[go: up one dir, main page]

TR201908404T4 - İşlenmiş yüksek afinite insan t hücresi reseptörleri. - Google Patents

İşlenmiş yüksek afinite insan t hücresi reseptörleri. Download PDF

Info

Publication number
TR201908404T4
TR201908404T4 TR2019/08404T TR201908404T TR201908404T4 TR 201908404 T4 TR201908404 T4 TR 201908404T4 TR 2019/08404 T TR2019/08404 T TR 2019/08404T TR 201908404 T TR201908404 T TR 201908404T TR 201908404 T4 TR201908404 T4 TR 201908404T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
tcr
cell
cells
seq
affinity
Prior art date
Application number
TR2019/08404T
Other languages
English (en)
Inventor
N Smith Sheena
t harris Daniel
M Kranz David
M Schmitt Thomas
D Greenberg Philip
Original Assignee
Hutchinson Fred Cancer Res
Univ Illinois
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hutchinson Fred Cancer Res, Univ Illinois filed Critical Hutchinson Fred Cancer Res
Publication of TR201908404T4 publication Critical patent/TR201908404T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Survivin antijeni için yüksek afiniteye sahip olan T hücresi reseptörler (TCRler) sağlanlanmaktadır. Yüksek afiniteli TCRleri, tek zincirli formatta TCRlerin mutasyonel kütüphanelerinin üretimi, bunu takiben mayanın yüzeyi üzerinde gelişmiş stabilite ve afinite için seçim (başka bir deyişle, güdümlü evrim) aracılığıyla işlenmektedir. Yapılandırmalarda, işlenmiş TCRler, in vivo hedeflenmiş iletim için çözünür formda veya bir adoptif T hücresi ortamında T hücrelerine yerleştirilen genler olarak kullanılabilmektedir.

Description

TARIFNAME ISLENMIS YÜKSEK AFINITELI INSAN T HÜCRESI RESEPTÖRLERI Bulus, in vitro teknikler ile islenmis yüksek afiniteli TCRIeri kapsayan, Wilms tümör antijenine (WT1) karsElT hücresi reseptörleri (TCR), bunun yanlis& modifiye TCRIer ve tek zincirli TCRIer üretmeye yönelik yöntemler ve terapötik, diagnostik ve görüntüleme yöntemleri için TCRIerin ilgili kullanilarüle ilgilidir. ÖNCEKI TEKNIK T hücresi reseptörleri (TCRler) ve antikorlar, antijenlerin (ligandlar) farklEtIIlflhrEtanIiasEl için gelisen moleküllerdir ((Murphy (2012), xix, 868 p.)). TCRIer, antijen sunucu hücrelerin (APCIer) veya herhangi bir çekirdekli hücrenin (örnegin, alyuvarlar dlSlEUa, vücuttaki tüm insan hücreleri) yüzeyi üzerinde majör histokompatibilite kompleksine (MHC) ait bir ürün baglamia sunulan antijenik peptitleri taniaktan sorumlu olan antijen-spesifik moleküllerdir. Aksine, antikorlar tipik olarak çözünür veya hücre-yüzeyi antijenleri tanIiaktadlElve bir MHC ile antijenin temsilini gerektirmemektedir. Bu sistem, klîla peptitlere hücre içi olarak islenen, bir hücre içi MHC molekülüne baglanan ve bir peptit-MHC kompleksi (pepMHC) olarak yüzeye iletilen bir hücre ile (virüs proteinleri dahil olmak üzere) eksprese edilen hücre içi antijenlerin tüm dizisini tanlýlabilme kapasitesini, TCRleri aracHJSZla, T hücrelerine vermektedir. Bu sistem, esas olarak herhangi bir yabancElproteinin (öregin mutasyona ugramlgl kanser antijeni veya virüs proteini) veya düzensiz bir sekilde eksprese edilen proteinin T hücreleri için bir hedef olarak islev görmesine olanak saglamaktadlEl((Davis and Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402; Davis ve ark. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544; Murphy (2012), xix, 868 p.) eserinde incelenmistir). Bir TCR ve bir pepMHC'nin etkilesimi, T hücresini baglanma afinitesine (veya ayrlgliîli oran.) bagllîblarak çesitli aktivasyon durumlarlEla tahrik edebilmektedir. TCR tanIia prosesi, T hücresinin, TCRIerin çesitli bir repertuvarIEtaglayarak bir normal, sagllElEhücre ve örnegin bir virüs veya malignite araciHglüla dönüstürülen arasIia ayrIi yapmasi olanak saglamaktadlü burada bir veya daha fazla TCR'nin, T hücresi etkinligini uyarmasEiçin esigin üstünde olan bir MHC molekülüne bagIÜ/abancüaolipeptide yönelik bir baglama afinitesi ile mevcut olmaleb yönelik yüksek bir olas|]]Kl bulunmaktadlEl (Manning and Kranz (1999) Immunology Today, 20, 417-422). Günümüze dek, in vitro kültürleme ile tanIilanan ya insan ya da fare T hücresi klonlarIan izole edilen yaban tip TCRIerin, nispeten düsük baglanma afinitelerine sahip oldugu gösterilmistir (Kd = 1 - 300 (M) (Davis ve ark (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544). Buna yönelik açlEIamanI bir klîmlEllEl, timusta gelisen T hücrelerinin, çok yüksek bir afiniteye sahip T hücreleri Silinecek sekilde, kendi-pepMHC ligandlarlîüzerine negatif olarak seçildigi (tolerans indüksiyonu) görülmektedir (Starr ve ark. (2003) Annu Rev Immunol, 21, 139-76). Bu nispeten düsük afinitelerin yerini tutmasEiçin, T hücreleri, hücre yüzeyi molekülleri CD4 ve CD8'in MHC moleküllerine (süslîda sI[ElII ve lelifZl I) baglandlgiüve aracüsinyalleme etkinliginde TCR ile sinerji olusturdugu bir es-reseptör sistemi gelistirmistir. Çok düsük afiniteye (örnegin, Kd :300 uM)sahip TCRIerin kuvvetli antijen-spesifik etkinligi aracllllZl etmesine olanak saglayan, CD8 bu proseste özellikle etkilidir. In vitro, yönlendirilmis gelisme, spesifik bir pepMHC için yüksek afiniteye sahip TCRIerin üretilmesi için kullanElIhaktadlB Kullanllân üç farklügösterim yöntemi, maya gösterimidir (Holler ve ark. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler ve ark. (2000) Proc Natl Acad Sci ABD, 97, 5387-92), faj gösterimidir (Li ve ark. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), ve T hücresi gösterimidir (Chervin ve ark. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84). Tüm üç yaklasida, proses, TCR'ye ait mutantlarI afinitesi, aynEkökten pepMHC (T hücrelerinin spesifik oldugu orijinal antijen) için artiEllBilglafiniteye sahip olacak sekilde, normal, düsük afiniteli yaban tip TCR sergileyen bir TCR'nin islenmesini veya modifiye edilmesini kapsamaktadlB Bu yüzden, yaban tip TCR, bir veya daha fazla CDR'de mutajenize kütüphanelere üretmeye yönelik bir kallül olarak kullanilBilStE ve yüksek afiniteye sahip mutantlar, aynElkökten peptit-MHC antijenine baglanarak seçilmektedir. Mevcut bulusta, maya gösterimi ile islenen Wilms Tümörü-1 (WT1) için spesifik olan bir yaban tip T hücresi reseptörü ve yüksek afinite T hücresi reseptörleri açllZIanmaktadlB WT1, hem bir tümör baskilâyEElhem de bir onkojen olarak islev görmesi için açilZlanan bir transkripsiyon faktörüdür. WT1, Iöseminin yanlis& çesitli katlZllümörlerde yüksek seviyelerde eksprese edilmektedir (Sugiyama ve ark. (2010) Japanese Journal of Clinical Oncology 40(5) 377-387). Bu, yaban tip T hücresi reseptörleri kullanan çesitli adoptif T hücresi yaklasIilarII ve asßabalarII hedefi olmustur. WT1, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafIdan ilk 75 kanser antijeninin bir öncelik listesinde 1'inci slûada gelmektedir (Cheever ve ark. (2009) Clin Cancer Res, 15, 5323-5337). Bu dogrultuda, bu kanser antijenini spesifik olarak hedefleyen maddelerin, örnegin, terapötik maddelerin tanIilanmasEgerekmektedir. Mevcut bulus, örnegin hedeflenen in vivo iletim için çözünür formda veya bir adoptif T hücresi ortamlEda T hücrelerin sokulan genler olarak kullan Hâbilen in vitro islenmis, yüksek afiniteli TCRIer saglamaktadlEl Sheena N smith ve ark. (Engineering high-affinity human single-chain T cell receptors against cancer antigens; 1 Ocak 2013),dogal olarak yüksek oranda stabil Valfa2 bölgesini kullanan, Wilms tümör antijeni için spesifik olan yaban tip TCR ve melanom antijen MARTl/Melan-A için spesifik olan bir yaban tip TCR'nin, söylenene göre maya gösterimi ve floresan ile aktiflestirilmis hücre aylülnaü aracÜJgIIýla ilgili peptit antijenlerine karsül'üksek afinite Için islendigini rapor etmistir. David H Aggen ve ark. (Identification and engineering of human variable regions that allow expression of stable single-chain T cell receptors; Protein Engineering, Design & Selection: PEDS; 1 Nisan 2011; Sayfa361-372), scTv fragmentlerinin, çesitli özgüllükler ile TCRlerin islenmesi için ve muhtemelen terapötik veya diagnostik uygulamalar için bir platform olarak islev görebildigini rapor etmektedir. BU LUSUN KISA AÇIKLAMASI Bulusun bir birinci yönünde, Istem 1'e göre bir modifiye T hücresi reseptörü veya bunun antijen-baglanma afinitesi saglanmaktadE Mevcut bulus, WT1 antijenine karsEbir yaban tip T hücresi reseptörü ve gelismis afiniteye sahip WT1 antijenine baglanan in vitro islenmis T hücresi reseptörleri (TCR) ile ilgilidir. Daha spesifik olarak, mevcut bulus, yaban tip T hücresi reseptörünün dizileri ve maya, faj veya memeli hücrelerinin yüzeyi üzerinde kütüphanelerin gösterimi aracElgllîla seçilen stabilize edici ve afinite mutasyonlarElle; artlEllIhlSlafiniteye sahip bir antijeni baglamaya yönelik bu kütüphanelerden seçilen TCR proteinleri; ve terapötik, diagnostik veya görüntüleme uygulamalar. yönelik in vitro seçilmis TCR türevlerinin kullaniEile ilgilidir. Bulusun bir yönü, bir T hücresi klonundan elde edilen bir Va ve bir Vß Içeren, bir T hücresi reseptörü veya bunun antijen-baglama fragmenti ile ilgilidir, burada T hücresi reseptörü, peptit WT1 ve HLA-A2 molekülünün bir kompleksine baglanmaktadlîl ve burada T hücresi reseptörü, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1'de belirtilen Vß amino asit sekansIlZl/e SEKANS KIMLIK NUMARASI:2'de belirtilen Va amino asit sekanslübermektedir. Bir örnekte, T hücresi reseptörünü eksprese eden bir konakçEhücre. Baska bir örnekte, konakçEhücre bir insan T hücresidir. Bulusun bir yönü, bir yaban tip T hücresi reseptöründen elde eidlen bir Va ve bir Vß'yüçeren, bir modifiye T hücresi reseptörü veya bunun antijen baglama fragmenti ile ilgilidir, burada Vu, Vß, veya her ikisi, yaban tip T hücresi reseptörüne göre bir veya daha fazla tamamlaylElHElbelirleme bölgesi (CDRler) içermektedir, burada modifiye T hücresi reseptörü, WT1/HLA-A2 olarak bilinen (HLA-A2 olarak bilinen MHC ürününe baglanan, WT1 peptit RMFPNAPYL (SEKANS KIMLIK NUMARASI:6) peptit/MHC antijenine baglanmaktadlB Bir örnekte, T hücresi reseptörü, SEKANS KIMLIK NUMARASIzl'de belirtilen Vß amino asit sekans- en az %80 oran-a özdeslige sahip olan bir amino asit sekansIElçeren bir Vß içermektedir, burada T hücresi reseptörü WT1/HLA-A2'ye baglanarak etkinlige aracl1]]Zl etmektedir. Baska bir örnekte, modifiye T hücresi reseptörü, SEKANS KIMLIK NUMARASI:3'te belirtilen Vß amino asit sekanleb en az %80 orania özdeslige sahip olan bir amino asit sekanslüberen bir modifiye Vß içermektedir, burada modifiye T hücresi reseptörü, 106 M daha yüksek olan bir afinite (KA degeri) ile WT1/HLA-A2'ye baglanmaktadlB Baska bir örnekte, T hücresi reseptörü, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2'de belirtilen Va amino asit sekansl en az %80 oranIa özdeslige sahip olan bir amino asit sekanlelEiÇeren bir Va içermektedir, burada T hücresi reseptörü WT1/HLA-A2'ye baglanarak etkinlige aracHJE etmektedir. Baska bir örnekte, modifiye T hücresi reseptörü, SEKANS KIMLIK NUMARASI:4'te belirtilen Voi amino asit sekansEla en az %80 oranEUa özdeslige sahip olan bir amino asit sekansIEiceren bir modifiye Va içermektedir, burada modifiye T hücresi reseptörü, 106 M daha yüksek olan bir afinite (KA degeri) ile WT1/HLA-A2'ye baglanmaktadlB Bir örnekte, T hücresi reseptörü, SEKANS KIMLIK NUMARASI:5'te belirtilen amino asit sekanslüçeren bir tek zincirli T hücresi reseptörüdür. Bir örnekte, T hücresi reseptörü, SEKANS KIMLIK NUMARASI:3'te belirtilen amino asit sekanslüa ait S95T, S97N, 1103Y, N104L'den seçilen CDR3ß'de mutasyonlardan en az birini barIIElnaktadlB Baska bir örnekte, T hücresi reseptörü, SEKANS KIMLIK NUMARASI:4'te belirtilen amino asit sekans- ait V29D, S30L, ve Q3lG'den seçilen CDRla'da mutasyonlardan en az birini barIlîilnaktadlE Bir örnekte, modifiye T hücresi reseptörü, mutant T hücresi reseptörlerinin bir maya gösterim kütüphanesinin in vitro seçimi ile üretilmetedir. Baska bir yapllândIElnada, modifiye T hücresi reseptörü, hedef antijenine baglanan bir çözünür protein olarak eksprese edilmektedir. Baska bir örnekte, yaban tip veya modifiye T hücresi reseptörleri, adoptif T hücresi terapileri için T hücrelerinde eksprese edilmektedir. Bulusun bir yönü, WT1 antijeni eksprese eden kanser hücrelerini hedefleyen bir terapötik madde saglamaktadlEl burada terapötik madde, birinci yöndeki bir modifiye T hücresi reseptörünü içermektedir. Bir yapUândlElnada, WT1 antijenini eksprese eden kanser hücrelerini hedefleyen bir terapötik madde, burada terapötik madde, birinci yöne göre modifiye T hücresi reseptörünü eksprese eden bir insan T hücresi içerdigi. Bir yapilândlElna, WT1 antijeni eksprese eden bir kansere sahip olan bir süjeyi tedavi etmeye yönelik bir yöntemde kullanllBIaya yönelik bulusa ait bir terapötik madde saglamaktadlEI Çesitli yönlerinden herhangi birinde bulusun tercih edilen yapÜândlElnalarüasaglElh açlKlanan veya alt istemlerde belirlenen sekildedir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, mevcut çallgnadan çesitli WT1/HLA-A2 spesifik T hücresi reseptörlerinin hizalanmlgl amino asit sekanslarIlIlgöstermektedir. WT1 P22, WT1/HLA-A2 tarafIan uyarllân bir insan T hücresi klonundan izole edilen yaban tip sekansIEltemsil etmektedir. Diger TCR sekanslarlZIdaha büyük yüzey seviyelerine yönelik ve daha yüksek afinitelere yönelik maya gösterim yöntemleri ile izole edilmistir. Dikdörtgenler için vurgulanan CDR3|3 ve CDRla içindeki amino asit kallEtHârÇlmaya gösterimi ile daha yüksek afinite için izole edilen TCRIerde mutasyonlardüVß zinciri için gösterilen sekanslar, yukarlîlhn asaglýa, SEKANS KIMLIK NUMARALARI:1, 21, 21, 3, ve 3'e karsUJKi gelmektedir. Tasvir edilen bagiantiiaylîßekans SEKANS KIMLIK NUMARASI:8'dir. va zinciri için gösterilen sekanslar, yukarln asag lila, SEKANS KIMLIK NUMARALARI:2, 22, 4, 2, ve 4'e karslmîlgelmektedir. Sekil 2A, TCR:pepMHC kompleksinin (A6; PDB:1AO7) bir yan görünümünü gösteren bir 3- boyutlu diyagramdlE a-zincirinin ve ß-zincirinin degisken (V) ve sabit (C) bölgeleri belirtilmektedir. Gösterilen yaplZlTCR'ye ait Ca bölgeyi kapsamamaktadlü HLA-A2 (al, (12, (13, ve ß2m) gir olarak gösterilmektedir ve Tax peptidi (LLFGYPWV, SEKANS KIMLIK NUMARASI:7) siyah olarak gösterilmektedir. Mevcut bulusta incelenen A6 TCR ve WT1 TCRlerin tümü, vaz segmentini (aynlîzamanda IMGT terimler dizinine dayanan TRAV12 olarak ifade edilen) kullanmaktadlü Sekil 28, peptit-MHC (Tax/HLA-AZ) üzerinden TCR (CDR) ayak izinin tepeden asaglZl görünümünü gösteren bir 3-boyutlu diyagramdlEi Kristal yapilârß, mevcut bulusta kullanüân WT1 TCR için açllZlanmamalela ragmen, 012 MHC heliks ve peptidin N-terminal ucu üzerinden konumlandlElân Va bölgesi ve (11 MHC heliks ve peptidin C-terminali ucu üzerinden konumlandlîlllân Vß bölgesi ile, bu dikgen kenetlenme yönelimi, günümüze dek esas olarak tüm komplekslerde gözlemlenmistir. Sekil 3, bir peptit:HLA.A2'ye karsEgelismis afiniteye yönelik tek zincirli TCRIeri islemeye yönelik bir yöntemi gösteren bir diyagramdlEl Yüksek afiniteli TCRIeri islemek üzere kullanüân genel proses gösterilmektedir. Sekil 4, tek zincirli T hücresi reseptör fragmentlerini islemeye yönelik maya gösterim sisteminin bir sematigidir (Va-baglantElâylEBVß veya Vß-baglantilâylEE/a). Sekiller 5A ve 5B, Vß3 üzerindeki konformasyon epitoplarIEltanlýbn iki antikor ile aylEilnadan sonra WT1 tek zincirli TCR hata egilimli kütüphanenin akgl sitometri histogramlarIEgöstermektedir. WT1 hata egilimli kütüphane, toplam 3 aylEna için, hem Therma th3.1 FITC IgG hem de BC th3.2 FITC IgM antikorlarÇlAlexaFluor 647 Keçi anti-fare IgG ve Keçi anti-fare IgM APC'nin bir 1:10 seyreltmesi ile dizisel olarak ölçülmüstür. Her bir aylîilna sonrasIa maya hücrelerinin alikuotlarlîlsonrasia Therma th3.1 FITC IgG, AlexaFluor 647 Keçi anti-fare IgG'nin 1:10 oranIEUa seyreltmesi ile inkübe edilmistir. Gri, yalnlîta ikincil antikor ile boyanan maya hücrelerini göstermektedir (Sekil 5A). 3'üncü aylîrlnadan sonra izole edilen, stabil klon WT1 D13, Therma th3.1 FITC IgG, AIexaFIuor 647 Keçi anti-fare IgG'nin 1:10 seyreltmesi ile boyanmlStlEl (Sekil SB). Sekiller 6A ve 68, WT1:HLA.A2 ile aylîilnadan sonra WT1 tek zincirli TCR D13 CDRla. kütüphanenin aklgl sitometri histogramlarIEl göstermektedir. WT1 D13 CDRla kütüphanesi, toplam bes aylülna için, 100-200 nM WT1:HLA-A2 dimer (DimerX; BD Pharmingen'den elde edilmistir), APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor ile dizisel olarak ölçülmüstür. Her bir aylElna sonrasIa 100 nM WT1:HLA-A2 dimer ile (DimerX; BD Pharmingen'den elde edilmistir), bunu takiben APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor ile Inkübe edildikten sonra maya hücrelerinin alikuotlarElGri, yalnlîta ikincil antikor ile boyanan maya hücrelerini göstermektedir (Sekil 6A). 5'inci aylûna sonrasia izole edilen, Klon WT1 D13.1; 100 nM WT1:HLA-A2 dimer (DimerX; BD Pharmingen'den elde edilmektedir), bunu takiben APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor ile boyanmlîstm (Sekil GB). Sekiller ?A ve 78, WT1:HLA.A2 ile aylünadan sonra WT1 tek zincirli TCR D13.1 birlestirilmis CDR3 kütüphanesinin akEl sitometri histogramlarlElElgöstermektedir. WT1 D13.1 birlestirilmis CDR3 kütüphanesi, toplam üç ayülna için, 10-100 nM WT1:HLA-A2 dimer (DimerX; BD Pharmingen'den elde edilmistir), APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor ile dizisel olarak ölçülmüstür. Her bir ayIEna sonrasIa 100 nM WT1:HLA-A2 dimer ile (DimerX; BD Pharmingen'den elde edilmistir), bunu takiben APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor ile inkübe edildikten sonra maya hücrelerinin alikuotlarlZl Gri, yalnlîta ikincil antikor ile boyanan maya hücrelerini göstermektedir (Sekil 7A). 3'üncü aylîilna sonraleUa izole edilen, gelismis baglama klonu WT1 D13.1.1; 100 nM WT1:HLA- A2 dimer (DimerX; BD Pharmingen'den elde edilmektedir), bunu takiben APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor ile boyanmlStlEl(Sekil 7B). Sekiller 8A ila 8D, WT1:HLA-A2 dimerleri ve monomerleri için bir yüksek afiniteli TCR, WT1 D13.1.1'in baglanma özelliklerini göstermektedir. Sekil 8A, çesitli WT1:HLA-A2 Ig dimer konsantrasyonlarEille, bunu takiben bir ikincil olarak floresan etiketli anti-Ig antikor ile boyanan yüksek afinite scTCR WT1 D13.1.1'in aklgl sitometri histogramlarIEl göstermektedir. Sekil BB, çesitli biyotinlenmis WT1:HLA-A2 Ig monomer konsantrasyonlarliile, bunu takiben SA-PE (1:100) ikincil ile boyanan yüksek afinite scTCR WT1 D13.1.1'in aklg sitometri histogramlarIElgöstermektedir. Sekil 8C, WT1:HLA-A2 dimer konsantrasyonuna karslIlçizilmis Sekil 7A'daki histogramlarlEl ortalama floresan yogunluk (MFI) degerlerini gösteren bir çizgi grafigidir. Sekil 8D, WT1:HLA-A2 monomer konsantrasyonuna karsEçizilen Sekil SB'deki histogramlar. ortalama floresan yogunluk (MFI) degerlerini gösteren bir çizgi grafigidir. Sekiller 9A-E, E. coli'de eksprese edilen çözünür yüksek afiniteli TCR WT1 D13.1.1'in bagIanmasllgöstermektedir. Sekiller 9A-D, hiç peptit olmadan (Sekil 9A), negatif kontrol peptidi Tax (Sekil 98), negatif kontrol peptit MART-1 (Sekil 9C), veya peptit WT1 (Sekil 9D) ile ilk olarak inkübe edilen, bunu takiben biyotin-etiketli WT1-D13.1.1 TCR inkübasyon ile insan T2 (HLA-A2+) hücrelerinin aklgl sitometri analizini gösteren bir histogramlar dizisidir. Sekil 9E, WT1-D13.1.1 TCR'nin, en az 260 nM'Iik bir minimum afinite (KD degeri) sahip oldugunu (aklgl sitometrisindeki hücrelerin yllZbnmasübu araIlKra afinitelerin az tahmin edilmesi ile sonuçland[g]l:lçin) gösteren titrasyonu tasvir eden bir grafiktir. Sekiller 10A ve 108, fare T hücrelerin yaban tip P22, D13.1, D13.0.1 ve D13.1.1 TCRIerin etkinligini göstermektedir. Izole fare CD8 (Sekil 10A) ve CD4 (Sekil 10B) T hücreleri, P22, 013.1, D13.0.1 ve D13.1.1 TCRleri ile kaliElaktarmlgtElmodifiye TCRIer, Vß bölgesi: F48S ve D51G'de D13 "stabilize edici" mutasyonsarElbarIiHnamlgtlE). KaliElaktaran T hücreleri sonrasIa HLA-A2+ APCler ve WT1 peptidin çesitli konsantrasyonlarüile inkübe edilmistir. 24 saatlik inkübasyondan sonra, IFN-y konsantrasyonlarEbir standart ELISA kullanilârak ölçülmüstür. Sekil 11, CD8 T hücrelerinde yüksek afiniteli TCR WT1 D13.1.1'in yaplîlal olarak insan peptitlerine benzer olan bir WT1 paneline karsIZletkinIik göstermemistir. WT1 yaplgl olarak benzer peptitler, WT1 peptidin (SEKANS KIMLIK NUMARASI:6) 9 kallEt-I her birinde korunmus mutasyonlar ile peptitler için insan proteomlEl arastlElnalarEhraclIlglýla saptanmlîstIE En yüksek afinite ile HLA-A2'ye bagland[g]l:ltahmin edilen 10 peptit sonrasIda sentezlenmistir. Peptit sayilârü 1-10, sßislîla, SEKANS KIMLIK NUMARALARI:25-34'e karsüilö gelmektedir. Fare CDS T hücreleri sonrasIa izole edilmistir ve D13.1.1 TCR ile kalitîlaktarmlgtlElWß bölgesi, F488 ve DSlG'de D13 stabilize edici mutasyonlar barlEUlEinamlStlE) ve ilgili peptitler ve HLA-A2+ APCler ile 24 saat boyunca inkübe edilmistir. Sekiller 12A ve 128, WT1-spesifik TCRIerin örnekleyici terapötik uygulamalarlElEgösteren diyagramlardlEl Sekil 12A, çözünür terapötik ürünler olarak kullanIia yönelik TCR formatlarII bes örnegini tasvir etmektedir: 1) ya Va-Vß yöneliminde ya da Vß-Va yöneliminde tek zincirli TCR (mutasyona ugramlglyüksek afinite V alanlarElbir yIlZisareti ile gösterilmektedir); 2) bir antikorun sabit bölge alanlarEiIe çerçevede kaynastlEllân tek zincirli TCR; 3) ya hafif zincirin ya da aglîl zincirin sabit bölgesine çerçeve içi immünoglobulin füzyonu; 4) dogrudan ilaca birlestirilmis tek zincirli TCR (veya 2 ve 3'te gösterilen immünoglobulin füzyonlarDJ ve 5) bir bispesifik maddenin üretilmesi için bir tek zincirli Fv (VL-baglantllâylEE/H) ile çerçeve için baglantllânan tek zincirli TCR. Sekil 128, maya gösterimi ile izole edilen yüksek afiniteli degisken alanlarElV) kullanabilen hücresel esalelterapilerin iki örnegini tasvir etmektedir, veya yaban tip TCR V alanlarüaynü zamanda Insan t hücreleri ile adoptif T hücresi terapileri için kullanilâbilmektedir). TCRIer, su sekilde adoptif T hücresi terapisinde T hücreleri ile ekspresyon için, memeli hücresi vektörlerine klonlanmaktadlîl 1) kimerik antijen reseptörlerinde (CAR) tek zincirli reseptörler ve 2) tam uzunlukta 0. ve B TCRIer. SEKANSLARIN KISA AÇIKLAMASI SEKANS KIMLIK NUMARASI:1, WT1/HLA-A2'ye baglanan TCR (P22)'nin bir yaban tip Vß bölgesinin amino asit sekansIlB SEKANS KIMLIK NUMARASI:2, WT1/HLA-A2'ye baglanan TCR (P22)'nin bir yaban tip Va bölgesinin amino asit sekansIlB SEKANS KIMLIK NUMARASI:3, WT1/HLA-A2'ye yüksek afinite ile baglanan TCR (D13.1.1)'in bir modifiye Vß bölgesinin amino asit sekansIlE SEKANS KIMLIK NUMARASI:4, WT1/HLA-A2'ye yüksek afinite ile baglanan TCR (D13.1.1)'in bir modifiye Va bölgesinin amino asit sekansIE SEKANS KIMLIK NUMARASI:5, WT1/HLA-A2'ye yüksek afinite ile baglanan tek Zincirli TCR (WT1-D13.1.1)'in amino asit sekansIlB SEKANS KIMLIK NUMARASI:6, WT-1 antijenin amino asit sekansiE SEKANS KIMLIK NUMARASI:7, Tax antijenin amino asit sekansIlEI SEKANS KIMLIK NUMARASI:8, baglantilây-I amino asit sekansIiEI SEKANS KIMLIK NUMARASI:9, primer Birlesme Yeri 4L'nin polinükleotit sekansIlE SEKANS KIMLIK NUMARASI:10, WT1-D13 CDRloi kütüphanesi PreSOE #1'in üretilmesi için kullanilân ters primerin polinükleotit sekansIlB SEKANS KIMLIK NUMARASI:11, WT1-D13 CDRlu kütüphanesi PreSOE #2'nin üretilmesi için kullanllân ileri primerin polinükleotit sekansIlEI SEKANS KIMLIK NUMARASI: 12, primer T7'nin polinükleotit sekanslß SEKANS KIMLIK NUMARASI:13, WT1-D13.1 CDR3 [31 kütüphanesine ait PreSOE #1'in üretilmesi için kullanllân ters primerin polinükleotit sekans- SEKANS KIMLIK NUMARASI:14, WT1-D13.1 CDR3 ßl kütüphanesine ait PreSOE #2'nin üretilmesi için kullanllân ileri primerin polinükleotit sekansIIEl SEKANS KIMLIK NUMARASI:15, WT1-D13.1 CDR3 ß2 kütüphanesine ait PreSOE #1'in üretilmesi için kullanilân ters primerin polinükleotit sekans- SEKANS KIMLIK NUMARASI:16, WT1-D13.1 CDR3 [32 kütüphanesine ait PreSOE #2'nin üretilmesi için kullanuân ileri primerin polinükleotit sekansIlEl SEKANS KIMLIK NUMARASI:17, WT1-D13.1 CDR3 al kütüphanesine ait PreSOE #1'in üretilmesi için kullanllân ters primerin polinükleotit sekans- SEKANS KIMLIK NUMARASI:18, WT1-D13.1 CDR3 (11 kütüphanesine ait PreSOE #Z'nin üretilmesi için kullanilan ileri primerin polinükleotit sekansIlEi SEKANS KIMLIK NUMARASI:19, WT1-D13.1 CDR3 (12 kütüphanesine ait PreSOE #1'in üretilmesi için kullanllân ters primerin polinükleotit sekans- SEKANS KIMLIK NUMARASI:20, WT1-D13.1 CDR3 0i2 kütüphanesine ait PreSOE #2'nin üretilmesi için kullanilan ileri primerin polinükleotit sekansIlEl SEKANS KIMLIK NUMARASI:21, WT1/HLA-A2'ye yüksek afinite ile baglanan TCR (Dl3)'ün bir modifiye Vß bölgesinin amino asit sekansIB SEKANS KIMLIK NUMARASI:22, WT1/HLA-A2'ye yüksek afinite ile baglanan TCR (Dl3)'ün bir modifiye Va bölgesinin amino asit sekansIE SEKANS KIMLIK NUMARASI:23, bir influenza A peptidin amino asit sekansIE SEKANS KIMLIK NUMARASI:24, bir degisken influenza A peptidin amino asit sekansIEl SEKANS KIMLIK NUMARASLARI:25-34, WT1 degisken peptidin amino asit sekanslarIE AYRINTILI AÇIKLAMA AsaglEllaki açlKlamanI bulusun anlasllBiasIERolaylastlElnasüimaçlanmaktad lElancak lellEllaylEEl olmasüimaçlanmamaktadlü Genel olarak, burada kullanllân terimler ve ifadeler, standart metinlere referansla, dergi referanslarü/e teknikte uzman kisilerce bilinen metinler ile bulunabilen teknikte kabul edilen anlamlar. sahiptir. Asag-ki tanIilar, bulus baglamIia bunlarlEI spesifik kullaniII açllZIanmasETçin saglanmaktadlEl Burada kullanIEglElhaliyle, "baglantllânmlgl', kovalent veya kovalent olmayan birlesme olabilen iki grup aras-a bir birlesmeyi ifade etmektedir. Gruplar, bir degisken uzunlukta peptit zinciri, bir amino olmayan asit kimyasal grubu veya teknikte bilinen diger araçlar kullanllârak baglantllânabilmektedir. Bir baglantllâylEEgrubu, bir proteinin veya peptidin iki fonksiyonel veya yaplîlal alanlar. faal bir sekilde baglantllâyan bir amino asit sekanslIl olabilmektedir. Burada kullanllgiühaliyle, "kemoterapötik ajan" terimi, bir kanser hücresinin, kanser hücreleri popülasyonunun, tümörün veya diger kötücül dokunun büyümesini, profilerasyonunu veya yayllüîasllîbzaltabilen veya önleyebilen herhangi bir maddeyi ifade etmektedir. Bu terimîn aynlîamanda herhangi bir antitümör veya antikanser ajanEkapsamasEl amaçlanmaktadlü Burada kullanI[gll:lhaliyle, "etkili miktar" teriminin, farmasötik olarak etkili miktar veya terapötik olarak etkili miktar gibi baglamlarlîkapsamaslîamaçlanmaktadlEl Örnegin, belirli yapliândlünalarda, etkili miktar, bir tarama tahlilinde veya bir klinik durumun gelisiminde faydaIElbir hale, faydalEbir sonuca, fonksiyonel etkinlige ulasilâbilmektedir. Burada kullanIlglElhaliyle, "kanser hücresi" teriminin, teknikte kapsamllZlolarak anlasüân sekilde terimleri kapsamasElamaçlanmaktadlEl Bir yapilândlîrlnada, bu terim, bir insan veya hayvanda kanserin bir klinik durumuna katklîslsaglayabilen anormal bir sekilde regüle edilmis bir hücreyi ifade etmektedir. Bir yapllândlünada, bu terim, bir insan veya hayvan vücudunun içindeki veya bunlardan elde edilen bir hücre veya bir kültürlenmis hücre çizgisini ifade edebilmektedir. Bir kanser hücresi, teknikte anlasIigiEilizere çok çesitli farklilâstlEllIhlglhücre, doku veya organ türüne sahip olabilmektedir. Kanser hücrelerinin özel örnekleri, meme kanseri, kolon kanseri, cilt kanseri, over kanseri, lösemi, akciger kanseri, karaciger kanseri, testis kanseri, özofageal kanser ve diger kanser tiplerini kapsamaktadlîl Burada kullan-[gElhaliyle, "tedavi etme" veya "tedavi", klinik bulgularEkapsayan ve tercihen, faydalEveya arzu edilen bulgular. elde edilmesine yönelik bir yaklasn ile ilgilidir. Tedavi, ya hastal[glI veya durumun semptomlar.. iyilesmesini ya da hastal[g]I veya durumun ilerlemesinin geciktirilmesini ifade edebilmektedir. Burada kullanIEgIllII haliyle, "önleme" veya "önlemek", bir hastalgl veya durumun baslang veya nüksetmesinin olaslHginnlemeye, inhibe etmeye veya azaltmaya yönelik bir yaklasIiEifade etmektedir. Bu aynlîamanda, bir hastallglI veya durumun semptomlar.. olusumunun veya nüksetmesinin olasHJIjlII önlenmesini, inhibe edilmesini veya azaltmasIEl ifade etmektedir, ve bu aynElzamanda hastal[glI veya durumun baslanglîlmjan veya nüksetmesinden önce bir hastaliglI veya durumun sllZl[g]Il,__Ietkisini, semptomlarIlZl/e/veya yükünün azaltllBiasIEIkapsamaktadlÜ Burada kullanIlglEl haliyle, "hücre büyümesinin inhibe edilmesi" veya "hücrelerin profilerasyonunun inhibe edilmesi" hücrelerin büyüme h-I azaltUBwasEleya durdurulmaslü ifade etmektedir. Örnegin, tümör hücrelerinin büyümesini inhibe ederek, tümörün büyüklügündeki artlSl oranEyavaslayabilmektedir. Diger yapllândlülnalarda, tümör, büyüklük olarak azalabilmektedir, gerileyebilmektedir veya aynEl büyüklükte olabilmektedir. Özel yapliândlîrlnalarda, hücre büyümesinin veya hücre profilerasyonunun hlZIZIen az %20, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %80 veya en az %90 oranIda inhibe edilmektedir. "Yaban tip" ve "wt" terimleri, burada birbirlerinin yerine kullanilEiaktadlEl ve dogal olarak olusan veya modifiye edilmemis TCR, örnegin orijinal veya ana T hücresi klonundan antijen için özgüllük ile, izole edilen degisken bölgeleri kodlayan bir polinükleotide veya bir amino asit sekans. sahip olan bir TCR'ye referansta kullanUBiaktadlE Amino asit sekanslarIEisunan sekillerde ve tablolarda, yaban tip bazen "wt" olarak belirtilmektedir. Üst sekansI asag-a sunulan sekanslarda, amino asidin bir çizgi, hizalanmaya ait wt veya üst sekansta bulunan ile aynlîibldugunu belirtmektedir. Bir harf, bir ikamenin üst sekanstan bu konumda gerçeklestiriIebîlecegini belirtmektedir. Burada kullanI[gll:haIiyle, "modifiye", "varyant", "mutant" "mutasyona ugramlgl' ve "elde edilen" T hücresi reseptörü terimleri, orijinal veya yaban tip T hücresi klonuna klýlasla bir veya daha fazla mutasyona sahip olan degisken bölgelerin TCR sekanslarIEi'fade etmektedir. Modifiye TCRIerin örnekleri yüksek afiniteli TCRIerini kapsamaktadlE Bir kodlama sekanslgl bir proteinin amino asit sekansEiçin veya tRNA veya rRNA gibi bir fonksiyonel RNA için kodlayan bir genin veya cDNA'nI parçasllgöstermektedir. Tam veya tamamlayEElsekans, Watson-Crick baz-eslesmesi kurallarlEb göre nükleotitlerin baska bir sekansEiIe bir hidrojen baglüiubleksi olusturan nükleotitlerin bir sekansllnlam. gelmektedir. Asaglîlakn, DNA veya RNA'da bir göreli konumu ifade etmektedir ve bir zincirin 3' ucuna dogru olan bölgedir. Ekspresyon, bir genin, yaplîlal RNA (rRNA, tRNA) veya mesajcEl RNA'ya (mRNA) transkripsiyonunu ve bir mRNA'nI bir proteine sonrasIa translasyonunu ifade etmektedir. Iki nükleik asit sekansÇlsekanslar aynüirganizma içinde aynüiüzenlemede dogal olarak bir araya gelmedigi sürece, sekanslar ayrEbrganizmalardan türetilirse, bu tür organizmalar. farkllîliürlerde olup olmadlKlarI göre birbirleriyle heterologdur. Homoloji, iki nükleotit veya amino asit sekanslarlîlaraslîidaki özdeslik derecesini ifade etmektedir. Spesifik olarak örneklendirilen TCR sekans- fonksiyonel olarak esdeger olan bir amino asit sekansÇiamino asitlerin ilavesi ve/veya delesyonu ile tek veya çoklu amino asit ikameleri ile modifiye edilen veya burada bir veya daha fazla amino asidin kimyasal olarak modifiye edildigi ancak bununla birlikte mevcut bulusa ait bir hücre bagIElveya bir çözünür TCR proteinin baglanma özgüllügünü ve yüksek baglanma etkinligini tutan bir amino asit sekansIIEl Fonksiyonel olarak esdeger nükleotit sekanslarÇl esasen spesifik olarak örneklendirilmis bir hücre baglEi/eya çözünür TCR proteini ile aynDJiyoIojik aktiviteye sahip polipeptitleri kodlayanlardlB Mevcut abulus baglamlEtla, çözünür bir TCR proteini, dogal bir hücreye baglEITCR'nin bölümlerinden yoksundur ve çözeltide stabildir (yani, burada aç[lZIand [giiîgibi ve protein çözeltileri için standart kosullar altlEtla kullan-@üaman çözeltide genellikle birikmemektedir). "Izole" terimi, dogal durumundan insan eli ile degistirilmis bir bilesim, bilesik, madde veya molekülü ifade etmektedir. Örnegin, dogada olusan bir bilesim veya madde, orijinal ortamlEUan degistirilmisse veya giderilmisse veya her iki durumda da izole edilmektedir. Örnegin, canIEbir hayvanda dogal olarak bulunan bir polinükleotit veya bir polipeptit izole edilmemektedir, ancak dogal durumundan birlikte görülen malzemelerden ayrilân aynü polinükleotit veya polinükleotiti burada terim kullanItgJElîialiyle izole edilmektedir. Bir nükleik asit yaplîüdogal olarak genden izole edilen veya aksi halde dogada olusmayacak sekilde birlestirilen ve yan yana koyulan nükleik asidin segmentlerini barlEU lîilnasEiiçin modifiye edilen bir nükleik asittir. Nükleik asit molekülü, ya deoksiribo-nükleotitleri veya 3'-5'-fosf0diester baglarlZI ile baglantllânan ribonükleotitleri bar En bir tek- veya çift-Zincirli lineer polinükleotit anlam. gelmektedir. BaglantII niteligi, sekanslarI birbirlerine göre normal fonksiyonlarlEilZlatkileme kabiliyetini etkilemiyorsa, iki DNA dizisi fonksiyonel olarak baglanmaktadlB Örnegin, bir promotor bölgesi, eger promotor bu kodlama sekansII transkripsiyonunu yapabilmekteyse, bir kodlama dizisine fonksiyonel olarak baglanabilmektedir. Bir polipeptit, peptit baglarEiIe baglantüânan amino asitlerin bir lineer polimeridir. "Promotor" terimi, RNA polimerazII baglanabildigi ve dogru transkripsiyonu baslatan, bir genin baslatma bölgesinin yukarIZIakIiIa bulunan ve genel olarak 80-120 baz çift uzunlugunda olan bir cis-etkili DNA sekansIEifade etmektedir. Transkripsiyonun açllîykapallîl regülasyonunu saglayan ve/veya aklgl asagEkodlama sekansII ekspresyonunu gelistiren (artlßn) ek transkripsiyon düzenleme sekanslarüiürlestirilebilmektedir. Bir rekombinant nükleik asit molekülü, örnegin bir rekombinant DNA molekülü, iki veya daha fazla homojen olmayan DNA molekülünün ligasyonu yoluyla in vitro olarak olusturulan yeni bir nükleik asit sekanslîl (örnegin, en az bir klonlama bölgesine klonlanmlg bir veya daha fazla yabancElDNA araya eklemesini içeren bir rekombinant plazmid). "Dönüsüm" ve "tranfeksiyon" terimleri, tutulumuna ve süje hücrelerinin genomuna entegrasyonuna yol açan, farkIElgenotipte baska bir hücreden saflastlEllIhlgl rekombinant DNA'nI harici uygulamasüle bir hücrenin genomunun yönlendirilmis modifikasyonunu ifade etmektedir. Bakterilerde, rekombinant DNA tipik olarak, bakteriyel kromozoma entegre edilmemektedir, ancak bunun yerine bir plazmid olarak bagIsEbir sekilde kopyalamaktadlB "Dönüstürülmüs" ve transfekte edilmis" terimleri burada birbirlerinin yerine kullanilüiaktadlEl Örnegin, bir T hücresi, uyarlEEl' hücresi muamelesinden önce burada tarif edilen bir modifiye veya yüksek afiniteli TCR'yi sifreleyen bir DNA sekanslýla transfekte edilebilmektedir. Yukarükli, DNA veya RNA'da herhangi bir bölgenin 5' tarafüüzerinde anlam. gelmektedir. Bir vektör, bir konakçEhücrede bagIislZI bir sekilde kopyasIEyapabilen ve yabnacEDNA'yEl kabul edebilen bir nükleik asit molekülüdür. Bir vektör, kendi replikasyon kökenini, yabancEl DNA'nI araya ekleme için kullanllân sIlEIlama endonükleazlarüiçin bir veya daha fazla benzersiz tanIia bölgesi ve genel olarak antibiyotik direncine yönelik kodlama genleri gibi seçilebilir markörler ve s[IZI[IZIa araya eklenen DNA'nI ekspresyonu için tanIia sekanslarEI (örnegin, promotor) tasIiaktadlEl YaygI vektörler, plazmid vektörlerini ve faj vektörlerini kapsamaktadlEl Bir yüksek afiniteli T hücresi reseptörü (TCR), yaban tip TCR'den bir hedef IigandlEla daha güçlü baglanma ile islenmis TCR'dir. BazEyüksek afinite örnekleri, yaklaslK] 10'6 M ila 10`12 M arasIaki bir hedef Iigand ve bunun içindeki tüm bireysel degerler ve aralllZlar için bir denge baglanma sabiti içermektedir. Bu aralllZl yaban tip afiniteler (10'4 ila 10'6 M) oldugu rapor edilenler ve yönlendirilmis evrim (yaklasilZl 10'12 M) ile izole edilmis olanlar arasiEtlaki afiniteleri kapsamaktadlB Bir sitokin, diger hücreleri etkileyen hücreler tarafIan üretilen bir protein, peptid veya glikoproteindir. Memeli hem insan hem de insan olmayan memelileri kapsamaktadlEl Genetik kodun esenerjiliginden dolayü çesitli fonksiyonel olarak esdeger nükleotit sekanslarII aynümino asit sekansIÜkodlad [gllitieknikte uzman kisilerce takdir edilecektir. T Hücresi Reseptörleri T hücresi reseptörü (TCR), bir heterodimerik reseptörü olusturmak üzere T hücresinin yüzeyi üzerinde eslesen iki zincirden (aß veya yö) olusturulmaktadß aß TCR, vücuttaki çogu T hücresinin üzerinde eksprese edilmektedir ve MHC-sIlHlZlantijenlerin tanlEl'nas- dahil oldugu bilinmektedir. aß TCRIerin moleküler genetigi, yaplîü/e biyokimyaslîlsimdi ayrlEtlIJD olarak incelenmistir. Her bir a ve B zinciri iki alandan olusmaktadB Hücre membrania proteini sabitleyen ve CD3 sinyalleme aparatII sabit alt birimleri ile birlesen Sabit alanlar (C) ve tamamlaylElDEl-belirleme bölgeleri (CDR) olarak adlandßlân, alt döngü aracllîlgüa antijen tanIia veren Degisken alanlar (V). V alanlarIn her biri üç tane CDR'ye sahiptir. Bu CDR'ler, majör histokompatibilite kompleksi (pepMHC) taraf-an kodlanan bir proteine bagIIZl bir antijenik peptid araslîidaki bir kompleks ile etkilesime girmektedir (Davis and Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402; Davis ve ark. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544; Murphy (2012), xix, 868 p.). TCR'nin moleküler genetigi, V alanlarIn kodlama bölgesini olusturmak üzere birlesen birçok gen araleUa genetik rekombinasyonun bir prosesini ortaya koymustur. Proses, aglîlve hafif zincirli genlerin, B hücresi ile elde edilen antikorlar ile sergilenen çok büyük çesitlilik üretmek üzere yeniden düzenlendigi antikorlar gelisimine analogdur (Tonegawa (1988) In Vitro Cell Dev Biol, 24, 253-65). T hücrelerinin durumunda, bir zincir V alani: bir V bölgesinin (insanlarda yaklasllZl 75 arasIa) bir Katllfha (J) geni segmentine (insanlarda yaklasüZi 61 arasIa) yeniden düzenlenmesi ile 0IusturulmaktadE(Sekil 5.8, Janeway, 8'inci baskm ß zinciri V alanübir V bölgesinin (insanlarda yaklasllZl 52 araleUa) bir Çesitlilik (D) genine (insanlarda 2 arasIa) bir Katilüia (J) geni segmentine (insanlarda 13 arasIa) yeniden düzenlenmesi ile 0lusturulmaktadlEl(Sekil 5.8, (Murphy (2012), xix, 868 p.)). VuJu ve VßDßJß geni yeniden düzenlemelerinin kesisim noktalarü her bir zincirin CDR3 döngüsünü kodlamaktadlrîlve bunlar, yalnEta yaklasiKl toplamda 1011 T hücresi bulundugu için (Mason (1998) Immunol Today, 19, 395-404) bir insanda ulasllâbilir çesitliligin çok yukar-a, 1015 farklElTCR'nin bir teorik sIIEIÜIe (Davis and Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402) aß TCR'nin çok büyük çesitliligine katkElsagIamaktadlÜ Her bir zincirin olasECDRl ve CDR2 çesitliligi, bu döngüler V geni içinde kodlandlg'lîilçin V genlerinin saylîliille temsil edilmektedir, ve TCRler in vivo somatik mutasyona ugramamaktadlîl CDR1 ve CDR2 döngülerinin çesitliliginin CDR3 döngülerine klýlasla nispeten sIlEllElolmas- ragmen, peptit antijeni ve/veya MHC ürününe dayanan özel V bölgelerinin seleksiyonunun bulundugu gösterilen çok say. örnek vardlE SItlîlI MHC ürünleri, uzunluk olarak 8 ila 10 amino asit olan peptitlere baglanmaktadlîlve bunlar vücutta tüm çekirdekli hücreler üzerinde eksprese edilmektedir (Rock and Goldberg (1999) Annu Rev Immunol, 17, 739-79) tarafIan incelenmistir). Buna karslEl, antikor- antijen etkilesiminin tüm baglanma enerjisi, yabanclîantijen üzerine odaklanmaktadlü TCR- peptitzMHC'nin baglanma enerjisinin bir önemli fraksiyonu kendi-MHC molekülünde yönlendirilmektedir (Manning and Kranz (1999) Immunology Today, 20, 417-422). AsIIa, daha yakI zamandaki çallginalar, CDR1 ve/veya CDR2 döngülerinin özel kallEtllârIlEl, MHC helisleri üzerinde özel kalliîtllâr ile etkilesime girmek üzere evrildigi, böylelikle MHC-sliîlhma prosesini açllîlayan, MHC için bir bazal afinite saglad[g]IlZönermektedir (Garcia ve ark. (2009) Nat Immunol, 10, 143-7; Marrack ve ark. (2008) Annu Rev Immunol, 26, 171-203). Sunlarlîil gerçeklestirilmesi için normal aral[glE üzerinde olan (yüksek afiniteli TCRler denilen) bir peptit-MHC antijenine (sIlElI) yönelik atinitelere sahip olan TCRlerin kullanÜIhaleb ilgi duyulmaktadlE 1) CD4 yardlcElT hücrelerinin (CDS esreseptöründen yoksun olan) etkinliginin tahrik edilmesi veya 2) bir "efektör" molekülün baglanmasEile, bir hücrenin dogrudan hedeflenmesi için kullanilâbilen çözünür TCRlerin gelistirilmesi (örnegin, bir bispesifik protein olusturulmasEiçin, antikor Fc bölgeleri, toksik ilaç, veya anti-CD3 antikoru gibi bir antikor scFv) ((Ashfield and Jakobsen (2006) IDrugs, 9, 554-9; Foote and Eisen (2000) Proc Natl Acad Sci ABD, 97, 10679-81; Holler ve ark. (2000) Proc Natl Acad Sci ABD, 97, 5387-92; Molloy ve ark. (2005) Curr Opin Pharmacol, 5, 438-43; Richman and Kranz (2007) Biomol Eng, 24, 361-73). Bu yaklasIi aynElzamanda, bazElkanser hastalar. karsllâstigllîbir sorunun üstesinden gelebilmektedir, bu sayede bunlarIT hücreleri, potansiyel tümör antijenlerine yeterli özgülük ve baglanma afinitesine sahip olan TCRleri eksprese etmemektedir (klîmen tolerans. timik ve çevresel proseslerinden dolaym Örnegin, 300'ün üzerinde MHC-sliEllÇl T hücresi-tanIiIEI tümör antijenleri tanllanmlStIEl (cancerimmunity.org/peptide/)(Boon and Old (1997) Curr Opin Immunol, 9, 681-3; Cheever ve ark. (2009) Clin Cancer Res, 15, 5323-37). Bu tümör antijenleri, hepsinin terapiler için hedefler olarak Islev gördügü, mutasyona ugramE peptitler, farklllâsma antijenleri, ve fazla eksprese edilmis antijenleri kapsamaktadlE Günümüze dek açlklanan kanserin antijenlerinin büyük çogunlugu, bir MHC molekülünün baglamIa yalnEta hücre yüzeyinde hedeflenebilen hücre içi proteinlerden elde edildigi için, TCRIer, antijenin bu sI-ütanliak üzere evrimlestikleri için terapötik için ideal adayßlusturmaktadlü Benzer sekilde, TCRIer, enfekte hücrelerde dogal olarak islenen ve hücre yüzeyi üzerinde bir MHC molekülü ile gösterilen viral proteinlerden elde edilen peptitleri saptayabilmektedir. HIV ve HTLV'deki viral genomlardan türetilmis peptitler dahil olmak üzere, son 25 yIa birçok viral antijen hedefi tanIiIanmigIlEl(örn., Addo ve ark. (2007) PLoS ONE, 2, e321; Tsomides ve ark. (1994) J Exp Med, 180, 1283-93; Utz ve ark. (1996) J Virol, 70, 843-51). Bununla birlikte, bu hastalllZIara sahip olan hastalar, enfekte hücrelerin baglanmaslZl/e y-iEiçin optimal TCRIerden yoksun olabilmektedir. Son olarak, yüksek oranda spesifik olan bir proseste, TCRIerin, otoimmün hedeflerinin reseptör antagonistleri olarak veya lokal immün hücre yan-Elimmün sistemini baskllâmak üzere iletim maddeleri olarak kullanllâbilmesi mümkündür, dolayisiyla genel immün supresyonundan kaçIHEnaktadEl ((Molloy ve ark. (2005) Curr Opin Pharmacol, 5, 438-43; Stone ve ark. (2012) Protein Engineering)). Modifiye T Hücresi Reseptörleri Yönlendirilmis evrim, spesifik bir pepMHC için yüksek afiniteye sahip TCRIerin üretilmesi için kullanilîhaktadß Kullanüân üç farkllîlgösterim yöntemi, maya gösterimidir (Holler ve ark. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler ve ark. (2000) Proc Natl Acad Sci ABD, 97, 5387-92), faj gösterimidir (Li ve ark. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), ve T hücresi gösterimidir (Chervin ve ark. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84). Tüm üç yaklasIida, proses, normal, düsük afiniteli yaban tip TCR sergileyen bir TCR'nin islenmesini kapsamaktadB böylece TCR'ye ait mutantlar, aynEkökten pepMHC (T hücrelerinin spesifik oldugu orijinal antijen) için artlîllüîlglafiniteye sahip olmaktadlE Bu yüzden, yaban tip TCR, bir veya daha fazla CDR'de mutajenize kütüphanelere üretmeye yönelik bir kalip] olarak kullanilBilgtlElbunu takiben yüksek afiniteye sahip mutantlar, aynElkökten peptit-MHC antijenine baglanarak seçilmektedir. Teknikte, bu tür in vitro, yönlendirilmis evrime, vahsi tip aûnitenin sadece birkaç katlütlan daha fazla olan afinitelerin islenmesi için gerekli oldugu iyi bilinmektedir. Maya gösterimi, ilgili proteinin bir Aga2-füzyonu olarak yüzey üzerinde eksprese edilmesine olanak saglamaktadlîl(Boder and Wittrup (1997) Nat. Biotech., 15, 553-557; Boder and Wittrup (2000) Methods Enzymol, 328, 430-44). Bu sistem, yüksek afiniteli TCRIerIn, tek zincirli antikorlarlE, fibronektinin ve diger proteinlerin islenmesinde basarIJIIJbir sekilde kullanilIhaktador. Maya gösterim sisteminde, TCR, Vß-baglantilâyüala veya Va-baglantilâyüîl Vß'da bir stabilize tek zincirli protein olarak (Aggen ve ark. (2011) Protein Engineering, Design, & Selection, 24, 361-72; Holler ve ark. (2000) Proc Natl Acad Sci ABD, 97, 5387-92; Kieke ve ark. (1999) Proc Natl Acad Sci ABD, 96, 5651-6; Richman ve ark. (2009) Mol Immunol, 46, 902-16; Weber ve ark. (2005) Proc Natl Acad Sci ABD, 102, 19033-8), veya iki zincirli heterodimer olarak (Aggen ve ark. (2011) Protein Engineering, Design, & Selection, 24, 361-72; Richman ve ark. (2009) Mol Immunol, 46, 902-16) gösterilmektedir. Iki fare TCR'si, bu sistem kullantlârak yüksek afinite için islenmistir: 2C (MHC sIEtZ-ll sIlEllDZlve 3.L2 (MHC lelFGII sIlEIlDII(HoIIer ve ark. (2000) Proc Natl Acad Sci ABD, 97, 5387-92; Weber ve ark. (2005) Proc Natl Acad Sci ABD, 102, 19033-8). Insan TCR tek zincirli VaVß fragmentleri (scTv veya scTCR olarak adlandlEllân) ayrlîla son zamanlarda, IMGT terimler dizini ile aynEl zamanda TCRA12 olarak bilinen, Va2 olarak adlandlîlân insan Vu bölgesinin harici stabilitesinden faydalanüârak gelistirilmistir (Aggen ve ark. (2011) Protein Engineering, Design, & Selection, 24, 361-72). Bu durumda, tek zincirli formattaki in vitro islenmis, yüksek afiniteli T hücresi reseptörleri, hem maya yüzeyi Üzerinde hem de çözünür formda E. co//den stabil proteinler olarak eksprese edilebilen insan stabilize scTv fragmentlerinin (Vß- baglantllâylaÄ/a) izole edilmesi için kullanllEnlStlEl TCR'Ier iki stabilize edilmis insan scTv fragmanÇlinsan T hücresi lenfotrofik virüsü Tax proteininden elde edilen bir peptide spesifik A6 scTv ve insan immün yetmezlik virüsü Gag proteininden elde edilen bir peptide (peptit: SL977-85) spesifik olan 868 scTv'yi kapsamlgtß Bu TCRIerin her ikisi Va2 genini (IMGT: TRAV12 ailesi) kullanmlgtlîJ ancak bunlar, TCRlerin izole edildigi orijinal T hücresi klonundan elde edilen CDR30i, CDRlß, CDRZB, ve CDR3B kallEtllâr- sahipti. Bu yüzden, bu scTCRIerin yüksek afiniteli mutantlarII her biri, aynElkökten peptit-MHC antijenlerine karsßrijinal (ana) TCRIerinden elde edilmistir. Bir ikinci sistemde, faj gösterimi, ilgili protein bir viral kaplama proteininin N-terminaline kaynastlEIlB1lStEl(Scott and Smith (1990) Science, 249, 386-90). A6, 868, ve 1G4 (MHC sIltZ-II sIlElltIl olarak adlandlEllânlarüapsayan, çesitli TCRIer, bu yöntemi kullanarak yüksek afinite için islenmistir (Li ve ark. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54; Sami ve ark. (2007) Protein Eng Des Sel, 20, 397-403; VareIa-Rohena ve ark. (2008) Nat Med, 14, 1390-5). Bu TCRIerin faj gösterimi, a ve [3 zincirlerinin eslesmesinin desteklenmesi amaciyla iki C alanEaraleUa bir dogal olmayan disülfit baglEl uygulanmasElle etkinlestirilmistir. Bu sistem bu yüzden aynü kökten peptit-MHC'Ierine karsEislenmeis için orijinal T hücresi klonlarlîiUan elde edilen tam uzunlukta (VaCoi/VßCß) heterodimerik proteinleri kullanmaktadlEl TCRIerin islenmesine yönelik olarak rapor edilen bir üçüncü sistem, memeli hücresi gösterimidir (Chervin ve ark. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84; Kessels ve ark. (2000) Proc Natl Acad Sci ABD, 97, 14578-83). Bu sitem, bir TCR-negatif T hücresi hibridoma TCR (1 ve ß-zincirlerini uygulamasEiçin bir retroviral vektör kullanmaktadlü Bir çallgmada (Kessels ve ark. (2000) Proc Natl Acad Sci ABD, 97, 14578-83), seçilmis mutant TCR'nin, aynlIl kökten peptide yaplgl olarak çok benzer olan bir peptide bagland[glElgösterilmektedir (ASNENMDAM'e karsElASNENMETM; süslýla, SEKANS KIMLIK NUMARALARI:23 ve 24). Baska bir çalgnada, mutant TCR'nin afinitesinin aynElkökten pepMHC için ar-[glEl gösterilmektedir (Chervin ve ark. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84). Bu tür yüksek afiniteli TCRIerin aynthamanda, aynEkökten peptidin yaplêhl olarak benzer degiskenlerine karsDyÜksek afiniteler sergiledigi birçok çallglnada gösterilmistir (örnegin, (Holler ve ark. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62)). Memeli hücresi gösterim sisteminde, uygulanan TCRIer, bir tam olarak fonksiyonel T hücresine olanak saglayan, CD3 alt birimlerinde, dogal konformasyonunda yüzey üzerinde eksprese edilmektedir. Tam uzunlukta, heterodimerik TCRIer dogal konakçllârlda bu yüzden bu yöntem kullanilârak islenmistir. WT1/HLA-A2'ye baglanan Yüksek-Afiniteli TCRIer Mevcut bulus, iyi bilinen kanser antijen WT1/HLA-A2'ye karsEbir yaban tip TCR ve çesitli yüksek afiniteli TCRIer saglamaktadlE Belirli örneklerde, islenmis TCRIer, in vivo hedeflenmis iletim için çözünür formda veya bir adoptif aktarIi yöntemi veya tedavisinde T hücreleri ile rekombinant olarak eksprese edilerek kullan ilâbilmektedir. Özel bir örnekte, TCR (scTCR) yapEl iskelesinin bir tek Zincirli VocVß formu, TCR'nin baglandEgiEKÖrnegin, tümör) yere efektör molekülün iletilmesi için bir sitokin, toksin, radyoizotop, kemoterapötik madde veya ilaç (antikor-ilaç konjugatlarlüla benzer) gibi bir yük ile kullanllâbilmektedir ve hazlîllanabilmektedir. TCR aynElzamanda, WT1 eksprese eden kanser hücrelerine karsEbir yanlü araclIJKIetmek üzere, CD4+T hücrelerinin CD8+T hücrelerinin ve/veya dogal katil (NK) hücrelerinin adoptif aktarIiEgibi, hücre terapilerinde kullanllâbilmektedir. Burada saglanan scTCR yapEliskeleleri aynElzamanda, bir radyoizotop veya floresan ki gibi, bir tespit edilebilir gruba, örnegin TCR'nin amin-reaktif veya sülfhidriI-reaktif amino asit yan zincirleri araclEgllýla, kovalent baglantlßma ile örnegin neoplastik veya viraI-iliskiIi-hücre-yüzey antijenlerinin tannlanmasEl araclHgllýla örnegin kötücül veya viral-enfekte hücrelerin teshisinde kullanllâbilmektedir. Bir örnekte, burada açlElanan scTCR proteinleri, maya, faj veya memeli hücrelerinin yüzeyi üzerinde gösterilebilirdir ve WT1 antijenine daha yüksek afinite ile TCRIerin islenmesi için kullanilâbilmektedir. Bir örnekte, burada açllîlanan scTCR, Escheri'ch/a 60/1, Asperg/7/us mger, AspergII/us fîcuum, Aspergi//us awamori, AspergIY/us oryzaei Tr/choderma reeseig Mucor mi'ehei; K/uyveromyces lad/'s, PIC/?[8 pastori's, Saccharomyces cerew'siae, Baci//us sabri/is veya BaC/Y/us //C/7enif0rm/'$, böcek hücreleri (örnegin, Drosophi/a me/anogaster) gibi bir prokaryotik hücrede, Çin hamster over hücre çizgileri (CHO) gibi hücre çizgilerini kapsayan memeli hücrelerinde veya örnegin bitki türlerinde (örnegin, kanola, soya fasulyesi, mlglü patates, arpa, çavdar, bugday) veya teknikte bilinen protein ekspresyon kaynaklarlükja eksprese edilebilmektedir ve büyük miktarlarda üretilebilmektedir. TCR aynElzamanda, örnegin ve örnek yoluyla yalnlîta bir hücrenn yüzeyi üzerine spesifik peptit/MHC'nin tespit edilmesi için kullanllâbilmektedir. Bir örnekte, aç[lZlanan scTCR genleri, alanlarI sinyallenmesi için genleere, DNA yapEEile kodlanna, uygun peptit sekanslarlîlkullanllârak baglanabilmektedir ve hedeflenmis hücreleri elimine edebilen T hücrelerine uygulanmaktadü Bu yapilâr, bir scTCR barIlEâin CARIarI kullanIiID antijen reseptörler (CARlar) olarak adlandlElllBrStE Saglanan tek zincirli VaVß TCR proteinlerinde, degisken alfa ve degisken beta zincirleri, antikor tek-zincirli Fv baglantüârüle gibi teknikte bilinenler dahil olmak üzere herhangi bir uygun peptit baglantilâylîüle baülanmaktadIEI(Bird ve ark. (1988) Science, 242, 423-426; Holliger ve ark. (1993) Proc Natl Acad Sci ABD, 90, 6444-8; Hoogenboom (2005) Nat Biotechnol, 23, 1105-16; Turner ve ark. (1997) J Immunol Methods, 205, 43-54). Bir örnekte, bir çözünür insan tek-zincirli TCR su yapiya sahiptir: Va-L-Vß veya Vß-L-Voi, burada baglantliâylEIJVß'yüJoi ile baglantllâyan bir baglantllâylîlîbeptittir, Vß bir TCR degisken ß bölgesi ve Vu, bir TCR degisken bölgesidir. Bir örnekte, VßVa TCR, WT1D13.1.1 olarak adlandEllBiaktadlElburada Vß, grup 3'ün bir TCR degiskeni [3 bölgesidir ve V012, grup 2'nin bir or bölgesi olan bir TCR degiskenidir (Utz, U., ve ark., 1996)(Aggen, D.A., ve ark., 2011). Bir örnekte, baglantllâylîljbeptit, 5'ten daha fazla lisin kallEtHârElliarIIEnaktadlEl Bir örnekte, baglantllâylEEeptit, 5 ve 30 arasliîlda amino asit barId Huaktadlü Bir örnekte, baglantllâylîlj peptit, GSADD-AKKDAAKKDGKS'nin (SEKANS KIMLIK NUMARASI:8) bir amino asit sekans. sahiptir. Bir örnekte, saglanan sc VßVu TCR bir sabit bölge barIHnamaktadlElTerminoloji sc VßVoi TCR burada kullanligilEUa, sc VßVor TCR'nin aynlîzamanda, terminoloji anlasI[gl|:l/e teknikte kullanIig'lElhalier dahil edildigi anlasllüîaktadß Bu yüzden, VB ve Va, baglantllâylEEl aracUJgllýla herhangi bir konfigürasyonda birbirlerine baglanabilmektedir. Bulusun bir yönünde, bulusa ait VßVu TCR, yaklaslEl 10'6 M ve 10'12 M aralelja bir denge baglanma sabiti (KD) ile bir Iiganda spesifik olarak baglanmaktadlB Bulusun bir yönüne ait bir örnekte, Iigand bir peptit/MHC IiganddE Bir örnekte, bulusa ait VßVoi TCR, normal, yaban tip TCRlerin afinitelerine klýasla bir Iiganda dogru artlEllüilgl afiniteye sahiptir. Biyolojik olarak Aktif Gruplar Aynlîtamanda saglanan, bir biyolojik olarak aktif grup kapsayan burada açllZlanan sekilde VßVu TCR proteinleridir. Burada kullanI[g]Elialiyle, "biyolojik olarak aktif grup", bir biyolojik sistemde bir ölçülebilir veya tespit edilebilir etkiye yol açan bir gruptur. Bir örnekte, biyolojik olarak aktif grup sunlardan seçilmektedir: anjiyojenez inhibitörleri, enzim inhibitörleri, mikrotü inhibitörleri, DNA interkalatörler veya çapraz baglaylElEr gibi bir anti-tümör maddesi, DNA sentez inhibitörleri, ancak bunlarla sIIEllEdegildir; IL-2, IL-15, GM-CSF, IL-12, TNF-u, IFN-y veya LT-a (Schrama ve ark. (2006) Nat Rev Drug Discov, 5, 147-59; Wong ve ark. (2011) Protein Eng Des Sel, 24, 373-83) gibi bir sitokin, ancak bunlarla sIEIllIcllegildir; TGF-ß, IL-37, IL-10 (Nold ve ark. (2010) Nat Immunol, 11, 1014-22; Stone ve ark. (2012) Protein Engineering) gibi bir anti-inflamatuvar grup, ancak bunlarla sIEllEldegildir, 90Y veya 131I (Reichert and Valge-Archer (2007) Nat Rev Drug Discov, 6, 349-56) gibi bir radyoizotop, ancak bunlarla sIlHlEljegildir; Psödomonas eksotoksin A, difteri toksin, veya risinin A zinciri (Pastan ve ark. (2006) Nat Rev Cancer, 6, 559-65; Schrama ve ark. (2006) Nat Rev Drug Discov, 5, 147-59) gibi bir toksin, ancak bunlarla sIlEllÜlegiIdir; bir Ilaç veya bir tek zincirli Fv gibi bir antikor. Bulusun bu yönüne ait bir örnekte, biyolojik olarak aktif grup, bir ilaç (örnegin, "antikor ilaç konjugatüteriminde) olarak bazen ifade edilen, bir sitotoksik moleküldür. Burada kullanlglîl haliyle, "sitotoksik" hücreler için toksik anlam. gelmektedir. Sitotoksik moleküllerin örnekleri, doksorubisin, metotreksat, mitomisin, 5-florurasil, duokarmisin, auristatinler, maytansinler, kalikamisinler ve yukariEIhkilerin analoglarIIZkapsamaktadE ancak bunlarla sIlIIllZlzlegildir (Jarvis (2012) Chemical and Engineering News, 90, 12-18; Litvak-Greenfeld and Benhar (2012) Adv Drug Deliv Rev; Ricart and Tolcher (2007) Nat Clin Pract Oncol, 4, 245-55). Sitotoksik moleküllerin, tam hücre ölümüne yol açmasEgerekmemektedir, ancak bunun yerine hücre etkinliginde büyümenin veya azalmanI ölçülebilir veya tespit edilebilir inhibisyonuna yol açmaslîgierekmektedir. Bir örnekte, burada açilZlanan bir TCR, bir ön ilacElbir ilaca dönüstürebilen bir enzime baglantllânabilmektedir. Bu, örnegin, ilacI aktif formunun TCR tarafIan (bir tümör bölgesinde) hedeflenen yerde olusturulmasIEb olanak saglanmasMa faydaIIlE Bir örnekte, biyolojik olarak aktif grup, tek zincirli TCR'ye, TCR'nin serbest amin gruplarülreya sülfhidril gruplarlZl gibi standart kimyasal reaksiyonlar yoluyla gerçeklestirilebilen bir baglantliâylEÜasEilea baglanlB Baska bir örnekte, TCR, bir bispesifik maddenin üretilmesi için bir tek zincirli antikor fragmentine (scFv) baglanmaktadlE Bir tümör antijenine karsEbir ve bir T hücresinin CD3 molekülüne karsEbir scFv içeren bispesifik antikorlar klinikte basarlýla kullanIIIhlSIlEl(Bargou ve ark. (2008) Science, 321, 974-7). Ek olarak, CD3'e karslîlbir TCR ve bir scFv barIBin bir bispesifik madde aynüamanda rapor edilmistir (Liddy ve ark. (2012) Nat Med, 18, 980-7). Aynüamanda saglanan, bir tespit edilebilir grubu kapsayan burada açilZlanan sekilde bir tek zincirli VßVa TCR'dir. Bir örnekte, tespit edilebilir grup, spektroskopik veya enzim esaslü yöntemler ile tespit edilebilmektedir. Bir örnekte, tespit edilebilir grup, floresein, R-fikoeritrin (PE), PE-Cy5, PE-Cy7, Teksas klünlîßjieya allofikosiyanin (APC) gibi ancak bunlarla sIlHlEl olmayan bir floresan grup; 1251, 32P, 99mTc gibi ancak bunlarla sIIEllElolmayan bir radyoaktif isaretli grup; yabanturpu peroksidaz veya alklin fosfataz gibi, ancak bunlarla sIlEllEl olmayan tespit edilebilir ürünler üreten özelliklere sahip bir enzim veya bir emici gruptur. Teknikte bilindigi üzere, TCR'ye baglanan bir biyolojik olarak aktif grup, tespit edilebilir grup veya diger grup, bir esnek peptit baglantllâylEEkullanllârak veya kimyasal konjugasyon ile baglanabilmektedir ve kovalent olarak veya kovalent olmayarak TCR'ye baglanmaktadlü Aynüzamanda burada saglanan, bir memeliye bir terapötik olarak etkili moleküle baglantllânan etkili miktarda bir modifiye TCR'nin uygulanmasIEliçeren, bir memelide kanserin tedavi edilmesine veya önlenmesine yönelik bir yöntemde kullanIia yönelik bir insan TCR'dir. Özel bir yapllândlîilnada, memeli insandEl Baska bir yapllândlElnada, memeli bir evcil hayvan (örnegin, köpek, kedi, tavsan, kemirgen, at) veya bir besi hayvanIIEl (örnegin, bir inek, at, domuz). AynEzamanda saglanan, burada aç[Elanan sekilde bir izole tek zincirli TCR (scTCR) ve E. co//de tek zincirli TCR üretmeye yönelik bir yöntemdir. AynElzamanda saglanan, burada açiKIanan sekilde bir scTCR içeren bir farmasötik bilesim ve bir farmasötik olarak kabul edilebilir taslýlîldiß AynElzamanda saglanan, bir T hücresinin yüzeyi üzerinde aktif TCR veren sinyalleme alanlarlüb baglantllânan burada açIKIanan sc VaVß TCRIerdir. Bir örnekte, bu scTCR, bir memelide kanserin tedavi eidlmesine yönelik bir yöntemde kullanilâbilmekte olup, sunlarEl içermektedir: TCR'nin bir vektöre klonlanmasÇlvektörün bir hastanIT hücrelerine sokulmasIZI ve T hücrelerinin tekrar hastaya adoptif olarak aktarilüiasiîl Modifiye TCR Polipeptitleri ve Polinükleotitleri Bulus, en az bir tek zincirli T hücresi reseptörü (scTCR) kodlayan DNA segmentini kapsayan bir DNA vektörü tasarlamaktadü Teknikte uzman kisi, burada açllîlanan tahliller ile baglantiIJElolarak standart mutajenez teknikleri aracinglîla, degistirilmis TCR sekanslarßlde edebilmektedir ve bunlarEc'bzeI baglama afinitesi ve/veya özgüllügü için test edebilmektedir. Teknikte bilinen faydalEImutajenez teknikleri, slBlandlBE] olmadan, de novo gen sentezini, oligonükleotit-yönlendirilmis mutajenez, bölge spesifik mutajenez, baglaylEEllarama mutajenez ve PCR ile sahaya yönelik mutajenez içermektedir (baklEllî) örnegin, Sambrook ve ark. (1989) and Ausubel ve ark. (1999)). Modifiye TCR kodlama sekanslarII elde edilmesinde, teknikte orta derecede uzman kisiler, TCR ile elde edilen proteinlerin belirli amino asit ikameleri, ilaveleri, delesyonlarEl/e post- translasyonel modinkasyonlar ile biyolojik etkinlikte kaylül veya azalma olmadan modifiye edilebilecegini anlayacaktlü Özellikle, korunmus amino asit ikamelerinin, baska bir deyisle bir amino asidin benzer büyüklük, yük, polarite ve konformasyona sahip baska bir amino asit ile ikamesinin, protein fonksiyonunu büüyk ölçüde degistirmesinin olasEl olmadiglü iyi bilinmektedir. Proteinlerin yapltâslarüilan 20 standart amino asit, su skeilde korunmus amino asitlerin dört grubuna kapsamlEIbir sekilde kategorize edilebilmektedir; nonpolar (hidrofobik) grup, alanin, izolösin, Iösin, metiyonin, fenilalanin, prolin, triptofan ve valin kapsamaktadlîj polar (yüksüz, nötr) grup, asparajin, sistein, glutamin, glisin, serin, treonin ve tirosin kapsamaktadß pozitif olarak yüklü (bazik) grup, arjinin, histidin ve lisin barilîilnaktadlü ve negatif olarak yüklü (asidik) grup aspartik asit ve glutamik asit barIlElnaktadlEl Bir amino asidin bir proteininde aynlZlgrubun içindeki baska biri ile ikamesinin, proteinin biyolojik etkinligi üzerinde bir yan etkiye sahip olmasßlasmegildir. Bir örnekte, bulusa ait bir scTCR, herhangi bir bölgede veya bir stabilize protein ile sonuçlanan degisken alanI bölgelerinde ek mutasyonlar barilübilmektedir. Bir örnekte, bir veya daha fazla ek mutasyon, bir veya daha fazla CDRl, CDRZ, HV4, CDR3, FR2, ve FR3'tedir. Mutajenez için kullanilan bölgeler, dogrudan evrim ile saptanabilmektedir, burada kristal yapllâr veya moleküler modeller, ilgili Iigand ile (örnegin antijen) etkilesen TCR'nin bölgelerinin üretilmesi için kullanllîhaktadlil Diger örneklerde, degisken bölge, scTCR ve Iigand arasia istenen bir etkilesimi saglamak için amino asitleri ekleyerek veya silerek yeniden sekillendirilebilmektedir. Bulusa ait polipeptitler modifiye TCRler ve bunlar. antijen baglanma fragmentler (örnegin, scTCR) ve kimerik antijen reseptörleri (CARIar) kapsamaktadlEl "Polipeptit", "protein" ve "peptit" ve "glikoprotein" terimleri birbirlerinin yerine kullanHBiaktadlElve amino asitlerin bir polimerinin herhangi bir özel uzunluga sIlEllElolmadiglElanlamEb gelmektedir. Terim, miristilasyon, sülfatlama, glikosilasyon, fosforilasyon ve sinyal sekanslarII eklenmesi veya delesyonu gibi modifikasyonlarEkapsamamaktadIE "Polipeptit" veya "protein" terimleri bir veya daha fazla amino asit anlam_ gelmektedir, burada her bir zincir, peptit baglarlTila kovalent olarak baglantllânan amino asitleri içermektedir ve burada söz konusu polipeptit veya protein, dogal proteinlerin sekans. sahip olan, peptit baglarÇlbaska bir deyisle dogal olarak olusan ve spesifik olarak rekombinant olmayan hücreler veya genetik olarak islenmis veya rekombinant hücreler ile üretilen proteinler ile birlikte kovalent olmayarak ve/veya kovalent olarak baglantllânan birden çok zinciri içermektedir ve dogal proteinin amino asit sekans. sahip olan molekülleri veya dogal sekansI bir veya daha fazla amino asidine eklemelerden ve/veya ikamelerden delesyonlara sahip olan molekülleri içermektedir. "Polipeptit" ve "protein" terimleri spesifik olarak mevcut bulusa ait modifiye TCRIeri veya bunlari antijen baglanma fragmentlerini veya bir modifiye TCR veya bunun antijen fragmentinin bir veya daha fazla amino asidine eklemelerden ve/veya ikamelerden delesyonlara sahip olan sekanslarElkapsamaktadlE Bu yüzden, "polipeptit" veya bir "protein", bir ("bir monomer" olarak adlandlElIân" veya birden çok ("bir multimer" olarak adlandlîllân) amino asit Zincirlerini içermektedir. Burada atlflia bulunulan "izole protein" terimi, bir süje proteinin, (1) tipik olarak dogada bulunabilen en azlTiUan bazEUiger proteinleri içermedigi, (2) aynEkaynaktan, örnegin yanlZl türlerden diger proteinleri esas olarak içermedigi, (3) farklilir türden bir hücre ile eksprese edildigi, (4) dogada birlestirildigi polinükleotitlerin, lipitlerin, karbohidratlarlül, veya diger malzemelerin en az yaklasllö yüzde 50'sinden ayrIlgiÇl (5) "izole protein"in dogada birlestirildigi bir proteinin bölümleri ile (kovalent veya kovalent olmayan etkilesim ile) birlestirilmedigi, (6) dogada birlestirilmedigi bir polipeptit ile faal olarak birlestirildigi (kovalent veya kovalent olmayan etkilesim ile), veya (7) dogada meydana gelmedigi anlam. gelmektedir. Bu tür bir izole protein, sentetik kökenli olabilen genomik DNA, cDNA, mRNA veya diger RNA veya bunlari herhangi bir kombinasyonu ile kodlanabilmektedir. Belirli örneklerde, izole protein, kullanIi- müdahale edebilen (terapötik, diagnostik, profilaktik, arastüna veya aksi) dogal ortamia bulunan proteinleri veya polipeptitleri veya diger kontaminantlarßsas olarak içermemektedir. Özel örneklerde, bir süje modifiye TCR sunlara sahip olabilmektedir: a) burada açllZlanan bir modifiye TCR'nin alfa zinciri degisken bölgesine en az %80 özdes, en az %85 özdes, en az %90 özdes, en az %95 özdes, veya en az %98 veya %99 özdes olan bir amino asit sekanleb sahip bir TCR alfa zinciri degisken bölgesi; ve b) burada açllZIanan bir modifiye TCR'nin beta degisken bölgesine en az %80 özdes, en az %85 özdes, en az %90 özdes, en az %95 özdes, veya en az %98 veya %99 özdes olan bir amino asit sekans. sahip bir beta zinciri degisken bölgesi. Özel örneklerde, modifiye TCR sunlarEiçerebilmektedir: a) sunlarEiçeren bir TCR alfa zinciri degisken bölgesi: i. burada açlKlanan bir seçili TCR'nin alfa zinciri CDR1 bölgesine amino asit sekansIa özdes olan bir CDR1 bölgesi; ii. seçili TCR'nin alfa zinciri CDR2 bölgesine amino asit sekansIa özdes olan bir CDR2 bölgesi; ve iii. seçili TCR'ninalfa zinciri CDR3 blgesine amino asit sekansIa özdes olan bir CDR3 bölgesi; ve b) sunlarlZIçeren bir beta zinciri degisken bölgesi: i. seçili TCR'nin beta zinciri CDR1 bölgesine amino asit sekansia özdes olan bir CDR1 bölgesi; ii. seçili TCR'nin beta zinciri CDR2 bölgesine amino asit sekanleUa özdes olan bir CDR2 bölgesi; ve iii. seçili TCR'nin beta zinciri CDR3 bölgesine amino asit sekanslia özdes olan bir CDR3 bölgesi; burada TCR bir WT1 antijenine spesifik olarak baglanmaktadlü Baska bir örnekte, modiifye TCR, veya bunun antijen baglama fragmenti modifiye TCR'nin bir degiskenidir burada degisken V alfa ve V beta bölgelerinin CDR bölgelerinde en fazla 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 veya daha fazla amino asit dlglEUa seçili modihye TCR'ye özdes olan bir alfa zinciri ve bir beta zincirini içermektedir. Bu baklidan, seçili degisken modifiye TCR'nin CDR bölgelerinde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 veya belirli örneklerde 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 daha fazla amino asit ikamesi bulunabilmektedir. Ikameler, ya V alfa ve/veya V beta bölgelerinde CDRlerde olabilmektedir. (BakIlîl örnegin, Muller, 1998, Structure 6: 1153-1167). Bir örnekte, bir modifiye TCR veya bunun bir antijen baglanma fragmentini kodlayan bir polinükleotit saglanmaktadE Diger ilgili örneklerde, polinükleotit, modifiye TCR kodlayan bir polinükleotidin bir degiskeni olabilmektedir. Polinükleotit degiskenleri, burada açiEIanan bir modifiye TCR kodlayan bir polinükleotit sekansIEI büyük oranda özdeslige sahip olabilmektedir. Örnegin, bir polinükleotit, burada açilZIana yöntemler (örnegin, asagßia açlKIand lglEilizere, standart parametreleri kullanan BLAST analizi) kullanarak burada açllZIanan bir TCR kodlayan bir sekans gibi bir referans polinükleotidine klýiasla en az %70 sekans özdesligine, tercihen en az %75, %80, %85, %90, %95, %96, %97, %98, veya %99 veya daha fazla sekans özdesligini içeren bir polinükleotit olabilmektedir. Teknikte uzman kisi, bu degerlerin, kodon esenerjiligini, amino asit benzerligini, okuma çerçevesi konumlandlElnasIü ve benzerini göz önünde bulundurarak iki nükleotit sekansEile kodlanan proteinlerin ilgili özdesligini saptamak üzere uygun bir sekilde ayarlanabilecegini anlayacaktE Tipik olarak, polinükleotit degiskenleri, tercihen degisken polinükleotit ile kodlanan TCR'nin baglama afinitesi, burada spesifik olarak belirtilen bir polinükleotit ile kodlanan bir TCR'ye göre büyük ölçüde azaltüâcak sekilde bir veya daha fazla ikame, ekleme, delesyon ve/veya araya ekleme barilBicaktlE Polinüklotit sekanslarEkarsllâstEIIJEken, iki sekanstaki nükleotitlerin, asaglüia açilîlandlgilîüzere maksimum uyum için hizalandgia aynlIloImaslZlhalinde iki sekansI "özdes" oldugu söylenmektedir. Iki sekans arasIaki karsllâstlüinalar tipik olarak, sekans benzerliginin lokal bölgelerinin tanllanmaslîlve karsilâstlîllöiaslîliçin bir karsilâstlîina penceresi üzerinde sekanslarI karsllâstlEIlBiasüle gerçeklestirilmektedir. Burada kullanI[gll]haliyle "karsilâstlülna penceresi", bir sekanlel, iki sekans. optimal olarak hizalanmasüdan sonra aynElsaylâa komsu konumun bir referans sekansElle karsilâst-[glîlen az yaklasilZl 20 komsu konum, genel olarak 30 ila 75, 40 ila 50 komsu konumun bir segmentini ifade etmektedir. Karsilâstülna için sekanslarI optimal hizalanmasÇl varsayüân parametreler kullanilârak biyoinformatik yaziIJIîilI (DNASTAR, Inc., Madison, WI) Lasergen esinde Megalign programEl kullanilârak gerçeklestirilebilmektedir. Bu program, asag-ki referanslarda açiElanan birçok hizalanma semasIElkapsamaktadB Dayhoff, MD. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (bas.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Cilt 5, Ek 3, sayfa 345-358; Hein J., Unified Approach to Alignment and Phylogenes, sayfa 626-645 (1990); Methods in Enzymology cilt 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153 (1989); Myers, E.W. and Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb. Theor 11:105 (1971); Santou, N. Nes, M., Mol. Biol. Evol. 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. ancl Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad., Sci. ABD 80:726-730 (1983). Alternatif olarak, karsilâstlîiina için sekanslarlEl optimal hizalanmasÇlSmith and Waterman'a, Add. APL. Math 2:482 (1981) ait lokal kimlik algoritmasüNeedleman ancl Wunsch'a, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), by the search for similarity methods of Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. ABD 85: 2444 (1988) ait kimlik hizalama algoritmasEliIe, bu algoritmalarI bilgisayariEiliygulamalarIElIWisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI'de GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, ve TFASTA) ile veya denetim ile gerçeklestirilebilmektedir. Yüzde sekans özdesliginin ve sekans benzerliginin saptanmasElçi uygun olan algoritmalarI tercih edilen bir örnegi, sEislSLla, Altschul ve ark., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1977), ve Altschul ve ark., J. MoI. Biol. 215:403-410 (1990) eserlerinde açllZIanan BLAST ve BLAST 2.0 algoritmalarIlEl BLAST ve BLAST 2.0, iki veya daha fazla polinükleotit arasIa yüzde sekans özdesliginin saptanmasEiçin, örnegin, burada açilZlanan parametreler ile kullanllâbilmektedir. BLAST analizleri gerçeklestirmeye yönelik yazll]]îlia, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezinden halka açllZl olarak ulasllâbilmektedir. Bir açllZIaylEElörnekte, kümülatif puanlar, nükleotit sekanslarlîiçin, parametreler M (bir çift eslesen kallEtEiçin ödül puanEl daima 0) ve N (eslesmeyen kallEtlIâr için ceza puanlîldaima <0) kullanllârak hesaplanabilmektedir. Kelime vuruslarII her bir dogrultuda uzamasIZSu durumlarda durdurulmaktadlEi kümülatif uyum puanÇlelde edilen maksimum degerinden X miktarlîla düserse; bir veya daha fazla negatif puanlama kallEtElJyarlarII birikmesi nedeniyle kümülatif puan sm ya da alti düserse; veya herhangi bir sekans. sonuna ulasma. BLAST algoritma parametreleri (W, T ve X), hizalamanI hassasiyetini ve h-Ebelirlemektedir. BLASTN programünükleotit sekanslarIZI için) varsayüân olarak 11 kelimelik bir uzunlugu (W) ve 10 beklentisini (E) ve BLOSUM62 puanlama matris hizalamasIIEKbakE Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. ABD 89:10915 (1989)), (B) 50, 10 beklentisini (E), M = 5, N = -4 ve her iki sarmal. karsHâstlBlBiasIEkullanmaktadlE Belirli örneklerde, "sekans özdesliginin yüzdesi", en az 20 konumun bir karsllâstlüina penceresi üzerinden iki optimal olarak hizalanan sekansI karsilâstlîlllüiaslîüe saptanmaktadlEl burada karsilâstlElna penceresindeki polinükleotit sekansII bölümü, iki sekans. optimal hizalanmasEilçin referans sekanslar. klýlasla (eklemeleri veya delesyonlarügermeyen) yüzde veya daha az, genel olarak yüzde 5 ila 15 veya yüzde 10 ila 12 oranlEbla eklemeler veya delesyon (baska bir deyisle bosluklar) Içerebilmektedir. Yüzde, aynüliükleik asit bazlarII her iki sekansta, eslesen konumlarI say-@erecek sekilde konumlarII belirlenmesi, eslesen konumlarI say-I referans sekans-aki (pencere büyüklügü) toplam konumlari say- bölünmesi ve sonuçlar. dizi kimliginin yüzdesini vermek üzere 100 ile çarpilfhaslýla hesaplanmaslýla hesaplanmaktadlEl Genetik kodun esenerjiliginden dolayl,`_l burada açlElanan sekilde bir TCR kodlayan birçok nükleotit sekanlelI bulundugu teknikte uzman kisilerce anlasilâcaktß Bu polinükleotidlerin bazllârü örnegin aynDantijene baglanan modifiye TCR'IerI kodlayan dogal veya orijinal polinükleotit sekansEI nükleotit sekansEla minimum sekans özdesligi tasIiaktadE Bununla birlikte, kodon kullanIIIaki farkIHJKlara baglEblarak degisen polinükleotitler, mevcut bulus ile açlEça öngörülmektedir. Bazlîörneklerde, memeli ekspresyonu için kodon-optimize edilmis sekanslar spesifik olarak tasarlanmaktadlEl DNA Iigaz, DNA polimeraz, sIlEllama endonükleazlarüve benzerini kapsayan enzimatik reaksiyonlar için klonlama, DNA izolasyonu, amplifikasyon ve saflastlElnaya yönelik standart teknikler ve çesitli ayrna teknikleri teknikte uzman kisilerce bilinen yaygI olarak kullanüân tekniklerdir. Çok saylîzlh standart teknik Sambrook ve ark. (1989) Molecular Cloning, Ikinci BaskÇl Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis ve ark. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (ed.) (1993) Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (ed.) (1979) Meth Enzymol. 68; Wu ve ark. (eds.) (1983) Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (bas.) Meth. Enzymol. 65; Miller (bas.) (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose (1981) Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Biology; Glover (ed.) (1985) DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (eds.) (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; ve Setlow ancl Hollaender (1979) Genetic Engineering: Principles and Methods, Ciltler. 1-4, Plenum Press, New York eserlerinde açllZJanmaktadlE KullanIlglIa, klgaltmalar ve terimler dizini, burada bahsedilenler gibi profesyonel dergilerde yaygI olarak kullanHBiaktadlElve alanda standart olarak kabul edilmektedir. Nükleotid sekanslarEbrasIaki homoloji, DNA hibridizasyon analizi ile saptanabilmektedir burada çift zincirli DNA hibridinin stabilitesi, olusan baz eslemesinin derecesine baglIlB Yüksek slîlakllEl kosullarEl/e/veya düsük tuz içerigi kosullarühibridin dengesini azaltmaktadE ve seçili bir homoloji derecesinden daha az olan sekanslar. tavlanmasII önlenmesi için degistirilebilmektedir. Örnegin, yaklasllZl %55 G - C içerigine, hibridizasyon ve 40 - 50°C'lik yllZlama kosullar. sahip sekanslar için, 6 X SSC (sodyum klorür/sodyum sitrat tamponu) ve %0.1 SDS (sodyum dodesil sülfat), yaklasik] %60 ila 70 oranIa homoloji, hibridizasyon ve 50 - 65°C'Iik yllâama kosullarEbelirtmektedir, 1 X SSC ve %0.1 SDS, %82-97 homoloji ve hibridizasyon ve 52°C'lik ylKlama kosullarDJelirtmektedir, 0.1 X SSC ve %0.1 SDS, yaklaslEJ %99-100 oranIa homoloji belirtmektedir. Nükleotid ve amino asit sekanslarIEl karsllâstlElnaya (ve homoloji derecesini ölçmeye) yönelik çesitli bilgisayar programlarElaynEl zamanda mevcuttur ve hem piyasada satüân hem de ücretsiz yazll]]îli saglayan bir liste Ausubel ve ark. (1999) eserinde bulunmaktadlEl KolaylllZIa ulasllâbilir sekans karsllâstlülna ve çoklu sekans hizalama algoritmalarüsßslýla Temel Yerel Hizalama Arama AracEKBLAST) (Altschul ve ark., 1997) ve ClustalW programlarIlEI BLAST, ncbi.nlm.nih.gov Internet sitesinde mevcuttur ve ClustaIW'nin bir sürümü www2.ebi.ac.uk sitesinde mevcuttur. Mikroorganizmalarl endüstriyel suslarEl(örnegin, Asperg//lus n/ger, AspergiY/us ficuum, Aspergi//us avi/aman, Asperg//Ius oryzae, Tr/'Choderma reesei, Mucor m/'ehei, K/uyveromyces lad/'s, Pic/ula pastor/'s, Saccharomyces @rem/ae, Es-Cher/'ch/'a 60/1; Baci//us sular/713 veya Bad/las /icheniform/'5), böcek (Drozofila), memeli (örnegini Çin hamster over hücre çizgileri, CHO), veya bitki türleri (örnegin, kanola, soya fasulyesi, mlîlîl patates, arpa, çavdar, bugday), TCR proteinlerinin rekombinant üretimi için konakçEl hücreler olarak kullanilâbilmektedir. BazEIörneklerde, yüksek afiniteli bir TCR proteininin veya çözünebilir proteinin heterolog ekspresyonundaki ilk adi, bir ekspresyon yaplglIJTCR veya çözünür TCR kodlama sekanslüve promoterler, arttlüülâr ve sonlandlîülâr gibi kontrol sekanslarlü içerecek sekilde birlestirilmektedir. Sinyal sekanslarElve seçilebilir markörler gibi diger sekanslar aynljamanda dahil edilebilmektedir. TCR'nIn hücre dlgllkspresyonunu elde etmek Için, ekspresyI yaplgîlbir salgllâylEEsinyal sekanslülçerebilmektedir. Örneklerde, sitoplazmik ekspresyon isteniyorsa, ekspresyon sekanslZlekspresyon yap_ dahil edilmemektedir. Örneklerde, promotor ve sinyal sekanslZlkonakçElhücrede fonksiyoneldir ve TCR'nin veya çözünür TCR proteininin ekspresyonunu ve salgllânmasIlZl saglamaktadlîl Etkili transkripsiyonun saglanmasEliçin transkripsiyonel sonlandEEllâr dahil edilebilmektedir. Ekspresyon veya protein saflastlünasIElgelistiren yardIicElsekanslar ekspresyon yap- aynüamanda dahil edilebilmektedir. Çesitli promotorler (transkripsiyonel baslatma düzenleme bölgesi) bulusa göre kullanilâbilmektedir. Uygun promotorun seçimi önerilen ifade konakçEla bagllZdJIabilmektedir. Heterolog kaynaklardan gelen promotorler, seçilen konakçlî'lh fonksiyonel olduklarlîlsürece kullanllâbilmektedir. Promotor seçimi ayrü istenen verim ve peptid veya protein üretimi seviyesine baglIlB E. Çal/deki protein ekspresyon seviyesini dramatik bir sekilde arttlElnak için tak gibi indüklenebilir promotorler lelIk`la kullanlEhaktadIE Proteinlerin artan ekspresyonu, konakçEl hücrelere zararlülabilmektedir. Sonuç olarak, konakçlîhücre büyümesi sIlEIllIblabilmektedir. Indüklenebilir promotor sistemlerinin kullanilfhasükonakçlZhücrelerin, gen ekspresyonunun indüklenmesinden önce kabul edilebilir yogunluklara kadar ekilmesini saglamaktadü böylece daha yüksek ürün verimlerini kolaylastlElnaktadEl Çesitli sinyal sekanslar, bulusa göre kullanilâbilmektedir. TCR kodlama dizisine homolog olan bir sinyal sekansElkullanüâbilmektedir. Alternatif olarak, ekspresyon konakçlflla verimli salgllâma ve isleme için seçilmis veya tasarlanmlg bir sinyal sekanslZlaynlZlzamanda kullanilâbilmektedir. Örnegin, uygun sinyal sekansmkonakçlîlhücre çiftleri, B. subtiY/s'de salgilâma için B. sabri/Is sacB sinyal sekansIÇl ve Sacc/raromyces cereV/'5/ae or-eslesme faktörü veya P. pastori's salgilâmaslîiçin P. pastor/'s asit fosfataz phol sinyal sekanslarIü kapsamaktadlîl Sinyal sekanslîdogrudan sinyal peptidaz bölünme bölgesini protein kodlama sekanlela kodlayan sekans araclIJIjllýla veya genellikle on kodondan daha az olan klgla bir nükleotit köprüsü aracMgllgla birlestirilebilmektedir, burada köprü asaglîllakli TCR sekansII dogru okuma çerçevesini saglamaktadE Ökaryotik protein ekspresyon sistemleri için transkripsiyon ve translasyonu arttlünak için elemanlar tanmlanmlgtlü Örnegin, karnabahar mozaik virüsünün (CaMV) promotörünün 1000 bp'yi heterolog bir promotörün her iki yan. yerlestirilmesi, transkripsiyon seviyelerini bitki hücrelerinde 10 ila 400 kat arttübilmektedir. Ekspresyon yaplgîlayrlîla uygun translasyon baslatma sekanslarIEliçermelidir. Ekspresyon yap-I uygun translasyon baslatma için bir Kozak konsensüs sekanslîliçerecek sekilde modifikasyonu, translasyon seviyesini 10 kat artlûbilmektedir. Markör ilgilenilen genden farklEJbir bölgeye entegre edilebilecek sekilde, ekspresyon yap-I bir parçaslîblabilen veya ondan ayrlîblan (örnegin ekspresyon vektörü tarafIan taslElan) seçici bir markör kullanlEhaktadlE Örnekler, antibiyotiklere direnç saglayan (örnegin, bla, E. co/i' konakçEIhücreleri için ampisilin direnci vermektedir, nptll, çok çesitli prokaryotik ve ökaryotik hücrelere kanamisin direnci vermektedir) veya konakçII minimum ortam (örnegin, HIS4, P. pastor/'s veya His- 5. cerei//Lsigae/I histidin yoklugunda büyümesine olanak saglamaktadlD üzerinde büyümesine izin veren markörleri kapsamaktadlB Seçilebilir markör, markörün bagnsIZ ekspresyonuna izin vermek için kendi transkripsiyonel ve translasyonel baslatma ve sonlandßna düzenleme bölgelerine sahiptir. Eger bir markör olarak antibiyotik direnci kullanUJIbrsa, seçim için antibiyotik konsantrasyonu, antibiyotige baglEloIarak, genellikle 10 ila 600 ug antibiyotik/mL ortam arasIa degisecektir. Ekspresyon yapEÇl bilinen rekombinant DNA teknikleri kullanüârak kurulabilmektedir (Sambrook ve ark., 1989; Ausubel ve ark., 1999). Klîlfibma enzimi sindirimi ve Iigasyonu, iki DNA parçasIEl birlestirmek için kullanllân temel adIlIardE DNA fragmanII uçlarEI Iigasyondan önce modifikasyon gerektirebilir ve bu, ç-[lârl doldurulmasÇlfragment(ler)in terminal k-ilarII nükleazlarla (örnegin, Exolll), bölgeye yönelik mutajenez ile silinmesi veya PCR ile yeni baz çiftlerinin eklenmesi ile gerçeklestirilebiImektedir. Seçilen parçalar. birlestirilmesini kolaylastlElnak için çoklu baglantilâylîüâr ve adaptörler kullanllâbilmektedir. Ekspresyon yapEEtipik olarak, E. C0//nin sIlEllama, ligasyon ve dönüsüm turlarIEkullanan asamalarda birlestirilmektedir. Ekspresyon yap-I yapIi- uygun olan çok say. klonlama vektörü, teknikte bilnmektedir (kZAP ve pBLUESCRIPT SK-l, Stratagene, LaJoIIa, CA; pET, Novagen Inc., Madison, WI - Ausubel ve ark., 1999 eserinde bahsedilmektedir) ve özel seçimin bulus için önemli degildir. Klonlama vektörünün seçimi, ekspresyon yap-[El konakçEhücreye dahil edilmesi için seçilen gen aktarn sisteminden etkilenecektir. Her bir asamanI sonunda, sonuçta elde edilen yapÇlklgflhma, DNA sekanslÇlhibridizasyon ve PCR analizleriyle analiz edilebilmektedir. Ekspresyon yapElZlklonlama vektörünün yaplîlîolarak lineer veya dairesel olarak konakçlýb dönüstürülebilmektedir veya klonlama vektöründen çilZlarIEbilmektedir ve oldugu gibi kullanllâbilmektedir veya bir dagllîltîii vektörüne uygulanabilmektedir. Iletim vektörü, seçilen konakçEl hücre tipinde ekspresyon yap-I uygulanmasIElve yasamElsürdürmesini kolaylastünaktadß Ekspresyon yapisi: konakçEhücrelere bilinen herhangi bir saylî'ila gen aktarma sistemi (örnegin, dogal yetkinlik, kimyasal araCIIJJItlönüsüm, protoplast dönüsümü, elektroporasyon, biyoistik dönüsümü, transfeksiyon veya konjugasyon) ile uygulanmaktadlE (Ausubel ve ark., 1999; Sambrook ve ark., 1989). Seçilen gen aktarIi sistemi, konakçü hücrelere ve kullanllân vektör sistemlerine baglIE Örnegin, ekspresyon yapisi: protoplast dönsümü veya elektroporasyon ile 5. cerevisiae hücrelerine uygulanabilmektedir. 5. cereV/'s/ae/nin elektroporasyonuna kolaylikla ulasllîhaktad iElve sferoplast dönüsüme klýlaslanabilir dönüsüm verimleri vermektedir. Ligand baglanma bölgesinden farklElbir bölgede bir TCR proteini ile spesifik olarak tepkimeye giren monoklonal veya poliklonal antikorlar, tercihen monoklonal, teknikte bilinen yöntemler ile üretilebilmektedir ve çogu piyasada satilüiaktadlü BakIlîJ örnegin, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2'inci baskiZIAcademic Press, New York; ve Ausubel ve ark. (1999) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York. Özel bir hedef Iigand için spesifik olan hücre-bagIIZl/eya çözünür formdaki TCRIer, örnegin, biyolojik numunelerin taranmaslîahücreler, doku numuneleri, biyopsi malzemesi, vücut slîllârü ve benzeri) için ve bir test numunesinde hedef ligandiiîl varllglII tespit edilmesi için diagnostik problar olarak faydalIIEI Sllîlllaa, TCRIer, kovalent olarak veya kovalent olmayan sekilde, saptanabilir bir sinyal saglayan bir maddenin birlestirilmesiyle etiketlenmektedir. Uygun etiketler; radyonüklitleri, enzimleri, substratlarÇI kofaktörleri, inhibitörleri, floresan maddeleri, kimyasal parlak maddeleri, manyetik partikülleri ve benzerini içermektedir, ancak bunlarla sIlEllEldegildir. Ek olarak TCR, bir ikinci baglanma molekülü için bir Iiganda birlestirilebilmektedir; örnegin, TCR biyotinlenebilmektedir. Bir hedef hücreye veya moleküle baglanan TCR'nin tespit edilmesi böylelikle, bir tespit edilebilir streptavidinin (bir floresan, rakyoaktif, kimyasal parlaklllZl maddesi veya diger tespit edilebilir molekülün eklendigi veya bir kromoforik substratI bulundugu bir enzimin mevcut oldugu bir streptavidin) baglanmasEile gerçeklestirilebiImektedir. ScTCR'ye kovalent olarak baglanan bu tür etiketlerin ve/veya toksik bilesiklerin kullanllilüçllîlayan Amerika Birlesik Devletleri Patentleri, 3,817,837; 3,850,752; 3,927,193; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; 4,331,647; 4,348,376; 4,361,544; 4,468,457; 4,444,744; 4,640,561; 4,366,241; RE 35,500; 5,299,253; 5,101,827; 5,059,413 NumarallIpatent dokümanlarIEkapsamaktad IEancak bunlarla lellElilîilegildir. Etiketli TCRler, kullanllân etikete uygun bir yöntem ve izleme cihazElkullanllârak tespit edilebilmektedir. Floresan mikroskobu veya floresans aktive hücre ayünasü etiketin bir floresan kignlîioldugu ve etiketin bir radyonüklid, gama saynüotoradyografi veya slîiîi sintilasyon sayIiüJIdugu durumlarda, örnegin yöntemin analiz edilen numune ve kullanllân radyonüklide uygun olmasllosuluyla kullanllâbilmektedir. Ek olarak, burada belirtildigi gibi bir MHC bileseninin yoklugunda, hedef Iigand için baglama bölgesinin bir parçasElolmayan TCR'nin bir kEinIEtanlýlan, tespit edilebilir bir molekül veya partikülün kullanligiEikincil tespit molekülleri veya partikülü bulunabilmektedir. Teknik, in situ diagnostik görüntüleme için faydalEllJilesikleri bilmektedir; bakIlîlörnegin, 5,101,827; 5,059,413 NumaralElU.S. Patent doküman ElTerapi ve / veya in vivo görüntüleme için yararlßlan radyonüklidler, 97Rubidyum, 111Indiyum, 125Iyodin, 131Iyodin, 123Iyodin, 67Galyum, 99Teknetyumu kapsamaktadE Toksinler, TCR-toksin kompleksi hücreye baglandigiIa, toksik k-i, sitotoksik etkisini uygulayabilecek sekilde içsellestirilmesi sartlEa digerlerinin yanllelG, difteri toksini, risin ve hint fasulyesi toksinini kapsamaktadß Immünotoksin teknolojisi teknikte iyi bilinmektedir ve uygun toksik moleküller, sIlEIiama olmadan, vindesin, antifolatlar, örnegin, metotreksat, sisplatin gibi ilaçlarÇidaunomisin, daunorubisin veya adriamisin gibi antrosiklinleri ve ribozom etkisizlestirici proteinler (örnegin difteri toksin, amerikaüzümü antiviral protein, abrin, risin, psödomonas eksotoksin A veya bunlari rekombinant türevleri) gibi sitotoksik proteinleri kapsamaktadlEi BakIiîi genel olarak, örnegin, Isnes and Pihl (1982) Pharmac. Ther. 25:355-381 and Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Eds. Baldwin and Byers, sayfa 159- 179, Academic Press, 1985. Bir peptitzMajör Histokompatibilite Kompleksine baglanma dahil olmak üzere, bunu üretmeye ve kullanmaya yönelik TCR moleküllerinin genel yapElIbçllZlanmaktadB BakIlîl örnegin, PCT/US98/04274; PCT/U598/20263; WO99/60120 numarallîatent dokümanlarü Farmasötik Bilesimler ve Terapötik Maddeler Belirli bir hedef Iigand için spesifik olan TCRler, özel antijen ile iliskili bir hastalllîtan, örnegin, kanser gibi bir neoplastik hastaliEiveya rahatsiîllthan muzdarip oldugu düsünülen hayvanlar. ve memelilerin tedavi edilmesinde faydaIIlEI Burada açiKlanan yöntemlere göre tedavi edilebilen kanser tiplerinin örnekleri, bunlarla sIIHlîblmadan, Wilms tümörü, mesane kanseri, meme kanseri, kolon kanseri, kolorektal kanser, özofageal karsinomlar, mide kanseri, hepatoselüler karsinom, böbrek kanseri, lösemi, karaciger kanseri, akciger kanseri, lenfoma, melanom, nöroblastom, küçük olmayan hücreli akciger karsinomu, oral kanseri, osteosarkoma, over kanseri, pankreas kanseri, prostat kanseri, renal kanseri, cilt kanseri, küçük hücreli akciger karsinomu ve testis kanserini kapsamaktadlîl Terapötik ürünler, burada gösterilen malzemeler kullanilârak üretilebilmektedir. Etkili miktarda terapötik ürünler, bir süjede ölçülebilir bir etki üreten minimum dozdur. Terapötik ürünler teknikte orta derecede uzman kisice kolaylüZla hazlHlanmaktadlEI Bir örnekte, bulusa ait bir scTCR dogrudan bir hastaya uygulanmaktadlB Bir yapilândlîilnada, bulusa ait bir scTCR, teknikte bilinen sekilde, PEG'e veya immünoglobulin sabit bölgelere baglantllânmaktadlü Bu yapilândlElna serum klerensini uzatmaktadlü Bir yapilândlünada, bir kemoterapötik maddeye veya ilaca bir kanser hücresi gibi bir hedef hücreye ilacI iletilmesi amaclýla baglantllânmaktadlü Bir yapüândlElnada, scTCR, bir sitokin gibi biyolojik efektör molekülüne baglantilânmaktadlEanyal and Kalra (2008) Eur J Pharmacol, 579, 1-12). Bir yapllândlElnada, scTCR, IL-2, IL-12, veya TNFu gibi anti-tümör etkinlik ile bir sitokine baglantilânmaktadlEl (Wong ve ark. (2011) Protein Eng Des Sel, 24, 373-83). Bir yapliândlElnada, scTCR, IL-10 veya IL-13 gibi bir immün-inhibe edici sitokine baglantllânmaktadlîlßtone ve ark. (2012) Protein Engineering). Bir yapllândlîrlnada, scTCR, bir bispesifik maddenin olusturulmaslîl için baska bir antijen baglanma molekülüne baglantilânmaktadlEI(Miller ve ark. (2010) Protein Eng Des Sel, 23, 549-57; Thakur and Lum (2010) Curr Opin MOI Ther, 12, 340-9). Bir yapilândlünada, bispesifik molekül, T hücrelerini ve hastalllîlljiiücreleri çapraz baglamak üzere anti-CD3 gibi, bir tek zincirli Fv'ye baglantllânan bir scTCR'den olusmaktadlü((Bargou ve ark. (2008) Science, 321, 974-7; Liddy ve ark. (2012) Nat Med, 18, 980-7) Bir yapllândlîilnada, scTCR, bir kimerik antijen reseptörü olusturmak üzere, CD3 gibi, TCR sinyalleme alanlarliîb baglantüânmaktadlE((Porter ve ark. (2011) N Engl J Med, 365, 725-33; Sadelain ve ark. (2009) Curr Opin Immunol, 21, 215-23; Stroncek ve ark. (2012) J Transl Med, 10, 48). Bu yöntemler ve intravenöz olarak gibi diger uygulama yöntemleri teknikte bilinmektedir. Faydalüjozajlar, teknikte orta derecede uzman kisi tarafIan saptanabilmektedir. scTCR bilesimleri, teknikte bilinen herhangi bir ara ile formüle edilebilmektedir. Bunlar tipik olarak, özellikle intravenöz, intraperitoneal veya sinovial uygulama için (özel hastalilg ile saptanan yol ile) enjeksiyon prepartlarEblarak veya ya süözeltiler ya da süspansiyonlar olarak, intranasal veya oral uygulama için formülasyonlar olarak halelanabilmektedir. Enjeksiyon veya diger uygulamadan önce 5_ çözelti için veya süspansiyon için uygun katü formlar aynEl zamanda hazlîllanabilmektedir. Preparat ayrlEb örnegin emülsifiye edilebilmektedir veya Iipozomlar içinde kapsüllenmis protein(ler)/peptid(ler) olabilmektedir. Aktif içerikler lelilZla, farmasötik olarak kabul edilebilir olan ve aktif içerik ile uyumlu olan yardIicEI maddeler veya taslEEliâr gibi opsiyonel farmasötik katkEi maddeleri ile karlgtlîilîhaktadß Uygun yardIicEimaddeler, bunlarla sIiEIIEIoImamak üzere, su, salin, dekstroz, gliserol, etanol veya benzeri ve bunlar. kombinasyonlarIEi kapsamaktadlE scTCR'nin enjekte edilebilir, aerosol veya nazal formülasyonlardaki konsantrasyonu, genellikle 0.05 ila 5 mg/ml arasIiadlEl Özel etkili dozajlarlEl seçimi, teknikte uzman kisi tarafIan gereksiz deneyler olmadan bilinmektedir ve gerçeklestirilmektedir. Benzer dozajlar, diger mukozal yüzeylere uygulanabilmektedir. Ek olarak, arzu edildiginde, bir scTCR kapsayabilen asiiâr, asII etkisinin artlün @atma veya emülsiyonlastlüina maddeler, pH tamponlama maddeler, ve/veya adjuvanlar gibi yardncEi maddeler gibi az miktarda farmasötik katkEinaddelerini bariEtllEbilmektedir. Etkili olabilen adjuvanlar. örnekleri, bunlarla lellBllZblmadan sunlarEkapsamaktadE N-asetiI-muramiI-L- treonyI-Disoglutamin (thr-MDP); N-asetiI-nor-muramiI-L-alaniI-D-izo-gIutamin (CGP 11637, nor-MDP olarak adlandlEilßîaktadlEJ; N-asetilmeturamil-L-alaniI-D-izotamtaminil-L-alanin-Z- (1'-2'-dipaImi-toil-sin-gliser0-3-hidroksifosforiloksi)-etilamin (CGP 19835A, MTP-PE olarak adlandlElBiaktadlEx Bakterilerden çilZlarilân üç bilesen içeren RIBI: %2 skualen/Tween® 80 emülsiyonunda monofosforil Iipit A, trehaloz dimikolat ve hücre duvarüiskeleti (MPL + TDM + CWS). Bu tür ek formülasyonlar ve uygulama biçimleri teknikte bilinen sekilde kullanilâbilmektedir. TCR degisken bölgelerine benzer birincil yaplýia (%90'dan daha fazla özdes) sahip olan ve hedef Iigand için yüksek afinite muhafaza eden mevcut bulusa ait scTCRler ve/veya baglanma fragmentleri, nötr ve tuz formlarü olarak asüâra formüle edilebilmektedir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar, bunlarla sIlBilZbImadan, inorganik asitler, örnegin hidroklorik asit veya fosforik asitler ile olusturulan asit ilaveli tuzlar (peptidin serbest amino gruplarEilIe olusturulan); ve organik asitler, örnegin asetik, oksalik, tartarik veya maleik asidi kapsamaktadlE Serbest karboksil gruplarlîile olusturulan tuzlar ayrlîlsi inorganik bazlardan, örnegin sodyum, potasyum, amonyum, kalsiyum veya ferrik hidroksitlerden ve organik bazlardan, örnegin izopropilamin, trimetilamin, 2-etilamino-etanol, histidin ve prokainden elde edilebilmektedir. Terapötik kullanma yönelik scTCRler, dozaj formülasyonu ile uyumlu olacak sekilde ve teknikte bilinene göre profilaktik olarak ve/veya terapötik olarak etkili miktarda veya sekilde uygulanmaktadE Uygulanacak miktar, genellikle doz bas. yaklasllZl 100 ila 20,000 ug protein arallglIa, daha genel olarak doz bas. yaklasllZl 1000 ila 10,000 ug protein arallgllîitladß Benzer bilesimler, örnegin, bir hedef IigandI baglEbldugu hücrelerin tespit edilmesi için görüntülemede kullanllüiasüçin etiketli scTCRler kullanüârak benzer sekillerde uygulanabilmektedir. Uygulanmaslîgereken aktif maddenin kesin miktarlarüdoktorun veya veterinerin kararüla baglEblabilmektedir ve her bireye özgü olabilmektedir, ancak böyle bir belirleme, böyle bir pratisyenin yetenegi dahilindedir. TCR ürünü, tek bir doz halinde; iki dozluk planda, örnegin iki ila sekiz hafta; veya bir çoklu doz plan. göre verilebilmektedir. Bir çoklu doz planIZlbir birincil tedavi kürünün 1 ila 10 veya daha fazla ayrüloz içerebilecegi, ard an cevabßürdürmek ve/veya güçlendirmek için gereken sonraki zaman arallKlarIa uygulanan diger dozlarlîçerebilen bir plandlE AçiElanan veya örneklendirilen bilesenlerin her formülasyonu veya kombinasyonu, aksi belirtilmedikçe bulusun uygulanmasEIçin kullanilâbilmektedir. Maddelerin spesifik isimlerin, teknikte orta derecede uzman kisinin aynlIilnaddeleri farkllîsekilde adlandlElllâbilecegi bilindigi üzere örnekleyici olmaslZlamaçlanmaktadlÜ Burada, bilesigin belirli bir izomerinin veya enantiyomerinin belirtilmedigi bir bilesik açllZlandlglia, örnegin bir formülde veya kimyasal bir isimde veya herhangi bir kombinasyonda bu tarifnamenin, ayrlZlayrEl/eya herhangi bir grupta açlKlanan bilesigin her izomerini ve enantiyomerini içermesi amaçlanmaktadlEl Teknikte orta derecede uzman kisi yöntemlerin, hedef IigandlarlEl, biyolojik olarak aktif gruplarlEl, baslanglgl malzemelerinin ve spesifik olarak örneklenenlerin dlglüldaki sentetik yöntemlerin, gereksiz deneylere basvurmaks- açllZlamanI uygulanmaleUa kullanllâbilecegini takdir edecektir. Teknikte bilinen tüm islevsel esdegerlerin, bu tür herhangi bir yöntemin, hedef IigandlarlEl, biyolojik olarak aktif gruplarlEl, baslanglgl materyallerinin ve sentetik metotlarlEl, bu bulusa dahil edilmesi amaçlanmlgtlEl Bu tarifnamede bir arallE] verildiginde, örnegin, bir slgklüîlarallglübir zaman aral[g]l3/eya bir kompozisyon arallgiütüm ara aralllZlar ve alt araliElar ve ayrEla verilen araliElardaki tüm ayrEdegerlerin bulusa dahil edilmesi amaçlanmlgtlü Kesin formülasyon, uygulama sekli ve dozaj, hastanI durumu göz önüne allrak doktor taraflEtlan seçilebilmektedir (bakIIîl örnegin, Fingl ve ark., in The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975, Ch. 1 syf. 1). Uzman doktorun, toksisite nedeniyle ya da organ fonksiyon bozuklugu nedeniyle uygulamayEI naslljve ne zaman sonlandßcaglükesecegini ya da ayarlayacagIEbilecegi belirtilmelidir. Aksine, eger klinik cevap yeterli degilse (toksisiteyi önleyen) uzman doktorun aynüamanda tedaviyi daha yüksek seviyelere ayarlayacaglüailmesi gerekir. Ilgili bozuklugun tedavisinde uygulanan bir dozun büyüklügü, tedavi edilecek durumun ciddiyetine ve uygulama yoluna bagIlZI olarak degisecektir. Durumun siddeti, örnegin kismen standart prognostik degerlendirme yöntemleri ile degerlendirilebilmektedir. AyrlEla, doz ve belki de doz sUZllgllIaPynEl zamanda, her bir hastanI yas., kilosuna ve tepkisine göre degisecektir. Yukar- tartlgliâna benzer bir program aynüamanda veterinerlikte kullanllâbilir. Tedavi edilen spesifik kosullara ve seçilen hedefleme yöntemine baglßlarak, bu tür maddeler sistemik veya lokal olarak formüle edilebilmektedir ve uygulanabilmektedir. Formülasyon ve uygulamaya yönelik teknikler Alfonso and Gennaro'da (1995) bulunabilmektedir. Uygun yollar, örnegin, oral, rektal, transdermal, vajinal, transmukozal veya baglBak uygulamasILIl intramüsküler, subkütan, veya intramedüler enjeksiyonlar. yanlîlslg, intratekal, intravenöz veya intraperitoneal enjeksiyonlar dahil olmak üzere parenteral iletimi kapsayabilmektedir. Enjeksiyon için, bulusa ait maddeler, sulu çözeltilerde, tercihen Hanks' çözeltisi, Ringer çözeltisi veya fizyolojik tuz çözeltisi gibi fizyolojik olarak uyumlu tamponlarda formüle edilebilmektedir. Transmukozol uygulamaya yönelik olarak, içine geçilecek olan bariyere uygun penetranlar formülasyonda kullanllfhaktadB Bu tür penetranlar genel olarak teknikte bilinmektedir. Sistemik uygulamaya uygun dozajlar. pratigi için burada açlKlanan bilesiklerin formüle edilmesi için farmasötik olarak kabul edilebilir tasElEErlEl kullanlEbulusun kapsamIadlB Uygun taslýlEElseçimi ve uygun imalat pratigi ile, mevcut bulusun bilesimleri, özellikle çözeltiler halinde formüle edilenler, intravenöz enjeksiyon gibi parenteral olarak uygulanabilmektedir. Uygun bilesikler, teknikte iyi bilinen farmasötik olarak kabul edilebilir tasMîllâr kullanilârak oral uygulama için uygun dozajlar halinde kolallEla formüle edilebilmektedir. Bu taslýlîllâr, açiklanan bilesiklerin, tedavi edilecek bir hastanI oral yoldan allElnasEîçin tabletler, haplar, kapsüller, slîllâr, jeller, suruplar, bulamaçlar, süspansiyonlar ve benzerleri olarak formüle edilmesini saglamaktadlîl Hücre içinden uygulanmasllmaçlanan maddeler, teknikte orta derecede uzman kisilerce iyi bilinen teknikler kullanllârak uygulanabilmektedir. Örnegin, bu tür maddeler, lipozomlara kapsüllenebilmektedir ve sonrasIa yukar- açllZlanan sekilde uygulanmaktadlü Lipozomler sulu iç taraflara sahip küresel Iipit çift katmanlardß Lipozom olusumu süsia bir 5qu çözeltide bulunan tüm moleküller sulu iç tarafa dahil edilmektedir. Lipozom içerikleri dlgl mikro ortamdan hem korunmaktadEhem de hücre membranlarEiIe Iipozomlar kaynast-[glü için hücre sitoplazmas- etkili bir sekilde iletilmektedir. Ek olarak, hidrofobikliklerinden dolaylZIküçük organik moleküller dogrudan hücre içinden uygulanabilmektedir. Mevcut bulusta kullanIia uygun farmasötik bilesimler, aktif içeriklerin hedeflenen amaca ulasllBrasElçin etkili bir miktarda barEU-[glîbilesimleri kapsamaktadIB Etkili miktarlar. belirlenmesi, Özellikle burada sunulan ayrlEtmBçllZlama dogrultusunda, teknikte uzman kisinin yetenegi dahilindedir. Aktif içeriklere ek olarak, bu farmasötik bilesimleri, farmasötik olarak kullanllâbilen preparasyonlara aktif bilesiklerin islenmesini kolaylastün eksipiyanlarü'e yardncljlnaddeleri içeren uygun farmasötik olarak kabul edilebilir taslîEErÜarlEtllübilmektedir. Oral uygulama için formüle edilen preparasyonlar, gecikmis saIIi için veya yalnlîta farmasötik ince baglBkak veya kalI baglîsaga ulastlglülja sallEmasEilçin formüle edilenler dahil olmak üzere, tabletler, drajeler, kapsüller, veya çözeltiler formda olabilmektedir. Mevcut bulusun farmasötik bilesimleri, kendi bas. bilinen herhangi bir sekilde, örnegin geleneksel karlgtlülna, çözündürme, ögütme, draje-üretme, yükseltme, emülsife etme, enkapsülasyon, tuzaklama veya Iiyofilize etme prosesleri araclIJgilýla imal edilebilmektedir. Parenteral uygulamaya yönelik farmasötik formülasyonlar, suda çözünür formda aktif bilesiklerin sulu çözeltilerini kapsamaktadlû Ek olarak, aktif bilesiklerin süspansiyonlarüuygun yaglEbnjeksiyon süspansiyonlarEblarak hazIEllanabilmektedir. Uygun Iipofilik çözücüler veya vehiküller, susam yagügibi yaglü'aglar veya etil oleat veya trigliseritler gibi sentetik yag asidi esterleri veya lipozomlarlZl kapsamaktadlü Sulu enjeksiyon süspansiyonlarÇl sodyum karboksimetil selüloz, sorbitol veya dekstran gibi süspansiyonun viskozitesini artßn maddeler içerebilmektedir. Opsiyonel olarak, süspansiyon aynlZI zamanda yüksek konsantrasyonlu çözeltilerin hazlEllanmas- izin vermesi için bilesiklerin çözünürlügünü artßn uygun stabilizatörler veya ajanlar içerebilmektedir. Oral kullanIia yönelik farmasötik preparasyonlar, tabletlerin veya draje çekirdeklerinin elde edilmesi için, arzu edildiginde uygun eksipiyanlarIeklenmesinden sonra, aktif bilesiklerin katEl eksipiyan ile birlestirilmesi, opsiyonel olarak sonuçta olusan karlglEliI ögütülmesi ve granüllerin karisimlari. islenmesi ile elde edilebilmektedir. Uygun eksipiyanlar, özellikle Iaktoz, sükroz, mannitol veya sorbitolü kapsayan sekerler gibi dolgu maddeleri; örnegin mElEl nisastasü bugday nisastasü pirinç nisastasü patates nisastasüjelatin, kitre, metil selüloz, hidroksipropilmetil-selüloz, sodyum karboksimetilselüloz, ve/veya polivinilpirrolidon (PVP) gibi selüloz preparasyonlarIlE Arzu edildiginde, çapraz bagllîpolivinil pirrolidon, agar veya aljinik asit veya sodyum aljinat gibi bunun bir tuzu gibi dag ltîlna maddeleri eklenebilmektedir. Draje çekirdekleri, uygun kaplamalar ile saglanmaktadE Bu amaçla, opsiyonel olarak arap zamkÇltalk, polivinil pirrolidon, karbopol jel, polietilen glikol, ve/veya titanyum dioksit, vernik çözeltileri, ve uygun organik çözücüleri veya çözücü karmlarübarilîabilen konsantre seker çözeltileri kullanilâbilmektedir. Boya maddeleri veya pigmentleri, aktif bilesik dozlarII farklEl kombinasyonlarIEtanIilamasEl/eya karakterize etmesi için tablet veya draje kaplamalar. eklenebilmektedir. Oral olarak kullanllâbilen farmasötik preparasyonlar, jelatinden üretilen silîlîlgeçirme kapsüllerin yanElsEi gliserol veya sorbitol gibi jeltain veya plastiklestiriciden üretilen yumusak, slîülElnaz kapsülleri kapsamaktadß SlEügeçirme kapsüller, Iaktoz gibi dolgu maddesi, nisastalar gibi baglayülâr ve/veya talk veya magnezyum stearat gibi yaglayüßr ve opsiyonel olarak stabilizatörler ile karElElida aktif içerikler barißbilmektedir. Yumusak kapsüllerde, aktif bilesikler, sabit yaglar, slîljaarafin, veya slîEpolietilen glikoller gibi uygun sliîllârda çözündürülebilmektedir veya süspansiyon halinde tutulabilmektedir. Ek olarak, stabilizatörler eklenebilmektedir. Tedavi Yöntemleri Yüksek afiniteli TCRler ve yüksek afinteli TCRleri içeren farmasötik bilesimler, örnegin, bir kansere, tümöre, kötücül tümöre veya neoplastik hastal[gb veya rahatslîligb sahip olan bir hastan tedavi edilmesi için kullanllâbilmektedir. Bir örnekte, kansere sahip olan bir hastanI tedavi edilemsin eyönelik bir yöntem burada açllZlanan bir yüksek afiniteli TCR'nin uygulanmasIEliçermektedir. Bir örnekte, yüksek afiniteli TCR, WT1 için spesifiktir. Bir örnekte, TCR, SEKANS KIMLIK NUMARASI:3'te belirtilen amino asit sekansIElçeren bir Vß içermektedir. Bir örnekte, TCR, SEKANS KIMLIK NUMARASI:4'te belirtilen amino asit sekanslüiçeren bir Vu Içermektedir. Bir örnekte, yüksek afiniteli TCR, SEKANS KIMLIK NUMARASI:5'te belirtilen amino asit sekanlelEiçeren bir tek zincirli TCR'yi içermektedir. Bir örnekte, yüksek afiniteli TCR, bir terapötik madde, örnegin, bir kemoterapötik madde ile kombinasyon halinde uygulanmaktadlü Yine baska bir örnekte, yüksek afiniteli TCR, bir biyolojik olarak aktif gruba konjuge edilmektedir. Bulusun baska bir yönü, ya yaban tip TCR ya da burada açiEianan yüksek bir afinite TCR eksprese eden T hücresinin uygulanmasIEiÇeren, buna ihtiyaciîcblan bir hastaya T hücresinin adoptif aktarnlüla yönelik bir yöntem saglamaktadlü Bir örnekte, T hücreleri, WT1 için spesifik olan bir TCR kodlayan bir polinükleotit ile transfekte edilmektedir. Bir örnekte, TCR, SEKANS KIMLIK NUMARASI:3'te belirtilen amino asit sekansIEIçeren bir Vß içermektedir. Baska bir örnekte, TCR, SEKANS KIMLIK NUMARASI:4'te belirtilen amino asit sekanlelüberen bir Va içermektedir. Baska bir örnekte, yüksek afiniteli TCR, SEKANS KIMLIK NUMARASI:5'te belirtilen amino asit sekanslüberen bir tek zincirli TCR'yi içermektedir. ÖRNEKLER AsaglEiiaki örnekler ayrEia bulusun sIiIliaylEßlmayan örneklerini açilZlamaktadiEi ÖRNEK 1 PEPTIT/HLA-AZ ANTIJENLERINE YÖNELIK YÜKSEK AFINITE IÇIN TCR'LERIN ISLENMESI Gelismis afinite ve stabilite için tek zincirli TCRlerin kesfedilmesi veya üretilmesi için kullanilân genel strateji Sekil 3'te gösterilmektedir. Proses, su sekilde gösterildigi üzere aitEiadIi içermektedir: 1) Gösterim için bir tek hücreli TCR formatüblarak P22 gibi bir T hücresinden (Sekil 1'de gösterilen sekans, ve SEKANS KIMLIK NUMARASIzl'de belirtilen amino asit sekansIEi içeren Vß ve SEKANS KIMLIK NUMARASI:2'de belirtilen amino asit sekansIIIÇeren Va) bir hücre klonundan Va ve Vß TCR genlerinin klonlanmaslZiV bölgeleri, HLA-A2 ile komplekste HLA-Az-siiîiiijntijenik peptit WT1'i (SEKANS KIMLIK NUMARASI:6) tanIiaktadiEI Mevcut bulusta, P22'den TCR V bölgesi genleri (örnegin, Dossett ve ark. (2009) Mol Ther. 17(4), 742), bir tek zincirli format (Vß-baglantllây-/oo olarak klonlanmigtlüve mayanlîn] yüzeyi üzerinde ekspresyon için bir maya gösterim vektörüne yerlestirilmistir (Sekil 4). 2) Bir anti-Vß antikor ile stabilize varyantlar için bir hata egilimli kütüphanenin ve FACIarI veya manyetik boncuk seçiminin üretimi. Tek zincirli Va ve Vß TCR'Ier, stabilize edici sabit bölgelerin kaybElnedeniyle genellikle instabil olduklarlEUan, maya yüzeyinde kararlEl ifadeye izin veren mutasyonlarEldengelemek için seçim yapmak için hataya egilimli mutajenez kütüphaneler üretilmektedir, faj ve memeli görüntüsünü içeren ancak bunlarla sIlHlEblmayan formatlar kullanllâbilmektedir. Faj gösterim vektörleri ve klonlama, 1011 kütüphane büyüklükleri verirken, maya gösterim vektörleri ve homolog rekombinant adnlar 1010 kütüphane büyüklükleri vermistir ((Benatuil ve ark. (2010) Protein Eng Des Sel, 23, 155-9). Immobilize ligandlara (faj gösterimi) afinite bazlIZIbaglanma veya antijenlerle (maya gösterimi) manyetik partikül seçimleri veya etiketli-peptid-MHC antijenleri (maya gösterimi) ile floresan aktif hücre sßlamaslîdahil varyantlarI seçimi Için çesitli yöntemler kullanlEnlStlEl Katlanmlgl epitoplarEl tanlýhn TCR Vß'ye karsEl antikorlarI kullanllîhasüfloresan aktif hücre slßlamasEKFACS) veya manyetik boncuk seçimi, mevcut örnekte gelismis antikor baglanmasüile varyantlarlîlizole etmek için kullanUEwaktadIE 3) Hata egilimli kütüphanenin seçiminden izole edilen scTCR klonlarÇItermal stabilite için degerlendirilmektedir ve bir stabilize degiskeni, afinite maturasyonu Için seçilmektedir sekanslanmaktadEI Tipik olarak, maya üzerinde artlîllüilgyüzey seviyelerine ve çözeltide daha büyük stabiliteye katkßaglayan tek bölgeli mutasyonlar tanmlanmaktadlü 4) Stabilize scTCR sekanslarElgenellikle CDRla, CDR30., CDR3ß'de CDR kütüphanelerinin üretimi için bir kalül olarak kullanilâbilmektedir, ancak CDRlß, CDRZa, CDR2ß, ve HV4'ü kapsayan ancak bunlarla sIlEllüilmayan diger bölgeler aynüamanda kullanilâbilmektedir. Mevcut bulusta, maya gösterimli varyantlar, manyetik boncuk seleksiyonlarElve/veya floresan ile aktive olan hücre aylEIElEr (FACS) kullanarak CDR kütüphanelerinden, peptit:MHC'ye gelismis baglanma için seçilmektedir, ancak faj gösterimi ile kaydlüna veya manyetik seleksiyonlar veya memeli gösterimi ile FACS'Ekapsayan ancak bunlarla sIlBlEI olmayan diger yöntemleri kullanan seleksiyonlar kullanilâbilmektedir. ) CDR kütüphanelerinin seleksiyonundan izole edilen scTCR kIonIarÇlbuna karslîblarak islendikleri peptit:MHC'ye spesifik baglanma için degerlendirilmektedir. Plazmidler, maya kIonlarIdan kurtarllBiaktadlElve sekanslanmaktadlü 6) Afinitenin ek gelismelerinin gerekli olmaslîhalinde, adli 5'te seçilen scTCR klonu, CDRla, CDR3u, CDR3ß gibi mutasyonlarßeçmeyen diger döngülerde veya bölgelerde ek kütüphanelerin üretimi için bir kallîil olarak kullanüâbilmektedir ancak CDRlß, CDR2 (1, CDRZB, ve HV4'ü kapsayan ancak bunlarla sIIEIIIZbImayan diger bölgeler aynlîzamanda kullan ilâbilmektedir. Bu adlar her birine ait örnekler ayri& asagi açlElanmaktadlE ÖRNEK 2 TAX:HLA.A2 ILE KOMPLEKSTE, Vu2'YI KULLANAN, INSAN TCR A6'NIN ANALIZI TCRIerin tümü, benzer bir IG-katÜ/e kenetlenme aç-Ekullanmaktadlîlve pepMHC'nin TCR tanIiasüCDR döngüleri üzerinde spesiûk kallEtlEr ile tamamen aracliIlZl edilmektedir (Garcia ve ark. (2009) Nat Immunol, 10, 143-7; Marrack ve ark. (2008) Annu Rev Immunol, 26, 171- 203; Rudolph ve ark. (2006) Annu Rev Immunol, 24, 419-66)). WT1 TCRIer içi kristal yapllârül, mevcut bulus sßsia kullanElâbilir olmamaleb ragmen, WT1 P22 TCR'nin aynlZI Vu2 alanIla kullanllân A6:Tax peptitzHLA-AZ kompleksinin (PDB: 1AO7) yapEEllGarboczi ve ark. (1996) Nature, 384, 134-141) gösterilmektedir. Kompleksin yandan görünümü, altlIDR içeren degisken alanlarI uçlarIlEl, peptit Tax (Sekil 2A) üzerine yerlestirilmis olan baglanma bölgesinin merkezi bölgesi olan Tax:HLA.A2 molekülüne kentlendigini göstermistir. Kristal yapEbabit bölge ((1) içermemektedir, ancak sabit bölgeler tam uzunluktaki yapMletabilize etmeye yard IicüilmaktadEl YukarlEIh aç[lZIanan adli 2'de seçilen stabilize edici mutasyonlar, genellikle Va/Vß arayüzü veya Car/Va veya Cß/Vß arayüzünün baglantüârII tam uzunlukta TCR'de gerçeklestigi çerçeve bölgelerinde seçilmektedir. AItEI CDR bölgesi dlgüba, "giderilmis" TCR ile, Tax:HLA-A2'nin üstten görünümü gösterilmektedir (Sekil 28). Bu görünüm, TCR'nIn, simdi tüm TCR:peptIt-MHC yapllârlîlçin gözlemlenen bir bulgu olan peptit-MHC'ye çapraz bir konum kullandlgTIEgöstermektedir. Bu yönelimde, iki CDR3 döngüsü, peptit üzerine yerlestirilirken, CDRl ve CDR2 döngülerinden baskI olarak MHC molekülünün helisleri ile etkilesime giren çesitli kallEtllâr bulunmaktadlEl AdIilar 4 ve 6'daki afinite maturasyon amaçlarEliçin, bu döngüler, diger bölgeler de kullanllâbilmesine ragmen, çogunlukla afinite mutasyon kütüphanelerinin üretilmesi için hedeflenmistir. ÖRNEK 3 WT1 TCRIerIn MAYA GÖSTERIMI Gelismis stabilite (adl 2) veya gelismis afinite (adli 5) için seleksiyonlarI gerçeklestirilmesi amacüla, TCR mutantlarII bir kütüphanesinin, leâisMa bir konformasyon epitopu veya bir peptit:MHC IigandEtanlýlan bir antikora baglanmasüçin taranabildigi bir gösterim sisteminin kullanllîhaslîgerekmektedir. Üç gösterim sistemi, yüksek afinite için TCRIerin islenmesi için kullanHIhaktadlElve bu proses için kullanllâbilmektedir: maya gösterimi, faj gösterimi, ve T hücresi (memeli hücresi) gösterimi. Ribozom, RNA, DNA ve CUS gösterimi gibi, alternatif gösterim yöntemleri aynüamanca bu proses için uygun olabilmektedir. Tüm bu durumlarda, antijen için düsük afiniye sahip yaban tip TCR, sisteme klonlanmlStElve peptit:MHC IigandlEh karslîgelismis stabilite ve afinite ile TCRIerin islenmesi için bir kallü olarak kullanUBTlgtlÜ Bu sistemlerden herhangi biri, bir tek TCR'nin kütüphaneler için bir kallül olarak kullanI[gEl burada açllZlanan yaklasIia ve artlElIIhE baglanma özelliklerine sahip TCRlerin seleksiyonuna uygulanabilmektedir. Mevcut örnekte, maya gösterimi, platform olarak kullanilB1lîstE(Sekil 4). WT1 TCR, hata egilimli mutajenez aracHJgllýla mutasyonlarI stabilize edilmesi için kallfil olarak kullanilBTlgtlEl ve seleksiyonlardan izole edilen stabilize klonlar afinite maturasyonu için kallglar olarak kullanllîhlstß m BIR STABILIZE WT1 TCR, WT1-D13'ÜN HATA EGILIMLI KÜTÜPHANE YAPIMI VE SELEKSIYONU WT1 hata egilimli kütüphane, bir kallîil olarak P22 olarak adlandlEllân WT1-aktif hücre çizgisi kullanan önceden açlKIanan sekilde (Richman ve ark. (2009) Methods Mol Biol 504, 323-350) üretilmistir. Insan WT1 hata egilimli scTCR kütüphanesi, linearize pCT302 vektörü, WT1 hata egilimli PCR ürünü ve kompetent EBY100 maya hücrelerini birlestirerek maya gösterim vektörüne uygulanmlStIE YaklaslEl 2.3 X 107 bagislîl klon barIlBan sonuçta olusan kütüphane, elektroporasyondan sonra mayanI sIlEIllIskeyreltme alikuotlarII kalliîlanmasljle degerlendirilmistir. Kütüphane, Tablo 1'e göre FACS aracHJgllýla, insan hVß3, anti-hVß3.1 FITC IgG (Thermo Scientific) ve anti-hVß3 FITC IgM'yi (Beckman Coulter) tanlýlan iki antikora baglanmasüçin seçilmistir. Tablo 1. Ayüna Kosullarlîl Aylîhia Kosullar 1 Thermo Scientific hVß3.1 FITC (1:10); AIexaFIuor® 647 Keçi anti-fare IgG (1:100) VE Beckman Coulter hVß3 FITC IgM (1: 10); Keçi anti-fare IgM APC (1:4) 2 Thermo Scientific hVß3.1 FITC (1:10); AlexaFluor 647® Keçi anti-fare IgG (1:100) VE Beckman Coulter hVß3 FITC IgM (1:10); Keçi anti-fare IgM APC (1:4) 3 Thermo Scientific hVß3.1 FITC (1:10); AlexaFluor® 647 Keçi anti-fare IgG (1:100) VE Beckman Coulter hVß3 FITC IgM (1:10); Keçi anti-fare IgM APC (1:4) Termal denatürasyon çallginalarlîlkullanarak, bu antikorlar. Vß3 üzerinde katlanmlglepitoplarlîl tanIIlg] taniladlKl (veriler gösterilmemistir). Sinyaller, AIexaFIu0r® 647 Goat anti-fare IgG (Life Technologies) ve Keçi anti-fare IgM APC (Invitrogen) ikincil antikorlar kullanilarak kuvvetlendirilmistir. 3 yinelemeli ayrIi süslâtla, bir Vß3-pozitif olarak boyama popülasyonu olusmustur (Sekil 5A). 3'üncü ayrlEltakiben, WT1-D13 olarak adlandlElân bir klon, gelismis Vß3 floresanlîliçin izole edilmistir (Sekil SB) ve 80 °C'ye _[glEUa termal stabilite göstermistir (veriler gösterilmemistir). WT1-D13 klonu, afinite maturasyonu için bir kalü olarak kullanilBilStB ÖRNEK 5 CDRla KÜTÜPHANESI YAPIMI VE WT1:HLA.A2, WT1.1'E ARTIRILMIS BAGLANMA ILE BIR WT1 TCR'NIN SELEKSIYONU Hata egilimli PCR kütüphanelerinin seleksiyonundan izole edilen stabilize WT1-D13, örtüsme ekstansiyonu (SOE) ile uçbirlestirme araciligilýla 4 bitisik kallEtlýükateden bir CDRla kütüphanesinin üretimi için bir kalip] olarak kullanllhilglü (Horton ve ark. (1990) Biotechniques, 8, 528-535). Insan WT1-D13 CDRla scTCR kütüphanesi böylelikle, Iinearize pCT302 vektörünü, WT1-D13 CDRla kütüphanesi PCR ürününü ve kompetent EBY100 maya hücrelerinin birlestirilmesi ile maya gösterim vektörüne uygulanmlgtlü YaklaslEl 3.1 X 106 baglislîl klon barlEtlEn sonuçta olusan kütüphane, elektroporasyondan sonra mayanI sIlEllElseyreltme alikuotlarII kallîilanmasElile degerlendirilmistir. WT1-D13 CDRla, WT1 (RMFPNAPYL, SEKANS KIMLIK NUMARASI:6)/HLA.A2/Ig dimerlerine (BD DimerX) baglanmasEl için Tablo 2'de gösterilene göre FACS ile ayrllüilgtlü Tablo 2. AylElna Kosullarü AylIina Kosullar 1 100 nM WT1:HLA.A2 dimer APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor (1:100) 2 100 nM WT1:HLA.A2 dimer APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor (1:100) 3 100 nM WT1:HLA.A2 dimer APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor (1:100) 4 100 nM WT1:HLA.A2 dimer APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor (1:100) 200 nM WT1:HLA.A2 dimer APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor (1:100) WT1 (RMFPNAPYL, SEKANS KIMLIK NUMARASI:6)/HLA-A2/Ig dimerler ile FACS tarafIan seleksiyonun bes turundan sonra, az miktarda pozitif bir sekilde boyama popülasyonu olusmaya baslamlgtlîl(Sekil 6A). 5'inci ayrIiEtakiben izole edilen, klon WT1-D13.1, WT1 (RMFPNAPYL, SEKANS KIMLIK NUMARASI:6)/HLA.A2'ye az miktarda bir baglanma gelisimi göstermistir ve ek afinite maturasyonu için bir kalü olarak kullanilIhlStlEl(SekiI GB). ÖRNEK 6 CDR3 KÜTÜPHANESI YAPIMI VE WT1:HLA.A2, WT1.1.1'E DAHA DA ARTIRILMIS BAGLANMA ILE BIR WT1 TCR'NIN SELEKSIYONU WT1 scTCR'nin afinitesinin daha da gelistirilmesi amaclýla, CDR3 kütüphaneleri, bir kallpl olarak WT1-D13 CDRloi kütüphanesinden izole edilen WT1-D13.1 klonu kullanüârak üretilmistir. WT1-D13.1 CDR3 kütüphaneleri, bir seferde her bir CDR3'te 5 bitisik kodonu kateden kodonlarElsoysuzIastün örtüsme ekstensiyonu (SOE) PCR ile uçbirlestirmeyle üretilmistir (CDR3ß döngüsünde 2 kütüphane; CDR3u kütüphanesinde 2). Her WT1-D13.1 CDR3 kütüphanesi böylelikle, Iinearize pCI' 302 vektörünü, WT1-D13.1 CDR3 PCR ürünü (yani CDR3u1, CDR3a2, CDR3ß1, veya CDR3ß2 kütüphanesi), ve kompetent EBY100 maya hücrelerinin birlestirilmesi ile maya gösterim vektörüne uygulanmlîstß Dört sonuçta olusan kütüphane havuzlanmEtlEl ve sonuçta olusan birlestirilmis kütüphane, elektroporasyondan sonra sIlEIlElseyreItme alikuotlarII kaplanmasElile saptandlîgllîlüzere yaklasllZl 3.5 X 106 bagIislZl klon barIlElnlgtlEl WT1-D13 CDR3 birlestirilmis kütüphaneleri, WT1 (RMFPNAPYL, SEKANS KIMLIK NUMARASI:6)/HLA.A2/Ig dimerlerine (BD DimerX) baglanma için Tablo 3'teki çizelgeye göre FACS ile ayrilßîlgtß Tablo 3. Aylîrlna KosullarEl Aylîrna Kosullar 1 100 nM WT1:HLA.A2 dimer APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor (1:100) 2 100 nM WT1:HLA.A2 dimer APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor (1:100) 3 10 nM WT1:HLA.A2 dimer APC-konjuge keçi anti-fare ikincil antikor (1:100) WT1 (RMFPNAPYL, SEKANS KIMLIK NUMARASI:8)/HLA-A2/Ig dimerler ile FACS tarafIan seleksiyonun üç turundan sonra, pozitif bir sekilde boyama popülasyonu olusmaya baslamlStlE (Sekil 7A). 3'üncü ayrlüiakiben izole edilen klon WT1-D13.1.1, WT1 (RMFPNAPYL, SEKANS KIMLIK NUMARASI:8)/HLA.A2'ye (Sekil 75) artßlüiIglbaglanmaslügiöstermistir. ÖRNEK 7 YÜKSEK AFINITELI WT1 TCR, WT1-D13.1.1'IN BAGLANMA ANALIZI CDR3 kütüphanelerinin seleksiyonlarian izole edilen WT1-D13.1.1 klonunun baglanmasII degerlendirilmesi amaciyla, WT1-D13.1.1'in maya gösterimi, WT1 (RMFPNAPYL, SEKANS KIMLIK NUMARASI:6)/HLA.A2 dimerler HLA-A2-Ig) ile titre edilmistir ve monomerler ECo//den eksprese edilmistir ve saflastlîllîhgtlü WT-1/A2 dimerleri, 160 pM ila 500 nM'de (Sekil 8A) tahlil edilmistir ve monomerler 6.4 nM ila 4 LiM'de (Sekil BB) tahlil edilmistir. Maya hücreleri sonrasIa ylEbnmlgtE ve akE sitometrisi ile analiz edilmistir. Ortalama floresan leIig]ü(MFI), WT-1/HLA-A2 kompleksinin konsantrasyonuna karsElher bir histogram için çizilmistir. Degerler, lineer olmayan regresyo analizi kullanilârak normallestirilmistir ve 25 nM ve 240 nM'Iik Kuapp degerleri, leislîLla dimer ve monomer için saptanmlStlEI(Sekil 8C ve 8D). Bu yüzden WT1-D13.1.1 nanomolar afinite sergilemistir. ÖRNEK 8 ÇÖZÜNÜR YÜKSEK AFINITELI WT1 TCR, WT1-Dl3.1.1'IN BAGLANMA ANALIZI Yüksek afinite ile WT1/HLA-A2'ye spesifik olarak baglüblan WT1-D13.1.1 scTv'nin ek olarak gösterilmesi için, WT1-D13.1.1 scTv'nin bir çözünür formu, E. co/i'inklüzyon vücutlarEUan eksprese edilmistir ve yeniden katlanmlgtlEI ve bir C teriminali BirA etiketi aracUJEMa biyotinlenmistir (Aggen ve ark. (2011) Protein Engineering, Design, & Selection, 24, 361-72; Zhang ve ark. (2007) J Exp Med, 204, 49-55). Insan hücresi çizgisi T2 (HLA-A2+), 1 ;M Tax, MART-1, veya WT1 peptitleri inkübe edilmistir ve ylElanmlgtlEl Biyotinlenmis WT1-D13.1.1 scTv, peptit (Sekil 9A) ile veya negatif peptit Tax (4 nM ila 1 iiM) (Sekil 98) ile, bos peptit MART-1 (4 NM ila 1 uM) (Sekil 9C), WT1 (4 nM ila 1 uM) (Sekil 9D) ile önceden yüklenmis T2 hücreleri üzerinde titre edilmistir. Hücreler yiElanmIgtlîlve SA-PE ile inkübe edilmistir ve aklgl sitometrisi ile analiz edilmistir. Yalnlîta WT1 peptidi ile yüklenen hücreler, çözünür TCR'nin WT1 için spesifik oldugunu gösteren WT1-D13.1.1 TCR'ye (Sekil 9A-D) baglanmlgtlîl WT1 titrasyonun MFI'ya karsElTCR konsantrasyonunun grafigine ait lineer olmayan regresyon, çözünür TCR'nin 260 nM'lik bir minimum KD degeri sergiledigini göstermistir (Sekil 9E). ÖRNEK 9 WT1 ANTIJENINE KARSI GELISMIS AFINITE IÇIN IZOLE TCRLERIN SEKANS ANALIZI WT1-spesifik (P22, D13, D13.1, D13.0.1 ve D13.1.1) tek Zincirli TCRlerin sekanslarüizole plazmidlerden saptanmlgtlîl ve Sekil 1'de gösterilmistir. P22, 013, D13.1, D13.0.1 ve D13.1.1'in Vß zincirinin amino asit sekansüsüslýla, SEKANS KIMLIK NUMARALARI: 1, 21, 21, 3 ve 3'te belirtilmektedir ve P22, D13, D13.1, D13.0.1 ve D13.1.1'in Va zincirinin amino asit sekanslarüslüslsîla, SEKANS KIMLIK NUMARALARI: 2, 22, 4, 2, ve 4'te belirtilmektedir. D13.0.1'in CDRloi mutasyonlarII olgunlasmlgl son afinite scTCR D13.1.1'den (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) çkhrüüwaslýla yapI[g]EbeIirtilmelidir. Sekil 1'deki aItIZd;iziIi amino asit konumlarÇl mutasyonlarI stabilize edilmesi için hata egilimli seleksiyonlardan kaynaklanan mutasyonlarübelirtmektedir. Kutulardaki amino asit konumlarü CDR kütüphanelerinden seçilmis afinite artlEna mutasyonlarlügöstermektedir. ÖRNEK 10 CD8 VE CD4 T HÜCRELERINDE WT1-P22, WT1-D13.1, WT1-D13.0.1 VE WT1-DI3.1.1 TCRlerin IN VITRO ETKINLIGI T hücrelerinde farklÜNTl-spesifik TCRlerin etkinliginin degerlendirilmesi için CD8 (Sekil 10A) ve CD4 (Sekil 108) T hücreleri, AAD transjenik farelerinden izole edilmistir (HLA-A2'nin (7.1 ve (12 alanlarIen ve fare Db'nin (13 alanian olusan bir hibrit sI[ElI genine sahip olan fareler bulunmaktadE bu AAD fareleri Jackson Laboratories'den bulunabilmektedir). Hücreler, anti- CD3 ve anti-CD28 antikorlarüle birlestirilmis boncuklarla aktive edilmistir ve daha sonra WT1- P22, WT1-D13.1, WT1-D13.0.1 ve WT1-D13.1.1 TCR'ler ile Chervin ve ark, (2013) Gene Ther. 20(6):634-44 eserinde açllZlanan sekilde transdükte edilmistir (sekanslar D13 stabilize edici mutasyonlar, Vß F485 ve D51G barlEUülnamlStlE). T hücreleri, AAD farelerinden splenik hücrelerin Concanavilin A uyarIilarEile hazlEllanan peptit WT1 ve AAD blast hücrelerinin farklEI konsantrasyonlarlîlle inkübe edilmistir. 24 saatlik inkübasyondan sonra, süpernatanlar, bir ELISA kullanilârak IFN-y konsantrasyonu için analiz edilmistir. CD8 T hücreleri, D13.0.1 ve D13.1.1 TCRler (Sekil 10A) ile en büyük etkinligi göstermistir. CD4 T hücreleri, sadece D13.1.1 TCR ile aktive edilmistir bu, D13.1.1'in, CD8'den bagIislîl olarak aktiviteye aracHJK] edebilecegini göstermistir (Sekil 108). MARTI gibi diger HLA-A2 baglanma peptitleri ile hiç reaktivite gözlemlenmemistir. ÖRNEK 11 CD8 T HÜCRELERINDE WT1-D13.1.1 TCR, WT1'E YAPISAL OLARAK BENZER OLAN INSAN PEPTITLER ILE REAKTIF DEGILDIR Yüksek afiniteli WT1-D13.1.1 TCR'nin özgüllügünün saptanmaslZlçin, WT1 peptide yaplgl olarak benzer peptitler ile in vitro etkinlik degerlendirilmistir. WT1'in 9 kalim-a korunmus mutasyonlara dayanarak yaplgal olarak WT1 peptidine benzer olan peptidler için bir proteom arastlîrlnaslîlgerçeklestirilmistir. Insan proteomda bulunan peptitler sonraleUa, tahmin algoritmalarEtaraclEgllsîla HLA-A2'ye baglanma yetenegi için degerlendirilmistir. En yüksek afiniteye sahip HLA-A2'ye baglandlgilîtahmin edilen on peptit (Sekil 11), sentezlenmistir ve yüksek afiniteli WT1-D13.1.1 TCR ile kallEI aktaran etkinlestirilmis CD8 T hücrelerine yetenekleri için test edilmistir. Bu peptitlerden hiç biri etkinlik göstermemistir, bu TCR'nin bu yaplîbl olarak benzer peptit ile sunuldugunda özgüllügünü sürdürdügünü önermektedir. ÖRNEK 12 WT1, WT1-D13.1 VE WT1-D13.1.1 TCRlerin TERAPÖTIK FORMATLARI Yüksel afiniteli TCRlerin, ilgili antijenini eksprese eden hücreleri hedeflemeye yönelik çesitli formatlarda kullanllâbilecegi simdi iyi bilinmektedir. Bu yüzden, yukarüh gösterilen islenme stratejilerden üretilen TCRlerin, Sekil 12'de gösterildigi üzere, ya çözünür formda ya da adoptif T hücresi terapileri için TCR gen terapisinde kullan [lâbildigi açlthlEl Malzemeler ve yöntemler Antikorlar. peptit:HLA-A2. MACS, ve AklilSitometrisi Reaktifleri Maya yüzey ekspresyonunu tespit etmek üzere kullanllân antikorlar sunlarEkapsamaktadlE anti-HA epitop etiketi (Klon HA.11; Covance), anti-hVß3 FITC antikor (klon CH92; Beckman- Coulter), anti-hVß3.1 FITC antikor (Klon 8F10; Thermo Scientific), anti-hVßZO antikor (Klon ELL1.4; Beckman-Coulter), bizim laboratuvarIllîtla üretilen anti-VaZ monoklonal antikor (veriler gösterilmemistir), Keçi-anti-fare IgM APC (Life Technologies), Keçi-anti-fare IgG F(ab')2 AIexaFlu0r® 647 ikincil antikor (Invitrogen), Streptavidin-fikoeritrin (SA:PE, BD Pharmingen), ve MACS mikroboncuklar (Miltenyl Biotec). HLA-A2'ye [WT1126-134: RMFPNAPYL (SEKANS KIMLIK NUMARASI:6) baglanan peptitler, Penn State University College of Medicine (Hershey, PA, ABD) üniversitesinde Makromoleküler Çekirdek Tesisinde standart F-moc (N-(9-florenil)metoksikarb0nil) kimyasEile sentezlenmistir. FACS ve aklgl sitometrisi analizi için, rekombinant çözünür dimerik HLA-A2:lg füzyon proteini (BDTM DimerX) kullanllßîlStE Ek olarak, UV @ED/arlgülja baska bir HLA.A2-sIlIlllIibeptit için bir UV-parçalanabilir peptidin degisimi ile üretilen monomerik HLA.A2-biyotin reaktifi, aklgl sitometrisi ve MACS seleksiyonlarEiçin kullanilB1lgtlE(Rodenko ve ark. (2006) Nat Protoc, 1, 1120-1132; Toebes ve ark. (2006) Nat Med, 12, 246-251). Mava ciösterim vektörlerinde scTv'nin klonlanmaslîxle ekspresyonu TCR degisken bölge fragmentler (scTv), Trp ortamIia büyümeye olanak saglayan bir galaktoz ile indüklenebilir AGA2 füzyonunu barlEtllEin, maya gösterim plazmidi pCT302'de (Vß-L-Va) (Boder ancl Wittrup (2000) Methods Enzymol, 328, 430-444) eksprese edilmistir. scTv geninin indüksiyonu, seleksiyon ortamia sabit faza dönüstürülmüs EBY100 maya hücrelerinin büyümesini bunu takiben galaktoz barlüdlgn ortama aktarIiEkapsamaktadlü Kalli] WT1 tek zincirli TCR geni, yapII VaZ-alanIa (Aggen ve ark. (2011) Protein Eng Des Sel, 24, 361-372) bir F49S mutasyonu ile Genscript (Piscataway, NJ, ABD) tarafIan sentezlenmistir. WT1-spesifik TCR genleri, CT L genlerinden izole edilmistir (Phillip Greenberg; örn. Dossett ve ark. (2009) Mol Ther. 17(4), 742 taraflian WTl'e karsÜ'CR genleri) ve genler, Genscript ile sentezlenmistir, bir tek zincirli format (VB-baglantilâylEB/a) olarak klonlanmlgtlîl mayanI yüzeyi üzerinde ekspresyon için bir maya gösterim vektörüne uygulanmlStE Degiskenden olusan scTvler, baglantüâyEllarafIan eklenen bölge GSADDAKKDAAKKDGKS'yi (SEKANS KIMLIK NUMARASI:8) bariiiiîiinaktadiE(Hoo ve ark. (1992) Proc Natl Acad Sci ABD, 89, 4759-4763; Weber ve ark. (2005) Proc Natl Acad Sci ABD, 102, 19033-19038; Aggen ve ark. (2011) Protein Eng Des Sel, 24, 361-372). scTv, pCT302'nin Nhel ve Xhol sIIEllama bölgelerine uygulanmlgtß Mutasvona ugramlîlscTv mava ciösterim kütüphanelerinin üretimi, ciösterimi ve seleksivonu Hata egilimli PCR, önceden açllZJandlglEl üzere rasgele mutasyonlarI üretilmesi için kullanilîhlgtWRichman ve ark. (2009) Mol Immunol, 46, 902-916). CDR1 ve 3 kütüphaneler, bir seferde örtüsme ekstensiyon (SOE) PCR kateden 4-5 bitisik kodonlar ile Uçbirlestirme kullanilârak üretilmistir (Horton ve ark. (1990) Biotechniques, 8, 528-535). WT1-D13 CDR10L kütüphanesi için, pre-SOE PCR ürünleri, asaglöhki primer çiftleri kullanüârak üretilmistir: 5' - GGC AGC CCC ATA AAC ACA CAG TAT -3' (Birlesme Yeri 4L) (SEKANS KIMLIK NUMARASI:9) ve 5' - ACG ATC GCT ATA GGT GCA GTI' CAA TGA TGC AAT AGC ACC TI'C CGG GAC ACT TAA TGG GCC GCT - 3'(SEKANS KIMLIK NUMARASI:10), ve 5' - ATI' GCA TCA 'I'I'G AAC TGC ACC TAT AGC GAT CGT NNS NNS NNS NNS 'I'I'C 'I'I'I' TGG TAT AGA CAG TAC AGT GGC AAA TCC CCG - 3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:11) ve 5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG -3' (T7) (SEKANS KIMLIK NUMARASI:12). SOE PCR, hem T7 hem de Birlesme Yeri 4L ile birlikte her bir ilgili Pre-SOE ile gerçeklestirilmistir. WT1-D13.1 CDR3 kütüphaneleri için, pre-SOE PCR ürünleri, asaglki primer çiftlerini kullanan dört kütüphanelerin her biri için üretilmistir: ßl: 5'-GGC AGC CCC ATA AAC ACA CAG TAT -3' (Birlesme Yeri 4L) (SEKANS KIMLIK NUMARASI:9). ve 5'-TGC ACA CAG GTA CAT GGA AGT TTG ATT GGT ACT AGC GCT TrC CAG AAT CAA ACT GAA ACG TTC TiT - 3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 13), ve 5' - AGT ACC AAT CAA ACT TCC ATG TAC CTG TGT GCA NNS NNS NNS NNS NNS GAA CAG TTT TTC GGC CCA GGT ACA AGA TTA ACG GTG - 3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:14) ve 5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG -3' (T7) (SEKANS KIMLIK NUMARASI:12); [32: Birlesme Yeri 4L (SEKANS KIMLIK NUMARASI:9) ve 5' - TGC ACA CAG GTA CAT GGA AGT TrG ATT GGT ACT AGC GCT TTC CAG AAT CAA ACT GAA ACG TTC TiT - 3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:15), ve 5' - AGT ACC AAT CAA ACT TCC ATG TAC CTG TGT GCA AGC AGT TCC ATC NNS NNS NNS NNS NNS GGC CCA GGT ACA AGA TrA ACG GTG - 3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:16) ve T7 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:12); (11: Birlesme Yeri 4L (SEKANS KIMLIK NUMARASI:9) ve 5' - GGC GCA CAG GTA AGT GGC GCT ATC TGA CGG 'I'I'G GCT ATC ACG GAT TAA CAG AGA GAC ATA CTG GGA - 3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:17), ve 5' - CAA CCG TCA GAT AGC GCC ACT TAC CTG TGC GCC NNS NNS NNS NNS NNS AAT ATG CTG ACC TTC GGT GGC GGT ACT CGC TTA ATG - 3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:18) ve T7 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:12); (12: Birlesme Yeri 4L (SEKANS KIMLIK NUMARASI:9) ve 5' - GGC GCA CAG GTA AGT GGC GCT ATC TGA CGG TTG GCT ATC ACG GAT TAA CAG AGA GAC ATA CTG GGA - 3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:19), ve 5' - CAA CCG TCA GAT AGC GCC ACT TAC CTG TGC GCC GCG AAT AAC GCG NNS NNS NNS NNS NNS 'I'I'C GGT GGC GGT ACT CGC 'I'I'A ATG - 3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:20) ve T7 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:12). Maya kütüphaneleri, Nhel ve Xhol parçalanmlsîlpCT 302 ile birlikte hata egilimli veya SOE PCR ürünlerinin elektroporasyonu ile EBY100 mayada homolog rekombinasyon ile üretilmistir (Horton ve ark. (1990) Biotechniques, 8, 528-535). Kütüphaneler, 48 saat boyunca galaktoz içeren ortamlarda (SG-CAA) indüklenmistir, 1 mL'Iik %1 oranIa PBS/BSA ile yllZianmlStEve Sekil 4A, 5A, 6A, 8A ve 9A'da belirtilen konsantrasyonlarda antikorlar veya peptitzMHC reaktifleriyle boyanmlgtlEHücreler y[lZlanm lgtlB(1 ml, %1 PBS/BSA) ve en floresan hücreler bir FACS Aria (BD Bioscience) yüksek hlîlElaylElEEl/eya QuadroMACSTM AylElElXMiltenyl Biotec) üzerindeki MACS LS kolonlarEkuIlanllârak seçilmistir. Izole edilmis klonlarI termal stabilitesini test etmek için maya, boyama protokolünden önce 30 dakika boyunca yüksek lelaklltha inkübe edilmistir (veriler gösterilmemistir). Yüksek afiniteli klonlarI izolasyonu ve bovamasEl Seleksiyonlarl] takiben, kütüphane klonlarlZl sIEIbyIEEl seyreltilerin kaplanmasElile Izole edilmistir. Koloniler genisletilmis ve galaktoz barißn ortamda (SG-CAA) 48 saat boyunca indüklenmistir, 1 mL'Iik %1 PBS/BSA ile ylKbnmlgtlE] ve çesitli konsantrasyonlarda peptit/HLA.A2 DimerX, keçi-antI-fare IgG F (ab')2 AlexaFIuor® 647 ikincil antikor veya çesitli konsatrasyonlarda UV-degisimli peptit/HLA.A2, SA-PE ile boyanmlstlB Hücreler ylElanmlSIEü ml, %1 PBS/BSA) ve bir Accuri C6 akglsitometresi üzerinde analiz edilmistir. Plazmidler, ZymoprepTM Yeast Plasmid Miniprep II (Zymo Research) kullanllârak geri kazanlliwlgtlîl ve Subcloning EfficiencyTM DH50iTM Kompetent Hücrelere (Invitrogen) Egoku dönüsümü araclIJgilîla E. coli'ye geri uygulanmlStE E. coli hücreleri genislemistir ve plazmidler QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) kullanHârak izole edilmistir. AyrEklonlarI sekanslarESanger sekanslama ile saptanmlgtE VARYASYONLARA ILISKIN AÇIKLAMALAR Tarifnamede bahsedilen tüm patentler ve yayIar, bulusun ait oldugu teknikte uzman kisilerin uzmanllglll seviyesinin göstergesidir. Bir Markush grubu veya diger gruplandüna burada kullanIIgiIa, gruba ait tüm ayrü elemanlar ve gruba ait tüm kombinasyonlar ve olasElalt kombinasyonlarlEl bulusa ayrDayrIZI dahil edilmesi amaçlanmaktadlü "Içermektedir", veya "içeren" terimlerinin, burada kullan-[glütla, belirtilen özelliklerin, tamsayllârlEl, adlilarI veya bilesenlerin varllglllîifade etmesi için kullanllfhaktadlüfakat bir veya daha fazla diger özelligin, tamsayIlEl, adIiIEl, bilesenin veya bunlarlEl gruplarII varllglElElveya ilavesini dEiarda bßakmamaktadlü Bulusun ayrEIyapllândülnalarII aynEl zamanda kapsanmasljmaçlanmaktadiElburada "içeren" veya "içermektedir" terimleri, zorunlu olarak es süreli olmayan ek yapHândünalarI böylece açlKIanmasEliçin opsiyonel olarak, gramer olarak analog olan terimler ile, örnegin "-den olusan/olusmaktadlE'l' veya "esas olarak -den olusan/esas olarak -den olusmaktadlE'i' ile yer degistirebilmektedir. AçllZlIKl amaclýla, burada kullanliglîl haliyle "içeren", "sahip olan", "kapsayan", "barIEin" veya ile karakterize edilen" ile es anlamlIlB ve kapsaylEEl/eya aç[lZ] uçludur ve ek, bahsedilmeyen elemanlarlJIeya yöntem adIiIIarEhariç tutmamaktadß Burada kullanIlgilZhaliyle, "-den olusan", istem elemanIda belirtilmeyen herhangi bir elemanÇladÇl bileseni veya içerigi hariç tutmaktadlB Burada kullanIlgllZilialiyle, "-den esas olarak olusan", istemin temel ve yeni karakteristiklerini bariz bir sekilde etkilemeyen (örnegin bir aktif içerigi etkilemeyen) malzemeleri veya adnlarEhariç tutmamaktadlEI Buradaki her bir durumda, "içeren", "-den esas olarak olusan" ve "-den olusan" terimlerinin herhangi biri diger iki terimden biri ile yer degistirebilmektedir. Burada örnek olarak uygun sekilde açiklanan bulus, herhangi bir eleman veya elemanlar yoklugunda, burada spesifik olarak açllZlanmayan sIlElhma veya sIlEliamaIarla uygulanabilmektedir. Bulus, çesitli spesifik ve tercih edilen yapllândlElnalardan ve tekniklerden hareketle açlKIanmaktadlEI Bununla birlikte, birçok varyasyonun ve modifikasyonun gerçeklestirilebilecegi anlaslIBiaIIlE Burada spesifik olarak aç[lZlananIar dlSIEUaki bilesimlerin, yöntemlerin, cihazlarlEl, cihaz elemanlarlEllEl, malzemelerin, opsiyonel özelliklerin, prosedürlerin ve tekniklerin, gereksiz deneye basvurmadan burada kapsamlßlarak açllîlanan sekilde bulusun pratigine uygulanabildigi teknikte uzman kisice takdir edilecektir. Burada aç[EIanan bilesimlerin, yöntemlerin, cihazlarlEl, cihaz elemanlarlEllEl, malzemelerin, prosedürlerin ve tekniklerin tüm teknikte bilinen fonksiyonel esdegerler; ve bunlar. bölümlerinin; bu bulus taraflEUan kaçlîimaslîlamaçlanmaktadlü Ne zaman bir arallE açlKIanlE'ka, tüm alt aralllZlar ve bireysel degerler kapsam dahilindedir. Bu bulus, sekillerde gösterilenler veya tarifnamede örneklenenler dahil olmak üzere, örnekleme veya açiKlama yoluyla verilen ve sIlIliama olmaks- açilZlanan yapilândlîiinalar ile sIlEliEtlegildir. Burada sunulan bazElreferanslar, ek baslanglgl malzemeleri, ek sentez yöntemleri ve ek analiz yöntemleri ve bulusun ilave kullanIllarElliakklElda ayrlEtllDJbilgi saglamaktadlE Teknikte uzman kisi, mevcut bulusun bulus konularIEgerçeklestirmek üzere ve bahsedilen amaçlari ve avantajlar. yanlis& burada kendinden bulunanlar. elde edilmesi için iyi uyarlandigJIElkolayllEla anlayacaktB Tercih edilen yapllândlünalarl simdi temsili olarak burada açiElanan bilesimler ve yöntemler ve yardlcüyöntemler örnekleyicidir. Buradaki degisiklikler ve diger kullannlar teknikte uzman kisilerce anlasllâcaktlü TR TR TR
TR2019/08404T 2013-11-22 2014-11-21 İşlenmiş yüksek afinite insan t hücresi reseptörleri. TR201908404T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361907887P 2013-11-22 2013-11-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201908404T4 true TR201908404T4 (tr) 2019-07-22

Family

ID=53180203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2019/08404T TR201908404T4 (tr) 2013-11-22 2014-11-21 İşlenmiş yüksek afinite insan t hücresi reseptörleri.

Country Status (20)

Country Link
US (4) US10344075B2 (tr)
EP (2) EP3071594A4 (tr)
JP (4) JP6476182B2 (tr)
KR (2) KR20160085345A (tr)
CN (2) CN105873945B (tr)
AU (4) AU2014352826B2 (tr)
BR (1) BR112016011567A2 (tr)
CA (2) CA2930847A1 (tr)
DK (1) DK3071593T3 (tr)
ES (1) ES2729406T3 (tr)
IL (2) IL245468B (tr)
MX (3) MX383471B (tr)
PL (1) PL3071593T3 (tr)
PT (1) PT3071593T (tr)
RU (2) RU2740648C2 (tr)
SA (1) SA516371174B1 (tr)
SG (2) SG10201804335QA (tr)
TR (1) TR201908404T4 (tr)
WO (2) WO2015077615A1 (tr)
ZA (2) ZA201603116B (tr)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2900087C (en) 2005-10-17 2024-02-13 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Wt1 hla class ii-binding peptides and compositions and methods comprising same
PL2010209T3 (pl) 2006-04-10 2017-04-28 Sloan Kettering Inst For Cancer Res Immunogeniczne peptydy WT-1 i sposoby ich użycia
HK1204261A1 (en) 2012-01-13 2015-11-13 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenic wt-1 peptides and methods of use thereof
US10815273B2 (en) 2013-01-15 2020-10-27 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenic WT-1 peptides and methods of use thereof
ES2832546T3 (es) 2013-01-15 2021-06-10 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Péptidos WT-1 inmunogénicos y métodos de uso de los mismos
MX383471B (es) 2013-11-22 2025-03-14 Univ Illinois Receptores de células t humanas con alta afinidad modificados por medio de manipulación genética.
AU2016325384B2 (en) * 2015-09-22 2021-07-22 Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg A method for high level and stable gene transfer in lymphocytes
CN108290940B (zh) * 2015-10-01 2021-12-07 圣拉斐尔医院有限公司 Tcr及其用途
GB201520570D0 (en) * 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
EP3394092A1 (en) 2015-12-23 2018-10-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center High affinity t cell receptors and uses thereof
MA45491A (fr) * 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics Inc Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés
US11534461B2 (en) 2016-11-14 2022-12-27 Fred Hutchinson Cancer Center High affinity merkel cell polyomavirus T antigen-specific TCRS and uses thereof
EP3595708A4 (en) * 2017-03-15 2020-12-16 Fred Hutchinson Cancer Research Center HIGH AFFINITY MAGE-A1 SPECIFIC TCRS AND THEIR USES
EP3615565B1 (en) * 2017-04-24 2025-03-26 Ospedale San Raffaele S.r.l. Tcr and peptides
JP7181517B2 (ja) * 2018-01-23 2022-12-01 国立大学法人三重大学 Ｔ細胞レセプター
CN112739339B (zh) * 2018-07-23 2024-12-27 海德堡医药研究有限责任公司 抗cd137抗体药物缀合物(adc)在同种异体细胞疗法中的用途
GB201911066D0 (en) 2019-08-02 2019-09-18 Achilles Therapeutics Ltd T cell therapy
KR20220050176A (ko) * 2019-08-20 2022-04-22 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 Wt-1에 특이적인 t-세포 면역요법
WO2021163366A1 (en) * 2020-02-12 2021-08-19 Abbvie Inc. Bispecific binding molecules
JP2023524435A (ja) 2020-04-28 2023-06-12 アキレス セラピューティクス ユーケー リミテッド Ｔ細胞療法
CN112239495B (zh) * 2020-10-29 2022-04-12 上海药明生物技术有限公司 稳定的tcr结构及应用
GB202109886D0 (en) 2021-07-08 2021-08-25 Achilles Therapeutics Uk Ltd Assay
EP4320435A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Achilles Therapeutics UK Limited Batch release assay for pharmaceutical products relating to t cell therapies
IL309200A (en) 2021-06-22 2024-02-01 Achilles Therapeutics Uk Ltd A method for producing antigen-specific t cells
US20250073333A1 (en) * 2021-07-19 2025-03-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Peptides and engineered t cell receptors targeting fanci, rad51, and pbk antigens and methods of use
CN119220425A (zh) * 2023-07-28 2024-12-31 佳吾益(北京)科技有限公司 发现mhc新抗原肽表位的工程化细胞

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3927193A (en) 1973-05-18 1975-12-16 Hoffmann La Roche Localization of tumors by radiolabelled antibodies
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4444744A (en) 1980-03-03 1984-04-24 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens
US4361544A (en) 1980-03-03 1982-11-30 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers
US4348376A (en) 1980-03-03 1982-09-07 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled anti-CEA antibody
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4468457A (en) 1981-06-01 1984-08-28 David M. Goldenberg Method for producing a CSAp tryptic peptide and anti-CSAp antibodies
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4640561A (en) 1985-11-15 1987-02-03 Ford Motor Company Flexible printed circuit connector
US5059413A (en) 1988-04-18 1991-10-22 Xoma Corporation Scintigraphic monitoring of immunotoxins using radionuclides and heterobifunctional chelators
DK0486622T3 (da) 1989-08-09 1999-07-19 Rhomed Inc Direkte radiomærkning af antistoffer og andre proteiner med technetium eller rhenium
US5299253A (en) 1992-04-10 1994-03-29 Akzo N.V. Alignment system to overlay abdominal computer aided tomography and magnetic resonance anatomy with single photon emission tomography
US6696251B1 (en) 1996-05-31 2004-02-24 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
EE200000697A (et) 1998-05-19 2002-06-17 Avidex Limited Lahustuv T-raku retseptor
US6534633B1 (en) 1998-10-21 2003-03-18 Altor Bioscience Corporation Polyspecific binding molecules and uses thereof
CA2457652C (en) 2001-08-31 2012-08-07 Avidex Limited Soluble t cell receptor
US7892559B2 (en) 2002-01-30 2011-02-22 Survac Aps Survivin-derived peptides and use thereof
WO2004033685A1 (en) 2002-10-09 2004-04-22 Avidex Ltd Single chain recombinant t cell receptors
GB0304068D0 (en) 2003-02-22 2003-03-26 Avidex Ltd Substances
GB0328363D0 (en) 2003-12-06 2004-01-14 Imp College Innovations Ltd Therapeutically useful molecules
ATE417065T1 (de) 2004-05-19 2008-12-15 Medigene Ltd Hochaffiner ny-eso-t-zellen-rezeptor
DE602005009825D1 (de) 2004-05-19 2008-10-30 Medigene Ltd Verfahren zur verbesserung von t-zellrezeptoren
GB0524477D0 (en) 2005-11-30 2006-01-11 Avidex Ltd Isolated T cell receptors which specifically bind to vygfvracl-hla-24
GB0511124D0 (en) 2005-06-01 2005-07-06 Avidex Ltd High affinity melan-a t cell receptors
AT503861B1 (de) * 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von t-zell-rezeptoren
US8088379B2 (en) 2006-09-26 2012-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Modified T cell receptors and related materials and methods
US9281917B2 (en) 2007-01-03 2016-03-08 Nokia Technologies Oy Shared control channel structure
CN102272153B (zh) 2008-11-24 2015-04-15 德国慕尼黑亥姆霍兹研究中心健康和环境有限公司 高亲和力t细胞受体及其应用
WO2010075417A1 (en) * 2008-12-23 2010-07-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Survivin specific t cell receptor for treating cancer
EP2393833A1 (en) * 2009-02-09 2011-12-14 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Repertoire of allo-restricted peptide-specific t cell receptor sequences and use thereof
GB0911566D0 (en) 2009-07-03 2009-08-12 Immunocore Ltd T cell receptors
EP2486049A1 (en) * 2009-10-06 2012-08-15 The Board Of Trustees Of The UniversityOf Illinois Human single-chain t cell receptors
CN103097407A (zh) 2010-07-28 2013-05-08 英美偌科有限公司 T细胞受体
EP3213765B1 (en) 2010-09-20 2019-08-28 BioNTech Cell & Gene Therapies GmbH Antigen-specific t cell receptors and t cell epitopes
RU2018130123A (ru) 2012-05-03 2018-11-07 Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер Клетка, экспрессирующая t-клеточный рецептор (tcr), для применения в клеточной иммунотерапии
WO2014191465A1 (en) * 2013-05-28 2014-12-04 Møller Niels Iversen Peptides derived from lawsonia intracellularis and their use in vaccination
PL228457B1 (pl) 2013-08-30 2018-03-30 Univ Jagiellonski Tomograf hybrydowy TOF-PET/CT
MX383471B (es) 2013-11-22 2025-03-14 Univ Illinois Receptores de células t humanas con alta afinidad modificados por medio de manipulación genética.
ES2841274T3 (es) 2014-08-04 2021-07-07 Hutchinson Fred Cancer Res Inmunoterapia con células T específica para WT-1
CN113105562B (zh) * 2018-09-26 2023-12-01 安源医药科技（上海）有限公司 突变型单链人凝血因子viii在制备融合蛋白中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
MX2021006932A (es) 2021-07-07
AU2014352834A1 (en) 2016-05-26
AU2021202274A1 (en) 2021-05-06
JP2022023196A (ja) 2022-02-07
RU2016124179A (ru) 2017-12-27
PT3071593T (pt) 2019-06-27
SG10201804335QA (en) 2018-06-28
IL245467B (en) 2020-04-30
BR112016011583A2 (pt) 2017-09-26
DK3071593T3 (da) 2019-06-11
MX383471B (es) 2025-03-14
PL3071593T3 (pl) 2019-11-29
JP2017501130A (ja) 2017-01-12
IL245467A0 (en) 2016-06-30
AU2019272003B2 (en) 2021-05-06
RU2016124163A (ru) 2017-12-27
CA2930852C (en) 2024-01-23
EP3071594A1 (en) 2016-09-28
NZ719720A (en) 2020-09-25
US10344075B2 (en) 2019-07-09
RU2740648C2 (ru) 2021-01-19
JP6970724B2 (ja) 2021-11-24
JP6476182B2 (ja) 2019-02-27
CN105873945A (zh) 2016-08-17
EP3071593B1 (en) 2019-03-13
EP3071593A1 (en) 2016-09-28
SA516371174B1 (ar) 2019-04-14
MX2016006620A (es) 2017-05-11
SG10201804330YA (en) 2018-07-30
IL245468B (en) 2020-10-29
AU2014352826B2 (en) 2019-08-01
WO2015077607A1 (en) 2015-05-28
MX371202B (es) 2020-01-22
JP6697386B2 (ja) 2020-05-20
US20190055298A1 (en) 2019-02-21
KR20160087866A (ko) 2016-07-22
AU2014352834B2 (en) 2019-08-29
KR20160085345A (ko) 2016-07-15
JP2020007374A (ja) 2020-01-16
EP3071593A4 (en) 2017-05-03
AU2014352826A1 (en) 2016-05-26
CN105899530B (zh) 2020-05-08
NZ719707A (en) 2020-09-25
RU2729383C2 (ru) 2020-08-06
JP2017501129A (ja) 2017-01-12
ZA201603116B (en) 2018-12-19
CN105899530A (zh) 2016-08-24
BR112016011567A2 (pt) 2017-10-24
US20220396606A1 (en) 2022-12-15
ZA201603169B (en) 2020-05-27
CA2930847A1 (en) 2015-05-28
US20160280756A1 (en) 2016-09-29
IL245468A0 (en) 2016-06-30
MX2016006625A (es) 2016-12-02
WO2015077615A1 (en) 2015-05-28
US20160280755A1 (en) 2016-09-29
CA2930852A1 (en) 2015-05-28
AU2019272003A1 (en) 2019-12-19
CN105873945B (zh) 2020-07-17
ES2729406T3 (es) 2019-11-04
US10023625B2 (en) 2018-07-17
EP3071594A4 (en) 2017-05-03
KR102415259B1 (ko) 2022-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6970724B2 (ja) 改変された高親和性ヒトｔ細胞受容体
AU2018200222B2 (en) Engineering T-cell receptors
HK1228412B (en) Engineered high-affinity human t cell receptors
HK1228412A1 (en) Engineered high-affinity human t cell receptors
NZ719720B2 (en) Engineered human t cell receptors with high affinity for wt1
NZ719707B2 (en) Engineered human t cell receptors with high affinity for binding survivin