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KR20000023579A - 에리트로마이신 및 그 제조방법 - Google Patents

에리트로마이신 및 그 제조방법 Download PDF

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KR20000023579A
KR20000023579A KR1019997000024A KR19997000024A KR20000023579A KR 20000023579 A KR20000023579 A KR 20000023579A KR 1019997000024 A KR1019997000024 A KR 1019997000024A KR 19997000024 A KR19997000024 A KR 19997000024A KR 20000023579 A KR20000023579 A KR 20000023579A
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KR
South Korea
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plasmid
compound
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alkyl
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KR1019997000024A
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페터 프란시스 리드레이
제임스 스타우톤
예수 코테스
마이클스테펜 패시
Original Assignee
바이오티카 테크놀로지 리미티드
디. 제이. 우드, 스피겔 알렌 제이
화이자 인코포레이티드
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Priority claimed from GBGB9710962.3A external-priority patent/GB9710962D0/en
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Abstract

에리트로마이신, 특히 C-13 치환기 R1(예를 들면, C3-C6 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐 그룹)은 적당한 미생물을 R1COOH의 존재하에 발효시켜 제조함. 바람직한 미생물은 요구하는 화합물을 생합성할수 있는 결합된 플라스미드를 함유하는 사카로폴리스포라 에리트라에아임.

Description

에리트로마이신 및 그 제조방법{ERYTHROMYCINS AND PROCESS FOR THEIR PREPARATION}
본 발명은 신규한 폴리케티드 및 그 제조방법에 관계되는 것으로서, 특히 사람을 포함하는 포유류, 조류 및 어류에 사용하는 항균성 및 항원충성 약품과 기타의 용도(예를 들면, 항암제, 아테롬성 동맥경화증, 위 무력증 등)로 유용하게 사용되는 신규한 에리트로마이신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신규한 화합물을 포함하는 의약 조성물과 포유동물, 어류 및 조류에 처리하여 포유동물, 어류 및 조류의 세균 및 원충의 감염을 치료하는 방법에도 관계된다.
상이한 폴리케티드 생합성 유전자 클러스터(cluster)로부터 유도된 폴리케티드 생합성 유전자 또는 이들의 부분들은 신규한 에리트로마이신의 제조에 사용될수 있다.
폴리케티드는 에리트로마이신, 테트라사이클린, 래파마이신, 아버멕틴, 폴리에테르 이오노포어 및 FK506과 같은 항생성 또는 기타의 약리학적 특성을 갖는 화합물들을 포함하는 내츄랄 제품과 구조적으로 다른 부류에 속한다. 특히, 폴리케티드는 스트렙토마이세스 및 관련된 방선균류 박테리아로부터 많이 제조되고 있다.
이들은 지방산 생합성에 유사한 방법으로 아실티오에스텔의 단계적인 농축을 반복하므로서 합성할수 있다. 내츄랄 폴리케디드에서 발견되는 큰 구조적인 차이점은 ″스타터″(starter) 또는 ″익스텐더″(extender) 유니트로서 (통상적인) 아세테이트 또는 프로피오네이트의 선택 또는 농축후에 관찰되는 β -케토 그룹의 처리도 차이에 의하여 나타난다. 처리단계의 예로는 β -하이드록시아실- 로의 환원, 2-에노일로의 탈수에 뒤이은 환원, 및 포화된 아실티오에스텔로의 완전한 환원이 있다. 이러한 처리단계의 입체화학적 결과는 각개 체인 사이클이 확장되는 특징을 나타낸다. 폴리케티드의 생합성은 폴리케티드 신다제(synthase)로 알려진 체인-형성 효소 그룹에 의하여 시작된다. 두 종류의 폴리케티드 신다제(PKS)가 악티노마이세트에 기재되어 있다. 그러나 본 발명의 신규한 폴리케티드와 그 처리방법들은 마크로리드 항생물질 에리트로마이신, 아버멕틴 및 래파마이신에 대한 PKS′s로 대표되는 Type I PKS′s에 의하여 합성되고(도 1 참조), 폴리케티드 체인 확장의 각개 사이클에 대한 효소의 다른 셋트 또는 ″모듈″로 이루어 진다(도2A 참조)(코르테스,제이., 등, Nature (1990) 348: 176-178; 도나디오, 에스., 등, Science (1991) 252: 675-679; 맥내일, 디. 제이. 등, Gene (1992) 115: 119-125; 슈벡스, 티. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7839-7843). 본 명세서에서 ″내츄럴 모듈″(natural module)이라는 용어는 α ,β-케토아실신다제(″KS″) 유전자로부터 폴리케티드 체인 확장의 한 사이클이 끝나는 다음 아실 캐리어 단백질(″ACP″) 유전자까지의 연속 도메인 셋트에 대하여 사용한다. 본 명세서에서, ″콤비나토리알″(combinatorial module)이란 용어는 제1 내츄럴 모듈의 제1 부위에서부터 제2 내츄럴 모듈의 동일한 제2 부위까지 확장된 임의 그룹의 연속 도메인(및 도메인 부분)에 대한 것이다. 제1 및 제2 부위는 모든 모듈에 존재하는 코아 도메인에 존재하며, 예를 들면 이러한 부위들은 해당하는 KS, AT(아실트란스퍼라제), ACP 도메인 또는 도메인들 사이의 연결부위에 있는 해당하는 부위일수 있다.
도 2는 에리트로마이신 생성 PKS(6-디옥시에리트로놀리드 B 신다제, DEBB로알려짐) 유전자의 조직을 보여 준다. 3개의 오픈 리딩 프레임은 DEBS 폴리펩티드를 인코딩한다. 유전자들은 모듈을 지정하는 6개의 반복 유니트로 조직되었다. 제1 오픈 리딩 프레임은 제1 멀티-효소 또는 3개의 모듈[1개의 로딩(loading) 모듈(ery-로드)과 2개의 확장 모듈(모듈 1과 모듈 2)]로 구성된 카셋트(DEBS1)를 인코딩한다: 로딩 모듈은 아실트란스퍼라제와 아실 캐리어 단백질을 포함한다. 전술한 제1 오픈 리딩 프레임은 본 발명에 인용한 W093/13663호의 도 1과 대비된다. 전술한 도면에는 오직 두 모듈, 즉 실질적인 두 로딩 모듈과 하나의 확장 모듈로 구성된 ORF1을 보여주고 있다.
DEBS에 있는 모듈 5의 케토리덕타제 도메인의 DNA 인코딩 부위의 프레임 내결실은 5,6-디디옥시-3-미카로실-5-옥소에리트로노리드 B, 5,6-디디옥시-5-옥소에리트로노리드 B 및 5,6-디디옥시-6,6-에폭시-5-옥소에리트로노리드 B의 형성으로 진행됨을 보여주고 있다(도날디오, 에스. 등. Science (1991) 252: 675-679). 유사하게, 해당하는 PKS-인코딩 DNA의 유전공학 및 이들의 사카로폴리스포라 에리트라에아에로의 도입에 의한 DEBS에 있는 모듈 4의 에노일리덕타제에 잔류하는 활성사이트의 변화는 6,7-앤하이드로에리트로마이신 C의 생성을 가져온다(도나디오 에스. 등. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 7119-7123).
본 발명에 인용된 W0 93-13663호에는 변형된 폴리케티드를 생성할수 있는 다른 형태의 DEBS 유전자의 유전자 조작이 기재되어 있다. 그러나 이와 같은 대부분의 기도는 비생산적인 것으로 기록되어 있다(허칭손 시. 알. 및 후지이 아이, Annu. Rev. Microbicl.(1995) 49: 201-238, 231페이지). 마크로사이클릭 면역억제성 폴리케티드 래파마이신의 생합성을 지배하는 모듈라 Type 1 PKS를 인코딩하는스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스로부터 유도된 유전자의 완전한 DNA 염기성 배열도 알려졌다(슈베케, 티. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7839-7843)(도 3 참조). DNA 배열은 EMBL/Genbank 데이터 베이스에 등록번호X86780으로 기탁되었다.
비록 수많은 중요한 치료용 폴리케티드가 확인되었지만, 향상된 성능과 완전히 새로운 생물학적 활성을 갖는 신규한 폴리케티드를 개발할 필요성은 남아 있다. 모듈라 Type 1 PKS에 의하여 생산되는 복합 폴리케티드는 특히 가치가 있는데, 이들은 구충제, 살충제, 면역억제제, 항균제 및/또는 항미생물제로서의 공지된 용도를 갖는 화합물을 포함한다. 이들의 구조적인 복잡성 때문에 전술한 신규의 폴리케티드들은 화학적 합성에 의하여 얻어지지 않고 있음은 물론이고 공지된 폴리케티드의 화학적인 변형에 의하여서도 얻어지지 않고 있다. 본 발명의 한 형태는 Type 1 PKS 유전자 어쌤블리가 확장 모듈에 뒤따르는 로딩 모듈을 인코딩한다는 본 발명자들의 발견에 의하여 이루어 졌다. 로딩 모듈이 확장 모듈과 이종이면서 변형된 스타터(starter) 유니트를 갖는 폴리케티드로 전환되는 경우에는, 특히 하이브리드 PKS 유전자 어쌤블리를 이용하는 것이 유리하다. 지금까지는 로딩 모듈의 존재가 인정을 받지 못하고 있었으므로 전술한 이론은 종래 알려지지 않은 개념이다. WO 93/13663호는 단일 기능 단위(예를 들면, 단일 효소)를 불활성화하거나 또는 결실, 삽입 또는 변환에 의하여 전체 모듈에 영향을 주므로서 PKS 유전자를 변형시키는데 관계되는 것이다. 전술한 특허문헌에서 로딩 어쌤블리로 표현한 것은 모듈이 아니다.
로딩 모듈이 상이한 많은 카복실산 유니트들을 포함하는 것인 겅우에는 하이브리드 유전자가 상이한 많은 플리케티드를 생산하는데 이용할수 있다. 예를 들면, 하이브리드 유전자는 ery-익스텐더 모듈을 갖는 avr-로딩 모듈을 인코딩하는 핵산을 사용할 수 있다. 로딩 모듈은 난내츄랄 산 유니트나 그들의 유도체를 수용할 수도 있다; 즉 avr-로딩 모듈은 특히 이 분야에 유리하다(듀톤 등; J.Antibiot. (1991) 44: 357-365). 더구나, 난내츄랄 스타터 유니트에 대한 내 츄랄로딩 모듈의 특이성을 측정하고 신규의 폴리케티드를 생성하는 로딩 모듈의 리락스특이성의 장점을 취할수도 있다. 따라서 본 발명의 다른 형태는 난내츄랄 카복실산과 이들의 유도체들을 도입하여 오직 DEBS 유전자만을 포함하는 에리트로마이신-생성 균주에서 신규의 에리트로마이신을 생성하는 ery-로딩 모듈의 기대하지 않았던 능력에 관계된다. 물론, 상이한 산화 상태에서 케티드 유니트를 제공하는 것에 의하여 확장 모듈을 대치하거나 또는 입체화학적으로 제품 폴리케티드 내에 변화를 줄 수도 있다. 폴리케티드 체인에 있는 메틸 그룹의 입체화학적 구조를 아실트란스퍼라제에 의하여 측정하는 것을 예상할수 있으나, 실제적으로는 PKS의 다른 도메인의 형태와 이러한 도메인들을 개별적으로 대치하거나 모듈 교체에 의하여 오직 변형만 되도록 개방하는 것이다. 메틸 및 기타의 치환기들은 아실트란스퍼라제 도메인 교체 및 전체 모듈 교체에 의하여 첨가되거나 제거될수 있다. 결론적으로, 광범위한 신규 에리트로마이신을 생산하기 위한 메카니즘으로서 확장 모듈 교체가 이루어진 에리트로마이신 로딩 모듈의 리락스 기질 특이성을 이용함과 동시에 확장 모듈 교체로 하이브리드 로딩 모듈을 치환하는 것이 가능함을 해당 업계에 종사하는 기술자들은 쉽게 알수 있을 것이다. 따라서 본 발명은 비-전환(non-transformed) 미생물과 전술한 유전자 어쌤블리, 전술한 유전자 어쌤블리를 포함하는 벡타 및 형질전환된 미생물에서 에리트로마이신을 생산하도록 그들을 표현하는 피형질전환체 생물에 의하여 신규한 에리트로마이신을 생산하는 방법에 관계된다. 피형질전환체 미생물은 DNA 재조합 플라스미드를 포함할수도 있고, 또한 플라스미드들은 결합될 수도 있다. 내부 배열을 갖는 플라스미드는 호스트 염색체의 특정 부착 사이트(att)에 결합된다. 피형질전환체 미생물들은 예를 들면, 에리트로마이신의 생산에 통상적인 생합성 일시변이의 전부 또는 일부를 수반하므로서 최초 제품을 변이시킬 수 있을 것이다(도 2B 참조). 그러나, WO91/16334호 또는 웨버 등, J. Bacteriol. (1985) 164: 425-433에 기재된 바와 같이 하나 또는 그 이상의 내츄랄 하이드록시 그룹 또는 슈가 그룹을 갖지 않는 제품을 생산하기 위하여는 정상 경로의 일부가 봉쇄된 돌연변이 미생물을 사용할 수도 있다. 또한 W097/06266호에 기재된바와 같이 요구하는 제품의 생산에 잠재적 속도 억제단계를 해소하기 위하여 정상 경로의 일부가 과표현된 미생물을 사용할 수도 있다.
본 발명의 방법은 효소 시스템을 조합하고 요구하는 형태의 신규 에리트로마이신을 생산할수 있는 빌딩 블록인 PKS 유전자 처리와 관계된다. 본 발명의 방법은 모듈과 멀티-모듈 그룹핑의 절단과 조합을 포함한다. 모듈 내부간에서 결합과 분리가 이루어지는 이론적인 위치는 모듈들 사이의 결합부위이다. 그러나 연부에 인접한 도메인(예를 들면, 효소-인코딩 부분) 내에서 절단과 결합이 일어나도록 하는 것이 바람직할수도 있다. DNA는 모든 모듈라 PKS들 사이에서 고도로 보존되고, 이는 전사될수 있는 하이브리드 들의 조합에 도움이 될수 있다. 이러한 구성은 중요할수 있는 인코드된 효소의 활성 사이트의 스페이스를 유지하는데 도움이 된다. 예를 들면, avr 로딩 모듈에 의하여 ery 로딩 모듈을 교체하므로서 하이브리드 유전자를 생산하는 경우에는 ery 모듈이 소량의 케토신다제(KS) 도메인과 함께 제거된다. 활성 사이트로부터 떨어져 있는 KS 도메인의 스타터는 고도로 보존되고 그에 따라 로딩 도메인과 KS 도메인의 스타더 사이에 있는 결합부위에 변형체로서 적당한 스프라이싱(splicing) 사이트를 제공한다. 제거된 ery 모듈은 avr 로딩 모듈에 의하여 교체된다.
실제적으로 로딩 모듈을 치환하였을 때 바로 로딩 모듈 도메인(일반적으로 아실트란스퍼라제(AT)와 아실 캐리어단백질(ACP))을 교체할 필요가 없을 뿐 아니라 뒤이은 확장 모듈의 스타트에 있는 KS도 교체할 필요가 없다. 전형적으로 제거된 로딩 모듈은 프로피오네이트 스타터를 갖고 있어서 교체는 하나 이상의 상이한 스타터를 구비하도록 한다. 그러나 프로피오네이트는 호스트 세포에 있는 프로피오네이트 풀로부터 확장 모듈의 KS속으로 공급되어 요구하는 제품을 희석시킨다. 이러한 작용에 의하여 KS 도메인의 모두 또는 대부분을 포함하는 확장된 로딩 모듈이 치환되지 않도록 할수 있다. (스프라이스 사이트는 KS 유전자의 말단 부분에 있을수도 있고 뒤이은 AT 유전자 또는 이들 사이의 결합부분에 있을 수도 있다.
″모듈 ″들을 교체할 때 모듈이 내츄랄 모듈에 국한되는 것은 아니다. 예를 들면, 제거, 교체 및/또는 교체되는 ″콤비나토리알 ″모듈은 두 내츄랄형 도메인으로부터 확장될수 있는데, 예를 들면 한 모듈의 AT로부터 다음 모듈의 AT로 또는 한 모듈의 KS로부터 다음 모듈의 KS로 확장될수도 있다. 스프라이스 사이트는 해당하는 보존된 마진 부분 또는 결합부위에 있게 된다. 또한 ″콤비나토리알 모듈 ″은 둘 또는 그 이상의 모듈이 동시에 첨가되어 2배 또는 그 이상의 배수로 될수 있다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같이 얻을수 있는 신규한 에리트로마이신에도 관계된다. 본 발명에 의한 에리트로마이신은 다음과 같은 것을 포함한다:
(i) C-13은 에틸 이외의 측쇄, 일반적으로 직쇠 C3-C6 알킬 그룹, 분지된C3-C8 알킬 그룹, C3-C8 사이크로알칼 또는 사이크로알케닐 그룹(예를 들면, 하나또는 그 이상의 하이드록시, C1-4알킬 또는 알콕시 그룹 또는 할로겐 원자로 치환된 것일수 있음), 또는 완전 포화되거나 부분적으로 포화되고 임의로 치환될수 있는(예를 들면, 사이크로알킬과 같이) O 나 S를 포함하는 3-6 멤버 헤테로사이클, 또는 R1Ol C1-C4알킬, C1-C4알콕시 및 C1-C4알킬티오 그룹중에서 서택된 최소한 하나의 치환기로 치환될수도 있는 페닐, 할로겐 원자, 트리플루오로메틸 및 시아노일수있고 또한 R1이 다음의 일반식 a 로 표시되는 그룹일수도 있다.
[일반식 a]
식중, X는 O, S 또는 -CH2- 이고, a, b, c 및 d는 각각 0-2의 정수로서 a+b+c+d≤5이다. C-13 치환기 R로서 바람직한 캔디데이트(candidate)는 avr 스타터 모듈 또는 래파마이신 스타터 변이체에 의하여 기질로 사용할수 있는 카복실레이트 유니트RCOOR 이다. 바람직한 기질은 카복실산 RCOOH이다. 유용하게 사용할수 있는 그 외의 기질로는 카복실산 염, 카복실산 에스텔 또는 아미드가 있다. 바람직한 에스텔은 듀톤 등의 EP0350187호에 기재된 바와 같이 avr 스타터 모듈에 의하여 쉽게 이용될수 있는 N-아세틸-시스티아민 티오에스텔이 있다. 바람직한 아미드로는 N-아실이미다졸이 있다. 그 외에도 카복실산의 산화성 전구물질로 사용되는 유도체가 있다. 적당한 기질로는 예를 들면 일반식 RCH(NH2)COOH 의 아미노산, 일반식 RCOCOOH 의 글리옥실산, 일반식 RCH2NH2의 메틸아민 유도체, 일반식 RCH2OH 의 메타놀 유도체, 일반식 RCHO 의 알데하이드 또는 일반식 R(CH2)nCOOH (식중, n은 2,4또는 6임)들이 있다. 바람직한 기질의 예로는 이소부티레이트(R=i-Pr) 및 2-메틸부티레이트(R=1-메틸프로필)이 있다. 기타의 사용 가능한 기질로는 n-부티레이트, 사이크로프로필 카복실레이트, 사이클로부틸 카복실레이트, 사이클로펜틸 카복실레이트, 사이클로헥실 카복실레이트, 사이클로헵타닐 카복실레이트, 사이클로헥세닐 카복실레이트, 사이클로헵테닐 카복실레이트, 및 사이클릭 카복실레이트의 링-메틸화 변이종과 이들의 유도체들이 있다.
에리트로마이신 아날로그는 PKS(6-디옥시에리트로놀리드)의 시작 제품 또는 하나 또는 그 이상의 정상적인 생합성 단계를 거친 후의 제품에 해당한다. 도 2b에 도시된 바와 같이 이러한 단계는 6-하이드록실레이션, 3-0-글리코실레이션, 5-0-글리코실레이션, 12-하이드록실레이션 및 특이성 슈가 메틸레이션을 포함한다,
따라서, 아날로그는 6-디옥시에리트로놀리드 B, 에리트로마이신 A 및 도 2에 도시된바와 같은 각종의 중간물질과 변이체에 해당하는 것들을 포함할수 있다.
(ii) 하나 또는 그 이상의 케티드 유니트의 산화상태에서 해당하는 내츄랄화합물과 다른 에리트로마이신 아날로그(도 2b)(예를 들면, 그룹 -CO-,-CH(0H)-, =CH- 및 --CH2-로부터 선택)
-CH(OH)-의 입체 이성체가 선택될수도 있다.
(iii) 내츄랄 메틸 측쇄가 없는 해당하는 내츄랄 화합물과 다른 에리트로마이신 아날로그.(이것은 변이체 AT의 사용에 의하여 얻어질수 있다.) 정상적인 확장모듈은 메틸화되지 아니한 케티드 유니트와 메틸화된 케티드 유니트를 제공하기 위하여 C2와 C3중의 하나를 사용한다. 메틸화된 유니트가 내츄랄 유니트인 경우에는 메틸화되지 아니한 유니트가 얻어지고(반대로 메틸화되지 아니한 내츄랄 유니트의 경우에는 메틸화된 유니트가 얻어진다.) 에틸 치환체를 얻기 위하여는 보다 큰, 예를 들면 C4유니트가 사용된다.
(iv) 내츄랄 메틸의 입체화학적 구조 및/또는 메틸 이외의 링 치환기에서 해당하는 내츄랄 화합물과 다른 에리트로마이신 아날로그.
(v) 전술한 (i) 내지 (iv)중 둘 이상의 태양을 갖는 에리트로마이신 아날로그.
(vi) 비-PKS 효소에 의하여 더 처리한, 예를 들면 하이드록실레이션, 에폭시에이션, 글리코실레이션 및 메틸레이션 처리공정 중 하나 이상의 처리공정을 더 거 친 전술한 것들의 유도체.
본 발명의 신규한 에리트로마이신을 제조하는 방법을 구체적으로 기재한다. 간단한 방법에서는 난내츄랄 스타터 유니트(카복실산 아날로그가 바람직하지만 이들에 제한되는 것은 아니다)를 에리트로마이신을 생산할수 있는 미형질전환 미생물에 도입한다. 바람직한 방법은 스타터 유니트를 에르트로마이신-생성 미생물의 발효 육즙(broth)속으로 도입하는 것이고, 더 바람직한 방법에서는 에리트로마이신을 생성할수 있는 형질전환된 미생물을 사용하는 것이다. 그러나 스타터 유니트 아날로그를 에리트로마이신-생성 미생물의 변환배지, 예를들면 분획되거나 분획되지 아니한 분쇄된 세포-배지속으로 도입할수도 있다. 이 방법은 에리트로마이신을 생성할수 있는 형질전환된 미생물에 특히 유리하게 적용된다. 다른 방법에서는 이종의 Type 1 PKS(″도나 PKS ″) 내에 있는 각개 모듈 또는 도메인을 인코딩하는 하나 또는그 이상의 DNA 절편이 에리트로마이신-생성 미생물의 DEBS 유전자 내에 있는 각개모듈 또는 도메인을 인코딩하는 DNA를 변환하기 위하여 사용하였다. ″도나 ″PKS로는 내츄랄 또는 난내츄랄 Type 1 PKS 로부터 유도된 로딩 모듈과 확장 모듈이 적당하지만, 이 목적에는 유전자 및 모듈라 조직의 최소한 일부가 유전자 염기성배열분석을 통하여 알려진 에리트로마이신, 래파마이신, 아버마이신, 테트로나신, 올리안도마이신, 모넨신, 암포테리신 및 리파마이신의 생합성에 이용되는 Type 1 PKS성분들이 더 적당하다. 가장 바람직한 도나 PKS의 로딩 모듈의 예로는 리락스 특이성을 보여주는 로딩 모듈, 예를 들면 스트렙토마이세스 아버미틸리스의 아버멕틴(avr)-생성 PKS의 로딩 모듈 또는 시키메이트-유도 스타터 유니트를 허용하는 래파마이신- , FK506- 및 아스코마이신-생성 PKS의 로딩 모듈로 사용하는 비정상적인 특이성을 갖는 로딩들이 있다. 기대 이상으로 형질전환되지 않은 유전학적으로 가공된 에리트로마이신-생성 미생물들은 적당한 조건하에서 배양되었을 때 난내츄랄 에리트로마이신을 생성함을 알게 되었고, 경우에 따라서 그 제품들은 내츄랄 에리트로마이신과 동일하게 처리됨을 알게 되었다.
본 발명의 다른 형태에서는, ″도나 ″ PKS DNA를 포함하는 플라스미드가 하이브리드 PKS를 만들기 위한 동상 재조합에 의하여 에리트로마이신-생성 균주의 염색체에 있는 DEBS 유전자속으로 융합되는 조건하에서 호스트 세포속으로 도입된다. 이러한 하이브리드 PKS는 다음에 설명하는 적당한 조건하에서 배양하면 유용한 신규의 에리트로마이신을 생성한다. 특히, DEBS 유전자의 로딩 모듈이 아버멕틴 생성(avr) PKS의 로딩 모듈에 의하여 치환된 경우에는, 신규한 에리트로마이신이 avr PKS에 의하여 사용된 형태의 스타터 유니트를 포함한다. 따라서, ery PKS의 로딩 모듈이 avr PKS 로딩 모듈에 의하여 치환된 경우에는 전술한 하이브리드 PKS를 포함하는 사카로폴리스포라 에리트라에아 균주가 전형적으로 avr PKS에 의하여 사용된 스타터 유니트를 포함하는 14-멤버 마크로리드를 생성함을 발견하였다.
S. 에스트라에아의 재조합 세포에 의하여 생성된 14-멤버 마크로리드가 에리트로마이신 A의 유도체를 포함하고 있다는 사실을 발견한 것은 기대하지 않았던 일로서, 이는 폴리케티드가 하이브리드 PKS 제품의 수차례의 형질전환에 필요한 처리단계를 거치면 신규하고 의학적으로 유용한 에리트로마이신 A 유도체가 얻어짐을 보여 주는 것이다. 더구나, 본 발명에 의하면 일부 하이브리드 에리트로마이신 유전자의 전사는 하이브리드 유전자가 조촉매인 특수 유전자 활성화제에 결합된Type II PKS용 조촉매의 제어하에 놓여 있을 때 특이하게 증가한다는 놀라운 사실이 발견되었다. 특히, 제어하에 놓여 있는 하이브리드 에리트로마이신을 포함하는 유전학적으로 처리된 세포들이 에리트로마이신 생산에 적당한 조건하에 놓여 있을 때 생산되는 신규한 에리트로마이신의 농도가 현저하게 증가하는 놀라운 사실을 알게 되었다. 이와 같은 유용한 에리트로마이신의 특이한 수율 증가는 Type II PKS 조촉매와 유전자 활성화제의 제어하에 놓여 있는 내츄랄 에리트로마이신 PKS에서 나타났다. 바람직한 예에서는, SCP2*-유도 플라스미드에 존재하는 요구하는 유전자가 스트렙토마이세스 코엘리칼라의 악티노르호딘 생합성 유잔자 클러스터로부터 유도된 2방향 actI 조촉매의 제어하에 놓이도록 하는 것이다. 이 경우 벡타는 특이성단백질 활성화제 ActII-orf4를 인코딩하는 구조 유전자를 포함한다. 재조합 플라스미드는 도입된 PKS 유전자 또는 호스트 균주에 이미 존재하는 유전자가 actI 유전자의 제어하에 나타나는 조건하에서 사카로폴리스포라 에리트라에아속으로 도입된다.
이러한 균주는 요구하는 에리트로마이신을 생산하는데, 유전자 활성화제는 조촉매로부터의 전사 효율을 향상시키기 위한 경우에만 특이성 조촉매를 필요로 한다. ActII-orf 패밀리의 활성화제가 이미 알려진 종류의 DNA-결합 단백질에 속하지 아니한다는 것은 놀라운 사실이다. 그러므로, 다른 추가의 단백질 또는 기타의 제어물질들도 악티노르호딘 또는 관련된 이소크로마네퀴논 안료를 생산하는데 알려지지 아니한 동질성 호스트에서 나타나도록 활성화시키는데 사용할수 있을 것으로 기대된다. 또한 재조합 균주는 동일한 PKS 유전자가 내츄랄 조촉매의 제어하에 놓여있을 때 보다 10배 이상의 에리트로마이신 제품을 생산할수 있으며 특이성 에리트로마이신 제품은 증식기로부터 정지기 사이에만 생산되지 않고 배양 배지 중에서도 계속하여 생산된다는 놀라운 사실을 알게 되었다. 이와 같이 얻어지는 에리트로마이신은 항생물질로 유용하게 사용될수 있음은 물론이고, 인간과 가축을 위한 각종의 다양한 용도로 사용될수 있다. 따라서, 유전학적으로 설계된 세포들이 사카로폴리스포라 에리트라에아인 경우, 활성화제와 조촉매는 악티노르호딘 PKS 유전자 클러스터로부터 유도되고 actI/ACT II-orf-규제 ery PKS 유전자 클러스터는 낮은 복사 번호의 플라스미드 벡타에 합체되어 염색체 내에 들어 간다. 따라서 이러한 세포들을 적당한 조건하에서 배양하면 동질성 제어하에 놓여 있지 않은 대조용 쥰주에 비하여 10배 이상의 14-멤버 마크로리드 제품을 생산할수 있게 된다. 이러한 유전학적으로 설계된 S. 에리트라에아에서는 동질성 제어하의 PKS 유전자들이 그 구조가 이미 설명된 하이브리드 Type I PKS 유전자인 경우, 전술한 제어하에 놓여있지 않은 동일한 하이브리드 Type I PKS 유전자들에 비하여 1O배 이상의 하이브리드 폴리케티드 제품을 생산할수 있다. 특히 하이브리드 Type I PKS 유전자들이 로딩 모듈을 avr 로딩 모듈로 치환한 ery PKS 유전자들인 경우에는 전술한 적당한 조건하에서 배양하였을 때 유전적으로 설계된 세포들에 의하여 신규 14-멤버 마크로리드의 생산량이 10배 이상 증가한 것으로 나타났다.
형질전환되지 아니한 유전적으로 설계된 에리트로마이신-생성 세포의 생장수 단과 신규한 에리트로마이신의 분리, 동정 및 용도에 대하여는 실시예에서 구체적으로 설명한다.
[발명의 개요]
본 발명은 다음의 일반식 1의 화합물과 약리학적으로 허용되는 이들의 염에관계된다.
[일반식 1]
상기 일반식에서, R1은 하나 또는 그 이상의 하이드록실 그룹으로 치환될수있는 알파-분지된 C3-C6알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시알킬 또는 알킬티오알킬 그룹; 알킬 그룹이 알파-분지된 C2-C5알킬 그룹인 C5-C8사이클로알킬알킬 그룹;하나이상의 메틸, 하하이드록실 또는 C1-C4알킬 그룹이나 할로겐 원자에 의하여 치환될수 있는 C3-C6사이클로알킬 또는 C5-C8사이클로알케닐 그룹; 또는 포화되거나 전부 또는 일부가 불포화될수 있고 하나 이상의 C1-C4알킬 그룹이나 할로겐 원자에 의하여 치환될수 있는 3-6 멤버 산소 또는 유황 함유 헤테로사이클릭 링일수도 있고, R1은 C1-C4알킬, C1-C4알콕시 및 C1-C4알킬티오 그룹, 할로겐 원자, 트리플루오로메틸, 및 시아노 그룹 중에서 선택된 최소한 하나의 치환기로 치환될 수 있는 페닐그룹일수 있으며; 또한 R1은 다음의 일반식 a를 갖는 그룹일 수 있다.
[일반식 a]
식 중, X는 O, S 또는 -CH2- 이고, a, b, c 및 d는 0-2의 정수로서 a+b+c+d≤5이다.
R2는 H 또는 OH 이고, R3-R5는 각각 H, CH3또는 CH2CH3이며, R6는 H 또는 OH이고, R7은 H, CH3또는 CH2CH3이며, R8은 H 또는 데소사민이고, R9은 H, CH3또는 CH2CH3이고, R10은 OH 또는 미카로스(R13이 H 임) 또는 크라디노스(R13이 CH3임), R11은 H 이며, R10=R11=O 일수 있고, R12는 H, CH3또는 CH2CH3를 나타낸다.
전술한 정의에서,3 또는 그 이상의 탄소원자를 포함하는 알킬 그룹은 직쇄일수도 있고 분지쇄일수도 있다. 할로 원자 또는 할로겐 원자는 불소, 염소, 브롬또는 요오드일수 있다. ″알파-분지된″ 이라는 의미는 C-13 위치에 있는 탄소가 두개의 다른 탄소원자에 결합된 제2 탄소원자이고, 알킬 체인의 나머지는 직쇄 또는 측쇄일수 있음을 의미한다.
일반식 1의 바람직한 화합물은 R3, R5, R7, R9및 R12가 CH3이고, R1이 하나 또는 그 이상의 하이드록실 그룹으로 치환될수 있는 이소프로필이나 세칸다리 부틸, 2-부텐-2-일, 2-펜텐-2-일 또는 4-메틸-2-펜텐-2-일 인 화합물이다. 또한 일반식 1에서 R3, R5, R7, R9및 R12가 CH3이고, R1이 하나 또는 하이드록실 그룹이나 하나 또는 그 이상의 C1-C4알킬 그룹으로 치환될수도 있는 C3-C6사이클로알킬이나 사이클로알케닐 그룹인 화합물도 바람직한 화합물이다. 바람직한 화합물에 있는 R1그룹으로는 하나 또는 그 이상의 하이드록실 그룹이나 하나 또는 그 이상의 C1-C4알킬 그룹이나 할로겐 원자로 치환될수도 있는 5 또는 6 멤버 산소 또는 유황함유 헤테로사이클릭 링, 3-티에닐 또는 3-푸릴 링이 있다. 그 외의 R1으로는 C3-C6알킬티오알킬 그룹, 특히 1-메틸티오에틸 그룹이 있다.
본 발명에 의한 화합물의 또 다른 예로는 일반식 2의 화합물과 약리학적으로허용되는 이들의 유도체가 있다.
[일반식 2]
상기 일반식에서, R1은 H; C1-C8알킬, C2-C8알케닐, C2-C8알키닐, 각개 알킬 또는 알콕시 그룹에 1-6개의 탄소원자를 포함하는 알콕시 알킬이나 알킬티오알킬(전술한 알킬, 알콕시, 알케닐 또는 알키닐 그룹들은 하나 또는 그 이상의 하이드록실 그룹이나 하나 또는 그 이상의 할로겐 원자로 치환될수 있음); 하나 이상의 메틸 또는 C1-C4알킬 그룹이나 할로겐 원자에 의하여 치환될수 있는 C3-C8사이클로알킬 또는 C5-C8사이클로알케닐 그룹;
포화되거나 전부 또는 일부가 불포화될수 있고 하나 이상의 C1-C4알킬 그룹이나 할로겐 원자에 의하여 치환될수 있는 3-6 멤버 산소 또는 유황 함유 헤테로사이클릭링; 또는 일반식 SR14로 표현되는 그룹(식 중, R14는 C1-C8알킬, C2-C8알케닐, C2-C8알키닐, C3-C8사이클로로알, C5-C8사이클로알케닐, 페닐 또는 치환기가 하나이상의 C1-C4알킬 그룹이나 C1-C4알콕시 그룹 또는 할로겐 원자인 치환된 페닐 또는 포화되거나 전부 또는 일부가 불포화될수 있고 하나 이상의 C1-C4알킬 그룹이나 할로겐 원자에 의하여 치환될수 있는 3-6 멤버 산소 또는 유황 함유 헤테로사이클릭 링일수 있다.
R2는 H 또는 OH 이고, R3-R5는 각각 H, CH3또는 CH2CH3이며, R6는 H 또는 OH이고, R7은 H, CH3또는 CH2CH3이며, R8은 H 또는 데소사민이고, R9은 H, CH3또는 CH2CH3이고, R10은 OH 똔 미카로스(R13이 H 임) 또는 크라디노스(R13이 CH3임), R11은 H 이며, R10=R11=O 일수 있고, R12는 H, CH3또는 CH2CH3를 나타낸다. 전술한 기의 정의는 R3-R5가 CH3이고, R7은 CH3이며, R9이 CH3인 경우 R1이 H 또는 C1알킬이 아니라는 전제하에 주어진 것이다.
전술한 정의에서, 3 또는 그 이상의 탄소원자를 포함하는 알킬 그룹은 직쇄또는 분지쇄이다. 할로는 할로겐 원자인 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 의미한다.
일반식 2의 바람직한 화합물은 R3, R5, R7, R9및 R12가 CH3이고, R1이 SR14(식 중, SR14는 메틸 또는 에틸 그룹임)인 화합물이다. 기타의 바람직한 일반식 2의 화합물로는 R1이 하나 또는 그 이상의 하이드록실 그룹으로 치환될수 있는 메틸, 이소프로필 또는 sec-부틸인 화합물이 있다. 또 다른 바람직한 화합물로는 R1이 하나 또는 그 이상의 하이드록실 그룹이나 하나 또는 그 이상의 할로원자로 치환될수도 있는 분지된 C3-C8알킬 그룹, 특히 1-(트리플루오로메틸)에틸 인 화합물이 있다.
본 발명은 또한 치료에 유효한 량의 일반식 1의 화합물 또는 그 들의 약리학적으로 허용되는 염을 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 포유동물, 어류 및 조류의 세균 감염 또는 원충감염을 치료하는 의약 조성물에도 관계된다.
본 발명은 또한 일반식 1 또는 일반식 2의 화합물 또는 약학적으로 허용되는그 들의 염을 치료에 유효한 량으로 포유동물, 어류 또는 조류에 투여하여 세균 감염과 원충 감염을 치료하는 방법에도 관계된다.
본 발명에서, ″치료 ″ 또는 ″처치 ″라는 용어는 세균 감염과 원충 감염을 예방하는 것과 감염에 의한 질병을 치료하는 것을 포함한다.
본 발명에서, ″세균 감염 ″ 및 ″원충 감염 ″이라는 용어는 포유동물, 어류 및 조류에서 나타나는 세균 감염과 원충 감염을 포함할 뿐만 아니라, 본 발명의 화합물과 같은 항생물질의 투여에 의하여 치료 또는 예방될수 있는 세균 감염과 원충감염에 관련되는 질병도 포함된다. 전술한 세균 감염과 원충 감염 및 이러한 감염에 관련되는 질병들은 다음과 같은 것 들이 있다: 스트렙토코커스 뉴모니애, 해모필러스 인플루엔자, 모락셀라 카타하리스, 스티필로코커스 아우리우스 또는 펩토스트렙토코커스에 의한 감염과 관계되는 폐렴, 중이염, 정맥동염, 기관지염, 편도염 및 유양돌기염; 스렙토코커스 파이오게네스, 그룹 C 및 G 스트렙토코찌, 클로스트리디움 디프테리애 또는 악티노바실루스 헤몰리티쿰에 의한 감염과 관계되는 인두염, 류머티스열 및 사구체신염; 미코플라스마 뉴모니애, 레지오넬라 뉴모필라, 스트렙토코커스 뉴모니에, 헤모필루스 인플루엔자, 또는 크라모디아 뉴모니에에 의한 감염에 관계되는 기도감염; 스타필로코커스 아우리우스, 응고효소-양성 포도상 구균(예를 들면, S. 에피데르미디스, S. 헤모리티쿠스 등), 스트렙토코커스 파이오게네스, 스트렙토코커스 아갈랍티에, 스트렙토코커스 그룹 C-F(미세콜로니 연쇄상 구균), 비리단스 스트렙토코찌, 코리네박테리움 미누티시뭄, 크로스티디움 또는 바르토넬라 헨셀레에 의한 감염에 관계되는 단순겅 피부 및 연조직 감염; 농양과 골수염 및 산욕열; 스타필로코커스 사프로필리쿠스 또는 엔터코커스에 의한 감염에 관계되는 단순성 급성 요도감염; 요도염과 자궁경관염; 클라미디아 트랙코마티스, 헤몬필루스 듀크레이, 트레포네마 팔리둠, 유리아플라스마 유리아리티쿰 또는 네이세리아 고노루히에에 의한 감염에 관계되는 성적으로 전염되는 질병; S. 아우레우스(식중독 및 독성 쇼크 증후군) 또는 그룹 A, B 및 C 연쇄상구균에 의한 감염에 관계되는 독소성 질병; 헬리코박터 파이로리에 의한 감염에 관계되는 궤양; 보렐리아 게쿠렌티스에 의한 감염에 관계되는 전신계 열성 증후군; 보렐리아 부르그도르페리에 의한 감염과 관계되는 라임 질병; 클라미디아 트래코마티스, 네이세리아 고노르 호이에, S. 아우리우스, S. 뉴모니에, S. 파이오게네스, H. 인푸르엔자 또는 리스테리아에 의한 감염에 관계되는 결막염, 각막염 및 누낭염; 마이코박테리움 아비움 또는 마이코박테리움 인트라셀루라레에 의한 감염에 관계되는 전염성 미코박테리움 아비움 콤프렉스(MAC); 캄피로박터 제주니에 의한 감염에 관계되는 위장염; 크립토스포리디움 spp.에 의한 감염에 관계되는 장원충; 비리단스 스트렙토코찌에 의한 감염에 관계되는 치골감염; 보르데텔리아 페르투시스에 의한 감염에 관계되는 해수; 크로스트리디움 페르프리겐스 또는 박테로이드스 spp. 에 의한 감염에 관계되는 가스 궤저; 및 헬리코박터 파이로리 또는 클라미디아 뉴모니에에 의한 감염에 관계되는 아데롬성 동맥경화증. 동물에 나타나는 치료 또는 예방할 수 있는 세균감염이나 원충 감염 또는 질병으로는 다음과 같은 것들이 있다: P. 하임, P. 멀토시다, 미코플라스마 보비스 또는 보르데텔라 spp. 에 의한 감염에 관계되는 소 호흡기 질환; E. 콜리 또는 원충(예를 들면, 코찌디아, 크리토스포리디아 등)에 의한 감염에 관계되는 소의 장 질병; stavm. 아우리우스, 스트렙토코커스 우베리스, 스트렙토코커스 아갈락티에, 스트렙토코커스 다이스갈락티에, 크레브시엘라 spp. 코리네박테리움 또는 엔테로코커스 spp. 에 의한 감염에 관계되는 젖소 유선염; A. 프리우로, P. 멀토시다 또는 미코플라스마 spp. 에 의한 감염에 관계되는 돼지의 장질병; E. 콜리, 라우소니아 인트라셀루라리스, 살모넬라 또는 세르풀리나 하이도디스인테리에에 의한 감염에 관계되는 돼지 호흡기 질병; 푸서박테리움 spp. 에 의한 감염에 관계되는 소 발질병; E. 콜리에 의한 감염에 관계되는 소 자궁근층염; 푸소박테리움 네크로포럼 또는 박테로이데스 노도수스에 의한 감염에 관계되는 소의 모상 우성질병; 모락셀라 보비스에 의한 감염에 관계되는 소 급성 카다르성 결막염; 원충(예를 들면 네오스포리움)에 의한 감염에 관계되는 소 조산증; E. 콜리에 의한 감염에 관계되는 개와 고양이의 요도 감염; Staph. 인터메디우스, Staph. 이피데르미디스, 코아귤라제 네그. Staph 또는 P. 멀토시다에 의한 감염에 관계되는 개와 고양이의 피부 및 연조직 감염; 및 아칼리게네스 spp., 박테로이데스 spp., 크로스 트리디움 spp., 엔테로박터 spp., 유박테리움, 펩토스트렙토코커스, 포르피로모나스 또는 프레보텔라에 의한 감염에 관계되는 개와 고양이의 구강 감염. 본 발명에 의하여 치료 또는 예방할수 있는 기타의 세균 감염과 원충 감염 및 질병으로는 제이. 피. 스탠포오드 등, ″The Sanford Guide To Antimicrobial Therapy, 26판 (안티마이크로비알 세라피, 인코포레이티드,1996)에 기재된 것들이 있다. 또한 본 발명의 화합물들은 정상적인 세균 또는 원충 감염과 관계가 없는 질병 상태(예를 들면, 암, 에이즈 및 아데롬성 동맥경화증)의 처치에도 괄목할 만한 용도를 갖고 있음이 명백하다.
사람과 같은 포유동물, 어류 및 조류의 세균성 감염에 의한 질병을 처치하는데 사용할 때는 일반식(1) 또는 일반식(2)의 화합물을 단독으로 투여할 수도 있고전술한 본 발명의 화합물과 약리학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제를 포함하는약품 조성물 형태로 투여될 수도 있다. 전술한 조성물은 정제, 캡슐제 형태로 경구투여할 수도 있고 혈관 주사나 근육 주사로 투여할 수도 있다. 일반식(1) 또는 일반식(2)의 화합물들은 좌약형태로 직장에 투여할수도 있다. 약리학적으로 허용되는 부형제는 투여형태에 따라 결정된다. 예를 들면, 정제에 사용할수 있는 부형제로는 락토스, 구연산염 및 인산염과 전분 같은 결합제 및 스테아린산 마그네슘, 소듐 라우렐 설페이트, 활석 등의 윤활제가 있다. 캡슐에 사용할수 있는 부형제로는 락토스 및 고분자량(예를 들면, 2000 내지 4000) 폴리에틸렌글리콜이 있다. 주사액, 멸균액 또는 현탁액에 사용할 수 있는 부형제로는 수성 물질(예를 들면, 물, 침투성 식염수 또는 덱스트로스 등) 또는 비-수성 물질(예를 들면, 면실유나 땅콩기름과 같은 식물성 오일 및 글리세롤이나 프로필렌글리콜 같은 폴리올들이 있다·
포유동물에 있어서의 세균 감염 또는 세균감염에 관련되는 질병을 치료하거나 인간의 각종 암(특히, 폐암)을 치료하기 위하여 생체내에 사용할 경우에는, 1일 투약량이 1회에 투여하거나 분할하여 투여하는 것에 관계없이 체중을 기준으로 0.1-100mg/kg, 특히 0.5-25mg/kg일수 있다.
본 명세서 사용한 ″약리학적으로 허용되는 염″이라는 용어는 본 발명의 화합물에 존재할수 있는 산성 또는 염기성 그룹의 염을 포함한다. 염기성을 갖는 본 발명의 화합물은 각 종의 유기 또는 무기산에 의하여 각종의 염을 형성할 수 있다. 염기성 화합물과 함께 약리학적으로 허용될수 있는 산 염을 형성할수 있는 산으로는 비-독성 산 부가염, 예를 들면 하이드로콜로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로아이오다이드, 나이트레이트, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 애시드 포스페이트, 이소니코티네이트, 아세테이트, 락테이트, 살리실레이트, 시트레이트, 애시드 시트레이트, 타트레이트, 판토데네이트, 바이타트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말리에이트, 겐티시네이트, 후마레이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 파모에이트[예를 들면, 1.1′-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3-나프토에이트)] 염과 같이 약리학적으로 허용되는 음이온을 포함하는 염들이 있다.
산성을 갖는 본 발명의 화합물들은 약리학적으로 허용되는 양이온에 의하여염기성 염을 형성할수 있다. 이러한 염들의 예로는 알카리 금속 또는 알카리토류 금속의 염들이 있는데, 바람직한 염은 본 발명에 의한 화합물의 칼슘, 마그네슘, 소듐 및 포타슘 염이다.
일부의 본 발명에 의한 화합물들은 비대칭성 중심을 갖고 있어서 상이한 경상이성체 및 디아스토머 형태로 존재할 수도 있다. 본 발명은 본 발명에 의한 화합물의 광학 이성체와 구조 이성체 및 이들의 혼합물의 용도와 이들을 포함하는 의약 조성물 및 그 처치방법에도 관계된다.
본 발명은 하나 또는 그 이상의 수소, 탄소 또는 다른 원자가 동위원소에 의하여 치환된 본 발명의 화합물들과 약리학적으로 허용되는 이들의 염에도 관계된다. 이러한 화합물들은 신진대사 약리운동학적 연구와 결합검사에서 조사와 진단에 유용하게 이용된다.
본 발명의 화합물들은 S. 코엘리칼라를 제외한 에리트로마이신을 생성할수 있는 비형질전환 또는 형질전환된 미생물, 특히 사카로폴리스포라종, 스트렙토마이세스 그리세오플라너스. 노카르디아 sp., 미크로모노스포라 Sp., 아르도박터 sp. 및 스트렙토마이세스 안티비오티쿠스(이들에 한정되는 것은 아니다)의 발효에 의하여 제조된다. 이 분야에 특히 적당한 것은 사카로폴리스포라 에리트라에아, 예를 들면 NRRL2338, 18643, 21484의 비형질전환 또는 형질전환된 균주이다. 특히 적당한 형질전환된 균주는 에리트로마이신 로딩 모듈이 아버멕틴 생산 스트렙토마이세스 아버미티리스 또는 래파마이신 생산 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스로부터 유래된 로딩 모듈로 치환된 것이다. 본 발명의 화합물을 생산하는 바람직한 방법은 일반식 R1COOH(식 중, R1은 일반식 1 및 2에서와 동일한 의미를 갖는다)의 카복실산 또는 이들의 염, 에스텔(특히 바람직 한 것은 N-아세틸시스테아민 티오에스텔이다), 아미드 또는 산화성 전구물질의 존재하에 적당한 미생물의 발효에 의하여 이루어 진다. 전술한 산 또는 유도체들은 접종시 또는 발효 중에 발효 시스템에 첨가될 수 있다. 본 발명에 의한 화합물의 생성은 발효 시스템으로부터 시료를 채취하여 유기용매로 추출하여 크로마토그래피, 예를들면 고압 액체 크로마토그래피로 본 발명에 의한 화합물의 발현을 검사하여 모니터링한다. 접종은 일반식(1) 또는 일반식(2)의 화합물의 수율이 최대로될 때까지 계속되는데, 그 기간은 보통 4일내지 10일이다. 카복실산 또는 그들의 첨가 농도는 0.05와 4.0 g/L사이가 바람직하다. 일반식(1),(2)의 화합물들이 최대 수율은, 예를 들면 산 또는 그 유도체를 수일 동안에 걸쳐 매일 발효 시스템에 첨가하는 경우에 얻어 질 수 있다. 발효에 사용되는 배양액은 탄소, 질소 및 극미량 원소의 동화작용성 공급원을 포함하는 통상의 복합 배지이다.
비형질전환되고 유전학적으로 처리된 에리트로마이신-생성 세포를 생육하는 바람직한 수단 및 일반식 (1),(2)의 화합물을 분리 및 동정하는 수단과 실질적인 용도를 실시예에서 구체적으로 설명한다.
상기의 식별자가 없습니다.
본 발명의 한 형태를도 도면에 의하여 설명한다.
도 1은 3개의 공지된 폴리케티드 화학식을 보여주는 도면,
도 2a는 6-디옥시에리트로놀리드 신다제 B(DEBS), PKS 생성 6-디옥시에리트로놀리드 B(6-DEB), 에리트로마이신 A의 전구물질을 보여주는 도표,
도 2b는 에리트로마이신 A로의 6-DEB의 전위를 포함하는 에리트로마이신의 포스트-PKS 생합성을 보여주는 도면,
도 3a 및 3b는 플라스미드 plG1의 구조를 보여주는 도표,
도 4a,4b 및 4c는 플라스미드 pND30의 구조를 보여주는 도표,
도 5는 pAVLD의 구조를 보여주는 도표,
도 6은 S. 에리트라에아 NRRL2338의 게놈으로의 pAVLD의 삽입을 보여주는 도면,
도 7은 래파마이신의 생합성을 보여주는 도면,
도 8은 플라스미드 pM06의 구조를 보여주는 도면,
도 9는 플라시미드 pCJR26의 구조를 보여주는 도면,
도 1O은 pC-ATX의 구조를 보여주는 도면,
도 11은 pC-AT12의 구조를 보여주는 도면,
도 12는 pCJR49의 구조를 보여주는 도면이다.
avr 로딩 모듈에 의하여 수용된 광범위한 스타터 유니트들이 종전의 연구(예를 들면 유럽특허출원 0214 731, 0350 187 및 0317 148호)에서 자세하게 설명되어 있다. 전술한 예들은 본 발명을 한정시키기 위하여 인용한 것이 아니고 avr 로딩 모듈의 효과를 확인하기 위하여 인용한 것이다. 더구나, plG1 또는 pND30 구조를 사용한 예는 avr 로딩 모듈에 결합되었을 때 본 발명에 의한 신규 화합물의 표현을 향상시키는 actl 조촉매 및 그와 동류의 활성화 유전자 actlorf4의 능력을 분명하게 나타내고 있다. 전술한 예에 따르면, 사카로폴리스포라 에리트라에아의 비전환균주는 신규한 에리트로마이신 폴리케티드를 생성하기 위하여 비유전적으로 공급된 기질을 쉽게 받아들일수 있다는 것이 분명하다. 당해 업계에 숙련된 기술자들은 본 발명의 특정한 신규 화합물들이 적당한 에리트로마이신 생산 균주(경우에 따라 요구하는 균주에 plG1 또는 pND30을 결합시킨 것일 수 있음)를 선발하고 적당한 스타터 유니트와 발효시키므로서 쉽게 생산될수 있음을 알수 있을 것이다. 본 발명의 6-디옥시에리트로마이신 및 6,12-디옥시에리트로마이신 유도체는 미국특허 5,141,926호 및 W0 97/06266호에 기재된 바와 같은 사카로폴리스포라 에리트라에아 NRRL 18643 또는 NRRL 21484를 사용하여 쉽게 생산할 수 있다. 유사하게 웨버 등, j. 박테리올., 164:425-433에 기재된 사카로폴리스포라 에리트라아에아 균주를 사용하면 본 발명의 화합물에 유사한 물질을 쉽게 얻을 수 있다. 예를 들면, 균주 UW24 또는 경우에 따라 plG1 또는 pND30에 의하여 형질전환된 것들은 에리트로노리드 B의 신규한 유사체를 얻는데 사용할수 있다.
자외선 스펙트라는 휴렛-팩카드 1090M 다이오드-검사 스펙트로포토메타를 사 용하여 측정한다. 모든 NMR 스펙트라는 배리안 유니티 50OMHz 스펙트로메타에 의하여 CDCI3에서 측정하고 피크 위치는 테트라메틸실란으로부터 나오는 ppm으로 표시한다. 피크 형상은 다음과 같이 나타낸다: s, 단선; d, 2중선; t, 3중선; q, 4중선; m, 다중선; br, 광역. NMR 구조에 나타난 원자수는 표준 명명법을 대표하는 것은 아니지만 특정한 예에서는 NMR 데이타에 관계된다. HPLC-MS 데이터는 APCI 공급원이 장비된 부이지 프래트폼 II 질량 스펙트로메타에 결합된 휴렛-팩카드 1090M 액체 크로다토그래프(방법 A) 또는 APCI 공급원이 장비된 부이지 프래트폼 II 질량 스펙트로메타에 결합된 휴렛-팩카드 1050 액체 크로마토그래프(방법 B 및 C)를 이용하여 얻었다.
HPLC 방법 A
칼럼 벡크만 울트라스페어 5㎛ ODS 4mm×25cm
유속 0.85mL/min.
이동상 성분: 22분 동안에 걸쳐 아세트니트릴:0.05M 초산암모늄(18:72)을 아세트니트릴:0.05M 초산암모늄(50:50)으로 되게 하고 아세트니트릴:0.05M 초산암모늄(50:50)을 22-25분 동안 유지한 후 최초 조건으로 환원시켜 25-30분간 유지.
HPLC 방법 B
칼럼 메타켐 인서트실 5㎛ C8 3㎜×150㎜.
유속 0.5mL/min.
이동상 이소크라틱: 0.1% 트리플루오로아세틱산을 포함하는
메타놀:0.05M 초산암모늄(60:40).
HPLC 방법 C
칼럼 와터스 심메트리 5㎛ C18 2.1㎜×150㎜.
유속 0.22mL/min.
이동상 성분: 30분 동안에 걸쳐 아세트니트릴:0.05M 초산암모늄(30:70)을 아세트니트릴:0.05M 초산암모늄(50:50)으로 변경
다음의 배지와 배양액을 사용하였다.
슈크로스-석시네이트 특정 배지
슈크로스 69g
KNO310g
석신산 2.36g
KH2PO42.7g
MgSO4.7H2O 1.2g
ZnCl210mg
MnCl2.4H2O 6.2g
CuCl2.2H2O 0.53mg
CoCl20.55mg
FeSO4.7H2O 2.5mg
CaCl2.2H2O 38mg
밀리-Q 물 1.0 L까지
KOH pH 6-6.4까지
수돗물 배지
글루코스 5g
트립톤 5g
효모 추출물 2.5g
EDTA 36mg
수돗물 1.0 L 까지
KOH pH 7.1 까지
ERY-P 배지
덱스트로스 50 g/L
누트리소이 분말 30 g/L
(NH4)2SO43 g/L
NaCl 5 g/L
CaCO36 g/L
pH 7.0으로 조정
누트리소이는 영국, 맨체스터 스커톤 로드 소재 브리티시 아카디 그룹의 상표임.
실시예 1a
플라스미드 plG1의 조합
ery PKS의 첫째 두 확장 모듈과 ery PKS의 티오에스트라제인 ery 로딩 모듈의 위치에 avr 로딩 모듈을 포함하는 하이브리드 Type I PKS 유전자가 함유된 SCP2 *-유도 플라스미드로 조성된다(도3 참조).
(i) 플라스미드 pVE3.4의 조합
아버멕틴(avr) PKS 유전자의 일부를 함유하는 플라스미드 pVE1446은 E. 콜리 균주 ATCC 68250(맥네일, e. 제이. 등, Ann. N. Y. Acad. Sci.(1994) 721:123-132)로부터 얻었다. 플라스미드 pVE1446은 BamHI로 다이제스트(digest)하고, 코오디네이트 32.15와 3.40 사이의 7.6 kbp(맥네일, 디. 제이. 등, Ann. N. Y. Acad. Sci.(1994) 721:123-132)는 겔 전기영동과 정제하고 재순환시켰다. 혼합물은 E. 콜리균주 TG1recO(캠브리지 대학의 피. 올리버 박사, 콜로드너, 알. 등, J. Bacteriol.(1985) 163: 1060-1066 및 캠브리지대학의 티. 깁슨에 의하여 조합됨)의 형질전환후 분리된 요구하는 플라스미드 pVE3.4를 함유하고 있다.
(ii) 플라스미드 pNCO12의 조합
플라스미드 pBK25(베비트, 디. 제이. 등, Eur. J. Biochem.(1992)204: 39-49)는 Ncol로 다이제스트하고 12kbp 절편은 내부수복되어 Smal로 선형화된 플라스미드pUC18 속으로 결합된다. 결합 혼합물은 E. 콜리 TG1 rec0으로 형질전환되고 각개 콜로니에 대하여 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pNC0 12는 제한 패턴에 의하여 동정하였다.
(iii) 플라스미드 pCRabc의 조합
플라스미드 pCRabc(도 3)는 다음과 같이 조합 한다. 별도의 세가지 반응을 유도한다: 첫째, 각각 20pmol의 합성 올리고뉴클레오티드 A1 (5′-CTC GTC GGT GGC TTTGOG-3′) 및 A2 (5′-CCC GGG AAA AAC GAA GAC TAG TGG CGC GGA CGG CCG-3′)를 100ng pNCO12 주형으로부터 1.0kbp를 증복시키는데 사용하였다. PCR 제품은 내부수복하고 포스포릴화한 다음 플라스미드 pCRa를 얻기 위하여 Smal-절단 pUC18속으로 결합시킨다. 둘째, 각각 20pmol의 합성 올리고뉴클레오티드 C1 (5′-CAC GCG CAG CGC GGC GGA-3′) 및 C2 (5′-CGA ACC GCT AGC GGT CGT CGC CAT GGC CT-3′)를 100ngpNC012 주형으로부터 1.5 kbp를 증폭시키기 위하여 사용하였다. 제품은 내부수복하고 포스포릴화한 다음 플라스미드 pCRc를 얻기 위하여 Smal-절단 pUC18속으로 결합시킨다. 셋째, 각각 20pmol의 합성 올리고뉴클레오티드 B1 (5′-GTG GCC CGG CCG TCC GCG CCA CTA GTC TTC GTT TTT-3′) 및 B2 (5′-AAC AGC TAG CGG TTC GTC CGC CGC TGC CGT GCC-3′)를 100ng pVE3.4 주형으로부터 1.4 kbp를 증폭시키기 위하여 사용하였다. 제품은 내부수복하고 포스포릴화한 다음 플라스미드 pCRb를 얻기 위하여 Smal-절단 pUC18속으로 결합시킨다.
플라스미드 pCRa를 HindIII과 Spel로 다이제스트하고 1.O kbp 인서어트를 미리 HindIII로 다이제스트한 플라스미드 pCRb에 삽입하여 플라스미드 pCRab를 얻는다. 플라스미드 pCRc를 Nhel과 EcoR1으로 다이제스트하고 1.5kbp 인서트를 미리Nhel과 EcoR1으로 다이제스트한 플라스미드 pCRab에 결합시켜 플라스미드 pCRabc를얻는다.
(iv) 플라스미드 pNEWAVETE의 조합
플라스미드 pCRabc를 Mfel 및 Sfil로 다이제스트하고 avr PKS의 로딩 도메인을 함유하는 DNA 단편을 겔 전기영동에 의하여 정제한 다음 Mfel 및 Sfil로 다이제스트한 플라스미드 pNTEP2과 결합시키고 거대 단편을 전기영동에 의하여 정제하였다. 생성된 혼합물을 E. 콜리로 형질전환시킨 다음, 각개 콜로니에 대한 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pNEWAVETE(13.7kbp)가 그들의 제한 패턴에 의하여 동정되었다.
(v) 플라스미드 pRM52의 조합
플라스미드 pRM52는 플라스미드 pRM55의 유도체이다(맥다니엘, 알. 등, Science, (1993) 262: 1546-1550). pRM5는 Ndel로 다이제스트하여 선형화하고 내부 수복한 다음, 재결합시켜 pRM51를 생성한다. pRM51은 Pacl 및 Nsil로 절단하고, 거대 Pacl-Nsil 절편을 분리하여 Ndel을 포함하고 함께 아닐링된 합성 뉴클레오티드 5′-TAA GGA GGA CAC ATA TGC A-3′및 5′-TAA TTC CTC CTG TGT AT-3′로부터 조합된 짧은 2본쇄 올리고뉴클레오티드 링커에 결합시킨다. 결합 혼합물을 E. coli TG1recO로 형질전환시키고 분리된 콜로니를 스크린하여 그들의 플라스미드 함량을 검사한다. 요구하는 플라스미드(19.6kbp)는 제한지도에 의하여 동정하고 pRM52로 명명하였다.
(vi) 플라스미드 p1G1의 조합
플라스미드 pNEWVETE를 Ndel 및 Xbal로 다이제스트하고 인서트를 슈크로스 경사판에서의 침강에 의하여 정제하였다. 정제된 인서트는 Ndel 및 Xbal로 다이제스트한 프라스미드 pRM52(19.6kbp)에 삽입하고 벡타는 슈크로스 경사판에서 침강에 의하여 정제하였다. 결합 혼합물은 E. 콜리로 형질전환시키고 각개 콜로니에 대한 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드는 p1G1은 제한 패턴에 의하여 동정하였다.
실시예 1B
플라스미드 pND30의 조합
플라스미드 pND30은 ery PKS의 제 1화장 모듈과 ery PKS의 티오에스테라제로 된 ery 로딩 모듈 대신 avr 모듈을 포함하는 하이브리드 Type I PKS가 함유된 SCP2*유도 플라스미드로 조성되었다. 이것은 다음과 같은 다수의 중간 플라스미드를 통하여 조합 되었다(도 4).
(i) 재조합 벡타 pCJR101의 조합
pCJR101(도 4)는 방선균류에 있는 PKS 유전자의 표현에 사용되도록 조합 된 왕복 플라스미드이다. 이 플라스미드는 E. 콜리에 복제하기 위한 ColE1 레프리콘, SCP2*저카피수 스트렙토마이세스 레프리콘(빕, 엠. 제이. 및 홉우드, 디. 에이., J. Gen. Microbiol. (1981) 126:427) 및 증식성 균사체에서 성장기로부터 정지기로의 전이 중 act 조촉매로부터의 전사를 활성화하는 act 클러스터로부터 유래된 actII-orf4 활성화제 유전자를 포함한다. 이 플라스미드는 다음과 같이 조합된다:(actII-orf4 활성화제 유전자를 함유하는) pMF1015로부터 유래된 약 970 bp DNA 절편(페르난데즈-모레노, 엠. 에이. 등, Cell, (1991) 66: 769-780)을 합성 올리고 뉴크레오티드: 5′-ACT AGT CCA CTG CCT CTC GGT AAA ATC CAG C-3′ 및 5′-CTT AAG AGG GGC TCC ACC GCG TTC ACG GAC-3′를 프라이머로 사용하고 프랭킹 Spel과 AfIII제한 사이트를 도입하는 PCR에 의하여 증폭된다. 이 절편은 플라스미드 pUC19의 내부 수복된 AatII 사이트에 결합되어 플라스미드 pCJR18이 얻어진다. 대략 215bp DNA 절편은 프라이머로서 올리고뉴크레오티드: 5′-ACA TTC TCT ACG CCT AAG TGT TCC CCT CCC TGC CTC-3′또는 5′-GTG ATG TAT GCT CAT ATG TGT CCT CCT TAA TTA ATC GAT GCG TTC GTC CGG TG-3′를 사용하고 프랭킹 Ndel과 AfIII 사이트를 도입하는 양방향성 조촉매 쌍 PactIII/PactI을 함유하는 pMV400으로부터 증폭된다. PCR제품은 Ndel과 AfIII로 다이제스트되고 미리 Ndel과 AfIII로 절단된 플라스미드 pCJR18과 결합되어 pCJR19를 생성한다. 티오스트렙톤에 대한 저항성을 부여하는 tsr 유전자를 포함하는 1.1kbp HindIII Sphl 절편은 프라이머로서 올리고뉴크레오티드: 5′-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC CCC-3′ 및 5′-GAC AGA TTG CAT GCC CTT CGA GGA GTG CCC GCC CGG-3′를 사용하고 프랭킹 HindIII와 Sphl 사이트를 도입하는 주형인 플라스미드 plJ922(라이디아트, 디. 제이. 등, Gene, (1985) 35:223-235)로부터 PCR에 의하여 얻어진다. PCR 제품은 HindIII 및 sphl로 다이제스트되고 HindIII 및 Sphl로 절단한 플라스미드 pCJR19d하 결합하여 플라스미드 pCJR24가 얻어진다. 플라스미드 plJ922는 BamHl 및 Sstl으로 다이제스트되고 퍼실리티 로커스의 일부를 포함하는 절편과 복제의 원형(라이디에이트, 디. 제이. 등, Gene, (1985) 35:223-235)은 BamHl과 Sstl으로 다이제스트된 pUC19에 리게이트되어 2중 기능 플라스미드 pCJR16(14.7kbp)를 생성한다. 플라스미드 pCJR24는 Sall 및 Sphl로 다이제스트되고 다이제스트에 의하여 생성된 두 개의 거대 절편은 겔 전기영동에 의하여 정제되고, Xhol와 Sphl으로 다이제스트된 플라스미드 pCJR16과 4-성분 리게이션으로 결합된다. 리게이션 혼합물은 스트렙토마이세스 리비단스를 형질전환하는데 사용되고, 콜로니들은 티오스트렙톤의 존재하에 선택된다. 이러한 콜로니 중의 하나는 요구하는 플라스미드 pCJR101(대략 12.4kbp)를 포함하고 있음이 n제한 패턴에 의하여 동정되었다.
(ii) 플라스미드 pCJR29의 조합
플라스미드 pCJR29의 cnnstruction은 도 4에 설명되었다. 티오스트렙톤에 대한 저항성을 부여하는 tsr 유전자를 포함하는 1.1 kbp HindIII-Xhol 절편은 올리고뉴클레오티드 5′-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC CCC-3′ 및 5′-GAC AGA TTC TCG AGC CTT CGA GGA GTG CCC GCC CGG-3′를 프라이머로 사용하고 프랭킹 HindIII 및 Xhol 사이트를 도입하는 주형인 플라스미드 plJ922로부터 PCR에 의하여 얻어진다. PCR 제품은 HindIII과 Xhol로 다이제스트되고 HindIII과 Xhol로 다이제스트되어 있는 플라스미드 pCJR16과 리게이트되어 플라스미드 pCJR25를 생성한다. 플라스미드 pCJR25는 HindIII과 Sphl로 다이제스트되고 HindIII과 Sphl로 이미 다이제스트되어 있는 플라스미드 pCJR19과 리게이트되어 플라스미드 pCJCR29(약 12.4kbp)를 생성한다. 플라스미드 pCJR29는 제한 패턴에 의하여 확인되었다. 플라스미드 pCJR29는 SCP2*-유도된 복제 유전자에 관련하여 tsr 유전자, actII-orf4 유전자 및 actI/actIII 조촉매의 pCJR101과 다르다.
(iii) 플라스미드 pND30의 조합
플라스미드 pNEWAVETE는 Ndel과 Xbal으로 다이제스트하고 인서트는 슈크로스 경사판에서 침강에 의하여 정제하였다. 정제된 인서트를 미리 Ndel과 Xbal으로 다이제스트되어 있는 플라스미드 pCJR29(대략 12.4 kbp)속에 리게이트하고 벡타는 슈크로스 경사판에서 침강에 의하여 정제하였다. 리게이션 혼합물을 E.콜리를 형질전환 하는데 사용하고, 각개 콜로니에 대하여 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pND30은 그 제한 패턴에 의하여 동정하였다.
실시예 1c
플라스미드 pCJR26의 조합
플라스미드 pMO6(도 8)은 수 단계에서 조합되었다.
(i) 플라스미드 pMO1의 조합
뉴클레오티드 1948로부터 eryAl(도나디오, dpt.등, Science(1991) 252, 675-679)의 뉴클레오티드 3273으로 확장한 S. 에리트라에아의 eryAl의 대략 1.3kbp DNA 세그먼트를 프라이머로서 합성 올리고뉴클레오티드 5′-CAT GCT CGA GCT CTC CTG GGA AGT-3′ 및 5′-CAA CCC TGG CCA GGG AAG ACG AAG ACG G-3′를 사용하고 주형으로서 플라스미드 pNTEP2를 사용하는 PCR에 의하여 증폭되었다. PCR 제품은 내부수복하고 Smal과의 다이제스트에 의하여 선형화된 플라스미드 pUC18과 리게이트하여 염기성 포스파타제로 처리하였다. 리게이션 혼합물은 E. coli TG1을 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니에 대하여 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 인서트를 보더링하는 Stul 사이트가 폴리링커에 있는 HindIII 사이트에 인접한 플라스미드 pMO1(3.9 kbp)가 그 제한 패턴에 의하여 동정되었다.
(ii) 플라스미드 pMO2의 조합
rapA의 뉴클레오티드 1643으로부터 뉴클레오티드 2486까지 확장하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스의 rapA 유전자의 약 0.85 kbp DNA 세그먼트는 올리고뉴클레오티드 5′-TTC CCT GGC CAG GGG TCG CAG CGT G-3′ 및 5′-CAC GGA CCG CGG ACC ACT CGA C-3를 플라이머로 사용하고 주형으로 재조합 박테리오파지λ-1E(슈베케, 티. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1995) 92:7839-7843)를 이용하는 PCR에 의하여 증폭되었다. PCR 제품은 내부 수복하고 Smal 과의 다이제스트에 의하여 선형화된 플라스미드 pUC18과 리게이트하고 염기성 포스페이타제로 처리하였다. 리게이션 혼합물을 E. coli TGl recO를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니에 대하여 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pMO2(3.5 kbp)는 그의 제한 패턴에 의하여 동정되었다.
(iii) 플라스미드 pMO3의 조합
뉴클레오티드 4128부터 뉴클레오티드 5928까지 확장하는 S. 에리트라에아의 eryAl 유전자의 약 1.7 kbp DNA 세그먼트는 프라이머로 합성 올리고뉴클레오티드 5′-TGG CCA GGG AGT CGG TGC ACC TAG GCA-3′ 및 5′-GCC GAC AGC GAG TCG ACG CCG AGT T-3′를 이용하고 주형으로 플라스미드 pNTEP2를 이용하는 PCR에 의하여 증폭하였다. PCR 제품은 내부수복하고 Smal과의 다이제스트에 의하여 선형화된 플라스미드 pUC18과 리게이트하고 염기성 포스페이타제로 처리하였다. BAII 및 AvrII 사이트가 폴리링커의 HindIII 사이트에 인접한 요구하는 플라스미드 pMO3(4.4 kbp)가 그의 제한 패턴에 의하여 동정되었다.
(iv) 플라스미드 pMO4의 조합
플라스미드 pMO1을 HindIII로 다이제스트하고 1.3 kbp 인서트를 HindIII와 BaIII로 다이제스트한 플라스미드 pMO3와 리게이트하였다. 리게이션 혼합물을 E. coli Tg1 recO를 형질전환하는데 사용하고, 각개 콜로니에 대하요 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pMO4(5.6kbp)는 그의 제한 패턴에 의하여 동정하였다.
(v) 플라스미드 pMO5의 조합
플라스미드 pMO4를 Stul으로 다이제스트하고, 3.0 kbp 인서트를 Stul로 다이제스트한 플라스미드 pNTEP2와 리게이트한 다음, 전기영동으로 정제하여 3.8 kbp 인서트를 제거하였다. 리게이션 혼합물을 E. coli Tg1 recO에 형질전환하고, 각개 콜로니에 대하요 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pMO5(12.8 kbp)는 그의 제한 패턴에 의하여 동정하였다.
(vi) 플라스미드 pMO6의 조합
플라스미드 pMO2를 BaII와 AvrII로 다이제스트하고, 인서트는 BaII와 AvrII로 다이제스트한 플라스미드 pMO5와 리게이트하였다. 리게이션 혼합물을 E. coli Tg1 recO를 형질전환하는데 사용하고, 각개 콜로니에 대하요 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pMO6(13.5 kbp)는 그의 제한 패턴에 의하여 동정하였다.
(vii) 플라스미드 pCJR26의 조합
플라스미드 pCJR26은 ery PKS와 ery 체인-말단 티오에스테라제의 제1 및 제2 확장 모듈인 ery 로딩 모듈을 포함하는 PKS 유전자(제1 확장 모듈 내의 메틸말로닐-CoA:ACP 아실트란스퍼라제를 인코딩하는 DNA 세그먼트가 rap PKS의 모듈 2의 말로닐-coA:ACP 아실트란스퍼라제를 인코딩하는 DNA에 의하여 치환된 것은 제외함)를 포함하는 SCP2*를 근본으로 하는 플라스미드이다. 이 플라스미드는 다음과 같이 조합된다(도 9): 플라스미드 pMO6를 Ndel와 Xbal로 다이제스트하고, 인서트는 Ndel와 Xbal로 다이제스트한 플라스미드 pCJR24와 리게이트하여 전기영동으로 정제하였다. 리게이션 혼합물을 E. coli Tg1 recO로 형질전환하고, 각개 콜로니에 대하요 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pCJR26은 그의 제한 패턴에 의하여 동정하였다.
실시예 1d
S. 에리트라에아 JC2/pCJR26의 조합과 TKL 유도체의 생산
플라스미드 pCJR26을 사용하여 S. 에리트라에아 JC2 원형질을 형질전환하였다. 티오스트렙톤 저항성 콜로니를 티오스트렙톤 10㎍/ml를 포함하는 R2T20 배지에서 선발하였다. 수개의 클론에 대하여 DIG-표시 DEBS1-TE 유전자를 갖는 게놈 DNA의 사우던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 염색체에 결합된 pCJR26의 존재를 검사하였다.
pCJR26의 결합된 카피를 갖는 클론은 티오스트렙톤 5㎍/ml를 포함하는 SSM 배지에서 28-30℃에서 7일 동안 생장시켰다. 이 기간이 경과한 후, 육즙을 여과하여 균사를 제거하고 pH를 pH 3으로 조절하였다. 육즙을 2배 량의 에틸아세테이트로 두 번 추출하고 에틸아세테이트 추출액을 합쳐서 동량의 포화 염화나트륨 용액으로 세척한 다음, 무수황산 나트륨 위에서 건조하고 감압하에 에틸아세테이트를 제거하여 조생성물 500mmg을 얻었다. 생성물은 다음의 화학식을 갖는 (2S,3R,5R)-2-메틸-3,5-디하이드록시-n-헥사노익산 δ-락톤과 (2S,3R,5R)-2-메틸-3,5-디하이드록시-n-헵타노익산 δ-락톤으로 나타났다.
[화학식]
실시예 1e
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pCJR26의 조합과 14-membered 마크로리드의 생산에 사용하는 용도
약 5mmg의 플라스미드 pCJR49를 사용하여 S. 에리트라에아 NRRL2338 원형질을 형질전환하여 플라스미드가 염색체에 결합된 균주를 얻었다. 수개의 콜로니에서 총 DNA를 얻고 나우던 히브리디세이션에 의하여 분석하고 플라스미드가 신규한 마크로리드 생합성 경로를 제공하는 EryAl의 모듈 2에 결합되었음을 확인하였다. 더구나 결합은 반복된 플라스미드 염기성 배열을 나타내었다. S. 에리트라에아 NRRL 2338/pCJR49는 5mg/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 트립틱 콩 육집에 접종하고 3일 동안 30℃에서 배양하였다. 이 종균 100ml를 사용하여 각개 플라스크에 500ml의 배지가 들어있고 300rpm으로 교반할 수 있는 2개의 스프링이 장비된 5×2L 플라스크에 5mg/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 2L의 슈크로스 석시네이트 특정 배지에 접종시켰다. 5일 동안 배양한 다음, 배양물을 원심분리하고 상등액의 pH를 pH 9로 조절한다. 상등액을 동량의 에틸아세테이트로 3회 추출하고 용매를 증발 제거하였다. 생성물을 HPLC/MS에 의하여 분석하고 두 마크로리드가 에리트로마이신 아날로그임을 동정하였다.
[화학식]
실시예 1f
플라시미드 pC-ATX의 조합
플라스미드 pC-ATX는 ery PKS와 ery 체인-말단 티오에스테라제의 제1 및 제2 확장모듈인 ery 로딩 모듈을 포함하는 PKS 유전자(제1 확장 모듈 내의 메틸말로닐-CoA:ACP 아실트란스퍼라제를 인코딩하는 DNA 세그먼트가 폴리에텔 폴리케티드 모넨신의 생성물질인 스트렙토마이세스 신나모넨시스 ATCC 14513으로부터 클론된 퓨타티브 Type I PKS 유전자 클러스터 유래의 말로닐-CoA:ACP 아실트란스퍼라제를 인코딩하는 DNA에 의하여 치환된 것은 제외함)를 포함하는 SCP2*를 근본으로 하는 플라스미드이다. 이 플라스미드는 다음과 같이 수 개의 중간 플라스미드를 거쳐 조합된다(도 9):
(i) 코스미드 pSCINO2의 분리
스트렙토마이세스 신나모넨시스 ATCC 14513(모넨신 생성물질)의 게놈 라이브라리는 BanHl-선형화되고 염기성 포스페이타제-처리된 코스미드 벡타 pWE15에 리게이트된 염색체 DNA의 크기로 분류된 35-45kbp Sau3A 절편으로부터 조합된다. 리게이션 혼합물은 추출물을 포장하는 기가팩을 사용하여 λ-입자 속에 포장하고 E. coli NM1blue에 감염시켰다. 라이브라리의 약 600 콜로니가 나일론 막의 표면에서 생장하였고, 그들의 DNA는 자외선 조사에 의하여 막에 교차결합되었다. 이 막은 뒤이은 스크린 공정에 사용하였다. DEBS의 모듈 2로부터 유래된 케토신다제 도메인을 포함하는 pMO8의 인서트는33PαATP의 존재하에 랜담 프리밍에 의하여 표시되고 DNA 하이브리디세이션을 위한 프로브로 사용되었다. 프로브는 4.0×SSC 완충액에서 68℃에서 16시간 동안 하이브리즈되고 이어서 0.8×SCC 완충액으로 68℃에서 1시간동안 세척하였다. 3개의 양성 클론이 분리되었다. 모든 3개 클론의 인서트의 DNA는 벡타 pWE15에 존재하는 T3과 T7 프리밍 사이트로부터 배열되었다. Type I 케토신다제와 말로닐-CoA:ACP 아실트란스퍼라제 도메인에 동질의 부위는 주형으로서 클론 2(pSCINO2로 명명)를 사용하는 T7 프리밍 사이트로부터 시작되는 DNA 염기성 배열에서 발견되었다. 말로닐-CoA:ACP 아실트란스퍼라제 도메인(ATX로 명명)의 부분적인 DNA 배열은 전술한 말로네이트-또는 메틸말로네이트-특정 CoA:ACP 아실트란스퍼라제(헤이독, 에스. 에프. 등, FEBS (1995) 374:246-248)와 다른 도메인의 푸타티브 기질 인식부위에 있는 보기드문 염기성 배열 모티브를 나타내었다.
(ii) 플라스미드 pMO38의 조합
ATX 도메인의 약 0.9 kbp DNA 세그먼트를 프라이머로서 다음의 올리고클레오티드 5′-CTG GCC AGG GCG CGC AAT GGC CGA GCA T-3′와 5′-CCC TAG GAG TCG CCG GCA GTC CAG CGC GGC GCC C-3′를 사용하고 주형으로서 코스미드 pSCINO2로부터 유래된 DNA를 사용하는 PCR에 의하여 증폭되었다. PCR 제품은 내부수선되고 Smal과의 다이제스트에 의하여 선형화된 플라스미드 pUC18에 리게이트된 다음 염기성 포스페이타제로 처리되었다. 리게이션 혼합물은 E. coli Tgl recO를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니에 대하여는 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pMO38(3.5kbp)는 그 제한 패턴에 의하여 동정되었다.
(iii) 플라스미드 pMO34의 조합
플라스미드 pMO34는 삽입된 D1-AT2 유전자의 스톱 코돈후에 삽입된 폴리클로닝 사이트를 갖는 pMO6의 유도체이다. 플라스미드 pMO6는 EcoRl와 HindIII로 다이제스트되고 폴리클로닝 사이트의 2본쇄 부위를 형성하는 두 올리고뉴크레오티드: 5′-AAT TCA TAA CTA GTA GGA GGT CTG GCC ATC TAG A-3′ 및 5′-TCG AAG ATC TAC CGG TCT GGA GGA TGA TCA ATA C-3′로 아니일되었다. 혼합물은 리게이트하고 E. coli Tgl recO로 형질전환하였다. 각개 콜로니는 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pMO34(13.5kbp)는 그 제한 패턴에 의하여 동정하였다.
(iv) 플라스미드 pMO35의 조합
플라스미드 pMO35는 TKLS-AT2 유전자와 스트렙토마이세스 콜리누스로부터 유래된 번역적으로 결합된 크로토닐-CoA-리덕타제 유전자를 함유하는 pMO34의 유도체이다(월레이스 등, E. J. Biochem. (1995) 233:954-962). 크로토닐-CoA-리덕타제 유전자는 평체 말단을 생성하도록 멍 빈 뉴크레아제로 처리되고 Spel로 절단된 pMO34에 리게이트되어 멍 빈 뉴크레아제를 사용하여 평체말단을 생성한 Ndel-BamHl 절편인 플라스미드인 pZYB3로부터 제거되었다. 리게이션 혼합물은 E. coli Tg1 recO를 형질전환하는데 사용하였고, 각개 콜로니에 대하여는 플라스미드 함량을 검사하였다.
크로토닐-CoA-케토리덕타제 유전자의 정확한 배위를 갖는 요구하는 플라스미드 pMO35(14.2 kbp)가 제한패턴에 의하여 동정되었다.
(V) 플라스미드 pMO36의 조합
플라스미드 pMO38을 BaII 및 AvrII로 다이제스트하고 인서트는 BaII와 AvrII로 다이제스트한 pM035와 리게이트하였다. 리게이션 혼합물을 사용하여 E. coli Tg1 rec0를 형질전환하고 각개 콜로니에 대하여 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pM036(13.5 kbp)은 그 제한패턴에 의하여 동정하였다.
(vi) 플라스미드 pC-ATX의 조합
플라스미드 pMO36을 Ndel와 Xbal과 다이제스트하고 인서트는 Ndel과 Xbal로 다이제스트한 플라스미드 pCJR29와 리게이트하고, 전기영동에 의하여 정제하였다. 리게이션 혼합물은 E. coli Tg1 recO로 형질전환하고 각개 코로니에 대하여 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pC-ATX는 그 제한패턴에 의하여 동정하였다.
실시예 1g
S. 에리트라에아 JC2/pC-ATX의 조합과 TKL 유도체의 제조
플라스미드 pC-ATX를 사용하여 S. 에리트라에아 JC2 원형질을 형질전환하였다. 티오스트렙톤 저항 콜로니는 10㎍/ml의 티오스트렙톤을 함유하는 R2T20 배지에서 선발하였다. 수개의 클론에 대하여 DEBS1-TE 유전자를 인코딩하는 DIG-표시 DNA를 갖는 게놈 DNA의 사우던 블로트 하이브리디제이션에 의하여 염색체에 결합된 pC-ATX의 존재를 검사하였다.
pC-ATX의 결합된 카피를 갖는 클론을 5㎍/ml의 티오스트렙톤을 함유하는 SSM배지에서 28-30℃로 수일 동안 배양하였다. 이 기간이 경과한 후, 육즙을 여과하여 균사를 제거하고 pH를 pH 3으로 조절하였다. 육즙을 2배 량의 에틸아세테이트로 두 번 추출하고 에틸아세테이트 추출액을 합쳐서 동량의 포화 염화나트륨 용액으로 세척한 다음, 무수황산 나트륨 위에서 건조하고 감압하에 에틸아세테이트를 제거하여 조생성물 500mmg을 얻었다. 생성물은 가스크로마토그래피, 질량분석기 및 NMR로 분석하고 다음의 화학식을 갖는 (2S,3R,4S,5R)-2-메틸-4-에틸-3,5-디하이드록시-n-헵타노익산 δ-락톤과 (2S,3R,,4S,5R)-2-메틸-4-에틸-3,5-디하이드록시-n-헵타노익산 δ-락톤으로 나타났다.
[화학식]
실시예 1h
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pC-ATX의 조합 및 14-membered 마크로리드 제조에의 용도
약 5mmg의 pC-ATX DNA를 사용하여 S. 에리트라에아 NRRL2338 원형질을 형질전환하고 플라스미드가 염색체에 결합된 균주를 얻었다. 수개의 콜로니에서 총DNA를 얻고 사우던 하이브리디제이션에 의하여 분석하고 플라스미드가 신규한 마크로리드 생합성 경로를 제공하는 EryAl의 모듈 2에 결합되었음을 확인하였다. 더구나 결합은 반복된 플라스미드 염기성 배열을 나타내었다. S. 에리트라에아 NRRL 2338/pC-ATX는 5mg/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 트립틱 콩 육집에 접종하고 3일동안 30℃에서 배양하였다. 이 종균 100ml를 사용하여 각개 플라스크에 500ml의 배지가 들어있고 30Orpm으로 교반할수 있는 2개의 스프링이 장비된 5x2L 플라스크에 5mg/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 2L의 슈크로스 석시네이트 특정 배지에 접종시켰다. 5일 동안 배양한 다음, 배양물을 원심분리하고 상등액의 pH를 pH 9로 조절한다. 상등액을 동량의 에틸아세테이트로 3회 추출하고 용매를 증발 제거하였다. 생성물을 HPLC/MS에 의하여 분석하고 두 마크로리드가 에리트로마이신 아날로그임을 동정하였다.
[화학식]
실시예 1i
플라스미드 pC-AT12의 조합
플라시미드 pC-AT12는 ery PKS와 ery 체인-말단 티오에스테라제의 제1 및 제2 확장모듈인 ery 로딩 모듈을 포함하는 PKS 유전자(제1 확장 모듈 내의 메틸말로닐-CoA:ACP 아실트란스퍼라제를 인코딩하는 DNA 세그먼트가 rap PKS의 모듈 2의 말로닐-CoA:ACP 아실트란스퍼라제를 인코딩하는 DNA에 의하여 치환된 것은 제외함)를 포함하는 SCP2*를 근본으로 하는 플라스미드이다. 이 플라스미드는 다음과 같이 수 개의 중간 플라스미드를 거쳐 조합된다(도 11).
(i) 플라스미드 pMO25의 조합
eryAl (도날디오, 에스. 등, Science (1991) 252:675-679)의 뉴크레오티드 6696으로부터 7707까지 확장되는 S. 에리트라에아의 eryAl 유전자의 약 1.0 kbp DNA 세그먼트를 프라이머로서 합성 올리고클레오티드 5′-GGC GGG TCC GGA GGT TGG CAC CGA GTT-3′와 5′-ACC TTG GCC AGG GAA GAC GAA CAC TGA-3′를 사용하고 주형으로서 플라스미드 pNTEP2를 사용하는 PCR에 의하여 증폭되었다. PCR 제품은 내부수선되고 Smal과의 다이제스트에 의하여 선형화된 플라스미드 pUC18에 리게이트된 다음 염기성 포스페이타제로 처리되었다. 리게이션 혼합물은 E. coli Tgl recO를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니에 대하여는 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 인서어트를 둘러싸는 Stul 사이트가 폴리링커의 HindIII 사이트에 인접한 요구하는 플라스미드 pM025(3.6 kbp)는 그 제한 패턴에 의하여 동정되었다.
(ii) 플라스미드 pMO26의 조합
eryAl의 뉴크레오티드 8660으로부터 9258까지 확장되는 S. 에리트라에아의 eryAl유전자의 약 0.6 kbp DNA 세그먼트를 프라이머로서 합성 올리고클레오티드 5′-TCC TAG GCC GGG CCG GAC TGG TCG ACC TGC CGG GTT-3′와 5′-AAA CAC CGC GAC CTG GTC CTC CGA GC-3′를 사용하고 주형으로서 플라스미드 pNTEP2를 사용하는 PCR에 의하여 증폭되었다. PCR 제품은 내부수선되고 Smal과의 다이제스트에 의하여 선형화된 플라스미드 pUC18에 리게이트된 다음 염기성 포스페이타제로 처리되었다. 리게이션 혼합물은 E. coli Tg1 recO를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니에 대하여는 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. AvrII사이트가 폴리링커의 HindIII 사이트에 인접한 요구하는 플라스미드 pM026(3.2 kbp)는 그 제한 패턴에 의하여 동정되었다.
(iii) 플라스미드 pMO27의 조합
플라스미드 pMO25는 EcoRI와 BaII로 다이제스트하고 인서트는 Ecol과 Ba11로 다이제스트한 플라스미드 pM02와 리게이트하였다. 리게이션 혼합물을 사용하여 E. coli Tg1 recO를 형질전환하고 각개 콜로니에 대하여 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pM027(4.4 kbp)은 그 제한패턴에 의하여 동정하였다.
(iV) 플라스미드 pMO32의 조합
플라스미드 pM026은 AvrII와 HindIII로 다이제스트하고, 인서트는 AvrII와 HindIII로 다이제스트한 플라스미드 pM027와 리게이트하였다. 리게이션 혼합물을 사용하여 E. coli Tg1 recO를 형질전환하고 각개 콜로니에 대하여 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pM032(5.1 kbp)은 그 제한패턴에 의하여 동정하였다.
(v) 플라스미드 pMO33의 조합
플라스미드 pMO32은 BspE1과 SexAl로 다이제스트하고, 인서트는 동일한 두 효소로 다이제스트한 플라스미드 pNTEP2와 리게이트하고 겔 전기영동으로 정제하여 2.8kbp 인서트를 제거하였다. 리게이션 혼합물을 E. coli Tg1 recO로 형질전환하고 각개 콜로니에 대하여 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pM033(12.8 kbp)은 그 제한패턴에 의하여 동정하였다.
(vi) 플라스미드 pC-AT12의 조합
플라스미드 pM033을 Ndel와 Xbal로 다이제스트하고 인서트는 Ndel과 Xbal로 다이제스트한 플라스미드 pCJR29와 리게이트하고, 전기영동에 의하여 정제하였다. 리게이션 혼합물은 E. coli Tg1 recO로 형질전환하고 각개 코로니에 대하여 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pC-AT12는 그 제한패턴에 의하여 동정하였다.
실시예 1j
S. 에리트라에아 JC2/pC-AT12의 조합 및 TKL 유도체 생산
플라스미드 pC-AT12를 사용하여 S. 에리트라에아 JC2 원형질을 형질전환하였다. 티오스트렙톤 저항 콜로니는 10㎍/ml의 티오스트렙톤을 함유하는 R2T20 배지에서 선발하였다. 수개의 클론에 대하여 DEBS1-TE 유전자를 인코딩하는 DIG-표시 DNA를 갖는 게놈 DNA의 사우던 블로트 하이브리디제이션에 의하여 염색체에 결합된 pC-AT12의 존재를 검사하였다.
pC-AT12의 결합된 카피를 갖는 클론을 5㎍/ml의 티오스트렙톤을 함유하는 SSM 배지에서 28-30℃로 수일 동안 배양하였다. 이 기간이 경과한 후, 육즙을 여과하여 균사를 제거하고 pH를 pH 3으로 조절하였다. 육즙을 2배 량의 에틸아세테이트로 두 번 추출하고 에틸아세테이트 추출액을 합쳐서 동량의 포화 염화나트륨 용액으로 세척한 다음, 무수황산 나트륨 위에서 건조하고 감압하에 에틸아세테이트를 제거하여 조생성물 500mmg을 얻었다. 생성물은 다음의 화학식을 갖는(3R,4S,5R)-4-메틸-3,5-디하이드록시-n-헥사노익산 δ-락톤과 (3R,,4S,5R)-4-메틸-3,5-디하이드록시-n-헵타노익산 δ-락톤으로 나타났다.
[화학식]
실시예 1k
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pC-AT12의 조합 및 14-멤버 마크로리드 제조에의 용도
약 5㎍의 pC-AT12 DNA를 사용하여 S. 에리트라에아 NRRL2338 원형질을 형질전환하고 플라스미드가 염색체에 결합된 균주를 얻었다. 수개의 콜로니에서 총DNA를 얻고 사우던 하이브리디제이션에 의하여 분석하고 플라스미드가 신규한 마크로리드 생합성 경로를 제공하는 EryAI의 모듈 2의 3′ 위치에 결합되었음을 확인하였다. 더구나 결합은 반복된 플라스미드 염기성 배열을 나타내었다. S. 에리트라에아 NRRL 2338/pC-AT12는 5mg/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 트립틱 콩 육집에 접종하고 3일 동안 30℃에서 배양하였다. 이 종균 100ml를 사용하여 각개 플라스크에 500ml의 배지가 들어있고 300rpm으로 교반할수 있는 2개의 스프링이 장비된 5x2L 플라스크에 5mg/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 2L의 슈크로스 석시네이트 특정 배지에 접종시켰다. 5일 동안 배양한 다음, 배양물을 원심분리하고 상등액의 pH를 pH 9로 조절한다. 상등액을 동량의 에틸아세테이트로 3회 추출하고 용매를 증발 제거하였다. 생성물을 HPLC/MS에 의하여 분석하고 두 마크로리드를 동정하였다.
[화학식]
실시예 1L
플라스미드 pCJR49의 조합
pCJR49는 모듈 2에 케토리덕타제를 갖고 있지 않고 모듈 2에 있는 AT 도메인이 제2 모듈에 있는 메틸말로닐 확장자 대신 말로닐 확장자를 결합하도록 RAPS AT2에 의하여 치환된 돌연변이 DEBS1-TE 유전자를 포함하는 pCJR24-기초 플라스미드이다.
pMO32는 Bsp티로 다이제스트되고 RAP 모듈 2로부터의 AT를 함유하는 절편이BspEl와 SexAl로 다이제스트된 pCJR24에 클론되어 플라스미드 pCJR49롤 생성한다. 플라스미드 pCJR49는 제한 효소 지도작성에 의하여 확인되었다.
실시예 1m
S. 에리트라에아 JC2/pCJR49의 조합 및 TKL 유도체 생산
약 5㎍의 pCJR49를 사용하여 S. 에리트라에아 JC2 원형질을 형질전환하여 플라스미드가 염색체에 결합된 균주를 얻었다. 수개의 콜로니로부터 총 DNA를 얻고 사우던 하이브리기제이션에 의하여 플라스미드가 EryTE에 결합되었음을 확인하였다. S. 에리트라에아 JC2/pCJR49를 5㎍/ml의 티오스트렙톤을 함유하는 트립틱 콩 육즙에서 30℃로 3일 동안 배양하였다. 이 종균 100ml를 사용하여 각개 플라스크에 500ml의 배지가 들어있고 300rpm으로 교반할수 있는 2개의 스프링이 장비된 5x2L 플라스크에 5㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 2L의 슈크로스 석시네이트 특정 배지에 접종시켰다. 5일 동안 배양한 다음, 배양물을 원심분리하고 상등액의 pH를 pH 9로 조절한다. 상등액을 동량의 에틸아세테이트로 3회 추출하고 용매를 증발 제거하였다. 생성물을 메타놀에 용해시키고 ′피네간-매트 GCQ 시스템'에서 GCMS에 의하여 분석하고 합성 표준품과 비교하여 새로운 두 락톤이 존재함을 확인하였다. 생성물은 다음의 화학식을 갖는 (4S,5R)-4-메틸-3-케토-5-디하이드록시-n-헥사노익산 δ-락톤과 (4S,5R)-4-메틸-3-케토-5-디하이드록시-n-헵타노익산 δ-락톤으로 나타났다.
[화학식]
실시예 1n
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pCJR49의 조합 및 14-멤버 마크로리드 제조에의 용도
5㎍의 pCJR49 DNA를 사용하여 S. 에리트라에아 NRRL2338 원형질을 형질전환하고 플라스미드가 염색체에 결합된 균주를 얻었다. 수개의 콜로니에서 총 DNA를얻고 사우던 하이브리디제이션에 의하여 분석하고 플라스미드가 신규한 마크로리드생합성 경로를 제공하는 EryAI의 모듈 2에 결합되었음을 확인하였다. 더구나 결합은 반복된 플라스미드 염기성 배열을 나타내었다. S. 에리트라에아 NRRL 2338/pCJR49는 5㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 트립틱 콩 육집에 접종하고 3일동안 30℃에서 배양하였다. 이 종균 100ml를 사용하여 각개 플라스크에 500ml의배지가 들어있고 30Orpm으로 교반할수 있는 2개의 스프링이 장비된 5x2L 플라스크에 5㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 2L의 슈크로스 석시네이트 특정 배지에 접종시켰다. 5일 동안 배양한 다음, 배양물을 원심분리하고 상등액의 pH를 pH 9로 조절한다. 상등액을 동량의 에틸아세테이트로 3회 추출하고 용매를 증발 제거하였다. 생성물을 HPLC/MS에 의하여 분석하고 두 마크로리드를 동정하였다.
[화학식]
실시예 2
S. 에리트라에아 ERMD1의 조합, avr 로딩 디도메인이 S. 에리트라에아 NRRL 2338의 ery 로딩 디도메인을 위하여 치환된 하이브리드 PKS를 운반
(i) 플라스미드 pAVLD의 조합
플라스미드 pCRabc를 BamHI로 선형화하고 이미 BgIII로 다이제스트된 pIJ702에 리게이트한다. 혼합물은 요구하는 플라스미드 pAVLD를 포함하고 있다(도5). 리게이션 혼합물을 E.coli Tg1 recO로 형질전환하고 각개 콜로니에 대하여 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드는 제한패턴에 의하여 동정하였다(도 5).
(ii) S. 에리트라에아 ERMD1의 조합
E. coli TG1 recO(pAVLD)로부터 분리한 pAVLD 약 5-10㎍을 S. 에리트라에아 NRRL 2338로 형질전환하고 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니를 분리하였다. 이 콜로니 중의 하나를 선발하여 총 DNA를 Pstl로 다이제스트하고 케토신다제 도메인 KS1을 인코딩하는 ery AI 유전자의 절편으로부터 유래된 인서트를 프로브로 사용하는 사우던 하이브리디제이션에 의하여 분석하였다. 분석 결과는 나란하게 결합된 pAVLD에 카피가 존재함을 나타내는 양성적으로 하이브리디스되는 8.5 kbp 및 33kbp의 Pstl 절면을 보여주었다(도 6).
실시예 3
S. 에리트라에아 ERMD1을 사용한 이소프로필 및 se.-부틸 에리트로마이신의 제조
S. 에리트라에아 ERMD1 발효물 50ml을 수돗물 배지에 옮기고 30℃에서 4일 동안 배양한 다음, 균사를 수거하여 티오스트렙톤(50㎍/ml)을 함유하는 슈크로스-석시네이트 배지 1.5 L에 접종시킨다. 30℃에서 4일 동안 배양한 다음, 전체 육즙을 동량의 에틸아세테이트로 두 번 추출한다. 추출물을 합쳐 감압하에 농축하고 실리카판(20x20cm) 박층 크로마토그래피에서 클로로포름/메타놀/.88 암모니아 8:2:0.01로 용리시킨다. 생성물은 페이스셉 C18 베이스-불활성 역상 칼럼 에 스5 오디에스(옥타데실실란) 6(4.6mmX25cm)에서 HPLC로 분리하여 메타놀/0.5% 초산암모늄(70:30)으로 1ml/min.로 용리한다. 유분을 7분과 11분 사이에 별도의 세 인젝션으로부터 수집하고 모인 유분은 재차 별도의 10개의 인젝션에 재차 분사한다. 4-탄소(C-4; 이소부틸) 스타터 유니트의 결합에 의하여 유도된 이소프로필 측쇄(일반식 1의 R1이 이소프로필)를 포함하는 아날로그가 처음에 용출되고 5-탄소(C-5;2-메틸부틸)스타터 유니트의 결합에 의하여 유도된 세칸다리부틸 측쇄(일반식 1의 R1이 세칸다리부틸)를 포함하는 아날로그는 수분 후에 나온다. 고해상도 MS는 이론치와 거의 같은 C-4 eryA, eryB 및 eryC 아날로그와 C-5 eryA, eryB 및 eryD 아날로그를 나타내었다.
아날로그 이론치 질량 측정치 질량
C5-eryA 762.5004 762.5021
C4-eryA 748.4847 748.4820
C5-eryB 746.4898 748.5077
C4-eryB 732.4898 732.4933
이 실험에서는 내츄랄 에리트로마이신은 미량 또는 검출할수 없는 양으로 존재하므로 eryC는 검출되지 않았다. 발효 육즙 중의 C-4/C-5의 농도는 육즙을 에틸아세테이트의 ESMS에 의하여 측정한 결과, 4:1과 6:1 사이로서 C-4가 많았다. A:B:D의 아날로그 비율은 대략 15:60:25 였으나, 가변성이어서 발효가 진행됨에 따라 A 아날로그의 비율이 증가하였다. 에리트로마이신의 총 수율은 약 400㎍이다. 이소부틸산과 2-메틸부틸산은 어느것도 보충하지 않았다. 따라서 이소부티릴 또는 2-메틸부티릴 스타터는 내츄랄 애버멕틴을 합성할 때(예를 들면, 하프너등, J. Antibiot.,(1991) 44:349-356)와 유사하게 공급된 전구물질에 의하여 내부에서 유도된 것으로 나타났다.
실시예 4a
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pIG1의 조합
약 5㎍의 플라스미드 pIG1을 S. 에리트라에아 NRRL2338 원형질로 형질전환하고 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니에서 총DNA를 얻고 사우던 하이브리디제이션에 의하여 분석하고 플라스미드가 EryAI에 결합되었음을 확인하였다. 또한 사우던 분석 결과는 결합 사이트가 ave 로딩 모듈을 통하여 변형된 마크로리드를 형성할 가능성이 있는 돌연변이를 생성하는데 적당함을 보여 준다.
실시예 4b
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30의 조합
약 5㎍의 플라스미드 pND30을 S. 에리트라에아 NRRL2338 원형질로 형질전환하고 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니에서 총DNA를 얻고 사우던 하이브리디제이션에 의하여 분석하고 플라스미드가 EryAI에 결합되었음을 확인하였다. 또한 사우던 분석 결과는 결합 사이트가 ave 로딩 모듈을 통하여 변형된 마크로리드를 형성할 가능성이 있는 돌연변이롤 생성하는데 적당함을 보여 준다.
실시예 5a
S. 에리트라에아 NRRL 2338/plG1을 사용한 13-이소프로필 및 13-sec.부틸 에리트로마이신의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/plG1을 티오스트렙톤 50㎍/ml을 함유하는수돗물배지에 접종하고 30℃에서 4일 동안 배양하였다. 균사 20ml을 수거하여 280rpm으로 교반할수 있는 스프링이 장비된 2 L 플라스크에 들어 있는 티오스트렙톤 50㎍/ml을함유하는 슈크로스-석시네이트 배지 500ml에 접종하는 종균으로 사용하였다. 3.5일과 6일 후에 육즙을 여과하여 균사를 여과 제거하고 육즙을 동량의 에틸아세테이트로 두 번 추출한다. 추출물을 합쳐 무수 황산나트륨 위에서 건조시켜 용매를 증발 제거하였다. GC 및 전자 스프레이 MS를 사용하여 생성물을 분석한 결과 총 5-6mg/L의 14-멤버 마크로리드 생성물 중 대부분의 성분은 세칸다리-부틸 에리트로마이신 D이고(대략 1.5mg/l), 그 외의 성분으로 세칸다리부틸 에리트로마이신 B와 세칸다리부틸 에리트로마이신 A; 이소프로필 에리트로마이신 A, B 및 D; 및 소량의 내츄랄 에리트로마이신 A, B 및 D가 존재하고 있음을 보여 주었다. S. 에리트라에아 NRRL 2338/plG1은 동량의 S. 에리트라에아 ERMD1(실시예 2)에 비하여 신규한 이소프로필- 및 세칸다리부틸-에리트로마이신을 거의 10-15배 정도 많이 생산하였는데, 이는 actI 조촉매와 그의 활성화 유전자 actII-orf4가 Type I PKS의 표현을 향상시키는 능력이 있음을 보여주는 것이다. 이소부틸산과 2-메틸부틸산은 어느것도 보충하지 않았다. 따라서 이소부티릴 또는 2-메틸부티릴 스타터는 공급된 전구물질에 의하여 내부에서 유도된 것으로 나타났다.
실시예 5b
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30을 사용한 13-이소프로필 및 13-sec.부틸 에리트로마이신의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30을 티오스트렙톤 50㎍/ml을 함유하는 수돗물 배지에 접종하고 30℃에서 4일 동안 배양하였다. 균사 20ml을 수거하여 280rpm으로 교반할수 있는 스프링이 장비된 2 L 플라스크에 들어 있는 티오스트렙톤 50㎍/ml을 함유하는 슈크로스-석시네이트 배지 500ml에 접종하는 종균으로 사용하였다. 3.5일과 6일 후에 육즙을 여과하여 균사를 여과 제거하고 육즙을 4분지 1 량의 에틸아세테이트로 세 번 추출한다. 추출물을 합쳐 무수 황산나트륨 위에서 건조시켜 용매를 증발제거하였다. GC 및 전자 스프레이 MS를 사용하여 생성물을 분석한 결과 총 5-6mg/L의 14-멤버 마크로리드 생성물 중 대부분의 성분은 세칸다리-부틸 에리트로마이신 D이고(대략 1.5mg/l), 그 외의 성분으로 세칸다리부틸 에리트로마이신 B와 세칸다리부틸 에리트로마이신 A; 이소프로필 에리트로마이신 A, B 및 D; 및 소량의 내츄랄 에리트로마이신 A, B 및 D가 존재하고 있음을 보여 주었다. S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30은 동량의 S. 에리트라에아 ERMD1(실시예 2)에 비하여 신규한 이소프로필 및 세칸다리부틸-에리트로마이신을 거의 10-15배 정도 많이 생산하였는데, 이는 actI 조촉매와 그의 활성화 유전자 actII-orf4가 Type I PKS의 표현을 향상시키는 능력이 있음을 보여주는 것이다. 이소부틸산과 2-메틸부틸산은 어느것도 보충하지 않았다. 따라서 이소부티릴 또는 2-메틸부티릴 스타터는 공급된 전구물질에 의하여 내부에서 유도된 것으로 나타났다.
실시예 6a
S. 에리트라에아 NRRL 2338/plG1을 사용한 13-사이클로펜틸 에리트로마이신 B의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/plG1 배양균을 300ml 에렌마이어 플라스크에 들어 있는 수돗물 배지 50ml에 접종하였다. 28℃에서 36시간 동안 배양한 후 이 플라스크를 5 L 용기에 들어있는 5 L의 ERY-P 배지에 접종하는데 사용하였다. 육즙을 1.75 L/min.의 유속으로 통기하면서 28℃에서 배양하였다. 24시간 후에 사이클로펜탄 카복실산(1.4 ml)을 가하고 168시간 동안 발효를 계속한다. 전체 육즙을수산화 나트륨을 사용하여 pH 8.5로 조절하고, 에틸아세톤(1O L)으로 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 건조하여 껌 상태의 조생성물(4.2g)을 얻었다. 이 추출물 1 g을 에틸아세테이트(5ml)에 용해시키고 에틸아세테이트(10ml)가 첨가된 포장 실리카겔(1Og; 인터내쇼날 솔밴트 테크놀로지)를 첨가한다. 칼럼을 에틸아세테이트 (4X1Oml); 디클로로메탄:메타놀(1:1) (2x1Oml); 디클로로메탄:메타놀:암모니아(90:9:1) (1x10ml); 디클로로메탄:메타놀:암모니아(80:19:1) ( 1x10ml); 메타놀(2x10ml)로 순차적으로 용출하였다. 유분 7-10은 합치고 증발시켜 건조하였다. 이러한 분류공정을 나머지 껌상 생성물 3.2g에 대하여도 반복한다. 이러한 공정을 거친 후 요구하는 생성물을 포함하는 껌상 생성물 920mg을 얻었다. 이 생성물을 유속 8 ml/min.의 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(7:3) 이동상을 이용하는 조르박스 7㎛ 오디에스 칼람(21.2mmx25cm)을 사용하는 역상 HPLC에 의하여 정제한다. 네 개의 분리된 인젝션으로부터 나오는 흥미있는 생성물을 포함하는 유분들을 합치고 합치고 건조한 다음, 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(28:72)아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(50:50)의 차등 이동상을 이용하는 벡크만 5㎛ 울트라스페어 ODS 칼람을 사용하는 역상 HPLC를 18분 동안 (유속 4 ml/min.) 반복한다. 다섯 개의 인젝션으로부터 나오는 흥미있는 생성물을 포함하는 유분들은 합치고 증발 건조하여 순수한 백색 고체(7 mg)을 얻었다. 생성물의 구조는 질량분석기(MS)와 핵자기공명(NMR) 스펙트로스코피에 의하여 확인하였다.
HPLC 체류시간 - 방법 A - 26.0분
APCI-MS(M+H)+m/e758에서 관찰, C40H72NO12에 요구되는 것이 758임
[화학식]
*: 변화될 수 있음을 의미함.
실시예 6b
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30을 사용한 13-사이클로펜틸 에리트로마이신 B의 제조
배양액으로 S. 에리트라에아를 사용하여 실시예6a와 동일하게 실시한다. 실시예 6a와 동일한 화합물이 얻어진다.
실시예 7a
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pIG1을 사용한 13-사이클로부틸 에리트로마이신 B의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pIG1 배양균을 3x30Oml 에렌마이어 플라스크에 들어 있는 수돗물 배지 50ml에 접종하였다. 28℃에서 72시간 동안 배양한 후 이 플라스크를 5 L 용기에 들어 있는 3.5 L의 ERY-P 배지에 접종하는데 사용하였다. 육즙을 28℃에서 500rpm으로 교반하면서 2.0 L/min.의 유속으로 통기하여 배양하였다. 두 사이클로부탄 카복실산(1.4 ml) 원료는 24시간 후와 48시간후에 가하고 168시간 동안 발효를 계속한다. 전체 육즙을 수산화 나트륨을 사용하여 pH 8.5로 조절하고, 에틸아세테이트(20 L)로 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 건조하여 껌 상태의 조생성물(9.2g)을 얻었다. 이 추출물 2.3g을 에틸아세테이트(12.5ml)에 용해시키고 에틸아세테이트(1Oml)가 첨가된 포장 실리카겔(1Og;인터내쇼날 솔밴트 테크놀로지) 카트리지에 주입한다. 칼럼을 에틸아세테이트 (4x24ml); 디클로로메탄:메타놀(9:1)(1x24ml); 디클로로메탄:메타놀(8:2)(2X24ml); 디클로로메탄:메타놀:암모니아(80:19:1)(1x24ml; 메타놀(1x24ml)로 순차적으로 용출하였다. 유분 6-8은 합치고 증발시켜 건조하였다. 이러한 분류공정을 나머지 껌상 생성물 4.7g에 대하여도 반복한다. 이러한 공정을 거친 후 요구하는 생성물을 포함하는 껌상 생성물 415mg을 얻었다. 이 생성물을 유속 8 ml/min.의 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(3:1) 이동상을 이용하는 조르박스 7㎛ ODS 칼람(21.2mmx25cm)을 사용하는 역상 HPLC에 의하여 정제한다. 네 개의 분리된 인젝션으로부터 나오는 흥미있는 생성물을 포함하는 유분들을 합치고 합치고 건조한 다음, 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(28:72)으로부터 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(50:50)까지의 차등 이동상을 이용하는 벡크만 5㎛ 울트라스페어 0DS 칼람을 사용하는 역상 HPLC를 18분 동안 (유속 4ml/min.) 반복한다. 다섯 개의 인젝션으로부터 나오는 흥미있는 생성물을 포함하는 유분들은 합치고 증발 건조하여 순수한 백색 고체(27 mg)를 얻었다. 생성물의 구조는 질량분석기(MS)와 핵자기공명(NMR) 스펙트로스코피에 의하여 확인하였다.
HPLC 체류시간 - 방법 A - 22.3분
APCI-MS(M+H)+m/e 744에서 관찰, C39H70NO12에 요구되는 것이 744임
[화학식]
실시예 7b
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30을 사용한 13-사이클로부틸 에리트로마이신 B의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30을 사용하여 실시예7a와 동일한 방법으로실시하였다. 생성물은 실시예 7과 동일한 화합물이다.
실시예 8a
S. 에리트라에아 NRRL 2338/plG1을 사용한 13-(3-푸라닐) 에리트로마이신 B의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pIG1 배양균을 30Oml 에렌마이어 플라스크에 들어 있는 수돗물 배지 50ml에 접종하였다. 28℃에서 72시간 동안 배양한 후 이 플라스크를 5 L 용기에 들어 있는 3.5 L의 ERY-P 배지에 접종하는데 사용하였다. 육즙을 28℃에서 500rpm으로 교반하면서 1.75 L/min.의 유속으로 통기하여 배양하였다. 3-푸로익산(6mml 메타놀 중의 1.4g) 원료는 24시간 후 멸균된 필터에 가하고 138시간 동안 발효를 계속한다. 전체 육즙의 pH는 수산화 나트륨을 사용하여 pH 8.5로 조절하고, 에틸아세테이트(1O L)로 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 건조하여 껌 상태의 조생성물(3.8g)을 얻었다. 이 추출물 1.9g을 에틸아세테이트(10ml)에 용해시키고 에틸아세테이트(10ml)가 첨가된 포장 실리카겔 카트리지(1Og; 인터내쇼날 솔밴트 테크놀로지)에 주입한다. 칼럼을 에틸아세테이트(4x24ml); 디클로로메탄:메타놀(9:1)(1x24ml); 디클로로메탄:메타놀(8:2) (2x24ml); 디클로로메탄:메타놀:암모니아(80:19:1)(1x36ml); 메타놀(1x24ml)로 순차적으로 용출하였다. 유분 8과 9는 합치고 증발시켜 건조하였다. 이러한 분류공정을 나머지 껌상 생성물 1.9g에 대하여도 반복한다. 이러한 공정을 거친 후 요구하는 생성물을 포함하는 고형물을 얻었다. 이 생성물을 유속 8 ml/min.의 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(3:1) 이동상을 이용하는 조르박스 7㎛ 0DS 칼람 (21.2mmx25cm)을 사용하는 역상 HPLC에 의하여 정제한다. 세 개의 분리된 인젝션으로부터 나오는 흥미있는 생성물을 포함하는 유분들을 합치고 합치고 건조한 다음, 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(28:72)으로부터 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(50:50)까지의 차등 이동상을 이용하는 벡크만 5㎛ 울트라스페어 0DS 칼람을 사용하는 역상 HPLC를 18분동안 (유속 4 ml/min.) 반복한다. 세 개의 인젝션으로부터 나오는 흥미있는 생성물을 포함하는 유분들은 합치고 증발 건조하여 순수한 13-(3-푸라닐) 에리트로마이신 B를 백색 고체(9 mg)상태로 얻었다. 생성물의 구조는 질량분석기에 의하여 확인하였다.
HPLC 체류시간 - 방법 A - 17.0분
APCI-MS(M+H)+m/e 756에서 관찰, C39H66NO13에 요구되는 것이 756임
[화학식]
실시예 8b
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30을 사용한 13-(3-푸라닐) 에리트로마이신 B의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30 배양균을 사용하여 실시예 8a와 동일한 방법으로 실시한다. 생성물은 실시예 8a와 동일한 13-(3-푸라닐) 에리트로마이신 B이다.
실시예 9a
S. 에리트라에아 NRRL 2338/plG1을 사용한 13-사이클로프로필 에리트로마이신 B의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pIG1 배양균을 30Oml 에렌마이어 플라스크에 들어 있는 수돗물 배지 50ml에 접종하였다. 28℃에서 72시간 동안 배양한 후 이 플라스크를 3.5 L의 ERY-P 배지에 접종하는데 사용하였다. 멸균한 후 즉시 티오스트렙톤(105mg)을 첨가하였다. 육즙을 28℃에서 500rpm으로 교반하면서 2.0 L/min.의 유속으로 통기하여 배양하였다. 사으클로프로판 카복실산 (1.2 ml)을 24시간 후에 가하고 144시간 동안 발효를 계속한다. 전체 육즙의 pH는 수산화 나트륨을 사용하여 pH 8.5로 조절하고, 에틸아세테이트(3 L)로 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 건조하여 껌 상태의 조생성물(1.7g)을 얻었다. 이 추출물(0.85g)을 에틸아세테이트(1Oml)에 용해시키고 에틸아세테이트(20ml)로 조정된 포장 실리카겔 카트리지(1Og; 인터내쇼날 솔밴트 테크놀로지)에 주입한다. 칼럼을 에틸아세테이트(4x24ml); 디클로로메탄:메타놀(9:1)(1x24ml); 디클로로메탄:메 타놀(8:2)(1x24ml); 디클로로메탄:메타놀:암모니아(80:19:1)(3x24ml); 메타놀(1x24ml)로 순차적으로 용출하였다. 유분 6-9는 합치고 증발시져 건조하였다. 이러한 분류공정을 나머지 껌상 생성물 0.85g에 대하여도 반복한다. 이러한 공정을 거친 후 요구하는 생성물을 포함하는 고형물을 얻었다. 이 생성물을 유속 8 ml/min.의 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(3:1) 이동상을 이용하는 조르박스 7㎛ ODS 칼람(21.2mmx25cm)을 사용하는 역상 HPLC에 의하여 정제한다. 네 개의 분리된 인젝션으로부터 나오는 흥미있는 생성물을 모함하는 유분들을 합치고 합치고 건조한 다음, 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(28:72)으로부터 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(50:50)까지의 차등 이동상을 이용하는 벡크만 5㎛ 울트라스페어 0DS 칼람을 사용하는 역상 HPLC를 18분 동안 (유속 4 ml/min.) 반복한다. 세 개의 인젝션으로부터 나오는 흥미있는 생성물을 포함하는 유분들은 합치고 증발 건조하여 순수한 13-사이클로프로필 에리트로마이신 B를 백색 고체(9 mg)상태로 얻었다. 생성물의 구조는 질량분석기에 의하여 확인하였다.
HPLC 체류시간 - 방법 A - 17.9분
APCI-MS(M+H)+m/e730에서 관찰, C38H68NO12에 요구되는 것이 730임
[화학식]
* 표시는 가역성일 수 있음을 나타낸다.
실시예 9b
S. 에리트라에아 NRRL2338/pND30을 사용한 사이클로프로필 에리트로마이신 B의 제조
S. 에리트라에아 NRRL/pND30 배양균을 사용하여 실시예 9a와 동일한 방법으로 실시한다. 실시예 9a에 예시된 화합물이 얻어졌다.
실시예 10a
S. 에리트라에아 NRRL 2338/plG1을 사용한 (1-메틸티오-에틸) 에리트로마이신 B의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/plG1 배양균을 2.8 L 페른바하 플라스크에 들어있는 수돗물 배지 1 L에 접종하였다. 29℃에서 84시간 동안 배양한 후 이 플라스크를 14 L의 발효통에 들어 있는 8 L의 보족 ERY-P 배지(50g/l 덱스트로스,30g/l 누트리소이 분말, 3g/l 황산암모늄, 5g/l NaCI, 6g/l CaC03, 1Og/l 슈크로스, 5g/l 콘 스팁, 0.5g/l MgS04, 및 1ml P2000)에 접종하는데 사용하였다. 배양액을 28℃에서 800rpm으로 교반하면서 8 L/min.의 유속으로 통기하여 배양하였다. 배양액의 pH는 NaOH 또는 H2S04(15%)를 사용하여 6.9와 7.3 사이로 유지하였다. 메틸티올아세틱산(3.2ml)을 24시간 후에 가하였다. 120시간 후에 메틸티올아세틱산 1.6ml를 추가로 가하고 142시간 동안 발효를 계속하였다. 전체 배양액을 원심분리하고 농축액 34 l를 얻고, 이 농축액을 XAD-16 레진 칼람(600ml;롬 앤드 하스)에 흡착시켰다. 레진 칼람을 물(1.8 L)로 세척하고 에틸아세테이트(2.5 L)로 용리하였다. 에틸아세테이트 용리액을 250ml까지 농축하고 요구하는 물질을 pH 3.5의 100mM 인 산나트륨 완충액(1.3 L)로 추출하였다. 생성물을 재차 에틸아세테이트에 용해시키고 수산화나트륨으로 pH 9로 조절한 다음, 에틸아세테이트(450ml)와 혼합하였다. 에리트로마이신이 많이 들어 있는 에틸아세테이트 층을 분리하고 증발시켜 껌상 물질(5.0g)을 얻고, 이 껌상 물질을 20% 메타놀(120 L)에 분산시킨 다음, CG-161 레진 칼람(100ml;도소 하스)에 올렸다. 이어서 레진 칼람을 20% 메타놀(3x100ml); 40% 메타놀(3x100ml); 60% 메타놀(3x100ml); 80% 메타놀(3x100ml) 및 순수 메타놀(4x10ml)로 순차적으로 용출시킨다. 순수 메타놀 유분 2 및 3을 고형물(220mg)이 형성될 때까지 증발시키고 0.1% 트리플루오로아세틱산을 포함하는 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄이 (32:68)부터 (38:62)의 그래디엔트를 갖는 이동상을 이용하는 역상 10㎛ 크로마실 C18 OPLC 칼람(75mmx25cm)에서 60분 동안 215ml/min.의 유속으로 정제하였다. 요구하는 생성물을 함유하는 유분을 합치고(1.7 L), 수산화나트륨을 사용하여 pH 9로 조절한 다음, 염화메틸렌(300ml)으로 추출하였다. 염화메틸렌 층을 분리하여 증발 건조시키고, 부분적으로 순수한 생성물을 얻었다. HPLC단계와 추출단계를 반복하여 순수한 (1-메틸티오-에틸) 에리트로마이신 B(31mg)을 얻었다. 생성물의 구조는 질량분석기와 NMR 스펙트로스코피에 의하여 확인하였다.
HPLC 체류시간 - 방법 B - 14.9분
APCl-MS(M+H)+m/e764에서 관찰, C38H70NO12S에 요구되는 것이 764임.
[화학식]
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30 배양균을 사용하여 실시예 1Oa와 동일한방법으로 실시한다. 실시예 1Oa에 예시된 화합물이 얻어졌다.
실시예 11
S. 에리트라에아 NRRL 2338를 사용한 13-사이클로부틸 에리트로마이신 B의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338 배양균을 30Oml 에렌마이어 플라스크에 들어 있는 수돗물 배지 50ml에 접종하였다. 28℃에서 48시간 동안 배양한 후 배양균을 30Oml 에렌마이어 프라스크에 들어 있는 50ml의 ERY-P 배지에 접종하는데 사용하였다. 육즙을 28℃에서 배양하였다. 사이클로부탄 카복실산 (20 ml)을 24시간 후에 가하고 168시간 동안 발효를 계속한다. 전체 육즙의 pH는 수산화 나트륨 수용액을 사용하여 pH 8.5로 조절하고, 에틸아세테이트(50ml)로 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 분리하여 농축하고 건조한다. 시료는 HPLC-MS 분석을 위하여 메타놀 1ml에 용해시킨다. 이 생성물은 avr 로딩 모듈(NRRL 2338/pIG1)을 제조하기 위한 실시예 7에 기술한바와 같은 비형질전환, 비재조합 NRR2338에 의하여 13-사이클로부틸 에리트로마이신 B를 생산함을 확인하였다.
HPLC 체류시간 - 방법 A - 22.3분
APCI-MS(M+H)+m/e744에서 관찰, C39H70NO12에 요구되는 것이 744임
실시예 12
S. 에리트라에아 NRRL 2338를 사용한 13-사이클로프로필 에리트로마이신 B의 제S조
S. 에리트라에아 NRRL 2338 배양균을 30Oml 에렌마이어 플라스크에 들어 있는 수돗물 배지 50ml에 접종하였다. 28℃에서 48시간 동안 배양한 후 배양균을 30Oml 에렌마이어 프라스크에 들어 있는 50ml의 ERY-P 배지에 접종하는데 사용하였다. 육즙을 28℃에서 배양하였다. 사이클로프로판 카복실산 (20 ml)을 24시간 후에 가하고 168시간 동안 발효를 계속한다. 전체 육즙의 pH는 수산화 나트륨 수용액을 사용하여 pH 8.5로 조절하고, 에틸아세테이트(50ml)로 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 분리하여 농축하고 건조한다. 시료는 HPLC-MS 분석을 위하여 메타놀 1 ml에 용해시킨다. 이 생성물은 avr 로딩 모듈(NRRL 2338/pIG1)을 제조하기 위한 실시예 9에 기술한바와 같은 비형질전환 , 비재조합 NRR2338에 의하여 13-사이클로프로필 에리트로마이신 B를 생산함을 확인하였다.
HPLC 체류시간 - 방법 A - 17.9분
APCI-MS(M+H)+m/e730에서 관찰, C38H68NO12에 요구되는 것이 73O임
실시예 13a
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pIG1을 사용한 13-사이클로부틸 에리트로마이신 A의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pIG1 배양균을 3x30Om1 에렌마이어 플라스크에들어 있는 50ml의 수돗물 배양액에 좁종시킨다. 28℃에서 72시간 동안 배양한 후, 3x5 L 소형 발효통에 들어 있는 3.5 L의 ERY-P 배지에 접종시킨다. 육즙을 28℃에서 500rpm으로 교반하면서 2.0 L/min.의 유속으로 통기하여 배양한다. 두 사이클로부탄 카복실산(1.4ml) 원료를 각각 24시간 후와 48시간 후에 첨가하고 168시간동안 발효시킨다. 전체 육즙의 pH는 수산화 나트륨 수용액을 사용하여 pH 8.5로 조절하고, 에틸아세테이트(20 L)로 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 건조하여 껌 상태의 조생성물(9.2g)을 얻었다. 이 추출물(2.3g)을 에틸아세테이트(12.5ml)에 용해시키고 에틸아세테이트(1Oml)로 조정된 포장 실리카겔 카트리지(1Og; 인터내쇼날 솔밴트 테크놀로지)에 주입한다. 칼럼을 에틸아세테이트(4x24ml); 디클로로메탄:메타놀(9:1)(1x24m1); 디클로로메탄:메타놀(8:2)(2x24ml); 디클로로메탄:메타놀:암모니아(80:19:1)(1x24ml); 메타놀(1x24ml)로 순차적으로 용출하였다. 유분 6-8은 합치고 증발시켜 건조하였다. 이러한 분류공정을 나머지 껌상 생성물 4.7g에 대하여도 반복한다. 이러한 공정을 거친 후 요구하는 생성물을 포함하는 고형물 415mg을 얻었다. 이 생성물을 유속 8 ml/min.의 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(3:1) 이동상을 이용하는 조르박스 7㎛ ODS 칼람(21.2mmx25cm)을 사용하는 역상 HPLC에 의하여 정제한다. 다섯 개의 분리된 인젝션으로부터 나오는 흥미있는 생성물을 포함하는 유분들을 합치고 건조한 다음, 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(28:72)으로부터 아세토니트릴:0.05M 초산암모늄(50:50)까지의 차등 이동상을 이용하는 벡크만 5㎛ 울트라스페어 0DS 칼람을 사용하는 역상 HPLC를 18분 동안 (유속 4 ml/min.) 반복한다. 생성물을 포함하는 유분들은 합치고 증발 건조하여 백색 고체 생성물(4mg)을 얻었다. 생성물의 구조는 질량분석기에 의하여 확인하였다.
HPLC 체류시간 - 방법 A - 17.5분
APCI-MS(M+H)+m/e 73O에서 관찰, C39H70NO13에 요구되는 것이 73O임
[화학식]
실시예 13b
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30을 사용한 13-사이클로부틸 에리트로마이신 A의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30을 사용하여 실시예 13a와 같은 방법으로실시한다. 실시예13a에 예시된 화합물이 생산되었다.
실시예 14a
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pIG1을 사용한 13-사이클로프로필 에리트로마이신 A의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pIG1 배양균을 6개의 280Oml 페른바하 플라스크에 접종한다. 각 플라스크에는 50mg의 티오스트렙톤이 함유된 수돗물 배지 1 L가 들어 있다. 28℃에서 24시간 동안 배양한 후 각개 플라스크에 사이클로프로판 카복실산 20Oppm을 가한다. 플라스크들은 8 L 흡기 발효통에 접종시킨다. 발효통들은 500갈론 시험용 용기에 들어 있는 314갈론의 ERY-P 배지에 접종하는데 사용하였다. 배양액을 27-29℃, pH 6.7-7.4에서 175rpm으로 교반하면서 분당 20 ft3/min.의 유속으로 통기하여 배양하였다. 33시간, 81시간, 및 117시간 후, 사이클로프로판카복실산(200mg/l)를 첨가하고, 계속하여 198시간 더 발효시켰다. 전체 육즙을 0.2㎛ 세라믹 필터(30 ft2; 유에스필터)로 여과하였다. 여액을 XAD-16 레진 칼람(12 L; 롬 앤드 하스)에 흡착시키고, 에틸아세테이트(60 L)로 용리하였다. 에틸아세테이트 용리액을 농축하여 껌상 물질(302 g)을 얻고, 여기에 2 L의 염화메틸렌을 가한다. 생성한 염화메틸렌 용액은 8 L의 250mM 중탄산나트륨 완충액(pH 9)로 세척한다. 에리트로마이신이 함유된 염화메틸렌 층을 분리하고 증발시켜 껌상 물질(200 g)을 얻고, 이 껌상 물질을 40% 메타놀(1O L)에 분산시켜 CG-161 레진 칼람(9L; 토소 하스)에 올렸다. 이어서 레진 칼람을 40% 메타놀(30 L)로 세척하고 이어서 75% 메타놀(8x1O L)와 순수 메타놀(3x1O L)로 순차적으로 용리시킨다. 미지의 물질을 포함하는 75% 메타놀 유분 5-8을 합치고 3.2 L로 될 때까지 증발 농축시킨다. 농축액은 pH 9로 조절하고 염화메틸렌 0.95 L를 가한 다음, 염화메틸렌 층을 분리하고 껌상 물질 12.4g이 얻어질 때까지 증발 농축시킨다. 껌상 물질(6 g)을 0.1% 트리플루오로아세틱 이소크라틱을 포함하는 메타놀:초산암모늄(50:50)의 이동상을 이용하는 크로마실 10㎛ C18 HPLC 칼람(75mmx25cm)를 사용하는 역상 HPLC에 의하여 215ml/min.의 유속으로 정제하였다. 미지의 생성물을 포함하는 유분들을 합치고(230ml) 증발 농축한 다음(110ml), 수산화나트륨을 사용하여 pH 9로 조절하고 염화메틸렌 50ml로 추출하였다. 염화메틸렌 층을 분리하고, 증발 건조시켜 부분적으로 순수한 생성물 630mg을 얻었다. 껌상 물질의 나머지 부분(1 g)은 0.1% 트리플루오로아세틱산을 포함하는 아세트니트릴:초산암모늄 구배(20:80) 내지 (25:75)의 이동상을 이용하는 메타켐 인서트실 10㎛C8 칼람(50mmx25cm)를 사용하는 역상 HPLC에 의하여 유속 125ml/min.로 50분 동안 정제하였다. 미지의 화합물을 포함하는 유분(28-46분)을 합치고 중탄산나트륨으로 포화시킨 다음, 염화메틸렌으로 추출하였다. 염화메틸렌 층을 분리하고 증발 건조시켜 부분적으로 순수한 생성물 361g을 얻었다. 이 부분적으로 순수한 생성물의 일부를, 예를 들면 0.1% 트리플루오로아세틱 이소크라틱을 포함하는 메타놀:초산암모늄(50:50)의 이동상을 이용하는 페노메넥스 프로디지 10㎛ C18 HPLC 칼람(50x250mm)를 사용하는 역상 HPLC에 의하여 1OOml/min.의 유속으로 정제하였다. 미지의 화합물을 포함하는 유분(27-31분)은 합치고 중탄산나트륨으로 포화시킨 다음, 염화메틸렌으로 추출하였다. 염화메틸렌 층을 분리하고 증발 건조시켜 부분적으로 순수한 생성물 361g을 얻었다. 이 부분적으로 순수한 생성물은 0.1% 트리플루오로아세틱 이소크라틱을 포함하는 메타놀:초산암모늄(50:50)의 이동상을 이용하는 페노메넥스 프로디지 10㎛ C18 HPLC 칼람(50x250mm)를 사용하는 역상 HPLC에 의하여 10Oml/min.의 유속으로 정제하였다. 미지의 화합물을 포함하는 유분(41-45분)은 합치고 중탄산나트륨으로 포화시킨 다음, 염화메틸렌으로 추출하였다. 염화메틸렌 층을 분리하고 증발 건조시켜 13-사이클로프로필 에리트로마이신(20mg)을 고체상태로 얻었다. 생성물의 구조는 MS와 NMR 스펙트로스코피(브룩커 디엠엑스 50OMz 스펙트로메터)에 의하여 다음과 같이 확인되었다.
HPLC 체류시간 - 방법 B - 5.6분
APCI-MS(M+H)+ m/e764에서 관찰, C38H68NO13에 요구되는 것이 764임.
[화학식]
실시예 14b
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30을 사용한 13-사이클로프로필 에리트로마이신 A의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30 배양균을 사용하여 실시예 14a와 동일한방법으로 실시한다. 실시예 14a와 동일한 화합물이 생성되었다.
실시예 15a
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pIG1을 사용한 13-(3-티에닐) 에리트로마이신 B의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pIG1 배양균을 30Oml 에렌마이어 플라스크에 들어 있는 수돗물 배지 50ml에 접종하였다. 28℃에서 48시간 동안 배양한 후 접종물 5ml을 300ml 에렌마이어 프라스크에 들어 있는 50ml의 ERY-P 배지에 접종하는데 사용하였다. 육즙을 28℃에서 배양하였다. 3-티오펜 카복실산의 N-아세틸시스테아민(메타놀 0.5ml 중의 20mg)을 24시간 후에 가하고 168시간 동안 발효를 계속한다. 전체 육즙의 pH는 수산화 나트륨 수용액을 사용하여 pH 8.5로 조절하고, 에틸아세테이트(50ml)로 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 분리하여 농축하고 건조한다. 시료는 HPLC-MS 분석을 위하여 메타놀 1 ml에 용해시킨다. 이 방법에 의하여 13-(3-티에닐) 에리트로마이신 B가 생산됨을 확인하였다.
HPLC 체류시간 - 방법 A - 20.0분
APCI-MS(M+H)+m/e772에서관찰, C39H66NO12S에 요구되는 것이 772임
실시예 15b
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pMD30을 사용한 13-(3-티에닐) 에리트로마이신 B의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 2338/pMD30을 사용하여 실시예 15a와 동일한 방법으로 실시하였다. 실시예 15a에 예시된 화합물이 생성되었다.
실시예 16
S. 에리트라에아 NRRL 18643을 사용한 6-디옥시-13-사이클로프로필 에리트로마이신 B의 제조
배양균 S. 에리트라에아 NRRL 18643, S. 에리트라에아의 eryF 돌연변이(Science, 1991, 5월, 252:114)를 2.8 L 페른바하 플라스크에 들어 있는 1L 수돗물 배지에 접종하였다. 29℃에서 24시간 동안 배양한 후 플라스크에 사이클로프로판카복실산(200ml)를 200rpm으로 교반하면서 첨가한다. 3일 동안 배양한 후, 하나의 플라스크는 14 L 발효통 내의 8 L 보족 ERY-P배지(60g/l 세렐로스, 30g/l 누트리소이 분말, 3g/l 황산암모늄, 5g/l NaCl, 5g/l 큰 스팁, 0.5g/l MgS04, 및 1 ml/l P2000)에 접종하는데 사용하였다. 배양액을 28℃에서 800rpm으로 교반하면서 8L/min.의 유속으로 통기하여 배양하였다. 배양액의 pH는 NaOH 또는 H2SO4(15%)를 사용하여 6.9와 7.3 사이로 유지하였다. 24시간 및 48시간 후에 사이클로프로판(1.6ml)을 가하였다. 두 번 발효시켜 발효에 총 163시간이 소요되었다. 전체 육즙의 pH는 수산화나트륨을 사용하여 pH 9로 조절하고 에틸아세테이트(16 L)로 추출하였다. 에틸아세테이트 추출물을 20 L 부치 회전 증발기에서 농축하여 유상물질을 얻었다. 유상 물질을 500ml의 염화메틸렌에 용해시키고, 500ml의 물을 가한 다음, 10% 수산화암모늄을 사용하여 물 층의 pH를 9로 조절하였다. 강력하게 흔든 후, 염화메틸렌 층을 수집하고 회전 증발기에서 증발시켜 오일상 잔류물 11.0g을 얻었다. 이 물질을 재차 250ml의 메타놀:물(4:6) 용액에 용해시키고, 80ml CG-161 레진 칼람(토소하스)에 올렸다. 칼람을 350ml의 메타놀:물(4:6) 용액으로 세척하고, 이어서 착색된 불순물이 칼람으로부터 용리되기 시작할 때까지 메타놀:물(7:3) 용액으로 세척한다(상 용량의 2배의 세척액이 소요됨). 이때 메타놀의 농도를 70%에서 100%로 변경시키면서 세척한다. 요구하는 생성물을 포함하는 유분을 증발 건조하고, 아세토니트릴: 완충액(0.0lM 초산암모늄, 0.02% 트리플루오로아세틱산 및 26% 아세토니트릴로 조성됨)(5:95)의 이동상을 이용하는 역상 10㎛ 크로마실 C18 HPLC 칼람에서 정제하였다. 뒤이어 40분 동안 이동상의 선상 그래디언트를 (5:95)에서 (33:67)까지 변경되도록 하였다. 요구하는 생성물을 포함하는 유분을 합치고 (530ml), 10% 수산화암모늄율 사용하여 pH를 9로 조절한 다음, 염화메틸렌(400ml)으로 추출하였다. 염화메틸렌 층을 분리하고 증발 건조하여 정제된 6-디욕시-13-사이클로프로필 에리트로마이신 B(12mg)을 얻었다. 생성물의 구조는 MS에 의하여 확인하였다.
HPLC 체류시간 - 방법 B - 21.4분
APCI-MS(M+H)+m/e714에서 관찰, C38H68NO12에 요구되는 것이 714임.
실시예 17
S. 에리트라에아 NRRL 18643을 사용한 6-디옥시-13-프로필 에리트로마이신 B의 제조
S. 에리트라에아 NRRL 18643는 YPD 한천(0.5% 디프코 효모 추출물, 0.5% 디프코 박토 펜톤, 0.25% 덱스트로스,0.5% MOPS, 1.7% 디프코 바스토 한천, pH 7)의 3일 패치로부터 250ml 에렌마이어 플라스크에 들어 있는 25ml의 YPD 육즙(0.5% 디프코 효모 추출물, 0.5% 디프코 박토 펜톤, 0.25% 덱스트로스, O.5% MOPS, pH 7)에 접종되었다. 플라스크를 225rpm으로 교반하면서 29℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양액 2.5ml을 ERY-P 배지(5% 덱스트로스, 3% 누트리소이 분말, 0.3% (NH4)2S04, O.5% NaCl, 0.6% CaC03, pH 7.0)에 접종하고 225rpm으로 교반하면서 29℃에서 총 6일 동안 배양하였다. 부틸산을 24시간, 72시간 및 120시간 마다 각각 40Oppm, 40Oppm 및 200ppm을 첨가하고, 1N NaOH를 사용하여 전체 육즙의 pH를 9.1로 조절하였다. 시료를 동량의 에틸아세테이트로 두 번 추출하고 에틸아세테이트층을 50℃의 수욕 상에서 질소의 존재하에 농축 건조한 다음, HPLC-MS 분석을 위하여 1.0ml의 현탁시킨다. 6-디옥시-13-프로필 에리트로마이신이 생성되었음을 확인하였다.
HPLC 체류시간 - 방법 C - 23.5분
APCI-MS(M+H)+m/e716에서 관찰, C38H70NO11에 요구되는 것이 716임.
실시예 18
항균성 시험
생체외 항균성 검사는 임상시험기준위원회(NCCLS)에서 발행한 ″항균력 디스크 감수성 시험에 대한 성능 기준-6판″; 승인기준에 따라 미량으로 실험하였다. 최저 억제농도(MICs)는 각종 미생물에 대하여 얻었다. 예를 들면 스타필로코커스 아우리우스 80CR5(마크로리드 감수성 균주)는 ≤ 0.1로부터 1.56㎍/ml 범위의 값을 갖는 것으로 나타났다.
상기의 식별자가 없습니다.

Claims (31)

  1. 일반식(1)의 화합물 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염.
    식 중, R1은 하나 또는 그 이상의 하이드록실 그룹으로 치환될수 있는 알파-분지된 C3-C6알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시알킬 또는 알킬티오알킬 그룹; 알킬 그룹이 알파-분지된 C2-C5알킬 그룹인 C5-C8사이클로알킬알킬 그룹; 메틸 그룹 또는 하나 또는 그 이상의 하하이드록실 또는 C1-C4알킬 그룹이나 할로겐 원자에 의하여 치환될수 있는 C3-C8사이클로알킬 또는 C5-C8사이클로알케닐 그룹; 또는 포화되거나 전부 또는 부분적으로 불포화될수 있고 하나 또는 그 이상의 C1-C4알킬 그룹이나 할로겐 원자에 의하여 치환될수 있는 3-6 멤버 산소 또는 유황 함유 헤테로사이클릭 링일수도 있고, R1은 또한 C1-C4알킬, C1-C4알콕시 및 C1-C4알킬티오 그룹, 할로겐 원자, 트리플루오로메틸, 및 시아노 그룹 중에서 선택된 최소한 하나의 치환기로 치환될 수 있는 페닐 그룹일수도 있으며; 또한 R1은 다음의 일반식(a)를 갖는 그룹일 수 있다.
    [일반식 a]
    [일반식 1]
    (식 중, X는 O, S 또는 -CH2- 이고, a, b, c 및 d는 0-2의 정수로서 a+b+c+d≤ 5의 조건을 충족시킬수 있는 정수임),
    R2는 H 또는 OH 이고, R3-R5는 각각 H, CH3또는 CH2CH3이며, R6는 H 또는 OH 이고, R7은 H, CH3또는 CH2CH3이며, R8은 H 또는 데소사민이고, R9은 H, CH3또는 CH2CH3이고, R10은 OH 또는 미카로스(R13이 H 임) 또는 크라디노스(R13이 CH3임), R11은 H이며, R10=R11=O 일수 있고, R12는 H, CH3또는 CH2CH3를 나타내며, 이러한 화합물의 일부는 하나 또는 그 이상의 -CHOH 또는 -CHOR 그룹이 케토 그룹에 의한 치환에 의하여 변질될수 있다.
  2. 일반식(2)의 화합물 및 약리적으로 허용되는 그들의 염.
    [일반식 2]
    상기 일반식에서, R1은 H; C1-C8알킬, C2-C8알케닐, C2-C8알키닐, 각개 알킬 또는 알콕시 그룹에 1-6개의 탄소원자를 포함하는 알콕시 알킬이나 알킬티오알킬(전술한 알킬, 알콕시, 알케닐 또는 알키닐 그룹들은 하나 또는 그 이상의 하이드록실 그룹이나 하나 또는 그 이상의 할로원자로 치환될수 있음);하나 이상의 메틸 또는 C1-C4알킬 그룹이나 할로겐 원자에 의하여 치환될수 있는 C3-C8사이클로알킬 또는 C5-C8사이클로알케닐 그룹;
    포화되거나 전부 또는 부분적으로 불포화될수 있고 하나 이상의 C1-C4알킬 그룹이나 할로겐 원자에 의하여 치환될수 있는 3-6 멤버 산소 또는 유황 함유 헤테로사이클릭 링; 또는 일반식 SR14로 표현되는 그룹(식 중, R14는 C1-C8알킬, C2-C8알케닐, C2-C8알키닐, C3-C8사이클로알킬, C5-C8사이클로알케닐, 페닐 또는 치환된 페닐(치환기는 하나 또는 그 이상의 C1-C4알킬 그룹이나 C1-C4알콕시 그룹 또는 할로겐 원자일수 있음); 또는 포화되거나 전부 또는 부분적으로 불포화될수 있고 하나 이상의 C1-C4알킬 그룹이나 할로겐 원자에 의하여 치환될수 있는 3-6 멤버 산소 또는 유황 함유 헤테로사이클릭 링일수 있으며, R2는 H 또는 OH 이고, R3-R5는 각각 H, CH3또는 CH2CH3이며, R6는 H 또는 OH 이고, R7은 H, CH3또는 CH2CH3이며, R8은 H 또는 데소사민이고, R9은 H, CH3또는 CH2CH3이고, R10은 OH 또는 미카로스(R13이 H임) 또는 크라디노스(R13이 CH3임)이며, R11은 H 이며, R10=R11=O 일수 있고, R12는 H, CH3또는 CH2CH3를 나타내는데, 이러한 정의는 R3-R5가 CH3이고, R7은 CH3이며, R9이 CH3인 경우 R1이 H 또는 C1알킬이 아니라는 전제하에 주어진 것이며, 전술한 화합물의 일부는 하나 또는 그 이상의 -CHOH 또는 -CHOR이 케토 그룹의 치환에 의하여 변질될수도 있다.
  3. 제1항에서, R1이 C3-C8사이클로알킬 또는 하나 또는 그 이상의 하이드록실 그룹이나 C1-C4알킬 그룹에 의하여 치환될수 있는 일반식(1)의 화합물.
  4. 제3항에서, R1이 사이클로프로필인 화합물.
  5. 제3항에서, R1이 사이클로부틸인 화합물.
  6. 제3항에서, R1이 사이클로펜틸인 화합물.
  7. 제3항에서, R1이 사이클로헥실인 화합물.
  8. 제1항에서, R1이 알파-분지된 C3-C8알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시알킬 및 알킬티오알킬 그룹 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 일반식(1)의 화합물.
  9. 제8항에서, R1이 이소프로필인 화합물.
  10. 제8항에서, R1이 이소부틸인 화합물.
  11. 제8항에서, R1이 2-부텐-2-일, 2-펜텐-2-일 및 4-메틸-2-펜텐-2-일 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 화합물.
  12. 제8항에서, R1이 1-메틸티오에틸인 화합물.
  13. 제1항에서, R1이 하나 또는 그 이상의 하이드록실 그룹이나 C1-C4알킬 그룹 또는 할로겐 원자로 치환될수 있는 5 또는 6 멤버 산소 또는 유황 함유 헤테로사이클릭 링임을 특징으로 하는 일반식(1)의 화합물.
  14. 제13항에서, R1이 3-티에닐인 화합물.
  15. 제13항에서, R1이 3-푸라닐인 화합물.
  16. 제1항에서, R1이 페닐인 화합물.
  17. 제1항에서, R1이 a와 b가 O이고, c와 d가 1이며, x가 -CH2-인 일반식(a)로 표시된 그룹임을 특징으로 하는 화합물.
  18. 제1항에서, R1이 a와 b가 O이고, c가 1이며, d가 2이고, x가 -CH2-인 일반식(a)로 표시된 그룹임을 특징으로 하는 화합물.
  19. 제1항에서, R1이 a와 b가 O이고, c가 1이며, d가 2이고, x가 -CH2-인 일반식(a)로 표시된 그룹임을 특징으로 하는 화합물.
  20. 제2항에서, R1이 SR14와 R14가 메틸 또는 에틸인 화합물.
  21. 제2항에서, R1이 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필 또는 세칸다리뷰틸인 화합물.
  22. 제2항에서, R1이 1-(트리플루오로메틸)에틸인 화합물.
  23. 일반식 R1COOH(식 중, R1은 청구항 1 또는 2에서 정의된 의미를 갖는다) 또는 그들의 염, 에스텔 또는 아미드, 또는 그들의 산화성 전구물질의 존재하에 에리트로마이신을 생산할수 있는 미생물을 발효시켜 일반식(1) 또는 (2)의 화합물을 분리하는 일반식(1) 또는 (2)의 화합물을 제조하는 방법.
  24. 제23항에서, 미생물이 사카로폴리스포라 에리트라에아이고, 이 미생물은 일반식(1)의 화합물을 생합성할수 있는 효과적으로 결합된 플라스미드를 포함할수도 있고, 이 플라스미드는 Type II PKS 조촉매/활성화제를 포함할수도 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에서, 효과적으로 결합된 플라스미드가 미생물 사카로폴리스포라 에리트라에아가 일반식(1)의 화합물을 생합성할수 있는 효과적으로 결합된 플라스미드를 포함할수도 있는 균주 NRRL 2338, 18643 또는 21484루부터 선발한 것이고 전술한 플라스미드는 actI 또는 그 활성화 유전자 actII-orf4를 포함할수도 있음을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에서, 효과적으로 결합될수 있는 플라스미드가 pAVLD, pIG1, pND30, pCJR26, pCJR49, pC-AT12, pCATX 또는 그들의 유사 구조체임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25항에서, 미생물이 S. 에리트라에아 ERMD1, S. 에리트라에아 NRRL 2338/pIG1, S. 에리트라에아 NRRL 2338/pND30 또는 기타 유사한 형질전환체임을 특징으로 하는 방법.
  28. 약리학적으로 유효한 량의 일반식(1) 또는 (2)의 화합물과 약리학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물.
  29. 일반식(1) 또는 (2)의 화합물의 치료 유효량을 포유동물, 조류 또는 어류에 투여하여 포유동물, 조류 또는 어류의 세균 또는 원충에 의한 감염 또는 감염에 관련되는 질병을 처치하는 방법.
  30. 포유동물, 조류 또는 어류의 세균감염을 처치하기 위한 의약품 제조에 사용되는 일반식(1) 또는 (2)에 표시된 화합물의 용도.
  31. 포유동물, 조류 및 어류의 성능(중량, 급이효능, 우유 수화량 등)을 향상시키는 일반식(1) 또는 (2)로 표시된 화합물의 용도.
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