KR20000069664A - 안정한 액체 인터페론 제제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 pH가 4.0 내지 7.2인 액체 인터페론 조성물을 제공한다. 조성물은 인터페론-베타와, 산성 아미노산, 아르기닌 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산인 약 0.3 중량% 내지 5 중량%의 안정화제를 포함한다. 필요한 경우, 충분한 이온 강도를 제공하기 위하여 염이 첨가된다. 액체 조성물은 사전 동결 건조시키거나 사전 공동화되지 않는다. 바람직하게는 액체는 액체와 접촉하는 하나 이상의 표면이 인터페론의 흡착에 비활성인 물질로 코팅된다. 또한 본 발명은 액체 인터페론 제제의 비경구 투여용 키트와 액체 인터페론 조성물의 안정화 방법도 제공한다.
Description
인터페론은 다양한 생물학적 활성을 가진 단백질인데, 그 중 일부는 항바이러스성, 면역조정성 및 항증식성이다. 그들은 비교적 작고, 종(種) 특이적인 단쇄 폴리펩티드이며, 바이러스, 폴리펩티드, 미토겐 등과 같은 여러가지 유도물질에 대한 노출에 반응하여 포유류 세포에 의해 생성된다. 인터페론은 바이러스 공격에 대하여 동물 조직과 세포를 보호하며 중요한 숙주 방어 메카니즘이다. 대부분의 경우에서, 인터페론은 다른 종류의 조직과 세포보다는 그들이 생성된 종의 조직과 세포를 더 잘 보호하며, 이는 사람으로부터 유도된 인터페론이 다른 종으로부터의 인터페론보다 사람 질환을 치료하는 데 더 효과적이어야 한다는 것을 가리킨다.
몇가지 다른 종류의 사람 인터페론이 있으며, 일반적으로 백혈구(인터페론-알파), 섬유 아세포(인터페론-베타), 면역원(인터페론-감마) 및 다수의 그들의 변이체로 분류된다. 인터페론의 일반적인 논의는 본 명세서에서 참고로 인용하는 인터페론 시스템(스튜어트 2세(W. E. Stewart, Ⅱ), 스프링거 벌라그(Springer-Verlag), 뉴욕. 1979) 및 인터페론 요법(세계 보건 기구 기술 보고서 시리즈 676, 세계 보건 기구, 제노바 1982)를 포함하여 여러 문헌과 논문에서 찾아볼 수 있다.
인터페론의 투여 방법은 이 중요한 치료제의 임상 적용에서 중요한 인자이다. 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 의한 인터페론의 전신 투여는 모상 세포 백혈병, 후천성 면역 결핍증(AIDS) 및 관련 카포시 육종과 같은 장해를 치료하는 데 있어서 다소 성공리에 가장 자주 사용되고 있다. 그러나 이들 정제된 형태의 단백질은 특히 분해되기 쉬운 것으로 알려져 있다. 인터페론-베타에 대해서, 용액 내 인터페론 분해의 일차 메카니즘은 공격성이고 탈아미드화 반응이다. 용액 및 기타 생성물에서 인터페론의 안정성이 부족하기 때문에 그 용도가 제한되고 있다.
통상적으로 임상용 약학적 인터페론 조성물은 복합 유기 부형제와 비이온성 계면 활성 제제(즉, 계면활성제), 여러가지 당류, 유기 폴리올 및/또는 사람 혈청 알부민과 같은 안정화제와 조합시켜 동결 건조시킨(즉, 냉동 건조시킨) 제제로서 인터페론을 함유한다. 동결 건조 제제는 주사용 멸균수의 별도 공급이 요구되기 때문에 복잡한 포장이 필요한 단점이 있다. 더욱이, 동결 건조 제제는 사용 전에 몇가지 조작이 필요하므로, 바늘에 찔리거나 주사제 제조 중에 성분들을 흘릴 가능성을 증가시킨다. 다발성 경화증(MS) 환자와 같이, 근육 약화 및 빈약한 근육 공조를 나타내는 환자군에 대해서 특히 문제가 많다. MS 환자는 인터페론을 자가 투여하여서 현재의 동결 건조 생성물보다 투여하기가 훨씬 더 쉬운 투약 형태의 유효성이 표적 환자군에 대한 중요한 추가된 가치를 나타내도록 할 수 있다. 동결 건조 제제의 사용시 필요한 재조합을 피하기 위하여 인터페론의 간단한 액체 제제가 매우 바람직하다.
또한 인터페론을 함유하는 액체의 비동결 건조 제제도 사람 혈청 알부민, 폴리올, 당류 및 음이온성 계면 활성 안정화제와 같은 복합체 담체를 함유할 수 있다[예를 들면, WO89/10756(하라(Hara) 등, 폴리올 및 p-히드록시벤조에이트 함유) 참조].
본 발명은 사람 인터페론-베타의 안정화 방법 및 안정한 인터페론-베타 액체 제제에 관한 것이다.
도 1은 액체 내 용존 산소 백분율의 함수로서 벌크 처리액에 남아있는 인터페론-베타 모노머의 백분율을 나타내는 그래프도이다.
도 2는 출발 물질에 대해서 정규화된 단백질 농도의 백분율 대 액체 제제 BG9589-1에 대한 시간을 나타내는 그래프도이다. "4℃"로 표지된 샘플(흑색 사각형)은 2 내지 6℃에서 배양된다. 다른 샘플들은 25℃(흑색 동그라미), 33℃(흑색 삼각형) 및 40℃(흑색 마름모)에서 배양된다.
도 3은 출발 물질에 대해서 정규화된 단백질 농도의 백분율 대 액체 제제 BG9589-3에 대한 시간을 나타내는 그래프도이다. "4℃"로 표지된 샘플은 2 내지 8℃에서 배양된다. 다른 샘플들은 25℃(흑색 동그라미), 33℃(흑색 삼각형) 및 40℃(흑색 마름모)에서 배양된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 현 방법과 설계에 관한 문제점과 단점을 극복하고 인터페론을 안정화시키는 간단한 방법과 저장 안정성을 향상시킨 간단한 인터페론 제제를 제공한다. 본 발명은 다음과 같은 본 발명자들의 논의에 부분적으로 의거한다:
(a) 인터페론-베타는 액체를 통하여 활성적으로 기포를 형성하거나 헤드 공간에서와 같이 정적으로 접촉하는 산소와 접촉시 현저하게 불안정하여 응집한다;
(b) 사람 혈청 알부민과 같은 담체가 없는 인터페론-베타 액체 제제는 특히 유리 표면에 흡착되기 쉽다;
(c) 인터페론-베타는 낮은 이온 강도에서 응집하며, 수성 상태에서 안정성을 위한 이온 환경을 요한다.
그러므로 본 발명은 이들 위험을 피하는 사람 인터페론-베타의 안정화 방법과, 안정화시킨 인터페론-베타의 결과 생성된 액체 제제에 관한다.
A. 정의
용어 "완충제"는 약산 및 그 산의 음이온을 함유하는 염의 용액, 또는 약염기 및 그 염의 용액을 말한다. 특히, 본 명세서에서 사용하는 용어 "아세트산"(또한 하기 표 1 참조)은 바람직하게는 아세트산 나트륨과 아세트산을 함유하는 완충제 시스템을 말하며 용어 "인산"은 각기 이염기 및 단염기 인산 나트륨 칠수화물 및 일수화물을 함유하는 완충제 시스템이다. 더욱이, 수산화나트륨과 조합하여 산성 아미노산을 함유하는 표 2(하기)의 이들 용액들은 이 용어가 이 분야에 공지되어 있기 때문에 통상적으로 완충액으로 고려되지는 않지만, 그럼에도 불구하고 여기서는 정의 내에 포함시킨다.
용어 "부형제"는 제조 및/또는 저장 중에 벌크 성질을 바꾸고, 안정성을 개선하고 및/또는 삼투몰농도를 조절하기 위하여 액체 제제로 첨가되는 어떠한 화합물을 말한다.
용어 "안정화제"는 안정성을 개선시키거나 아니면 향상시키는 부형제를 말한다.
용어 "안정성"은 필연적으로 기능적인 정의를 가지며 항바이러스성과 같은 인터페론 활성 및/또는 인터페론 구조의 상대 시간적 불변성을 의미한다.
용어 "공동화된"은 압력 변화 또는 물리적 교반 때문에 적어도 그 제조 및 저장 중에 산소 함유 기포(예를 들면, 공기)와 접촉하고 있는 어떤 액체 인터페론 제제를 말한다. 또한 용어 "공동화"는 액체 인터페론 제제의 제조, 저장 및 사용 중 어떤 지점에서 산소 함유 가스/액체 계면이 형성되는 것을 의미한다. 용어 "공동화된"도 액체 인터페론 제제의 용존 산소 레벨이 적어도 제조 및 저장 중에 통상 대면하는 온도에서 분위기 평형의 약 10%를 초과하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 안내, 척추내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 유효 활성과 양립하는 농도에서 환자에게 비교적 비독성이고 무해하여 염으로 인하는 부작용이 인터페론의 이로운 효과를 손상시키지 않도록 하는 어떤 유기 또는 무기 부가염을 의미한다.
화합물의 "유효량"은 치료하고자 하는 특정 상태에 대해 결과를 가져오거나 영향을 미치는 양이다. 또한 "유효량"은 항바이러스 활성에 대한 CPE 테스트에서 양성 결과를 유발하는(즉, 항바이러스 효과를 주는) 양을 의미한다.
여기서 사용되는 바와 같이, 인터페론의 "약학적으로 유효량"은 특정 상태를 치료함에 있어서 안전하고 효과적인 것으로 의학 및 약학 분야에 공지된 약제의 농도 백분율을 의미한다.
"혈액에 대한 등장성"("등장"으로 호환가능하게 사용됨)은 삼투 작용이 혈액에 실질적으로 동일하도록, 즉, 제제와 접촉하는 세포가 그 형태를 실질적으로 유지하고 삼투압에 의한 물의 유효 전달을 행하지 않도록 충분한 농도의 성분을 갖는 액체 인터페론 조성물을 말한다.
"고분자 이온 화학종"(고분자 전해질 화학종"으로 호환가능하게 사용됨)은 전해질이고 본 발명의 제제에 사용시 소정 삼투몰농도에 대한 이온 강도를 최대화하는 고분자량의 물질을 말한다. 이 정의는 인터페론-베타가 고 이온 강도에 의해 안정화되지만 총 이온 강도는 용액을 혈액에 대한 등장성이 되도록 하는 필요성에 의하여 제한된다는(실시예 7 참조) 본 발명자들의 발견에 기초한다. 소정 삼투몰농도에 대해 이온 강도를 최대화하는 바람직한 방법은 고분자 이온 화학종인 부형제를 사용하는 것이다.
"인터페론에 대해 비활성"인 물질은 적어도 인터페론과 물리적 및/또는 화학적으로 반응하지 않는 성질을 가진 물질을 의미한다.
B. 인터페론 제조
일반적으로 본 발명은 천연 인터페론, 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 인터페론 및 화학적 합성 또는 변형에 의해 제조된 인터페론을 포함하여 모든 종류의 인터페론에 적용가능하다. 또한, 본 발명은 사람 또는 어떤 다른 적당한 종의 섬유 아세포, 백혈구, 림프구 또는 다른 인터페론 함유 또는 생성 조직으로부터의 미처리, 반정제 또는 정제된 인터페론으로 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명은 사람 섬유 아세포 인터페론(인터페론-베타)에 적용가능하다.
가장 바람직한 인터페론-베타는 재조합 형태이며, 여러가지 인터페론을 포함하는 단백질을 생성하기 위한 재조합 DNA 방법은 공지되어 있으며 어떤 방식으로든 본 발명을 한정하려는 것은 아니다[예를 들면, 미국 특허 제4,399,216호, 제5,149,636호, 제5,179,017호(악셀(Axel) 등); 제4,470,461호(카우프만(Kaufman)) 참조]. 인터페론의 재조합 형태가 생성되고 있다[예를 들면, 유럽 특허 제041313호(피어스(Fiers), 인터페론-베타의 발현); 미국 특허 제4,966,843호(맥모빅 (McMormick) 등, CHO 세포 내 인터페론의 발현); 미국 특허 제5,326,859호(수가노 (Sugano)등, DNA 암호화 인터페론 베타) 참조]. 또한 인터페론-베타는 재조합적으로 또는 화학적으로 변형될 수 있으며, 혈청 함유 또는 무혈청 배지에서 생성될 수 있다. 인터페론-베타의 형태는 시스테인 고갈 돌연변이체(미국 특허 제4,588,585호 및 제4,737,462호; 마크(Mark) 등)와 메티오닌 고갈 돌연변이체(EP 260 350, 왕 (Wang) 등)와 같은 변이체를 포함할 수 있다. 단백질의 일차 아미노산 서열은 당 부분을 사용하는 유도체화(글리코실화)에 의하거나 다른 보충 분자에 의하여 증대될 수 있다. 다른 변형으로는 숙주 세포의 번역후 처리 시스템을 통하여 실행될 수 있다. 고리 내 개개의 아미노산 잔기들은 산화, 환원 또는 기타 변성에 의하여 더 변형될 수 있으며, 단백질은 분열되어 활성 단편을 얻을 수 있다. 그러므로 특정 재조합 인터페론-베타의 정확한 화학적 구조는 몇가지 인자에 의존할 것이며 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다. 여기서 기술한 제제에 포함되는 모든 그러한 인터페론-베타 단백질은 적당한 환경 조건에 놓이면 그들의 생활성을 유지할 것이다.
재조합 인터페론-베타의 한가지 제조 방법은 사람 인터페론-베타 유전자로 형질전환된 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포를 배양하는 것이다. 재조합 인터페론-베타는 태아 소 혈청을 함유하는 뱃치 현탁액 배양에서 성장한 CHO 세포에 의해 분비된다. 세포들은 약 35℃에서 CO2인큐베이터(5% CO2)에 수용된 회전 플라스크 내에서 성장할 수 있다. 다중 회전 플라스크는 푸울되어 규모 확대가 필요하다면, 크기를 증가시킨 발효기로 접종될 수 있다. 소정 발효기 내 성장은 활성 인터페론-베타 생성물이 배양 배지에 축적하는 약 6일 동안 실행시킨다. 그 다음 배양물을 수거하여 세포를 예를 들면 접선 흐름 여과에 의하여 생성물 함유 배지로부터 제거한다.
C. 인터페론 정제
인터페론의 정제 방법은 잘 특징지어져 있으며 이 분야의 통상의 지식을 가진 자들이 이용할 수 있다. 그러한 방법은 여러 가지 크로마토그래피 분리 단계를 수반하는 단단계 또는 다단계 과정을 포함한다[예를 들면, 미국 특허 제5,015,730호(프리젠(Friesen) 등, 친화 크로마토그래피 및 HPLC); 제4,541,952호 (호소이(Hosoi) 등, 킬레이트 크로마토그래피) 참조].
한 예시적인 방법은 인터페론-베타 분자의 대단히 소수성이고 비교적 염기성인 성질과 뿐만아니라 금속 이온 결합에 대한 강한 친화성을 이용하는 것을 수반한다[예를 들면, 본 명세서에서 모두 참고로 인용되는 나이트(Knight) 및 파이 (Fahey)의 "사람 섬유 아세포 인터페론, 개선된 정제", J.Biol. Chem.,256:3609-3611(1981) 및 에디(Edy) 등의 "아연 킬레이트 크로마토그래피에 의한 사람 섬유 아세포 인터페론의 정제", J.Biol. Chem., 232:5934-5935(1981) 참조].
간단히 말해서, 포획 및 정제 단계는 인터페론-베타를 일련의 세파로스 (Sepharose) 칼럼(파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech) 제품)에 결합시키고 염과 폴리올로 용출하는 것을 수반한다. 일단 최종 세파로스 용출액을 증류시키고 pH를 저하시켜서 조절하면, 그 안의 인터페론-베타는 SP 세파로스(파마시아 바이오텍)에 결합할 것이다. 칼럼 부하물에 존재하는 대부분의 잔류 단백질은 사실상 모노머 인터페론-베타보다 더 염기성이고 그 인터페론보다 칼럼에 더 밀착하여 결합한다. DNA와 바이러스는 이 칼럼 상의 인터페론-베타로부터 분할한다. 그 다음 칼럼은 염화나트륨을 함유하는 일련의 완충제로 세척한다.
이제 인터페론 생성물은 아연으로 미리 충진된 킬레이트 세파로스(파마시아 바이오텍)에 결합시킨다(전술한 에디 등의 문헌 참조). 모든 후속 단계가 그렇지만, 이 칼럼은 무산소 분위기하에서 조작하여 분자 내 유리 술프히드릴기를 보호한다. 정제시킨 인터페론을 산성화하고 저 pH에서 유지하여 어떤 잔류 바이러스를 비활성화시킨다. 중화후, 인터페론은 직교류 여과, 그 다음 중성 완충액으로 교환시킨 완충제를 사용하여 농축시킨다. 이 후, 벌크 인터페론은 조제 단계 전에 -70℃에서 저장할 수 있다.
D. 인터페론 조제
전술한 예시적인 정제 방법에서와 제1 완충제 교환 프로세스 후에, 중성 완충액을 안정화제를 함유하는 pH 4 내지 7.2의 완충제로 대체한 것을 제외하고는 제2 완충제 교환 프로세스를 개시하며, 이하 더 상세하게 기술한다. 인터페론을 함유하는 얻어진 제제는 "프로세스 중간물"로 언급하며, 저장을 위해 동결시킬 수 있다(또한 실시예 7 참조).
동결 상태로(아르곤 또는 질소와 같은 비활성 가스 분위기하에) 저장하면, 그 후 그것을 해동하고, 0.22 미크론 필터를 통하여 바람직하게는 스테인레스 스틸로 된 자중 용기로 펌핑할 수 있으며, 여기서 프로세스 중간물이 목적하는 최종 생성물 중량이 얻어질 때까지 미리 여과 멸균된 희석제와 조합한다. 희석제는 제2 완충제 교환 프로세스에서 사용된 것과 동일한 완충제로 구성한다. 그 다음 최종 액체 생성물은 무균 과정하에 예를 들면, 두 개의 직렬식 0.22 미크론 필터를 사용하여 여과 멸균시키고, 비활성 가스 입구, 탈가스 밸브/필터 조합 및 유입/유출 딥 튜브를 포함하는, 바람직하게는 스테인레스 스틸로 된 밀봉 용기로 분배한다. 질소와 같은 비활성 가스를 사용하여, 최종 생성물은 무균적으로 멸균 주사기를 충진할 수 있는 장치의 펌프 헤드로 가압 전달한다.
몇가지 멸균 주사기의 무균 충진 방법이 유용하며 사용되는 특정 방법으로 본 발명의 범주를 한정하려는 것은 아니다. 예시적인 방법으로서 하이팩(HYPAC) 오토클레이브식 주사기 충진기(뉴 저지 소재의 벡톤 디킨슨 파마슈티컬 시스템스 (Becton Dickinson Pharmaceutical Systems) 제품)를 사용할 수 있다. 주사기는 팁 캡을 끼워 오토클레이브 처리한다. 일반적으로, 이 종류의 장치는 인터페론 제제로 충전하고자 하는 주사기를 포함하는 진공 챔버를 구비한다. 챔버를 무균 환경에 놓는다. 각각의 주사기는 그 개구 단부가 플런저 핀에 결합되어 주사기 통의 개구 단부로 끼워맞춤되도록 챔버 내에서 수직으로 놓는다. 핀은 스토퍼를 통으로 삽입시켜서 액체를 안에 가두도록 설계한다. 삽입후에는 주사기안에는 작은 헤드 공간이 남는다. 챔버를 배기하고 비활성, 무산소 가스(예를 들면, 아르곤, 질소)로 몇 번 역세척하며 최종 진공에 도달할 때까지, 핀을 개구된 주사기 통으로 단거리로 기계적으로 구동시키고 스토퍼는 자동적으로 각각의 주사기로 삽입시킨다. 그러면 챔버는 여과된 공기로 채워져 챔버 내 압력이 다시 분위기 레벨로 된다. 진공의 양은 비활성 가스 함유 헤드 공간의 크기를 결정할 것이다.
본 발명자들이 사용하는 구체적인 시스템에서, 주사기는 수직 배향되고 회전 디스크 상에서 스프로켓에 의해 적절히 유지된다. 주사기는 주사기에 삽입되는 바늘 아래로 먼저 위치시킨다. 바늘은 비활성 가스(예를 들면, 질소, 아르곤)으로 주사기 내부를 세척한다. 그 다음 바늘은 주사기 밖으로 후퇴시킨다. 그 후 주사기는 주사기로 삽입되는 제2 바늘 아래에 위치시킨다. 이 주사기는 생성물을 주사기로 분배하는 펌프에 부착시킨다. 그 후 제2 바늘을 주사기 밖으로 후퇴시킨다. 그 다음 주사기를 주사기에 삽입되는 제3 바늘 아래에 위치시킨다. 플런저(미리 오토클레이브 처리함)가 비활성, 무산소 가스(예를 들면, 질소, 아르곤)를 주사기로 취입한 다음, 바늘을 주사기 밖으로 후퇴시킨다. 플런저는 액체의 상부와 플런저의 저부 사이에 비활성 가스의 헤드 공간을 남기도록 위치 설정한다.
1. 부형제
바람직하게는, 부형제는 예를 들면 헤파린 또는 다른 고분자 화학종을 포함할 수 있는 고분자 전해질과 같이, 소정 삼투몰농도에 대한 이온 강도를 최대화하는 고분자 이온 화학종이다, 실시예 4에 논의되는 바와 같이, 인터페론-베타는 고 이온 강도에 의해 멸균되지만, 총 이온 강도는 용액이 혈액에 대해 등장성이어야 하는 필요성에 의하여 제한된다. 그러므로 소정 삼투몰농도에 대해 이온 강도를 최대화하는 바람직한 방법은 고분자 이온 화학종을 사용하는 것이다. 본 발명의 인터페론-베타는 혈액에 대해 등장성이다(약 290 밀리오스몰/킬로그램).
본 발명의 가장 바람직한 안정화제는 어떤 산성 아미노산(예를 들면, 글루탐산, 아스파르트산) 또는 아르기닌과 글리신으로부터 선택되는 아미노산 중 하나를 포함할 수 있는 아미노산이다. 가장 바람직하게는, 아미노산 안정화제는 pH 5.0 용액 중에 산성 형태(아르기닌-HCl)로서 포함되는 아르기닌이다. 바람직한 산성 아미노산은 L-글루탐산이다. 어떤 이론으로 얽매이고 싶지는 않지만, 고분자 이온 부형제가 바람직하다는 사실은 아마도 (3가의 기를 가진) 아르기닌과 리신이 (2가의 기를 가진) 글리신보다 인터페론을 더 잘 안정화시키고, 또한 테스트된 전하를 띄지 않는 화학종의 어떠한 것 보다도 더 잘 안정화시키는 이유 때문일 것이다.
부형제가 아르기닌-HCl이라면, 그 농도는 0.5%(w/v) 내지 5% 범위일 것이며 가장 바람직하게는 3.13%(150 mM 아르기닌-HCl에 등가임)이다. 부형제가 글리신이라면, 그 농도는 0.50(w/v)% 내지 2.0%, 가장 바람직하게는 0.52%(66.7 mM 내지 266.4 mM, 가장 바람직하게는 70 mM에 등가임) 범위일 것이다. 부형제가 글루탐산이라면, 그 농도는 100 mM 내지 200 mM 범위일 것이며 가장 바람직하게는 170 mM(1.47%(w/v) 내지 2.94% 범위, 가장 바람직하게는 2.5%에 등가임)이다.
본 발명자들은 50 mM 아세트산 나트륨과 빙초산을 pH 5.0의 100 mM 염화나트륨과 조합한 pH 완충제 시스템을 사용하여 인터페론-베타의 액체 제제에 대한 안정화제로서 여러 가지 부형제를 분석하였다. 액체 인터페론 샘플은 약 1 내지 3주 동안 37℃에서 배양함으로써 열 응력을 가하거나 기계적 응력으로서 1 내지 3일 동안 회전기 상에 놓는다. 처리된 샘플은 실시예 1에 기재된 방법에 의하여 인터페론-베타 안정성에 대해서 평가한다. 실시예 7에 더 상세하게 기재되어 있는 바와 같이, pH 5.0에서 아세트산 나트륨으로 완충되고 아미노산 부형제를 함유하는(그리고 선택적으로 염화나트륨을 함유하는) 제제는 가장 좋은 안정성을 나타낸다.
2. 인터페론
바람직한 인터페론은 섬유 아세포 인터페론-베타이고, 가장 바람직하게는 포유류 세포로부터 생성된 재조합 사람 인터페론-베타이다. 재조합 사람 인터페론-베타는 유리 술프히드릴기와 하나 이상의 디술피드 결합을 함유할 수 있다. 특히 바람직한 분자는 분자당 17번 위치에 한 개의 유리 술프히드릴과 31번 및 41번 사이에 한 개의 디술피드 결합을 함유한다. 천연 사람 IFN 베타의 경우로 알려진 바와 같이, N-글리코실화가 Asn-80에서 예상된다. 본 발명의 액체 제제 내 농도 범위는 약 30 ug/ml 내지 약 250 ug/ml이다. 바람직한 농도 범위는 48 내지 78 ug/ml이고 가장 바람직한 농도는 약 60 ug/ml이다. 국제 표준치에 관하여, 바이오겐 내부 표준은 인터페론에 대한 WHO 국제 표준, 내츄럴#Gb-23-902-531로 표준화되어서, IU(0.5 ml 주사 부피에 관함)로서 농도 범위가 약 6 IMU 내지 50 IMU이고 가장 바람직한 농도는 12 IMU이다.
3. 완충제
pH를 약 4.0 내지 7.2, 바람직하게는 약 4.5 내지 약 5.5, 가장 바람직하게는 5.0의 범위에서 유지시키기 위하여 본 발명에서 사용하고자 하는 유기산과 인산 완충제는 시트르산 완충제(예를 들면, 시트르산 일나트륨-시트르산 이나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산 삼나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산 일나트륨 혼합물 등), 숙신산 완충제(예를 들면, 숙신산-숙신산 일나트륨, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산 이나트륨 혼합물 등), 타르타르산 완충제(예를 들면, 타르타르산-타르타르산 나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산 칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마르산 완충제(예를 들면, 푸마르산-푸마르산 일나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산 이나트륨 혼합물, 푸마르산 일나트륨-푸마르산 이나트륨 혼합물 등), 글루콘산 완충제(예를 들면, 글루콘산-글루콘산 나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산 칼륨 혼합물 등), 옥살산 완충제(예를 들면, 옥살산-옥살산 나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산 칼륨 혼합물 등), 락트산 완충제(예를 들면, 락트산-락트산 나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산 칼륨 혼합물 등), 인산 완충제(인산 나트륨 일염기/인산 나트륨 이염기) 및 아세트산 완충제(예를 들면, 아세트산-아세트산 나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)와 같은 유기산 및 그것의 염으로 된 통상의 완충제일 수 있다.
후술되는 실시예에서, 본 발명자들은 가장 적당한 완충제의 평가를 위하여 상이한 완충제와 상이한 pH의 인산 나트륨, 시트르산 나트륨, 숙신산 나트륨, 탄산 나트륨 및 아세트산 나트륨을 사용한다. 인터페론-베타 샘플을 약 6일 내지 2주 동안 37℃에 놓거나 7 내지 9시간 동안 회전기 상에 놓아서 분해 프로세스를 촉진시킨다. 그 다음, 샘플의 화학적 성질을 결정한다. 샘플은 실시예 1에서 후술되는, 광학 밀도, 펩티드 맵핑, 크기 배제 HPLC, 환원 및 비환원 SDS-PAGE/웨스턴 블로트 및 등전집속/웨스턴 블로트(IEF)에 의하여 분석한다. 모든 시험 인터페론-베타 샘플을 2 내지 8℃에 놓여진 출발 인터페론-베타 물질 또는 인터페론-베타 샘플과 비교한다. 본 발명자들의 데이타는 pH가 본 인터페론-베타 샘플의 안정성을 결정하는 주요 인자이고 pH 4.0 내지 5.0의 샘플이 pH 7.0 이상의 것 보다 더 안정하다는 것을 나타낸다(실시예 2 참조). 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 생리학적 pH (pH 7.2)에서 몇가지 인터페론-베타 제제를 개발할 수 있었다.
4. 공동화
인터페론-베타 내 대부분의 유리 술프히드릴 잔기는 디술피드 결합을 재배치시키는 고 pH(pH 〉 8.0)에서 산화를 행한다. 본 발명자들은 크기 배제 크로마토그래피, 비환원 SDS-PAGE 및 레이저 광 산란에 의하여 본 발명의 벌크 중간물에서 인터페론-베타이 다소 응집되었음을 검출하였다. 계속해서 본 발명자들은 응집된 인터페론-베타의 형성이 용존 산소의 레벨에 의존할 수 있다는 것을 발견하였다. 액체 인터페론-베타 제제가 공동화되지 않도록 하기위해 본 발명자들이 개발한 프로세스 기준은 다음을 포함한다: (a) 가능하다면, 제조 및 저장 중에 산소 함유 가스/액체 계면이 없어야 한다; 및/또는 (b) 제조 및 저장 중에 기포가 형성되지 않아야 한다; 및/또는 (c) 제제 내 용존 산소의 레벨은 제조 및 저장 온도에서 분위기 평형의 10% 이하로 유지되어야 한다(실시예 3 참조).
5. 표면에의 인터페론 흡착
또한 본 발명자들은 인터페론이 일정한 표면에 흡착될 것이며 유리 용기 내에 그것을 저장하는 것은 인터페론과 접촉하는 용기의 하나 이상의 표면이 흡착을 방지하거나 실질적으로 흡착을 배제하는 재료로 코팅되거나 아니면 피복되어야 할 필요가 있다고 결론지었다. 이 표면은 화학적으로 또는 물리적으로 흡착에 비활성일 수 있다. 이 목적을 위한 예시적인 재료는 이 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 스프레이 또는 소성된 실리콘, 폴리프로필렌 또는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)을 포함할 수 있다. 본 발명자들은 본 발명자들의 바람직한 60 ug/ml 액체 제제(BG9589-1,2,3 및 4: 하기 표 1에 요약함)를 취하여 그것을 스프레이 처리 실리콘으로 코팅한 1 ml 길이의 Ⅰ형 유리 주사기로, 그리고 0.75 ml Ⅰ형 유리 바이얼로 충진하였다. 그 다음은 샘플은 단백질 농도 측정을 위해 역상 HPLC(rpHPLC)로 분석한다. 데이타는 실리콘 코팅된, 미리 충진된 주사기와 비교했을 때 유리 바이얼로 충진된 이들 샘플에서 용액 내에 단백질이 더 적었다는 것을 나타낸다(실시예 5 참조).
6. 바람직한 제제
본 발명자들은 최종 농도를 하기 표 1에 나타낸, 각기 60 ug/ml의 인터페론-베타를 함유하는 네 개의 액체 제제를 사용하여 단백질 안정성의 동력학적 분석을 실행하였다. 플루로닉 F68(Pluronic F68, 바스프 제품)과 같은 계면활성제를 함유하는 다른 제제는 표 2에 나타낸다.
| pH 시스템 | 부형제 | 최종 pH |
| 20 mM 아세트산염 | 150 mM 아르기닌-HCl | 5.0 ("BG9589-1") |
| 20 mM 인산염 | 70 mM 글리신100 mM 염화나트륨 | 5.0 ("BG9589-2") |
| 20 mM 인산염 | 140 mM 아르기닌-HCl | 7.2 ("BG9589-3") |
| 20 mM 인산염 | 70 mM 글리신100 mM 염화나트륨 | 7.2 ("BG9589-4") |
모든 제제 구성 성분은 USP 등급의 물질이다. 자세한 조성은 다음과 같다:
BG9589-1
성분(원료로서) 양
아르기닌-HCl, USP 15.8 mg
빙초산, USP 0.167 mg
아세트산 나트륨 삼수화물, USP 0.972 mg
인터페론-베타 30 ugm
주사용수, USP 0.5 ml
BG9589-2
성분(원료로서) 양
글리신, USP 2.628 mg
빙초산, USP 0.185 mg
아세트산 나트륨 삼수화물, USP 0.932 mg
인터페론 베타-1a 30 ugm
주사용수, USP 0.5 ml
염화나트륨 2.922 mg
BG9589-3
성분(원료로서) 양
아르기닌-HCl, USP 14.725 mg
인산 나트륨 이염기-7H20 2.332 mg
인산 나트륨 일염기-1 H20 0.359 mg
인터페론 베타-1a 30 ugm
주사용수, USP 0.5 ml
BG-9589-4
성분(원료로서) 양
인산 나트륨 이염기-7H20 1.984 mg
인산 나트륨 일염기-1 H20 0.359 mg
인터페론 베타-1a 30 ugm
글리신 2.628 mg
염화나트륨 2.922 mg
주사용수, USP 0.5 ml
| pH 시스템 | 부형제 | 최종 pH |
| 20 mM 아세트산염 | 150 mM 아르기닌-HCl 및 15 mM 사람 혈청 알부민 | 5.0 |
| 20 mM 아세트산염 | 150 mM 아르기닌-HCl 및0.1% 플루로닉 F-68 | 5.0 |
| 20 mM 아세트산염 | 140 mM 염화나트륨 | 5.0 |
| 20 mM 아세트산염 | 15 mM 사람 혈청 알부민140 mM 염화나트륨 | 5.0 |
| 20 mM 아세트산염 | 0.1% 플루로닉 F-68140 mM 염화나트륨 | 5.0 |
| 170 mM L-글루탐산150 mM 수산화나트륨 | 15 mM 사람 혈청 알부민 | 5.0 |
| 170 mM L-글루탐산150 mM 수산화나트륨 | 0.1% 플루로닉 F-68 | 5.0 |
다른 물질도 본 발명의 제제에 포함될 수 있다. 이들은 페놀(약 0.2%); 메틸파라벤(0.08%); 프로필파라벤(0.008%); m-크레졸(0.1%); 클로로부탄올(0.25%); 벤질 알코올(0.1%); 및 티메로살(0.1%)과 같은 방부제를 포함하며, 모든 바람직한 퍼센트는 w/v이다. 단백질 응집 및 탈아미드화(데이타 없음)를 결정하기 위한 분석에 의거하여, 가장 바람직한 방부제는 클로로부탄올과 벤질 알코올이다.
7. 비경구 투여용 키트
본 발명의 바람직한 구체예는 본 액체 제제의 비경구 투여를 위한 패키지 키트를 포함한다. 패키지는 본 발명의 액체 제제로 미리 충전시킨 주사기, 수 개의 알코올 면봉, 하나 이상의 바늘, 하나 이상의 접착 밴드 및 사용 지시서를 포함한다. 또한 본 발명의 액체 제제가 통상의 무바늘 주사 시스템으로도 사용될 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다.
E. 인터페론의 사용
본 발명의 인터페론은 항바이러스 활성을 가진다(실시예 7 참조). 임상에서 사용하기 위하여, 어떤 특정한 경우에 투여되는 인터페론의 양, 뿐만 아니라 인터페론이 투여되는 빈도는 사용되는 인터페론의 종류, 치료하고자 하는 질환 및 인터페론 치료에 대한 환자의 반응과 같은 인자에 의존한다.
본 발명의 액체 조성물의 바람직한 용도는 재발하는 다발성 경화증의 치료에 대해서이다. 천연 인터페론-베타 및 재조합 인터페론-베타를 동결 건조시킨(즉, 재구성된) 액체 제제가 다발성 경화증이 재발하는 환자에게 투여되고 있다{제이콥스(Jacobs) 등의 문헌[Annals of neurology 39:285-294(1996년 3월)], 여기서 인용된 문헌들 및 문헌[다발성 경화증의 치료: 시험 설계, 결과 및 앞으로의 전망](루드닉(R.A.Rudnick) 등 편집, 런던: 스프링거, 1992)중의 제이콥스와 문샤우어 (Munschauer)의 "다발성 경화증의 인터페론 치료"(223-250쪽) 참조}. 다발성 경화증 치료를 위한 본 명세서에서 기술한 액체 제제의 용도는 제이콥 등의 전술한 문헌에 기재된 바와 동일한 프로토콜을 따르며 동일한 일차 결과 변수를 측정한다.
본 액체 제제의 용도를 평가하는 한가지 방법은 독물학적 연구를 실행하고 액체 제제의 투여와 연관된 조직 자극을 평가하는 것이다. 본 발명자들은 토끼로 본 액체 제제의 독물학적 연구를 실행하였다(실시예 8 참조).
발명의 개요
본 발명은 pH가 약 4 내지 7.2이고 안정화제로서 아미노산 및 경우에 따라서, 염(아미노산이 전하를 띄는 측쇄를 함유하지 않을 때)을 함유하는 완충액에 넣을 때 사람 인터페론-베타를 안정화시킬 수 있다는 발견으로 상기 문제점들을 해결하였다. 인터페론-베타는 동결 건조시키는 것이 아니라 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법을 사용하여 일단 제조되면, 본 발명의 제제에 바로 포함시킨다.
그러므로, 본 발명의 한가지 양태는 인터페론과, 산성 아미노산, 아르기닌 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산인 약 0.3 중량% 내지 5 중량%의 안정화제로 이루어지는 액체 조성물이다. 액체 조성물은 사전 동결 건조시키지 않는다. 더욱이, 액체 조성물은 주사기와 같은 용기 내에 함유되며, 그 용기의 액체와 접촉하는 면은 실리콘 또는 폴리테트라플루오로에틸렌과 같은, 인터페론에 비활성인 재료로 코팅하는 것이 바람직하다. 바람직한 조성물은 pH가 약 4.0 내지 약 7.2인 완충제 내에 인터페론-베타, 또는 재조합하여 생성된 인터페론을 포함한다. 본 발명의 다른 제제들은,
(1) pH 5.0의 20 mM 아세트산 완충제(상기 완충제는 사전 동결 건조시키지 않으며, 인터페론과, (a) 150 mM 아르기닌-HCl; (b) 100 mM 염화나트륨 및 70 mM 글리신; (c) 150 mM 아르기닌-HCl 및 15 mg/ml 사람 혈청 알부민; (d) 150 mM 아르기닌-HCl 및 0.1% 플루로닉 F-68; (e) 140 mM 염화나트륨; (f) 140 mM 염화나트륨 및 15 mg/ml 사람 혈청 알부민; 및 (g) 140 mM 염화나트륨 및 0.1% 플루로닉 F-68로부터 선택되는 성분들을 포함함);
(2) 인터페론-베타, 170 mM L-글루탐산 및 150 mM 수산화나트륨들 포함하며 사전 동결 건조시키지 않은 pH 5.0의 액체;
(3) pH 7.2의 20 mM 인산 완충제(상기 완충제는 사전 동결 건조시키지 않으며, 인터페론과, (a) 140 mM 아르기닌-HCl; 및 (b) 100 mM 염화나트륨 및 70 mM 글리신을 포함함).
본 발명의 다른 구체예는 액체 인터페론 제제의 비경구 투여용 키트이다. 키트는 pH가 4 내지 6인 액체 제제를 함유하는 용기와 사용 지시서를 포함하며, 상기 액체는 사전 동결 건조시키지 않은 약학적으로 유효량의 인터페론-베타와 약 5 중량% 이하의 아미노산 안정화제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 필수적으로, 적당한 이온 강도에서 pH가 4.0 내지 6.0 범위 내에서 유지되는 완충제 내에 사전 동결 건조시키지 않은 유효량의 인터페론-베타와 아미노산 안정화제로 구성되는, 포유류에 비경구 투여하기에 적당한 액체 약학적 조성물이다. 상기 조성물은 주사기와 같은 저장 용기 내에 함유된다. 바람직하게는, 저장 용기는 산소 함유/액체 계면이 없다(즉, 인터페론 용액은 제조 및 저장 중에 산소 함유 가스에 노출되지 않는다). 필수적으로, 인터페론-베타는 3개월 이상의 기간 동안 약 2℃ 내지 약 25℃의 온도에서 저장 중에 그 항바이러스 활성을 유지한다.
필수적으로 3개월 이상의 기간 동안 약 2℃ 내지 약 25℃의 온도에서 저장 중에 그 항바이러스 활성을 유지하도록 액체 약학적 조성물 내 인터페론을 멸균하는 본 발명의 방법은 a) 유효량의 인터페론-베타; b) pH가 4.0 내지 7.2 범위 내에서 유지되며 적당한 이온 강도를 가진 완충제; 및 c) 사전 동결 건조시키지 않으며 제조 및 저장 중에 산소 함유 가스에 노출시키지 않는 아미노산 안정화제를 혼합하는 것을 포함한다.
본 발명의 액체 제제는 동결 건조시킨 제제에 비해 많은 이점을 가진다. 그 이점은 다음을 포함한다. (ⅰ) 액체 제제에 요구되는 더 작은 주사 부피는 더 큰 부피보다 덜 불편하다; (ⅱ) 복잡한 부형제를 간단한 아미노산으로 대체하는 것은 완성된 생성물 품질을 더 근접하게 모니터링하는 것을 가능하게 한다; (ⅲ) 주사용수의 별도 공급, 그리고 별도의 주사기 및 바이얼에 대한 필요성을 없애기 때문에 포장은 매우 간단하게 된다; (ⅳ) 더 적은 액체 전달 물질로 인하여 투여량 정확도를 개선할 수 있다; (ⅴ) 주사의 제조 중에 바늘에 찔리거나 성분들을 흘릴 가능성을 줄이기 때문에 생성물 안정성이 개선된다.
그러므로, 본 발명의 목적은 인터페론-베타 조성물의 사전 동결 건조를 요하지 않는 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 a) 액체 조성물의 제조시 공동 및/또는 헤드 공간의 형성을 피하거나, b) 아르곤 또는 질소와 같은 비활성 가스로 구성된 헤드 공간과 함께 액체 제제를 저장함으로써 인터페론-베타 액체 제제 중의 안정성 손실을 방지하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 투여 전에 저장과 적재를 손쉽게 하는 액체 상태로 장기간 동안 저장할 수 있는 액체 제제를 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 동결 건조 및 재조합 단계를 제거하여 용이하게 만들어지고 투여되는 액체 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 더 다른 목적은 통상 사용되던 혈청 알부민 외에 대체 안정화제로서 간단한 아미노산을 사용하여 생성물 품질을 더 용이하게 모니터링하도록 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 덜 비싸게 생성할 수 있는 비동결 건조 인터페론-베타를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 이점은 하기 상세한 설명에 부분적으로 설명하며, 부분적으로는, 본 명세서로부터 명백할 것이며, 또는 본 발명의 실시로부터 알게 될 수도 있다. 본 명세서에 포함되고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면을 예시하여, 본 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하려 한다.
다음 실시예는 본 발명의 구체예를 예시하기 위하여 제공하는 것이며, 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석해서는 안된다.
실시예 1: 애세이 방법
몇가지 잘 특징지어진 방법을 사용하여 본 발명의 액체 제제 내 인터페론-베타의 물리화학적 성질을 결정하며 이들 방법은 다른 인터페론의 성질을 모니터하는데도 사용될 수 있다.
불용성 응집물의 유무는 320 nm에서의 흡광도와 580 nm에서의 투과도를 측정함으로써 모니터된다. 가용성 단백질의 농도는 278 내지 280 nm에서의 흡광도(흡광 계수가 1.5임)를 측정하거나 표준으로서 제제 완충제에 가해진 인터페론의 공지된 농도를 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 결정된다. 액체 제제 샘플은 애세이 전에 원심분리시킨다. 가용성 응집물 백분율은 TSK-GelG2000SWXL 칼럼[펜실베이니아주 몽고메리빌에 소재하는 토소 하스(Toso Haas) 제품]상의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 인터페론-베타 모노머로부터 응집물을 분리함으로써 결정된다. 280 nm에서 모니터되는 피크 면적이 가용성 응집물 백분율을 산출하는데 사용된다.
펩티드 골격의 안정성은 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)에 의해 확인된다. 인터페론-베타는 10 내지 20% 구배 겔[MiniPlus Sepragel; 매사츄세츠주 나티크에 소재하는 인테그레이티드 세퍼레이션 시스템스 (Integrated Separation Systems) 제품]상의 전기영동을 행하기 전에 도데실황산나트륨의 존재하에 메르캅토에탄올로 환원시킨다. 그 다음 단백질은 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기영동적으로 전달되고 양고추냉이 퍼옥시다제에 커플링된 염소 항 마우스 항체와 항 인터페론-베타를 사용하여 면역 검출에 의해 전개된다[예를 들면, 단백질의 겔 전기영동법, 실용 방법(2판, 헤임스(B.D. Hames) 및 릭우드(D. Rickwood), IRL 프레스) 참조].
탈아미드화 및 기타 화학적 변화에 의해 야기되는 순수 표면 전하의 변화는 폴리아크릴아미드 겔 상의 등전집속(IEF 3-10 MiniPlus Sepragel, 인테그레이티드 세퍼레이션 시스템스 제품)에 의하여 모니터한다[상기 단백질의 겔 전기영동법, 실용 방법 참조].
메티오닌 산화, 아스파라긴 탈아미드화 및 기타 가능한 화학적 변화도 펩티드 맵핑에 의해 모니터한다. 인터페론-베타는 디티오트레이톨의 존재하에 엔도프로테이나제 Lys-C[와코 퓨어 케미컬스(Wako Pure Chemicals)]로 분해시키고 얻어진 펩티드 단편들은 역상 HPLC에 의해 분리시킨다[일반적으로, 칼가트기(Kalgahtgi, K.) 및 호바스(Horvath, C.)의 "고성능 액체 크로마토그래피에 의한 급속 펩티드 맵핑", J.Chromatography 443, 343-354(1988) 참조].
N-결합된 단당류 프로파일은 글리코 인코포레이티드(Glyko Inc., 캘리포니아주 노바토 소재) 제품, 형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE) 시스템을 사용하여 결정한다. 아스파라긴 결합된(N-결합된) 단당류는 효소, 펩티드 N-글리코시다제 F를 사용하여 당단백질로부터 방출시킨 다음 환원성 아민화에 의해 환원 말단부에 형광단으로 표지하여 분리시킨 후 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정량화한다.
인터페론의 항바이러스 활성은 스튜어트 2세의 인터페론 시스템(스프링거 벌라그; 2판 1981)에 더 완전하게 기재된 것과 같은 다수의 방법에 의해 결정된다. 세포병리학적 효과 저해 애세이(CPE)는 인터페론 항바이러스 활성을 결정하는데 특히 유용하다. 본 발명의 바람직한 방법은 본 명세서에서 참고로 인용하는 WHO 기술 보고서 시리즈 제725호, 부록 1,(1985)에 기재되어있다. 간단히 말하면, 이 CPE 방법은 WHO 참조 표준에 대해서 검정된 인터페론-베타 표준의 실험 원료를 제조함으로써 시작된다. 이 원료는 10% 태아 소 혈청과 10,000 유니트(U)/ml 농도의 4 mM L-글루타민을 함유하는 D-MEM+ 배지에서 제조한다. 애세이 하는 날에 표준, 콘트롤 및 샘플을 다음 세가지 별도의 희석물 시리즈로 D-MEM+로 희석한다: a) 32 U/ml에서 시작하여 2 배 희석; b) 12 U/ml에서 시작하여 1.5 배 희석; 및 c) 6 U/ml에서 시작하여 1.2 배 희석. 희석물 50 ㎕를 칼럼 내에서 한 희석물 시리즈 당 한 플레이트씩, 96 웰 플레이트의 웰들에 가한다. 그 다음, D-MEM+ 내 A549 세포(ATCC 카탈로그 번호 CCL-185, 메릴랜드주 록빌)를 5 ×105세포/ml, 50 ㎕/웰로 각각의 웰에 가하고 세포와 인터페론-베타의 두 배 희석을 실행한다. 세포와 인터페론을 37℃에서 5% 이산화탄소 하에 15 내지 20 시간 동안 배양한다. 플레이트 내용물을 표백통으로 넣어 요동시키고 배지 내 적당히 희석시킨 EMC(뇌심근염) 바이러스를 각 웰에 가한다. 바이러스와 세포를 37℃, 5% 이산화탄소로 30 시간동안 배양한다. 플레이트 내용물을 표백통으로 넣어 요동시키고, 0.75% 크리스탈 바이올렛 염료를 그 플레이트로 가한다. 5 내지 10 분후, 플레이트를 증류수로 세척하고 건조시킨다. 각 애세이 플레이트는 인터페론이나 EMC를 포함하지 않는 세포 성장 콘트롤 웰, EMC와 세포를 함유하지만 인터페론은 함유하지 않는 바이러스 콘트롤 웰, 및 인터페론 표준의 희석물 시리즈를 포함한다.
플레이트를 육안으로 검사하여 생존가능한 세포가 있는 각 칼럼의 최종 웰을 결정한다(〉25% 융합성 자주색 얼룩). 검출 한계는 바이러스 세포독성으로부터 보호하는 표준의 최저 농도로 결정한다. 최종 양성 웰의 샘플 희석도를 표준에 대하여 결정된 검출 한계치와 샘플 희석 인자를 곱하여 샘플 내 인터페론 활성(NU/ml)을 얻는다. 각 플레이트로부터의 결과는 기하 평균의 결정과 95% 신뢰 구간의 산출을 위해 로그 단위로 전환한다.
실시예 2: 완충제 시스템의 선택
본 발명자들은 각 세트 당 9 내지 10 가지 상이한 성분을 함유하는 완충제의 세 세트를 제조하였다. 세트Ⅰ은 pH 4.0 내지 7.2의 일련의 인산나트륨 및/또는 100 mM 염화나트륨을 함유한다. 세트Ⅱ는 pH 4.0 내지 7.0의 추가로 일련의 시트르산나트륨 완충제를 함유한다. 세트Ⅲ은 일련의 숙신산나트륨, 아세트산나트륨 및 탄산나트륨 완충액을 함유하며 모두 pH값이 4.0 내지 7.2 범위인 100 mM 염화나트륨으로 조합시킨다. 두 개의 다른 용액은 염화나트륨을 pH 4.0 내지 7.2의 황산나트륨으로 대체하였다.
해동시킨 벌크 인터페론-베타를 2 내지 8℃에서 두가지 이상의 완충제로 교환하면서 상이한 완충제로 밤새도록 투석한 다음, 사용전에 멸균 여과한다. 단백질 농도는 278 nm에서의 흡광도(흡광 계수는 1.5 mg-1ml·cm-1)로 측정하며 모든 샘플은 140 ug/ml 또는 150 ug/ml 인터페론-베타를 함유하였다. 샘플을 여과하고 2.2 ml 에펜도르프관을 부분적으로 채워서 네 개의 세트로 나눈다. 한 세트는 2 내지 8℃에 놓고; 한 세트는 37℃에서 6일 내지 2주 동안 놓고; 다른 세트는 7 내지 9시간동안 회전기 상에 놓고; 나머지 세트는 제로 타임 콘트롤로 사용한다. 불용성 응집물로 인한 단백질의 손실 백분율은 여러 치료 중의 단백질 농도의 손실을 출발 농도로 나눔으로써 산출한다.
결과:
불용성 응집물에 의한 단백질 손실 백분율은 출발 단백질 농도로 나눈 단백질 농도의 손실로서 산출한다. 모든 데이타의 통계학적 분석은 pH 4.0 내지 5.0의 완충제 내 인터페론 샘플이 더 높은 pH의 완충제 보다 응집물로 인한 단백질의 손실 백분율이 더 낮았다는 것을 나타낸다. 37℃ 및 pH 4.0 내지 5.0에서 배양된 인터페론 샘플은 응집물로 인한 약 10% 내지 15%를 손실하였다. 6.0보다 더 큰 pH값에서는 손실율이 40 내지 50%까지 증가하였다. 또한 본 발명자들은 인터페론 샘플이 6.0보다 더 큰 pH값에서 더 가용성인 응집물을 갖는다고 결론을 내렸다. 더욱이, 본 발명자들은 pH가 4.0에서 7.2로 증가함에 따라서, 탈아미드화되는 인터페론의 양이 실질적으로 직선으로 증가하며, 7.0 이상의 pH에서 85% 이상의 인터페론이 연구중에 탈아미드화되었다는 것을 펩티드 맵핑에 의하여 결론지었다. 본 발명자들은 IEF/웨스턴 블로트로 샘플내 단백질 화학종의 등전점(pI)(즉, 단백질이 전기장에서 이동하지 않으며 단백질 상의 평균 전하가 제로인 pH)을 측정하였으며 그 블로트는 시트르산 나트륨에서 샘플의 엑스트라 pI밴드 및 숙신산나트륨에서 샘플에 대한 밴드 강도의 이동을 나타낸다. 인산염은 pH 5.0에서 완충 능력이 없다. pH 5.0에서 염화나트륨과의 아세트산 나트륨은 밴드 패턴 또는 강도 변화를 나타내지 않았다.
실시예 3: 공동화 효과
실시예 2에 기재된 pH 스크리닝 실험 중에 저장 튜브의 헤드 공간이 샘플 일부의 단백질 손실에 대해 중요한 것으로 나타났다. 2.2 ml 부피 튜브 내 샘플 1.5 ml로는 단백질 손실이 관찰되지 않았다. 대조적으로, 1.2 ml 샘플에는 응집물의 상당한 증가가 일어났다. 이것은 정제 프로세스의 바이러스 비활성화 단계 중에 응집되는 인터페론-베타의 형성이 이 단계 중의 용존 산소 레벨에 의존한다는 본 발명자들의 관찰과 일치한다.
간단히, 바이러스 비활성화 단계는 15% 인산으로 7.85+/-0.25에서 2.5 내지 3.5로 킬레이트 세파로스 용출액(C 섹션 참조)의 pH를 조절하고, 120 내지 135분동안 산성화된 용출액을 유지한 다음, pH를 0.5 N 수산화나트륨으로 6.7+/-0.7로 재조절하는 것을 수반한다. 모든 단계는 2 내지 8℃에서 실행한다. 본 발명자들은 이 단계에서 인터페론-베타 응집물의 형성과 용존 산소의 양 간에 상관 관계가 있는지 결정하기위한 연구를 계획하였다.
재료 및 방법
킬레이트 세파로스 칼럼으로부터의 용출액을 50 ml 또는 100 ml 분액으로 나누고 100 ml 회전 플라스크로 넣었다. 각각의 플라스크에 아르곤을 살포한 15% 인산 1 ml를 가한다. 그 다음 플라스크를 약 2 분동안 천천히 교반하고 약 2시간동안 2 내지 8℃에서 교반하지 않고 방치한다. 이 방치 기간 후에, 아르곤을 살포한 수산화나트륨 6.5 ml를 가하고 샘플을 여러 시간에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 애세이한다. 액체 내 용존 산소를 산소 프로브(오리온, 모델 860)으로 연속해서 측정하고 염기 첨가시 기록한다. 용존 산소 레벨이 10% 이하인 샘플에 대해서 아르곤 가스를 반응 용기 헤드 공간을 통과시켜 세척한다.
결과:
수산화나트륨 첨가시 존재하는 용존 산소의 양과 바이러스 비활성화 단계를 통한 인터페론-베타의 수율 간의 명확한 관계를 밝히는 도 1에 데이타를 제공한다. 10% 이하의 용존 산소 농도에서 얻어진 수율은 다른 산소 농도에서의 모든 다른 수율과 상당히 다르다. 또한 본 발명자들은 응집물을 특성 분석하고(데이타는 본 명세서에 제공안함) 그 특이적인 활성이 벌크 중간물로부터 약 30 내지 40 배 감소된다고 결론지었다. 또한 본 발명자들은 약 90% 이상의 응집물이 비환원 조건하에서 SDS 변성에 내성이며, 공유 가교 결합을 암시한다고 결론을 내렸다. 환원 조건(2% 베타-메르캅토에탄올) 하에서 응집물은 모노머로 붕괴되며, 디술피드 결합을 수반하는 가교 결합을 암시한다고 결론지었다.
실시예 4: 부형제의 선택
여러 가지 부형제를 함유하는 일련의 인터페론-베타(60 ug/ml)를 50 mM 아세트산나트륨과 100 mM 염화나트륨을 함유하는 바람직한 pH 5.0 완충제로 제조한다. 부형제는 글리신, 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 당, 글리세린, PEG3350, 글루타티온 및 플루로닉 F-68을 함유한다. 인터페론-베타 벌크 중간물을 2 내지 8℃에서 두가지 이상의 완충제로 교환하면서 pH 5.0의 50 mM 아세트산나트륨 및 100 mM 염화나트륨으로 상이한 완충제로 밤새도록 투석한 다음, 사용전에 멸균 여과한다. 인터페론-베타 농도는 백그라운드 공제하여 278 nm에서의 흡광도에 의해 측정한다. 모든 샘플을 약 60 ug/ml의 최종 인터페론 농도로 희석한다. 모든 제조된 샘플을 여과하고 2 ml를 4 ml 유리 바이얼(비실리콘 처리)에 옮기고 헤드 공간을 아르곤으로 살포하여 바이얼을 밀봉한다. 샘플 세트를 2 내지 8℃ 및 37℃에 2주 까지의 기간 동안 놓는다. 다른 샘플은 실온에서 3일 동안 회전시켜서 기계적 응력을 준다.
실시예 1의 과정을 따라서 샘플을 분석한다. 또한, 제제 중의 용존 산소의 백분율을 시바 코닝(Ciba-Corning) 모델 248 혈류 가스 분석기에 의해 측정한다. "실험"치는 샘플의 산소 분압(mmHg)에서 질소 퍼지 완충제 블랭크의 산소 분압을 뺀 값이며 "콘트롤"치는 실온에서 저장된 완충제 블랭크 중의 산소 분압에서 질소 퍼지 완충제 블랭크의 산소 분압을 뺀 값이다. 용존 산소 백분율 ("실험"/"콘트롤")은 항상 30% 미만이다.
37℃에서 배양된 샘플의 IEF/웨스턴 블로트와 SDS-PAGE/웨스턴 블로트는 밴드 이동과 강도 손실, 뿐만아니라 PEG3350 및 글루타티온을 함유하는 샘플에서 인터페론 다합체의 존재를 나타낸다. 37℃에서 한 주 더 지나서 글리세린 부형제는 본 발명자들의 블로트에서 한 개의 엑스트라 밴드를 나타낸다. 수크로스 부형제는 밴드 강도의 손실을 나타낸다. 이 초기 스크리닝 과정은 더 이상의 연구를 위해 아르기닌-HCl, 글리신, 염화나트륨 및 만니톨을 더 상세하게 고려할 수 있게 한다.
실시예 5: 인터페론 흡착
해동시킨 벌크 인터페론-베타를 두 개 이상의 완충제로 교환하면서 2 내지 8℃에서 밤새도록 BG-9589-1,2,3 및 4(표 1 참조)로 투석하고, 사용 전에 여과한다. 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도(흡광 계수는 1.5 mg-1ml·cm-1)로 측정한다. 모든 샘플을 대략 60 ug/ml의 최종 농도로 희석한다. 희석시킨 샘플을 여과하고 0.5 ml를 질소로 헤드 공간을 세척하여 세 벌로 1.0 ml 길이의 스프레이 처리 실리콘 BD 주사기(Ⅰ형 유리)에 채우거나, 0.75 ml를 아르곤으로 헤드 공간을 세척하여 세 벌로 0.75 ml Ⅰ형 유리 바이얼에 채운다. 단백질 농도는 역상 HPLC(실시예 1)로 결정한다.
결과:
하기 표 3은 역상 HPLC로 측정한 단백질 농도를 열거한다. 그 데이타들은 실리콘 코팅 사전충진식 주사기와 비교하였을 때 유리 바이얼로 충진된 샘플에 단백질이 더 적었다는 것을 가리킨다. 그러므로 실리콘 처리 주사기가 인터페론-베타의 액체 제제에 사용된다.
| 유리 바이얼(ug/ml)(S.D) | 실리콘 처리 주사기(ug/ml)(S.D) | |
| BG9589-1 | 59.3(2.6) | 63.3(2.5) |
| BG9589-2 | 58.3(0.7) | 61.7(0.1) |
| BG9589-3 | 56.4(0.4) | 58.8(1.1) |
| BG9589-4 | 55.5(0.7) | 59.3(0.5) |
실시예 6: 생리학적 pH에서의 제제
이온 강도/인산염. 완충제 성분 농도를 변화시킨 pH 7.2의 완충제 시스템인 인산염/염화나트륨으로 초기 연구를 실행하였으며, 여기서 인산염 농도는 10, 50 및 75 mM 사이에서 변하였으며 이온 강도(I= ΣcIzI 2로 정의되며, 식중, cI및 zI는 각기 이온종 I의 몰 농도와 원자가 전하이다)가 0.2, 0.4 및 0.6이고, 염화나트륨을 첨가하여 조절하였다.
인산염(10, 50 및 75 mM) 및 이온 강도(I = 0.2, 0.4 및 0.6)의 변수에 대한 완전 요인 배치 실험을 사용하였다. 완충제 중의 인산나트륨 일염기, 인산나트륨 이염기 및 염화나트륨(목적하는 이온 강도를 얻기 위하여)의 조성을 엘리스(Ellis) 및 모리슨(Morrison)의 "pH 의존성 프로세스 연구를 위한 일정한 이온 강도의 완충제", Methods Enzymol. 87:405-426(1982)에 따른 스프레드시트를 사용하여 계산한다. 그 식으로 특정 pH, 인산염 농도 및 이온 강도에 대한 각 완충제 성분의 필요량을 결정하였다. 요인 배치 실험에 사용되는 아홉 개의 용액 각각을 파마시아(Pharmacia) PD-10 탈염 칼럼을 통하여 인터페론-베타 벌크 중간물을 완충제 교환함으로써 얻는다. 모든 얻어진 용액의 pH는 7.20+/-0.15이다. 농도를 280 nm에서의 흡광도로 애세이한 다음 적당한 완충제로 150 ug/ml 인터페론-베타로 희석한다. 얻어진 용액을 아르곤 하에 0.22 미크론 필터를 통과시켜 멸균 여과하고, 1.3 ml를 아르곤 헤드 공간을 가진 5 ml 유리 바이얼로 분액하였다. 샘플을 37℃에서 6일 동안 배양하고 삼중조로 하였다.샘플을 580 nm에서의 투과 백분율, 단백질 회수 백분율 및 IEF-PAGE/웨스턴 블로트에 의해 분석한다.
결과:
이온 강도 변화에 대한 투과 백분율의 분석은 이온 강도가 증가됨에 따라서 투과율이 증가되는(즉, 불용성 단백질 응집물의 양이 감소되는) 경향임을 나타낸다. 비록 IEF-PAGE 웨스턴 블로트는 이온 강도가 변함에 따른 탈아미드화 경향을 나타내지 않고 모든 샘플이 동일하게 탈아미드화하는 것으로 나타나지만 단백질 회수 백분율의 데이타는 유사한 경향을 나타낸다. 그러므로 6일 동안 37℃에서 저장한 후, 샘플은 인산염 농도가 감소되고 이온 강도가 증가됨에 따라서 더 적은 응집물을 나타내는 경향이 있었다. 인산염 농도 변화의 함수로서 투과 백분율 및 회수 백분율에 대한 실험 결과(본 명세서에서 제공하지 않음)는 인산염 농도가 증가함에 따라서 투과%가 감소하려는 약한 경향을 나타내지만, 변화 분석은 상이한 인산염 농도에 대한 샘플 평균의 상당한 차이를 나타내지 않는다. 회수 백분율 데이타는 더 낮은 인산염 농도에 대해서 개선된 단백질 회수율을 나타낸다(94% 신뢰 레벨에서 상당한 차이). IEF-PAGE 웨스턴 블로트는 인산 농도 변화에 따른 탈아미드화의 식별가능한 경향을 나타내지 않는다.
부형제/염 비. 예비 연구(도시 안함)는 고 이온 강도를 유지하고 pH 7.2에서 안정화 효과를 나타내기 위하여 어떤 부형제는 염(예를 들면, 염화나트륨)을 필요로 할 수 있다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 부형제(글리신, 리신, 알기닌, 수크로스 및 만니톨)와 등장성에 기여하는 염화나트륨의 분획(f염= 0, 0.25, 0.75 및 1.0)을 사용하여 요인 배치 연구를 실험하였다. 분획은 [f염= O염/(O염+ O부형제)]로 계산하며, 식중에서 O염및 O부형제는 용액 중의 각기 염화나트륨과 부형제의 삼투몰농도(mOsm/kg)이다. 염 분획은 모든 상이한 부형제에 걸쳐서 염 효과를 비교하는 수단을 제공한다. 모든 샘플은 부형제:염의 비(f염으로 정의됨) 변화에 따라서 등장에 대한 첨가제를 함유한다.
pH 7.2인 20 mM 인산염 중의 각 부형제의 10%(v/w) 원액을 제조하고, 탈기하고 아르곤으로 세척한다. pH 7.2인 250 mM 염화나트륨, 20 mM 인산염의 원액을 제조하고 탈기하고 아르곤으로 세척한다. 벌크 인터페론-베타 중간물을 아르곤으로 세척한 20 mM 인산염 pH 7.2 완충제로 대충 투석한다. 얻어진 용액을 280 nm에서의 흡광도에 의해 인터페론-베타 농도에 대해서 애세이하고 인산 완충제와 부형제 및 염의 각각의 원액으로 희석하여 60 ug/ml 인터페론-베타와 목적하는 최종 염 및 부형제 조건을 얻는다. 얻어진 샘플을 여과 멸균하고(0.22 미크론) 질소 헤드 공간을 가진 1.0 ml 벡톤 디킨슨 스프레이 처리 실리콘, Ⅰ형 유리 주사기(0.5 ml 충진 부피)로 채운다. 샘플을 40℃에서 저장한다.
6일 째에, 아르기닌, 글리신 및 수크로스 샘플을 0.22 미크론 필터를 통과시키는 여과 전후에, 320 nm 및 280 nm에서의 흡광도로 분석한다. 2주 째에, 아르기닌, 리신 및 만니톨을 IEF-PAGE, 환원 SDS-PAGE 및 비환원 SDS-PAGE와 함께 유사하게 분석한다. 콘트롤 샘플을 2 내지 8℃에서 저장하고 유사하게 분석하였다.
결과:
인터페론-베타 1a의 회수율(콘트롤의 백분율로서)은 수크로스 및 만니톨에 대한 f염을 증가시킴에 따라서 증가하며, f염= 1(130 mM 염화나트륨)에서 최대 회수율에 도달한다. 아르기닌 및 리신의 경우, 회수율은 f염이 증가함에 따라 감소한다. pH 7.2에서 글리신 제제에 대한 최대 회수율은 약 f염= 0.75에서 도달한다.
등장에 첨가되는 글리신, 리신, 아르기닌, 만니톨 및 수크로스 등과 같은 여러가지 부형제와 함께 pH 7.2 인산 완충제를 사용하는 이 부형제 스크리닝 연구는 모든 전하를 띄지 않는 부형제에 대해서 빈약한 회수율을 나타내었다. 탈아미드화 정도는 이들 첨가제에 영향받지 않았다. 예를 들면, 환원 및 비환원 SDS/PAGE는 모든 제제에서 비글리코실화 인터페론-베타 화학종의 손실과, 등장성 염화나트륨 단독 및 만니톨에 대해 더 무거운 다합체 밴드를 나타낸다. 말하자면, 부형제의 이온 특성과 생리학적 pH에서 이들 완충제 시스템 내 응집물에 대하여 인터페론-베타를 안정화시킬 수 있는 그 능력 간에는 강한 상관 관계가 있다. 수크로스 및 만니톨과 같은 비이온성 첨가제는 보호를 제공하지 않는 것으로 나타나거나 생리학적 pH에서 실질적으로 단백질 손실을 촉진할 수 있다. 가용성 화학종 당 단일 전하를 가진 염화나트륨은 만니톨이나 수크로스 보다 더 잘 실행한다. 아미노산은 생리학적 pH에서 분자당 두 개의 전하를 함유한다. 글리신의 경우, 분자 자체의 쯔비터 이온 성질은 인터페론-베타를 안정화시키기에 충분한 것으로 보이지 않는다. 각기 분자당 세 전하를 함유하는 아르기닌과 리신은 염화나트륨 단독 또는 글리신/염화나트륨 제제 보다 더 잘 인터페론-베타를 안정화시킨다.
실시예 7: 안정성 및 동력학적 연구
제제를 비활성 분위기하에 무균 충진하고 주사기를 시간 변화에 대한 온도 범위에서 배양하고 주사기 내용물을 분석한다. 간단히, 해동 벌크 인터페론-베타를 두 개 이상의 완충제로 교환하면서 2 내지 8℃에서 밤새도록 BG9589-1,2,3 및 4로 투석한다. 단백질 농도는 흡광 계수가 1.5 ml/mg/cm인 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정한다. 모든 샘플을 약 60 ug/ml의 최종 인터페론-베타 1a 농도로 희석한다. 표 1의 네 개의 인터페론-베타 1a를 여과하고 내면을 소성 실리콘 또는 스프레이 처리 실리콘으로 코팅한 1.0 ml 길이의 벡톤 디킨슨(BD) 주사기로 0.5 ml를 분배한다. 샘플을 OD, 크기 배제 HPLC(SEC), 등전집속 겔 전기영동(IEF)/웨스턴 블로트, 환원 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)/웨스턴 블로트, 펩티드 맵핑, 형광단 관련 탄수화물 전기영동(FACE) 및 CPE 바이오애세이에 의하여 분석한다. 주사기 내 헤드 공간은 질소이다. 주사기를 2 내지 8℃, 25℃, 33℃ 및 40℃에서 9일에 이르기까지 배양한다. 실시예 1의 방법에 따라서 샘플을 분석한다.
결과:
본 발명자들의 샘플의 단백질 농도를 분석하고 여러 온도에서 90일 까지의 기간 동안 출발 물질의 단백질 농도에 대해서 정규화하였다. 도 2는 BG9589-1이 2 내지 8℃(평균 4℃)에서 25℃까지의 온도 범위에서 3개월 배양후 완전한 단백질 안정성(단백질 손실 없음)을 나타내었다는 것을 보여준다. 체온에 가까운 저장 온도(33℃)에서, 약 18%의 단백질이 분해되었다. 체온을 초과하는 저장 온도(40℃)에서는 3개월의 끝무렵에 약 30%의 단백질이 분해되었다. BG9589-2에 대해서 실질적으로 동일한 결과를 얻었다(도시 안함). 도 3은 BG9589-3에 대한 2개월 저장 테스트의 결과를 나타낸다. 단백질 분해는 4 내지 25℃에서 최소였지만 더 고온에서는 빠르게 분해되었다. BG9589-3의 결과는 도 2 및 도 3의 것들과 실질적으로 동일하였다. 이들 데이타는 환원 SDS-PAGE/웨스턴 블로트로 확인하였다.
"소성" 주사기에서, 이 연구 기간에 걸쳐서 검출가능한 가용성 응집물은 나타나지 않았다. 단백질 농도, CPE 애세이, 산화 AP6 백분율 및 탄수화물 프로파일의 상당한 변화는 관찰되지 않았다. 환원 SDS-PAGE/웨스턴 블로트 및 IEF/웨스턴 블로트로 알 수 있는 바와 같은 샘플 내 관찰가능한 변화는 없다. 출발 시간점과 비교하여 약간의 탈아미드화 백분율 증가는 있다. 그러나, 이들 주사기를 충진하는데 사용한 벌크 중간물은 탈아미드화가 37%이며, 이는 주사기로 채운 후 물질의 33.8% 보다 더 높다. 후자의 낮은 값은 애세이 변이성으로 인할 수 있다. "스프레이 처리" 주사기에서는 이 연구 기간에 걸쳐서 검출가능한 가용성 응집물은 없었다. 단백질 농도, CPE 애세이, 탈아미드화 백분율, 산화 AP6 백분율 및 탄수화물 프로파일의 상당한 변화는 관찰되지 않았다. 환원 SDS-PAGE/웨스턴 블로트 및 IEF/웨스턴 블로트로 알 수 있는 바와 같은 샘플 내 관찰가능한 변화는 없다. 요컨대, 지금까지의 결과는 최종 생성물 BG9589-1이 "소성 실리콘" 주사기의 경우, 2 내지 8℃에서 3개월까지 안정하고, "스프레이 처리 실리콘" 주사기의 경우, 2 내지 8℃에서 6개월까지 안정하다는 것을 나타내고 있다.
본 발명자들은 주사기를 무균 충진한 후 제제 BG9589-1 및 BG9589-2(표 1 참조)에 대한 항바이러스 CPE 분석을 행하였다. BG9589-1 및 BG9589-2에 대한 보고된 활성 값은 12.0 MU/ml이다. 2 내지 8℃에서 3개월까지 샘플을 저장한 후 항바이러스 CPE 애세이를 반복하였다. BG9589-1에 대한 보고된 활성 값은 11.6 MU/ml이고 95% 신뢰 구간은 10.2 내지 13.3 MU/ml이다.
또한 본 발명자들은 2 내지 8℃에서 5개월 동안, 그리고 -70℃에서 6개월 동안 BG9589-1의 벌크 중간물 물질의 안정성을 측정하였다. 파일롯 완전여과 (diafiltration) 연구로부터 BG9589-1의 샘플을 실시예 1의 방법에 의해 분석하였다. 지금까지의 결과는 BG9589-1의 제조과정 중의 물질이 2 내지 8℃에서 5개월 동안, 그리고 -70℃에서 6개월 동안 안정하다는 것을 나타낸다.
이 구체적인 연구 기간에 걸쳐서, 검출가능한 가용성 응집물은 없었다. 탈아미드화 백분율과 탄수화물 프로파일의 상당한 변화는 관찰되지 않는다(탈아미드화 백분율의 차이는 애세이 변이성 내에 있다). 환원 SDS-PAGE/웨스턴 블로트 및 IEF/웨스턴 블로트로 알 수 있는 바와 같은 샘플 내 관찰가능한 변화는 없다. -70℃에 대한 단백질 농도 감소는 샘플이 한 냉동/해동 사이클을 거치기 때문일 것이다. 그럼에도 단백질 농도의 감소는 초기 농도의 15% 이내이다.
실시예 8: 예비 임상 연구
몇가지 새로운 제제로 투여했을 때 인터페론의 국소 독성을 평가하는 토끼의 단일 근육내(IM) 투약 국소 내성 연구를 실행한다. 본 액체 조성물 또는 동결건조 및 재조합 인터페론 제제로의 투여로 인한 주사 부위 반응은 정상 염수의 투여후 다음 증거들과 필적한다.
1. 인터페론-베타의 네가지 제제의 단일 투약 IM 투여후 토끼 자극/생체이용효율 연구
뉴질랜드산 흰토끼 20 마리의 수컷 각각에 다음 다섯 가지 제제 중 한 가지로서 인터페론 베타-1a의 단일 30 ug 근육내 주사하였다: BG9589-1(pH 5.0, 아세트산 완충제, 아르기닌 안정화제, 0.5 ml/투여량); BG9589-2(pH 5.0, 아세트산 완충제, 글리신/NaCl 안정화제, 0.5 ml/투여량); BG9589-3(pH 7.2, 인산 완충제, 아르기닌 안정화제, 0.5 ml/투여량); BG9589-4(pH 7.2, 아세트산 완충제, 글리신/NaCl 안정화제, 0.5 ml/투여량); 및 pH 7.2이고 1.5% HSA를 함유하는 동결 건조 인터페론-베타 제제 1.0 ml/투여량(제이콥스 등의 전술한 문헌 참조)
네 마리 동물들에게 각각의 치료를 행하였다. BG9589-1 또는 동결건조 제제를 투여한 동물들에게 음성 콘트롤로서 반대쪽 동일 부위에 정상 염수의 등가 부피 주사를 다시 행하였다. 투약후 72시간 동안 혈청 인터페론 활성 분석을 위하여 혈액 샘플을 채집하였다. 홍반, 반흔 형성 및 부종에 대한 피부의 육안 평가를 투약후 6, 12, 24, 48 및 72시간 경과시 실행한다. 투약 72시간후 혈액 채집에 이어서, 동물을 희생시키고, 주사 부위를 조직 손상의 증후에 대해서 육안으로 검사한 다음, 10% 중성 완충 포르말린에 고정시킨다. 근육 샘플(3/주사부위)을 염증, 괴사, 출혈 및 병변에 대해서 현미경으로 검사한다.
결과:
일차 자극 지수 점수(EPA 피부 분류 시스템)에 의해 등급을 나눌 때, 상기 자극 제제 중 어느 것도 경 피부 자극제 이상인 것으로 결정되지 않았다. 한 동물의 BG9589-4 주사 부위의 육안 검사는 약간의 자극(출혈)을 나타냈지만, 현미경 조사로는 출혈의 증후가 없는 것으로 나타났으며 육안 관찰은 인위 구조였던 것으로 결정되었다. 요컨대, 현미경 조사는 액체 제제 테스트 약품 주사 부위 반응은 일관되게 최소 내지 경증 반응이었고 동결 건조 제제 또는 정상 염수의 투여로 유발된 것 보다 더 심한 반응은 없었던 것으로 나타났다.
또한, 액체 제제의 반복된 IM 투여후 토끼 피부 자극은 8일 동안 이틀 마다(총 5회 투약) 액체 제제 또는 정상 염수를 근육내 주사한 복수군의 토끼를 사용하여 용이하게 테스트할 수 있다. 각각의 동물의 등에 미리 규정한 부위에 투여하여 테스트 약품에 대한 국소 노출을 최대화한다. 육안 피부 평가는 각 처치군에 대해서 각각의 투여후 4 내지 6 시간째 및 최종 투여후 24 시간째에 행한다. 투약 24시간후 육안 검사에 이어서, 동물을 희생하고, 주사 부위를 조직 손상의 증후에 대해서 검사하고 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정시킨다. 보존된 조직을 염증, 괴사, 출혈 및 병변에 대해서 현미경으로 검사한다. 또한 혈액 샘플을 혈액학 및 혈청 화학 평가를 위하여 초기 테스트 약품 투여 직전 및 희생시 채집한다.
실시예 9: 임상 연구
본 액체 제제는 종래의 인터페론 제제와 상당히 다르다. 어떤 임상 징후에 대해서, 사람에게 투여했을 때 인터페론의 약력학 및 약동학적 행동 변화에 대한 가능성이 있다. 불행하게도, 인터페론-베타의 활성은 매우 종 특이적이고 대부분의 타당한 약리학적 정보는 사람 배양 세포 연구, 생체 연구 및 그다지 많지는 않지만 붉은 털 원숭이(rhesus monkey) 연구로부터 유도된다. 약리학적 변화(있다면)에 대한 가장 바람직한 테스트 방법은 사람의 생물학적 등가성 시험을 행하는 것이다.
혈청내 항바이러스 레벨은 실시예 1에서 예로서 기술한 바와 같이, 세포 변성(CPE) 바이오애세이를 사용하여 정량화될 수 있다. 사람 생물학적 등가성 연구는 다수의 액체 및 동결 건조 인터페론 제제로 실행될 수 있다. 혈청 분석, 곡선하면적(AUC) 및 C최대활성 변수를 통하여, 통상의 기술을 가진 자라면 동결 건조 및 액체 제제가 생물학적 등가성인지를 결정할 수 있다. 생물학적 등가성 연구 프로토콜의 한 가지 예이기는 하지만, 본 발명자들은 간단히, 이중 맹검, 단일 투약, 크로스오버 연구를 기술하여 건강한 지원자에게서 본 발명의 액체 제제와 동결 건조 인터페론-베타 생성물의 생물학적 등가성을 설명한다.
계획. 이중 맹검, 2 주기 크로스오버에서 각각의 피험자에게 동일한 투여량(예를 들면, 60 ug/12MU)의 인터페론-베타 제제를 투여한다(표 4). 피험자들은 18 내지 45세이며 신장 및 체형에 대해서 정상 체중 범위의 15% 이내이다. 혈액학, 화학, 혈청 인터페론 베타 활성 및 약리학적 프로파일을 위한 혈액 샘플을 투여 직전 및, 투여후 144시간에 걸쳐서 각 투약후 여러 시간대에서 채집한다. 주사 통증 및 주사 부위 반응의 평가도 행한다.
연구 실행. 인터페론 관련 감기 증후군에 대한 예방 조치로서, 모든 피험자에게 투여 기간 직전 및 투여 기간에 걸쳐서 아세트아미노펜을 투여한다.
약력학.
혈청 인터페론 베타 측정. 혈청 레벨은 (CPE) 애세이에 의해 항바이러스 활성의 유니트로서 측정한다. 혈청 항바이러스 레벨을 AUC, C최대및 T최대에 대하여 분석한다. AUC 값은 투약 시간으로부터 최종 검출가능한 레벨(AUC0-T), 그리고 투약후 144시간에 걸쳐서(AUC0-144) 산출될 것이다. 치료 데이타의 표준 도형 분석은 SAS(버전 6.08, 노스 캐롤라이나주 캐리 소재 SAS 연구소)를 사용하여 실행한다.
| 투약군 | 경로 | 투여량(MU) | 치료 주기1 | 치료 주기2 |
| 1 | IM | 12 | 동결건조(60 mcg) | 액체(60 mcg) |
| 2 | IM | 12 | 액체(60 mcg) | 동결건조(60 mcg) |
약동학. 대식 세포 및 T 세포 활성을 반영하는 인터페론 유발 효소 GTP 시클로히드롤라제의 생성물인 생물학적 마커 네오프테린[휴버(C. Huber) 등의 J. Exp. Med. 1984;160:310-314;1996년 9월 20일; 푹스((D. Fuchs) 등의 Immutol. Today 9: 150-155,1988]은 그 특징이 규명되었다. 재조합 사람 인터페론 베타의 비임상 및 임상 연구에서, 네오프테린의 유발은 여러 가지 재조합 사람 인터페론 베타 치료의 투여후 혈청 활성 레벨가 상호 관련있다.
네오프테린은 표준 실험실 방법에 의해 측정된다. 인터페론-베타의 약동학 프로파일은 세 가지 혈청 네오프테린 매개변수의 계산에 의해 정량적 방식으로 기술되었다. 첫번째 매개변수, EAUC은 네오프테린하 면적 대 기준선 레벨로 정규화된 시간 곡선이다. 두번째 매개변수는 E최대이고 이 매개변수는 관찰 피크 네오프테린 레벨과 기준선 네오프테린 레벨의 차이이다. 세번째 매개변수는 유발율, IR이고, 이 매개변수는 피크 네오프테린 레벨을 기준선 네오프테린 레벨로 나누어 계산한다.
통계. 윌콕슨-맨-휘트니(Wilcoxon-Mann-Whitney) 이면, 일면 테스트 방법을 AUC에 관해서 사용하여 등가를 결정한다. 동결 건조 제제에 대한 액체 제제로부터의 인터페론의 상대 생물학적 등가성 및 그 90% 신뢰 한계를 평가하기 위하여, AUC로 대수 변환후 분산 분석(ANOVA)을 행한다. "피험자 간" 변분으로부터 순서와 성을 분리시킨다. "피험자 내" 변분으로부터 기간 및 치료로 인한 성분은 분리시킨다.
본 발명의 다른 구체예와 용도는 여기에 개시된 발명의 상세한 설명과 실시예를 고려하여 이 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 상세한 설명과 실시예는 다음 청구의 범위로 나타내는 본 발명의 진정한 범주와 사상 내에서 단지 예시를 하고자 하는 것이다.
Claims (43)
- 인터페론과, 산성 아미노산, 아르기닌 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산인 약 0.3 중량% 내지 5 중량%의 안정화제로 이루어지며, 사전 동결 건조시키지 않은 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 표면이 인터페론에 비활성인 물질로 코팅되는, 상기 액체 조성물을 함유하는 용기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제1항에 있어서, 인터페론은 인터페론-베타 또는 재조합하여 생성된 인터페론인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제1항에 있어서, pH가 약 4.0 내지 약 7.2인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제4항에 있어서, pH가 약 4.8 내지 5.2인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제5항에 있어서, pH가 5.0인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제5항에 있어서, 산성 아미노산이 글루탐산인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제1항에 있어서, 아르기닌이 아르기닌-HCl인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제1항에 있어서, 인터페론 농도가 약 6 IMU/ml 내지 50 IMU/ml인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 용기의 상기 하나 이상의 표면이 실리콘 및 폴리테트라플루오로에틸렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 코팅되는 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제10항에 있어서, 용기가 주사기인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 인터페론-베타와, (a) 150 mM 아르기닌; (b) 100 mM 염화나트륨 및 70 mM 글리신; (c)150 mM 아르기닌 및 15 mg/ml 사람 혈청 알부민; (d) 150 mM 아르기닌 및 계면활성제; (d) 140 mM 염화나트륨; (e) 140 mM 염화나트륨 및 15 mg/ml 사람 혈청 알부민; 및 (f) 140 mM 염화나트륨 및 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택되는 안정화제를 포함하며, 사전 동결 건조시키지 않은 pH 5.0의 20 mM 아세트산 완충제.
- 제12항에 있어서, 계면활성제는 0.1%(w/v) 플루로닉 F-68인 것을 특징으로 하는 완충제.
- 제12항에 있어서, 아르기닌은 아르기닌-HCl인 것을 특징으로 하는 완충제.
- 제12항에 있어서, 상기 완충제를 포함하며, 완충제와 접촉하는 하나 이상의 표면이 실리콘 및 폴리테트라플루오로에틸렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 코팅되는 용기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 완충제.
- 제15항에 있어서, 용기가 주사기인 것을 특징으로 하는 완충제.
- 인터페론-베타 및 170 mM L-글루탐산을 포함하며, 사전 동결 건조시키지 않은 pH 5.0의 액체 조성물.
- 제1항에 있어서, 아미노산 글리신을 포함하며, 염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제17항에 있어서, 15 mg/ml 사람 혈청 알부민 및 0.1%(w/v) 플루로닉 F-68로 구성된 군으로부터 선택되는 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 인터페론-베타와, (a) 140 mM 아르기닌; 및 (b) 70 mM 글리신과 조합한 100 mM 염화나트륨으로 구성된 군으로부터 선택되는 안정화제를 포함하며, 사전 동결 건조시키지 않은 pH 7.2의 20 mM 인산 완충제.
- 제20항에 있어서, 상기 액체를 포함하며, 완충제와 접촉하는 하나 이상의 표면이 실리콘 및 폴리테트라플루오로에틸렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 코팅되는 용기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제20항에 있어서, 용기가 주사기인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 포유류에게 비경구 투여하기에 적합하고 유효량의 인터페론-베타, pH를 4.0 내지 6.0 범위 내에서 유지하는 완충제 및 아미노산 안정화제로 이루어지고, 상기 인터페론-베타는 사전 동결 건조시키지 않으며, 액체 조성물과 접촉하는 하나 이상의 표면이 실리콘 및 폴리테트라플루오로에틸렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 코팅되는 저정 용기 내에 함유되는 액체 약학적 조성물.
- 제23항에 있어서, 저장 용기는 산소 함유/액체 계면이 없는 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제23항에 있어서, 인터페론-베타는 약 2℃ 내지 약 25℃의 온도에서 2 개월 이상의 기간 동안 저장 중에 항바이러스 활성을 필수적으로 유지하는 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제23항에 있어서, 인터페론-베타는 사전 공동화되지 않은 것을 특징으로 하는 액체 조성물
- 제23항에 있어서, 완충제는 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 푸마르산, 글루콘산, 옥살산, 락트산 및 아세트산 완충제로 구성된 군으로부터 선택되는 유기산 완충제인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제23항에 있어서, 아미노산 안정화제는 산 아미노산, 글리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제28항에 있어서, 아미노산은 조성물을 기준으로 약 0.3 중량% 내지 약 5.0 중량%의 양으로 첨가시키는 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제23항에 있어서, 액체 조성물의 pH는 4.5 내지 5.5의 범위인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제30항에 있어서, 액체 조성물의 pH는 5.0인 것을 특징으로 하는 액체 조성물
- 제23항에 있어서, 멸균한 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제23항에 있어서, 혈액에 등장성인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제23항에 있어서, 인터페론-베타는 사람 재조합 인터페론-베타인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 제34항에 있어서, 사람 재조합 인터페론-베타의 활성은 6 내지 50 IMU/ml 단백질인 것을 특징으로 하는 액체 조성물.
- 인터페론과, 산성 아미노산, 아르기닌 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산인 약 0.3 중량% 내지 3.13 중량%의 안정화제로 이루어지며, 사전 동결 건조시키지 않은 것을 특징으로 하는 냉동 액체 조성물.
- a) 사전 동결 건조시키지 않은 약학적으로 유효량의 인터페론-베타 및 약 3.1 중량% 이하의 아미노산 안정화제로 이루어지는 pH 4 내지 6의 액체 제제를 함유하는 용기; 및 b) 그것의 사용 지시서를 포함하는, 액체 인터페론 제제의 비경구 투여용 키트.
- 제37항에 있어서, c) 알코올 면봉; d) 바늘; 및 하나 이상의 접착 밴드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제37항에 있어서, 용기는 액체 조성물과 접촉하는 하나 이상의 표면이 실리콘 및 폴리테트라플루오로에틸렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 코팅되는 주사기인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제39항에 있어서, 용기는 주사기이고 주사기에 포함되는 액체 제제는 산소 함유/액체 계면이 없는 것을 특징으로 하는 키트.
- 인터페론-베타가 약 2℃ 내지 약 25℃의 온도에서 3 개월 이상의 기간 동안 저장 중에 항바이러스 활성을 필수적으로 유지하도록, a) 인터페론-베타; b) pH를 4.0 내지 7.2의 범위 내에서 유지하는 완충제; 및 c) 아미노산 안정화제를 혼합하는 단계를 포함하는, 사전 동결 건조시키지 않고 공동화되지 않은 액체 약학적 조성물내 인터페론-베타의 안정화 방법.
- 제42항에 있어서, 적당한 이온 강도를 제공하도록 염을 혼합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제42항에 있어서, 염은 염화나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
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