불안정하다. "가교 결합"의 현상이 일어날 수 있고, 복합체의 침전을 유발한다. 그러므로, 이 상태의 복합체는 주사제로서 사용될 수 없다.
- DNA가 지질로 과잉포화되고 그러므로 복합체가 전부 양성인 상 C. 그러므로, DNA는 지질에 의해서 완전히 보호되고 세포막(전부 음성)을 통한 이의 통과가 촉진된다. 그러므로, 상 C의 복합체는 핵산의 세포로의 전달에 사용하기에 특히 적합하다.
복합체가 전하 비의 함수로서 정해지는 상을 나타내는 표가 도 8/15, 9/15, 10/15 및 11/15에 도시되어 있다.
도 8/15, 9/15, 10/15 및 11/15는 상을 본 발명의 화합물과 아민 함유 동족체, 즉, 아미딘 또는 구아니딘 작용이 아미노 작용에 의해서 치환되는 양이온성 지질 사이의 전하 비의 함수로서 비교한다. 상 B가 훨씬 더 낮은 전하 비를 향하여 이동됨이 관찰된다. 따라서, 양이온성 헤드로의 아미딘 작용의 혼입은 DNA에 대한 화합물의 친화력의 증가에 기여한다. 이것은 DNA와 함께 형성한 복합체가 결과적으로 과도하게 높은 전하 비가 되지 않고 이로부터 독성에 대해 유리한 효과를 초래하면서 상 C에 사용될 수 있으므로 본 발명의 화합물의 중요한 성질을 구성한다.
DNA에 대한 본 발명의 화합물의 친화력은 또한 에티듐 브로마이드 첨가 후 형광 감소 측정의 도움으로 평가된다. 사실상, 지질에 의한 DNA의 에티듐 브로마이드는 DNA로의 결합의 표시이다.
따라서, 에티듐 브로마이드 1 mg/ml의 용액 4 μl를 제조된 복합체에 첨가한 다음, 형광을 260 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장에서 측정한다. DNA에 대해서 수득된 형광만이 100 %로서 정의된다.
결과가 도 12/15, 13/15 및 14/15의 표에 나타나 있다. 이러한 결과는 본 발명의 화합물이 DNA에 대해 매우 양호한 친화력를 지니고 이는 본 발명 화합물의 특히 유리한 성질을 구성함을 나타낸다.
Claims (34)
- 화학식 1의 D, L 또는 DL 형태의 리포폴리아민, 및 이의 염.화학식 1화학식 2화학식 3상기식에서,- R1, R2및 R3는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 그룹 -(CH2)q-NRR'을 의미하고, 여기에서·q는 1 내지 6의 정수이고, q의 값은 상이한 그룹 R1, R2및 R3사이에 서로 독립적이며,·R과 R'는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 화학식 2의 그룹을 의미하며,r은 0 내지 6으로 다양할 수 있는 정수이며,R5그룹은 서로 독립적으로 수소 원자 또는 탄화수소 잔기를 의미하며,R1, R2및 R3중 적어도 하나가 화학식 2의 적어도 하나의 그룹을 포함하는 것으로 이해되며,- m과 n은 서로 독립적으로 1 내지 6으로 다양할 수 있는 정수이며, n이 1 이상일 경우, m은 상이한 값을 지니고 R3는 화학식 1 내에서 상이한 의미를 지닐 수 있으며,- p는 1 내지 6으로 다양할 수 있는 정수를 의미하며,- R4는 화학식 3의 그룹을 의미하며,여기에서,·R7및 R8은 서로 독립적으로 수소 원자 또는 친수성 그룹을 의미하고, 그룹 R7및 R8중 적어도 하나는 수소와 상이하며,·t는 0 내지 10 중에서 선택된 정수이며, R6, X, Y 및 s는 t가 1 이상의 정수일 경우 상이한 단위 [X-(CHR6)s-Y] 내의 상이한 의미를 지닐 수 있으며,·X는 산소 또는 황 원자 또는 아미노 또는 알킬아미노 그룹을 의미하고, 알킬 치환체는 선형 또는 측쇄형이며 1 내지 8 개의 탄소 원자를 함유하며,·Y는 카보닐 그룹 또는 메틸렌 그룹을 의미하며,·R6는 수소 원자 또는 경우에 따라 치환된 천연 아미노산 측쇄를 의미하며,·s는 1 내지 10의 다양한 정수를 의미하며, s가 1일 경우, R6는 경우에 따라 치환된 아미노산 측쇄를 의미하며, s가 1 이상일 경우, R6는 수소 원자를 의미한다.
- 제 1 항에 있어서, 화학식 2의 그룹에서, R5가 수소 원자 또는 임의로 할로겐화되는 지방족 또는 방향족 탄화수소 잔사임을 특징으로 하는 화합물.
- 제 2 항에 있어서, 화학식 2에서, R5그룹 중의 하나가 수소 원자를 의미하고 다른 하나가 1 개 내지 10 개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 잔사 또는 바람직하게는 벤질 및 이의 유도체 중에서 선택된 방향족 잔사를 의미함을 특징으로 하는 화합물.
- 제 2 항에 있어서, 화학식 2에서, 2 개의 R5그룹이 수소 원자를 의미하는 화합물.
- 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, R1, R2및/또는 R3가 수소 원자와 상이하고 q가 값 2 또는 3이고 r이 0인 화학식 2를 포함함을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 1에서, m이 2, 3 및 4 중에서 선택됨을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 3에서, 그룹 R7과 R8중 적어도 하나가 하나 이상의 지방족 지방쇄, 스테로이드 유도체, 천연 또는 합성 지질 또는 이들의 배합으로 이루어진 친지성 그룹을 의미함을 특징으로 하는 화합물.
- 제 7 항에 있어서, 친지성 그룹이 임의로 할로겐화되는 5 개 내지 22 개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 측쇄, 포화 또는 불포화 지방족 라디칼로 의미됨을 특징으로 하는 화합물.
- 제 7 항에 있어서, 친지성 그룹이 콜레스테롤, 콜레스탄올, 3-α-5-사이클로-5-α-콜레스탄-6-β-올, 콜산, 콜레스테릴 포르메이트, 코테스타닐 포르메이트, 3α,5-사이클로-5α-콜레스탄-6β-일 포르메이트, 콜레스테릴아민, 6-(1,5-디메틸헥실)-3a,5a-디메틸헥사데카하이드로사이클로펜타[a]사이클로프로파[2,3]-사이클로펜타[1,2-f]나프탈렌-10-일아민, 또는 콜레스타닐아민 중에서 선택된 스테로이드 유도체로 의미됨을 특징으로 하는 화합물.
- 제 7 항에 있어서, 친지성 그룹이 u가 2 내지 6의 정수이고 R9가 아실 라디칼, 예를 들면, 콜레스테릴 포르메이트, 아라키도닐 또는 콜산인 그룹 (CH2)u-NH-R9로 의미됨을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 두 그룹 R7과 R8이 친지성 그룹을 의미함을 특징으로 하는 화합물.
- 제 11 항에 있어서, 두 그룹 R7과 R8이 5 개 내지 22 개, 바람직하게는 12 개 내지 22 개의 탄소 원자를 함유하는 지방쇄를 의미함을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, R1이 화학식 1의 그룹을 포함하고 R2와 R3가 수소 원자임을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, R1과 R2가 각각 화학식 2의 그룹을 포함하고 R3가 수소 원자임을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, R1과 R3가 각각 화학식 2의 그룹을 포함하고 R2가 수소 원자임을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, R1, R2및 R3가 각각 화학식 2의 그룹을 포함하는 화합물.
- 제 1 항 내지 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 또는 세포내 표적 성분과 배합함을 특징으로 하는 화합물.
- 제 17 항에 있어서, 표적 성분을 R6아미노산 측쇄의 수준에서 혼입함을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항 내지 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오틴, 로다민, 폴레이트 또는 Arg-Gly-Asp 에피토프를 포함하는 선형 또는 환형 펩티드 또는 슈도펩티드 서열을 포함하는 형태의 마커를 R6아미노산 측쇄의 수준에서 혼입함을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, R4 및 R5가 제 1 항에 기재된 의미를 갖는 하기 화학식의 화합물 중에서 선택됨을 특징으로 하는 화합물.화학식 4화학식 5화학식 6화학식 7
- 제 1 항에 있어서,중에서 선택됨을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항 내지 21 항 중 어느 한 항에 따른 화합물과 핵산을 포함하는 조성물.
- 제 22 항에 있어서, 또한 하나 이상의 보조제를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 23 항에 있어서, 보조제가 하나 이상의 중성 지질임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 23 항 또는 24 항에 있어서, 중성 지질이 2 개의 지방쇄를 함유하는 지질임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 23 항 내지 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 지질이 예를 들면, 디올레오일포스패티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스패티딜에탄올아민(POPE), 디-스테아로일, -팔미토일 및 -미리스토일포스패티딜에탄올아민 및 1 내지 3 회 N-메틸화된 이의 유도체; 포스패티딜 글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로사이드(예를 들면, 특히 갈락토세레브로사이드), 스핀고지질(예를 들면, 스핑고마이엘린), 또는 아시알로갱글리오사이드(예를 들면, 특히 아시알로GM1 및 GM2) 중에서 선택된 생리학적 조건 하에서 양쪽성이거나 이온 전하가 부족한 천연 또는 합성 지질임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 23 항에 있어서, 보조제가 핵산 응축의 수준에서 직접 또는 간접적으로 수반된 화합물임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 23 항 내지 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제가 전부 또는 일부로서 프로트아민, 히스톤 또는 뉴클레올린 및/또는 이들의 유도체 중 하나로부터 유도되거나 전부 또는 일부의 펩티드 단위(KTPKKAKKP) 및/또는 (ATPAKKAA)로 이루어지고, 단위 수가 2 내지 10으로 다양하게 할 수 있으며, 연속적으로 또는 불연속적으로 반복될 수 있음을 특징으로 하는 조성물.
- 제 22 항에 있어서, 표적 성분을 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 22 항 내지 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 제형을 위해 약학적으로 허용되는 비히클을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 22 항 내지 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 및/또는 점성 막으로의 적용에 약학적으로 허용되는 비히클을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 핵산의 세포로의 전달을 위한 제 1 항 내지 21 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
- 아민 그룹이 유레아의 티오 또는 옥소 유도체를 리포폴리아민과 반응시킴으로써 형성되거나 폴리아미노아미딘이 펩티드 커플링에 의해서 지질에 이식됨을 특징으로 하는 제 1 항 내지 21 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조방법.
- (1) 핵산을 제 1 항 내지 21 항에 정의된 화합물과, 경우에 따라 하나 이상의 보조제 및/또는 표적 성분과 함께 접촉시켜 복합체를 형성한 다음,(2) 세포를 (1)에서 형성된 복합체와 접촉시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 핵산의 세포로의 전달 방법.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PA0105 | International application |
Patent event date: 19991126 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
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| PG1501 | Laying open of application | ||
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| PA0201 | Request for examination |
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| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20050629 Patent event code: PE09021S01D |
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| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20050908 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20050629 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |