DE69725850T2

DE69725850T2 - Analoge des parathormons zur behandlung der osteoporose

Info

Publication number: DE69725850T2
Application number: DE69725850T
Authority: DE
Inventors: Jean-Rene Barbier; Paul Morley; Witold Neugebauer; James Whitfield; E. Gordon WILLICK
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2017-08-02
Also published as: JP2001500845A; GEP20033095B; AU723728B2; CN1231676A; IS4962A; BR9711002A; NZ333809A; CN1176947C; JP4122061B2; CA2261564C; KR100500859B1; ATE253078T1; PT915911E; LV12293A; ES2207740T3; BR9711002B1; BG103128A; JP2007254480A; EP0915911A1; LV12293B

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Analoge von humanem Parathyroidhormon, die sich als wirksam bei der Behandlung von Osteoporose erwiesen haben.
Hintergrund der Erfindung
Osteoporose stellt eine Hauptursache für Körperbehinderungen bei älteren Personen und insbesondere bei älteren Frauen dar. Man weiß seit kurzem, dass humanes Parathyroidhormon (hPTH) und bestimmte Analoge davon Stimulatoren des Knochenwachstums darstellen, die sich zur Behandlung von Osteoporose eignen. Osteoporose ist eine fortschreitende Erkrankung, die zur Verminderung der gesamten Knochenmasse und zu einer erhöhten Knochenbrüchigkeit führt. Dies führt oft zu spontanen Brüchen von belasteten Knochen und zu physischen und mentalen Einbußen, die für immobilisierende Beeinträchtigungen charakteristisch sind. Die nach den Wechseljahren auftretende Osteoporose wird durch das Fehlen von Östrogenen verursacht, was eine jahrzehntelange Beschleunigung des Knochen-Turnovers bei einem verstärkten Ungleichgewicht zwischen Resorption von altem Knochenmaterial und Bildung von neuem Knochenmaterial auslöst. Dies führt zu einer Ausdünnung, einer erhöhten Porosität und einer trabekulären Verarmung von belasteten Knochen. Osteoporose tritt auch bei Hyperthyroidismus, Hyperparathyroidismus, Cushing-Syndrom und der Verwendung bestimmter steroidaler Arzneistoffe auf. Zur Abhilfe dienten bisher eine Erhöhung des diätetischen Calciums, eine Östrogentherapie und erhöhte Dosen an Vitamin D, jedoch hauptsächlich mit Mitteln, wie Antiresorptiva, die die Knochenresorption durch Osteoklasten hemmen.
Das Parathyroidhormon (PTH) wird von der Nebenschilddrüse gebildet und stellt einen wichtigen Regulator des Blutcalciumspiegels dar. PTH ist ein Polypeptid. Synthetische Polypeptide lassen sich nach dem von Erickson und Merrifield beschriebenen Verfahren (The Proteins, Hrsg. Neurath et al., Academic Press, New York, 1976, S. 257) sowie nach einem modifizierten Verfahren gemäß Hodges et al. (Peptide Research, Bd. 1 (1988), S.19, oder gemäß E. Atherton und R. C. Sheppard (Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1989) herstellen.
Wenn das Senumcalcium unter eine normale Konzentration verringert wird, setzt die Nebenschilddrüse PTH frei. Der Calciumspiegel wird dann durch Resorption von Knochencalcium, durch erhöhte Resorption von Calcium aus dem Dünndarm und durch eine erhöhte renale Reabsorption von Calcium aus naszierendem Urin in den Nierentubuli erhöht. Obgleich durch kontinuierliche Infusion niedriger PTH-Konzentrationen Calcium aus dem Knochen entfernt werden kann, können die gleichen geringen Dosen bei intermittierender Injektion das Knochenwachstum fördern.
Tregear (US-Patent 4 086 196) beschreibt humane PTH-Analoge und führt aus, dass die ersten 27 bis 34 Aminosäuren bei einem in vitro-Zelltest in Bezug auf die Stimulation von Adenylyl-cyclase am wirksamsten sind. Rosenblatt (US-Patent 4 771 124) beschreibt die Eignung von hPTH-Analogen, bei denen Trp²³ durch die Aminosäuren Phenylalanin, Leucin, Norleucin, Valin, Tyrosin, β-Naphthylalanin oder α-Naphthylalanin ersetzt ist, als PTH-Antagonisten. Bei diesen modifizierten hPTH-Analogen sind ebenfalls die 2 und 6 aminoterminalen Säuren entfernt, was zu einem Verlust der meisten agonistischen Wirkungen bei Verwendung zur Behandlung von Osteoporose führt. Diese Analogen wurden als Inhibitoren von PTH und mit PTH verwandten Peptiden bezeichnet. Für diese Analogen wird eine mögliche Eignung bei der Behandlung von mit einigen Tumoren verbundener Hyperkalzämie geltend gemacht.
Pang et al. (WO 93/06845, Veröffentlichungstag 15. April 1993) beschreiben Analoge von hPTH mit Substitutionen von Arg²⁵, Lys²⁶ und Lys²⁷ durch zahlreiche Aminosäuren, einschließlich Alanin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin oder Valin. Diesen Analogen wird (ohne Stützung durch Daten von Tierversuchen oder Studien am Menschen) eine Wirkung bei der Behandlung von Osteoporose unter minimalem Einfluss auf den Blutdruck und die glatte Muskulatur zugeschrieben.
PTH wirkt über eine Aktivierung der beiden zweiten Messenger-Systeme, der durch G_s-Protein aktivierten Adenylyl-cyclase (AC) und der durch G_q-Protein aktivierten Phospholipase C_β. Das letztgenannte Enzym führt zu einer Stimulation der Aktivität von membrangebundener Proteinkinase Cs (PKC). Es wurde gezeigt, dass für die PKC-Aktivität die PTH-Reste 29 bis 32 notwendig sind (Jouishomme et al., J. Bone Mineral Res., Bd. 9 (1994), S. 1179–1189). Es wurde festgestellt, dass eine Zunahme des Knochenwachstums, d. h. die Wirkung, die sich zur Behandlung von Osteoporose eignet, mit einer Fähigkeit der Peptidsequenz zur Erhöhung der AC-Aktivität gekuppelt ist. Von der nativen PTH-Sequenz wurde gezeigt, dass sie alle diese Aktivitäten aufweist. Die hPTH-(1-34)-Sequenz ist nachstehend als (A) wiedergegeben:
Das nachstehende lineare Analoge hPTH-(1-31)-NH₂, für das in der nachstehenden Tabelle 1 Daten angegeben sind, weist nur eine AC-stimulierende Aktivität auf. Es wurde im Rattenmodell nach Ovariektomie gezeigt, dass es bei der Wiederherstellung von Knochenverlust volle Aktivität besitzt (R. H. Rixon et al., J. Bone Miner. Res., Bd. 9 (1994), S. 1179–1189; Whitfield et al., Calcified Tissue Int., Bd. 58 (1996), S. 81–87; US-Patent 5 556 940 (Willick et al., Ausgabetag 17. September 1996).
das vorstehende Molekül B kann anstelle des dargestellten Amidendes eine freie Carboxylgruppe aufweisen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue PTH-Analoge mit größerer Stoffwechselstabilität, erhöhter Aktivität bei der Knochenwiederherstellung, erhöhter AC-Aktivität und minimalen klinischen Nebenwirkungen bereitzustellen.
Kurze zusammenfassende Darstellung der Erfindung Ein Aspekt der Erfindung besteht in einem humanen Parathyroidhormon-(hPTH-(1-31))-Analogen, bei dem die Aminosäure 27 Lys ist oder durch einen hydrophoben Rest ersetzt worden ist und das zwischen Glu²² und Lys²⁶ unter Bildung eines Lactams cyclisiert worden ist. Beim hydrophoben Rest kann es sich um Leu, Ile, Nle, Met oder α-Aminobuttersäure handeln und das Analoge kann ein C-terminales Amid oder eine C-terminate Carboxygruppe umfassen.
Die erfindungsgemäßen Analogen eignen sich für therapeutische Zwecke und insbesondere bei der Behandlung von Osteoporose. Die Erfindung betrifft ferner Zusammensetzungen, die die Analogen enthalten, sowie die Verwendung der Analogen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Verwendung bei der Behandlung von Osteoporose.
Zu Beispielen für Salze gehören Salze von anorganischen Säuren, Salze von organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Weinsäure und Citronensäure, Salze von anorganischen Basen, wie Natrium- und Ammoniumsalze, und Salze von organischen Basen, wie Triethylamin-, Ethylamin- und Methylaminsalze.
Erfindungsgemäß wird die Cyclisierung durch Bildung eines Lactams unter Kupplung der Seitenketten der natürlichen Reste 22 und 26 durchgeführt.
Auch Substitutionen verschiedener Aminosäuren haben sich als wirksam erwiesen. Lys²⁷ kann durch Leu oder durch andere natürlich auftretende, hydrophobe oder polare Reste ersetzt sein. Ein weiterer Faktor besteht darin, wie gut der Rest zum Rezeptor passt. Ala ist nicht so stark hydrophob wie Leu. Lys und Tyr werden im allgemeinen als polar angesehen, ergeben aber dennoch hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Rezeptor. Beispielsweise kann Lys eine solche Faltung ergeben, dass der hydrophobe Teil mit anderen hydrophoben Resten im Rezeptor in Wechselwirkung tritt und die NH₂-Gruppe dem Lösungsmittel ausgesetzt ist. Zu derartigen Substitutionen gehören Ornithin, Citrullin, α-Aminobuttersäure, Alanin, Norleucin, Isoleucin und Tyrosin oder beliebige lineare oder verzweigte aliphatische α-Aminosäuren mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen in der Seitenkette, wobei derartige Analoge am Ende der aliphatischen Kette eine polare oder geladene Gruppe aufweisen. Zu Beispielen für polare oder geladene Gruppen gehören: Amino, Carboxyl, Acetamido, Guanido und Ureido. Obgleich offensichtlich Leu²⁷ die günstigste Substitution darstellt, bleibt ferner bei zahlreichen anderen Substitutionen in Position 27 anscheinend nahezu die vollständige Aktivität erhalten, wobei diese Verbindungen die erwünschten Eigenschaften aufweisen, wie eine erhöhte proteolytische Stabilität oder Wasserlöslichkeit. Von Ile, Norleucin, Met und Ornithin wird erwartet, dass sie sich am wirksamsten erweisen.
Diese Substitution führt zu einer Stabilisierung einer α-Helix in der Rezeptorbindungsregion des Hormons. Dies wurde durch Prüfung des Spektrums des Zirkulardichroismus der Lactamanalogen im Vergleich zum Spektrum des Zirkulardichroismus des linearen Moleküls [Leu²⁷]-hPTH-(1-31)-NH₂ bestätigt. Die Spektren des Zirkulardichroismus sind gegenüber dem Vorliegen einer α-helikalen Sekundärstruktur hochgradig empfindlich. Die Technik wurde zum Nachweis des Vorliegens einer α-Helix in hPTH-Fragmenten verwendet (Neugebauer et al., Biochemistry, Bd. 31 (1991), S. 2056–2063). Ferner wurde die Stabilisierung einer α-Helix bei Bildung der vorerwähnten Lactame in hPTH-(20-34)-NH₂ gezeigt (Neugebauer et at., Int. J. Protein Peptide Res., Bd. 43 (1994), S. 555–562). Es gibt eine potenzielle amphiphile α-Helix zwischen den Resten 21 und 31 von hPTH-(1-31)-NH₂. Es wurden Daten vorgelegt, die zeigen, dass die hydrophobe Seite dieser Helix mit dem PTH-Rezeptor in Wechselwirkung tritt (W. Neugebauer et al., Biochemistry, Bd. 34 (1995), S. 8835–8842; T. J. Gardella, et al., Endocrinology, Bd. 132 (1993), S. 2024–2030).
Es wurde festgestellt, dass bei der wirksamsten Zyklisierung die Bildung eines Lactams zwischen den Resten Glu²² und Lys²⁶ beteiligt ist.
Genauer ausgedrückt, haben Rezeptor-Bindungsuntersuchungen an PTH-Fragmenten einen Hinweis für eine hauptsächliche Bindungsregion innerhalb der Reste 14–34 ergeben¹. Wir haben darauf hingewiesen, dass die α-Helix der Reste 17–29 als solche an den PTH-Rezeptor bindet und dass der amphiphile Bereich dieser α-Helix mit seiner hydrophoben Seite eine Bindung mit dem Rezeptor eingeht². Dieses Modell stimmt mit den Ergebnissen einer Untersuchung über Rezeptorbindungsregion-Analoge überein³.
NMR-Untersuchungen haben gezeigt, dass auch ein Modellpeptid, das sich bei CD als hochgradig helikal erweist, zahlreiche nicht-helikale Konformationen aufweist. Somit kann auf die Struktur eines rezeptorgebundenen Peptidhormons, wie PTH, nicht in zuverlässiger Weise aus seiner freien Struktur in Lösung geschlossen werden. Eingeschränkte Analoge von Peptidhormonen wurden zur Begrenzung der Anzahl an für das Peptid verfügbaren Konformationszuständen verwendet⁸. Die Prüfung der Sequenz von hPTH ergibt 3 mögliche Salzbrücken innerhalb der Reste 17–29, die eine α-Helix entweder stabilisieren oder destabilisieren können. Diese liegen zwischen Glu²² und Lys²⁶ und zwischen Lys²⁶ und Asp³⁰, für die beide die Stabilisierung einer α-Helix erwartet wird, sowie zwischen Lys²⁷ und Asp³⁰, für die eine Destabilisierung einer α-Helix erwartet wird⁴. Die Lactambildung zwischen diesen Restepaaren würde die für hPTH in dieser helikalen Region verfügbaren Konformationen beschränken. Ferner befinden sich zwei dieser Lactame, nämlich Glu²²-Lys²⁶ und Lys²⁶-Asp³⁰, von denen die Stabilisierung einer α-helikalen Struktur erwartet wird, auf der polaren Seite des amphiphilen Bereiches der α-Helix. Vom dritten Lactam, nämlich Lys²⁷-Asp³⁰, wird erwartet, dass es zumindest teilweise eine α-Helix destabilisiert, wobei ein Rest, nämlich Lys²⁷, beteiligt ist, der sich auf der hydrophoben Seite der amphiphilen Helix befindet. Eine Cyclisierung zwischen den Positionen 25 und 29 kann auch auftreten, wenn Arg in Position 25 durch Lys oder Orn ersetzt ist und wenn Gln²⁹ durch Glu oder Asp ersetzt ist.
Die Substitution von Lys²⁷ durch Leu führt zu einem stärker hydrophoben Rest auf der hydrophoben Seite der amphiphilen Helix. Dies führte zu einer erhöhten Adenylyl-cyclase-Stimulationswirkung bei der ROS-Zelllinie. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass von den vorstehend erörterten Substitutionen abweichende Substitutionen gleichermaßen zu Analogen mit den gleichen oder verstärkten Aktivitäten führen.
Es ist zu erwarten, dass die kombinierte Wirkung aus der Substitution und beiden Lactam-Bildungen die α-Helix stabilisiert und die biologische Aktivität erhöht sowie diese Region des Moleküls vor einem proteolytischen Abbau schützt. Das Vorliegen des Amidrestes am C-Terminus wird insofern bevorzugt, als dass dadurch ein zusätzlicher Schutz des Peptids gegen einen exoproteolytischen Abbau zu erwarten ist, wenngleich einige Proteasen diese Produkte hydrolysieren können (F. M. Leslie und A. Goldstein, Neuropeptides , Bd. 2 (1982), S.185–196).
Ferner wurde festgestellt, dass andere geeignete Aminosäuresubstitutionen vorgenommen werden können. Speziell ersetzten wir den oxidationsempfindlichen Met-Rest in den Positionen 8,18 durch den natürlich auftretenden, hydrophoben Rest Nle gemäß JP-B-61-24598. Es ist ferner zu erwarten, dass andere derartige hydrophobe Reste, wie Leu, Ile, Val, Phe und Trp, ebenfalls geeignet sind (vergl. US-5 393 869, Nakagawa et al.).
In US-5 393 869 (Nakagawa et at.) und US-5 434 246 (Fukuda et al.) wird über einige substituierte hPTH-Analoge berichtet, die eine erhebliche AC-Aktivität aufweisen und speziell eine verstärkte Stabilität gegenüber einem proteolytischen Angriff haben könnten.

1. Ser-1 zu Aib (α-Aminoisobuttersäure)
2. Lys-2 zu Gln (es wird über eine 2,5-fache AC-Aktivität berichtet)
3. Reste 14, 15, 16, 17 zu Lys, ganz oder teilweise (Dadurch soll die Aktivität in erheblichem Maße bis zum 8-fachen erhöht werden. Dies kann auf eine Erhöhung der Wasserlöslichkeit zurückzuführen sein. Es ist zu erwarten, dass diese Produkte in vivo gegenüber trypsinartigen Enzymen labiler sind.) Es wird angegeben, dass dieses Tetrapeptid (Reste 14 bis einschließlich 17) so beschaffen ist, dass mindestens eine wasserlösliche Aminosäure vorliegt: beispielsweise His-14 oder Lys-14; Leu-15, Lys-15 oder Arg-15; Asn-16, Orn-16, Hci (Nomocitrullin)-16, Asp-16, Arg-16, Lys-16, DLys-16, Ser-16 oder Gly-16; und 17-Ser, 17-Lys, 17-Asp oder 17-Arg. Beispielsweise kann auch Glu darunter fallen.
4. Arg 25 zu His beschränkt den Proteaseangriff auf ein Minimum. Da unsere Lactame, insbesondere Leu oder eine andere hydrophobe Aminosäure in Position 27 in gewissem Umfang unlöslich werden können und auch schwer zu lösen sind, ist zu erwarten, dass die gleichen Substitutionen auch bei unseren Lactamen geeignet sind.

Die erfindungsgemäßen Lactame lassen sich durch bekante, nachstehend beschriebene Verfahren herstellen. Sie können zur Stimulation des Knochenwachstums, zur Wiederherstellung von Knochen und zur Förderung der Knochenheilung bei verschiedenen Gegebenheiten, z. B. bei der Behandlung von Osteoporose und normalen Brüchen, verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Struktur von natürlichem humanem PTH, Reste 1–31 (SEQ ID NO: 1).
2 zeigt die Struktur von [Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID NO: 3)
3 zeigt repräsentative histologische Schnitte von Knochen, die nach Ablauf von 8 Wochen nach Ovariektomie (OVX) präpariert wurden, zur Erläuterung der unterschiedlichen Fähigkeit von hPTH-(1-31)-NH₂ und von deren Lactamderivaten zur Verhinderung von Knochenverlust und zur Stimulation des Knochenwachstums in ovariektomierten (OVX)-Sprague-Dawley-Ratten.
4 zeigt das trabekuläre Knochenvolumen von Kontrolltieren und von mit einem hPTH-Analogem behandelten Tieren, und zwar von Ratten, die ursprünglich eine starke Knochenverarmung aufwiesen. Die Behandlung der Tiere begann 9 Wochen nach OVX. [Leu²⁷]cyclo[Glu²²-Lys²⁶]hPTH-(1-31)-NH₂ war das wirksamste der Fragmente. Es führte zu einer Wiederherstellung der Knochen auf die Werte von normalen Kontrollratten.
5 zeigt die trabekuläre Dicke von Ratten-Oberschenkelknochen bei normalen Tieren, ovariektomierten Tieren, mit Placebo behandelten Tieren und mit hPTH-(1-31)-NH₂, [Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ behandelten Tieren.
6 zeigt den maximalen Blutdruckabfall und die Zeitspanne bis zum maximalen Blutdruckabfall bei Zugabe einer Dosis von 0,8 nmol/100 g hPTH-(1-31)-NH₂, [Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂. Die Peptide wurden entweder subkutan (leerer Balken) oder intravenös (schraffierter Balken) verabreicht.
7 zeigt die Struktur von [Leu²⁷]hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID NO: 5)
8 ist ein Diagramm, das den Einfluss von unterschiedlichen Dosierungen von linearem hPTH(1-31)-NH₂ auf das Knochenwachstum erläutert.
9 zeigt die Struktur von [Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-OH (SEQ ID NO: 8)
10 zeigt die Struktur von [Ala²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID NO: 11)
11 zeigt die Struktur von [Nle²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID NO: 12)
12 zeigt die Struktur von [Nle^8,18, Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID NO: 13)
13 zeigt die Struktur von cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID NO: 14)
14 zeigt die Struktur von [Ile²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID NO: 15)
15 zeigt die Struktur von [Tyr²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID NO: 16)
16 zeigt die Struktur von α-Acetyl-[Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID NO: 17)
17 zeigt die Struktur von [Leu²⁷]cyclo(Lys²²-Glu²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID NO: 18)
Herstellung von Hormon-Analogen
Die von R. B. Merrifield entwickelte Festphasen-Peptidsynthese ("Solid-Phase Peptide Synthesis", Advances in Enzymology, Bd. 32 (1969), S. 221–296) (diese Literaturstelle wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) stellt eine weit verbreitete und erfolgreiche Technik zur Synthese von Polypeptiden, z. B. von Parathyroidhormon, dar. Die Strategie beruht darauf, dass die carboxylendständige Aminosäure des Peptids an einen festen Träger gebunden wird. Die folgenden Aminosäuren werden sodann in hoher Ausbeute addiert. Die N-endständige α-Aminogruppe wird so geschützt, dass die Schutzgruppe ohne Entfernung des Peptids vom festen Träger entfernt werden kann. Die hier angewandte Chemie beinhaltet eine Modifikation des ursprünglichen Merrifield-Verfahrens. Diese Modifikation wird als Fmoc-Weg bezeichnet. Die Fmoc-Gruppe (Fluorenylmethoxycarbonylgruppe) kann unter milden alkalischen Bedingungen entfernt werden, wobei die alkalistabilen Seitenkettenschutzgruppen und die Bindung am Träger unverändert bleiben. Diese Technik wird von E. Atherton und R. C. Sheppard beschrieben ("Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach", IRL Press, New York, N. Y.; diese Literaturstelle wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht.
Beispiel 1
Herstellung und Reinigung von linearen hPTH-(1-31)-Amidanalogen
Die α-Aminogruppen der Aminosäuren wurden während der Kupplung mit 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) geschützt. Die Kupplung wurde mit einem Gemisch aus Hydroxybenzotriazol (HOBt), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TBTU) und Diisopropylethylamin (DIPEA) durchgeführt. Ein 4-facher Überschuss von aktivierten Aminosäuren wurde unter doppelter Kupplung bei der Addition der Asn-, Gln-, His-, Val- und Ile-Reste verwendet. Die Kupplungszeiten für die Addition von Arg und Gly wurden von 30 auf 60 Minuten verlängert. Die Kupplung des ersten Restes (Val³¹) an den Träger (Tentagel^R, Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland) wurde manuell vorgenommen. Sämtliche übrigen Schritte wurden mit dem automatischen Peptid-Synthesegerät PerSeptive Biosystems Modell 9050 Plus durchgeführt. Die Seitenketten wurden folgendermaßen geschützt: Arg (2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl); Glu, Asp und Ser (tert.-Butyl); His, Gln und Asn (Trityl); Trp (tert.-Butyloxycarbonyl).
Nach Fmoc-Entfernung vom N-endständigen Ser wurde das Peptidharz mit DCM gewaschen und sodann vom Harz durch 4-stündiges Schütteln bei 20°C mit 7,5 ml Reagenz K (6,19 ml TFA, 0,38 ml jeweils an Wasser, 90% Phenol/Wasser und Thioanisol und 0,19 ml 1,2-Ethandithiol) abgespalten. Das abgespaltene Peptidgemisch wurde durch Filtration entfernt und durch Zugabe von tert.-Butylmethylether ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gewonnen, 2-mal mit tert.-Butylmethylether gewaschen und sodann durch Vakuumzentrifugation getrocknet.
Das Rohprodukt wurde in 14 ml 15% Acetonitril/Wasser, 0,1% TFA, gelöst und an einer Vydac^R-C₁₈-Säule (10 μm, 1 × 25 cm) chromatographiert. Das Produkt wurde mit einem 1%/min-Gradienten von Acetonitril (14–40%) in 0,1% wässriger TFA eluiert. Die Reinheit des Endprodukts wurde durch analytische HPLC an einer Vydac^R-C₁₈-Säule (10 μm, 0,4 × 25 cm) und durch Molekülmassenbestimmung an einem Elektronenstrahl-Massenspektrometer (VG Quattro) bestimmt. Die Daten für das auf diese Weise gebildete hPTH-(1-31)-NH₂ sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
Beispiel 2
Herstellung und Reinigung von cyclischen Analogen
[Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂
Dieses Peptid wurde gemäß Beispiel 1 mit Lys-Alloc und Glu-Oall als Substituenten in den Positionen 26 bzw. 22 hergestellt. Nach Addition von Fmoc-Ser¹⁷ wurde das Peptidharz von der Säule in ein Reaktionsfläschchen (Minivial^R, Applied Science), gebracht, in 1,7 ml einer Lösung von Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium(0) (0,24 mmol) 5% Essigsäure und 2,5% N-Methylmorpholin (NMM) in Dichlormethan (DCM) unter Argon suspendiert und sodann 6 Stunden bei 20°C geschüttelt, um die Allyl- und Alloc-Schutzgruppen zu entfernen (N. A. Sole et al., Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Hrsg. J. Smith und R. Hodges, ESCOM (1993), S. 93–94), (diese Literaturstelle wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) zu entfernen. Anschließend wurde das Peptidharz mit 0,5 Diethyldithiocarbamat (DEDT), 0,5% NMM in DMF (50 ml) und sodann mit DMF (50 ml) und DCM (50 ml) gewaschen. Das Peptid (0,06 mmol) wurde durch 14-stündiges Schütteln bei 20°C mit 0,06 mmol 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt)/0,12 mmol DMM in 2 ml DMF cyclisiert (L. A. Carpino, J. Am. Chem. Soc., Bd. 115 (1993), S. 4397–4398). Das Peptidharz wurde sodann filtriert, 1-mal mit DMF gewaschen, wieder in die Säule gepackt und mit DMF gewaschen, bis Blasen aus der Suspension verschwunden waren. Die restliche Synthese wurde gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die N-endständige Fmoc-Gruppe nicht entfernt wurde. Das Fmoc-Peptid wurde vom Harz mit dem Reagenz K auf die vorstehend angegebene Weise abgespalten. HPLC wurde gemäß Beispiel 1 durchgeführt, wobei die Fmoc-Gruppe vor der endgültigen HPLC entfernt wurde.
Beispiel 3
Adenylyl-cyclase-Test
Die Fähigkeit von hPTH-Analogen zur Bindung an Rezeptoren und zur Aktivierung des an Adenylyl-cyclase gekuppelten Signalgebungsmechanismus wurde an einer differenzierungskompetenten osteoplastenartigen ROS 17/2-Rattenosteosarkom (ROS)-Zelllinie bestimmt. Es ist bekannt, dass diese Aktivität eng an die Fähigkeit des Analogen zur Wiederherstellung der Knochenmasse in der ovariektomierten Ratte gekuppelt ist. Die Adenylyl-cyclase-Stimulierungsaktivität wurde bestimmt, indem man den zellulären ATP-Pool vorher mit [³H]-Adenin markierte und anschließend die Menge des aus dem [³H]-ATP während der ersten 10-minütigen Einwirkung eines speziellen Analogen erzeugten [³H]-cyclischen AMP maß. Diese Vorgehensweise beruht auf dem von Whitfield et al. beschriebenen Verfahren (J. Cellular Physiology, Bd. 150 (1992), S. 299–303; diese Literaturstelle wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht).
Die Ergebnisse für die Adenylyl-cyclase sind in der nachstehenden Tabelle 2 als die Konzentrationen angegeben, die für eine halbmaximale Erhöhung der AC-Aktivität erforderlich sind.
Beispiel 4
Bestimmung der anabolen Aktivitäten von hPTH-Analogen am ovariektomierten Rattenmodell
Dosierungen
Die Dosen beruhten auf den Dosis-Wirkungs-Daten bei hPTH-(1-31)-NH₂. Die Knochenbildungsfähigkeit von hPTH-(1-31)-NH₂ wurde unter Verwendung mehrerer Dosen (0,8, 0,6, 0,4 und 0,2 nmol/100 g Körpergewicht) und unter Anwendung eines regenerativen oder die Behandlung bewertenden Modells anstelle eines präventiven Modells getestetl1. 3 Monate alte, ovariektomierte Ratten wurden 9 Wochen gehalten, um eine ernsthafte Verarmung des vorwiegend nicht-lamellaren femoralen, trabekulären Knochens herbeizuführen, bevor die 6-wöchigen täglichen Injektionen begannen. Nach 9 Wochen hatten die Tiere etwa 75% ihrer femoralen, trabekulären Knochenmasse verloren. 8 zeigt den durch lamellare Abscheidung verursachten dosisabhängigen Anstieg der durchschnittlichen trabekulären Dicken, der durch die 36 Injektionen in vier verschiedenen Dosen des Fragments herbeigeführt worden war. Das Fragment konnte auch das trabekuläre Knochenwachstum bei wesentlich älteren Ratten stimulieren. Dabei waren 36 Injektionen der mittleren Dosis von 0,6 nmol/100 g Körpergewicht an hPTH-(1-31)-NH₂ zu einem signifikanten Anstieg der durchschnittlichen trabekulären Dicke über den normalen Ausgangswert im vorher verarmten (9 Wochen nach OVX) femoralen, trabekulären Knochen von 1 Jahr alten Ratten befähigt, wobei die Wirkung ebenso groß war wie die von hPTH-(1-84). Demgemäß wurde die Dosierung von 0,6 nmol/100 g Körpergewicht für die weiteren Tests herangezogen.
Eine vollständige Beschreibung der Verfahrensweise findet sich bei Rixon et al., J. Bone & Mineral Research, Bd. 9 (1994), S. 1179–1189 und bei Whitfield et al., Calcif. Tissue Int., Bd. 58 (1996), S. 81–87 (diese Literaturstellen werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Normale, scheinovariektomierte und ovariektomierte Sprague-Dawley-Ratten (Alter 3 Monate, 255–260 g) wurden von Charles River Laboratories (St. Constant, QC) bezogen. Die Ratten wurden willkürlich in Gruppen von 8 Tieren eingeteilt. Sie erhielten Purina-Rattennahrung und Wasser nach Belieben. Es kam zu keinen unplanmäßigen Todesfällen. Die Tiere erhielten nach Ablauf von 2 Wochen 6-mal pro Woche eine einmalige tägliche subkutane Injektion. Diese Behandlung wurde 8 Wochen nach OVX beendet (d. h. 36 Injektionen). 8 scheinovariektomierte Ratten und 8 ovariektomierte Kontrollratten erhielten 36 Injektionen des Trägers (0,15 M NaCl mit einem Gehalt an 0,001 N HCl), während 8 ovariektomierte Ratten 0,6 nmol Fragment im Träger/100 g Körpergewicht erhielten. Nach Ablauf von 8 Wochen nach OVX wurden die Oberschenkelknochen entfernt, isoliert, gereinigt und an der mittleren Diaphyse halbiert. Die proximate Hälfte wurde verworfen. Nach Entfernen der Epiphyse wurden die einzelnen Hälften der Oberschenkelknochen in Längsrichtung zweigeteilt. Das Knochenmark wurde ausgespült.
Die Knochenbildungsfähigkeit der Fragmente wurde aus den Veränderungen der durchschnittlichen Dicke (Fläche/Durchmesser) der Trabeculae in den distalen Hälften der Oberschenkelknochen der in verschiedener Weise behandelten Tiere bestimmt. Zur Messung der durchschnittlichen trabekuäären Dicke wurden die beiden entmineralisierten Hälften der Oberschenkelknochen jeder Ratte dehydratisiert und in Paraffin eingebettet. 10 μm-Längsschnitte aus der mittleren Ebene eines jeden Knochens wurden angefertigt und mit Sanderson-Knochen-Schnellfärbemittel (Surgipath Medical Industries, Inc., Winnipeg, MB, Kanada) gefärbt. Die durchschnittliche trabekuläre Dicke wurde unter Verwendung eines M4-Abbildungssystems und der Knochenmorphometrie-Software der Fa. Imaging Research Inc., (St. Catherines, ON, Kanada) gemessen.
Repräsentative histologische Knochenschnitte, die 8 Wochen nach OVX präpariert wurden, sind in 3 dargestellt. Die Ergebnisse sind ferner in 5 in Form eines Balkendiagramms dargestellt. Die Balken zeigen die Werte für die trabekuläre Dicke normaler Ratten, ovariektomierter (OVX) Ratten, scheinovariektomierter Ratten, mit hPTH-(1-31)-NH₂ und [Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ behandelten Ratten. [Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH2 zeigt im Vergleich zum linearen Analogen hPTH-(1-31)-NH₂ eine besonders überlegene Wirkung. Dieses lineare Analoge hat sich bei der Knochenwiederherstellung als vollständig aktiv erwiesen, bedient sich aber nur eines einzigen zellulären signalgebenden Weges (AC-Aktivierung). Somit ist von diesen cyclischen Analogen wie beim linearen Analogen zu erwarten, dass sich im Vergleich zu ihren längeren Gegenstücken, wie hPTH-(1-34) oder hPTN-(1-84), die die beiden zellulären signalgebenden Mechanismen aktivieren, weniger unerwünschte klinische Nebenwirkungen ergeben.
Beispiel 5
Knochenwiederherstellung durch hPTH-Analoge bei Ratten mit stark verarmtem trabekulärem Knochen
In diesem zweiten Beispiel der Knochenwiederherstellung werden die Fähigkeiten der Lactamfragmente zur Wiederherstellung von stark verarmtem trabekulärem Knochen verglichen. In diesem Versuch wurde das 6-wöchige Programm mit einer einzigen Tagesinjektion von 0,6 nmol Peptid/100 g Körpergewicht bei jungen, geschlechtsreifen Ratten bis zum Ende der 9. Woche nach OVX verschoben. Zu diesem Zeitpunkt waren 75% des trabekulären Knochens verloren. Wie aus 4 ersichtlich ist, erwies sich [Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ als das wirksamste der Fragmente. Es stellte das trabekuläre Knochenvolumen wieder her, und zwar bis zu den Werten bei den normalen Kontrollratten.
Beispiel 6
Hypotonische Wirkungen von hPTH-Analogen
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht über 290 g) wurden durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (65 mg/kg Körpergewicht) betäubt. Die rektale Temperatur wurde mit einem YSI402-Thermistor (Yellow Springs Instrument Co., Inc. Yellow Springs, OH) überwacht und während der gesamten Versuchsdauer zwischen 36,0 und 38,5°C gehalten. Ferner wurde die Ohrmuscheltemperatur unter Verwendung eines YSI-Banjo-Thermistors überwacht. Die Schwanzarterie wurde freigelegt und mit einem Jelco 25-gIV-Katheter (Johnson and Johnson Medical Inc., Arlington, TX) kannüliert und mit einem Statham-Druckmesswandler verbunden. Dessen Signale wurden mit einem Biopac Systems MP100-Monitor (Harvard Instruments, Saint Laurent, QC, Kanada) digital aufgezeichnet. Zur intravenösen Injektion von PTH oder einem seiner Fragmente wurde ferner eine Femoralvene freigelegt. Nach dem chirurgischen Eingriff an der Ratte wurde eine Stabilisierungsperiode von 8 Minuten eingehalten. Anschließend wurde PTH oder eines seiner Fragmente (gelöst in angesäuerter Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,001 N HCl) in die Femoralvene oder unter die Abdomenhaut injiziert. Daten wurden 12 Minuten nach der intravenösen Injektion oder 22 Minuten nach der subkutanen Injektion gesammelt. 6 zeigt den maximalen Blutdruckabfall und die Zeitspanne bis zum maximalen Abfall bei Verabreichung einer Dosis von 0,8 nmol/100 g an [Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂. Die Verabreichung erfolgte entweder subkutan (offener Balken) oder intravenös (schraffierter Balken). Das [Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂-Analoge zeigt eine erhöhte biologische Verfügbarkeit. Dies ergibt sich aus der wesentlich kürzeren Zeitspanne, die nach subkutaner Injektion für einen Abfall auf den minimalen Blutdruck erforderlich ist. Die beiden cyclischen Analogen zeigen eine verstärkte hypotonische Wirkung bei subkutaner Injektion, verglichen mit hPTH-(1-31)-NH₂. Somit ist zu erwarten, dass jedes cyclische Lactam-Analoge bei subkutaner Injektion stärker erwünschte Eigenschaften als das lineare Gegenstück aufweist. Hierzu gehören eine stärkere biologische Verfügbarkeit, die sich aus der erhöhten Beständigkeit gegenüber Proteasen ergibt, und/oder eine erhöhte Fähigkeit zum Transport aus einer Lipidumgebung. Die letztgenannte Wirkung könnte auf die Stabilisierung der amphiphilen Helix in der Nähe des C-Terminus des Hormons zurückzuführen sein.
Weitere Ergebnisse
Für diese Ergebnisse wurden folgende Peptide herangezogen: hPTH-(1-31)-NH₂ (1); [Leu²⁷]-hPTH-(1-31)-NH₂ (2) (9); [Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂.
Adenylyl-cyclase-Aktivität
Wir berichteten früher, dass [Leu²⁷]-hPTH-(1-34)-NH₂ in Bezug auf die Stimulierung der AC-Aktivität in der ROS-Zelllinie wirksamer ist als hPTH-(1-34)-NH₂ ⁵. Ferner stellten wir fest, dass das Peptid 2 (EC₅₀, 11,5 ± 5,2 nM) wirksamer ist als die native Sequenz 1 (EC₅₀, 19,9 ± 3,9 nM) (12). Aufgeführt sind die Peptide 1(•); 2(⎕); 4(
); 5(O). Die Lactambildung zwischen Glu und Lys (3) führte eine noch größere AC-Stimulierungsaktivität mit EC₅₀-Werten von 3,3 ± 0,3 nM herbei. Somit besteht die Nettowirkung dieser Cyclisierung und des Ersatzes von Lys²⁷ durch Leu in einer etwa 6-fachen Erhöhung der Aktivität.
Bestimmung der Korrelation zwischen der hypotonischen Wirkung und der osteogenen Aktivität
Wie in Beispiel 6 beschrieben und in 6 dargestellt ist, korreliert die hypotonische Wirkung, die im Anschluss an eine subkutane Injektion von hPTN-Analogen beobachtet wird, mit der osteogenen Aktivität. Demgemäß eignet sich der Test zum Screening von als Kandidaten in Frage kommenden hPTH-Analogen auf deren osteogene Wirkung und zur Aussonderung von nicht-hypotonischen Konstrukten, wobei keine Laboratoriumstesttiere geopfert werden müssen.
Zu Hintergrundstudien verwendeten wir einen besonderen Satz von osteogenen und nicht-osteogenen AC-, AC/PLC- oder PLC-aktivierenden PTH-Fragmenten, um endgültig zu zeigen, dass nur die AC-Stimulierung den Blutdruck verringert, und um die hypotonischen Wirkungen dieser Fragmente bei subkutaner oder intravenöser Injektion an weibliche Ratten zu vergleichen. Wir zeigten, dass die hypotonische Reaktion nur durch AC- oder AC/PLC-stimulierende Fragmente ausgelöst wird und dass die relativ geringe hypotonische Reaktion auf eine subkutane Injektion und nicht die wesentlich stärkere Reaktion auf eine intravenöse Injektion mit den osteogenen Aktivitäten von hPTH-(1-31)-NH₂, hPTH-(1-34) und hPTH-(1-84) bei OVX-Ratten korreliert, was jedoch nicht für hPTH-(1-30)-NH₂ gilt, das AC stimuliert und den Blutdruck verringert, jedoch nicht die Knochenbildung stimuliert.
Speziell verringerten hPTH-(1-84) und dessen hPTH-(1-34)-, hPTH-(1-31)-NH₂-und hPTH-(1-30)-NH₂-Fragmente den Schwanzarteriendruck bei betäubten weiblichen Sprague-Dawley-Ratten innerhalb von 1 Minute nach der Injektion in eine Femoralvene um 42,4–67,1%, verminderten aber nach subkutaner Injektion den Druck nach 2 bis 19 Minuten nur um 8,5–36,2%. hPTH-(1-84) und hPTH-(1-34) stimulieren sowohl Adenylyl-cyclase als auch Phospholipase-C in ihren Zielzellen, jedoch muss die hypotonische Wirkung spezifisch durch die Adenylyl-cyclase-Aktivierung stimuliert worden sein, da hPTH-(1-30)-NH₂ und hPTH-(1-31)-NH₂, die nur Adenylyl-cyclase stimulieren können, stark hypotonisch wirkten, wenn sie intravenös injiziert wurden, während hPTH-(7-84), das nur Phospholipase-C stimulieren kann, bei intravenöser Injektion nicht signifikant hypotonisch war. Da die osteogene Wirkung von PTH ebenfalls durch Adenylyl-cyclase-Stimulation vermittelt wird, war zu erwarten, dass die hypotonische Reaktion zum Screening von neuen PTH-Konstrukten auf mögliche Osteogenizität verwendet werden kann. Tatsächlich korrelierten die osteogenen Aktivitäten von subkutan injiziertem hPTH-(1-31)-NH₂, hPTH-(1-34) und hPTH-(1-84) eng mit ihren hypotonischen Aktivitäten, wobei hPTH-(1-34) wesentlich stärker hypotonisch war und die beiden übrigen Moleküle signifikant stärker hypotonisch waren. hPTH-(1-31)-NH₂ und hPTH-(1-84) waren gleichermaßen osteogen und hypotonisch. Jedoch brach diese Korrelation bei hPTH-(1-30)-NH₂ zusammen, das AC fast ebenso stark wie hPTH-(1-31)-NH₂ und hPTH-(1-34) stimuliert und den Blutdruck ebenso stark wie hPTH-(1-31)-NH₂ verringert, jedoch nicht die Knochenbildung stimuliert. Dennoch stellt die Fähigkeit zu einer signifikanten Verringerung des arteriellen Druckes eine gemeinsame Eigenschaft von osteogenem PTH und PTH-Fragmenten dar und stellt somit einen rasch bestimmbaren vorläufigen Indikator der in vivo-Bioaktivität von PTH-Fragmenten dar.
Speziell waren sowohl hPTH-(1-34) als auch hPTH-(1-31)-NH₂ bei einer Dosis von 0,8 nmol/100 g Körpergewicht maximal hypotonisch.
Diese hypotonische Reaktion war von einer vorübergehenden (20–30 Minuten) Rötung der Ohren und Pfoten der Ratten begleitet, was als geeigneter visueller qualitativer Marker angesehen werden kann.
Obgleich AC- oder AC/PLC-stimulierende Fragmente bei intravenöser Injektion stark hypotonisch waren, verringerte eine intravenöse Injektion von 0,8 nmol/100 g Körpergewicht an hPTH-(7-84), das nur PLC stimulieren kann, sehr langsam (9,8 ± 2,0 Minuten) und sehr geringfügig den Schwanzarteriendruck um 3,28 ± 1,0 mmHg, verglichen mit der prompten Verringerung (0,9 ± 0,08 Minuten) um 43,2 ± 5,8 mmHg durch das AC/PLC-stimulierende hPTH-(1-84) oder verglichen mit dem ebenfalls prompten Abfall um 51,6 ± 3,3 mmHg durch das AC-stimulierende hPTH-(1-31)-NH₂.
Eine subkutane Injektion eines AC- oder AC/PLC-stimulierenden Fragments verursachte eine wesentlich langsamere und kleinere Verringerung des Schwanzarteriendrucks als eine intravenöse Injektion der gleichen Dosis. Beispielsweise verringerten 0,8 nmol/100 g Körpergewicht an hPTH-(1-34) den Druck nur um 27,9 ± 3,6 mmHg bei subkutaner Injektion, verglichen mit 50,9 ± 5,6 mmHg bei intravenöser Injektion. Die gleiche Dosis an hPTH-(1-31)-NH₂ verringerte den Blutdruck nur um 11,1 ± 1,6 mmHg bei subkutaner Injektion, verglichen mit 51,6 ± 3,3 mmHg bei intravenöser Injektion.
Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den raschen und großen Verringerungen des Schwanzarteriendrucks durch intravenöse Injektion von hPTH-(1-84), hPTH-(1-34) und hPTH-(1-31)-NH₂, wobei aber hPTH-(1-34) mindestens doppelt so wirksam war (P < 0,01) als die anderen beiden Moleküle, und zwar bei subkutaner Injektion.
Einer der Faktoren, der die hypotonische Wirkung und die Osteogenizität von PTH oder einem PTH-Fragment bei subkutaner Injektion beeinflusst, ist deren Fähigkeit zur inaktivierungsfreien Wanderung von der Injektionsstelle zu den Zielen, zunächst in das Gefäßsystem und anschließend in die Knochen. Diese Fähigkeit spiegelt sich in der Zeitspanne wieder, die erforderlich ist, dass der Schwanzarteriendruck nach der Injektion auf einen minimalen Wert sinkt. Eine C-endständige Verkürzung des PTH-Moleküls von 84 auf 31 Reste beseitigte die Fähigkeit zur Stimulation von PLC, ohne dass die Fähigkeit zur Stimulation von AC verringert wurde und verkürzte die Zeitspanne, die zum Erreichen des minimalen Schwanzarteriendrucks erforderlich war, um den Faktor 9. Die Entfernung eines weiteren Restes unter Bildung von hPTH-(1-30)-NH₂ verlängerte die zum Abfall des Blutdrucks auf ein Minimum benötigte Zeitspanne in drastischer Weise von 2,0 ± 0,31 Minuten im Fall von hPTN-(1-31)-NH₂ auf 13,8 ± 2,3 Minuten. Die Feststellung ist jedoch wichtig, dass hPTH-(1-31)-NH₂ zur Verminderung des Blutdrucks eine längere Zeitspanne benötigte als hPTH-(1-84).
Der Einsatz von hPTH-(1-31)-NH₂, dem ersten PTH-Konstrukt, das zur Stimulation von AC in ebenso starker Weise wie hPTH-(1-34) befähigt ist, ohne PLC zu aktivieren und die membrangebundene PKC-Aktivität zu stimulieren, in der vorliegenden Studie liefert nunmehr den direktesten Beweis, dass die hypotonische Wirkung von PTH vollständig auf die AC-Aktivierung zurückzuführen ist. Obgleich eine intravenöse Injektion von 0,8 nmol/100 g Körpergewicht an hPTH-(7-84), das nur PLC/PKCs stimulieren kann, nicht in signifikanter Weise den Schwanzarteriendruck beeinflusste, bewirkte eine intravenöse Injektion der gleichen Dosis an hPTH-(1-31)-NH₂ einen ebenso starken Abfall des Drucks wie hPTH-(1-34).
Da AC auch die PTH-induzierte Stimulation von kortikaler und trabekulärer Knochenbildung in OVX-Ratten vermittelt, scheint das Auslösen einer hypotonischen Reaktion bei intakten weiblichen Ratten einen einfachen, rasch messbaren Indikator einer möglichen Osteogenizität eines PTH-Konstrukts darzustellen. Andererseits würde es das Ausbleiben der Verringerung des arteriellen Drucks gestatten, ein Fragment von der weiteren Prüfung auszuschließen, wodurch unnötige, teure, zeitaufwändige Osteogenizitätstests bei OVX-Ratten vermieden würden. Die hypotonischen Reaktionen auf eine intravenöse Injektion korrelierten nicht mit der osteogenen Beschaffenheit der PTHs. Jedoch verliefen die wesentlich geringeren hypotonischen Reaktionen von hPTH-(1-31)-NH₂, hPTH-(1-34) und hPTH-(1-84) bei subkutaner Injektion parallel mit der Osteogenizität dieser Moleküle, wobei hPTH-(1-34) die stärkste hypotonische und osteogene Wirkung aufwies und die anderen beiden Moleküle untereinander gleich wirksam waren, jedoch eine geringere Wirksamkeit als hPTH-(1-34) in Bezug auf eine Verringerung des Blutdrucks und eine Stimulation der Knochenbildung zeigten. Diese Korrelation fiel aber bei hPTH-(1-30)-NH₂ weg, dass AC fast ebenso stark wie hPTH-(1-31)-NH₂ und hPTH-(1-34) stimuliert und den Blutdruck ebenso stark wie hPTH-(1-31)-NH₂ verringert, jedoch die Knochenbildung nicht stimuliert¹¹. Der Grund für dieses Ausbleiben der Osteogenizität ist unbekannt. Es kann nicht nur darauf zurückzuführen sein, dass eine subkutane Injektion von hPTH-(1-30)-NH₂ mehr Zeit zur Verringerung des Blutdrucks benötigt, da subkutan injiziertes hPTH-(1-84) die gleiche Zeitspanne zur Verringerung des Blutdrucks benötigt, jedoch stark osteogen wirkt. Klarerweise hängt die osteogene Reaktion von zahlreichen verschiedenen Faktoren ab, die es gemeinsam ermöglichen, dass ausreichend aktives Hormon oder Hormonfragment von der Injektionsstelle zu den reifen Osteoblasten, die den Ziel-PTH-Rezeptor exprimieren, gelangt. Das Versagen des AC-stimulierenden, blutdrucksenkenden hPTH-(1-30)-NH₂ in Bezug auf eine Stimulation der Knochenbildung kann das Ergebnis der Kombination einer größeren Instabilität, eines geringfügig höheren EC₅₀-Werts für die AC-Stimulierung, d. h. 20 nM anstelle von 16 nM für hPTH-(1-31)-NH₂ und hPTH-(1-34), und einer langen Zeitspanne zur Wanderung von der Injektionsstelle in den Kreislauf darstellen.
Trotz der mangelnden Fähigkeit von hPTH-(1-30)-NH₂ zu einer osteogenen Wirkung, stellt die Fähigkeit zur erheblichen Verringerung des arteriellen Drucks immer noch eine gemeinsame Eigenschaft der osteogenen PTHs dar und bedeutet somit einen rasch bestimmbaren Indikator einer möglichen in vivo-Bioaktivität von PTH-Fragmenten. Daraus folgt, dass die hypotonische Reaktion auch einen wirksamen Indikator der Fähigkeit eines osteogenen PTH-Konstrukts zur Erreichung seiner Ziele nach Verabreichung durch orale oder andere Nichtinjektions-Verabreichungswege darstellt.
Die Beschwerden und andere mögliche Folgen einer hypotonischen Reaktion nach jeder Injektion können die Bereitschaft von osteoporotischen Patienten, eine Langzeitbehandlung mit PTH oder einem PTH-Fragment zu akzeptieren, einschränken. Günstigerweise werden derzeit intermittierende subkutane Injektionen von PTHs zur Stimulation der Knochenbildung herangezogen. Diese Moleküle besitzen alle eine bei weitem geringere hypotonische Wirkung bei subkutaner Injektion, im Vergleich zur intravenösen Injektion. Gemäß unserer früheren Argumentation^6,7 weist hPTH-(1-31)-NH₂ den zusätzlichen Vorteil einer Stimulation von AC ohne Stimulation von PLC und ohne potenzielle Ca²⁺- und PKCs-vermittelte Nebeneffekte, die es auslösen könnte, auf.
Die erfindungsgemäßen Analogen können warmblütigen Säugetieren, die einer Behandlung bedürfen, insbesondere einem Menschen, durch parenterale, topische oder rektale Verabreichung oder durch Inhalation oder orale Abgabe verabreicht werden. Die Analogen können zweckmäßigerweise in einer parenteralen Dosierungsform zubereitet werden, indem man etwa 1 bis etwa 300 mg pro Dosiseinheit mit einem herkömmlichen Träger, Verdünnungsmittel, Bindemittel, Konservierungsmittel, Stabilisator, farbgebenden Mittel oder dergl. entsprechend der eingeführten pharmazeutischen Praxis vermischt.
Zur parenteralen Verabreichung ist eine schmerzfreie subkutane Injektion von 1 bis 2 ml durch eine ultrafeine Spritzennadel mit 30 "gauge" nicht mehr als 1-mal täglich für 1 bis 2 Jahre lang erforderlich, je nach der Schwere der Krankheit. Das injizierte Material enthält eines der erfindungsgemäßen Produkte in einer wässrigen, isotonischen, sterilen Lösung oder Suspension (gegebenenfalls mit einem Konservierungsmittel, wie Phenol, oder einem Solubilisierungsmittel, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)). Zu den verträglichen Trägerstoffen und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, gehören Wasser, schwach angesäuertes Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Ferner werden herkömmlicherweise sterile, fixierte Öle als Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Synthetische Monoglyceride, Diglyceride, Fettsäuren (z. B. Ölsäure) finden bei der Herstellung von Injektionspräparaten als fixiertes Öl Verwendung.
Für die rektale Verabreichung können die erfindungsgemäßen Analogen in Form von Suppositorien zubereitet werden, indem man sie mit einem geeigneten nicht-reizenden Trägerstoff, wie Kakaobutter oder Polyethylenglykole, vermischt.
Zum topischen Einsatz können die erfindungsgemäßen Analogen in Form von Salben, Gelees, Lösungen, Suspensionen oder klebende Hautpflaster zubereitet werden.
Präparate zur Inhalation lassen sich beispielsweise gemäß WO 94/07514 herstellen.
Die tägliche Dosis soll nicht mehr als 0,05 mg/kg Körpergewicht oder etwa 3,5 mg bei einem Patienten mit einem Gewicht von 70 kg übersteigen, und zwar je nach der Aktivität der speziellen Verbindung, dem Alter, dem Gewicht, dem Geschlecht und dem Zustand des zu behandelnden Patienten. Bekanntlich variiert die Menge des Wirkstoffes, die mit den Trägermaterialien zur Herstellung einer Einzeldosis vereinigt wird, je nach der behandelten Person und dem speziellen Verabreichungsweg.
Nachstehend findet sich eine Liste von Analogen, die sich gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren herstellen lassen.
Literatur
Die Offenbarung der folgenden Literaturstellen wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht.

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(2) Neugebauer, W.; Barbier, J.-R.; Sung, W. L.; Whitfield, J. F.; Willick, G. E. Solution Structure and Adenylyt Cyclase Stimulating Activities of C-Terminal Truncated Human Parathyroid Hormone Analogues Biochemistry 1995, 34, 8835–8842.
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(7) Whitfield, J. F.; Morley, P. Small Bone-Building Fragments of Parathyroid Hormone: New Therapeutic Agents for Osteoporosis Trends Pharmacol. Sci 1995 16, 382.386.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Humanes Parathyroidhormon-hPTH-(1-31)-Analoges, bei dem die Aminosäure 27 Lys ist oder durch einen hydrophoben Rest substituiert ist und das zwischen Glu²² und Lys²⁶ unter Bildung eines Lactams cyclisiert ist.
Analoges nach Anspruch 1, wobei der hydrophobe Rest Leu ist.
Analoges nach Anspruch 1, wobei der hydrophobe Rest unter Ile, Nle, Met und α-Aminobuttersäure ausgewählt ist.
Analoges nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einer C-endständigen Amid- oder einer C-endständigen Carboxylgruppe.
Analoges nach Anspruch 1 mit SEQ ID NO: 3.
Analoges nach Anspruch 1 mit SEQ ID NO: 14.
Zusammensetzung, enthaltend ein Analoges nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten.
Analoges nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung bei der Therapie.
Verwendung eines Analogen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Behandlung von Osteoporose.