[go: up one dir, main page]

KR102789429B1 - 림프구에 유전자를 고 수준으로 안정적으로 전달하는 방법 - Google Patents

림프구에 유전자를 고 수준으로 안정적으로 전달하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102789429B1
KR102789429B1 KR1020187010577A KR20187010577A KR102789429B1 KR 102789429 B1 KR102789429 B1 KR 102789429B1 KR 1020187010577 A KR1020187010577 A KR 1020187010577A KR 20187010577 A KR20187010577 A KR 20187010577A KR 102789429 B1 KR102789429 B1 KR 102789429B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell
delete delete
cells
dna
transferase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020187010577A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180054718A (ko
Inventor
미카엘 후드첵
졸탄 이빅스
Original Assignee
율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크 filed Critical 율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크
Publication of KR20180054718A publication Critical patent/KR20180054718A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102789429B1 publication Critical patent/KR102789429B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4203—Receptors for growth factors
    • A61K40/4204—Epidermal growth factor receptors [EGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/50—Vectors for producing vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본원에 개시된 방법은 림프구 및 기타 포유류 세포에 전이유전자를 안정적으로 삽입하는데 있어서 전례 없는 효율, 융통성, 활용성 및 속도를 제공하는 새로운 기술을 개시한다. 이러한 새로운 방법은 mRNA-코딩된 전이효소 (예, 슬리핑 뷰티 전이효소)와 미니서클 DNA-코딩된 전이성 인자의 조합의 사용을 기반으로 한다. 새로운 방법은, DNA-코딩된 전이성 인자를 플라스미드 DNA-코딩된 전이효소와 조합하여 사용하는 기존 방식에 비해, 보다 우수한 유전자-전달율을 달성할 수 있으며, 동시에 독성이 낮다. 본 발명의 용도는, 비-제한적으로, 면역 수용체 (예, T 세포 수용체 또는 합성 키메라 항원 수용체)를 코딩하는 전이유전자의 인간 T 림프구내 안정적인 삽입을 포함하며, 면역 수용체는 종양 세포에 의해 발현되는 분자에 대한 특이성을 부여한다. 전이효소 mRNA 및 트랜스포존 미니서클 DNA는 비-제한적인 예로 전기천공 및 뉴클레오펙션 등의 전기적 전달 등의 방법에 의해 림프구로 도입될 수 있다.

Description

림프구에 유전자를 고 수준으로 안정적으로 전달하는 방법
본 발명은 유전자 전달 방법 및 기법과, 면역치료 방법 및 기법에 관한 것이다.
유전자 변형된 세포 및 조직은 살아있는 유기체에서 진단 및 치료학적 용도로의 활용이 증가하고 있다. 유전자 변형은, 예를 들어, 하나 또는 수개의 전이유전자 (transgene)를 도입하여 세포에 새로운 특성을 부여하거나, 또는 특정한 특성과 기능을 조절 또는 제거하기 위해 하나 또는 수개의 유전자 변형인자를 도입함으로써 수행된다. 이러한 유전자-조작된 세포의 치료학적 용도로서 의미있는 예는 종양 세포에 의해 발현되는 분자를 인지하는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 합성 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자-전달에 의해 변형되어, 항-종양 특이성을 부여하는 조작된 T 세포를 이용하는 것이다. 화학요법 및 방사선요법에 내성을 나타내는 진행형 악성 종양을 가진 환자를 대상으로 한 임상 실험과 전-임상 종양 모델에서, 이러한 조작된 TCR- 및 CAR-변형된 T 세포의 항-종양 기능과 치유적 효능에 대한 강력한 증거가 존재한다 (Hudecek Blood 2010; Hudecek Cancer Immunol Res 2013; Hudecek Cancer Immunol Res 2015; Hudecek Leukemia 2015; Kalos Science Transl Med 2011; Grupp N Engl J Med 2013; Davila Science Transl Med 2014; Maude N Engl J Med 2014).
T 세포로의 유전자 전달을 달성하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 전략은 바이러스 전달 시스템, 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이다. 바이러스 전달 시스템이 TCR 및 CAR 등의 전이유전자를 인간 T 림프구에 안정적으로 전달하기 위해 사용되어 왔으며, 전-임상 및 임상 용도의 종양-반응성 TCR/CAR T 림프구를 구축할 수 있었다. 예를 들어, 특히, CD19에 특이적인 합성 키메라 항원 수용체 (CAR)를 보유한 조작된 T 세포가 파일롯 실험들에서 B 세포 악성에 대하여 주목할만한 효능을 보여주었다1 -3. CD19-CAR T 세포 요법의 효능을 보여주는, 지금까지 발표된 모든 임상 실험들에서, 삽입형 렌티바이러스 (LV) 또는 γ-레트로바이러스 (RV) 벡터가 CAR 유전자 전달 및 발현을 달성하기 위해 채택되었다. 그러나, 전이유전자가 시간이 경과됨에 따라 침묵화될 바람직하지 않은 가능성, 게놈의 전사 활성 부위에 다른 유전자 (예, 온코진)의 부적절한 활성화 및 유전독성 (genotoxicity)이 우선적으로 삽입될 가능성; 뿐만 아니라 삽입형 바이러스의 제조, 보관 및 취급에 있어 높은 비용과 번거로운 수고 등의 문제가 있고, 특히 후자의 문제는 치료학적 용도로 유전자-변형된 T 세포를 제조하기 위한 보다 광범위한 활용을 어렵게 하는 등의, 바이러스 유전자-전달 벡터의 사용과 관련하여 개념 상의, 기술 상의 및 전략 상의 문제들이 다수 존재한다. 즉, 안전성 뿐만 아니라 국제적 수준에서 CAR T 세포 요법을 확립하기 위해 요구되는 벡터 생산 비용 및 규모 측면에서 바이러스 벡터와 관련된 문제들이 계속적으로 존재한다.
안정적인 유전자-전달을 달성하기 위한 또 다른 전략은 트랜스포존 (transposon) 기법이다. 트랜스포존 또는 전이성 인자 (transposable element, TE)는 숙주 세포의 게놈에 안정적으로 삽입될 수 있는 능력을 가진 유전 인자로서, 이러한 과정을 전위 (transposition)라 한다 (Ivics Mobile DNA 2010). TE는 1950년대에 바바라 매클린턱에 의해 옥수수 유전자 실험에서 주장되었지만, 전위에 대한 최초의 기능성 모델은 1970년 후반에 박테리아 TE에서 확인되었다 (Shapiro PNAS 1979). 한편, TE가 모든 유기체의 게놈에 존재한다는 것은 명백한 사실이며, 게놈 서열분석을 통해 인간 게놈의 약 45%가 트랜스포존으로부터 유래된 것으로 확인되었다 (International Human Genome Sequencing Consortium Nature 2001). 그러나, 기능성 (또는 자율적인) TE가 동정된 무척추동물과는 대조적으로, 인간과 대부분의 고등 척추동물은 기능성 TE를 가지고 있지 않다. TE의 돌연변이 가능성에 맞서는 진화 선택압에 의해 수백만년 전에 진화 과정 중에 기능적으로 불활성화된 것으로 추정된다.
자율적인 TE는, 2개의 역위된 말단 반복 서열 (inverted terminal repeat sequence, ITR) 사이에 위치한 효소인 전이효소 (transposase)를 코딩하는 DNA를 포함하며, ITR은 이들 ITR 사이에 코딩되어 있는 전이효소에 의해 인지되고, 임의의 이중 가닥 DNA 서열로의 TE의 전위를 촉매할 수 있다. 트랜스포존에는 2가지 유형이 존재하는데, 클래스 I 또는 레트로트랜스포존은 RNA 매개 및 "복사 및 붙이기" 기전을 통해 이동하고, 클래스 II 또는 DNA 트랜스포존은 절개-삽입 또는 "절단 및 붙이기" 기전을 통해 이동한다 (Ivics Nat Methods 2009). 박테리아, 하등 진핵생물 (예, 효모) 및 무척추동물의 트랜스포존은 대체적으로 종 특이적인 것으로 보이며, 그래서 척추 동물의 세포에서는 효과적인 DNA 전위에 이용될 수 없다. 어류 유래 비활성형 TE의 "슬리핑 뷰티"로 지칭되는 서열 셔플링을 통해 최초의 활성형 트랜스포존이 인공적으로 구축된 (Ivics Cell 1997) 이후에야 비로서, 인간 세포 등의 척추동물 세포로 전위를 통한 DNA 삽입을 성공적으로 달성하는 것이 가능해졌다. 슬리핑 뷰티는 트랜스포존의 Tcl/marine rfamily에 속하는 클래스 II DNA 트랜스포존이다 (Ni Genomics Proteomics 2008). 그 동안 추가적인 기능성 트랜스포존들이 초파린, 개구리 및 심지어 인간 게놈 등의 여러가지 종들에서 동정 및 재구축되었으며, 이들 모두 척추 동물 및 인간 숙주 세포 게놈내로의 DNA의 전위를 허용하는 것으로 나타났다. 이들 트랜스포존 각각은 전위 효율, 발현 안정성, 유전자 탑재력 (payload capacity) 등과 관련된 장점과 단점을 가지고 있다.
Davila ML, Riviere I, Wang X, et al. Efficacy and toxicity management of 19-28z CAR T cell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia. Sci Transl Med. 2014;6(224):224ra225. Maude SL, Frey N, Shaw PA, et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med. 2014;371(16):1507-1517. Kochenderfer JN, Dudley ME, Kassim SH, et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. J Clin Oncol. 2015;33(6):540-549. Izsvak Z, Hackett PB, Cooper LJ, Ivics Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 2010;32(9):756-767. Ivics Z, Izsvak Z. Nonviral gene delivery with the sleeping beauty transposon system. Hum Gene Ther. 2011;22(9):1043-1051. Aronovich EL, McIvor RS, Hackett PB. The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. Hum Mol Genet. 2011;20(R1):R14-20. Swierczek M, Izsvak Z, Ivics Z. The Sleeping Beauty transposon system for clinical applications. Expert Opin Biol Ther. 2012;12(2):139-153. Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH, Izsvak Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 1997;91(4):501-510. Mates L, Chuah MK, Belay E, et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 2009;41(6):753-761. Peng PD, Cohen CJ, Yang S, et al. Efficient nonviral Sleeping Beauty transposon-based TCR gene transfer to peripheral blood lymphocytes confers antigen-specific antitumor reactivity. Gene Ther. 2009;16(8):1042-1049. Field AC, Vink C, Gabriel R, et al. Comparison of lentiviral and sleeping beauty mediated alphabeta T cell receptor gene transfer. PLoS One. 2013;8(6):e68201. Huang X, Guo H, Kang J, et al. Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies. Mol Ther. 2008;16(3):580-589. Jin Z, Maiti S, Huls H, et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 2011;18(9):849-856. Singh H, Manuri PR, Olivares S, et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 2008;68(8):2961-2971. Singh H, Huls H, Kebriaei P, Cooper LJ. A new approach to gene therapy using Sleeping Beauty to genetically modify clinical-grade T cells to target CD19. Immunol Rev. 2014;257(1):181-190. Singh H, Figliola MJ, Dawson MJ, et al. Manufacture of clinical-grade CD19-specific T cells stably expressing chimeric antigen receptor using Sleeping Beauty system and artificial antigen presenting cells. PLoS One. 2013;8(5):e64138. June CH, Riddell SR, Schumacher TN. Adoptive cellular therapy: a race to the finish line. Sci Transl Med. 2015;7(280):280ps287. Ramos CA, Savoldo B, Dotti G. CD19-CAR trials. Cancer J. 2014;20(2):112-118. Mayrhofer P, Schleef M, Jechlinger W. Use of minicircle plasmids for gene therapy. Methods Mol Biol. 2009;542:87-104. Chen ZY, He CY, Ehrhardt A, Kay MA. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Mol Ther. 2003;8(3):495-500. Kay MA, He CY, Chen ZY. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nat Biotechnol. 2010;28(12):1287-1289. Mayrhofer P, Blaesen M, Schleef M, Jechlinger W. Minicircle-DNA production by site specific recombination and protein-DNA interaction chromatography. J Gene Med. 2008;10(11):1253-1269. Chabot S, Orio J, Schmeer M, Schleef M, Golzio M, Teissie J. Minicircle DNA electrotransfer for efficient tissue-targeted gene delivery. Gene Ther. 2013;20(1):62-68. Kobelt D, Schleef M, Schmeer M, Aumann J, Schlag PM, Walther W. Performance of high quality minicircle DNA for in vitro and in vivo gene transfer. Mol Biotechnol. 2013;53(1):80-89. Sharma N, Cai Y, Bak RO, Jakobsen MR, Schroder LD, Mikkelsen JG. Efficient sleeping beauty DNA transposition from DNA minicircles. Mol Ther Nucleic Acids. 2013;2:e74. Cui Z, Geurts AM, Liu G, Kaufman CD, Hackett PB. Structure-function analysis of the inverted terminal repeats of the sleeping beauty transposon. J Mol Biol. 2002;318(5):1221-1235. Hudecek M, Sommermeyer D, Kosasih PL, et al. The nonsignaling extracellular spacer domain of chimeric antigen receptors is decisive for in vivo antitumor activity. Cancer Immunol Res. 2015;3(2):125-135. Wang X, Chang WC, Wong CW, et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 2011;118(5):1255-1263. Hudecek M, Lupo-Stanghellini MT, Kosasih PL, et al. Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1-specific chimeric antigen receptor T cells. Clin Cancer Res. 2013;19(12):3153-3164. Hudecek M, Schmitt TM, Baskar S, et al. The B-cell tumor-associated antigen ROR1 can be targeted with T cells modified to express a ROR1-specific chimeric antigen receptor. Blood. 2010;116(22):4532-4541. Brown CE, Wright CL, Naranjo A, et al. Biophotonic cytotoxicity assay for high-throughput screening of cytolytic killing. J Immunol Methods. 2005;297(1-2):39-52. Sommermeyer D, Hudecek M, Kosasih PL, et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells derived from defined CD8 and CD4 subsets confer superior antitumor reactivity in vivo. Leukemia. 2015. Frigault MJ, Lee J, Basil MC, et al. Identification of chimeric antigen receptors that mediate constitutive or inducible proliferation of T cells. Cancer Immunol Res. 2015;3(4):356-367. Zayed H, Izsvak Z, Walisko O, Ivics Z. Development of hyperactive sleeping beauty transposon vectors by mutational analysis. Mol Ther. 2004;9(2):292-304. Wang GP, Levine BL, Binder GK, et al. Analysis of lentiviral vector integration in HIV+ study subjects receiving autologous infusions of gene modified CD4+ T cells. Mol Ther. 2009;17(5):844-850. Vigdal TJ, Kaufman CD, Izsvak Z, Voytas DF, Ivics Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 2002;323(3):441-452. Schones DE, Cui K, Cuddapah S, et al. Dynamic regulation of nucleosome positioning in the human genome. Cell. 2008;132(5):887-898. Papapetrou EP, Lee G, Malani N, et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2011;29(1):73-78. Sadelain M, Papapetrou EP, Bushman FD. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nat Rev Cancer. 2012;12(1):51-58. Izsvak Z, Ivics Z, Plasterk RH. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 2000;302(1):93-102. Lukacs GL, Haggie P, Seksek O, Lechardeur D, Freedman N, Verkman AS. Size-dependent DNA mobility in cytoplasm and nucleus. J Biol Chem. 2000;275(3):1625-1629. Wilber A, Frandsen JL, Geurts JL, Largaespada DA, Hackett PB, McIvor RS. RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues. Mol Ther. 2006;13(3):625-630. Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 2003;302(5644):415-419. Yant SR, Wu X, Huang Y, Garrison B, Burgess SM, Kay MA. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 2005;25(6):2085-2094. de Jong J, Akhtar W, Badhai J, et al. Chromatin landscapes of retroviral and transposon integration profiles. PLoS Genet. 2014;10(4):e1004250. Grabundzija I, Irgang M, Mates L, et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Mol Ther. 2010;18(6):1200-1209. Huang X, Guo H, Tammana S, et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 2010;18(10):1803-1813. Maldarelli F, Wu X, Su L, et al. HIV latency. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 2014;345(6193):179-183. Voigt K, Gogol-Doring A, Miskey C, et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 2012;20(10):1852-1862. Ivics Z, Katzer A, Stuwe EE, Fiedler D, Knespel S, Izsvak Z. Targeted Sleeping Beauty transposition in human cells. Mol Ther. 2007;15(6):1137-1144. Morgan M, Anders S, Lawrence M, Aboyoun P, Pages H, Gentleman R. ShortRead: a bioconductor package for input, quality assessment and exploration of high-throughput sequence data. Bioinformatics. 2009;25(19):2607-2608. Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzberg SL. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 2009;10(3):R25. Quinlan AR, Hall IM. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 2010;26(6):841-842. Barski A, Cuddapah S, Cui K, et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 2007;129(4):823-837. Zhang Y, Liu T, Meyer CA, et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 2008;9(9):R137. Bejerano G, Pheasant M, Makunin I, et al. Ultraconserved elements in the human genome. Science. 2004;304(5675):1321-1325. Monjezi R, Miskey C, Gogishvili G, et al. Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 2016 Aug 5, DOI: 10.1038/leu.2016.180.
본원에 개시된 방법은 림프구 및 기타 포유류 세포에 전이유전자를 안정적으로 삽입하는데 있어서 전례 없는 효율, 융통성, 활용성 및 속도를 제공하는 새로운 기술이다. 이러한 새로운 방법은 미니서클 DNA-코딩된 전이성 인자와의 조합으로 mRNA-코딩된 전이효소의 사용을 기반으로 한다. 새로운 방법은, DNA-코딩된 전이성 인자를 플라스미드 DNA-코딩된 전이효소와 조합하여 사용하는 기존 방식에 비해, 보다 우수한 유전자-전달율을 달성할 수 있으며, 동시에 독성은 낮다.
하기 효과들이 본 발명에 따른 미니서클에 의해 달성되는 우수한 유전자-전달율에 기여할 것이다:
- 플라스미드와 비교해 미니서클의 반감기가 더 길다
- 미니서클이 플라스미드와 비교해 세포질을 통과해 핵으로 이동하기 더 용이하다
- 트랜스포존은 큰 환형 플라스미드와 비교해 작은 슈퍼코일형 MC로부터 더 쉽게 이동한다.
본 발명에 있어서, 이러한 효과들은 미니서클로 한정되지 않으며, DNA가 전이성 인자의 공여 플라스미드로서 적합한 통상적인 플라스미드 보다 크기가 작은 한, 전이유전자용 발현 카세트를 포함하는 전이성 인자를 코딩하는 임의의 그외 DNA에도 적용가능하다. 즉, 본 발명에서, 전이유전자용 발현 카세트를 포함하는 전이성 인자를 코딩하는 임의의 DNA가 사용될 수 있으며, 단, 전이성 인자를 코딩하는 DNA는 후술한 전이성 인자를 코딩하는 DNA이다.
본 발명에 따라 달성되는 높은 유전자-전달율로 인해, 본 발명의 방법 및 용도는 우수 의약품 제조 관리 기준 (good manufacturing practice, GMP) 하에 달성될 것이다. 예를 들어, 본 발명을 사용해 CAR T 세포를 구축하는 경우, CD3/CD28 자극을 이용해 형질감염 전에 T 세포를 활성화할 수 있으며, 당해 기술 분야의 최신 방법과 달리, 본 발명은 치료학적으로 적절한 용량의 CAR T 세포를 수득하기 위해 CAR T 세포 증식에 피더 세포를 사용할 필요가 없다.
본 발명에서, (플라스미드 DNA와 비교해) 소량의 형질감염된 미니서클은, 미니서클로 인해 발생하는 독성을 낮추는데 도움이 된다. 즉, 이러한 효과는 미니서클에만 한정되지 않으며, 전이유전자용 발현 카세트를 포함하는 전이성 인자를 코딩하는 임의의 다른 DNA에도 적용되며, 단 이 DNA는 전이성 인자에 공여 플라스미드로서 적합한 통상적인 플라스미드 보다 작은 크기를 가진다. 따라서, 본 발명에서, 전이성 유전자에 대한 발현 카세트를 포함하는 전이성 인자를 코딩하는 임의의 DNA도 사용될 수 있으며, 단, 전이성 인자를 코딩하는 DNA는 후술한 전이성 인자를 코딩하는 DNA이다.
본 발명의 다른 이점은 미니서클에 항생제 내성 유전자가 없어, 항생제 내성 유전자의 숙주 박테리아로의 수평적인 유전자 전달 및 항생제 내성 유전자의 숙주 게놈내로의 비-의도적인 삽입이 배제된다는 것이다.
본 발명에서, mRNA는 전이효소의 공급원으로서 사용될 수 있는 것으로 확인되었다. 이 결과는, 수명이 짧은 mRNA가 본 발명에서 전이효소를 충분한 양으로 공급하기에 적합한 공급원인지는 알려진 바 없었으므로, 예상되지 않았다. 본 발명에서 전이효소의 공급원으로서 mRNA의 사용은 2가지 이점이 있다: 첫째, mRNA에 의해 공급되는 전이효소는 수명이 짧아, 이미 삽입된 전이효소가 다시 이동할 위험성이 낮다. 둘째, mRNA로서 전이효소의 공급은, 게놈에 삽입된 트랜스포존의 제어불가한 연속적인 전위를 야기할 수 있는, 전이효소 발현 카세트의 숙주 게놈내 비-의도적인 삽입 위험성이 없다.
또한, 본 발명은, 전이유전자를 운반하는 트랜스포존의 인접-무작위 삽입을 제공하면서도 높은 수준으로 발현되거나 또는 암과 관련된 유전자를 선호하지 않는다는 점에서, 유익하다. 또한, 본 발명을 이용할 경우, LV 삽입과 비교해 현저하게 높은 비율의 게놈 안전 지대 (safe harbor)로의 전이유전자 삽입이, 랜덤 삽입시 예상되는 퍼펙트 스코어에 가깝게 이루어진다. 이에, 본 발명은 비-바이러스성 전위 (virus-free transposition)를 이용해 림프구 (예, CAR T 세포)와 같은 재조합 포유류 세포를 제조하는데 이용할 수 있다. 본 발명의 벡터의 탁월한 안전성 프로파일, 높은 수준의 안정적인 전위율 및 취급 용이성으로 인해, 본 발명은 예를 들어 진보된 세포 및 유전자 요법에서, 바람직한 유전자-전달 전략이 된다.
본 발명의 용도는, 비-제한적으로, 면역 수용체 (예, T 세포 수용체 또는 합성 키메라 항원 수용체)를 코딩하는 전이유전자를 인간 T 림프구에 안정적으로 삽입하는 것을 포함하며, 면역 수용체는 종양 세포에 의해 발현되는 분자에 대한 특이성을 부여한다. 전이효소 mRNA 및 트랜스포존 미니서클 DNA는, 비-제한적인 예로, 전기천공 (electroporation) 및 뉴클레오펙션과 같은 전기적 전달 등의 방법으로 림프구에 도입될 수 있다.
도 1. 미니서클 DNA와 SB100X mRNA.
(A) 미니서클 (MC) DNA 제조의 개략도. MC-DNA 인자는 모 플라스미드로부터 PhiC31 인테그라제에 의해 매개되는 부위 특이적인 분자내 재조합에 의해 제조된다. 모 플라스미드 DNA는, 궁극적으로 박테리아 백본을 자르지만 MC-DNA는 절단하지 않는, 조작된 수개의 I-SceI 제한효소 부위를 포함한다. MC-DNA는 전이유전자와 프로모터만 포함하고 있으며, 박테리아 복제 오리진 또는 항생제 내성 마커는 더 이상 운반하지 않는다.
(B) 부위 특이적인 분자내 재조합을 통해 기존의 모 플라스미드로부터 제조되는 MC 벡터의 개략도. MC는 전이유전자와 프로모터만 포함하며, 박테리아 복제 오리진과 항생제 내성 유전자는 포함하지 않는다. EF1, 연장 인자-1 α 프로모터; CMV, 사이토메갈로바이러스 프로모터; ORI, 박테리아 복제 오리진; AntibioR, 항생제 내성 유전자; LIR, 좌측 역위 반복체; RIR, 우측 역위 반복체; 오픈 서클 = 재조합 부위.
(C) 제한효소 분해 및 겔 전기영동에 의한 정제된 MC DNA 분석. MC-GFP, MC-CD19 CAR 또는 MC-SB100X 250 ng을 PmeI 또는 PacI로 절단하고, 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 분석한다. 레인 M: 1kbp DNA ladder (PlasmidFactory); 레인 1: PacI 절단된 MC-GFP; 레인 2: PmeI 절단된 MC-CD19 CAR; 레인 3: PmeI 절단된 MC-SB100X.
(D) 시험관내 전사된 SB100X mRNA의 겔 전기영동 분석. ARCA 캡핑된 SB100X mRNA는 변성 아가로스 겔에서 개별 단일 밴드로서 약 1400 bp 위치에 이동한다. 레인 M: RNA 마커 (FlashGel, Lonza); 레인 1: SB100X mRNA.
도 2. MC-DNA에서 최고 전위를 달성하기 위한 SB100X mRNA 적정 (titration).
(A) T 림프구의 SB-매개 리프로그래밍 프로토콜. T 세포를 anti-CD3/anit-CD28 마이크로비드로 약 36시간 동안 활성화한 다음 전이효소 (플라스미드-DNA, MC-DNA 또는 mRNA) 및 트랜스포존 도너 (플라스미드-DNA 또는 MC-DNA)를 4D-뉴클레오펙터 시스템을 이용해 공동-형질감염시킨다. 일련의 유세포 측정 분석으로 전이유전자-양성 T 세포의 %를 측정한다. 전형적인 실험에서는, 트랜스포존에 CD19-특이 CAR을 코딩하는 전이유전자가 포함된다. 본원에서는, 전이유전자-양성 T 세포를 전이유전자 카세트에 함유된 tEGFR 형질도입 마커를 이용해 농화하고, 기능성 검사 수행 전에 CD19+ EBV-형질전환된 B 세포 (TM-LCL)로 7일간 항원-특이적인 자극을 통해 증폭시켰다.
(B) mRNA SB100X 및 MC-CD19 CAR (mRNA-MC), 플라스미드 (P-P) 또는 MC-DNA (MC-MC)를 지정된 비율로 사용해 뉴클레오펙션한 CD8+ T-세포주에서, 14일째 tEGFR 발현에 대한 유세포 측정 분석. 2x10e6 T 세포의 뉴클레오펙션에 사용된 양: P-P: SB100X DNA 1㎍ + pT2 1㎍; MC-MC: P-P와 동일 몰량; mRNA-MC: Mc-MC에서와 같이 동량의 MC (P-P와 동일 몰량), mRNA의 배수. Mock = 전이효소 및 트랜스포존 비-함유 용액에서 뉴클레오펙션을 수행하였다.
(C) SB100X mRNA, 및 MC-CD19 CAR, P-P 또는 MC-MC를 여러가지 비율로 사용해 형질감염시킨 후, 형질감염 후 14일째 tEGFR의 발현 비교. 데이타는 3번의 독립 실험들의 평균 ± SD로 표시한다. 스튜던트 t 검정으로 통계학적 분석을 수행하였으며, *p<0.01, **p<0.001은 데이타 간 통계학적으로 유의한 차이를 의미한다.
(D) 유전자-변형된 CD8+ T 세포의 생존성 및 증식. 형질감염 후 48시간째에, 살아있는 T 세포 %를 측정하기 위해 7-AAD 염색을 수행하였다 (점 그래프 및 좌측 다이아그램). CAR-변형된 T 세포의 수율을 형질감염 후 14일까지 수득되는 EGFRt+ T 세포의 절대 값 및 %로부터 계산하였다 (우측 다이아그램). 데이타는 평균 ± SD로 표시된다.
도 3. MC-DNA로부터 SB100X mRNA를 이용한 전위는 유전자 전달율과 타겟 세포 생존성을 기존 플라스미드-DNA를 이용한/로부터의 전위에 비해 향상시킨다.
(A) 플라스미드 (P-P), 미니서클 DNA (MC-MC, 동일 몰량) 또는 SB100X mRNA, 및 MC-CD19 CAR (mRNA-MC, 비율 4:1)을 형질감염하고, 형질감염 후 14일째 tEGFR 양성 T 세포의 %.
(B), (C) P-P, MC-MC 또는 mRNA-MC의 형질감염 후, tEGFR 또는 GFP 발현 및 세포 생존성 비교. tEGFR 또는 GFP 발현 및 세포 생존성을 유세포 측정으로 분석하였다. 6회 (B) 또는 3회 (C) 독립적인 실험들의 평균 ± SD를 나타낸다. 통계학적 분석은 스튜던트 t 검정을 이용해 수행하였다. *p<0.01, **p<0.001, ***p<0.001은 데이터 간 통계학적으로 유의한 차이를 의미한다.
(D) P-P, MC-MC 또는 mRNA-MC의 형질감염 후 유세포 측정 분석으로 조사한, IL-2 첨가 배양시 28일간 tEGFR의 표면 발현 안정성.
(E) P-P, MC-MC 또는 mRNA-MC의 형질감염 후 2주 이내의 T 세포 증식. CD8+ T 세포 수는 트리판 블루 배제 염색으로 계수하여 측정하였다. 세포의 총 수 (좌측 그래프) 및 유전자 변형된 세포 수 (우측 그래프)를 도시한다. 데이타는 3번의 독립적인 실험들의 평균 ± SD를 표시한다.
도 4. 렌티바이러스 형질도입 또는 트랜스포존 시스템을 이용해 제조된 CD19 CAR 발현성 T 세포의 시험관내 작동자 기능 비교.
(A) tEGFR 농화 및 피드 세포를 이용한 특이적인 증폭 후 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 tEGFR 발현을 도시한 유세포 측정의 점 그래프.
(B) CD19+ 발현 및 대조군 종양 세포주에서 렌티바이러스 형질도입 (LV) 또는 트랜스포존 시스템 (P-P, MC-MC 또는 mRNA-MC)을 이용해 구축한 CD19 CAR 발현성 CD8+ T 세포의 특이적인 세포독성. 세포용해 % 값은 모의 대조군 T 세포주의 값에 대해 정규화된다. 3번의 독립 실험들에서 K562/CD19에 대한 세포독성 데이타 (E: T=10:1)를 정규화하고 (모의 세포에 의한 세포독성 활성), 일원식 ANOVA로 분석한다.
(C) CD19+ 발현성 종양 세포주와 함께 공동-배양한 후 24시간 후 수득한 상층액에서의 사이토카인 방출 분석. 데이타는 3번의 독립 실험들에서 수득한 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 IFN-γ 또는 IL-2 생산 결과를 평균 ± SD로 표시하며, 일원식 ANOVA로 분석한다.
(D) CD19 발현성 타겟 세포주로 자극한 지 72시간 후 CD19 CAR T 세포를 외인성 사이토카인을 첨가하지 않고 증식시키고, 이를 CFSE 염료 희석에 의해 분석하였다. 분석을 위해, 3세트 웰을 수집하고, 살아있는 7AAD-, CD8+ 또는 CD4+ T 세포주의 증식을 분석하였다. 세포 분열 지수를 3번의 독립 실험들에서 계산하고, 데이타를 일원식 ANOVA로 분석하였다.
(E) 도 4d에 도시된 실험의 반복: K562/CD19+ 타겟 세포로 자극 후 72시간 이내에 CFSE 염료 희석에 의해 평가한 CD19-CAR T 세포의 증식. 분석 배지에 외인성 사이토카인은 첨가되지 않았다. 분석을 위해, 3세트 웰을 수집하고, 살아있는 (7AAD-) T 세포의 증식을 분석하였다. 세포 증식 지수 (즉, 평균 세포 분열 수)를 3번의 독립 실험들에서 수득한 데이타로부터 FlowJo 소프트웨어를 사용해 계산하였으며, 데이타를 일원식 ANOVA로 분석하였다 (**p<0.001).
도 5. SB100XmRNA, 및 MC-CD19 CAR를 이용한 전위를 통해 변형된 CD19 CAR T 세포의 생체내 종양 반응성
(A) 상단 패널: NSG 마우스에 Raji-ffluc 세포를 접종하고, 7일 후 10x106의 CD19 CAR T 세포 (CD8+ 및 CD4+ T 세포, 각각 5x106), 비-변형된 대조군 T 세포를 처리하거나, 또는 처리하지 않고 두었다. 마우스 코호트를 생발광 이미징에 의해 분석하였다. 파선은 T 세포 전달 일을 표시한다. 7일 (T 세포 전달 당일), 10일 (T 세포 전달 후 3일) 및 14일 (T 세포 전달 후 7일)의 생발광 이미지를 도시한다. 하단 패널: NSG 마우스에 Raji-ffluc/eGFP 세포를 접종하고, 7일 후 5x106 CD19-CAR T 세포 (1:1, CD8+ 및 CD4+ T 세포, 각각 2.5x106), 비-변형된 대조군 T 세포를 처리하거나, 처리하지 않고 두었다. SB100X mRNA 및 CD19-CAR MC (4:1 비율)로 형질감염하여 CD19-CAR T 세포를 구축하였다. 7일 (T 세포 주입 전, 상단 열) 및 14일 (T 세포 주입 후 7일, 하단 열)에 생발광 이미지를 수득하였다. 데이타는 서로 다른 공여체로부터 수득한 T 세포를 이용한 2번 이상의 독립적인 실험에서 수득한 결과를 나타낸다.
(B) 좌측 패널: 각 마우스 전신을 포함한 대상 부위들에서 수득한 생발광 신호의 평균값을 각 시간대에 각 치료군에 대해 그래프로 작성한다. 데이타는 도 5A의 상단 패널에 나타낸 마우스로부터 수득하였다. 우측 패널: 각 마우스 전신을 포함하는 대상 부위들에서 수득한 생발광 신호의 평균값을 각 시간대에 각 치료군에 대해 그래프로 작성한다. 데이타는 도 5A의 하단 패널에 나타낸 마우스로부터 수득하였다. 진한 파선은 T 세포 주입 일을 나타낸다. 데이타는 서로 다른 공여체로부터 수득한 T 세포를 이용한 2번 이상의 독립적인 실험에서 수득한 결과를 나타낸다.
(C) 좌측 패널: 대조군 T 세포로 처리되거나 또는 T 세포 처리되지 않은 (무처리) 마우스 대비, CD19 CAR을 발현하는 T 세포로 처리된 마우스의 생존율에 대한 Kaplan-Meier 분석. 우측 패널: SB 전위 (SB100X mRNA 및 CD19-CAR MC) (n=5)에 의해 제조된 CD19-CAR T 세포, LV 형질도입 (n=5)에 의해 제조된 T 세포 또는 대조군 T 세포 (n=3)로 처리된 마우스 군, 또는 무처리 군 (n=2)에서의 생존율에 대한 Kaplan-Meier 분석. 데이타는 서로 다른 공여체로부터 수득한 T 세포를 이용한 2번 이상의 독립적인 실험에서 수득한 결과를 나타낸다.
(D) CD19-CAR T 세포로 처리된 마우스의 말초혈 및 골수에서 인간 T 세포의 빈도. T 세포 전달 후 3, 7 및 14일 (종양 접종 후 10, 14 및 21일)에 채혈하고, 실험 종료시 골수를 채취하였다. 대표적인 유세포 측정의 점 그래프는 CD8+ 및 CD4+ T 세포 (살아있는 7-AAD- CD45+ 세포 게이트)를 표시한다. 데이타는 서로 다른 공여체로부터 수득한 T 세포를 이용한 2번 이상의 독립적인 실험에서 수득한 결과를 나타낸다.
(E) 실험 18일 (대조군/무처리 마우스) 및 35일 (CD19-CAR 군)에 수득한 NSG 마우스의 골수에서 CD45+ ffLuc/eGFP+ Raji 세포의 빈도. 수평 바는 평균 값을 표시한다. 데이타는 서로 다른 공여체로부터 수득한 T 세포를 이용한 2번 이상의 독립적인 실험들에서 수득한 결과를 나타낸다.
도 6. spPCR (splinkerette PCR)을 이용한, SB100XmRNA 및 MC-CD19 CAR로 변형된 T 세포의 전이유전자 카피수 측정.
(A) spPCR 반응 각각의 PCR 산물 3 ㎕가 로딩된 아가로스 겔. 제한 희석 클로닝을 통해 수득한 CAR+ T 세포 클론의 게놈 DNA를 전술한 spPCR을 이용하여 트랜스포존 좌측 역위 말단 반복체에 특이적인 프라이머로 증폭시켰다. 레인 M: 100 bp DNA ladder (NEB); 클론 1-10: CAR T 세포 클론 10주로부터 유래된 인풋 게놈 DNA; MC: SB100X mRNA없이 MC-CD19 CAR 단독으로 형질감염된 샘플의 인풋 게놈 DNA; Mock: 뉴클레오펙션/비-형질감염된 T 세포의 인풋 게놈 DNA; NDC: DNA 무첨가 대조군.
(B) SB100X 전위를 통해 SB100X mRNA 및 MC-CD19 CAR (4:1 비율)로 유전자 변형된 여러가지 CD8+ CAR T 세포 클론들 n=10의 요약 데이터. T 세포 당 평균 카피 수와 SD를 나타낸다.
(C) SB100X mRNA 및 MC CD19-CAR (4:1 비율)로 변형된 CD4+ (n=10) 및 CD8+ (n=9) CD19-CAR T 세포 클론의 유전자 카피 수. CD8+ CD19-CAR T 세포 클론에 대해 나타낸 실험은 (B) 실험의 레플리케이트이다.
도 7. 인간 T 세포에서 SB 및 LV의 삽입부 특성과 안전성 평가.
(A) 인간 게놈의 유전자-관련 특징에서 LV 및 SB 삽입 빈도 비교. 랜덤 예상 빈도에 따른 SB 및 LV 삽입부의 배수-농화 (fold-enrichment)를 그래프로 작성한다. 파선은 x 축의 카테고리에서 무작위 처리 확률에 의해 예측되는 삽입 빈도 대비 1배 농화를 나타낸다. TSS 및 TES: 각각 전사 개시부 및 전사 종결부.
(B) 게놈 삽입부 빈도와 유전자의 전사 상태 간의 연관성. 활성화된 T 세포의 유전자들은 이들의 발현 수준 증가에 따라 동일한 크기의 그룹 10개로 클러스터링하였다 (좌에서 우). 파선은 1에 대해 정규화한 예상되는 무작위 삽입 빈도를 표시한다. SB의 추세선 (검정)을 선형 세팅에 피팅하였다. 지수 설정 (exponential setting)을 이용해 LV 데이타세트의 첫 데이타 포인트 9개에 대해 추세선을 피팅하였다 (R2 값이 표시됨). 가장 활성이 높은 유전자들로 구성된 그룹에서 삽입 빈도 증가는 지수 추세를 따르지 않는다.
(C) T 세포의 게놈 안전 지대내 SB 및 LV의 삽입 빈도. 게놈 안전 지대는 x 축의 다음과 같은 기준 5개를 동시에 충족시키는 인간 염색체의 영역이다: 초보존 영역이 아님, miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음 (TSS), 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음 및 전사 단위 영역이 아님. 좌측 다이아그램은 각 기준을 충족시키는 SB, LV 및 무작위 삽입의 %를 도시한다. 우측 다이아그램은 5가지의 기준을 모두 충족하는 삽입체의 %를 도시한다.
도 8. MC 및 플라스미드-코딩된 SB 전이효소 및 트랜스포존을 이용한 eGFP의 전위.
(A) CD8+ T 세포를 eGFP 및 SB100X (P-P)를 코딩하는 기존 플라스미드 각 1 ㎍으로, 또는 대응되는 동일 몰량의 MC (MC-MC)로 형질감염시켰다. eGFP 발현을 유세포 측정으로 분석하였다. 데이타는 3번의 독립 실험의 평균 ± SD를 나타낸다, p<0.001.
(B) eGFP 발현의 안정성을 형질감염 후 28일에 유세포 측정에 의해 분석하였다. 3번의 독립적인 실험들에서 수득한 데이타의 평균 ± SD를 나타낸다.
(C) 형질감염 후 48시간째 T 세포의 생존성을 7-AAD 염색 및 유세포 측정 분석으로 평가하였다. 데이타는 3번의 독립적인 실험들의 평균 ± SD를 나타낸다. 통계학적 분석은 스튜던트 t 검정으로 수행하였다, p<0.05.
도 9. CD4+ T 세포에서 MC SB 전위.
CD4+ T 세포를, CD19-CAR 트랜스포존 및 SB100X 전이효소 (P-P)를 코딩하는 통상적인 플라스미드 각 1 ㎍ 또는 대응되는 MC (MC-MC, 동일 몰량의 DNA 사용)로 형질감염하였다 (n=3). 14일째 EGFRt 발현을 나타낸 유세포 측정의 점 그래프를 도시한다 (살아있는, 즉, 7-AAD 음성 세포에 대해 게이팅함).
도 10. CD8+ 나이브 및 기억 T 세포 서브세트에서 MC SB의 전위.
CD8+ 나이브 (CD45RA+RO-62L+, TN), 중심 기억 (CD45RA-RO+62L+, TCM) 및 작동자 기억 (CD45RA-RO+62L+, TEM) T 세포를 정제하여, SB100X mRNA 및 CD19-CAR MC로 형질감염하였다. 유세포 측정의 점 그래프는 형질감염 후 14일째 EGFRt 발현을 도시한다 (살아있는, 즉, 7-AAD 음성 세포에 대해 게이팅함).
도 11. T 세포에서 SB 및 LV 삽입부 주변 염색체 DNA의 뉴클레오티드 조성.
각 데이타 포인트는 T 세포에서 SB 및 LV 삽입체 주변 염색체 DNA에서 5개의 뉴클레오티드 빈 (bin)의 평균 TA-함량을 표시한다. 분석 범위 20 kbp (A, B) 및 2.6 kbp (C, D)를 나타낸다. 랜덤 데이타세트는 인간 염색체의 컴퓨터로 구축한 임의 유전자좌 약 10.000개의 TA 함량을 보여준다.
도 12. 인간 T 세포 염색체 상의 SB 타겟 부위의 염기 조성.
뉴클레오티드 58개 길이의 뉴클레오티드 빈도 매트릭스를 표로 표시하며, "V"-숫자는 연속되는 뉴클레오티드를 표시한다. 삼각형은 삽입부를 표시한다. 표는 각 뉴클레오티드에서 4가지 뉴클레오티드 A, C, G 및 T의 상대적인 빈도 (%)를 표시한다.
도 13. T 세포의 전사 활성 및 억제된 염색질내 SB 및 LV 삽입부를 표시함.
RNA 중합효소 II (PolII)에 의해 커버링되거나 또는 특이적인 히스톤 변형 (X축에 열거됨)을 가진 염색체 영역을 활성화된 인간 T 세포에서 수득한 이용가능한 데이타베이스로부터 확보하였다. 랜덤 대조군 (파선) 대비 ChIP-Seq 피크에서 삽입부 출현의 배수 변화를 y 축에 나타낸다.
도 14. 형질감염 후 14일째 EGFRt 발현에 대한 유세포 측정 분석. (A) SB100X mRNA 및 CD19-CAR MC를 제공받은 비-활성화된 T 세포 또는 (B) 비-활성화된 모의-형질감염된 T 세포로의 유전자 전달을 수행하였다.
도 15. 형질감염 후 14일째 EGFRt 발현에 대한 유세포 측정 분석. (A) SB100X mRNA 및 CD19-CAR MC를 제공받은 비-활성화된 T 세포에 유전자-전달을 수행하고, CD19+ EBV-LCL을 이용해 증폭시켰다. (B) CD19+ 타겟 세포에 대한 세포용해 활성을 표준 4시간 세포독성 분석으로 분석하였다.
도 16. 형질감염 후 14일째 EGFRt 발현에 대한 유세포 측정 분석. (A) SB100X mRNA 및 CD19-CAR MC를 제공받은 비-활성화된 T 세포에 유전자-전달을 수행하고, 형질전환 후 항원-의존적인 증폭없이 T 세포 배지에서 유지시켰다. (B) CD19+ 타겟 세포에 대한 세포용해 활성을 표준 4시간 세포독성 분석으로 분석하였다.
도 17. 형질감염 후 14일째 EGFRt 발현에 대한 유세포 측정 분석. SB100X MC 및 CD19-CAR MC (1:1 비율)를 제공받은, 비-활성화된 (A) CD4+ T 세포 및 (B) 비-활성화된 CD8+ T 세포에서 유전자-전달을 수행하거나 (좌측 점 그래프) 또는 모의-형질감염을 수행하였다 (우측 점 그래프). (C) CD19+ 타겟 세포에 대한 CD8+ CD19 CAR T 세포의 세포용해 활성을 표준 4시간 세포독성 분석으로 분석하였다.
도 18. 형질감염 후 14일째 EGFRt 발현에 대한 유세포 측정 분석. Agile Pulse MAX System을 사용해 SB100X MC 및 CD19-CAR MC (1:1 비율)를 전기천공으로 도입되는 CD8+ T 세포에서 유전자-전달을 수행하였다.
도 19. SB100X 및 CD19-CAR MC DNA의 적정, 및 수득되는 CD19-CAR 트랜스포존 카피 수와의 상관성. (A-B) SB100X-코딩 MC 및 CD19-CAR-코딩 MC를 적정한 양으로 형질감염시킨 CD8+ T 세포에서, 형질감염 후 14일째 EGFRt 발현에 대한 유세포 측정 분석. (A) 하나의 대표적인 실험에 대한 유세포 측정 결과를 나타낸 점 그래프. (B) EGFRt+ T 세포의 % (좌측 다이아그램) 및 EGFRt 마커에 대한 염색 후 평균 형광 강도 (우측 다이아그램). 데이타는 여러가지 공여체로부터 수득한 T 세포를 이용한 n=2의 독립적인 실험들의 평균 ± SD를 나타낸다. (C) 다클론 EGFRt+ CD8+ T 세포를 FACS로 정제하였으며, 액적 디지탈 PCR에 의한 트랜스포존 카피 수 분석을 위해 게놈 DNA를 분리하였다. 데이타는 평균 트랜스포존 카피 수를 표시하며, 여러가지 공여체로부터 수득한 T 세포를 이용한 n=2의 독립적인 실험들의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 20. (A) SB100X MC 및 CD19-CAR MC의 형질감염 후 9일째 Vγ9Vδ2 γδ T 세포에서 EGFRt 발현에 대한 유세포 측정 분석. (B) CD19+ EBV-LCL로 자극 후 Vγ9Vδ2 γδ T 세포에서 EGFRt 발현에 대한 유세포 측정 분석. (C) CD19+ 타겟 세포에 대한 CD19-CAR 변형된 및 모의-형질전이된 Vγ9Vδ2 γδ T 세포의 세포용해 활성을 표준 4시간 세포독성 분석으로 분석하였다. (D) CD19+ 타겟 세포로 자극 후 CD19-CAR 변형된 및 모의-형질전이된 Vγ9Vδ2 γδ T 세포에 의한 사이토카인 분비를 20시간 공동-배양 후 수득한 상층액에서 ELISA에 의해 분석하였다.
도 21. SB100X MC 및 CD19-CAR MC를 벌크 PBMC에 형질감염시킨 후 9일째 EGFRt 발현에 대한 유세포 측정 분석. Vγ9Vδ2 γδ T 세포 (CD3+ Vγ9Vδ2+), NKT 세포 (CD3+, CD56+) 및 NK 세포 (CD3-, CD56+) 상에서의 EGFRt 발현.
지금까지, 플라스미드 DNA-코딩된 전이효소 및 플라스미드 DNA-코딩된 트랜스포존 (TE)을 이용한 포유류 세포의 게놈내 전이유전자의 전위 및 안정적인 삽입 기술들이 선행 기술 분야에 개시되어 왔다. 보다 상세하게는, 종양-반응성 TCR 및 CAR을 코딩하는 전이유전자를 플라스미드 DNA-코딩된 전이효소 및 플라스미드 DNA-코딩된 트랜스포존 (TE)을 이용해 인간 T 림프구의 게놈내에 전위하고 안정적으로 삽입하는 기술들이 선행 기술 분야에 개시되어 있다.
인간 T 림프구에서, (전기적 전달 등의 다양한 방법을 통해 T 림프구에 도입되는) 플라스미드 DNA-코딩된 전이효소 및 플라스미드 DNA-코딩된 트랜스포존 (TE)을 사용하면, 안정적인 유전자 전달이 매우 낮은 수준으로 달성되며 (전형적으로 <10%) (Huang Mol Therapy 2008; Field PLoS1 2013), 유전 물질의 T 세포내 도입과 관련된 독성 수준이 높아, 의도한 치료학적 용도로 충분한 양의 유전자-변형된 T 세포를 수득하기 위해서는, 추가적인 선별 공정 (기계적, 예를 들어, 비드-기반 또는 FACS 분류 및/또는 생물학적, 예를 들어, 항원-의존적인 자극) 및 생체외 증폭 (전형적으로, 수주)(Singh Immunol Rev 2014)이 필수적이다. 그러나, 특히, 유전자 전달이 플라스미드 DNA-코딩된 전이효소 및 플라스미드 DNA-코딩된 CAR 트랜스포존을 이용해 이루어진 CAR-변형된 T 림프구의 사용은 (렌티바이러스 또는 레트로바이러스 유전자 전달을 통해 유전자-변형된 CAR T 세포와 비교해) 품질이 좋지 않거나, 또는 심지어 전임상 및 임상 활용에서 치료학적 효능이 불량하다.
본원에서, 본 발명자들은, 인간 T 림프구로의 유전자 전달을 달성하기 위해, 최초로 mRNA-코딩된 전이효소 (SB100X)를 미니서클 DNA-코딩된 트랜스포존 (eGFP 또는 CD19-특이적인 CAR을 코딩함)과 조합하여 사용하였다. 이 방법을 이용해, 본 발명자들은, 플라스미드 DNA-코딩된 전이효소 (SB100X) 및 플라스미드 DNA-코딩된 트랜스포존 (eGFP 또는 CD19-특이적인 CAR을 코딩함)을 사용하는 경우와 비교해, 매우 높은 수준의 안정적인 TE 삽입 (>50%), 장기간 안정적인 전이유전자의 발현 (적어도 4주간 동일한 수준으로 안정적임), T 림프구에 대해 현저하게 낮은 독성이 달성되었다.
본 발명의 새로운 방법으로 인한 더 높은 수준의 유전자 전달율 및 낮은 독성으로, 치료학적인 개수를 수득하기 위한 생체외 배양 시간을 현저하게 줄일 수 있거나, 및/또는 소정의 기간내에 유전자-변형된 T 림프구의 전체 수율을 현저하게 높일 수 있으며, 심지어 추가적인 선별 또는 증폭 공정없이 바로 치료학적 용도로 사용할 수 있다.
본 발명은 포유류 세포의 게놈내 안정적인 TE 삽입을 달성하기 위해 mRNA-코딩된 전이효소와 미니서클 DNA-코딩된 트랜스포존 (TE)의 조합 사용을 최초로 개시한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 림프구의 게놈내 안정적인 TE 삽입을 달성하기 위해 mRNA-코딩된 전이효소와 미니서클 DNA-코딩된 트랜스포존 (TE)의 조합 사용을 최초로 개시한다.
나아가, 본 발명은 림프구에 전이유전자를 전달하기 위한 임의의 잠재적인 전이효소 공급원 (비-제한적인 예로, mRNA, 플라스미드-DNA, 미니서클-DNA, 선형 DNA, 폴리펩타이드)과 미니서클 DNA-코딩된 트랜스포존 (TE)의 조합 사용을 최초로 개시한다.
나아가, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 종양-반응성 인간 T 림프구를 암의 면역요법에 사용하도록 유도하기 위해, 종양-반응성 TCR 또는 CAR에 대한 유전 정보를 포함하는 미니서클 DNA-코딩된 트랜스포존을 mRNA-코딩된 슬리핑 뷰티 전이효소 SB100X와 조합 사용하는 것을 최초로 개시한다.
나아가, 본 발명은, 림프구에서 플라스미드 DNA-코딩된 전이효소 및 플라스미드 DNA-코딩된 트랜스포존 (TE)을 이용하는 확립된 기존 방법과 비교해, 미니서클 DNA-코딩된 트랜스포존 (TE)을 mRNA-코딩된 전이효소와 조합 사용함으로써, 현저하게 매우 안정적인 유전자 전달율과 현저하게 감소된 독성이 달성되는 기술적인 진보를 개시한다.
미니서클 DNA-코딩된 트랜스포존 (TE)을 mRNA-코딩된 전이효소와 조합 사용하여 안정적인 유전자 전달을 달성할 수 있다는 본 발명의 발견은 새로운 일이며, 선행 기술 분야에서 언급된 바 없으며; mRNA는 T 림프구 및 기타 포유류 세포의 핵 또는 세포질내 삽입 후 수명이 짧고 빨리 분해되는 것으로 알려져 있어, 예상하지 못하였다.
따라서, 전이효소의 공급원으로서 mRNA가 미니서클 DNA로부터 전위를 수행하기에 적합하고 충분할 것으로도 기대 또는 예상되지 않았으며, 전이효소의 공급원으로서 mRNA의 사용이, 플라스미드-DNA 코딩된 전이효소 및 플라스미드-DNA 코딩된 트랜스포존을 이용하는 기존의 확립된 방법과 비교해, 심지어 보다 우수한 전위율을 달성할 것이라는 것도 기대 또는 예상할 수 없었다.
본원에서, 용어 "미니서클 DNA"는 박테리아 복제 오리진과 항생제 내성 유전자가 없는 슈퍼코일형 DNA 분자 벡터를 지칭한다. 즉, 이는 주로 진핵생물 발현 카세트로 구성된다 (예, F. Jia et al. Nature methods, Vol.7, no.3, p.197-199, March 2010).
본원에서, "게놈 안전 지대"는 하기 5가지의 기준을 모두 만족시키는 인간 염색체 영역이다: 초보존 영역이 아님, miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음 (TSS), 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 및 전사 단위 영역이 아님.
본원에서, "초보존된" 게놈 염색체 영역은 인간, 마우스 및 랫 게놈에 완벽하게 보존된 유전자내 또는 유전자간 비-코딩 영역이다.
바람직한 구현예 :
본 발명의 바람직한 구현예는 입양 암 면역요법을 위한 종양-반응성 CAR-변형된 T 림프구를 제조하기 위해 mRNA-코딩된 SB100X 전이효소 및 미니서클 DNA-코딩된 CAR 트랜스포존을 사용하는 것이다.
유용한 구현예에서, CAR은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD44v6, CD123, CD135, EpCAM, EGFR, EGFRvariants, GD2, ROR1, ROR2, CD269, CD319, CD38, CD138 또는 종양 세포, 질병에 걸린 세포 또는 정상 세포 상에 발현되는 임의의 기타 표면 분자에 특이적이다.
다른 유용한 구현예에서, 미니서클 DNA는 a/b 또는 g/d T 세포 수용체, 사이토카인, 자살 유전자, 형질도입 마커 또는 세포내 도입하기에 바람직한 임의의 기타 천연 또는 합성 분자를 코딩할 수 있다.
다른 유용한 구현예에서, 변형된 세포는 CD8+ 킬러 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 나이브 T 세포, 기억 T 세포, 중심 기억 T 세포, 작동자 기억 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 불변 T 세포, NKT 세포, 사이토카인 유발성 킬러 T 세포, g/d T 세포, B 림프구, 자연 살상 세포, 단핵세포, 대식세포, 수지상 세포, 과립구 또는 유전자 변형에 사용하기에 바람직한 임의의 기타 포유류 세포 타입이다.
유용한 구현예에서, mRNA 및 DNA 미니서클은 전기천공, 뉴클레오펙션 (nucleofection)과 같은 전기적 전달; 리포펙타민 (lipofectamin), 푸겐 (fugene), 칼슘 포스페이트와 같은 물질을 이용한 화학적 전달; 나노입자, 또는 물질을 세포에 전달하는데 적합한 임의의 기타 고려가능한 방법에 의해 세포내로 도입된다.
유용한 구현예에서, 전이성 인자의 게놈내 전위를 매개하는 전이효소는 슬리핑 뷰티 (Sleeping Beauty), PiggyBac, Frog Prince, Himarl, Passport, Minos, hAT, Tol1, Tol2, AciDs, PIF, Harbinger, Harbinger3-DR 및 Hsmar1, 및 전위 활성이 동일하거나, 낮거나 및/또는 높은 이들의 임의 유도체이다.
본 발명의 또 다른 유용한 구현예에서, SB100X 전이효소 자체는 미니서클-DNA, 선형 DNA, 폴리펩타이드, 또는 미니서클-DNA 코딩된 TE의 전위를 달성하는데 적합한 임의의 기타 공급원으로서 전달될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예들은 하기에서 정의된 바와 같다:
1. 포유류 세포의 게놈에 전이성 인자를 안정적으로 삽입하기 위한 조합의 용도로서,
상기 조합이
상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA (minicircle DNA), 및
전이효소 (transposase)의 공급원의 조합인, 용도.
2. 제1항에 있어서, 상기 전이효소의 공급원이 전이효소를 코딩하는 핵산인, 용도.
3. 제2항에 있어서, 상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 전이효소를 코딩하는 mRNA, 전이효소를 코딩하는 플라스미드 DNA, 전이효소를 코딩하는 미니서클 DNA 또는 전이효소를 코딩하는 선형 DNA인, 용도.
4. 제3항에 있어서, 상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 전이효소를 코딩하는 mRNA인, 용도.
5. 제3항에 있어서, 상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 전이효소를 코딩하는 미니서클 DNA인, 용도.
6. 제5항에 있어서, 상기 전이효소를 코딩하는 미니서클 DNA 및 상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA가 동일한 미니서클 DNA인, 용도.
7. 제1항에 있어서, 상기 전이효소의 공급원이 전이효소 폴리펩타이드인, 용도.
8. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 전이효소가 SB100X인, 용도.
9. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 포유류 림프구인, 용도.
10. 제9항에 있어서, 상기 포유류 림프구가 인간 림프구인, 용도.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 림프구가 T 림프구인, 용도.
12. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 CD8+ 킬러 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 나이브 (naive) T 세포, 기억 T 세포, 중심 기억 T 세포, 작동자 기억 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 불변 T 세포, NKT 세포, 사이토카인 유발성 킬러 T 세포, g/d T 세포, B 림프구, 자연 살상 세포, 단핵세포, 대식세포, 수지상 세포 또는 과립구인, 용도.
13. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 CD8+ 킬러 T 세포 또는 CD4+ 헬퍼 T 세포인, 용도.
14. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자가 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 발현하기 위한 유전 정보를 포함하며, 상기 포유류 세포가 인간 T 림프구인, 용도.
15. 제14항에 있어서, 상기 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체가 종양-반응성이고, 상기 용도에 의해 수득되는 인간 T 림프구가 암의 입양 면역요법 (adoptive immunotherapy)에 사용하기에 적합한 종양-반응성 인간 T 림프구인, 용도.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 전이성 인자가 키메라 항원 수용체에 대한 유전 정보를 포함하는, 용도.
17. 제16항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체가 CD19, CD20, CD22, CD33, CD44v6, CD123, CD135, EpCAM, EGFR, EGFR 변이체, GD2, ROR1, ROR2, CD269, CD319, CD38 또는 CD138에 특이적인 것인, 용도.
18. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA가 a/b 또는 g/d T 세포 수용체, 사이토카인, 자살 유전자 또는 형질도입 마커를 코딩하는 것인, 용도.
19. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 용도가 시험관내 용도인, 용도.
20. 제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이효소를 코딩하는 핵산 및 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA 미니서클이 전기천공, 뉴클레오펙션과 같은 전기적 전달 (electrotransfer); 화학적 전달 (chemotransfer), 칼슘 포스페이트; 또는 나노입자에 의해 세포내로 도입되는, 용도.
21. 제2항 내지 제7항 또는 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자의 게놈으로의 전위를 매개하는 전이효소가 Sleeping Beauty, PiggyBac, Frog Prince, Himarl, Passport, Minos, hAT, Tol1, Tol2, AciDs, PIF, Harbinger, Harbinger3-DR 및 Hsmar1 또는 전위 활성을 가진 이들의 유도체인, 용도.
22. 포유류 세포의 게놈에 전이성 인자를 안정적으로 삽입하기 위한 조합의 용도로서,
상기 조합은
전이유전자용 발현 카세트를 포함하는 전이성 인자를 코딩하는 DNA (DNA encoding a transposable element containing an expression cassette for a transgene), 및
전이효소의 공급원의 조합이며,
상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA는 복제 오리진 및/또는 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는, 용도.
23. 제22항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA는 복제 오리진을 포함하지 않는, 용도.
24. 제22항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA는 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는, 용도.
25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA는 복제 오리진과 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는, 용도.
26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA는 하기 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 플라스미드로부터 복제 오리진 및/또는 항생제 내성 유전자를 제거함으로써 수득가능한, 용도:
pT;
pT2;
pT의 DNA 서열과 90% 이상 동일한 DNA 서열을 가진 플라스미드;
pT2의 DNA 서열과 90% 이상 동일한 DNA 서열을 가진 플라스미드; 및
전이성 인자에 대한 공여 플라스미드로서 적합한 임의의 기타 플라스미드.
27. 포유류 세포의 게놈에 전이성 인자를 안정적으로 삽입하기 위한 조합의 용도로서,
상기 조합이,
전이유전자용 발현 카세트를 포함하는 전이성 인자를 코딩하는 DNA, 및
전이효소의 공급원의 조합이며,
상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA가 플라스미드에서 1bp (base pair) 이상을 제거하여 수득가능하고, 상기 플라스미드는 하기 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도:
pT;
pT2;
pT의 DNA 서열과 90% 이상 동일한 DNA 서열을 가진 플라스미드;
pT2의 DNA 서열과 90% 이상 동일한 DNA 서열을 가진 플라스미드; 및
전이성 인자에 대한 공여 플라스미드로서 적합한 임의의 기타 플라스미드.
28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA의 전체 길이가 상기 발현 카세트의 전체 길이 보다 최대 3.0 kb, 바람직하게는 최대 2.0 kb 긴, 용도.
29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA의 전체 길이가 발현 카세트의 전체 길이 보다 최대 1.5 kb 긴, 용도.
30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA의 전체 길이가 발현 카세트의 전체 길이 보다 최대 1.0 kb 긴, 용도.
31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA가 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 사용되는 미니서클 DNA인, 용도.
32. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자가 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체이고, 상기 포유류 세포가 인간 T 림프구인, 용도.
33. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자가 a/b 또는 g/d T 세포 수용체, 사이토카인, 자살 유전자 또는 형질도입 마커인, 용도.
34. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용도가 시험관내 용도인, 용도.
35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이효소의 공급원이 제2항 내지 제6항, 제8항 또는 제21항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 것인, 용도.
36. 제22항 내지 제31항 또는 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 것인, 용도.
37. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 일차 세포, 바람직하게는 일차 인간 세포인, 용도.
38. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 용도가 비-바이러스성 용도인, 용도.
39. 안정적으로 삽입된 전이성 인자를 포함하는 재조합 포유류 세포를 수득하는 방법으로서,
전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA와 전이효소를 코딩하는 핵산의 조합을 포유류 세포에 도입하는 단계,
재조합 포유류 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 제3항 내지 제6항, 제8항 또는 제21항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 것인, 방법.
41. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 전이효소가 SB100X인, 방법.
42. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 포유류 림프구인, 방법.
43. 제42항에 있어서, 상기 포유류 림프구가 인간 림프구인, 방법.
44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 림프구가 T 림프구인, 방법.
45. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 CD8+ 킬러 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 나이브 T 세포, 기억 T 세포, 중심 기억 T 세포, 작동자 기억 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 불변 T 세포, NKT 세포, 사이토카인 유발성 킬러 T 세포, g/d T 세포, B 림프구, 자연 살상 세포, 단핵세포, 대식세포, 수지상 세포 또는 과립구인, 방법.
46. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 CD8+ 킬러 T 세포 또는 CD4+ 헬퍼 T 세포인, 방법.
47. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자가 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 발현하기 위한 유전 정보를 포함하며, 상기 포유류 세포가 인간 T 림프구인, 방법.
48. 제47항에 있어서, 상기 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체가 종양-반응성이고, 상기 방법에 의해 수득되는 인간 T 림프구가 암의 입양 면역요법에 사용하기에 적합한 종양-반응성 인간 T 림프구인, 방법.
49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 전이성 인자가 키메라 항원 수용체에 대한 유전 정보를 포함하는, 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체가 CD19, CD20, CD22, CD33, CD44v6, CD123, CD135, EpCAM, EGFR, EGFR 변이체, GD2, ROR1, ROR2, CD269, CD319, CD38 또는 CD138에 특이적인, 방법.
51. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA가 a/b 또는 g/d T 세포 수용체, 사이토카인, 자살 유전자 또는 형질도입 마커를 코딩하는 것인, 방법.
52. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 시험관내 방법.
53. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 전이효소를 코딩하는 핵산 및 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA 미니서클이 전기천공, 뉴클레오펙션과 같은 전기적 전달; 화학적 전달, 칼슘 포스페이트; 또는 나노입자에 의해 세포내에 도입되는, 방법.
54. 제39항 내지 제41항 또는 제43항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자의 게놈으로의 전위를 매개하는 전이효소가 Sleeping Beauty, PiggyBac, Frog Prince, Himarl, Passport, Minos, hAT, Tol1, Tol2, AciDs, PIF, Harbinger, Harbinger3-DR, 및 Hsmar1 또는 전위 활성을 가진 이들의 유도체인, 방법.
55. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA와 전이효소를 코딩하는 핵산으로 된 조합이 포유류 세포에 함께 도입되는, 방법 또는 용도.
56. 제54항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA과 상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 동일한 미니서클 DNA인, 방법 또는 용도.
57. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 전이효소를 코딩하는 핵산 및 상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA가 포유류 세포에 1:1 이상의 몰비, 바람직하게는 2:1 내지 10:1의 몰비, 더 바람직하게는 3:1 내지 9:1의 몰비, 보다 더 바람직하게는 4:1 내지 8:1의 몰비로 도입되는, 방법.
58. 안정적으로 삽입된 전이성 인자를 포함하는 재조합 포유류 세포를 수득하는 방법으로서,
전이유전자용 발현 카세트를 포함하는 전이성 인자를 코딩하는 DNA, 및 전이효소를 코딩하는 핵산의 조합을 포유류 세포에 도입하는 단계;
재조합 포유류 세포를 수득하는 단계를 포함하며,
상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA가 복제 오리진 및/또는 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는, 방법.
59. 제58항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA가 복제 오리진을 포함하지 않는, 방법.
60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA가 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는, 방법.
61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA가 복제 오리진과 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는, 방법.
62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA가 하기 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 플라스미드로부터 복제 오리진 및/또는 항생제 내성 유전자를 제거함으로써 수득가능한, 방법:
pT;
pT2;
pT의 DNA 서열과 90% 이상 동일한 DNA 서열을 가진 플라스미드;
pT2의 DNA 서열과 90% 이상 동일한 DNA 서열을 가진 플라스미드; 및
전이성 인자에 대한 공여 플라스미드로서 적합한 임의의 기타 플라스미드.
63. 안정적으로 삽입된 전이성 인자를 포함하는 재조합 포유류 세포를 수득하는 방법으로서,
전이유전자용 발현 카세트를 포함하는 전이성 인자를 코딩하는 DNA, 및 전이효소를 코딩하는 핵산의 조합을 포유류 세포에 도입하는 단계, 및
재조합 포유류 세포를 수득하는 단계를 포함하며,
상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA는 플라스미드에서 1bp 이상을 제거하여 수득가능하고, 상기 플라스미드는 하기 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법:
pT;
pT2;
pT의 DNA 서열과 90% 이상 동일한 DNA 서열을 가진 플라스미드;
pT2의 DNA 서열과 90% 이상 동일한 DNA 서열을 가진 플라스미드; 및
전이성 인자에 대한 공여 플라스미드로서 적합한 임의의 기타 플라스미드.
64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA의 전체 길이가 상기 발현 카세트의 전체 길이 보다 최대 3.0 kb, 바람직하게는 최대 2.0 kb 긴, 방법.
65. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA의 전체 길이가 발현 카세트의 전체 길이 보다 최대 1.5 kb 긴, 방법.
66. 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA의 전체 길이가 발현 카세트의 전체 길이 보다 최대 1.0 kb 긴, 방법.
67. 제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA가 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 사용되는 미니서클 DNA인, 방법.
68. 제58항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자가 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체가 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 것이고, 상기 포유류 세포가 인간 T 림프구인, 방법.
69. 제58항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자가 a/b 또는 g/d T 세포 수용체, 사이토카인, 자살 유전자 또는 형질도입 마커인, 방법.
70. 제58항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 시험관내 방법인, 방법.
71. 제58항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 제40항에 따라 정의되는 것인, 방법.
72. 제58항 내지 제67항 또는 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 것인, 방법.
73. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 일차 세포, 바람직하게는 일차 인간 세포인, 방법.
74. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 비-바이러스성 방법인, 방법.
75. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 조합은 전이성 인자를 코딩하는 DNA 또는 미니서클 DNA와 상기 전이효소를 코딩하는 핵산을 동시에 도입함으로써 도입되는, 방법.
76. 제75항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA 또는 미니서클 DNA, 및 상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 동일한 DNA 미니서클인, 방법.
77. 제39항 내지 제54항 또는 제56항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합은 상기 전이효소를 코딩하는 핵산과 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA 또는 미니서클 DNA를 순차적으로 도입함으로써 도입되는, 방법.
78. 제39항 내지 제54항 또는 제56항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합은 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA 또는 미니서클 DNA와 상기 전이효소를 코딩하는 핵산을 순차적으로 도입함으로써 도입되는, 방법.
79. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA가 선형화된 DNA (linearized DNA) 또는 환형 DNA (circular DNA)인, 방법 또는 용도.
80. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 전이효소의 공급원 또는 상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 전이효소를 코딩하는 미니서클 DNA이며, 상기 미니서클 DNA는 선형화된 미니서클 DNA 또는 환형 미니서클 DNA인, 방법 또는 용도.
81. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 전이효소를 코딩하는 핵산과 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA 또는 미니서클 DNA가 포유류 세포에 1:1 이상의 중량비로, 바람직하게는 2:1 내지 10:1 중량비로, 더 바람직하게는 3:1 내지 9:1의 중량비로, 보다 더 바람직하게는 4:1 내지 8:1의 중량비로 도입되는, 방법.
82. 전술한 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 재조합 포유류 세포.
83. 전이유전자용 발현 카세트를 포함하는 전이성 인자를 1 카피 (copy) 이상 포함하는 재조합 인간 T 세포.
84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 상기 세포내 전이성 인자의 카피수가 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개인, 재조합 세포.
85. 제82항 또는 제83항에 있어서, 상기 세포내 상기 전이성 인자의 카피수가 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개인, 재조합 세포.
86. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 카피들 중 0% 내지 5%가 하기 기준을 모두 충족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되는, 재조합 세포:
(i) 초보존 (ultraconserved) 영역이 아님,
(ii) miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음,
(iii) 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음,
(iv) 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 및
(v) 전사 단위 (transcription unit) 영역이 아님.
87. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 카피들 중 5% 이상이 하기 기준을 모두 충족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되는, 재조합 세포:
(i) 초보존 영역이 아님,
(ii) miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음,
(iii) 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음,
(iv) 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 및
(v) 전사 단위 영역이 아님.
88. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 카피들 중 적어도 10%가 하기 기준을 모두 충족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되는, 재조합 세포:
(i) 초보존 영역이 아님,
(ii) miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음,
(iii) 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음,
(iv) 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 및
(v) 전사 단위 영역이 아님.
89. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 카피들 중 적어도 15%가 하기 기준을 모두 충족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되는, 재조합 세포:
(i) 초보존 영역이 아님,
(ii) miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음,
(iii) 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음,
(iv) 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 및
(v) 전사 단위 영역이 아님.
90. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 카피들 중 적어도 20%가 하기 기준을 모두 충족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되는, 재조합 세포:
(i) 초보존 영역이 아님,
(ii) miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음,
(iii) 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음,
(iv) 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 및
(v) 전사 단위 영역이 아님.
91. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 카피들 중 적어도 40%가 하기 기준을 총족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되는, 재조합 세포:
(v) 전사 단위 영역이 아님.
92. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 하나 이상의 카피, 바람직하게는 전체 카피가 하기 기준들 중 한가지 이상의 기준을 충족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되는, 재조합 세포:
(i) 초보존 영역이 아님,
(ii) miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음,
(iii) 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음,
(iv) 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 및
(v) 전사 단위 영역이 아님.
93. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 하나 이상의 카피, 바람직하게는 전체 카피가 하기 기준들 중 2개 이상의 기준을 충족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되는, 재조합 세포:
(i) 초보존 영역이 아님,
(ii) miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음,
(iii) 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음,
(iv) 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 및
(v) 전사 단위 영역이 아님.
94. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 하나 이상의 카피, 바람직하게는 전체 카피가 하기 기준들 중 3개 이상의 기준을 충족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되는, 재조합 세포:
(i) 초보존 영역이 아님,
(ii) miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음,
(iii) 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음,
(iv) 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 및
(v) 전사 단위 영역이 아님.
95. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 하나 이상의 카피, 바람직하게는 전체 카피가 하기 기준들 중 4개 이상의 기준을 충족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되는, 재조합 세포:
(i) 초보존 영역이 아님,
(ii) miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음,
(iii) 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음,
(iv) 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 및
(v) 전사 단위 영역이 아님.
96. 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 카피 수가 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개인, 재조합 세포.
97. 제82항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포에서 상기 전이성 인자의 일시적인 카피 (transient copy)의 카피 수가 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개인, 재조합 세포.
98. 의학에 사용하기 위한, 전술한 어느 한 항에 따른 재조합 세포.
99. 암 치료에 사용하기 위한, 전술한 어느 한 항에 따른 재조합 세포.
100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 상기 용도가 면역요법에서의 용도인, 재조합 세포.
101. 제100항에 있어서, 상기 면역요법에서의 용도가 자가면역 질환의 치료 용도인, 재조합 세포.
102. 제100항에 있어서, 상기 면역요법에서의 용도가 감염성 질환의 치료 용도인, 재조합 세포.
103. 제102항에 있어서, 상기 감염성 질환이 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 진균 감염인, 재조합 세포.
104. 제98항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포가 T 세포인, 재조합 세포.
105. 유전자 요법에 사용하기 위한, 제82항 내지 97항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포.
106. 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA 및 전이효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물.
107. 제106항에 있어서, 상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 제3항 내지 제6항, 제8항 또는 제21항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 것인, 조성물.
108. 제106항 또는 제107항에 있어서, 상기 전이성 인자가 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 것인, 조성물.
109. 제1항 내지 제18항, 제20항 내지 제33항, 제35항 내지 제51항, 제53항 내지 제69항 또는 제71항 내지 81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용도 또는 방법이 생체내 용도 또는 생체내 방법인, 용도 또는 방법.
110. 제109항에 있어서, 상기 용도 또는 방법이 유전자 요법에서의 용도 또는 유전자 요법을 위한 방법인, 용도 또는 방법.
본 발명은 하기 비-제한적인 실시예들을 들어 예시된다:
실시예 :
실시예 1: 슬리핑 뷰티-매개 전위를 이용한 mRNA-코딩된 과활성 슬리핑 뷰티 전이효소 100X (SB100X) 및 미니서클 DNA-코딩된 eGFP 또는 CD19-CAR 전이유전자가 도입된 CAR-변형된 인간 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 제조.
재료 및 방법:
인간 개체
뷔르츠부르크 대학 (뷔르츠부르크 대학병원, UKW)의 생명윤리 위원회로부터 승인받은 연구 프로토콜에 참여하기 위해 서면 동의를 받은 건강한 공여자들로부터 혈액 샘플을 채혈하였다. Ficoll-Hypaque (Sigma, St.Louis, MO) 상에서 원심분리하여 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)를 분리하였다.
세포주
293T 세포 (ATCC: CRL-11268, American Type Culture Collection, Manassas, VA)는 10% 소 태아 혈청 및 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 둘베코의 변형된 이글스 배지에서 배양하였다. K562 (ATCC: CCL-243), K562/ROR1, K562/CD19, Raji (ATCC: CCL-86), JeKo-1 (ATCC: CRL-3006) 및 JeKo-1-ffluc 세포들은 10% 소 태아 혈청 및 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다 (세포 배양 배지 및 첨가물들 모두: GIBCO, Carlsbad, CA).
면역표현형 ( Immunophenotyping )
PBMC 및 T 세포주를 다음과 같은 접합 mAb들 중 1개 이상으로 염색하였다: CD3, CD4, CD8, CD25, CD45, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69 및 매칭되는 이소형 대조군 (BD Biosciences, San Jose, CA). 형질도입된 T 세포주는 바이오틴-접합된 anti-EGFR 항체 (ImClone Systems Incorporated, Branchburg, NJ) 및 스트렙타비딘-PE (BD Biosciences, San Jose, CA)로 염색하였다 27. 7-AAD (BD Biosciences)를 이용한 염색은 제조사의 지침에 따라 생존/사멸 세포를 식별하기 위해 수행하였다. 유세포 분석은 FACSCanto에서, 분류-정제(sort-purification)는 FACSAriaII (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에서 수행하였으며, 데이타는 FlowJo software (Treestar, Ashland, OR)로 분석하였다.
렌티바이러스 벡터 구축, 렌티바이러스 제조 및 CAR-T 세포 제조
짧은 스페이서와 4-1BB 공동-자극 도메인을 가진 CD19-특이적인 CAR을 함유한 epHIV7 렌티바이러스 벡터의 구축은 공지되어 있다 (Hudecek Clin Cancer Res 2013). CAR 구조체들 모두 CAR 하류에 절단된 상피 성장 인자 수용체 (EGFRt; 또는 tEGFR) 서열을 코딩한다 (Wang Blood 2011). 이들 유전자는 T2A 리보좀 스킵 인자 (ribosomal skip element)에 의해 연결된다.
각 렌티바이러스 벡터 플라스미드와 패키징 벡터 pCHGP-2, pCMV-Rev2 및pCMV-G를 Calphos 형질감염 시약 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용해 공동-형질감염시킨 293T 세포에서 CAR/EGFRt 및 ffluc/eGFP-코딩하는 렌티바이러스의 상층액을 준비하였다. 배지는 형질감염 16시간 이후에 교체하고, 24, 48 및 72시간 이후에 렌티바이러스를 수집하였다. CAR-T 세포는 공지된 바와 같이 제조하였다 (Hudecek Clin Cancer Res 2013). 간략하게는, CD8+ bulk T 세포, CD8+ TCM 및 CD4+ bulk T 세포를 건강한 공여체의 PBMC로부터 분류하고, anti-CD3/CD28 비드 (Life Technologies)로 활성화한 다음 렌티바이러스 상층액을 형질도입하였다. 렌티바이러스 형질도입은 1일에 스피노큘레이션 (spinoculation)에 의해 수행하였으며, T 세포를 RPMI-1640 + 10% 인간 혈청, 글루타민, 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 50 U/mL IL-2에서 증식시켰다. 트리판 블루 염색을 수행하여 살아있는 T 세포를 정량하였다. 증식 후, EGFRt+ T 세포를 농화하여, 방사선 처리된 B-LCL로 자극하였다.
트랜스포존 벡터 구축
트랜스포존 벡터 pT2/HB (Addgen #26557)를 Addgene 사에서 입수하였다. 그린 형광 단백질을 코딩하는 트랜스포존 벡터 (pT2/HB:eGFP)를 구축하기 위해, Kozak 서열과 강화된 GFP (eGFP)를 코딩하는 서열의 상류에 HindIII 제한효소 부위, EF1/HTLV 하이브리드 프로모터, NheI 제한효소 부위를 코딩하는 코돈 최적화된 유전자가 존재하고, 하류에 정지 코돈과 NotI 및 BamHI 제한효소 부위가 존재하게 합성한 다음, 상업 회사 (GeneArt, Regensburg)에서 입수한 pT2/HB에 HindIII 및 BamHI 부위를 이용해 서브클로닝하였다. CD19-특이적인 CAR (pT2/HB:CD19-CAR)을 코딩하는 트랜스포존 벡터를 제조하기 위해, 상기한 CD19-CAR_tEGFR 유전자 (섹션: 렌티바이러스 벡터 구축)를 제한효소 절단에 의해 렌티바이러스 벡터로부터 수득하고, NheI 및 NotI 제한효소 부위를 이용해 pT2/HB:eGFP에 서브클로닝하여, eGFP 전이유전자를 치환하였다. 과활성 슬리핑 뷰티 100X (SB100X) 전이효소를 코딩하는 벡터를 Addgene (Addgene#34879: pCMV(CAT)T7-SB100) 사로부터 입수하였다.
DNA 미니서클 및 SB100X mRNA 제조
전매 프로토콜을 사용해 Plasmid Factory (Bielefeld)에서 DNA 미니서클을 제조하였다: i) pT2/HB:eGFP -> MC-GFP; ii) pT2/HB:CD19-CAR -> MC-CD19 CAR; 및 iii) pCMV(CAT)T7-SB100 -> MC-SB100X. 미니서클을 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. SB100X mRNA를 EUFETS (Idar-Oberstein)에서 표준 프로토콜을 이용해 시험관내 전사 (IVT)를 통해 제조하거나, 또는 mMessage mMachine kit (Ambion)를 사용해 실험실에서 제조하였다.
SB 전위를 통한 GFP - 및 CAR- 발현성 T 세포의 제조
CD8+ bulk T 세포, CD8+ TCM 및/또는 CD4+ bulk T 세포를 건강한 공여자의 PBMC에서 분류하고, anti-CD3/CD28 비드 (Life Technologies)로 활성화한 다음, 제조사의 지침 (Lonza, 퀴른)에 따라 4D 뉴클레오펙터 디바이스에서 플라스미드 DNA, 미니서클 DNA 및/또는 mRNA가 포함된 뉴클레오펙션 완충제/첨가제 중에서 활성화된 인간 T 림프구에 대해 최적화된 프로토콜을 이용해 뉴클레오펙션을 수행하였다. T 세포는 T 세포 배지 (RPMI/10% 인간 혈청/글루타민/pen-strep)에서 유지 및 증식시켰다. 뉴클레오펙션 후 일정한 시간 간격으로 표현형 분석을 수행하여, 도입된 전이 유전자를 발현하는 T 세포의 비율을 측정하였다. 트리판 블루 염색으로 세포를 계수하여, 뉴클레오펙션 후 각 시간대에 그리고 증폭 공정 중에 세포 배양물에서 생존 세포의 수를 측정하였다.
세포독성, 사이토카인 분비 및 CFSE 증식 분석
반딧불이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 타겟 세포를 3세트로 5x103 세포/웰로 다양한 작동자:타겟 (E:T) 비율로 작동자 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 4시간 인큐베이션한 후, 루시페린 기질을 공동-배양물에 첨가하였으며, 타겟 세포 단독에 비해 타겟 세포 및 T 세포를 수용한 웰에서의 발광 신호 감소를 루미노미터 (Tecan)로 측정하였다. 특이적인 세포용해를 표준 식으로 계산하였다 31. 사이토카인 분비를 분석하기 위해, 50x103 T 세포를 3세트로 웰에 타겟 세포와 함께 1:1 (K562/CD64), 2:1 (Raji) 또는 4:1 (K562/CD19 및 K562) 비율로 접종하고, 24시간 배양 후 수득한 상층액에서 멀티플렉스 사이토카인 면역분석 (Luminex) 또는 ELISA (Biolegend)에 의해 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 측정하였다. 증식을 분석하기 위해, 50x103 T 세포를 0.2 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, Invitrogen)로 표지하고, 헹군 다음, 외인성 사이토카인을 첨가하지 않은 CTL 배지 중에 2:1 (Raji) 또는 4:1 (K562/CD19, K562/ROR1 및 K562) 비율로 타겟 세포와 함께 3세트로 웰에 접종하였다. 72시간 배양한 후, 세포를 anti-CD3 또는 anti-CD4 또는 anti-CD8 mAb 및 7-AAD로 표지하여, 분석에서 죽은 세포를 제외시켰다. 샘플을 유세포 측정으로 분석하고, CFSE 희석에 의해 살아있는 T 세포의 세포 분열을 조사하였다. 증식 지수를 FlowJo 소프트웨어를 사용해 계산하였다.
NOD/ SCID / γc -/- ( NSG ) 마우스에서 T 세포의 입양 전달
모든 마우스 실험은 UKW Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인받았다. 6-8주령의 암컷 NSG 마우스를 the Charles River Laboratory에서 입수하거나, 실험실에서 교배하였다. 6-8주령의 암컷 NSG 마우스에 반딧불이 루시퍼라제를 발현하는 Raji 종양 세포 5x105개를 꼬리 정맥 주사를 통해 0일에 접종하였다. 7일에, n=5 마우스로 구성된 그룹에 5x106개의 CAR-변형된 또는 비변형된 대조군 T 세포 (CD8+ 및 CD4+ T 세포를 동일 비율로 함유)를 정맥내 주사하였다. 생발광 이미지를 촬영하여 종양 부하 및 분포를 확인하고, 생존율을 측정하기 위해 Kaplan-Meier 분석을 수행하였다.
T 세포 클론내 크랜스포존 삽입체의 카피수 측정
SB100X mRNA, 및 CD19-CAR MC의 형질감염 후 적어도 1달 이후에 제한 희석에 의해 T 세포 클론을 제조하고, 이의 게놈 DNA를 FspBI 및 DpnI 제한 효소로 절단하였다. 2단계 nested PCR을 수행하였으며 (상세 내용은 하기 참조), 겔 전기영동에 의해 PCR-산물을 분석하였다.
보다 상세하게는, SB100X mRNA 및 MC 트랜스포존의 형질감염 후 적어도 1달 이후에 EGFRt+ T 세포 클론으로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 클론 당 DNA 1㎍을 FspBI (Thermo) 및 DpnI (NEB)으로 분해하였다. 분해를 적용해 모 MC를 단편화하였으며, 이는 카피 수 측정을 방해할 수 있다. 분해된 DNA는 컬럼으로 정제하고, 20㎕에서 용출시켰다. 5㎕를 50 pmol FspBI overhang-특이적인 링커와 밤새 16℃에서 연결시켰다. 링커는, 10mM Tris-Cl pH8, 50mM NaCl, 0.5mM EDTA 중에 100-100 pmol 올리고뉴클레오티드 L(+) 및 L(-) FspBI을 어닐링함으로써 구측하였다. 연결 반응물 1㎕를 프라이머 Linker (연결된 링커에 특이적임) 및 T-Bal-rev (트랜스포존의 5' 말단 역위 반복체에 특이적임)를 이용한 1차 PCR 반응의 주형으로서 하기 조건에 따라 사용하였다: 94℃ 3분; 사이클 10회: 94℃ 30초, 63℃까지 (1℃/초), 30초, 72℃ 1분; 사이클 25회: 94℃ 30초, 61℃까지 (1℃/초) 30초, 72℃ 1분; 72℃ 10분. 100배 희석한 PCR 반응물 1㎕를 프라이머 Nested 및 T-Bal를 사용한 nested PCR에서 다음과 같은 반응에 사용하였다: 94℃ 3분; 사이클 10회: 94℃ 30초, 65℃까지 (1℃/초), 30초, 72℃ 1분; 사이클 25회: 94℃ 30초, 63℃까지 (1℃/초) 30초, 72℃ 1분; 72℃ 10분. nested PCR 반응물 5㎕를 1% 아가로스 겔에 로딩하여, 측면 게놈 DNA를 가진 삽입부에 해당되는 밴드를 가시화하였다.
SB 삽입 라이브러리 구축 및 서열분석
n=3 공여체의 CD8+ CAR T 세포주로부터 게놈 DNA를 분리하고, 울트라-솔리시터 (ultra-solicitor)로 절단한 다음, 각 삽입부 주변 게놈 영역을 3단계 PCR (상세 내용은 하기 참조)에 의해 증폭시켰다. 최종 PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고, 200-500 bp 스미어 (smear)를 정제하여 서열분석하였다 (IlluminaHiSeq, BeckmanCoulter Genomics).
보다 상세하게는, 공여자 3명에서 수득한 CD8+ EGFRt+ T 세포의 게놈 DNA를 형질감염 후 1딜 이후에 분리하였다. DNA 2㎍을 Covaris M220 울트라-솔리시터 디바이스로 평균 600 bp 단편 크기로 Screw-Cap microTUBE에서 50㎕ 중에 하기 설정으로 절단하였다: 피크 입사 파워 (peak incident power) 50W, 충격 계수 (duty factor) 20%, 사이클/파열 (cycles per burst) 200, 처리 28초. 절단된 DNA 1.2 ㎍을 블런트 처리하고, NEBNext End Repair Module (NEB)을 사용해 5'-인산화하고, NEBNext dA-Tailing Module (NEB)을 사용해 3'-A-테일을 제조사의 권고에 따라 부가하였다. DNA를 클린 및 컨센트레이터 키트 (Zymo)로 정제하고, 10mM Tris pH8 (EB) 8㎕로 용출시켜, T4 리가제 (NEB)를 사용해 부피 20㎕ 중에 16℃에서 밤새 50 pmol T-링커 (하기 참조)와 연결하였다. T-링커는, 10 mM Tris-Cl pH8, 50 mM NaCl, 0.5 mM EDTA 중에 100-100 pmol 올리고뉴클레오티드 Linker_TruSeq_T+ 및 Linker_TruSeq_T-를 어닐링하여, 형성하였다. 열-불활화 후, 비-통합형 트랜스포존 공여 플라스미드 DNA의 단편을 포함하는 연결 산물을 3시간 동안 50㎕ 중에서 DpnI (NEB)로 절단하고, DNA를 컬럼-정제하여 20㎕ EB에서 용출시켰다. 용출물 6㎕를 링커 및 트랜스포존 역위 반복체에 특이적인 프라이머 25 pmol을 사용한 PCR I에 사용하였다: 각각 Linker 및 T-Bal-Long, PCR 조건: 98℃ 30초; 사이클 10회: 98℃ 10초, 72℃ 30초; 사이클 15회: 98℃ 10초, 62℃까지 (1℃/초) 30초, 72℃ 30초, 72℃ 5분. 모든 PCR 반응은 NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix (PCR 프라이머 서열은 하기 표 참조)를 사용해 수행하였다. PCR 산물을 컬럼 정제하고, 20㎕ EB 중에 용출시킨 다음, 10㎕를 다음과 같은 프로그램에 따라 프라이머 Nested 및 LAM-SB-50을 사용한 PCR II에 사용하였다: 98℃ 30초; 사이클 12회: 98℃ 10초, 65℃까지 (1℃/초) 30초, 72℃ 30초, 72℃ 5분. 컬럼 정제한 PCR II 산물 1/3은, 여러가지 T 세포 공여체 샘플에 바코드를 심기 위해, 프라이머 PE-nest-ind-N 및 SB-20-bc-ill-N (N은 Illumina 서열분석 후 단지 이를 추적하기 위해 여러가지 T 세포 공여자 샘플을 바코딩하기 위한 Illumina TrueSeq 인덱스의 수)을 하기 PCR 프로그램에 따른 PCR III에 사용하였다: 98℃ 30초; 사이클 12회: 98℃ 10초, 64℃까지 (1℃/초) 30초, 72℃ 30초, 72℃ 5분. 최종 PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 분리하고, 200-500 bp의 스미어를 겔 분리하여 정제하였다. 라이브러리를 Beckman Coulter Genomics 사에서 Illumina HiSeq 장치를 이용해 레피드 플로우-셀로 싱글-말단 100 뉴클레오티드 서열분석 설정에 따라 서열분석을 수행하였다.
프라이머 명 서열
L(+) GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC (서열번호 1)
L(-)FspBI TAGTCCCTTAAGCGGAG-AMINO (서열번호 2)
Nested AGGGCTCCGCTTAAGGGAC (서열번호 3)
Linker GTAATACGACTCACTATAGGGC (서열번호 4)
T_Bal rev GAATTGTGATACAGTGAATTATAAGTG (서열번호 5)
T_Bal CTTGTGTCATGCACAAAGTAGATGTCC (서열번호 6)
T_Bal_long CTTGTGTCATGCACAAAGTAGATGTCCTAACTGACT (서열번호 7)
LAM_SB_50 AGTTTTAATGACTCCAACTTAAGTG (서열번호 8)
SB20h-bc-ill-N AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-TruSeq-Illumina-Index-CTTAAGTGTATGTAAACTTCCGACT (서열번호 9)
PE-nest-ind1-N CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-reverse-complement-of-TruSeq-Illumina-Index-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT (서열번호 10)
Linker_TruSeq_T+ GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT (서열번호 11)
Linker_TruSeq_T- GATCGGAAGAGCACACG-Amino (서열번호 12)
PE_nest_ind6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT (서열번호 13)
PE_nest_ind7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATagtctgGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT (서열번호 14)
PE_nest_ind8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATtcaagtGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT (서열번호 15)
생물정보 분석
출력값 (read)은 바코드를 이용해 각 공여자에 할당하고, R 소프트웨어의 Shortread 툴을 이용해 트리밍하고51, 뉴클레오티드 5 중 2개를 정성-트리밍한 나머지 서열들은 프레드 스코어 (phred score)가 <20이었다. 수득한 출력값은 Bowtie52을 이용하여 hg19 인간 게놈 어셈블리에 고유하게 맵핑하였다. 임의의 SB 삽입 부위는, 이를 뒷받침하는 독립 출력값이 10개 이상 존재하는 경우에는, 유효한 것으로 간주하였다. SB 삽입 부위의 뉴클레오티드 조성을 계산하였고, R 소프트웨어에서 SeqLogo 툴을 사용해 그래프로 작성하였다.
본원에서는, 주석이 첨부된 인간 게놈 피처 (http://genome.ucsc.edu)에서 컴퓨터 연산으로 통해 수득한 10.000 랜덤 게놈 위치 세트 또는 삽입 부위에 대해 주석을 달기 위해, BEDtools v2.17.0 53을 사용하였다. 암-관련 유전자 세트를 http://www.bushmanlab.org/links/genelists39에서 입수하였다. hg19 게놈 어셈블리의 염색체 길이에서 주석이 첨부된 모든 전사체들의 좌표를 제하여, 비-유전자 (non-genic) 카테고리를 구축하였다. SB 및 HIV의 삽입 부위 빈도를 유전자 발현 수준과 연관시키기 위해, 본 발명자들은 활성화된 인간 T 세포의 공개된 유전자 발현 데이타를 이용하였다 37.
활성화된 인간 T 세포에서 수득한 ChIP-Seq 데이타의 BED 파일을 http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lmi/epigenomes/hgtcell.aspx 54 및 MACS ChIP-Seq peak-calling algorithm 55 "macs14-t *.bed -g hs --nomodel --nolambda --space=30"에서 검색하였다.
초보존된 인자의 게놈 좌표를 입수하고 56, 인간 miRNA 유전자들 모두 다운받았다 (http://www.mirbase.org/ftp.shtml). '게놈 안전 지대' 좌표는 hg19 인간 게놈 어셈블리에 대한 모든 안전 지대 하위분류들의 모든 좌표와 교차시켜 수득하였다.
통계
통계학적 분석은 Prism 소프트웨어 (GraphPad)로 수행하였다. p<0.05인 결과는 유의한 것으로 간주하였다.
결과
MC-코딩된 전이효소 및 트랜스포존을 이용한 전위는 높은 수준의 유전자 전달을 달성할 수 있으며, DNA 형질감염과 관련된 독성을 낮춘다.
EGFRt 형질도입 마커 27,28 또는 eGFP와 cis 배치로 최적화된 CD19-CAR을 발현하는 모 pT2 트랜스포존 공여 벡터 및 과활성 SB100X 전이효소를 코딩하는 플라스미드로부터 MC를 제조하였다 (도 1B). 그런 후, 건강한 공여자의 CD8+ T 세포에 형질감염을 수행하고, 트랜스포존 및 전이효소를 MC (MC-MC) 또는 플라스미드 (P-P)로서 전달하였을 때 달성할 수 있는 전이유전자 발현의 전위율 및 안전성과 비교하였다. 전체 실험에서, 동량의 트랜스포존 및 전이효소 벡터, 및 동일 몰량의 MC 및 이의 대응되는 플라스미드를 형질감염시켰다. 형질감염 후 분석한 모든 시간대에 MC 조합물로 변형된 T 세포에서 현저하게 높은 수준의 전위율이 확인되었다. 14일째에, CAR-변형된 (즉 EGFRt+) T 세포의 평균 %는 MC의 경우 49.8%이었고, 플라스미드의 경우에는 12.8%에 불과하였으며, 플라스미드-코딩된 SB100X 전이효소 및 CAR 트랜스포존 보다는 MC-코딩된 SB100X 전이효소 및 CAR 트랜스포존으로 형질감염 후 평균 4.4배 더 높았다 (n=7, p<0,0001). 14일 후 EGFRt+ T 세포의 %는 안정적으로 유지되었으며, 잠재적으로 CD19-CAR33의 고유한 신호전달로 인해 휴지기 T 세포에서 시간 경과에 따라 심지어 조금씩 증가하였다 (도 3B). EGFRt에 대해 선택되고 CD19+ 피더 세포로 증식시킨 T 세포는 적어도 6주간의 또 다른 배양 시기에 복수의 증식 사이클 동안 안정적인 전이유전자 발현성을 나타내었다. 전위 효율에 대한 비슷한 데이타는 CD8+ T 세포에서 eGFP에 대해서도 수득되었으며 (도 8A, B), 여러 명의 공여체로부터 수득한 CD4+ T 세포에서 CD19-CAR과 eGFP를 이용하여, MC가 매개 전위에서 기존의 플라스미드 보다 우수하다는 본 발명의 발견 결과가 검증되었다 (도 9).
SB 전위를 통해 유전자-변형된 T 세포를 치료학적으로 적절한 수로 신속하게 제조하는 방법은, 플라스미드 DNA의 전기적 형질감염으로 인한 심각한 독성으로 인해 제한적이다. 본 발명자들은, 우수한 전위율을 매개할 뿐만 아니라, MC는 T 세포에 대한 독성 역시 낮다. 형질감염 후 48시간째에 생존 T 세포의 %는, 플라스미드와 비교해, MC로 변형된 CD8+ T 세포에서 평균적으로 1.4배 (CD19-CAR) 및 3.2배 (eGFP) 높았다 (둘다: n=3, p<0.05) (도 2D; 도 3B; 도 8C). MC의 우수한 전위율 및 낮은 독성으로, 배양 14일내에 달성될 수 있는 CD19-CAR T 세포의 수율이, 심지어 항원-의존적인 증식없이도, 약 6배 높아졌다 (n=4, p<0,05) (도 3E). 요컨대, 이들 데이타는, 트랜스포존 및 전이효소 공여 벡터로서 MC의 사용이 인간 T 세포에서 전위를 매개하는데 있어 실현가능하며, 매우 효율적이며, 플라스미드 DNA 보다 우수하다는 것을, 입증해준다.
mRNA -코딩된 SB 전이효소를 이용한 MC에서의 전위
다음으로, MC 대신 mRNA로서 SB100X를 제공하는 것이 MC 트랜스포존 공여 벡터에서 전위를 달성하는데 충분한지를 조사하였다. 적정 실험을 수행해, SB100X mRNA 및 MC의 최적 비율을 측정하고 (1:1, 2:1, 4:1, 8:1), 형질감염 후 14일에 유세포 측정에 의해 EGFRt 발현을 분석하였다. 모든 비율에서 플라스미드에 비해 mRNA-MC 조합을 사용한 경우에서 보다 우수한 전위율이 관찰되었다 (도 2B, C). 최고 전위율은 SB100X mRNA 및 CD19-CAR MC가 4:1 비율로 사용되었을 때 달성되었으며, 유전자 전달 수율은 플라스미드 조합 (P-P)의 3.7배였으며 (n=3; p<0,001), MC 조합과는 실질적인 차이가 없었다 (도 2B, C). SB100X mRNA의 양을 더욱 높이면 (8:1 비율), 아마도 저해 효과 과 발생으로 인해, 전위 효율이 감소되었다 34. 또한, SB100X mRNA를 MC 트랜스포존과 조합 사용하면, 플라스미드와 비교해, 형질감염 후 48시간에, 생존 T 세포의 비율이 현저하게 증가하였다 (1.4배 높음; n=3; p<0.05). 이는, 다시금, 14일의 배양 기간 종료시, 유전자-변형된 T 세포는 실질적으로 고 수율로 확인되었다 (평균 3.6배 높음; n=4) (도 3B). 중요하게도, 최적의 SB100X mRNA 및 CD19-CAR MC 조합 (4:1 비율)을 이용하여 달성된 전위율은 정제된 나이브, 중심 기억 및 작동자 기억 CD8+ T 세포들에서 마찬가지로 높았으며 (도 10), 이는 이러한 유전자 전달 전략이 이들 표현형 및 기능적으로 구분되는 서브세트들을 벌크 CD8+ T 세포 집단에서 CD29-CAR로 변형시키는데 편향성이 없다는 것을 의미한다. 요컨대, 이들 데이타는, SB100X를 상대적으로 수명이 짧은 mRNA로서 사용하는 것이 MC 트랜스포존 공여 벡터로부터의 전위를 달성하기에 충분하며, 플라스미드와 비교해 탁월한 수준의 안정적인 유전자 전달과 강화된 T 세포 생존성을 달성함을, 입증해준다.
MC 전위는 CD19-CAR T 세포의 강력한 항-종양 기능을 시험관내 및 생체내 부여한다.
다음으로, MC 및 플라스미드로부터 SB 전위에 의해 CAR-변형된 T 세포의 기능을 분석하고, 이의 효능을 LV 형질도입에 의해 동일한 CD19-CAR로 변형된 T 세포와 비교하였다. CAR-변형된 및 비-형질도입된 CD8+ 및 CD4+ T 세포주 세트를 n=3 공여체로부터 수득하고, CAR-발현성 T 세포를 EGFRt 마커를 사용해 >90% 순도로 농화하였다 (도 4A). 먼저, 세포용해 활성을 CD19를 안정적으로 발현하는 K562 세포, 그리고 타겟 세포로서 Raji 및 JeKo-1 림프종을 이용해 평가하였다. mRNA-MC, MC-MC 및 P-P 전위에 의해 변형된 다양한 CD8+ CD19-CAR T 세포주들은, 유사하게 강력하고 특이적인 세포 용해를, LV 형질도입에 의해 제조된 CAR T 세포에서 수득되는 결과와 비슷한 수준으로, 나타내었다 (도 4B). CD19+ 림프종과의 공동-배양 후 수행한 정량적인 사이토카인 분석에서, 모든 CD8+ 및 CD4+ CD19-CAR T 세포주에서 유사한 수준의 IFN-γ 및 IL-2가 생산되었다 (도 4C). 나아가, 유사한 생산성 증식 (productive proliferation) (72시간내 세포 분열 횟수 ≥3)이, SB 전위 또는 LV 형질도입에 의한 유전자-변형 여부와 관계없이, CFSE 희석에 의해 모든 CD8+ 및 CD4+ CD19-CAR T 세포주에서 확인되었다 (도 4D, E).
다음으로, 전신성 CD19+ 림프종 이종이식 모델 (NSG/Raji-ffLuc)에서 항-종양 효능을 분석하였으며, 분석은 임상 전위에 가장 적절한 조합일 것이므로, SB100X mRNA 및 CD19-CAR MC으로 변형된 CAR T 세포에 집중하였다. 본 실험에서, SB-변형된 CD8+ 및 CD4+ CD19-CAR T 세포의 1회 투여시 매개되는 강력한 항-종양 효과가 검증되어, 모든 처리 마우스에서 림프종이 빠르게 제거되었으며 (각각 n=5 또는 n=4), 대조군 T 세포가 처리된 마우스에서는 공격적이고 유해한 림프종이 관찰되었다 (도 5A, B). SB-변형된 CAR T 세포는 반응 피크에서 말초혈에서 검출할 수 있었으며, 림프종 제거 후 모든 마우스의 골수에서 지속되었다 (도 5D). 골수로부터 완전한 림프종 제거는 유세포 측정에 의해 검증되었다 (도 5E). Kaplan-Meier 분석 결과, 전체 SB CD19-CAR 처리군의 관찰 기간 종료시 생존율은, 비교를 위한 LV-형질전이된 CD19-CAR T 세포로 처리된 마우스에서와 동일하게 나타났다 (도 5C). 요컨대, 이들 데이타는, MC 트랜스포존 공여 벡터로부터의 SB 전위를 통해 제조된 CD19-CAR T 세포가 시험관내 및 생체내에서 매우 강력하며, LV 형질전이에 의해 제조된 CD19-CAR T 세포와 유사하게 효과적인 항-종양 반응을 매개함을 입증해준다.
트랜스포존 삽입 부위 분석으로 근접-랜덤 게놈 삽입 패턴이 확인된다.
안전성과 관련된 문제를 해결하기 위해, 유전자 카피 수 및 삽입 부위 분석을 위해 게놈 DNA를, SB100X mRNA 및 CD19-CAR MC로 변형된 T 세포로부터 준비하였다. CD8+ T 세포 클론의 경우, 평균 n=5 (각각 범위 3-8 및 3-11) CD19-CAR 트랜스포존 카피, CD4+ T 세포 클론의 경우, n=6 (범위 3-12) 트랜스포존 카피가 제한 희석에 의해 수득된 것으로 확인되었다 (도 6B, C). 이후, 다클론 CD8+ CD19-CAR T 세포로부터 유래된 삽입 부위 라이브러리를 Illumina MySeq 플랫폼에서 대규모 병렬 서열분석을 위해 구축하였다. MC-유래 CAR 트랜스포존의 고유 삽입 부위 26,834곳을 맵핑하고 특징을 규명하였다. 인간 CD4+ T 세포에서 LV 삽입 부위에 대한 데이타베이스를 기준으로서, 그리고 비교에 이용하였다 35. 트랜스포존 삽입 부위 주변 20-kbp 범위에서 뉴클레오티드 빈도 분석을 통해, MC로부터의 전위가 랜덤 뉴클레오티드 빈도와 근접하게 이들 영역에서 발생하는 것으로 확인되었으며, LV 삽입은 GC-풍부한 염색체 부위에 편향된 것으로 확인되었다 (도 11A, B). 그러나, 이들 2가지 벡터 시스템은, 삽입 부위 주변의 더 작은 1.5-kbp 범위에서, AT-풍부 DNA를 선호하는 것으로 나타났다 (도 11 C, D). 회문 구조 ATATATAT 모티프가 검출되었으며, 이는 통상적인 공여 플라스미들로부터 이동한 트랜스포존에서 확인되는 바와 마찬가지로 모든 MC-유래 트랜스포존에 인접한 SB의 TA 다이뉴클레오티드 타겟 서열을 함유한다 36 (도 12).
다음으로, CD19-CAR 트랜스포존이 게놈의 개별 부위, 예를 들어, 엑손 및 인트론, 유전자 및 암 관련 유전자에 삽입하는데 선호성이 존재하는 지를 분석하였다. MC에서 전위는 매우 약하지만, 유전자 카테고리에 대해 통계학적으로 유의한 (<0.001) 편향성을 가지는 것으로 확인되었지만; 평가한 모든 카테고리에서, 이러한 선호성은 LV 삽입에서 확인되는 수준 보다 실질적으로 낮았다 (도 7A). 중요하게도, 트랜스포존 삽입은, 예상한 랜덤 빈도와 비교해, 암-관련 유전자에서 1.29배, 유전자에 1.15배 높게 확인되었으며, 이들 카테고리에서 LV-에 의한 삽입은 각각 2.11배 및 2.64배 높았다 (p<0.01 및 p<0.05). 일관되게, CD19-CAR 트랜스포존은 랜덤 방식과 유사한 수준으로 비-유전자 영역에 삽입되었지만 (랜덤 대비 0.89배), LV 전이유전자는 이들 영역에서 매우 낮은 빈도로 관찰되었다 (랜덤 대비 0.23배) (도 7A).
나아가, 유전자내 트랜스포존 삽입 빈도 및 유전자 발현 수준 간에 연관성이 존재하는 지를 확인하였다. 활성화된 인간 T 세포에 대해 이용가능한 트랜스트립톰 프로파일 37을 이용하였으며, 유전자들을 동일 크기로 구성된 그룹 10종으로 발현 수준에 따라 클러스터링하고, 각 그룹에서 트랜스포존 및 LV 삽입을 계수하였다. 이 데이타에서, MC-유래 트랜스포존이 랜덤 방식에 가깝게 저-발현성 유전자와 고-발현성 유전자 둘다에 삽입되었고, 고-발현성 유전자에 대한 선호성이 극히 낮다는 것이, 확인되었다 (도 7B). 이와는 대조적으로, LV는 고-발현성 유전자로의 삽입 선호성이 강하였으며, 삽입 빈도와 해당 유전자의 발현 수준 간의 지수 상관 관계가 존재하였다 (R2 0.976) (도 7B). 또한, 본 발명자들은, 모두 고-발현성 유전자에 대한 염색질 마크인, H3K36- 및 H3K79-트리메틸화 및 RNA 중합효소 II 테그가 존재하는 염색체 영역내에서, LV 삽입체의 강한 농화를 확인하였다. LV 삽입체는, 4K20-, H3K27- 및 H3K9-트리메틸화로 표시된, 전사적으로-비활성의 헤테로크로마틱 염색체 세그먼트에서는 낮은 빈도로 확인되었다 (도 13). 대조적으로, 트랜스포존 삽입은 활성 전사 마커에 대해 약간의 친화성을 나타내었으며, 전사적으로 침묵 상태인 염색질 도메인으로의 삽입 역시 동일한 수준이었다 (도 13). 요컨대, 이들 데이타는, MC에서 이동한 SB 트랜스포존은 인간 T 세포의 게놈에 거의-랜덤 삽입 패턴을 보이며, LV와는 대조적으로 고 발현성 또는 전사 활성형 유전자에 대해 선호성이 없다는 것을, 보여준다.
MC에서 이동한 CD19-CAR 트랜스포존은 게놈 안전 지대에 효과적으로 삽입된다.
이상적으로는, 전위는 CAR 전이유전자의 삽입이 유전자-변형된 T 세포의 전사 완전성을 손상시키지 않는 게놈 영역에서 발생하는 것이다. 따라서, MC-변형된 CD19-CAR T 세포의 삽입 부위 라이브러리에, 이러한 게놈 안전 지대 (GSH) 38,39를 정의하기 위해 확립된 기준을 적용하였으며, 이를 LV 삽입 부위 데이타세트와 비교하였다. 게놈에서 컴퓨터 연산으로 수득한 랜덤 위치는 GSH에 빈도 28%로 맵핑되었다. CD19-CAR 트랜스포존 삽입 부위들 중 20.8%가, LV 삽입 부위는 불과 3%가, 5가지의 GSH 기준들을 모두 만족시키는 것으로 확인되었다 (도 7C). 특히, LV와 비교해, 트랜스포존 삽입 부위들은 암 관련 유전자 (59% vs. 38%) 및 유전자에서 >300 kbp 떨어진 부위에 현저하게 높은 비율로 위치하였는데, 이 2가지는 중요한 기준이다 (도 7C). 본 분석에서, 공지된 발암유전자내 SB 트랜스포존 및 LV의 삽입은 발생하지 않았으며 39, 게놈의 극 소수 일부를 차지하는 초보존된 게놈 영역에도 삽입되지 않았다. 요컨대, 본 발명자들은, CAR T 세포와 같은 기능성 재조합 포유류 세포가 MC DNA에서 SB-매개 전위 등의 전위에 의해 제조될 수 있다는 것을 입증하였다. MC-유래 트랜스포존은 매우 우호적인 게놈 삽입 프로파일을 가진다.
즉, 본 발명에 따르면, 본 발명의 강화된 전위 전략은 LV-기반의 유전자 전달과 같은 공지된 바이러스 유전자 전달에 비해 안전성 이점을 제공해준다.
실시예 2: 비-활성화된 T 세포에서 mRNA-코딩된 과활성 슬리핑 뷰티 전이효소 100X (SB100X) 및 미니서클 DNA-코딩된 CD19-CAR 전이유전자를 이용한 슬리핑 뷰티-매개 전위
재료 및 방법:
인간 개체
뷔르츠부르크 대학의 생명윤리 위원회로부터 승인받은 연구 프로토콜에 참여하기 위해 서면 동의를 받은 후 건강한 공여자들로부터 말초 혈액을 수득하였다.
트랜스포존 및 렌티바이러스 벡터 구축
EF1/HTLV 하이브리드 프로모터, Kozak 및 eGFP 서열로 구성되며 이후에 정지 코돈이 존재하는 카세트를 합성하여 (GeneArt), pT2/HB 트랜스포존 공여 벡터 (Addgene, #26557)에 서브클로닝하였다. 그런 후, eGFP는, 기존 렌티바이러스 벡터 epHIV7 27, 28로부터 유래되는, T2A 인자 및 절단된 상피 성장 인자 수용체 (EGFRt)와 시스 배위로 존재하는 CD19-CAR을 코딩하는 유전자 (FMC63 타겟팅 도메인, IgG4-Fc Hinge 스페이서, CD3zeta 및 4-1BB 공동-자극)로 교체하였다. pCMV(CAT)T7-SB100X 벡터는 Addgene (#34879) 사에서 입수하였다.
미니서클 DNA 및 SB100X mRNA 제조
GFP 및 CD19-CAR_EGFRt 트랜스포존을 코딩하는 MC와 SB100X를 PlasmidFactory (Bielefeld) 사에서 부위-특이적인 재조합을 이용해 모 pT2 플라스미드로부터 제조하고, 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 폴리(A)-테일형 ARCA-capped SB100X mRNA를 mMessage mMachine kit (Ambion)키트를 사용해 실험실에서 제조하거나, EUFETS (Idar-Oberstein)에서 합성하였다.
유전자-변형된 T 세포 구축 및 시험관내 분석
Ficoll-Hypaque 상에서 원심분리하여 말초혈로부터 말초혈 단핵구 세포를 수득하였다. CD8+ 및 CD4+ T 세포를 면역자기 비드 (Miltenyi)를 이용한 네거티브 분리에 의해 PBMC로부터 정제하였다. SB100X 전이효소 mRNA 및 CD19-CAR-코딩 MC (중량비 4:1)의 형질감염을, RPMI-1640 + 10% 인간 혈청, 글루타민, 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (T 세포 배지) 및 50 U/mL IL-2 중에 분리하거나 또는 밤새 배양한 직후에 수행하였다. 형질감염은 제조사의 지침 (Lonza)에 따라 4D-Nucleofector에서 1x106 T 세포에 대해 수행하였다. 형질감염 후, T 세포를 50 U/mL IL-2 첨가된 T 세포 배지에서 증식시켰다. 트리판 블루 염색을 수행해 살아있는 T 세포를 정량하였다. T 세포를 다음과 같은 접합된 mAb로 염색하고: CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD62L; 생존/사멸 세포 식별을 위해 7-AAD (BD Biosciences)로 염색하였다. CAR+ (즉, EGFRt+) T 세포는 바이오틴-접합된 anti-EGFR 항체 (ImClone Systems Inc.) 및 스트렙타비딘-PE로 염색하여 검출하였다. FACSCanto (BD)에서 유세포 분석을 수행하고, FlowJo 소프트웨어 (Treestar)로 데이타를 분석하였다. 일부 실험에서는, T 세포를 방사선 처리된 CD19+ 피더 세포를 사용해 7일간 기능성 검사 전에 증식시켰으며, 공지된 바와 같이 기능성 분석을 수행하였다 29-31.
세포독성, 사이토카인 분비 및 CFSE 증식 분석
반딧불이 루시퍼라제를 발현하는 타겟 세포를 3세트로 5x103 세포/웰로 다양한 작동자:타겟 (E:T) 비율로 작동자 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 4시간 인큐베이션한 후, 루시페린 기질을 공동-배양물에 첨가하였으며, 타겟 세포 및 T 세포가 수용된 웰에서의 발광 신호 감소를 루미노미터 (Tecan)로 측정하였으며, 타겟 세포 단독과 비교하였다. 특이적인 세포용해를 표준 식으로 계산하였다. 사이토카인 분비를 분석하기 위해, 50x103 T 세포를 3세트로 웰에 타겟 세포와 함께 2:1 (Raji 및 Jeko-1) 또는 4:1 (K562/CD19 및 K562) 비율로 접종하고, 24시간 배양 후 수득한 상층액에서 ELISA (Biolegend)에 의해 IFN-γ 및 IL-2 생산을 측정하였다. 증식을 분석하기 위해, 50x103 T 세포를 0.2 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, Invitrogen)로 표지하고, 헹군 다음, 외인성 사이토카인을 첨가하지 않은 배지 중에 4:1 (K562/CD19 및 K562) 비율로 타겟 세포와 함께 3세트로 웰에 접종하였다. 72시간 배양한 후, 세포를 anti-CD8/CD4 mAb 및 7-AAD로 표지하여, 분석에서 죽은 세포를 제외시켰다. 샘플을 유세포 측정으로 분석하고, CFSE 희석에 의해 살아있는 T 세포의 세포 분열을 조사하였다. 증식 지수를 FlowJo 소프트웨어를 사용해 계산하였다.
결과:
CD8+ T 세포를 PBMC에서 분리하고, SB100X-코딩 mRNA 및 CD19-CAR-코딩 MC (중량 비 4:1)로 형질감염시켰다. 형질감염 후, T 세포를 T 세포 배지에서 재조합 IL-2 (50U/ml)의 존재 하에 밤새 두었다. 그런 후, T 세포를 방사선 처리된 CD19+ Raji 림프종 세포 (작동자:타겟 비 = 1:7)로 자극하고, 증식시켰다. 대조군 T 세포를 모의-형질감염시키고, 재조합 IL-2 (50U/ml)의 존재 하에 밤새 둔 다음 다시 anti-CD3/anti-CD28 비드 (Dynal)로 자극하여 증식시켰다. EGFRt 발현을 형질감염 후 14일째에 유세포 측정에 의해 분석하였으며, 그 결과 SB100X mRNA 및 CD19-CAR MC로 형질감염된 T 세포에서 안정적인 유전자-전달이 높은 수준으로 확인된 반면 (도 14A), 모의-형질감염된 T 세포에서는 그렇지 않았다 (도 14B). 기능성 분석으로 높은 수준의 특이적인 세포용해 활성, 사이토카인 분비 (IFN-g, IL-2, TNF-a) 및 CD19-CAR T 세포의 특이적인 생산성 증식이 검증되었다.
다른 실험으로, CD8+ T 세포를 형질감염 후, Raji 림프종 세포 대신 방사선 처리된 CD19+ TM EBV-LCL (Epstein-Barr Virus-transformed lymphoblastoid cell line) (작동자:타겟 비율 = 1:7)로 자극하고, 증식시켰다. 뉴클레오펙션 후 14일 에 EGFRt 발현을 유세포 측정으로 분석한 결과, 높은 수준의 안정적인 CD19-CAR 유전자-전달이 확인되었다 (도 15A). 기능성 분석에서, CD19-CAR T 세포는 CD19+ 타겟 세포에 대해 높은 수준의 특이적인 세포용해 활성을 부여하였으며 (도 15B), 사이토카인을 생산하고, CD19+ 타겟 세포로의 자극 후 생산성 증식을 나타내는 것으로 확인되었다.
또 다른 실험에서는, 50U/mL IL-2가 첨가된 T 세포 배지에서 CD8+ T 세포를 형질감염 후 유지시켰다. 뉴클레오펙션 후 14일째에 수행된 EGFRt 발현을 유세포 측정으로 분석하였으며, CD19-CAR 유전자 전달이 안정적으로 높은 비율로 이루어진 것을 확인하였다 (도 16A). 기능성 분석에서, 높은 수준의 특이적인 세포용해 활성 (도 16B), 사이토카인 분비 (IFN-g, IL-2, TNF-a), 및 CD19+ 타겟 세포로의 자극 후 CD19-CAR T 세포의 특이적인 생산성 증식이 확인되었다.
실시예 3: 비-활성화된 T 세포에서 미니서클 DNA-코딩된 과활성 슬리핑 뷰티 전이효소 100X (SB100X) 및 미니서클 DNA-코딩된 CD19-CAR 전이유전자를 이용한 슬리핑 뷰티-매개 전위
재료 및 방법:
인간 개체
뷔르츠부르크 대학의 생명윤리 위원회로부터 승인받은 연구 프로토콜에 참여하기 위해 서면 동의를 받은 후 건강한 공여자들로부터 말초 혈액을 수득하였다.
트랜스포존 및 렌티바이러스 벡터 구축
EF1/HTLV 하이브리드 프로모터, Kozak 및 eGFP 서열로 구성되며 이후에 정지 코돈이 존재하는 카세트를 합성하여 (GeneArt), pT2/HB 트랜스포존 공여 벡터 (Addgene, #26557)에 서브클로닝하였다. 그런 후, eGFP는, 기존 렌티바이러스 벡터 epHIV7 27, 28로부터 유래되는, T2A 인자 및 절단된 상피 성장 인자 수용체 (EGFRt)와 시스 배위로 존재하는 CD19-CAR을 코딩하는 유전자 (FMC63 타겟팅 도메인, IgG4-Fc Hinge 스페이서, CD3zeta 및 4-1BB 공동-자극)로 교체하였다. pCMV(CAT)T7-SB100X 벡터는 Addgene (#34879) 사에서 입수하였다.
미니서클 DNA 및 SB100X mRNA 제조
GFP 및 CD19-CAR_EGFRt 트랜스포존을 코딩하는 MC와 SB100X를 PlasmidFactory (Bielefeld) 사에서 부위-특이적인 재조합을 이용해 모 pT2 플라스미드로부터 제조하고, 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
유전자-변형된 T 세포 구축 및 시험관내 분석
Ficoll-Hypaque 상에서 원심분리하여 말초혈로부터 말초혈 단핵구 세포를 수득하였다. CD8+ 및 CD4+ T 세포를 면역자기 비드 (Miltenyi)를 이용한 네거티브 분리에 의해 PBMC로부터 정제하였다. 전이효소 및 트랜스포존 공여 MC 벡터의 형질감염을, RPMI-1640 + 10% 인간 혈청, 글루타민, 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 50 U/mL IL-2 중에 분리 또는 밤새 배양한 직후에 수행하였다. 형질감염은 제조사의 지침 (Lonza)에 따라 4D-Nucleofector에서 1x106 T 세포에 대해 수행하였다. 뉴클레오펙션 후, T 세포를 RPMI-1640 + 10% 인간 혈청, 글루타민, 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 50 U/mL IL-2에서 증식시켰다. 트리판 블루 염색을 수행해 살아있는 T 세포를 정량하였다. T 세포를 다음과 같은 접합된 mAb로 염색하고: CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD62L; 생존/사멸 세포 식별을 위해 7-AAD (BD Biosciences)로 염색하였다. CAR+ (즉, EGFRt+) T 세포는 바이오틴-접합된 anti-EGFR 항체 (ImClone Systems Inc.) 및 스트렙타비딘-PE로 염색하여 검출하였다. FACSCanto (BD)에서 유세포 분석을 수행하고, FlowJo 소프트웨어 (Treestar)로 데이타를 분석하였다. 일부 실험에서는, T 세포를 방사선 처리된 CD19+ 피더 세포를 사용해 7일간 기능성 검사 전에 증식시켰으며, 공지된 바와 같이 CAR T 세포의 기능성 분석을 수행하였다 29-31.
세포독성, 사이토카인 분비 및 CFSE 증식 분석
반딧불이 루시퍼라제를 발현하는 타겟 세포를 3세트로 5x103 세포/웰로 다양한 작동자:타겟 (E:T) 비율로 작동자 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 4시간 인큐베이션한 후, 루시페린 기질을 공동-배양물에 첨가하였으며, 타겟 세포 및 T 세포가 수용된 웰에서의 발광 신호 감소를 루미노미터 (Tecan)로 측정하였으며, 타겟 세포 단독과 비교하였다. 특이적인 세포용해를 표준 식으로 계산하였다 2. 사이토카인 분비를 분석하기 위해, 50x103 T 세포를 3세트로 웰에 타겟 세포와 함께 2:1 (Raji 및 Jeko-1) 또는 4:1 (K562/CD19 및 K562) 비율로 접종하고, 24시간 배양 후 수득한 상층액에서 ELISA (Biolegend)에 의해 IFN-γ 및 IL-2 생산을 측정하였다. 증식을 분석하기 위해, 50x103 T 세포를 0.2 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, Thermo)로 표지하고, 헹군 다음, 외인성 사이토카인을 첨가하지 않은 배지 중에 4:1 (K562/CD19 및 K562) 비율로 타겟 세포와 함께 3세트로 웰에 접종하였다. 72시간 배양한 후, 세포를 anti-CD8/CD4 mAb 및 7-AAD로 표지하여, 분석에서 죽은 세포를 제외시켰다. 샘플을 유세포 측정으로 분석하고, CFSE 희석에 의해 살아있는 T 세포의 세포 분열을 조사하였다. 증식 지수를 FlowJo 소프트웨어를 사용해 계산하였다.
결과:
CD4+ 및 CD8+ T 세포를 PBMC에서 분리하고, SB100X-코딩 MC 및 CD19-CAR-코딩 MC (각각 CD4+ 및 CD8+ T 세포)로 형질감염시켰다. 형질감염 후, T 세포를 50 U/mL IL-2가 첨가된 T 세포 배지에서 밤새 두었다. 그런 후, T 세포를 anti-CD3/anti-CD28 비드로 자극하고, 증식시켰다. 대조군 T 세포를 모의-형질감염시키고, 50 U/mL IL-2가 첨가된 T 세포 배지에서 밤새 둔 다음 다시 anti-CD3/anti-CD28 비드로 자극하여 증식시켰다. EGFRt 발현을 형질감염 후 14일째에 유세포 측정에 의해 분석하였으며, 그 결과 SB100X MC 및 CD19-CAR MC로 형질감염된 T 세포에서 안정적인 유전자-전달이 높은 수준으로 확인된 반면 (도 17A, B), 모의-형질감염된 T 세포에서는 그렇지 않았다. 기능성 실험에서, CD19-CAR 형질전이된 T 세포는 CD19+ 타겟 세포에 대해 높은 수준의 특이적인 세포용해를 부여하고 (도 17C), 사이토카인을 생산하며, CD19+ 타겟 세포를 이용한 자극 후 생산적인 증식을 달성하였다.
실시예 4: T 세포에서 통상적인 전기천공기를 이용한, 미니서클 DNA-코딩된 과활성 슬리핑 뷰티 전이효소 100X (SB100X) 및 미니서클 DNA-코딩된 CD19-CAR 전이유전자의 슬리핑 뷰티-매개 전위
재료 및 방법:
인간 개체
뷔르츠부르크 대학의 생명윤리 위원회로부터 승인받은 연구 프로토콜에 참여하기 위해 서면 동의를 받은 후 건강한 공여자들로부터 말초 혈액을 수득하였다.
트랜스포존 및 렌티바이러스 벡터 구축
EF1/HTLV 하이브리드 프로모터, Kozak 및 eGFP 서열로 구성되며 이후에 정지 코돈이 존재하는 카세트를 합성하여 (GeneArt), pT2/HB 트랜스포존 공여 벡터 (Addgene, #26557)에 서브클로닝하였다. 그런 후, eGFP는, 기존 렌티바이러스 벡터 epHIV7 27, 28로부터 유래되는, T2A 인자 및 절단된 상피 성장 인자 수용체 (EGFRt)와 시스 배위로 존재하는 CD19-CAR을 코딩하는 유전자 (FMC63 타겟팅 도메인, IgG4-Fc Hinge 스페이서, CD3zeta 및 4-1BB 공동-자극)로 교체하였다. pCMV(CAT)T7-SB100X 벡터는 Addgene (#34879) 사에서 입수하였다.
미니서클 DNA 제조
eGFP 및 CD19-CAR_EGFRt 트랜스포존을 코딩하는 MC와 SB100X를 PlasmidFactory (Bielefeld) 사에서 부위-특이적인 재조합을 이용해 모 pT2 플라스미드로부터 제조하고, 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
유전자-변형된 T 세포 구축 및 시험관내 분석
Ficoll-Hypaque 상에서 원심분리하여 말초혈로부터 말초혈 단핵구 세포를 수득하였다. CD8+ T 세포를 면역자기 비드 (Miltenyi)를 이용한 네거티브 분리에 의해 PBMC로부터 정제하였다. T 세포를 2일간 anti-CD3/anti-CD28 비드 (Dynal)로 활성화하였다. 트랜스포존 및 전이효소 MC 벡터의 형질감염을, 제조사의 지침 (BTX)에 따라 Agile Pulse MAX System을 사용해 수행하였다. 전기천공 후, T 세포를 50U/ml IL-2 첨가된 T 세포 배지에서 밤새 유지시킨 후, anti-CD3/anti-CD28 비드 (Dynal)로 자극하였다. 트리판 블루 염색을 수행해 살아있는 T 세포를 정량하였다. T 세포를 다음과 같은 접합된 mAb로 염색하고: CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD62L; 생존/사멸 세포 식별을 위해 7-AAD (BD Biosciences)로 염색하였다. CAR+ (즉, EGFRt+) T 세포는 바이오틴-접합된 anti-EGFR 항체 (ImClone Systems Inc.) 및 스트렙타비딘-PE로 염색하여 검출하였다. 전기천공 후 14일째에 FACSCanto (BD)에서 유세포 분석을 수행하고, FlowJo 소프트웨어 (Treestar)로 데이타를 분석하였다.
세포독성, 사이토카인 분비 및 CFSE 증식 분석
반딧불이 루시퍼라제를 발현하는 타겟 세포를 3세트로 5x103 세포/웰로 다양한 작동자:타겟 (E:T) 비율로 작동자 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 4시간 인큐베이션한 후, 루시페린 기질을 공동-배양물에 첨가하였으며, 타겟 세포 및 T 세포가 수용된 웰에서의 발광 신호 감소를 루미노미터 (Tecan)로 측정하였으며, 타겟 세포 단독과 비교하였다. 특이적인 세포용해를 표준 식으로 계산하였다 2. 사이토카인 분비를 분석하기 위해, 50x103 T 세포를 3세트로 웰에 타겟 세포와 함께 2:1 (Raji 및 Jeko-1) 또는 4:1 (K562/CD19 및 K562) 비율로 접종하고, 24시간 배양 후 수득한 상층액에서 ELISA (Biolegend)에 의해 IFN-γ 및 IL-2 생산을 측정하였다. 증식을 분석하기 위해, 50x103 T 세포를 0.2 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, Thermo)로 표지하고, 헹군 다음, 외인성 사이토카인을 첨가하지 않은 배지 중에 4:1 (K562/CD19 및 K562) 비율로 타겟 세포와 함께 3세트로 웰에 접종하였다. 72시간 배양한 후, 세포를 anti-CD8/CD4 mAb 및 7-AAD로 표지하여, 분석에서 죽은 세포를 제외시켰다. 샘플을 유세포 측정으로 분석하고, CFSE 희석에 의해 살아있는 T 세포의 세포 분열을 조사하였다. 증식 지수를 FlowJo 소프트웨어를 사용해 계산하였다.
결과:
CD8+ T 세포를 PBMC에서 분리하였다. 일 예로, 3.5x10e6 CD8+ T 세포를 각각 SB100X-코딩 MC 4 ㎍ 및 CD19-CAR-코딩 MC 4 ㎍ (비율 1:1)이 든 4 mm 큐벳 (부피 100㎕)에서 전기천공을 수행하였다. 전기천공은 각 진폭 1200 V으로 2회 펄스, 펄스 지속 기간 0.1 millisecond (ms) 및 펄스 간격 0.2 ms로 수행하였다. 전기천공 후, T 세포를 IL-2 (50U/ml)가 첨가된 T 세포 배지에서 밤새 두었다. 그런 후, T 세포를 anti-CD3/anti-CD28 비드로 자극한 다음 증식시켰다. 대조군 T 세포를 모의-형질감염시키고, 재조합 IL-2의 존재 하에 밤새 둔 다음 다시 anti-CD3/anti-CD28 비드로 자극하여 증식시켰다. EGFRt 발현을 형질감염 후 14일째에 유세포 측정에 의해 분석하였으며, 그 결과 SB100X MC 및 CD19-CAR MC로 형질감염된 T 세포에서 안정적인 유전자-전달이 높은 수준으로 확인된 반면 (도 18), 모의-형질감염된 T 세포에서는 그렇지 않았다. 기능성 실험에서, CD19-CAR 형질전이된 T 세포는 CD19+ 타겟 세포에 대해 높은 수준의 특이적인 세포용해를 부여하고, 사이토카인을 생산하며, CD19+ 타겟 세포를 이용한 자극 후 생산적인 증식을 달성하였다.
실시예 5: 슬리핑 뷰티-매개 전위 후 T 세포의 게놈에서의 트랜스포존 카피수 적정
재료 및 방법:
인간 개체
뷔르츠부르크 대학의 생명윤리 위원회로부터 승인받은 연구 프로토콜에 참여하기 위해 서면 동의를 받은 후 건강한 공여자들로부터 말초 혈액을 수득하였다.
트랜스포존 및 렌티바이러스 벡터 구축
EF1/HTLV 하이브리드 프로모터, Kozak 및 eGFP 서열로 구성되며 이후에 정지 코돈이 존재하는 카세트를 합성하여 (GeneArt), pT2/HB 트랜스포존 공여 벡터 (Addgene, #26557)에 서브클로닝하였다. 그런 후, eGFP는, 기존 렌티바이러스 벡터 epHIV7 27, 28로부터 유래되는, T2A 인자 및 절단된 상피 성장 인자 수용체 (EGFRt)와 시스 배위로 존재하는 CD19-CAR을 코딩하는 유전자 (FMC63 타겟팅 도메인, IgG4-Fc Hinge 스페이서, CD3zeta 및 4-1BB 공동-자극)로 교체하였다. pCMV(CAT)T7-SB100X 벡터는 Addgene (#34879) 사에서 입수하였다.
미니서클 DNA 제조
eGFP 및 CD19-CAR_EGFRt 트랜스포존을 코딩하는 MC와 SB100X를 PlasmidFactory (Bielefeld) 사에서 부위-특이적인 재조합을 이용해 모 pT2 플라스미드로부터 제조하고, 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
유전자-변형된 T 세포 구축 및 시험관내 분석
Ficoll-Hypaque 상에서 원심분리하여 말초혈로부터 말초혈 단핵구 세포를 수득하였다. CD8+ 및 CD4+ T 세포를 면역자기 비드 (Miltenyi)를 이용한 네거티브 분리에 의해 PBMC로부터 정제하고, anti-CD3/anti-CD28 비드 (Dynal)로 자극하였다. 전이효소 및 트랜스포존 미니서클 벡터를 2일에 형질감염시켰다. 형질감염은 제조사의 지침 (Lonza)에 따라 4D-Nucleofector에서 1x106 T 세포에 대해 수행하였다. 뉴클레오펙션 후, T 세포를 RPMI-1640 + 10% 인간 혈청, 글루타민, 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 50 U/mL IL-2에서 증식시켰다. 트리판 블루 염색을 수행해 살아있는 T 세포를 정량하였다. T 세포를 다음과 같은 접합된 mAb로 염색하고: CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD62L; 생존/사멸 세포 식별을 위해 7-AAD (BD Biosciences)로 염색하였다. CAR+ (즉, EGFRt+) T 세포는 바이오틴-접합된 anti-EGFR 항체 (ImClone Systems Inc.) 및 스트렙타비딘-PE로 염색하여 검출하였다. FACSCanto (BD)에서 유세포 분석을 수행하고, FlowJo 소프트웨어 (Treestar)로 데이타를 분석하였다. 일부 실험에서는, T 세포를 방사선 처리된 CD19+ 피더 세포를 사용해 7일간 기능성 검사 전에 증식시켰으며, 공지된 바와 같이 CAR T 세포의 기능성 분석을 수행하였다 29-31.
액적 디지탈 PCR
액적 디지탈 PCR (ddPCR)을 수행하기 전에, 메틸화된 비-통합형 벡터만 절단하는 효소 DpnI (20,000 U/mL) 1㎕을 사용해 NEB 3.1 완충제 3㎕ 중에서 최종 부피 30㎕로 37℃에서 샘플 300ng을 절단하였다. DpnI 절단된 샘플에, 0.5㎕의 NEB 3.1 완충제 및 3.5㎕의 H2O를 첨가하여 최종 부피 35㎕로 만들어 25℃에서 2시간 동안 1㎕의 CviQI (10,000 U/mL)로 단편화하였다.
액적 생성을 위해, 프라이머 (600nM), 프로브 (200nM) 및 절단된 주형 (각각 17ng)을 레디 투 유즈 ddPCR Supermix (Bio-Rad)에 최종 부피 25㎕으로 실온에서 첨가하였다. PCR 혼합물 20㎕를 DG8 카트리지내 특정 웰에 첨가하였다. 그런 후, 액적 생성 오일 70㎕를 각 웰에 첨가하여 실온에서 2분간 인큐베이션하였다. 웰을 덮고, QX100 Droplet Generator에 넣었다. 2분 후, 웰 당 액적 약 20,000개가 생성되었다. 생성된 액적 40㎕를 96웰 PCR 플레이트로 이동시키고, PX1 PCR Plate Sealer (Bio-Rad)에서 싱글 실링 호일로 밀폐하였다. PCR 반응을 다음과 같은 조건을 이용해 2℃/초의 승온 속도로 사이클러에서 수행하였다: 95℃ 10분, 94℃ 30초, 사이클 40회: 60℃ 60초, 98℃ 10분.
각 액적에 대한 형광 측정을 QX100 Droplet Reader로 수행하였으며, 리보뉴클레아제 P/MRP 30 서브유닛 (RPP30)을 카피 수 기준으로 사용하였다 (게놈 당 카피 2). 분석은 QuantaSoft 소프트웨어를 사용해 수행하였다. 하기 프라이머 및 올리고를 액적 디지탈 PCR 카피 수 분석에 사용하였다:
프라이머 명 서열 (5' -> 3')
CAR-Fwd ATCTGGATGTCGGGGATCAG (서열번호 16)
CAR-probe FAM-AGCAGCATGGTGGCGGCGCT-BH1 (서열번호 17)
CAR-Rev GCTTGCTCAACTCTACGTCT (서열번호 18)
MC-Fwd CCGACCTTAATGCGCCTC (서열번호 19)
MC-probe FAM-GCGCTGTAGCCTCACGCCCACATATGT-BH1 (서열번호 20)
MC-Rev AGGATTAAATGTCAGGAATTGTGAA )서열번호 21)
RPP30-Fwd GGTTAACTACAGCTCCCAGC (서열번호 22)
RPP30-probe HEX-TGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACC-BH1 (서열번호 23)
RPP30-Rev CTGTCTCCACAAGTCCGC (서열번호 24)
결과
SB100X-코딩 MC 및 CD19-CAR-코딩 MC를 사용해 형질감염을 수행하였다. T 세포의 게놈에서 유전자-전달율 및 유전자 카피수 (즉, 트랜스포존 카피수)에 대한 영향을 확인하기 위해, T 세포에 형질감염된 SB100X MC 및 CD19-CAR MC 벡터의 양을 적정하였다. SB100X MC 및 CD19-CAR MC의 연속 희석 (2배 연속 희석, SB100X MC DNA 범위: 500ng 내지 31ng, CD19-CAR MC DNA 범위: 600ng 내지 37.5ng) (도 19A)을 사용하였다. 형질감염 후 14일째에, 유전자-변형된 T 세포의 %를 EGFRt 마커를 사용한 유세포 측정으로 분석하였다 (도 19B). 형질감염시키는 MC 벡터의 양이 많을 수록 유전자 전달율이 증가하는 것으로 확인되었으며, 형질감염시키는 MC의 양이 적을 수록 유전자 전달율이 감소하는 것으로 확인되었다 (도 19A, B). 또한, MC 벡터를 더 많은 양으로 형질감염시킬 경우, EGFRt 마커의 발현에 대한 유세포 측정에서 MFI의 수준이 더 높으며, MC 벡터를 더 적은 양으로 형질감염시킬 경우, EGFRt 마커의 발현에 대한 유세포 측정에서 MFI의 수준이 더 낮은 것으로 확인되었다 (도 19A, B).
다음으로, 전체 EGFRt+ T 세포 (EGFRt 저, 중 및 고 발현 세포)를 포함하는 게이팅 전략으로 EGFRt+ T 세포를 순도 >90%까지 FACS로 분류하고, ddPCR을 이용해 이후 카피수 분석을 위해 게놈 DNA를 분리하였다. 형질전환된 MC DNA 벡터의 양과 CD19-CAR 트랜스포존 카피 수 간에 상관 관계가 발견되었는데, 즉 다량의 MC 벡터를 형질감염시키면 트랜스포존이 더 많은 카피수로 수득되었으며, MC 벡터를 소량 형질감염시키면 트랜스포존이 적은 카피수로 수득되었다 (도 19C). T 세포 게놈에서 트랜스포존의 평균 카피수는, SB100X MC DNA 500ng 및 CD19-CAR MC DNA 벡터 600ng을 형질감염시켰을 때, 11.3이었다. SB100X MC DNA 31ng 및 CD19-CAR MC DNA 벡터 37.5ng을 형질감염시켰을 경우, T 세포의 게놈내 트랜스포존의 평균 카피수는 2.8로 감소하였다 (도 19C).
요컨대, 이들 데이타는, T 세포에 형질감염되는 MC-코딩 SB100X와 MC-코딩 CD19-CAR의 양을, 바람직한 유전자-전달율, 바람직한 전이유전자 발현 수준 및 바람직한 유전자 카피수를 달성하도록 적정할 수 있다는 것을 보여준다. 이는, 유전자 카피 수 (즉, 트랜스포존의 카피수)를 원하는 수로 미세 조정하는데 유용하며, 예를 들어, 유전자 카피수를 게놈 삽입 횟수를 줄여 유전자독성 및 삽입 돌연변이 위험성을 낮추기 위해 줄이고; 전이유전자 발현 수준을 높이기 위해 유전자 카피 수를 증가시키거나; 최적의 기능적인 성과를 달성하기 위해 전이유전자의 발현을 낮추거나 또는 높이는데, 예를 들어 CAR-변형된 T 세포의 최적의 기능적인 성과를 수득하기 위해 전이유전자 발현을 줄이거나 또는 증가시키는데, 유용하다.
실시예 6: MC 트랜스포존을 이용한 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 킬러 T 세포 이외의 다른 백혈구 서브세트에서의 슬리핑 뷰티-매개의 유전자 전달
재료 및 방법:
인간 개체
뷔르츠부르크 대학의 생명윤리 위원회로부터 승인받은 연구 프로토콜에 참여하기 위해 서면 동의를 받은 후 건강한 공여자들로부터 말초 혈액을 수득하였다.
트랜스포존 및 렌티바이러스 벡터 구축
EF1/HTLV 하이브리드 프로모터, Kozak 및 eGFP 서열로 구성되며 이후에 정지 코돈이 존재하는 카세트를 합성하여 (GeneArt), pT2/HB 트랜스포존 공여 벡터 (Addgene, #26557)에 서브클로닝하였다. 그런 후, eGFP는, 기존 렌티바이러스 벡터 epHIV7 27, 28로부터 유래되는, T2A 인자 및 절단된 상피 성장 인자 수용체 (EGFRt)와 시스 배위로 존재하는 CD19-CAR을 코딩하는 유전자 (FMC63 타겟팅 도메인, IgG4-Fc Hinge 스페이서, CD3zeta 및 4-1BB 공동-자극)로 교체하였다. pCMV(CAT)T7-SB100X 벡터는 Addgene (#34879) 사에서 입수하였다.
미니서클 DNA 제조
eGFP 및 CD19-CAR_EGFRt 트랜스포존을 코딩하는 MC와 SB100X를 PlasmidFactory (Bielefeld) 사에서 부위-특이적인 재조합을 이용해 모 pT2 플라스미드로부터 제조하고, 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
유전자-변형된 백혈구 구축 및 시험관내 분석
Ficoll-Hypaque 상에서 원심분리하여 말초혈로부터 말초혈 단핵구 세포를 수득하고, 전이효소 및 트랜스포존 미니서클 벡터를, RPMI-1640 + 10% 인간 혈청, 글루타민, 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신에서 50 U/mL IL-2 및 졸레드로네이트를 최종 농도 5μM로 첨가하여 밤새 배양한 후, 형질감염을 수행하였다. 형질감염은 제조사의 지침 (Lonza)에 따라 4D-Nucleofector에서 10x106 PBMC 세포에 대해 수행하였다. 뉴클레오펙션 후, PBMC 세포를 RPMI-1640 + 10% 인간 혈청, 글루타민, 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신, 50 U/mL IL-2 및 졸레드로네이트 (f.c. 5μM)에서 증식시켰다. 형질감염 후 9일째에, 트리판 블루 염색을 수행해 살아있는 세포를 정량하고, 다음과 같은 접합된 mAb로 염색하고: Vγ9Vδ2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD45RA, CD45RO, CD56, CD62L; 생존/사멸 세포 식별을 위해 7-AAD (BD Biosciences)로 염색하였다. CAR+ (즉, EGFRt+) 세포는 바이오틴-접합된 anti-EGFR 항체 (ImClone Systems Inc.) 및 스트렙타비딘-PE로 염색하여 검출하였다. FACSCanto (BD)에서 유세포 분석을 수행하고, FlowJo 소프트웨어 (Treestar)로 데이타를 분석하였다. 일부 실험에서는, T 세포를 면역자기 비드를 사용해 분리하고, 방사선 처리된 CD19+ 피더 세포를 사용해 7일간 기능성 검사 전에 증식시켰으며, 공지된 바와 같이 CAR T 세포의 기능성 분석을 수행하였다 29-31.
결과:
벌크 PBMC에 SB100X MC 및 CD19-CAR MC의 형질감염을 수행하였다. T 세포, NKT 세포 및 NK 세포의 증식을 뒷받침하기 위해 배양 배지에 IL-2를 첨가하였다. 졸레드로네이트를 배양 배지에 첨가하여, γδ (gamma delta) T 세포의 증식을 뒷받침하였다. 형질감염 후 9일째에 유세포 측정으로 EGFRt 발현을 분석하였으며, Vγ9Vδ2 γδ T 세포에서 안정적인 높은 수준의 유전자-전달율이 관찰되었다 (도 20A). 이후, γδ T 세포를 CD19+ EBV-LCL (Epstein-Barr Virus transformed lymphoblastoid cell line)로 자극하고, IL-2 및 졸레드로네이트를 첨가한 T 세포 배지에서 증식시켰다. 증식 사이클 종료시, 유세포 측정으로 EGFRt 발현을 분석하였으며, CD19-CAR을 발현하는 γδ T 세포 %가 추가로 증가되었음을 확인하였다 (도 20B). CD19-CAR 변형된 γδ T 세포에 의한 특이적인 CD19+ 타겟 세포 인지가 세포독성 분석 및 사이토카인 분비 분석에서 검증되었다 (도 20C, D). 또 다른 실험에서, SB100X MC 및 CD19-CAR MC의 형질감염을 벌크 PBMC에 수행하였으며, T 세포, NKT 세포 및 NK 세포의 증식을 뒷받침하기 위해 배양 배지에 IL-2를 첨가하였으며, γδ (gamma delta) T 세포의 증식을 뒷받침하기 위해 배양 배지에 졸레드로네이트를 첨가하였다. 형질감염 후 9일째에 유세포 측정으로 EGFRt 발현을 분석하였으며, Vγ9Vδ2 γδ T 세포 (CD3+ Vγ9Vδ2+), NKT 세포 (CD3+, CD56+), NK 세포 (CD3-, CD56+) 및 B 세포 (CD3-, CD19+)에서 안정적인 높은 수준의 유전자-전달율이 확인되었다 (도 21).
SEQUENCE LISTING <110> Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg <120> A method for high level and stable gene transfer in lymphocytes <130> 192305 <150> EP 15002732.4 <151> 2015-09-22 <150> EP 16153490.4 <151> 2016-01-29 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L(+) primer <400> 1 gtaatacgac tcactatagg gctccgctta agggac 36 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L(-)FspBI primer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is g-AMINO <400> 2 tagtccctta agcggan 17 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nested primer <400> 3 agggctccgc ttaagggac 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker primer <400> 4 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T_Bal rev primer <400> 5 gaattgtgat acagtgaatt ataagtg 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T_Bal primer <400> 6 cttgtgtcat gcacaaagta gatgtcc 27 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T_Bal_long primer <400> 7 cttgtgtcat gcacaaagta gatgtcctaa ctgact 36 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAM_SB_50 primer <400> 8 agttttaatg actccaactt aagtg 25 <210> 9 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SB20h-bc-ill-N primer <220> <221> misc_feature <222> (59)..(64) <223> nnnnnn is a TRUSEQ-ILLUMINA-INDEX barcode DNA sequence <400> 9 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60 nnnncttaag tgtatgtaaa cttccgact 89 <210> 10 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PE-nest-ind1-N primer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(30) <223> nnnnnn is a reverse complement DNA sequence of a TRUSEQ-ILLUMINA-INDEX sequence <400> 10 caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60 atct 64 <210> 11 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker_TruSeq_T+ primer <400> 11 gtaatacgac tcactatagg gctccgctta agggactcag acgtgtgctc ttccgatct 59 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker_TruSeq_T- primer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is g-AMINO <400> 12 gatcggaaga gcacacn 17 <210> 13 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PE_NEST_IND6 primer <400> 13 caagcagaag acggcatacg agatattggc gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60 atct 64 <210> 14 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PE_NEST_IND7 primer <400> 14 caagcagaag acggcatacg agatagtctg gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60 atct 64 <210> 15 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PE_NEST_IND8 primer <400> 15 caagcagaag acggcatacg agattcaagt gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60 atct 64 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR-Fwd primer <400> 16 atctggatgt cggggatcag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR-probe oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is FAM-A <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is T-BH1 <400> 17 ngcagcatgg tggcggcgcn 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR-Rev primer <400> 18 gcttgctcaa ctctacgtct 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC-Fwd primer <400> 19 ccgaccttaa tgcgcctc 18 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC-probe oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is FAM-G <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is T-BH1 <400> 20 ncgctgtagc ctcacgccca catatgn 27 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC-Rev primer <400> 21 aggattaaat gtcaggaatt gtgaa 25 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPP30-Fwd primer <400> 22 ggttaactac agctcccagc 20 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPP30-probe oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is HEX-T <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is C-BH1 <400> 23 nggacctgcg agcgggttct gacn 24 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPP30-Rev primer <400> 24 ctgtctccac aagtccgc 18

Claims (110)

  1. 포유류 세포의 게놈에 전이성 인자 (transposable element)를 안정적으로 삽입하기 위해,
    전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA, 및
    전이효소 (transposase)의 공급원
    의 조합을 사용하는 시험관내(in vitro) 방법으로서,
    상기 전이효소의 공급원이 전이효소를 코딩하는 mRNA 이거나, 또는 상기 전이효소의 공급원이 전이효소 폴리펩타이드이고,
    상기 전이성 인자가 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 발현하기 위한 유전 정보를 포함하고,
    상기 포유류 세포가 인간 T 림프구인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전이효소가 SB100X인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체가 종양-반응성이고, 상기 방법에 의해 수득되는 인간 T 림프구가 암의 입양 면역요법 (adoptive immunotherapy)에 사용하기 위한 종양-반응성 인간 T 림프구이거나, 또는 상기 전이성 인자가 키메라 항원 수용체에 대한 유전 정보를 포함하거나, 또는
    상기 키메라 항원 수용체가 CD19, CD20, CD22, CD33, CD44v6, CD123, CD135, EpCAM, EGFR, EGFR 변이체, GD2, ROR1, ROR2, CD269, CD319, CD38 또는 CD138에 특이적인 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    i) 상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA가 a/b 또는 g/d T 세포 수용체를 코딩하거나;
    ii) 상기 전이효소를 코딩하는 핵산 및 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA 미니서클이 전기천공, 뉴클레오펙션 (nucleofection) 또는 전기적 전달 (electrotransfer); 화학적 전달 (chemotransfer), 칼슘 포스페이트; 또는 나노입자에 의해 세포내로 도입되거나;
    iii) 상기 전이성 인자의 게놈내 전위를 매개하는 전이효소가 Sleeping Beauty, PiggyBac, Frog Prince, Himarl, Passport, Minos, hAT, Tol1, Tol2, AciDs, PIF, Harbinger, Harbinger3-DR 및 Hsmar1 이거나; 또는
    iv) 상기 i) 내지 iii) 중 하나 이상인, 방법.
  5. 포유류 세포의 게놈에 전이성 인자를 안정적으로 삽입하기 위해,
    전이유전자용 발현 카세트를 포함하는 전이성 인자를 코딩하는 DNA, 및
    전이효소의 공급원
    의 조합을 사용하는 시험관내(in vitro) 방법으로서,
    상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA는 복제 오리진 및 항생제 내성 유전자를 포함하지 않고,
    상기 전이효소의 공급원이 전이효소를 코딩하는 mRNA 이거나, 또는 상기 전이효소의 공급원이 전이효소 폴리펩타이드이고,
    상기 전이유전자가 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체이고,
    상기 포유류 세포가 인간 T 림프구인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    i) 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA는 하기 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 플라스미드로부터 복제 오리진 및 항생제 내성 유전자를 제거함으로써 수득가능하거나:
    pT;
    pT2;
    pT의 DNA 서열과 90% 이상 동일한 DNA 서열을 가진 플라스미드;
    pT2의 DNA 서열과 90% 이상 동일한 DNA 서열을 가진 플라스미드; 및
    전이성 인자에 대한 공여 플라스미드인, 임의의 기타 플라스미드;
    ii) 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA의 전체 길이가 상기 발현 카세트의 전체 길이 보다 최대 3.0 kb, 또는 최대 2.0 kb 긴 것이거나;
    iii) 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA의 전체 길이가 발현 카세트의 전체 길이 보다 최대 1.5 kb 긴 것이거나;
    iv) 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA의 전체 길이가 발현 카세트의 전체 길이 보다 최대 1.0 kb 긴 것이거나;
    v) 상기 전이유전자가 제3항에 따라 정의되는 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체이고, 상기 포유류 세포가 인간 T 림프구이거나;
    vi) 상기 전이유전자가 a/b 또는 g/d T 세포 수용체이거나;
    vii) 상기 방법이 비-바이러스성 방법이거나; 또는
    viii) 상기 i) 내지 vii) 중 하나 이상인, 방법.
  7. 안정적으로 삽입된 전이성 인자를 포함하는 재조합 포유류 세포를 수득하는 시험관내(in vitro) 방법으로서,
    전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA와 전이효소를 코딩하는 핵산의 조합을 포유류 세포에 도입하는 단계,
    재조합 포유류 세포를 수득하는 단계를 포함하고,
    상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 전이효소를 코딩하는 mRNA 이거나; 및/또는 상기 전이효소가 SB100X 이고 선택적으로 폴리펩타이드로 전달되고,
    상기 전이성 인자가 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 발현하기 위한 유전 정보를 포함하고,
    상기 포유류 세포가 인간 T 림프구인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체가 종양-반응성이거나, 또는
    상기 방법에 의해 수득되는 인간 T 림프구가 암의 입양 면역요법에 사용하기 위한 종양-반응성 인간 T 림프구인, 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 전이성 인자가 키메라 항원 수용체에 대한 유전 정보를 포함하거나, 상기 키메라 항원 수용체가 CD19, CD20, CD22, CD33, CD44v6, CD123, CD135, EpCAM, EGFR, EGFR 변이체, GD2, ROR1, ROR2, CD269, CD319, CD38 또는 CD138에 특이적인, 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    i) 상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA가 a/b 또는 g/d T 세포 수용체를 코딩하는 것이거나;
    ii) 상기 전이효소를 코딩하는 핵산 및 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA 미니서클이 전기천공, 뉴클레오펙션 또는 전기적 전달; 화학적 전달, 칼슘 포스페이트; 또는 나노입자에 의해 세포내에 도입되거나;
    iii) 상기 전이성 인자의 게놈으로의 전위를 매개하는 전이효소가 Sleeping Beauty, PiggyBac, Frog Prince, Himarl, Passport, Minos, hAT, Tol1, Tol2, AciDs, PIF, Harbinger, Harbinger3-DR, 및 Hsmar1 이거나;
    iv) 상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA와 전이효소를 코딩하는 핵산의 조합이 포유류 세포에 함께 도입되고,
    v) 상기 전이효소를 코딩하는 핵산 및 상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA가 포유류 세포에 1:1 이상의 몰비, 2:1 내지 10:1의 몰비, 3:1 내지 9:1의 몰비, 또는 4:1 내지 8:1의 몰비로 도입되거나; 또는
    vi) 상기 i) 내지 v) 중 하나 이상인, 방법.
  11. 안정적으로 삽입된 전이성 인자를 포함하는 재조합 포유류 세포를 수득하는 시험관내(in vitro) 방법으로서,
    전이유전자용 발현 카세트를 포함하는 전이성 인자를 코딩하는 DNA, 및 전이효소를 코딩하는 핵산의 조합을 포유류 세포에 도입하는 단계; 및
    재조합 포유류 세포를 수득하는 단계를 포함하며,
    상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA가 복제 오리진 및 항생제 내성 유전자를 포함하지 않고,
    상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 전이효소를 코딩하는 mRNA이고,
    상기 전이유전자가 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체이고,
    상기 포유류 세포가 인간 T 림프구인, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA가 하기 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 플라스미드로부터 복제 오리진 및 항생제 내성 유전자를 제거함으로써 수득가능한, 방법:
    pT;
    pT2;
    pT의 DNA 서열과 90% 이상 동일한 DNA 서열을 가진 플라스미드;
    pT2의 DNA 서열과 90% 이상 동일한 DNA 서열을 가진 플라스미드; 및
    전이성 인자에 대한 공여 플라스미드인, 임의의 기타 플라스미드.
  13. 제12항에 있어서,
    i) 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA의 전체 길이가 상기 발현 카세트의 전체 길이 보다 최대 3.0 kb, 또는 최대 2.0 kb 긴 것이거나;
    ii) 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA의 전체 길이가 발현 카세트의 전체 길이 보다 최대 1.5 kb 긴 것이거나;
    iii) 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA의 전체 길이가 발현 카세트의 전체 길이 보다 최대 1.0 kb 긴 것이거나;
    iv) 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA가 제1항, 제5항, 제7항 및 제11항 중 어느 한 항에 따라 사용되는 미니서클 DNA 이거나;
    v) 상기 전이유전자가 제3항에 따라 정의되는 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체이고, 상기 포유류 세포가 인간 T 림프구이거나 상기 전이유전자가 a/b 또는 g/d T 세포 수용체이거나;
    vi) 상기 방법이 비-바이러스성 방법이거나; 또는
    vii) 상기 i) 내지 vi) 중 하나 이상인, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 조합은 전이성 인자를 코딩하는 DNA 또는 미니서클 DNA와 상기 전이효소를 코딩하는 핵산을 동시에 도입함으로써 도입되거나; 또는
    상기 조합은 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA 또는 미니서클 DNA와 상기 전이효소를 코딩하는 핵산을 순차적으로 도입함으로써 도입되는, 방법.
  15. 제1항, 제5항, 제7항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 상기 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA가 선형화된 DNA (linearized DNA) 또는 환형 DNA (circular DNA)이거나;
    ii) 상기 전이효소를 코딩하는 핵산과 상기 전이성 인자를 코딩하는 DNA 또는 미니서클 DNA가 포유류 세포에 1:1 이상의 중량비로, 2:1 내지 10:1 중량비로, 3:1 내지 9:1의 중량비로, 또는 4:1 내지 8:1의 중량비로 도입되거나; 또는
    iii) 상기 i) 내지 ii) 중 하나 이상인, 방법.
  16. 제7항 또는 제11항에 따른 방법에 의해 수득가능한 포유류 재조합 세포로서,
    상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 전이효소를 코딩하는 mRNA이고,
    상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 카피들 중
    A) 적어도 5%; 또는
    B) 적어도 10%; 또는
    C) 적어도 15%; 또는
    D) 적어도 20%
    가 하기 기준 중 하나 이상을 충족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되고:
    (i) 초보존 (ultraconserved) 영역이 아님,
    (ii) miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음,
    (iii) 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음,
    (iv) 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 및
    (v) 전사 단위 영역 (transcription unit)이 아님;
    상기 포유류 세포가 인간 T 림프구인, 재조합 세포.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 카피들 중 적어도 40%가 하기 기준을 총족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되는, 재조합 세포:
    전사 단위 영역이 아님.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 재조합 세포의 염색체 게놈내 상기 전이성 인자의 하나 이상의 카피, 또는 전체 카피가 하기 기준들 중
    A) 하나 이상; 또는
    B) 2개 이상; 또는
    C) 3개 이상; 또는
    D) 4개 이상
    의 기준을 충족시키는 게놈 염색체 영역에 삽입되는, 재조합 세포:
    (i) 초보존 영역이 아님,
    (ii) miRNA로부터 300 kb 이상 떨어져 있음,
    (iii) 전사 개시부로부터 50 kb 이상 떨어져 있음,
    (iv) 암과 관련된 유전자로부터 300 kb 이상 떨어져 있음, 및
    (v) 전사 단위 영역이 아님.
  19. 제16항에 있어서, 의약에 사용하기 위한, 재조합 세포.
  20. 제16항에 있어서, 암 치료에 사용하기 위한, 재조합 세포.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 사용이 면역요법에서의 사용이거나, 또는
    상기 사용이 면역요법에서의 사용으로서, 상기 면역요법에서의 사용이 자가면역 질환의 치료 용도이거나, 상기 면역요법에서의 사용이 감염성 질환의 치료 용도이고, 상기 감염성 질환이 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 진균 감염인, 재조합 세포.
  22. 제16항에 있어서, 유전자 요법에 사용하기 위한, 재조합 세포.
  23. 전이성 인자를 코딩하는 미니서클 DNA 및 전이효소를 코딩하는 핵산을 포함하는, 시험관 내에서 포유류 세포의 게놈에 전이성 인자를 안정적으로 삽입하기 위한 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 전이효소를 코딩하는 핵산이 제2항 또는 제4항에 따라 정의되거나; 또는 상기 전이성 인자가 제3항 또는 제4항에 따라 정의되는 것인, 조성물.
  25. 제1항, 제5항, 제7항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포가 CD8+ 킬러 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 나이브 (naive) T 세포, 기억 T 세포, 중심 기억 T 세포 (central memory T cell), 작동자 기억 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 불변 T 세포, 사이토카인 유발성 킬러 T 세포, 또는 g/d T 세포인, 방법.
  26. 제16항에 있어서,
    상기 세포가 CD8+ 킬러 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 나이브 (naive) T 세포, 기억 T 세포, 중심 기억 T 세포 (central memory T cell), 작동자 기억 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 불변 T 세포, 사이토카인 유발성 킬러 T 세포, 또는 g/d T 세포인, 재조합 세포.
  27. 제23항에 있어서,
    상기 세포가 CD8+ 킬러 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 나이브 (naive) T 세포, 기억 T 세포, 중심 기억 T 세포 (central memory T cell), 작동자 기억 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 불변 T 세포, 사이토카인 유발성 킬러 T 세포, 또는 g/d T 세포인, 조성물.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 삭제
  89. 삭제
  90. 삭제
  91. 삭제
  92. 삭제
  93. 삭제
  94. 삭제
  95. 삭제
  96. 삭제
  97. 삭제
  98. 삭제
  99. 삭제
  100. 삭제
  101. 삭제
  102. 삭제
  103. 삭제
  104. 삭제
  105. 삭제
  106. 삭제
  107. 삭제
  108. 삭제
  109. 삭제
  110. 삭제
KR1020187010577A 2015-09-22 2016-09-22 림프구에 유전자를 고 수준으로 안정적으로 전달하는 방법 Active KR102789429B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15002732 2015-09-22
EP15002732.4 2015-09-22
EP16153490.4 2016-01-29
EP16153490 2016-01-29
PCT/EP2016/072524 WO2017050884A1 (en) 2015-09-22 2016-09-22 A method for high level and stable gene transfer in lymphocytes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180054718A KR20180054718A (ko) 2018-05-24
KR102789429B1 true KR102789429B1 (ko) 2025-03-31

Family

ID=56979580

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187010577A Active KR102789429B1 (ko) 2015-09-22 2016-09-22 림프구에 유전자를 고 수준으로 안정적으로 전달하는 방법

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20190169637A1 (ko)
EP (1) EP3352798A1 (ko)
JP (3) JP7142571B2 (ko)
KR (1) KR102789429B1 (ko)
CN (1) CN108601849A (ko)
AU (1) AU2016325384B2 (ko)
BR (1) BR112018005620A2 (ko)
CA (1) CA2999608A1 (ko)
EA (1) EA201890772A1 (ko)
HK (1) HK1256068A1 (ko)
WO (1) WO2017050884A1 (ko)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
US20200063157A9 (en) * 2016-02-26 2020-02-27 Poseida Therapeutics, Inc. Transposon system and methods of use
EP3219800A1 (en) 2016-03-15 2017-09-20 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin A transposon-based transfection system for primary cells
CA3047313A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hat family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
US11278570B2 (en) 2016-12-16 2022-03-22 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
CN107236762A (zh) * 2017-06-19 2017-10-10 河北浓孚雨生物科技有限公司 一种微环dna转染t细胞制备临床级car‑t细胞制剂的方法
US20200048716A1 (en) * 2017-11-03 2020-02-13 Twister Biotech, Inc Using minivectors to treat ovarian cancer
US10869888B2 (en) 2018-04-17 2020-12-22 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
JP2021527427A (ja) 2018-06-21 2021-10-14 ビー−モーゲン・バイオテクノロジーズ，インコーポレーテッド 強化されたｈＡＴファミリーのトランスポゾンが介在する遺伝子導入ならびに関連する組成物、システム、及び方法
EP3591060B1 (en) 2018-07-04 2024-01-24 Yeditepe Universitesi An electroporation solution and an electroporation process performed with this solution
WO2020033916A1 (en) * 2018-08-09 2020-02-13 Juno Therapeutics, Inc. Methods for assessing integrated nucleic acids
US12240915B2 (en) 2018-08-30 2025-03-04 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor
US20210388393A1 (en) * 2018-10-12 2021-12-16 Ann & Robert H. Lurie Children's Hospital of Chicago Plga-peg/pei nanoparticles and methods of use
US10918667B2 (en) 2018-11-20 2021-02-16 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expressing therapeutic agent and uses thereof
US11026973B2 (en) 2019-04-30 2021-06-08 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof
AU2020341479A1 (en) 2019-09-03 2022-03-31 Myeloid Therapeutics, Inc. Methods and compositions for genomic integration
AU2020351204A1 (en) 2019-09-18 2022-04-21 Aldevron, Llc Synthetic DNA vectors and methods of use
US10980836B1 (en) 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
US12076343B2 (en) 2020-02-19 2024-09-03 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Engineered safety in cell therapy
DE102020002394B4 (de) 2020-04-21 2022-04-14 Bundesrepublik Deutschland, vertr. durch das Bundesministerium der Verteidigung, vertr. durch das Bundesamt für Ausrüstung, Informationstechnik und Nutzung der Bundeswehr Gasfiltrationsvorrichtung einer Schutzbelüftungseinrichtung
KR102384173B1 (ko) * 2020-05-22 2022-04-06 인천대학교 산학협력단 박테리아 인공 염색체 재조합 스크리닝 방법
KR102362878B1 (ko) 2020-05-25 2022-02-11 인천대학교 산학협력단 Cho 세포에 전이 유전자를 통합하기 위한 방법
US12043654B2 (en) 2020-06-02 2024-07-23 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Anti-GCC antibody and CAR thereof for treating digestive system cancer
KR20230133837A (ko) 2020-11-04 2023-09-19 마이얼로이드 테라퓨틱스, 인크. 조작된 키메라 융합 단백질 조성물 및 그의 사용 방법
GB2623191A (en) 2021-03-17 2024-04-10 Myeloid Therapeutics Inc Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof
JP2024518100A (ja) 2021-05-11 2024-04-24 マイエロイド・セラピューティクス，インコーポレーテッド ゲノム組込みのための方法および組成物
CN114045305B (zh) * 2021-10-15 2023-03-24 深圳市深研生物科技有限公司 多转座子系统
EP4514829A1 (en) 2022-04-28 2025-03-05 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
EP4514834A1 (en) 2022-04-28 2025-03-05 Immatics US, Inc. Dominant negative tgfbeta receptor polypeptides, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
EP4514821A1 (en) 2022-04-28 2025-03-05 Immatics US, Inc. Il-12 polypeptides, il-15 polypeptides, il-18 polypeptides, cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
EP4450614A1 (en) 2023-04-19 2024-10-23 Johann-Wolfgang-Goethe-Universität Frankfurt am Main Treatment of leukemia by combining a hypomethylating agent in combination with engineered car-nk cells
WO2025096649A1 (en) 2023-11-01 2025-05-08 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102011118018A1 (de) 2011-10-25 2013-04-25 Plasmidfactory Gmbh & Co. Kg Minicircles mit Transpositionskassetten und ihre Verwendung zur Transformation von Zellen
WO2014153114A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to modify cells for therapeutic objectives

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE443762T1 (de) * 2002-01-09 2009-10-15 Minos Biosystems Ltd Induktierbare transposition beim transgenen organismus mit transposon-vektor
ES2358994T3 (es) * 2002-07-24 2011-05-17 Manoa Biosciences Inc. Vectores basados en transposones y métodos para la integración de ácidos nucleicos.
WO2006124001A1 (en) * 2005-05-17 2006-11-23 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Transposition of maize ac/ds elements in vertebrates
US20110047635A1 (en) * 2006-08-28 2011-02-24 University of Hawail Methods and compositions for transposon-mediated transgenesis
CN101962660B (zh) * 2010-07-09 2012-12-12 上海海洋大学 一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法及其载体和载体的制备方法
JP6464140B2 (ja) 2013-03-13 2019-02-06 ヘルス リサーチ インコーポレイテッドＨｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ． 腫瘍抗原を直接認識するために組換えｔ細胞レセプターを使用するための組成物及び方法
TR201908404T4 (tr) 2013-11-22 2019-07-22 Hutchinson Fred Cancer Res İşlenmiş yüksek afinite insan t hücresi reseptörleri.
EP3943507A1 (en) * 2014-04-10 2022-01-26 Seattle Children's Hospital, dba Seattle Children's Research Institute Drug related transgene expression

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102011118018A1 (de) 2011-10-25 2013-04-25 Plasmidfactory Gmbh & Co. Kg Minicircles mit Transpositionskassetten und ihre Verwendung zur Transformation von Zellen
WO2014153114A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to modify cells for therapeutic objectives

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
N. Sharma et al. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 2013, Vol.2, e74*
S. Bire et al. BMC Biotechnology. 2013, Vol.13, Article No.75*
Z. Izsvak et al. ioessays. 2010, Vol.32, pp.756-767*

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016325384A1 (en) 2018-05-10
CA2999608A1 (en) 2017-03-30
AU2016325384B2 (en) 2021-07-22
KR20180054718A (ko) 2018-05-24
EP3352798A1 (en) 2018-08-01
EA201890772A1 (ru) 2018-10-31
CN108601849A (zh) 2018-09-28
WO2017050884A1 (en) 2017-03-30
HK1256068A1 (zh) 2019-09-13
US20190169637A1 (en) 2019-06-06
JP7142571B2 (ja) 2022-09-27
JP2022097517A (ja) 2022-06-30
JP2024095667A (ja) 2024-07-10
BR112018005620A2 (pt) 2018-10-09
JP2018532426A (ja) 2018-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102789429B1 (ko) 림프구에 유전자를 고 수준으로 안정적으로 전달하는 방법
US11590171B2 (en) Targeted replacement of endogenous T cell receptors
Monjezi et al. Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors
KR20210148293A (ko) 마이크로RNA-적응 shRNA(shRNAmiR)를 포함하는 유전자-변형 면역 세포
US12161671B2 (en) Immune cells with DNMT3A gene modifications and methods related thereto
US20250109413A1 (en) Method for Producing Genetically Modified Cells
EP4323514A1 (en) Non-viral homology mediated end joining
WO2025117745A1 (en) Methods and compositions for improving precision of endonuclease-mediated genome editing
CN116802274A (zh) 用于减少细胞中ii类mhc的组合物和方法
HK40037128A (en) Targeted replacement of endogenous t cell receptors

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20180413

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20210923

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20230825

Patent event code: PE09021S01D

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20240828

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

PX0701 Decision of registration after re-examination

Patent event date: 20250102

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PX07013S01D

X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20250327

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20250327

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration