KR20000029783A

KR20000029783A - 골다공증치료를위한부갑상선호르몬유사체

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Publication number: KR20000029783A
Application number: KR1019997000903A
Authority: KR
Inventors: 바르비에쟝-르네; 몰리폴; 노게바우어위톨드; 로스버지니아; 위트필드제임스; 윌릭고든이.
Original assignee: 루시에 라포인테-쇼우;카르타 커티 케이; 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 2000-05-25
Anticipated expiration: 2017-08-01
Also published as: GEP20033095B; FI990126L; DK0915911T3; CZ34799A3; JP4122061B2; CN1231676A; BR9711002B1; LV12293A; CA2261564A1; AU3690597A; IS4962A; BR9711002A; ATE253078T1; LV12293B; SI9720057A; DE69725850D1; WO1998005683A1; EP0915911A1; CA2261564C; EP0915911B1

Abstract

본 발명은 대사 안정성, 골재생 활성, AC 활성이 증대되고 임상적 부작용은 최소화되어, 특히 골다공증 치료에 효과적인 새로운 PTH 유사체를 제공하는 데 그 목적이 있다. 이 펩티드는 hPHT(1-31)의 변형체로, 일 예로 Glu²²-Lys²⁶, 또는 Lys²⁶-Asp³⁰사이에 락탐이 형성된 형태를 포함한다. 또한, 천연의 Lys²⁷이 Leu 이나 기타 소수성 잔기, 즉, Ill, 노를류신, Met, Val, Ala, Trp 또는 Phe 로 교체될 수도 있다. 통상, 해당 유사체들은 래트의 골육종 세포에서 아데닐일 사이클라제를 촉진시키는 기능을 강화하였고, 난소 적출된 래트 모델에서 골재생 활동을 증가시켰다. 실험을 통해 해당 유사체가 래트의 혈압에 미치는 효과(혈압 강하 효과)를 살펴본 결과, 유사체의 활동 및 생물학적 활성도가 높은 것으로 나타났다. 혈압 강하 작용과 골형성 작용의 연관 관계를 알아보는 측정 검사도 또한 제시되었다.

Description

골다공증 치료를 위한 부갑상선 호르몬 유사체 {PARATHYROID HORMONE ANALOGUES FOR THE TREATMENT OF OSTEOPOROSIS}

골다공증은 노인층, 특히 노년기 여성에게 장애를 일으키는 주요 요인이다. 최근들어 인간 부갑상선 호르몬(hPTH) 및 그 특정 유사체가 골다공증 치료에 유용한 뼈의 성장 자극제인 것으로 알려졌다. 골다공증은 전체 골 질량 감소 및 골 연화를 초래하는 진행성 질병이다. 골다공증으로 인해, 힘을 받는 뼈가 쉽게 자연 골절되며, 신체 및 정신적 쇠퇴가 초래되어 거동이 불가능해지는 상처를 입기 쉽게된다. 오래된 뼈의 흡수(bone resorption)와 새로운 뼈의 생성 간에 불균형을 심화하여 오랜 기간 동안 뼈의 대사를 증진시키는 역할을 해온 에스트로겐이 사라진 것이 폐경기 이후 골다공증의 원인이다. 이로써, 힘을 받는 뼈가 가늘어지고, 구멍이 증가하고, 소주 고갈(trabecular depletion)이 있게 된다. 골다공증은 또한, 갑상선 기능 항진증, 부갑상선 기능 항진증, 쿠싱 증후군(Cusing's syndrome), 및 특정 스테로이드 약품의 사용 등과도 관련이 있다. 기존 치료법에는 칼슘 섭취량 증가, 에스트로겐 요법, 비타민 D 투입량 증대가 관련되며, 주요 방법은 파골세포에 의한 골흡수를 저해하는 항흡수제(antiresorptives) 등과 같은 약품 사용이다.

부갑상선 호르몬(PTH)은 부갑상선에서 생성되며 혈중 칼슘 수준을 조절하는 인자로 중요하다. PTH는 폴리펩티드이며, Erickson 과 Merrifield 이 개시한 방법으로 합성 폴리펩티드를 제조할 수 있다(Erickson and Merrifield, The Proteins, Neurath et al., Eds., Academic Press, New York, 1976, page 257, Hodges 등의 변형법: Hodges et al(1988), Peptide Research 1, 19, Atherton 등의 변형법: Atherton, E. And Sheppard, R.C. Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1989).

혈청 칼슘이 정상 수준 이하로 감소하면, 부갑상선이 PTH를 분비하고, 골 칼슘 흡수, 장에서의 칼슘 흡수, 신장의 신장 세관 속 신생 뇨로부터의 칼슘 재흡수 작용이 증대되어 칼슘 수준이 증가한다. PTH가 지속적으로 낮게 투입될 경우 뼈로부터 칼슘이 제거되는 결과를 가져올 수 있지만, 실제로 낮은 수준의 투입량을 간헐적으로 주입하면 뼈의 성장을 촉진할 수 있다.

Tregear(미국 특허 4,086,196)는 인간 PTH 유사체를 개시하면서, 시험관 내 세포 측정검사를 통해 처음의 27번에서 34번까지의 아미노산이 아데닐일 사이클라제(adenylyl cyclase) 자극에 가장 효과적이라고 주장하였다. Rosenblatt(미국 특허 4,771,124)는 Trp²³를 PTH 길항물질인 페닐알라닌, 류신, 노를류신, 발린, 티로신, β-나프틸알라린 또는 α-나프틸알라닌으로 교체한 hPTH 유사체의 성질을 개시하였다. 또한, 변형된 hPTH 유사체에서 2번과 6번 터미널 아미노산(2 and 6 amino terminal acid)이 제거되어, 골다공증 치료를 위해 사용될 때의 대부분의 작용활동(agonist activation)이 손실되었다. 이 유사체는 PTH 및 PTH-연관 펩티드의 억제제로 만들어졌다. 이 유사체는 일부 종양과 연관된 칼슘과잉혈증 치료에 유용하게 이용될 가능성이 있다고 주장되었다.

Pang 등(Pang et al, WO93/06845, 1993년 4월 15일 공개)은 Arg²⁵, Lys²⁶, Lys²⁷을 알라닌, 아스파라긴, 아르파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린 등 여러 아미노산으로 교체한 hPHT 유사체를 개시하였다. 이 유사체는 동물이나 인간 시험을 통해 얻은 데이타가 제공되지 않은 상태로, 골다공증을 치료하는데 효과적이며 혈압이나 평활근에 최소한의 영향만을 끼친다고 주장되었다.

PTH는 G_s-단백질 활성 아데닐일 사이클라제(AC) 및 G_q-단백질 활성 포스포리파제 C_β의 두가지 2차 메신저 시스템으로 작동된다: -의 작용. 후자에 의해 세포막에서 일어나는 단백질 키나제 Cs(Protein kinase Cs: PKC)의 활성이 촉진된다. PKC 활성에는 PTH 잔기 29번에서 32번까지가 필요하다고 밝혀졌다(Jouishomme et al(1994) J. Bone Mineral Res. 9, (1179-1189). 골다공증 치료에 유용한 골성장의 증가가 펩티드 서열의 AC 활성 촉진 능력과 관련이 있다는 것은 널리 알려져있다. 자연 상태의 PTH서열은 이 두가지 활성을 모두 일으킨다. hPTH-(1-34)서열은 통상 (A)로 나타내진다.

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu

Gln Asp Val His Asn Phe-OHA

아래 표1에 데이타가 제공된, 다음의 선형 유사체 hPTH-(1-31)-NH₂는 AC-활성만을 나타내며, 난소 적출된 래트(rat) 표본에서 손실된 뼈를 완전히 재생할 수 있음이 밝혀졌다(Rixon, R. H. et al (1994), J. Bone Miner. Res. 9, 1179-1189; Whitfield et al(1996), Calcified Tissue Int. 58, 81-87; Willick et al, U.S. Patent No. 5,556,940 issued on 17 September 1996).

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu

Gln Asp Val-NH₂B

B에 나타낸 상기 분자는 위와 같이 아미드 말단 대신에 프리 카르복시(carboxyl ending) 말단을 가질 수도 있다.

본 발명의 목적은 대사 안정성, 골재생 활성, AC 활성이 증대되고 임상적 부작용은 최소화된 새로운 PTH 유사체를 생성하는데 있다.

본 발명은 골다공증 치료에 효과적인 인간 부갑상선 호르몬의 유사체에 관한 것이다.

도 1은 자연 상태의 인간 PTH의 구조, 잔기 1-31을 나타낸다(서열 ID 번호: 1).

도 2는 〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 3)를 나타낸다.

도 3은 〔Leu²⁷〕사이클로(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 4)를 나타낸다.

도 4는 ROS 17/2 세포의 아데닐일 사이클라제 자극에 있어 본 발명에 의한 상기 유사체의 활동을 나타낸다.

도 5는 OVX(난소 적출) 후 8주 말엽에 준비된 대표적인 골조직 단편으로 도 2는 hPTH-(1-31)NH₂및 이의 락탐 변형체가 골손실을 예방하고 OVX Sprague-Dawley 래트(rat)에서 골성장을 자극하는 능력의 차이를 보여준다.

도 6은 콘트롤 래트와 뼈가 심하게 고갈된 래트를 hPTH 유사체로 처리하였을 때의 소주골 용적을 나타낸다. OVX 후 9주째에 처리가 행해졌다. 〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂가 단편들 중 가장 효과적이었으며, 정상의 콘트롤 래트가 나타낸 수치까지 골을 재생하였다.

도 7은 정상, OVX, sham, hPTH-(1-31)-NH₂, 〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂, 및 〔Leu²⁷〕사이클로(Lyn²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂로 처리된 래트 대퇴골의 소주 두께를 나타낸다.

도 8은 0.8 mnol/100g 으로 hPTH-(1-31)-NH₂, 〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂, 또는 〔Leu²⁷〕사이클로(Lyn²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂를 가하였을 때 최대로 떨어진 혈압과 이 때까지 걸린 시간을 나타낸다.

도 9는 hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 5)를 나타낸다.

도 10은 〔Leu²⁷〕사이클로(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 6)를 나타낸다.

도 11은 〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-30)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 7)을 나타낸다.

도 12는 본 발명에 의한 다양한 유사체의 아데닐일 사이클라제 자극 활성을 나타낸 도표이다.

도 13은 hPTH-(1-31)-NH₂, hPTH-(1-30)NH₂, 및 이들의 고리형(cyclic) 유사체의 혈압 강하 작용을 나타낸다.

도 14는 선형(linear) hPTH-(1-31)-NH₂의 투여량을 달리했을 때 골성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 15는 〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-OH의 구조(서열 ID 번호: 8)를 나타낸다.

도 16은 〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-34)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 9)를 나타낸다.

도 17은 〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-34)-OH 의 구조(서열 ID 번호: 10)를 나타낸다.

도 18은 〔Als²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 11)를 나타낸다.

도 19는 〔Nle²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 12)를 나타낸다.

도 20는 〔Nle²⁷〕사이클로(Nie^{8, 18}, Leu²⁷)사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 13)를 나타낸다.

도 21은 사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 14)를 나타낸다.

도 22는 〔Ile²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 15)를 나타낸다.

도 23은 〔Tyr²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 16)를 나타낸다.

도 24는 α-acetyl-〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 17)를 나타낸다.

도 25는 〔Leu²⁷〕사이클로(Lys²²-Glu²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 18)를 나타낸다.

도 26는 〔Leu²⁷〕사이클로(Asp²²-Orn²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 19)를 나타낸다.

도 27은 〔Cys²²;Cys²⁶;Leu²⁷〕사이클로(Cys²²-Cys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 20)를 나타낸다.

도 28은 〔Cys²⁶;Cys³⁰;Leu²⁷〕사이클로(Cys²⁶-Cys³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂의 구조(서열 ID 번호: 21)를 나타낸다.

호르몬 유사체의 준비

R.B. Merrifield가 개발한 solid phase peptide synthesis 기법("Solid-Phase Peptide Synthesis", Advances in Enzymology 32, 221-296, 1969)이 부갑상선 호르몬 등 폴리펩티드 합성을 위하여 널리 사용되고 있다. 이 방법의 기본은 해당 펩티드의 카르복실 말단 아미노산을 고체 지지체에 부착시키는 것으로, 이후에 연결되는 아미노산이 다량 첨가된다. N-말단 α-아미드기 보호기는 제거시 펩티드가 고체 지지체에서 분리되지 않도록 하면서 분리될 수 있어야 한다. 본 발명에서 이용되는 방법은 원래의 메리필드 방법의 변형으로 Fmoc법이라고 부른다. Fmoc(fluorenylmethoxycarbonyl)기는 약알칼리에서 제거될 수 있다. 이와 같이 제거되면 알칼리에 안정한 곁사슬 보호기 및 지지체와의 연결은 온전하게 남게된다. 이 기법은 참고 문헌에 기재된대로 E. Atherton, R.C. Sheppard가 개시한 방법이다("Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach", IRL Press, New York, N.Y.).

본 발명은 다음의 아미노산 서열을 가지는 인간 부갑상선 호르몬 hPTH 및 의약품으로 적합한 해당 hPTH의 염을 제공한다.

아미노산 서열:

R-NH-R1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-

Glu-Arg-Val-R8-Trp-Leu-R9-R10-R11-Leu-R12-Asp-Y.

여기에서,

R = 수소, 또는 직쇄상이나 분지상 사슬의 알킬, 아킬 또는 아릴기,

R1 = Ser, Ala 또는 Aib,

R2 = Met 또는 천연의 소수성 아미노산,

R3 = His 또는 수용성 아미노산,

R4 = Leu 또는 수용성 아미노산,

R5 = Asn 또는 수용성 아미노산,

R6 = Ser 또는 수용성 아미노산,

R7 = Met 또는 천연의 소수성 아미노산,

R8 = Glu, Lys 또는 Asp,

R9 = Cys, Glu 또는 Orn,

R10 = Arg, Lys, Orn, Gln, Glu 또는 Asp,

R11 = 자연 상태로 발견되는 소수성 또는 극성 아미노산,

R12 = Gln, Arg, Glu, Asp, Lys 또는 Orn,

X = OH, NH₂및

Y = X, Val-X, Val-His-X, Val-His-Asn-X, Val-His-Asn-Phe-X, Val-His-Asn-

Phe-Val-X, Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-X 및 Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu

-X 이고,

R3 및 R6 가 Lys, Orn, Glu 또는 Asp 일 때, 11와 26, 26과 30, 27과 30, 25와 29번 아미노산 쌍 등의 사이에 하나 또는 두개의 고리를 형성한다. 단, 고리 형성에서 사이클로(Lys²⁶-Asp³⁰)〔Leu²⁷〕-hPTH-(1-34)-NH₂, 사이클로 (Lys²⁷-Asp³⁰)-hPTH-(1-34)-NH₂및 사이클로 (Lys²⁶-Asp³⁰)〔Leu²⁷〕-hPTH-(1-34)-OH 는 제외된다. 상기 염에는 무기산염 및 포름산, 아세트산, 타르타르산, 시트르산 등의 유기산염, 나트륨 및 암모늄 등 무기염기의 염 및 트리에틸라민, 에틸라민, 메틸라민 등의 유기염기의 염이 포함된다.

본 발명은 또한, 자연 상태의 22번 및 26번 사이 또는 26번과 30번 잔기 사이 등과 같이 선택된 아미노산 쌍의 곁사슬이 결합되는 락탐을 형성함으로써 고리화(cyclization)를 이루었다. 다른 종류의 고리화, 예를 들어 Cys가 포함된 유사체 Cys²²-Cys²⁶및 Cys²⁶-Cys³⁰사이에 이황화 결합(disulfide bridge)을 형성하는 예 등도 고려되었다.

또한, 다양한 아미노산을 교체하는 것도 효과적이었다. Lys²⁷을 Leu이나 기타 천연의 다양한 소수성 또는 극성 잔기로 교체할 수 있다. 해당 잔기가 수용체와 얼마나 잘 맞느냐 하는 것도 중요하다. Ala는 Leu만큼 소수성을 띄지않는다. Lys와 Tyr는 일반적으로 극성을 띄는 것으로 알려져있으나, 수용체와 소수성의 상호작용을 일으킨다. 예를 들어, Lys은 접혀져, 소수성 부분이 수용체의 다른 소수성 잔기와 상호작용을 하고 NH₂는 용매에 노출되게 된다. 이런 아미노산 교체 대상으로 오르니틴, 시트룰린, α-아미노뷰틸산, 알라닌, 노를류신, 이소류신 및 티로신 또는 곁사슬에 2내지 10개의 탄소를 갖는 직쇄상 혹은 분지상의 α-아미노 지방산(aliphatic acid) 등이 해당되며, 해당되는 유사체는 지방족 사슬 말단에 극성 또는 하전기(polar or charged group)를 가지고 있다. 극성기로는 아미노, 카르복실, 아세트아미도, 구아니도, 유레이기 등이 해당된다. Leu²⁷이 가장 교체에 적합하게 보이지만, 다른 많은 pos²⁷(27번 위치에서의) 교체물도 거의 완전하게 활성을 나타내며, 단백질 분해에 대한 안정성이 증가되거나 수용성이 증가되는 등 바람직한 성질을 가지는 것으로 보인다. 이소류신(Ile), 노를류신, 메티오닌, 오르니친이 가장 활발한 작용을 나타낼 것으로 예상되었다.

이 같은 교체로 호르몬의 수용체 결합 부위의 α-나선(helix)이 안정화된다. 이와 같은 사실은 선형 분자 〔Leu27〕-hPTH-(1-31)-NH₂의 원편광 이색성 스펙트럼(circular dichroism spectrum)과 락탐 유사체의 원편광 이색성 스펙트럼을 비교, 조사하여 확인되었다. 원편광 이색성 스펙트럼은 α-나선 2차 구조에 대한 감도가 뛰어나, 이 기술은 hPTH 단편에 α-나선이 존재함을 보여주기 위해 사용되고있다(Neugebauer et al (1991) Biochemistry 31, 2056-2063). 또한, hPTH-(20-34)-NH₂에 상기 락탐이 형성될 때의 α-나선의 안정성은 개시된 바 있다(Neugebauer et al(1994) Int. J. Protein Peptide Res. 43, 555-562). hPTH-(1-31)-NH₂의 21번과 31번 잔기 사이에 친 양쪽성 α-나선이 있을 가능성이 있으며, 이 나선의 소수성 면(hydrophobic face)이 PTH 수용체와 상호작용을 일으키는 것을 나타내는 자료가 제시된 바 있다(Neugebauer, W. (1995) et al Biochemistry 34, 8835-8842; Gardella, T.J. et al(1993), Endocrinology 132, 2024-2030).

가장 효과적인 고리화는 Glu²²와 Lys²⁶또는 Lys²⁶과 Asp³⁰잔기 사이 등에서 락탐이 형성되는 것이었다. Lys²⁷과 Asp³⁰사이 등에서 처럼 다른 고리화도 가능하지만, 이 경우 해당 락탐은 α-나선을 다소 불안정하게 하였다.

더 자세히 살펴보면, PTH 단편의 수용체 결합 연구에서, 주요 결합 부위가 잔기 14와 34 사이라는 것을 알 수 있었다. 본 발명인은 17번 내지 29번의 α 나선이 이 같이 PTH 수용체에 결합하며, 이 α-나선의 친 양쪽성 부분 중 소수성 면이 수용체와 결합된다고 추측하였다. 이 모델은 수용체 결합 부분의 유사체에 관한 연구 결과와 일치된다.

NMR 조사로 CD에 의해 나선이 많이 형성된 것으로 알려진 대표적인 펩티드에도 나선 구조가 아닌 형태가 다수 존재한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, PTH 등의 수용체가 결합되는 펩티드 호르몬 구조를 용액 내의 자유로운 구조로 부터 신뢰할만하게 유추해낼 수는 없다. 조절된 펩티드 호르몬 유사체(constrained analogues)를 이용하여 펩티드의 가능 콘포메이션(conformation)을 제한할 수 있다. hPTH 서열을 조사해 보면 17번 내지 29번 사이에 α-나선을 안정시키거나 불안정하게 할 수 있는 염교가 3개 있을 수 있다는 것을 알 수 있다. Glu²²와 Lys²⁶, Lys²⁶과 Asp³⁰사이, Lys²⁷과 Asp³⁰사이가 이에 해당되며, 앞의 두가지 연결은 α-나선을 안정시키는 것으로, Lys²⁷-Asp³⁰는 α-나선을 불안정시키는 것으로 보인다. 이와 같은 잔기쌍 사이의 락탐 형성은 해당 나선 부분에서 가능한 hPTH의 콘포메이션 상태를 제한하게 된다. 나아가, 이 락탐 중 α-나선구조를 안정시킬 것으로 생각되는 Glu²²-Lys²⁶및 Lys²⁶-Asp³⁰는 α-나선의 친 양쪽성 부분의 극성면에 위치한다. 세번째의 Lys²⁷-Asp³⁰의 연결은 적어도 부분적으로 α-나선을 불안정하게 할 것으로 생각되고, 친 양쪽성 나선의 소수성 면에 위치하는 잔기 Lys²⁷과 관련된다. Arg이 Lys 또는 Orn으로 교체되고, Gln²⁹가 Glu 또는 Asp으로 교체되면 25번과 29번 사이에 역시 고리화가 가능하다.

Lys²⁷을 Leu로 교체하면 친 양쪽성 나선의 소수성 면에 더 소수성기가 있게된다. 이 경우, ROS 세포 라인(ROS cell line)에서 아데닐일 사이클라제 자극 활성도가 증가되었다. 이 분야에 통상의 기술을 가진 자는 위에서 밝힌 다른 이러한 교체로 유사체가 동일하거나 더 활발한 활성을 나타낼 가능성이 크다는 것을 알 수 있을 것이다.

이와 같이, 교체와 앞서 밝힌 두가지 중 하나에 따른 락탐 형성을 함께 수행하면 α-나선이 안정되고 생활성(bioactivity)이 증가되고, 단백질 분해 효소로부터 해당 분자 지역을 보호하는 효과를 발휘할 것으로 생각된다. C-말단에 아미드가 있는 것이 바람직한데, 비록 일부 펩티드 분해 효소로 가수분해될 가능성이 있지만, 외부 단백질 효소의 작용(exoproteolytic degradation)에 대해서도 펩티드를 보호할 것이 기대되기 때문이다(Leslie, F.M. and Goldstein, A. (1982) Neuropeptides 2, 185-196).

다른 아미노산의 교체도 또한 효과적이었다. 본 발명인은 일본 특허 공보 61-24598에 따라 8번, 18번에 위치하고 산화에 대한 감수성이 있는 Met 잔기를 천연 소수성 잔기 Nie로 교체하였다. 또한, 다른 소수성 잔기 즉, Leu, Ile, Val, Phe, Trp 등도 Nakagawa 등에 의한 미국 특허 5,393,869호에 따라 바람직한 교체 대상일 것으로 예상된다.

리버스 락탐(Reverse lactams)도 또한 고려되었다. 본 발명인은 Lys²²-Glu²⁶사이의 전환이 효과적임을 밝혔다. 따라서, 26-30과 27-30 간에도 비슷한 전환이 효과적으로 이루어질 수 있을 것으로 보인다.

상기 언급된 Cys-Cys에 더하여, 바람직한 22-26 락탐 부위에서 또 다른 교체 즉, Asp²²-Orn²⁶교체를 수행하여, 다양한 크기의 고리가 만들어져 유용하게 쓰일 수 있다는 것을 확인하였다.

Nakagawa 등의 미국특허 5,393,869와 Fukuda 등의 미국특허 5,434,246에서, 일부 교체된 hPTH 유사체가 상당한 AC 활성을 나타내었으며, 단백질 효소 공격에 대한 안정성을 증대시킬 수 있는 것으로 보고되었다. 이 교체 내용은 다음과 같다.

1. Ser-1Aib (α-아미노이소뷰틸산)

2. Lys-27Gln (AC 활성이 2.5배 향상된다고 보고됨)

3. 14,15,16,17번 잔기Lys. 일부 또는 전체가 최고 8배로 활성을 증대시킨다고 보고됨. 이는 수용성의 증대에 기인한 것일 수 있음. 생체실험에서 이들은 트립신 유사 효소에 더 불안정할 것으로 예상된다. 발명자들은 이 테트라펩티드(잔기 14-17을 포함)에 적어도 하나의 수용성 아미노산이 포함되도록 하였다. 예를 들어, His-14 또는 Lys-14; Leu-15, Lys-15 또는 Arg-15; Asn-16, Orn-16, Hci(호모시트룰린)-16, Asp-16, Arg-16, Lys-16, DLys-16, Ser-16 또는 Gly-16; 및 17-Lys, 17-Ser, 17-Asp 또는 17-Arg. 등이 Glu를 포함할 수 있다.

4. 단백질 분해 효소의 공격을 최소화하기 위한 교체인 Arg² His. 본 발명인이 개발한 락탐 중 27번 위치에 Leu 또는 기타 소수성 아미노산이 있는 것은 다소 불용성이어서 용해하기 쉽지 않다. 따라서, 이와 같은 교체를 본 발명에 적용할 수 있을 것이다.

이 분야의 통상의 지식을 가진 이는 고리형의 1-31 h-PTH (1-31 h-PTH cyclics)가 바람직하기는 하지만, 제시한 데이타를 볼 때 1-30 내지 1-37의 범위의 환상 단편도 마찬가지로 효과적임을 알 수 있을 것이다. 더 구체적으로 말해, 37번까지 아미노산을 첨가했을 때 호르몬의 생물학적 성질이 변할 수 있다는 것은 어느 문헌에도 제시되어 있지 않으며, 이의 효과는 또한 여기 제시된 1-34 데이타를 살펴보면 확인할 수 있다.

하기 공지의 방법으로 본 발명에 의한 락탐을 준비하여, 골성장 촉진, 골재생, 골다공증, 일반적인 골절 치료 등의 다양한 경우에 뼈의 회복을 촉진하기 위해 사용할 수 있다.

실시예 1

선형 hPTH-(1-31)-아마이드 유사체의 합성 및 정제

결합 과정 중 아미노산의 α-아미노기를 9-플루오렌일메톡시카르보닐(Fmoc)로 보호하였다. 하이드록시벤조트리아졸(HOBt), 2-(1H-벤조트리아졸-1-yl)-1,1,3,3-테트라메틸루로니엄 플루오르 붕산염(TBTU) 및 디이소프로필에틸라민 (DIPEA)의 혼합물 속에서 결합이 이루어졌다. 활성화된 아미노산은 요구량의 4배 정도가 Asn, Gln, His, Val, Ile 잔기와 함께 이중 결합에 사용되었다. Arg, Gly 의 결합 시간은 30분에서 60분으로 증가시켰다. 처음의 잔기(Val³¹)를 지지체(Tentagel R. Rapp Polymere, Tubingen, Germany)에 부착시키는 것은 수동으로 실시되었다. 이를 제외한 모든 단계는 자동 펩티드 합성기(PerSeptive Biosystems Model 9050 Plus)로 수행되었다. 곁사슬은 다음을 이용하여 보호되었다: Arg(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만(pentamethylchroman)-6-술포닐(sulfonyl)); Glu, Asp, Ser (t-뷰틸); His, Gln, Asn(트리틸); Trp(t-뷰틸옥시카르보닐 (butyloxycarbonyl)).

N말단의 Ser로 부터 Fmoc 분리 후, 펩티드 수지를 DCM으로 세척하고, 시약K(TFA 6.19 ml, 물, 90% 페놀/물, 티오아니졸 각 0.38 ml, 1,2-에탄티올(ethanedithiol) 0.19 ml) 7.5 ml에서 20℃, 4시간 동안 진탕(shake)하여 수지를 절단한다. 절단된 펩티드 혼합물을 여과로 분리한 후, t-뷰틸-메틸에테르(t-butyl-methylether)에 첨가하여 침전시켰다. 원심분리기로 침전물을 모으고, t-뷰틸-메틸에테르로 두 차례 세척한 후, 진공 원심분리로 건조시켰다.

이렇게 생성된 결과물을 15% 아세토니트릴/물, 0.1% TFA 14 ml 에서 용해시킨 후, Vydac C18-칼럼)(10 μ, 1 x 25 cm)에서 크로마토그래피를 실시하였다. 생성물은 수용액 속 0.1% TFA 에서 아세토니트릴(14-40%)의 농도 기울기 1%/min. 으로 용출되었다. 최종 산물의 순도는 Vydac C18-칼럼(10μ, 0.4 x 25 cm) 상에서 분석 HPLC 및 electrospray mass spectrometer(VG Quattro)를 이용하는 분자량 측정검사로 측정되었다. 이렇게 형성된 hPTH-(1-31)-NH₂에 대한 데이타가 아래 표1에 제시되어있다.

실시예 2

사이클릭 유사체의 합성 및 정제

〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂. 이 펩티드는 Lys-Alloc 및 Glu-OAll이 26번과 22번에 오도록 교체를 수행하여 실시예 1와 같은 방법으로 합성하였다. Fmoc-Ser17을 첨가한 후, 펩티드-수지를 칼럼에서 분리하여 반응병(Minivial, Applied Science)에 담고, 아르곤의 존재 하에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0))(0.24 mmol), 5% 아세트산, 디클로로메탄(DCM)에 포함된 2.5% N-메틸모르폴린(NMM) 용액 1.7 ml에서 현탁시켰다. 그 후, 알릴, 알록 보호기(allyl and alloc protecting groups)를 제거하기 위하여 20℃ 에서 6시간 동안 진탕하였다(Sole, N.A. et al(1993) In Peptides: Chemistry, Structure, and Biology, Smith, J. and Hodges, R. (Eds), ESCOM pp. 93-94). 이 펩티드 수지를 0.5% 디에틸디티오카르바메이트(DEDT), DMF 내의 0.5% NMM(50 ml)로 세척한 후, DMF(50 ml)와 DCM (50 ml)으로 다시 세척하였다. 이 펩티드(0.06 mmol)를 20℃, 14시간 동안 0.06 mmol 1-하이드록시-7-아자벤조티아졸(1-hydroxy-7-azabenzotriazole:HOAt)/2 ml DMF 내의 0.12 mmol NMM 와 진탕하여 고리화를 진행시켰다(Carpino, L.A.(1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 4397-4398). 펩티드-수지를 여과하고, DMF로 한차례 세정한 후, 칼럼에 다시 패킹(repack)하고, 현탁액에서 거품이 없어질 때까지 DMF로 세척하였다. 나머지 합성 과정은 N-말단 Fmoc기를 제거하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시되었다. 위에서 언급한 대로 시약K를 사용하여 수지로부터 Fmoc-펩티드를 절단하였다. 실시예 1에서와 같이 HPLC를 실시하고, 마지막 HPLC 전에 Fmoc기를 제거하였다.

유사체 〔Leu²⁷〕사이클로(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂도 유사한 방법으로 준비되었다.

실시예 3

아데닐일 사이클라제 측정검사

hPTH 유사체의 수용체 결합 및 아데닐일 사이클라제와 관련된 신호 기작 활성화능력을 ROS 17/2 래트 골육종(ROS) 세포 라인 등의 분별 가능한 파골세포(differentiation-competent osteoblast)를 이용하여 결정하였다. 이 활성은 유사체가 난소 적출된 래트에서 골질량을 회복시키는 능력과 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다. 아데닐일 사이클라제 자극 활성은 세포 ATP 풀(pool)을 〔³H〕-아데닌으로 미리 표식하고(prelabel), 특정 유사체에 노출된 후 최초 10분 동안 〔³H〕ATP 로부터 생성되는 〔³H〕-사이클릭 AMP 양을 측정하여 예측되었다. 이 방식은 참고문헌에 제시된 대로 Whitfield 등이 개시한 (Whitfield et al, J. Cellular Physiology 150, 299-303, 1992) 방법에 기초하고 있다.

AC 활성 결과는 최대 아데닐일 사이클라제 활성(AC 활성)의 절반에 해당하는 활성도를 나타내는데 필요한 농도로 표 2에 제시되어 있다. 이 데이타는 도 4에도 나타나있다. 도 4에서 검게 표시된 원은 hPTH-(1-31)-NH₂의 아데닐일 사이클라제 자극 활성을, 흰색 세모꼴과 검은색 세모꼴은 각각 〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂및 〔Leu²⁷〕사이클로(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂의 활성을 나타낸다.

실시예 4

난소 적출된 래트 모델에 대한 hPTH 유사체의 동화 작용

투입량

1회 투입량은 hPTH-(1-31)-NH₂에 대한 투입량-반응 데이타에 기초하였다. hPTH-(1-31)-NH₂의 골생성 능력을 시험하기 위해 다양한 투입량(체중의 100g 당 0.8, 0.6, 0.4, 0.2 nmole) 및 예방이 아닌 재생이나 치료-평가 모델이 이용되었다. 난소 적출된 생후 3개월 래트의 대퇴부 소주골 대부분의 라멜라가 아닌(non-lamellar) 부분이 심하게 결핍되도록 9주간 방치한 후, 6주 동안 매일 투여를 실시하였다. 9주 말엽에 래트 대퇴부 소주골 질량이 약 75% 상실되었다. 4가지로 단편 투입량을 달리하여 각각 36회 투입하였을 때 라멜라 침착으로 인해 변화된 평균 소주 두께의 증가 정도를 도 14에 나타내었다. 이 단편은 보다 더 성숙된 래트에서도 소주골 성장을 촉진할 수 있다. 그 결과, 중간 정도의 투입량 즉, 체중 100g당 0.6 nmole로 hPTH-(1-31)-NH₂를 36회 투입한 경우, 소주골 고갈시(일년생 래트의 난소를 적출(OVX)한 후 9주된 상태)의 보통 시작값보다 현저하게 소주 굵기가 증가되었다. 그 효과는 hPTH-(1-84)와 비견할 만했다. 따라서, 이후의 실험에서는 투입량을 체중100g당 0.6 nmole 로 조절하였다.

자세한 실험 절차는 Rixon 등(Rixon et al, J. Bone ＆ Mineral Research 9, 1179-1189, 1994 and Whitfield et al Calcif. Tissue Int. 58, 81-87, 1996)에 의해 개시된 바 있다. 정상, Sham-OVX, OVX Sprague-Dawley 래트(생후 3개월; 255-260g)는 챨스 리버 연구소(Charles River Laboratories, St. Constant, QC)에서 구입하였다. 임의로 래트를 8마리씩 나눈 후, 무제한으로 퓨리나 래트 먹이(Purina rat chow)와 물을 제공하였다. 예기치 않게 사망하는 경우는 일어나지 않았다. 난소 적출 후 둘째 주 말엽부터 여덟번째 주 말엽까지 매주 일일 한차례씩 6번의 피하주사가 래트에 투여되었다. Sham-OVX 8마리 및 OVX 컨트롤 래트 8마리에게 담체(Vehicle:0.001 N HCl을 포함하는 0.15 M NaCl)가 36회 투여되었으며, OVX 래트 8마리에 담체 속의 단편이 0.6 nmole/100g 로 투여되었다. 난소 적출 후 8주째 말엽에 대퇴골을 분리, 세척하고 골간 중간 지점을 양분하여 기부(proximal end)의 반쪽은 버렸다. 골단이 제거된 각각의 대퇴골 반쪽을 길이 방향으로 잘라 두 부분으로 나누었으며, 골수를 제거했다.

서로 다르게 처리한 래트의 단부(distan end) 대퇴골 반쪽 소주의 평균 굵기(면적/둘레)의 변화를 살펴 단편들의 골생성 능력을 측정하였다. 평균 소주 굵기를 측정하기 위해서, 각각의 래트로부터 탈염된 대퇴골 반쪽 두개를 준비하여 수분을 제거하고 파라핀에 포매(embed)하였다. 각 뼈의 중간 층(middle plane)에서 세로 10 μm 단면을 절단한 후, 샌더슨 골염색제(Sanderson's rapid bone strain)로 착색하였다(Surgipath Medical Industries, Inc., Winnipeg, MB, Canada). 이미징 리서치 사(Imaging Research Inc., St. Catherines, ON, Canada)의 골 형태 측정 소프트웨어 및 M4 이미지 시스템을 사용하여 소주의 평균 굵기를 측정하였다.

OVX 후 8주 말엽에 준비된 대표적인 뼈 조직 단면 형태가 도 5에 제시되었다. 이는 도 7에 막대 그래프의 형태로도 나타나 있다. 막대는 각각, 정상, OVX, Sham, hPTH-(1-31)-NH₂,〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂, 〔Leu27〕사이클로(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂ 의 소주 굵기를 나타낸다. 특히, 〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂가 선형 유사체 hPTH(1-31)-NH₂보다 활성이 우수하였다. 선형 유사체는 골재생에는 활발한 작용을 보이나, 세포 신호(AC-활성된) 경로는 하나만을 사용한다. 따라서, hPTH-(1-34) 또는 hPTH-(1-84) 등 두가지 신호 기작을 모두 활성시키는 긴 유사체들과 비교했을 때, 이 선형 유사체의 고리형 (사이클릭) 유사체는 임상 부작용이 적을 것으로 추측된다.

실시예 5

소주골이 심하게 상실된 래트의 hPTH 유사체에 의한 골재생

이 골 재생에 관한 실시예에서, 락탐 단편의 심하게 상실된 소주골 재생 능력이 비교되었다. 이 실험에서는, 체중 100g 당 0.6 nmole 로 젊고 성숙한 래트에 일일 일회 6주간 투여하는 시기를 OVX 후 9주째 말엽으로 늦추었다. 이 때, 래트 소주골은 75%가 상실된 상태였다. 도 6에 나타낸 대로, 단편들 중 (Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂이 가장 큰 효과를 보였으며, 이 경우 소주 굵기가 정상의 콘트롤 래트와 같은 수준으로 회복되었다.

실시예 6

hPTH 유사체의 혈압강하 효과

Sprague-Dawley 래트 암컷(체중 290g 이상)을 마취하기 위하여 복강에 소디엄 펜토바비탈 (sodium pentobarbital: 체중 1kg 당 65 mg)을 주사한다. YS1402 thermistor(Yellow Springs Instrument Co., Inc. Yellow Springs, OH)를 이용하여 직장내 온도를 측정하면서, 실험이 진행되는 동안 36.0-38.5℃로 온도가 유지되도록 하였다. 귓바퀴의 온도도 YSI banjo thermistor로 모니터하였다. 꼬리 동맥을 노출시켜, Jelco 25-glV catheter를 가지고 캐뉼라를 삽입하고(Johnson and Johnson Medical Inc., Arlington, TX) Statham pressure transducer에 연결하였다. 이 변환기를 통한 신호는 Biopac Systems MP100 Monitor (Harvard Instruments, Saint Laurent, QC, Canada)를 이용 디지탈화되어 기록되었다. PTH나 이 단편을 정맥을 통해 주사하기 위해 대퇴부 혈관을 노출시켰다. 수술 후, 래트를 8분간 안정시킨 후, PTH나 이의 단편(0.001 N HCL을 포함하여 산성화된 염류에 용해된)을 대퇴부 혈관이나 복부 피부 아래로 주입하였다. 정맥 주사는 주사 후 12분 동안, 피하 주사는 주사 후 22분 동안의 데이타를 얻었다. 도 8에 〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂와 〔Leu²⁷〕사이클로 (Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂를 0.8 nmol/100g 으로 피하 주사(흰색 막대)나 정맥 주사(빗금친 막대)로 투입했을 때, 최대로 떨어진 혈압 및 소요된 시간을 나타내었다. 〔Leu27〕사이클로(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂와 비교했을 때, 〔Leu²⁷〕사이클로(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ 유사체의 생물학적 이용 효능(bioavail ability)이 더 높았다. 이는 피하 주사 후 최소 혈압까지 도달되는데 소요되는 시간이 훨씬 적은 것으로 나타내진다. hPTH-(1-31)-NH₂와 비교했을 때, 두 고리형(cyclic) 유사체는 피하 내로 투입하였을 경우 혈압강하 효과가 더 컸다. 이로써, 각각의 환상 락탐 유사체는 피하로 주입되었을 때 선형 분자보다 더 바람직한 성질을 갖는 것으로 생각된다. 즉, 단백질 분해 효소에 대한 저항력이 커짐으로써 생물학적 이용 효능이 커지거나, 지질 환경에서 수송되는 능력이 더 커지며, 이 두가지를 함께 만족시키기도 한다. 수송 능력의 증대는 이 호르몬 C-말단 근처의 양쪽 친화성 나선이 안정된 것에 기인한 것일 수 있다.

덧붙여서, 다음의 결과도 얻을 수 있었다. 여기에서 사용된 펩티드는 다음과 같다.

hPTH-(1-31)-NH₂(1); 〔Leu²⁷〕-hPTH-(1-31)-NH₂(2)(도 9); 〔Leu²⁷〕사이클로 (Glu²²-Lsy²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂(3)(도 2); 〔Leu²⁷〕사이클로 (Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂(4); 사이클로(Lys²⁷-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂(5)(도 10); hPTH-(1-30)-NH₂(6); 〔Leu²⁷〕hPTH-(1-30)-NH₂(7); 〔Leu²⁷〕사이클로 (Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-30)-NH₂(8).

아데닐일 사이클라제 활성.

〔Leu²⁷〕hPTH-(1-34)-NH₂가 hPTH-(1-34)-NH₂보다 ROS 세포 라인에서 AC 활성이 더 크다는 것은 언급되었다. 우리는 또한 펩티드 2(EC₅₀, 11.5 ±5.2 nM)가 자연 상태의 서열 1(EC₅₀, 19.9 ±3.9 nM)(도 12) 보다 활성이 크다는 것을 밝혀냈다. 이 도면에서는 펩티드 1(·); 2(?), 3(); 4(▲); 5(○)의 결과가 제시되어 있다. Glu²²와 Lys²⁶사이의 락탐 형성으로 AC 자극 활성은 훨씬 더 증대되었고, EC₅₀는 3.3 ±0.3 nM 이었다(도 12). 따라서, 해당 고리화와 Lys²⁷의 Leu로의 교체를 함께 수행함으로써, 이 활성은 약 6배 증가하였다. 이와 비교하여, Lys²⁶과 Asp³⁰사이(4), 또는 Lys²⁷과 Asp³⁰사이(5)에서의 락탐 형성은 변형되기 전 보다 아데닐일 사이클라제 자극을 감소시키는 결과를 가져왔다. 따라서, 26-30 사이의 락탐(4)는 이의 선형 형태보다 AC 활성의 다소 감소하여 EC₅₀는 17.5 ±3.3 nM : 11.5 ±5.2 nM 이었다(2)이었다. 27-30사이의 락탐(5)는 해당 선형 펩티드의 활성도에서 보다 활성이 더 현저하게 줄어 EC₅₀가 40.3 ±4.4 nM을 기록하였다 (1의 경우는 19±3.9 nM).

앞서, hPTH-(1-30)-NH₂(6)은 1번 유사체와 비슷한 AC 자극 활성도 (EC₅₀, 20 nM)를 나타낸다고 언급하였다. 덧붙여, 〔Leu²⁷〕-hPTH-(1-30)-NH₂(7) 과 사이클로 (Glu²²-Lsy²⁶)-hPTH-(1-30)-NH₂(8)(도 11)도 펩티드 6과 비슷한 AC 자극 활성도를 보인다는 것을 알 수 있었다.

혈압강하 효과:

도 13은 선형(6 및 7) 및 고리형 락탐 유사체(3 및 8)의 혈압강하 작용을 나타낸다. 도면에 나타낸 것은 유사체를 체중 100 당 0.8 nmol로 래트에 주입하였을 때, 최대로 떨어진 (위) 혈압 및 이에 도달하기 까지 소요된 시간이다. 유사체는(좌에서 우, 펩티드 8,7,6,3)은 정맥으로 주입되거나 (색칠한 막대) 피하로 주입(흰색 막대)로 주입되었다. Val³¹을 제거했을 때 유사체 6,7,8은 모두 피하로 주입된 펩티드가 맥관계까지 수송되는 속도가 상당히 줄어드는 결과를 보였다(p＜0.05)(도 13). 그럼에도 불구하고, 펩티드 6 및 8의 실제 전체 혈압이 떨어진 것은 펩티드 5를 제외하고, 다른 정맥 또는 피하로 투입된 유사체와 큰 차이를 보이지는 않았다.(p＞0.05)

골형성 작용과 혈압강하 효과의 상관관계 측정 검사

실시예 6 및 도 8 에 나타낸대로, hPTH를 피하로 투입한 후 관찰되는 빠른 혈압 강하 효과와 골형성 작용은 서로 관련되어 있다. 따라서, 이 측정검사를 이용하면 실험 대상 동물을 희생시킬 필요 없이, 비-혈압강하성 생성물을 제거하고 골형성 효과를 얻을 수 있는 hPTH 유사체를 선별할 수 있다.

우리는 혈압 강하 효과는 AC 활성이 일어났을 때만 발생한다는 것을 증명하고, 래트 암컷에게 피하나 정맥주사로 주사한 해당 단편들의 혈압 강하 작용을 비교하기 위하여, 골형성 및 골형성을 하지 못하는 AC-, AC/PLC-, 또는 PLC-활성 PTH 단편들을 선택하여 이용하였다. 혈압강하 반응은 AC-나 AC/PLC-촉진 단편에 의해서만 촉발되며, OVX-래트 내에서 hPTH-(1-31)NH₂, hPTH-(1-34), hPTH-(1-84)의 골형성 작용과 연관되는 것은 더 큰 변화를 보인 정맥 주입에 대한 혈압강하 반응이 아니라, 상대적으로 작은 피하 주사에 대한 혈압강하 반응임을 알 수 있었다. 아데닐일 사이클라제를 자극하고, 혈압 저하를 일으키지만 골형성은 촉진하지 않은 hPTH-(1-31)-NH₂는 이의 예외이다.

구체적으로 살펴보면, hPTH-(1-84)와 이의 단편 hPTH-(1-34), hPTH-(1-31)-NH₂및 hPTH-(1-34)NH₂은 마취한 Sprague-Dawley 래트 암컷의 대퇴부 혈관으로 주입된 후 약 1분 내에 42.4 % - 67.1 % 만큼 꼬리 동맥 압력을 저하시켰으나, 피하 주사로는 2-29분 동안 8.5-36.2% 만큼 혈압을 감소시키는 데 그쳤다. hPTH-(1-84)와 hPTH-(1-34)는 표적 세포에서 둘다 AC 활성 및 포스포리파제-C(phospholipase-C)를 자극하였으나, 이 경우 혈압강하 작용은 아데닐일 사이클라제 활성에 의한 것임이 분명하다. 아데닐일 사이클라제 활성만을 일으킬 수 있는 hPTH-(1-30)NH₂및 hPTH-(1-31)NH₂가 정맥으로 투입되었을 때 혈압강하 효과가 현격했으나, 포스포리파제-C 활성만을 일으키는 hPTH-(7-84)는 정맥으로 투여되었을 때 큰 혈압강하 효과를 나타내지 않았기 때문이다. PTH의 골생성 작용은 아데닐일 사이클라제 활성에 의해서 중개되기 때문에, 혈압강하 반응으로 골형성이 가능한 새로운 PTH 생성물을 선별할 수 있을 것으로 추측되었다. 실제, 피하로 투입된 hPTH-(1-31)NH₂, hPTH-(1-34), hPTH-(1-84)의 골생성 작용은 이들의 혈압강하 작용과 매우 밀접한 관계가 있었으며, 이 중 hPTH-(1-34)는 다른 두 분자들 보다 훨씬 더 혈압 강하 효과가 컸다. hPTH-(1-31)NH₂와 hPTH-(1-84)는 둘다 골형성 효과 및 혈압강하 효과를 나타내었다. 그러나, 이 같은 상관관계는 hPTH-(1-30)-NH₂에는 부합되지 않았다. 이 단편의 경우는 hPTH-(1-31)NH₂, hPTH-(1-34)과 거의 비슷한 수준의 강한 AC 활성을 보이고, hPTH-(1-31)-NH₂만큼 혈압을 강하하였으나, 골형성은 촉진하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 동맥 혈압을 크게 저하시키는 능력은 골형성 PTH와 PTH 단편의 공통된 성질이므로, PTH 단편의 생체 내의 생활성(bioactivity)을 신속하게 알 수 있는 지표로 이용될 수 있다.

더 자세하게는, hPTH-(1-34)와 hPTH-(1-31)-NH₂는 둘다 체중 100g당 0.8 nmole 에서 가장 혈압강하 효과가 우수했다.

이 혈압강하 반응은 래트의 귀, 발이 일시적으로 (20-30분) 붉게 되는 증상을 동반하였다. 이 증상은 육안으로 식별할 수 있는 표시로써 이용될 수 있을 것이다.

AC- 또는 AC 와 PLC 를 동시에 촉진하는 단편은 정맥 주사로 투입될 때 혈압강하 효과가 크게 나타났지만, 시간이 오래 소요되면서(9.8 ± 2.0 분) 매우 약하게 PLC 만을 촉진시킬 수 있는 hPTH-(7-84)을 체중 100g 당 0.8 nmole 로 정맥 주사하였을 경우, 혈압은 3.28 ± 1.0 mm HG 만큼 저하되었다. 이는 AC/PLC-촉진 hPTH-(1-84)에 의해 신속하게(0.9 ± 2.0 분) 43.2 ± 5.8 mm Hg 에 해당하는 혈압이 저하되는 것이나, AC 자극 hPTH-(1-31)NH₂가 마찬가지로 신속하게 혈압을 5.6 ± 3.3 mm Hg 저하시킨 것과 비교된다.

AC-나 AC/PLC-촉진 단편을 일회 피하로 투여했을 때, 같은 양을 정맥으로 투입할 때 보다 꼬리 동맥 혈압이 저하되는 속도와 폭이 적었다. 예를 들어 hPTH-(1-34)를 체중의 0.8 nmol/100 g 로 피하로 투입하였을 때는 단지 혈압이 27.9 ± 3.6 mm Hg 만큼 저하되었으나, 정맥 주사의 경우에는 혈압이 50.9 ± 5.6 mm Hg 저하되었다. 같은 양의 hPTH-(1-31)NH₂을 피하 주입하면 혈압이 단지 11.1 ± 1.6 mm Hg 만큼 저하되었지만, 정맥 투여하면 51.6 ± 3.3 mm Hg 만큼 저하되었다.

정맥으로 hPTH-(1-84), hPTH-(1-34), hPTH-(1-31)NH₂을 주입하였을 때 꼬리 동맥 혈압이 저하되는 정도나 속도에는 큰 차이가 없었으나, 피하 투입시 hPTH-(1-34)는 다른 두 분자 보다 최소 두배 효과적이었다(P＜0.01).

피하로 투입된 PTH나 PTH 단편의 혈압강하 작용 및 골형성에 영향을 미치는 요인 중의 하나는 해당 물질들이 투입 장소에서 표적까지 맥관계를 통해 뼈 속까지 불활성화되지 않고 이동할 수 있느냐 하는 것이다. 이 능력은 주사 후 꼬리 동맥 혈압이 최대로 하강하는데 걸리는 시간으로 추정할 수 있다. 84번에서 31번 잔기까지 PTH 분자의 C-말단을 단축하면 AC 자극 능력은 감소되지 않고 PLC 자극 능력은 없어졌으며, 꼬리 동맥 혈압이 최소로 떨어지는데 걸리는 시간은 9배 줄어들었다. 잔기 하나를 더 제거하여 hPTH-(1-30)NH₂이 되면, 혈압이 최저로 떨어지는데 걸리는 시간이 현저히 증가하였다. 이 시간은 13.8 ± 2.3 분으로 hPTH-(1-31)NH₂의 경우의 2.0 ± 0.31 분과 비교된다. 그러나, hPTH-(1-31)NH₂가 혈압을 낮추는데는 hPTH-(1-84) 보다 시간이 오래걸리지 않았다는 사실은 주목할 만하다.

hPTH-(1-34)와 같이 큰 AC 촉진 효과를 보이면서, 막과 관련되는 PKC 및 PLC 는 활성화하지 않는 생성물로 본 발명을 통해 최초로 발견된 hPTH-(1-31)NH₂는 PTH의 혈압강하 작용은 전적으로 AC 활성화에 의한 것이라는 것을 보여주는 가장 직접적인 증거이다. 따라서, PLC/PKC 만 촉진시킬 수 있는 hPTH-(7-84)를 0.8 nmol/100 g 으로 정맥 투여했을 때 꼬리 동맥 혈압에는 큰 영향이 없으나, hPTH-(1-31)NH₂를 같은 투여량으로 정맥 투입하면 hPTH-(1-34) 만큼 혈압을 크게 저하시키는 결과가 나타난 것이다.

AC는 또한 OVX 래트에서 PTH 에 의해 유도되는 피질 및 소주골 형성을 중개하기 때문에, 난소가 적출되지 않은 정상 암컷 래트에서 혈압강하 반응이 촉발되는가하는 것으로 PTH 유사체의 골형성 가능성을 간단하고 신속하게 측정할 수 있을 것이다. 동맥 혈압을 저하시키지 못하는 단편은 더 이상 측정 검사를 하지 않아도 되므로, 고비용에 오랜 시간이 걸리고 불필요한 골형성 실험을 피할 수 있게된다. 정맥 주입한 PTH 의 혈압강하 반응은 골형성과는 상관관계가 없었다. 그러나, 피하로 투입된 hPTH-(1-31)NH₂, hPTH-(1-34), hPTH-(1-84)에 대한 혈압강하 반응은 비록 훨씬 작은 것으로 나타났지만, 이 분자들의 골형성 능력과 관련되었다. 이 중 hPTH-(1-34)의 혈압강하와 골형성 작용이 가장 현저했으며, 다른 두 분자는 혈압강하 및 골형성 촉진 면에서 비슷하게 효과를 보였으나, hPTH-(1-34) 보다 효과적이지는 않았다. 그러나, 이와 같은 상관관계는 hPTH-(1-30)NH₂에는 해당하지 않았는데, 이 분자는 hPTH-(1-31)NH₂및 hPTH-(1-34) 만큼 강한 AC 촉진 능력을 발휘하고, 혈압 강하에 있어서도 hPTH-(1-31)NH₂ 만큼 효과적이었으나, 골형성은 촉진시키지 못했다. 이 같은 골형성 능력 부족에 대한 원인은 알 수 없었다. 피하로 주입된 hPTH-(1-30)NH₂가 혈압을 저하하는데 걸리는 시간이 더 필요하다는 것만으로는 설명될 수 없는데, 그 이유는 피하로 투입된 hPTH-(1-84)는 혈압을 저하시키는 데 이와 동일한 시간이 필요했지만, 활발하게 골형성 작용을 일으켰기 때문이다. 골형성 반응은 충분한 양의 활동 호르몬이나 호르몬 단편이 투입 장소로 부터 표적 PTH 수용체-발현 성숙 파골세포에 도달할 수 있도록 하는 여러가지 다른 요인들이 결합된 결과인 것은 분명하다. 즉, AC-촉진, 혈압강하를 일으키는 hPTH-(1-30)NH₂가 골형성을 촉진하지 못하는 것은 불안정성, AC 촉진을 위한 EC₅₀가 다소 높은 점(hPTH-(1-31)NH₂및 hPTH-(1-34)의 경우 16nM 이나 이 경우는 20nM 임), 투입 장소로부터 순환기로 들어오는데 까지 걸리는 시간이 길다는 점 등이 결합된 결과일 수 있다.

hPTH-(1-30)NH₂이 골형성을 촉진하지 못하더라도, 동맥 혈압을 상당히 저하시키는 것은 골형성 PTH의 보편적인 성질로써, PTH 유사체의 생체내 생활성을 신속하게 알려주는 지표로 이용될 수 있다. 이와 같은 혈압강하 반응은 골형성 PTH 유사체가 구강 투여 또는 주사를 통하지 않은 경로를 통해 투입될 경우에도, 투입 후 표적까지 도달하는 능력을 가리키는 지표로 쓰일 수 있음은 물론이다.

매회 투입에 따른 혈압강하 반응때문에 생기는 불쾌감이나 다른 후유증으로 인해 PTH나 PTH단편을 장기간 투입하는 치료를 골다공증 환자가 거부할 수 있다. 다행히도, 현재 골형성 촉진을 위하여 PTH 를 간헐적으로 피하 주사하는 것이 이용되고 있으며, 정맥 주사의 경우 보다 해당 분자들에 의해 혈압이 강하되는 정도가 훨씬 낮다. 앞서 밝힌 대로,^6,7. hPTH-(1-31)NH₂는 PLC 및 다른 잠재적인 Ca2+ - 및 PKCs- 로 인한 부작용을 촉진시키지 않고도 AC 를 촉진시킨다는 장점도 더 가지고 있다.

실시예 7

사이클로(Lys²⁷-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂(5). 이 분자는 〔Leu²⁷〕사이클로 (Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂의 경우와 유사하게 합성되었다. 분자량은 3700.64(±0.38)(예상 M+1 + 3700.14)에, ＞95%의 순도를 갖는 것으로 예상되었다. 이 펩티드의 서열을 밝혀 락탐의 위치를 확인하였다.

〔Leu²⁷〕사이클로 (Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-30)-NH₂(8). 이 펩티드는 Val을 수동적으로 지지물에 연결하지 않고, 펩티드 3과 같이 합성되었다. 분자량 3586.14(±0.19)(예상 M+1 + 3685.99)에, ＞97%의 순도를 갖는 것으로 추측된다.

본 발명의 유사체는 항온 포유류, 특히 인간에게 비경구, 국부 또는 직장 투여, 또는 흡입이나 구강 투여를 통해 주입될 수 있다. 이 유사체는 의약품 요건에 부합되는 기존의 담체, 부형제, 결합제, 보전제, 안정제, 착색제, 작용인자 등과 함께 매회 복용양 1내지 약 300 mg 으로, 비경구의 투입을 위해 기존의 방식대로 조제될 수 있다.

비경구 투여시, 초미세 30-게이지 주사 바늘로 1-2 ml씩 고통없이 피하로 주입하되 투여 횟수는 일일 일회로 제한하여야 하고, 증세의 심각성에 따라 1년 내지 2년동안 투여될 수 있다. 하나를 수양액(aqueous), 등장액(isotonic), 살균 용액 이나 현탁액 속에 본 발명에 의한 유사체를 선택적으로 페놀 등의 보전제나 EDTA 등의 용해제와 함께 제공할 수 있다. 이용될 수 있는 적합한 담체 및 용매에는 물, 약간의 산성을 띄는 물, 링거액(Ringer's solution) 및 등장의 소디엄 클로라이드 용액(isotonic sodium chloride solution)이 포함된다. 덧붙여, 살균된 지방유(fixed oil)도 종래대로 용매나 현탁 매질로 이용된다. 합성 모노글리세라이드(monoglycerides), 디글리세라이드(diglycerides), 지방산(fatty acids)(올레산(oleic acid 등))를 주사용 물질 준비시 지방유로 이용할 수 있다.

직장 투여를 위하여, 본 발명의 유사체는 코코아 버터나 폴리에틸린 글리콜,등의 적합한 비자극성 물질과 혼합하여 좌약 형태로 준비할 수 있다.

국소 투여(topical use)를 위하여, 본 발명의 유사체를 연고, 젤리, 용액, 부유물 또는 피부 부착용 패치 등으로 만들 수도 있다.

흡입도 가능한데 예를 들어 PCT 특허 출원 094/07514 호에서 개시된 수단을 이용할 수 있을 것이다.

일일 투여량은 0.05 mg/kg 즉, 70 kg 인 경우 약 3.5 mg을 초과할 필요는 없으며, 그 양은 특정 화합물의 활성, 나이, 체중, 성, 치료 대상자의 상태 등에 따라 결정된다. 물론, 일회 투여량 속에 운반 물질과 합쳐지는 활성 성분의 양은 치료 대상 및 투여 방법에 따라 달라진다.

다음 표에 기재된 유사체들은 모두 상기 언급한 단계에 따라 생성되었다.

표 1

참고문헌

(1) Caulfield, M.P.; McKee, R.L.; Goldman, M.E.; Duong, L.T.; Fisher, J.E.; Gay, C.T.; DeHaven, P.A.; Levy, J.J.; Roubini, E.; Nutt, R.F.; Chorev, M.; Rosenblatt, M. The Bovine Renal Parathyroid Hormone(PTH) Receptor Has Equal Affinity for 2 Different Amino Acid Sequences-The Receptor Binding Domains of PTH and PTH-Related Protein Are Located Within the 14-34 Region, Endocrinology 1990, 127, 83-87.

(2) Neugebauer, W.; Barbier, J.-R.; Sung, W.L.; Whitfield, J.F.; Willick, G.E. Solution Structure and Adenylyl Cyclase Stimulating Activities of C-Terminal Truncated Human Parathyroid Hormone Analogues Biochemistry 1995, 34, 8835-8842.

(3) Gardella, T.J.; Wilson, A.K.; Keutmann, H.T.; Oberstein, R.; Potts, J.T.; Kronenberg, H.M., and Nussbaum, S.R.Analysis of Parathyroid Hormone's Principal Receptor-Binding Region by Site-Directed Mutagenesis and Analog Design. Endocrinology 1993, 132, 2024-2030.

(4) Marqusee, S.; Baldwin, R.L. Helix Stabilization by Glu...Lys+Salt Bridges in Short Peptides of De Novo Design. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987, 84, 8898-8902.

(5) Surewicz, W.K.; Neugebauer, W.; Gagnon, L.; MacLean, S.; Whitfield, J.F.; Willick, G.E. Structure-Function Relationships in Human Parathyroid Hormone: The Essential Role of Amphiphilic-Helix. In Peptides; Chemistry, Structure, and Biology 1993; Smith, J.; Hodges, R., Eds.; ESCOM Leiden, The Netherlands, 1993, pp. 556-558.

(6) Whitfield, J.F.; Morley, P.; Willick, G.E.; Ross, V.; Barbier, J.R.; Issacs, R.J.; Ohannessianbarry, L. Stimulation of the Growth of Femoral Trabecular Bone in Ovariectomized Rats by the Novel Parathyroid Hormone Fragment, HPTH-(1-31)NH2(Ostabolin) Calcif. Tissue Int. 1996, 58, 81-87.

(7) Whitfield, J.F.; Morley, P. Small Bone-Building Fragments of Parathyroid Hormone: New Therapeutic Agents for Osteoporosis Trends Pharmacol. Sci. 1995 16, 382-386.

서열 리스트

(1) 일반 사항

(i) 출원인:

(A) 이름: 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다

(B) 거리: 인텔렉츄얼 프라퍼티 서비시즈

몬트올 로드, 빌딩 M-58, 룸 EG-12

(C) 도시: 오타와

(D) 주: 온타리오

(E) 국가: 캐나다

(F) 우편번호: K1A OR6

(ii) 발명 명칭: 골다공증 치료를 위한 부갑상선 호르몬 유사체

(iii) 서열 갯수: 33

(iv) 컴퓨터 읽기 형태:

(A) 매체 종류: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종

(C) 운영체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30

(v) 본 출원 데이타

(A) 출원 번호: PCT/CA97/00547

(B) 출원일: 1997. 8. 1.

(vi) 선출원 데이타

(A) 출원 번호: 08/691,647

(B) 출원일: 1996. 8. 2.

(2) 서열 ID 번호 1

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 1의 서열

(2) 서열 ID 번호 2

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 2의 서열

(2) 서열 ID 번호 3

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 3의 서열

(2) 서열 ID 번호 4

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 4의 서열

(2) 서열 ID 번호 5

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 5의 서열

(2) 서열 ID 번호 6

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 6의 서열

(2) 서열 ID 번호 7

(i) 서열 특징

(A) 길이: 30개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 7의 서열

(2) 서열 ID 번호 8

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 8의 서열

(2) 서열 ID 번호 9

(i) 서열 특징

(A) 길이: 34개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 9의 서열

(2) 서열 ID 번호 10

(i) 서열 특징

(A) 길이: 34개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 10의 서열

(2) 서열 ID 번호 11

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 11의 서열

(2) 서열 ID 번호 12

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 12의 서열

(2) 서열 ID 번호 13

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 13의 서열

(2) 서열 ID 번호 14

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 14의 서열

(2) 서열 ID 번호 15

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 15의 서열

(2) 서열 ID 번호 16

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 16의 서열

(2) 서열 ID 번호 17

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 17의 서열

(2) 서열 ID 번호 18

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 18의 서열

(2) 서열 ID 번호 19

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 19의 서열

(2) 서열 ID 번호 20

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 20의 서열

(2) 서열 ID 번호 21

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 고리형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 21의 서열

(2) 서열 ID 번호 22

(i) 서열 특징

(A) 길이: 34개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 22의 서열

(2) 서열 ID 번호 23

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 단백질

(xi) 서열번호 23의 서열

(2) 서열 ID 번호 24

(i) 서열 특징

(A) 길이: 4개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열번호 24의 서열

(2) 서열 ID 번호 25

(i) 서열 특징

(A) 길이: 5개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열번호 25의 서열

(2) 서열 ID 번호 26

(i) 서열 특징

(A) 길이: 6개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열번호 26의 서열

(2) 서열 ID 번호 27

(i) 서열 특징

(A) 길이: 7개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열번호 27의 서열

(2) 서열 ID 번호 28

(i) 서열 특징

(A) 길이: 8개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열번호 28의 서열

(2) 서열 ID 번호 29

(i) 서열 특징

(A) 길이: 4개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열번호 29의 서열

(2) 서열 ID 번호 30

(i) 서열 특징

(A) 길이: 4개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열번호 30의 서열

(2) 서열 ID 번호 31

(i) 서열 특징

(A) 길이: 4개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열번호 31의 서열

(2) 서열 ID 번호 32

(i) 서열 특징

(A) 길이: 31개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열번호 32의 서열

(2) 서열 ID 번호 33

(i) 서열 특징

(A) 길이: 5개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 스트랜디드니스(strandedness):

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열번호 33의 서열

본 발명에 의한 인간 hPTH 호르몬 유사체는 대사 안정성, 골재생 활성, AC 활성을 증가시키고 임상적 부작용은 최소화하므로, 특히 골다공증 치료에 효과적이다.

Claims

27번 위치가 Lys이거나 알맞은 소수성 잔기로 교체되고, 고리화가 일어나 락탐이 형성된 인간 부갑상선 hPTH-(1-31) 유사체.
제1항에 있어서,

상기 고리화가 Glu²²과 Lys²⁶사이 또는 Lys²⁶와 Asp³⁰사이에 일어난 유사체.
제1항에 있어서, 상기 소수성 잔기가 Leu 인 유사체.
제1항에 있어서, 상기 소수성 잔기가 오르니틴, 시트룰린, α-아미노뷰틸산, 또는 곁사슬에 2내지 10개의 탄소를 갖는 직쇄상 혹은 분지상의 α-아미노 지방산(aliphatic acid)으로 이루어지는 군에서 선택되며 지방족 사슬 말단에 극성 또는 하전기를 가지고 있는 유사체.
제4항에 있어서, 상기 소수성 잔기가 이소류신, 노를류신, 메티오닌, 오르니친으로 이루어지는 군에서 선택되는 유사체.
제1항에 있어서, C-터미날 아미드 말단이나 C-터미날 카르복시 말단을 갖는 유사체.
제1항에 있어서, 서열 ID 번호 3을 갖는 유사체.
제1항에 있어서, 서열 ID 번호 4를 갖는 유사체.
제1항에 의한 인간 부갑상선 호르몬(hPTH)-(1-31) 유사체를 포함하고, 의약품으로 적합한 담체나 부형제와 함께 항온 동물에 투여하기 위한 화합물.
제9항에 있어서, 상기 유사체의 소수성 잔기가 Leu인 화합물.
제9항에 있어서, 상기 유사체의 소수성 잔기가 이소류신, 노를류신, 메티오닌 및 오르니틴으로 이루어지는 군으로 부터 선택되는 화합물.
제9항에 있어서, 상기 유사체가 서열 ID 번호 3을 갖는 화합물.
제9항에 있어서, 상기 유사체가 서열 ID 번호 4를 갖는 화합물.
제1항에 의한 인간 부갑상선 호르몬 (hPTH)-(1-31) 유사체를 치료 효과를 발휘하는 양 만큼 항온 동물에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
제14항에 있어서,

상기 유사체의 소수성 잔기가 Leu인 방법.
제14항에 있어서, 상기 유사체의 소수성 잔기가 이소류신, 노를류신, 메티오닌 및 오르니틴으로 구성되는 군에서 선택되는 방법.
제14항에 있어서, 상기 유사체가 서열 ID 번호 3을 가지는 방법.
제15항에 있어서, 상기 유사체가 서열 ID 번호 4를 가지는 방법.
아미노산 서열이,

R-NH-R1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-

Glu-Arg-Val-R8-Trp-Leu-R9-R10-R11-Leu-R12-Asp-Y 이고,

여기에서,

R = 수소, 또는 직쇄상이나 분지상 사슬의 알킬, 아킬 또는 아릴기,

R1 = Ser, Ala 또는 Aib,

R2 = Met 또는 천연의 소수성 아미노산,

R3 = His 또는 수용성 아미노산,

R4 = Leu 또는 수용성 아미노산,

R5 = Asn 또는 수용성 아미노산,

R6 = Ser 또는 수용성 아미노산,

R7 = Met 또는 천연의 소수성 아미노산,

R8 = Glu, Lys 또는 Asp,

R9 = Cys, Glu 또는 Orn,

R10 = Arg, Lys, Orn, Gln, Glu 또는 Asp,

R11 = 자연 상태로 발견되는 소수성 또는 극성 아미노산,

R12 = Gln, Arg, Glu, Asp, Lys 또는 Orn,

X = OH, NH₂및

Y = X, Val-X, Val-His-X, Val-His-Asn-X, Val-His-Asn-Phe-X, Val-His-Asn-

Phe-Val-X, Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-X 및 Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-X 이고, R3 및 R6 가 Lys, Orn, Glu 또는 Asp 일 때, 11와 26, 26과 30, 27과 30, 25와 29번 아미노산 쌍 등의 사이에 하나 또는 두개의 고리를 형성하는 여기에서, 고리 형성시 사이클로(Lys²⁶-Asp³⁰)〔Leu²⁷〕-hPTH-(1-34)-NH₂, 사이클로 (Lys²⁷-Asp³⁰)-hPTH-(1-34)-NH₂및 사이클로 (Lys²⁶-Asp³⁰)〔Leu²⁷〕-hPTH-(1-34)-OH 는 제외됨 인간 부갑상선 호르몬 및 의약품으로 적합한 해당 호르몬의 염.
제19항에 있어서,

상기 고리화가 락탐의 형태인 유사체.
제20항에 있어서, 상기 락탐이 i, i+4 락탐인 유사체.
제21항에 있어서, 상기 락탐이 Glu22-Lys26 락탐인 유사체.
제21항에 있어서, 상기 락탐이 Lys26-Asp30 락탐인 유사체.
제20항에 있어서, R 이 H이고, X가 NH₂인 유사체.
제24항에 있어서, R11이 Lys 이거나 Leu인 유사체.
제25항에 있어서, R2 및 R7이 Met 또는 Nle인 유사체.
제26항에 있어서, R1은 Ser, R2은 Met, R7이 Met, R8은 Glu, R9은 Arg, R10은 Lys, R12는 Gln인 유사체.
제27항에 있어서, R3 은 His 또는 Lys, R4는 Leu, Lys 또는 Arg, R5 는 Asn, Orn, Hci, Asp, Arg, Lys, D-Lys, Ser 또는 Gly, R6은 Ser, Lys, Asp 또는 Arg인 유사체.
제27항에 있어서, R3-R6가 His-Lys-Lys-Lys, His-Leu-Lys-Lys, Lys-Lys-Lys-Lys 또는 His-Leu-Lys-Ser인 유사체.
제27항에 있어서, Y=X인 유사체.
제27항에 있어서, Y=Val-X인 유사체.
제27항에 있어서, Y=Val-Leu-Asn-Phe-X인 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 6을 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 7을 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 8을 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 9를 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 10을 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 11을 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 12를 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 13을 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 14를 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 15을 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 16을 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 17을 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 18을 가지는 유사체.
제19항에 있어서, 서열 ID 번호 19을 가지는 유사체.
골형성 유무를 파악하기 위하여 펩티드 생성물을 선별하는 방법에 있어서,

(a) 테스트 동물을 마취하고,

(b) 펩티드 생성물, 또는 의약품으로 적합한 이의 염을 의약품으로 적합한 용매에 용해된 상태로, 효력을 발생할 수 있는 투여량 만큼 테스트 동물의 피하로 투입하고,

(c) 상기 동물의 동맥 혈압을 측정하는 방법을 포함하는 펩티드 생성물의 선별 방법으로, 마지막 단계에서 단시간 안의 작은 혈압 변화가 상기 펩티드의 골형성 능력을 알 수 있게 해주는 방법.
제 47항에 있어서, 상기 용매가 산성화된 염류인 방법.
제 48항에 있어서, 상기 용매에 .0001 N HCL이 포함되는 방법.
제 49항에 있어서, 상기 테스트 동물이 래트이고, 혈압 강하는 투입 후 2-19분 이내에서 8.5% 내지 36.2%인 방법.
제 50항에 있어서, 상기 펩티드가 19항에 의한 hPTH 단편인 방법.
제 51항에 있어서, 상기 hPTH의 투여량이 체중의 약 0.8 nmole/110 g인 방법.
제 52항에 있어서, 상기 hPTH가 서열 ID 번호 3인 방법.