KR102786380B1

KR102786380B1 - 항-피로글루타메이트화된 아밀로이드 베타 인간화 항체

Info

Publication number: KR102786380B1
Application number: KR1020187004514A
Authority: KR
Inventors: 마틴 클라인슈미트; 옌스-울리히 라펠트; 앙케 피에초타; 슈테판 쉴링; 스티븐 길리
Original assignee: 비보리온 테라퓨틱스 엔.브이.
Priority date: 2015-07-16
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2025-03-26
Anticipated expiration: 2036-07-15
Also published as: US11045533B2; IL256579A; US20180140689A1; US20200138922A1; IL256579B2; WO2017009459A3; EA038120B1; AU2016293104B2; CN108699139B; JP2022017271A; IL256579B; AU2016293104A1; ZA201800048B; EA201890313A1; WO2017009459A2; JP2018524370A; CN108699139A; BR112018000097A2; MX2018000696A; CA2992386A1

Abstract

본 발명은 피로글루타메이트화된 아밀로이드 베타 펩타이드 (Aβ N3pE)의 N-말단에서의 에피토프에 결합하는 인간화 항체, 및 아밀로이드 펩타이드의 축적 및 부착과 관련된 질환 및 병태, 예를 들어 아밀로이드증, 일군의 피로글루타메이트화된 아밀로이드 펩타이드와 관련된 장애 및 이상, 예를 들어, 알츠하이머병, 다운증후군, 뇌 아밀로이드 혈관병증 및 기타 관련 양상의 예방적 및 치료적 처리에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 뇌 및 주변부의 다양한 조직에서 Aβ N3pE의 축적을 방지하거나 부착을 역전시키고 아밀로이드증을 완화시키기 위해, 혈장, 뇌 및 뇌척수액 중의 피로글루타메이트화된 아밀로이드 베타 펩타이드를 결합시키는 인간화 단일 클론 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은, 또한 본 발명의 인간화 항체를 사용하는 아밀로이드증의 진단을 위한 진단적 분석에 관한 것이다.

Description

항-피로글루타메이트화된 아밀로이드 베타 인간화 항체

아밀로이드증은 단일 질병체가 아니라 오히려 하나 이상의 장기 또는 신체 시스템에 축적되는 아밀로이드라 불리는 왁스 같은 전분-유사 단백질의 세포외 조직 침착물에 의해 특징되는 진행성 질환 프로세스의 다양한 그룹이다. 아밀로이드 침착물이 축적됨에 따라, 장기 또는 신체 시스템의 정상적인 기능을 방해하기 시작한다. 여기에는 적어도 15종의 상이한 유형의 아밀로이드증이 있다. 주된 형태는 알려진 선행 연구가 없는 원발성 아밀로이드증이며, 몇몇 다른 상태에 이은 속발성 아밀로이드증 및 유전성 아밀로이드증이 있다.

속발성 아밀로이드증은 만성 감염 또는 염증성 질환, 예컨대 결핵, 가족성 지중해 열이라고 불리는 박테리아성 감염, 뼈 감염 (골수염), 류마티스성 관절염, 소장의 염증 (육아 종성 장염), 호지킨 병 및 한센병에서 발생한다.

아밀로이드 침착물은 아밀로이드 P (오각형의) 성분 (AP), 정상 혈청 아밀로이드 P (SAP)에 관련된 당 단백질 및 황산화 글리코사미노글리칸 (GAG), 결합 조직의 복합 탄수화물이 포함된다. 아밀로이드 물질의 약 90%를 차지하는 아밀로이드 원섬유단백질은 여러 종류의 단백질 중 하나를 포함한다. 이들 단백질은 소위 "베타-플리츠"시트 원섬유 ("beta-pleated" sheet fibrils)로 폴딩될 수 있으며, 이는 콩고 레드의 결합 부위를 나타내는 고유한 단백질 구성으로, 아밀로이드 단백질의 독특한 염색 특성을 가진다.

많은 노화 질환은 아밀로이드-유사 단백질에 기초하거나 관련되어 있으며, 질환의 진행뿐만 아니라 발병에 기여하는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 물질의 세포 외 침전물의 축적에 의해 부분적으로 특징지어진다. 이러한 질환은 신경 질환, 예컨대 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행, 루이소체 치매 (Lewy body dementia), 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌 출혈 (hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis) (네덜란드 형); 괌 파킨슨 치매 복합증을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 아밀로이드-유사 단백질에 기초하거나 관련된 다른 질환은 진행성 핵상 마비 (progressive supranuclear palsy), 다발성 경화증 (multiple sclerosis); 크로이츠펠트 야콥병 (Creutzfeld Jacob disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), HIV-관련 치매 (HIV-related dementia), ALS (근위축성 측삭 경화증), 성인 개시 당뇨병 (Adult Onset Diabetes); 노인성 심장 아밀로이드증 (senile cardiac amyloidosis); 내분비 종양 (endocrine tumor) 및 황반 변성 (macular degeneration)을 포함한 다른 것들을 포함한다.

이러한 질환의 병인은 다양할 수 있지만, 그들의 특징적인 침착물은 종종 많은 공유된 분자 성분을 포함한다. 상당한 정도로, 이는 전-염증성 경로의 국부적 인 활성화에 기인하여 활성화 된 상보성 성분, 급성 기반 반응물, 면역 조절제 및 다른 면역 매개체의 동시 침착을 유도하는 것에 기인할 가능성이 있다 (McGeer et al., Tohoku J Exp Med. 174(3): 269-277 (1994)).

최근, 축적된 증거는 알츠하이머병에 N-말단 변형된 Aβ 펩타이드 변이체가 관여를 보여준다. 알츠하이머 환자의 뇌 뿐만 아니라, 손상되지 않은 개체의 노인성 플라크에서도 Aβ 1-40 및 Aβ 1-42의 존재를 나타난다. 그러나, N-말단 절단 및 pyroGlu 변형된 Aβ N3pE-40/Aβ N3pE-42는 거의 독점적으로 알츠하이머병 환자의 플라크 내에 새겨져 있으며, 이 Aβ 변이체는 적합한 진단 마커 및 약물 개발의 잠재적 타겟이 된다.

현재, 몇몇 상업적 제조업자는 낮은 피코그램 (pg) 범위에서 Aβ 1-40/1-42 및 Aβ N3pE-40/Aβ N3pE-42의 검출이 가능한 ELISA 키트를 제공한다.

알츠하이머병 (AD) 환자의 뇌는 신경 섬유 매듭의 존재와 신피질 뇌 구조의 Aβ 펩타이드의 침착에 의해 형태학적으로 특징지어진다 (Selkoe, D.J. & Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 545-584 (2003)). Aβ 펩타이드는 β- 및 γ-세크레타제에 의한 순차적 절단 후에 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)로부터 유리된다. γ-세크레타제 절단은 Aβ 1-40 및 Aβ 1-42 펩타이드의 생성을 초래하며, 이들은 그들의 C- 말단이 상이하고, 응집, 피브릴 형성 및 신경 독성의 상이한 효력을 나타낸다 (Shin, R.W. et al. Amyloid beta-protein (Abeta) 1-40 but not Abeta 1-42 contributes to the experimental formation of Alzheimer disease amyloid fibrils in rat brain. J. Neurosci. 17, 8187-8193 (1997); Iwatsubo, T. et al. Visualization of Abeta 42(43) and Abeta 40 in senile plaques with end-specific Abeta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron 13, 45-53 (1994); Iwatsubo, T., Mann, D.M., Odaka, A., Suzuki, N. & Ihara, Y. Amyloid beta protein (Abeta) deposition: Abeta 42(43) precedes Abeta 40 in Down syndrome. Ann. Neurol. 37, 294-299 (1995); Hardy, J.A. & Higgins, G.A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science 256, 184-185 (1992); Robner, S., Ueberham, U., Schliebs, R., Perez-Polo, J.R. & Bigl, V. The regulation of amyloid precursor protein metabolism by cholinergic mechanisms and neurotrophin receptor signaling. Prog. Neurobiol. 56, 541-569 (1998)).

확산성 플라크에 침착된 대다수의 Aβ 펩타이드는 N-말단 절단 또는 변형된 것이다. Piccini와 Saido의 연구는 노인성 플라크와 혈관 침전물의 핵심 구조는 50% 피로글루타메이트 (pyroGlu)로 변형된 펩타이드로 구성되어있음을 보여준다. (Piccini et al., J Biol Chem. 2005 Oct 7; 280(40):34186-92; Saido et al., Neuron. 1995 Feb; 14(2)): 457-66). PyroGlu로 변형된 펩타이드는 다른 Aβ 종 보다 세포 독성이 강하고 아미노펩티다제에 대해 안정하다 (Russo et al., J Neurochem. 2002 Sep; 82(6):1480-9). 따라서 pyroGlu Aβ 종은 반감기가 길어서 이들 종의 축적과 신경 독성 올리고머 및 응집체의 형성에 유익하다 (Saido, Neurobiol Aging. 1998 Jan-Feb; 19(1 Suppl):S69-75). 글루타메이트의 pyroGlu로의 고리화로 인해, 전하를 띈 아미노산이 손실되어 펩타이드의 용해도를 크게 감소시키고 응집 경향의 증가를 유발한다. 시험관내 연구는, 예를 들어 Aβ3 (pE)의 초기 올리고머화는 비-변형 펩타이드에 비해 훨씬 더 빠르다는 것을 보였다 (Schilling et al., Biochemistry. 2006 Oct 17;45(41):12393-9). Aβ N3pE-42 펩타이드는 Aβ 1-40/1-42 펩타이드와 공존하고 (Saido, T.C. et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Abeta N3pE, in senile plaques. Neuron 14, 457-466 (1995)　; Saido, T.C., Yamao, H., Iwatsubo, T. & Kawashima, S. Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci . Lett . 215, 173-176 (1996)), 많은 관찰에 기초하여 AD의 발병에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 예를 들어, Aβ N3pE-42 펩타이드의 특정 신경 독성이 개술되었다. ((Russo, C. et al. Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)--strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 1480-1489 (2002) and the pE-modification of N-truncated Aβ peptides confers resistance to degradation by most aminopeptidases as well as Aβ-degrading endopeptidases (Russo, C. et al. Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)--strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 1480-1489 (2002); Saido, T.C. Alzheimer's disease as proteolytic disorders: anabolism and catabolism of beta-amyloid. Neurobiol. Aging 19, S69-S75 (1998)). 글루탐산의 pE로의 고리화는 N-말단 전하의 손실을 유도하여 비변형된 Aβ 펩타이드에 비해 Aβ N3pE의 응집을 촉진시킨다 (He, W. & Barrow, C.J. The Abeta 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vitro than full-length A beta. Biochemistry 38, 10871-10877 (1999); Schilling, S. et al. On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides (in vitro). Biochemistry 45, 12393-12399 (2006)). 따라서, Aβ N3pE-42 형성의 감소는 이들이 분해에 대해 보다 접근 가능하게 함으로써 펩타이드를 불안정화하고, 보다 고분자량의 Aβ 응집체의 형성을 방해하여 신경 세포의 생존을 향상시킬 것이다.

그러나, 오랫동안 Aβ 펩타이드의 pE-변형이 어떻게 발생하는지는 알려지지 않았다. 최근, 글루타미닐 시클라제 (QC)가 약산성 조건하에서 Aβ N3pE-42 형성을 촉매할 수 있고, 특정 QC 억제제가 시험관 내에서 Aβ N3pE-42 생성을 예방한다는 것이 밝혀졌다 (Schilling, S., Hoffmann, T., Manhart, S., Hoffmann, M. & Demuth, H.-U. Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions. FEBS Lett. 563, 191-196 (2004)　; Cynis, H. et al. Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta 1764, 1618-1625 (2006)).

모든 사실은 pyroGlu Ab가 피브릴 형성의 초기화를 위한 일종의 세균임을 시사한다. 추가적인 연구 (Piccini et al., 2005, supra)에서 플라크 침착을 가지지만 AD 특이적 병리를 가지지 않은 지원자는 Aβ-종의 특징적인 양 때문에 AD 환자와 구별될 수 있다. 따라서, N-말단 절단된, pyroGlu 변형된 펩타이드의 양은 AD 환자의 뇌에서 유의하게 높았다.

Aβ-펩타이드의 3번 또는 11번 위치에서 pyroGlu의 번역 후 형성은 N-말단 글루타메이트 잔기의 고리화를 의미한다. 글루타미닐 시클라제 (QC)는 pyroGlu 펩타이드 생성에 중요한 역할을 한다. QC는 식물- 및 동물계에 널리 퍼져 있으며, 그 중에서도 펩타이드 호르몬의 성숙과 관련되어 있다. 암모니아 방출에 의한 글루타민의 고리화 및 pyroGlu 로의 물의 방출에 의한 글루타메이트의 고리화 모두 QC에 의해 수행된다. 글루타민 고리화와 달리 글루타메이트 고리화는 자발적으로 발생하지 않는다. QC는 글루타메이트에서 pyroGlu로의 효율적인 (원하지 않는) 부작용을 촉매한다. 생성된 pyroGlu 잔기는 단백질 분해로부터 단백질을 보호한다. QC가 pyroGlu Aβ의 생성에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주는 여러 참고 문헌이 있다:

1. 몇몇 연구에서, QC는 Aβ의 N-말단에서 글루타메이트로부터 pyroGlu 잔기의 형성을 촉매하는 것을 나타냈다 (Cynis et al., Biochim Biophys Acta. 2006 Oct; 1764(10):1618-25, Schilling et al., FEBS Lett. 2004 Apr 9;563(1-3):191-6);

2. Aβ 펩타이드와 QC는 모두 해마와 피질에서 대량으로 발현된다. 이러한 두뇌 영역은 AD에서 특히 위험에 노출되어 있다 (Pohl et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15; 88(22):10059-63, Selkoe, Physiol Rev. 2001 Apr;81(2):741-66);

3. APP는 자유 글루타메이트 잔기를 갖는 Aβ의 N-말단이 생산될 수 있는 원형질막으로의 수송 중에 β-세크레타제에 의해 절단된다 (Greenfield et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jan 19; 96(2):742-7). 분비성 소포에 있어서, 처리된 APP 및 QC의 공동 국지화가 결정되었다. 따라서 소포의 약산성 환경에서 글루타메이트 잔기의 피로글루타메이트로의 빠른 변형이 발생할 수 있다.

4. 또한, 다른 신경퇴행성 질환 (가족성 덴마크형 치매 (FDD) 또는 가족성 영국형 치매 (FBD))는 N-말단 pyroGlu 변형된 펩타이드, 예를 들어, Bri2와 관련이 있지만, 그들의 1차 구조의 관점에서 Aβ와는 관련이 없다 (Vidal R. et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 4920-4925).

아마도 pyroGlu Aβ의 QC-촉매화된 형성은 신경퇴행성 질환의 발생 및 진행에 관여한다. N-말단 변형된 아밀로이드 펩타이드의 형성은 Aβ 응집 과정에서의 근본적인 요인을 확실히 나타내며, 질병의 발병일 가능성일 수 있다. QC의 억제에 의한 pyroGlu Aβ 형성의 억제는 치료적 접근을 나타낼 수 있다. QC 억제제는 pyroGlu Aβ의 형성을 예방할 수 있고, 뇌에서의 피로글루타메이트 Aβ의 농도를 감소시켜 Aβ-펩타이드의 올리고머화를 지연시킨다. Shilling et al.는 AD 환자의 피질에서 QC 발현이 상향 조절되었고, pyroGlu-변형된 Aβ-펩타이드의 출현과 상관 관계가 있음을 보여준다. QC 억제제의 경구 투여는 AD의 2가지 다른 형질전환 마우스 모델 및 새로운 초파리 모델에서의 피로글루타메이트 변형된 AβpE (3-42) 수준을 감소시켰다 (Schilling et al., 2008 Biol. Chem. (389), 983-991).

루이소체 치매 (LBD)는 65세 이상의 노인에서 발생할 수 있는 신경 퇴행성 장애이며, 전형적으로 인지 (사고) 장애 및 비정상적인 행동 변화의 증상을 유발한다. 증상은 인지 장애, 신경학적 징후, 수면 장애 및 자율 신경계 장애를 포함할 수 있다. 인지 장애는 대부분의 경우 LBD의 특징이다. 환자들은 점차적으로 악화되는 혼란의 재발 에피소드가 있다. 인지 능력의 변동은 주목도와 각성도의 변화 정도와 관련이 있다. 인지 장애 및 사고의 변동은 몇 분, 몇 시간 또는 며칠에 걸쳐 달라질 수 있다. 루이소체는 인산화 및 비인산화 된 신경 필라멘트 단백질로 형성된다; 그들은 손상되거나 비정상적인 단백질의 제거에 관여하는 시냅스 단백질 α-시누클레인 뿐만 아니라 유비퀴틴을 포함한다. 루이소체 외에도 신경 세포의 세포 과정에 봉입체인 루이 신경 돌기가 존재할 수도 있다. 아밀로이드 플라크는 DLB에 걸린 환자의 뇌에서 형성될 수 있지만, 그들은 알츠하이머병에 걸린 환자보다 아밀로이드 플라크가 더 적은 경향이 있다. AD의 다른 미세병리학적 특징인 신경 섬유 매듭은 LBD의 주된 특징은 아니지만, 아밀로이드 플라크 외에 빈번히 존재한다.

근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 상부 및 하부 운동 뉴런의 퇴행을 특징으로한다. 일부 ALS 환자에서는 치매 또는 실어증이 나타날 수 있다 (ALS-D). 치매는 가장 일반적으로 전두측두엽 치매 (frontotemporal dementia, FTD)이며, 이들 경우의 대부분이 치상회의 뉴런과 정면 및 측두엽의 표층에 유비퀴틴-양성, tau-음성 삽입물을 가진다.

봉입체 근육염 (IBM)은 50세 이상의 사람들에게서 흔히 발견되는 심각한 질환으로, 근육 섬유가 염증을 일으켜 위축되기 시작하지만, 뇌는 보호되고 환자는 완전한 지성을 유지한다. 아밀로이드-β 단백질 생산에 관여하는 두 가지 효소가 아밀로이드-β가 증가하는 노년층의 가장 흔하고 진행성인 근육 질환 환자의 근육 세포 내부에서 증가하는 것으로 밝혀졌다.

아밀로이드-유사 단백질의 축적 및 침착에 기초하거나 관련되는 또 다른 질병은 황반 변성이다. 황반 변성은 망막의 중심 영역인 황반 (광민감성 세포가 시각적 신호를 뇌로 보내는 안구 뒤쪽의 얇은 조직)의 악화를 유발하는 일반적인 안구 질환이다. 선명하고 깨끗한 "직선" 시력은 황반에 의해 처리된다. 황반의 손상은 사각 지대, 흐리거나 왜곡된 시각의 발달을 가져온다. 노화-관련 황반 변성 (AMD)은 미국에서 시각 장애의 주요 원인이며, 65세 이상의 사람들은 백인의 법적 실명의 주요 원인이다. 40세 이상의 미국인 약 180만 명이 후기 AMD를 가지며, 중기 AMD 환자 약 730만 명은 시력 손실의 실질적인 위험에 있다. 정부는 2020년까지 후기 AMD 환자가 290만 명에 이를 것으로 추정하고 있다. AMD의 희생자들은 이 실명 상태의 원인과 치료법에 대해 알려진 것이 거의 없다는 것을 발견하는데 있어서 종종 놀라고 좌절감을 느낀다.

황반 변성에는 두 가지 형태: 건식 황반 변성과 습식 황반 변성이 있다. 황반의 세포가 서서히 부서지기 시작하는 건식 형태는 황반 변성 케이스의 85%에서 진단된다. 비록 한쪽 눈이 시력을 잃지만 다른 쪽 눈은 영향을 받지 않지만, 양쪽 눈은 보통 건식 AMD에 의해 영향을 받는다. 망막 밑의 노란색 침전물인 드루젠 (Drusen)은, 건식 AMD의 초기 증상이다. 드루젠의 수 또는 크기가 증가함에 따라 후기 건식 AMD 또는 습식 AMD가 발생할 위험이 증가한다. 건식 AMD는 습한 형태의 질병으로 변하지 않고 진행되어 시력을 잃을 수 있다; 그러나 초기-단계의 건식 AMD가 갑자기 습식 형태로 변할 수도 있다.

습식 형태는 황반 변성의 15% 만을 차지하지만, 실명의 90%를 초래하며, 후기 AMD로 간주된다 (습식 AMD의 초기 또는 중기 단계는 없음). 습식 AMD는 항상 건식한 형태의 질병이 선행된다. 건식 형태가 악화됨에 따라, 일부 사람들은 황반 뒤에 비정상적인 혈관이 생기기 시작한다. 이들 혈관은 매우 약해서 액체와 혈액이 누출되어 (즉 '습식' 황반 변성) 황반에 급격한 손상을 일으킨다.

AMD의 건식 형태는 초기에는 종종 약간 흐린 시력을 유발한다. 시야의 중심이 특히 흐려져 질병이 진행됨에 따라 이 영역이 커진다. 만약 한쪽 눈에만 영향이 미친다면 증상이 나타나지 않을 수 있다. 습식 AMD에서는 직선이 물결 모양으로 나타나고 중심 시야 손실이 빠르게 발생할 수 있다.

황반 변성의 진단은 전형적으로 동곡 확대 검사, 시력 검사 및 AMD 진단에 도움이되는 안저 검사라고 불리는 절차를 사용하여 안구 뒤를 보는 것을 포함하고, 습식 AMD가 의심될 경우-형광 혈관 조영술을 시행할 수도 있다. 건식 AMD가 후기 단계에 이르면 시력 감소를 막기 위한 현재 치료법이 없다. 그러나, 산화 방지제와 아연의 특정 고용량 제형은 중기 단계의 AMD가 후기 단계로 진행하는 것을 지연시키거나 예방할 수 있다. Macugen® (pegaptanib sodium injection), 레이저 광 응고법 및 광 역학 요법은 비정상적인 혈관 증식 및 황반에서의 출혈을 조절할 수 있어 습식 AMD을 가진 일부 사람에게 도움이 된다; 그러나 이미 손실된 시력은 이러한 기술로는 회복되지 않는다. 시력이 이미 상실되면 삶의 질을 향상시키는데 도움이 될 수 있는 저시력 보조기가 존재한다.

노화-관련 황반 변성 (AMD)의 가장 초기 징후 중 하나는, 망막 색소 상피 (RPE)의 기저막과 부르크막 (Bruch's membrane, BM) 사이에 드루젠으로 알려진 세포 외 침착물의 축적이다. Anderson et al. 의 최근 연구는 드루젠이 아밀로이드 베타를 함유하고 있음을 확인했다. (Experimental Eye Research 78 (2004) 243 - 256).

피로글루타메이트화된 Aβ 펩타이드는 Aβ 펩타이드의 축적과 알츠하이머병의 플라크 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 그들의 소수성 전위 때문에, 이들 펩타이드는 응집 및 플라크 형성을 촉진한다는 것이 밝혀졌다. 뉴런에서 Aβ N3pE-42를 발현하는 형질전환 마우스 모델에서 이 펩타이드는 생체 내에서 신경 독성을 가지며, 뉴런의 손실을 유발한다는 것이 밝혀졌다 (Wirths et al. (2009) Acta Neuropatho/118, 487-496).

Aβ 펩타이드의 N-말단 피로글루타메이트에 대한 특이성을 갖는 항체는 N-말단에서 피로글루타메이트를 운반하지만 APP 또는 N-말단 피로글루타메이트를 갖지 않는 다른 Aβ 종을 검출하지 못하는 Aβ의 병원성 종에 대해서만 특이성을 가지기 때문에 유리한 것으로 여겨진다. 따라서, 제어 불가능한 대뇌 염증과 같은 잠재적 부작용의 위험은 피로글루타메이트화된 변이체인 다른 Aβ 종에 대한 항체와 비교하여 본 발명의 항체의 사용에 의해 저하될 것이다.

Aβ N3pE 펩타이드를 표적으로 하는 항체가 공지되어 있다 (Acero et al (2009) J Neuroimmunol 213, 39-46; Saido et al. (1996) Neuron 14, 457-466; US 7,122,374 및 WO 2012/136552).

그러나, 인간 치료에 사용될 수 있고 아밀로이드증, 특히 Aβ N3pE가 관련 될 수 있는 질환 및 병태, 예를 들어 임상 또는 전-임상 알츠하이머병, 다운 증후군 및 임상 또는 전-임상 혈관병증에 긍정적으로 영향을 미칠 수 있는 Aβ N3pE 펩타이드에 대한 특이성을 갖는 인간화 항체가 필요하다.

본 발명은, 부분적 또는 완전한 인간화 항체 및 이의 단편을 포함하는 키메라 항체 및 이의 단편을 포함하는, 모노머, 다이머, 트라이머 등 또는 폴리머 형태, 응집체, 섬유, 필라멘트의 형태 또는 플라크의 압축된 형태로 항체에 제시될 수 있는, 소정 범위의 β-아밀로이드 항원, 특히 Aβ N3pE 펩타이드로부터의 특정 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합하는 능력을 갖는, 매우 특이적이고 고도로 효과적인 항체를 포함하는 신규 방법 및 조성물을 제공한다.

특히, 본 발명은 인간화 항체 또는 이의 기능적 변이체로서, 여기서 상기 항체의 경쇄 가변부가 서열번호 7의 아미노산 서열:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLX ₁ SDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLX ₂ YLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK (서열번호 7)

(여기서,

X₁은 Y 및 H로부터 선택되고;

X₂는 A, I 및 T로부터 선택된다);

또는 서열번호 28 및 서열번호 36으로부터 선택된 아미노산 서열:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSDGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSTHVPPTFGQGTKVEIK (서열번호 28)

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYVVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK (서열번호 36)

을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 것;

및/또는

여기서 상기 항체의 중쇄 가변부가 서열번호 17의 아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGX ₃ TMNWVRQAPGQGLEWMGLINPX ₄ NX ₅ VTRYNQKFX ₆ GRVTX ₇ X ₈ RDTSTTTVX ₉ MELTSLTSEDTAX ₁₀ YYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS (서열번호 17)

(여기서,

X₃는 Y 및 H로부터 선택되고;

X₄는 Y 및 S로부터 선택되고;

X₅는 G, T, A 및 E로부터 선택되고;

X₆는 K 및 Q로부터 선택되고;

X₇은 L 및 I로부터 선택되고;

X₈은 I 및 T로부터 선택되고;

X₉은 Y 및 H로부터 선택되고;

X₁₀은 V 및 T로부터 선택된다);

또는 서열번호 32 및 서열번호 40으로부터 선택된 아미노산 서열:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNLAYSIYYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYDYDNILDYVMDYWGQGTLVTVSS (서열번호 32) (서열번호 40)KKPGASVKVSCKASGYIFNNYWINWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGDTNYNGKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYIVYWGQGTLVTVSS (서열번호 40)

을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 것인, 인간화 항체 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.

본 발명은 Aβ N3pE가 관여될 수 있는 아밀로이드증의 질병 및 증상에 긍정적으로 영향을 미치는 인간화 항체 또는 이의 단편을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 순환 및 조직, 특히 뇌에서 Aβ N3pE 펩타이드에 결합하는 인간화 항체 및 이의 단편을 제공한다. 본 발명의 인간화 항체는 자유 Aβ N3pE 펩타이드 분자 또는 결합 형태의 Aβ N3pE 펩타이드에도 결합할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 뇌와 같은 중추 신경계 및 혈장과 같은 순환에서 Aβ N3pE 펩타이드의 가용성 및 결합 형태의 제거를 변경시키는 인간화 항체를 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 인간화 항체 및 이의 단편을 제공하고, 인간화 항체는 Aβ N3pE의 N-말단을 갖는 피로글루타메이트에 특이적으로 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 벡터에 형질전환된 숙주 세포 또는 인간화 항체 또는 이의 단편을 발현하는 폴리누클레오티드를 혼입시키는 것에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 인간화 항체 및 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 인간화 항체 및 이의 단편의 용도에 관한 것이며, 인간에서 Aβ N3pE에 결합하고 이를 클리어링 또는 제거함으로써 아밀로이드증 또는 Aβ N3pE 독성으로 특징지어진 질환 및 병태를 진단, 예방 및 치료하는데 유용하다.

특정 실시양태에서, 생물학적 유체 및 조직에서 Aβ N3pE 펩타이드에 결합 하고 이를 클리어링 또는 제거할 수 있는 본 발명의 인간화 항체는 Aβ N3pE-함유 플라크, 예컨대 뇌의 확산성, 신경성 및 뇌 혈관 플라크의 형성과 관련된 증상의 예방 및/또는 치료에 유용하다.

면역학적으로 반응성인 단편을 포함하는 본 발명의 인간화 항체의 투여는 전술한 플라크 또는 다른 생물학적 복합체로부터 Aβ N3pE의 클리어런스 또는 제거를 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 인간화 항체는 순환계, 다른 체액 및 전술한 플라크 및/또는 다른 생물학적 복합체가 형성되는 부위 또는 Aβ N3pE가 손상 효과를 나타내는 다른 부위로 용이하게 수송될 것이다.

또한, 본 발명의 인간화 항체에 의한 플라크 또는 다른 생물학적 복합체로부터의 Aβ N3pE의 제거는 불용성 형태의 플라크의 가용화를 유도하여, 뇌 조직과 같은 영향을 받는 조직으로부터 완전한 플라크 제거를 유도한다. 이는 신경 퇴행성 질환, 예컨대 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행, 루이소체 치매 (Lewy body dementia), 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌 출혈 (hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis) (네덜런드 형); 괌 파킨슨 치매 복합증으로 진단된 환자의 인지 향상을 유도할 수 있다

순환 또는 다른 체액 중의 Aβ N3pE에 대한 본 발명의 인간화 항체의 결합은 Aβ N3pE의 순환형 또는 용해형의 제거를 추가로 초래할 수 있다. 상기에서 논의 된 바와 같이, Aβ N3pE는 높은 소수성을 나타내며, 다른 것, 예를 들어 비 피로글루타메이트화된 Aβ 펩타이드에 대해 높은 친화성을 갖고, 아밀로이드 플라크와 같은 올리고머 및 초분자 구조의 형성을 초래한다. 특히 이러한 올리고머 구조는 고도로 신경 독성이 있는 것으로 나타났다. 올리고머 구조의 형성은 세포 손상 및 신경 세포의 사멸을 초래한다. 따라서, Aβ N3pE의 순환형 또는 가용형의 제거 또는 심지어 Aβ N3pE를 포함하는 올리고머의 제거는 세포 손상 및/또는 신경 독성의 예방을 유도한다. 따라서, 본 발명은 또한 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행, 루이소체 치매 (Lewy body dementia), 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌 출혈 (hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis) (네덜런드 형); 괌 파킨슨 치매 복합증과 같은 신경 퇴행성 질환의 예방 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 아밀로이드-유사 단백질, 특히 Aβ N3pE, 예를 들어 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증, 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, HIV-관련 질환, ALS (근위축성 측삭 경화증), 성인 발병 당뇨병과 관련된 치매; 노인성 심장 아밀로이드증 및 다른 것과 관련된 황반 변성을 포함하는 기타 질환에 기초하거나 관련된 다른 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 Aβ 변이체, 생물학적 샘플, 예를 들어 분비액 또는 혈청 샘플, 바람직하게는 혈청 샘플 또는 조직 샘플 중의 특히 Aβ N3pE의 정량적 결정을 가능하게 하는 매우 민감하고 동시에 강력한 검출 기술을 제공한다. 이것은 혈액 내 Aβ N3pE 펩타이드의 낮은 존재량을 고려한다면, 굉장히 곤란한 것이다. 그러나, 이러한 검출 기술을 이용 가능하게 하는 것은 약물 스크리닝 및 약물 개발 프로그램에서 저분자 억제제의 효능을 연구하기위한 전제 조건이다.

본 발명의 교시에 의해 사용 가능해진 항체는 속발성 아밀로이드증 및 노화-관련 아밀로이드증, 예를 들어 알츠하이머병 (AD), 루이소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌출혈 (네덜란드형), 괌 파킨슨-치매 복합체뿐만 아니라, 아밀로이드-유사 단백질에 기초하거나 관련된 다른 질병, 예컨대, 몇가지 예를 들면 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥병, 아밀로이드증 네덜란드형을 동반한 유전성 뇌출혈, 파킨슨병, HIV-관련 질환, ALS (근위축성 측삭 경화증), 성인 발병 당뇨병과 관련된 치매, 노인성 심장 아밀로이드증 및 황반 변성을 포함하는 기타 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않은 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애군인 아밀로이드증의 진단에 특히 유용하다.

도 1은 마우스 항체 클론 #6의 CDR 정의를 나타낸다
경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)의 가변 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다. LC 및 HC의 세 CDR은 Kabat 및 Wu, 1971 (Kabat E. A. and WU, T.T.: An Attempt to Locate the Non-helical and Permissively Helical Sequences of Proteins: Application to the Variable Regions of Immunoglobulin Light and Heavy chains. Proc. Nat. Acad . Sci . USA; Vol. 68, No. 7, pp. 1501-1506, 1971) 및 Kabat 등 1991 (Kabat E. A. and WU, T.T.: IDENTICAL V REGION AMINO ACID SEQUENCES AND SEGMENTS OF SEQUENCES IN ANTIBODIES OF DIFFERENT SPECIFICITIES: Relative Contributions of VH and VL Genes, Minigenes, and Complementarity-Determining Regions to Binding of Antibody-Combining Sites. The Journal of Immunology, Vol. 147; pp. 1709-1719, 1991)에 따라 구성되고 (selected by Sircar et al., 2009 (Sircar A. et al.: RosettaAntibody: antibody variable region homology modeling server. Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, pp. W474-W479); Clothia 등 1989에 따라 정의된 HC의 CDR1 옆에 위치한다 (Clothia C. et al.: Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature, Vol. 342, pp. 877-883, 1989).
도 2는 단백질 G 크로마토그래피에 의한 인간화 항체 클론 #6의 정제를 나타낸다. 재조합 생성 인간화 항체 클론 #6을 단백질 G 크로마토그래피로 정제하였다. 24 ㎕의 입력 분획 (lane 1), 플로우스루 분획 (lane 22) 및 용출 분획 (lane 3)을 비환원 조건하에 10% SDS PAGE에 로딩하였다. 인간화 (lane 4) 항체 2 ㎍를 쿠마시 염색된 10% SDS 겔에서 마우스 항체 (lane 5)와 비교하였다.
도 3은 인간화 항체 클론 #6 HC T97 변이체 및 LC L41 변이체의 KD의 계산을 나타낸다. Aβ(pE3-18)에 대한 인간화 항체 클론 #6의 HC T97 및 LC L41 변이체의 결합 친화력을 1 내지 100 nM (HC T97 변이체) 및 10 내지 1000 nM (LC L41 변이체)의 펩타이드 농도를 사용하여 SPR에 의해 측정하였다. KD는 5.3 nM으로 계산되었다. LC L41 변이체의 KD 값은 상기한 바와 같이 펩타이드 농도에 대해 플로팅한 RU_equ 값 및 정상 상태 모델에 의한 피팅에 의해 162.7 nM으로 결정되었다.
도 4는 인간화 항체 클론 #6 변이체인 HC T97을 발현하는 안정한 세포주의 생성을 나타낸다. A) 인간화 항체 클론 #6 변이체 HC T97을 안정하게 발현하는 CHO DG44 세포의 MTX 처리. 0.5 μM MTX (lane 2)는 MTX 0.1 μM 및 MTX를 처리하지 않은 것(lane 1 및 4)을 비교하여 증가된 발현을 유도한다. 1μM MTX (lane 4)를 사용한 처리와 비교하여 사멸 세포의 양보다 적다. 24 ㎕의 상층액을 비 환원 조건 하에서 10% SDS PAGE 상에 로딩하였다. B) 18개의 클론은 제한 희석을 통해 클론 선택한 후 수득하였고 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 24 ㎕의 상층액을 비 환원 조건하에 12% SDS PAGE에 로딩하였다. C) 이들 18개의 클론 중 5개를 스케일 업하여 7일 동안 배양하여 상층액의 발현 수준을 SPR로 분석할 수 있었다.
도 5는 AβpE3-18 펩타이드를 갖는 인간화 항체 클론 #6의 ITC 측정을 나타낸다. 정제된 인간화 항체 클론 #6 HC T97 변이체를 ITC 측정에 사용하였다. 상단: ITC 측정의 미가공 데이터. 하단: 기능적 몰비 펩타이드/항체로서 첨가된 펩타이드의 농도를 나타내는 미가공 데이터의 통합. 열역학 파라미터 값은 왼쪽에 나타내었다.
도 6은 Fc 감마 수용체 CD16A에 대한 서열번호 73 (WT)의 인간 IgG1 Fc 야생형 영역 또는 이의 K322A 돌연변이 변이체 (서열번호 74)를 모두 포함하는 2가지 항체의 결합을 나타낸다.
도 7은 Fc 감마 수용체 CD32A에 대한 서열번호 73 (WT)의 인간 IgG1 Fc 야생형 영역 또는 이의 K322A 돌연변이 변이체 (서열번호 74)를 모두 포함하는 2가지 항체의 결합을 나타낸다.
도 8은 Fc 감마 수용체 CD32B에 대한 서열번호 73 (WT)의 인간 IgG1 Fc 야생형 영역 또는 이의 K322A 돌연변이 변이체 (서열번호 74)를 모두 포함하는 2가지 항체의 결합을 나타낸다.
도 9는 Fc 감마 수용체 CD64에 대해 서열번호 73 (WT)의 인간 IgG1 Fc 야생형 영역 또는 이의 K322A 돌연변이 변이체 (서열번호 74)를 모두 포함하는 2가지 항체의 결합을 나타낸다.
도 10은 C1q에 대해 서열번호 73 (WT)의 인간 IgG1 Fc 야생형 영역 또는 이의 K322A 돌연변이 변이체 (서열번호 74)를 모두 포함하는 2가지 항체의 결합을 나타낸다.

정의

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 적어도 2개의 손상되지 않은 항체로부터 형성된 손상되지 않은 단일 클론 항체, 다중 클론 항체, 다중특이성 항체 (예: 이중 특이성 항체) 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편을 특이적으로 포함한다. 항체는 예를 들어, IgM, IgG (예: IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgD, IgA 또는 IgE일 수 있다. 그러나 바람직하게는, 상기 항체는 IgM 항체가 아니다.

"항체 단편"은 손상되지 않은 항체의 일부, 일반적으로 손상되지 않은 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편 : 디아바디 (diabodies); 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "단일 클론 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 즉, 개체군을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단일 클론 항체는 매우 특이적이며 단일 항원 부위에 대해 쏠려있다. 또한, 전형적으로 상이한 결정체 (에피토프)에 대해 쏠려있는 상이한 항체를 포함하는 "다중 클론 항체" 조제물과 대조적으로, 각각의 단일 클론 항체는 항원 상의 단일 결정체에 대해 쏠려있다. 그들의 특이성 외에도, 단일 클론 항체는 종종 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양물에 의해 합성된다는 점에서 종종 유리할 수 있다. "단일 클론 항체"는 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단일 클론 항체는 문헌 (Kohler et al., Nature, 256:495 (1975))에 의해 최초로 기술된 하이브리도마 방법 또는 일반적으로 공지된 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. "단일 클론 항체"는 또한 예를 들어, 문헌 (Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))에 기재되어 있다.

본원에서 단일 클론 항체는 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에 상응하는 서열의 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 동일하거나 상동인 키메라 항체 (면역글로불린)를 포함하며, 사슬의 나머지는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 그러한 항체의 단편 뿐만 아니라 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다.

비-인간 (예: 쥐)항체의 "인간화" 형태는 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편 (Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 부분 서열)이며, 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함한다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 상보-결정 영역 (CDR)의 잔기를 갖는 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이고, 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 가지는 마우스, 랫트 또는 래빗과 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR의 잔기에 의해 대체된다. 일부 예에서는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열 어느 곳에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다.

이러한 변형은 항체 성능을 더욱 정제하고 최적화하기 위해 만들어졌다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 모두가 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하는 실질적으로 모든 하나 이상의, 전형적으로 2개의 가변 도메인 및 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 모두가 인간 면역글로불린 서열의 그것을 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 최적으로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986), Reichmann et al, Nature. 332:323-329 (1988): 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biel., 2:593-596 (1992))를 참고한다.

"단일-사슬 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 V_H 및 V_L 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 대한 리뷰는 문헌 (Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994))을 참조한다.

용어 "디아바디 (diabody)"는 동일한 폴리펩타이드 사슬 (V_H-V_D)에서 경쇄 가변 도메인 (V_D)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는 단편인, 2개의 항원- 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭한다. 너무 짧은 링커를 사용하여 동일한 사슬의 두 도메인 사이가 쌍이 되도록 허용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보적인 도메인과 강제로 쌍을 이루어 두 개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는 문헌 (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sol. USA, 90:6444-6448 (1993))에 기재되어 있다.

"분리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리 및/또는 회수된 항체이다. 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로리법 (Lowry method)에 의해 측정된 항체의 95 중량% 이상, 가장 바람직하게는 99 중량% 이상, (2) 스핀 컵 시퀀서 (spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15 잔기를 수득하기에 충분한 정도, (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는, 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 균일하게 정제한다. 단리된 항체는 항체 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에, 재조합 세포 내에서 원위치로 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "세포", "세포주" 및 "세포 배양"이라는 표현은 상호 교환적으로 사용되고, 모든 이러한 표시는 자손 (progeny)을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어는 전이의 수에 관계없이 일차 대상 세포 및 그로부터 유도된 배양물을 포함한다. 고의적이거나 부주의한 돌연변이로 인해 모든 자손이 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 이해한다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 별개의 지정이 의도되는 경우, 이것은 문맥으로부터 명백할 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 상호 교환 가능하며, 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 구성된 생체 분자를 의미하도록 정의된다.

본원에서 펩타이드 또는 아미노산 서열이 언급된다면, 각 아미노산 잔기는 하기 통상적인 리스트에 따라 아미노산의 관용명에 대응하는 1문자 또는 3문자로 표시된다:

아미노산 1 -문자 기호 3 -문자 기호

알라닌 A Ala

아르기닌 R Arg

아스파라긴 N Asn

아스파라긴산 D Asp

시스테인 C Cys

글루타민 Q Gln

글루타민산 E Glu

글리신 G Gly

히스티딘 H His

이소로이신 I Ile

로이신 L Leu

리신 K Lys

메티오닌 M Met

페닐알라닌 F Phe

프롤린 P Pro

세린 S Ser

트레오닌 T Thr

트립토판 W Trp

티로신 Y Tyr

발린 V Val

본 명세서에서 사용된 용어 "하나" 및 "상기"는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 정의되고, 문맥이 부적절하지 않은 이상 복수를 포함한다.

"아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질에 의해 유발되거나 관련한 질환 및 장애"라는 용어는 모노머성, 피브릴성 또는 폴리머성 상태 또는 세 가지 임의의 조합에서의 아밀로이드-유사 단백질의 존재 또는 활성에 의해 유발되는 질환 및 장애를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 질환 및 장애는 아밀로이드증, 내분비 종양 및 황반 변성을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

용어 "아밀로이드증"은 속발성 아밀로이드증 및 노화-관련 아밀로이드증, 예컨대 경도 인지 장애 (MCI), 산발적 알츠하이머병, 루이소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌출혈 (네덜란드형); 괌 파킨슨-치매 복합체, 가족성 영국형 치매 (FBD)와 같은 가족성 알츠하이머 및 가족성 덴마크형 치매 (FDD)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애군을 지칭하며; 뿐만 아니라 아밀로이드-유사 단백질에 기초하거나 연관된 다른 질환, 예를 들어 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, 파킨슨병, HIV-관련 질환, ALS (근위축성 측삭 경화증), 봉입체 근육염 (IBM), 성인 발병 당뇨병, 및 노인성 심장 아밀로이드증; 및 황반 변성을 포함하는 다수의 안구 질환, 드루센-관련 시신경 병증 및 베타-아밀로이드 침착으로 인한 백내장을 포함한다.

"아밀로이드 β, Aβ 또는 /β-아밀로이드"는 당업계에서 인정되는 용어이며, 아밀로이드 β 단백질 및 펩타이드, 아밀로이드 β 전구체 단백질 (APP) 뿐만 아니라 이의 변형, 단편 및 임의의 기능적 등가물을 지칭한다. 특히, 본원에서 사용되는 아밀로이드 β는 APP의 단백질 분해 절단에 의해 생성된 임의의 단편을 의미하며, 이는 Aβ₁ _-38, Aβ₁ _-40, Aβ₁ _- ₄₂을 포함하지만 이에 한정되지 않는 아밀로이드 병리학에 관여하거나 관련된다. 이들 Aβ 펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같다:

Aβ 1-42 (서열번호 1):

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala

Aβ 1-40 (서열번호 2):

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val

Aβ 1-38 (서열번호 3):

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly

"pGlu-Aβ" 또는 "Aβ N3pE"는 Aβ의 아미노산 서열에서 3번 위치의 글루탐산 잔기에서 시작하는 Aβ의 N-말단 절단된 형태를 지칭하며, 상기 글루탐산 잔기는 피로글루탐산 잔기 형태로 고리화된다. 특히, 본원에서 사용되는 pGlu-Aβ 또는 Aβ N3pE는 Aβ₁ _-38, Aβ₁ _-40, Aβ₁ _- ₄₂을 포함하지만 이에 한정되지 않는 아밀로이드 병리학에 관여하거나 관련된다.

Aβ, Aβ₃ _-38, Aβ₃ _-40, Aβ₃ _-42의 N-말단 절단된 형태의 서열은 다음과 같다:

Aβ 3-42 (서열번호 4):

Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala

Aβ 3-40 (서열번호 5):

Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val

Aβ 3-38 (서열번호 6):

Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly

본 발명은 N-말단의 아미노산 1번 및 2번을 절단 또는 손실에 의해 N-말단 절단된 인간 Aβ 펩타이드에 대해 특이적인 인간화 항체에 관한 것이며, 이렇게 밝혀진 N-말단 아미노산 3번은 피로글루타메이트 형성에 의해 변형되고 따라서 N-말단의 3번 위치에서 피로글루타메이트 잔기를 갖는다 (추가로 Aβ N3pE 펩타이드 또는 N3pE-Aβ 펩타이드 또는 피로글루타메이트 Aβ 펩타이드라고 지칭함).

제1 양태에서, 본 발명은 인간화 항체에 관한 것으로서, 여기서 상기 항체의 경쇄 가변부는 서열번호 7의 아미노산 서열:

(여기서,

X₁은 Y 및 H로부터 선택되고;

X₂는 A, I 및 T로부터 선택된다);

을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서 서열번호 7의 아미노산을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 상기 항체의 가변부를 갖는 항체는 경쇄에 하기 CDR 영역:

V_L CDR1: KSSQSLLX ₁ SDGKTYLN (서열번호 8),

(여기서, X₁이 Y 및 H로부터 선택된다);

V_L CDR2:LVSKLDS (서열번호 9); 및

V_L CDR3:VQGTHFP (서열번호 10)

을 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 항체의 경쇄 가변부에서 X₁은 Y이고, X₂는 I 이고, 따라서 경쇄는 서열번호 11의 아미노산 서열:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK (서열번호 11)

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 경쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 경쇄는 하기 CDR 영역:

V_L CDR1: KSSQSLLYSDGKTYLN (서열번호 12),

V_L CDR2: LVSKLDS (서열번호 9); 및

V_L CDR3: VQGTHFP (서열번호 10)

을 포함한다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체의 경쇄 가변부에서 X₁은 Y이고, X₂는 A이고 따라서 경쇄 가변부는 서열번호 13의 아미노산 서열:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLAYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK (서열번호 13)

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 경쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 서열번호 12의 V_L CDR1, 서열번호 9의 V_L CDR2 및 서열번호 10의 V_L CDR3의 CDR 영역을 포함한다.

가장 바람직하게는, 본 발명의 항체의 경쇄 가변부에서 X₁은 Y이고, X₂는 T이고 따라서 경쇄 가변부는 서열번호 14의 아미노산 서열:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK (서열번호 14)

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 경쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 서열번호 12의 V_L CDR1, 서열번호 9의 V_L CDR2 및 서열번호 10의 V_L CDR3의 CDR 영역을 포함한다.

더욱더 바람직하게는, 본 발명의 항체 경쇄 가변부에서 X₁은 H이고, X₂는 T이고 따라서 경쇄는 서열번호 15의 아미노산 서열:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK (서열번호 15)

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 경쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 경쇄는 하기 CDR 영역:

V_L CDR1: KSSQSLLHSDGKTYLN (서열번호 16),

V_L CDR2: LVSKLDS (서열번호 9); 및

V_L CDR3: VQGTHFP (서열번호 10)

을 포함한다.

또한, 제1 양태에 따르면, 본 발명은 인간화 항체에 관한 것으로서, 상기 인간화 항체의 중쇄의 가변부는 서열번호 17의 아미노산 서열:

(여기서,

X₃는 Y 및 H로부터 선택되고;

X₄는 Y 및 S로부터 선택되고;

X₅는 G, T, A 및 E로부터 선택되고;

X₆는 K 및 Q로부터 선택되고;

X₇은 L 및 I로부터 선택되고;

X₈은 I 및 T로부터 선택되고;

X₉은 Y 및 H로부터 선택되고;

X₁₀은 V 및 T로부터 선택된다);

본 발명의 바람직한 실시양태에서 상기 항체의 중쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 17의 아미노산을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 중쇄에 하기 CDR 영역:

V_H CDR1: GYSFTGX ₃ TMN (서열번호 18),

(여기서, X₃는 Y 및 H로부터 선택된다);

V_H CDR2: LINPX ₄ NX ₅ VTRYNQKFX ₆ G (서열번호 19); 및

(여기서, X₄는 Y 및 S로부터 선택되고, X₅는 G, T, A 및 E로부터 선택되고; X₆가 K 및 Q로부터 선택된다);

V_H CDR3: EAKREWDETY (서열번호 20)

을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 항체의 중쇄 가변부에서 X₃는 Y, X₄는 Y, X₅는 G, X₆는 K, X₇은 T, X₈은 I, X₉은 Y이고 X₁₀은 V이고, 따라서 중쇄는 서열번호 11의 아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGVTRYNQKFKGRVTLIRDTSTTTVYMELTSLTSEDTAVYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS (서열번호 21)

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 중쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 중쇄는 하기 CDR 영역:

V_H CDR1: GYSFTGYTMN (서열번호 22),

V_H CDR2: LINPYNGVTRYNQKFKG (서열번호 23); 및

V_H CDR3: EAKREWDETY (서열번호 20)

을 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 항체의 중쇄 가변부에서 X₃는 H, X₄는 S, X₅는 G, X₆는 Q, X₇은 I, X₈은 T, X₉은 H이고 X₁₀은 V이고, 따라서 중쇄는 서열번호 24의 아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTAVYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS (서열번호 24)

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 중쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 중쇄에 하기 CDR 영역:

V_H CDR1: GYSFTGHTMN (서열번호 25),

V_H CDR2: LINPSNGVTRYNQKFQG (서열번호 26); 및

V_H CDR3: EAKREWDETY (서열번호 20)

을 포함한다.

더욱더 바람직하게는, 본 발명의 항체의 중쇄 가변부에서 X₃는 H, X₄는 S, X₅는 G, X₆는 Q, X₇은 I, X₈은 T, X₉은 H이고 X₁₀은 V이고, 따라서 중쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS (서열번호 27)

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 중쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 중쇄는 하기 CDR 영역:

V_H CDR1: GYSFTGHTMN (서열번호 25),

V_H CDR2: LINPSNGVTRYNQKFQG (서열번호 26); 및

V_H CDR3: EAKREWDETY (서열번호 20)

을 포함한다.

가장 바람직하게는, 본 발명의 항체의 중쇄 가변부에서 X₃는 H, X₄는 S, X₅는 T, X₆는 Q, X₇은 I, X₈은 T, X₉은 H이고 X₁₀은 T이고, 따라서 중쇄는 서열번호 66의 아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNTVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(서열번호 66)

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 중쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 중쇄는 하기 CDR 영역:

V_H CDR1: GYSFTGHTMN (서열번호 25),

V_H CDR2: LINPSNTVTRYNQKFQG (서열번호 67); 및

V_H CDR3: EAKREWDETY (서열번호 20)

을 포함한다.

더욱더 바람직하게는, 본 발명의 항체의 중쇄 가변부에서 X₃는 H, X₄는 S, X₅는 A, X₆는 Q, X₇은 I, X₈은 T, X₉은 H이고 X₁₀은 T이고, 따라서 중쇄는 서열번호 68의 아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNAVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(서열번호 68)

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 중쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 중쇄는 하기 CDR 영역:

V_H CDR1: GYSFTGHTMN (서열번호 25),

V_H CDR2: LINPSNAVTRYNQKFQG (서열번호 69); 및

V_H CDR3: EAKREWDETY (서열번호 20)

을 포함한다.

더욱더 바람직하게는, 본 발명의 항체의 중쇄 가변부에서 X₃는 H, X₄는 S, X₅는 E, X₆는 Q, X₇은 I, X₈은 T, X₉은 H이고 X₁₀은 T이고, 따라서 중쇄는 서열번호 70의 아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNEVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(서열번호 70)

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 중쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 중쇄는 하기 CDR 영역:

V_H CDR1: GYSFTGHTMN (서열번호 25),

V_H CDR2: LINPSNEVTRYNQKFQG (서열번호 71); 및

V_H CDR3: EAKREWDETY (서열번호 20)

을 포함한다.

또한, 본 발명의 제1 양태에 따르면, 인간화 항체는 경쇄 및 중쇄의 가변부의 하기 조합을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다:

더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체의 경쇄 가변부는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

보다 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체의 중쇄 가변부는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

보다 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체의 중쇄 가변부는 서열번호 66, 72 및 74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체의 중쇄 가변부는 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체의 경쇄 가변부는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 본 발명에 따른 인간화 항체의 중쇄 가변부는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

더욱더 바람직하게는,

- 본 발명에 따른 인간화 항체의 경쇄 가변부가 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이루어지고,

- 본 발명에 따른 인간화 항체의 중쇄 가변부가 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이루어지고,

- 상기 항체의 경쇄 가변부가 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이루어지고, 서열번호 12의 V_L CDR1, 서열번호 9의 V_L CDR2 및 서열번호 10의 V_L CDR3의 CDR 영역을 포함하고,

- 상기 항체의 중쇄 가변부가 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이루어지고, 서열번호 25의 V_H CDR1, 서열번호 26의 V_H CDR2 및 서열번호 20의 V_H CDR3의 CDR 영역을 포함한다.

더욱더 바람직하게는,

- 본 발명에 따른 인간화 항체의 중쇄 가변부가 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이루어지고,

- 상기 항체의 중쇄 가변부가 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이루어지고, 서열번호 25의 V_H CDR1, 서열번호 71의 V_H CDR2 및 서열번호 20의 V_H CDR3의 CDR 영역을 포함한다.

제2 양태에서, 본 발명은 인간화 항체에 관한 것으로서, 상기 항체 경쇄 가변부는 서열번호 28의 아미노산 서열:

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 경쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 경쇄는 하기 CDR 영역:

V_L CDR1: RSSQSLVHSDGNTYLH (서열번호 29),

V_L CDR2: KVSNRFS (서열번호 30); 및

V_L CDR3: SQSTHVPPT (서열번호 31)

을 포함한다.

또한, 제2 양태에 따르면, 본 발명은 인간화 항체에 관한 것으로서, 상기 항체의 중쇄 가변부는 서열번호 32의 아미노산 서열:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNLAYSIYYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYDYDNILDYVMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 32)

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 중쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 중쇄는 하기 CDR 영역:

V_H CDR1: GFTFSDYGMA (서열번호 33),

V_H CDR2: FISNLAYSIYYADTVTG (서열번호 34); 및

V_H CDR3: YDYDNILDYVMDY (서열번호 35)

을 포함한다.

제3 양태에서, 본 발명은 인간화 항체에 관한 것으로서, 상기 항체의 경쇄 가변부는 서열번호 36의 아미노산 서열:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYVVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(서열번호 36)

을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지고, 이로 이루어진다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 경쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 경쇄는 하기 CDR 영역:

V_L CDR1: KSSQSLLYSNGKTYLN (서열번호 37),

V_L CDR2: VVSKLDS (서열번호 38); 및

V_L CDR3: VQGTHFPFT (서열번호 39)

을 포함한다.

또한, 제3 양태에 따르면, 본 발명은 인간화 항체에 관한 것으로서, 상기 항체의 중쇄 가변부는 서열번호 40의 아미노산 서열:

QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFNNYWINWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGDTNYNGKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYIVYWGQGTLVTVSS(서열번호 40)

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체의 중쇄 가변부를 갖는 항체는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 중쇄는 하기 CDR 영역:

V_H CDR1: GYIFNNY (서열번호 41),

V_H CDR2: QIYPGDGDTNYNGKFKG (서열번호 42); 및

V_H CDR3: EGYIVY (서열번호 43)

을 포함한다.

또한, 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 N3pE-Aβ 펩타이드에 대한 특이적인 인간화 항체에 관한 것으로서, 경쇄는 하기로부터 선택된 CDR 영역을 포함한다.

또한, 본 발명은 인간 N3pE-Aβ 펩타이드에 대한 특이적인 인간화 항체에 관한 것으로서, 중쇄는 하기로부터 선택된 CDR 영역을 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 인간화 항체는 국제특허 WO2010/009987에 기재된 하기로부터 선택된 하이브리도마 세포:

Aβ 5-5-6 (수탁번호 DSM ACC 2923)

Aβ 6-1-6 (수탁번호 DSM ACC 2924)

Aβ 17-4-3 (수탁번호 DSM ACC 2925)

Aβ 24-2-3 (수탁번호 DSM ACC 2926)

에 의해 생산된 단일 클론 마우스 항체의 인간화 형태이다.

본 발명의 인간화 항체에 대한 경쇄 및 중쇄의 서열은 다양할 수 있다. 면역글로불린은 인간 프레임워크 영역 세그먼트에 기능적으로 결합된 하나 이상의 마우스 상보 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 사슬이 경쇄/중쇄 두 쌍을 가질 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는 발명의 인간화 항체를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한것이다.

본 발명의 항체의 인간 프레임워크 영역은 CDR-제공 비-인간 면역글로불린의 프레임워크 또는 가변 영역 아미노산 서열과, 인간 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 서열 컬렉션 내에서 상응하는 서열의 비교에 의해 결정된다. 동일한 아미노산의 높은 비율을 가진 서열이 선택된다.

본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오타이드는 경쇄에서 서열번호 9, 10, 16, 29-31 및 37-39의 아미노산 서열로 이루어지는 것으로부터 선택된 CDR 및 중쇄에서 서열번호 20, 22, 23, 25, 26, 33-35, 41-43, 67, 69 및 71의 아미노산 서열로 이루어지는 것으로부터 선택된 CDR을 포함하는 항체를 코딩한다.

또한, 항체를 코딩하는 항체가 더욱 바람직하며, 경쇄 가변부는 서열번호 7, 11, 13, 14 및 28로부터 선택된 아미노산을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

또한 항체를 코딩하는 항체가 더욱 바람직하며, 중쇄 가변부는 서열번호 17, 21, 24, 27, 32, 36, 40, 66, 68 및 70로부터 선택된 아미노산을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

추가 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 인간 IgG1 Fc 영역을 갖는다.

C1q 및 2개의 세린 프로테아제인 C1r 및 C1s는 상보성 의존성 세포 독성 (CDC) 경로의 제1성분인 복합체 C1을 형성한다. C1q는 약 460,000의 분자량을 갖는 6가의 분자이며, 6개의 콜라겐성 "줄기 (stalk)"가 6개의 구형의 머리 영역 (globular head region)에 연결되어 있는 튤립 꽃다발에 비유되는 구조이다 (Burton and Woof, Advances in Immunol 51:1-84; 1992). C1q에 대한 IgG1 분자의 결합은 상보성 활성화를 개시하고, 이어서 상보성-매개 세포 용해를 유도한다. 본 발명의 인간화 항체는 염증성 질환 및 병태의 치료에 사용되어야 하며, 즉, 본 발명의 인간화 항체는 항염증성 특성을 가져야 한다.

본 발명의 인간화 항체의 이펙터 기능은 항체의 Fc 영역과 조혈 세포상에 특화된 세포 표면 수용체인 Fc 수용체 (FcR)의 상호 작용에 의해 매개될 수 있다. Rc 수용체는 면역글로불린 슈퍼 패밀리에 속하며, 면역 복합체의 식균작용에 의해 항체-코팅 병원균의 제거, 및 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)(Van de Winkel and Anderson, J. Leuk. Bioi. 49:511-24; 1991)을 통해 적혈구 및 상응하는 항체로 코팅된 다양한 다른 세포 표적 (예: 종양 세포)의 용해를 매개하는 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명은 또한 그들의 이펙터 기능을 충족시키는 Fc 수용체에 여전히 결합하는 인간화 항체를 제공한다. 그러나, 바람직한 본 발명의 인간화 항체는 상보성 의존성 세포 독성을 나타내지 않는다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 인간화 항체는 상보성 시스템을 활성화시키지 않고 오히려 상보성-매개 세포 용해를 억제한다.

따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 3 또는 2 아미노산 치환, 가장 바람직하게는 하나의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG Fc 영역을 갖는다. 아미노산 치환은 본 발명의 항체의 인간 IgG1 Fc 영역의 부위 특이적 돌연변이 유발과 같은 통상적인 방법에 의해 달성될 수 있다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 322번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG Fc 영역을 갖는다. 아미노산 치환은 바람직하게는 K322A이다.

가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 인간 IgG Fc 영역을 갖는다.

또한, 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체의 경쇄 가변부는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 중쇄 가변부는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 인간 IgG Fc 영역은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

더욱더 바람직하게는,

- 인간 IgG1 Fc 영역이 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이루어지고,

- 상기 항체의 경쇄 가변부가 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 서열번호 12의 V_L CDR1, 서열번호 9의 V_L CDR2 및 서열번호 10의 V_L CDR3의 CDR 영역을 포함하고,

- 상기 항체의 중쇄 가변부가 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 서열번호 25의 V_H CDR1, 서열번호 26의 V_H CDR2 및 서열번호 20의 V_H CDR3의 CDR 영역을 포함한다.

더욱더 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체의 경쇄 가변부가 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 본 발명에 따른 인간화 항체의 중쇄 가변부가 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 인간 IgG Fc 영역이 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

더욱더 바람직하게는,

- 본 발명에 따른 인간화 항체의 경쇄 가변부가 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고,

- 본 발명에 따른 인간화 항체의 중쇄 가변부가 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고,

- 인간 IgG1 Fc 영역이 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고,

- 상기 항체의 중쇄 가변부가 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 서열번호 25의 V_H CDR1, 서열번호 71의 V_H CDR2 및 서열번호 20의 V_H CDR3의 CDR 영역을 포함한다.

본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오타이드는 경쇄에서 서열번호 9, 10, 16, 29-31 및 37-39의 아미노산 서열로 이루어지는 것으로부터 선택된 CDR 및 중쇄에서 서열번호 20, 22, 23, 25, 26, 33-35, 41-43, 67, 69 및 71의 아미노산 서열로 이루어지는 것으로부터 선택된 CDR을 포함하고; 서열번호 73 및 74로부터 선택된 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 항체를 코딩한다.

또한, 항체를 코딩하는 항체가 더욱 바람직하며, 경쇄 가변부는 서열번호 7, 11, 13, 14 및 28로부터 선택된 아미노산을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 인간 IgG Fc 영역은 서열번호 73 및 74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

또한 항체를 코딩하는 항체가 더욱 바람직하며, 중쇄 가변부는 서열번호 17, 21, 24, 27, 32, 36, 40, 66, 68 및 70으로부터 선택된 아미노산을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 인간 IgG Fc 영역은 서열번호 73 및 74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

전술한 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 발현 벡터로 통합될 수 있다. 적절한 숙주에 있어서의 발현 벡터의 형질전환, 숙주 선택뿐만 아니라 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 다이머의 발현 컬렉션 및 정제, 결합 단편 또는 다른 면역글로불린 형태는 당업계에 잘 공지된 절차이다.

당업자는, 예를 들어 포유동물 세포 또는 박테리아 세포와 같은 특정 세포에서의 벡터의 생산을 위해 원하는 특성에 기초하여 벡터를 선택할 수 있다.

다양한 유도성 프로모터 또는 인핸서 중 임의의 것을 본 발명의 항체 또는 조절될 수 있는 핵산의 발현용 벡터에 포함시킬 수 있다. 그러한 유도성 시스템은, 예를 들어 사이클린 유도성 시스템 (Ghsossen & Bizard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Gossen et al., Science, 268:17664769 (1995); Clontech, Palo Alto, Calif.); 중금속에 의해 유도된 메탈로티오네인 프로모터 (metallothionein promoter); 엑디손에 반응하는 곤충 스테로이드 호르몬 또는 무리스테론 (muristerone)과 같은 관련 스테로이드 (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996); Yao et al., Nature, 366:476-479 (1993); Invitrogen, Carlsbad, Calif.); 글루코코르티노이드 및 에스트로겐과 같은 스테로이드에 의해 유도된 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) (Lee et al., Nature, 294:228-232 (1981); and heat shock promoters inducible by temperature changes; the rat neuron specific enolase gene promoter (Forss-Petter, et al., Neuron 5; 197-197 (1990)); 인간 β-액틴 유전자 프로머터 (Ray, et al., Genes and Development (1991) 5:2265-2273); 인간 혈소판 유래 성장 인자 B (PDGF-B) 사슬 유전자 프로모터 (Sasahara, et al., Cell (1991) 64:217-227); 랫트 나트륨 채널 유전자 프로머터 (Maue, et al., Neuron (1990) 4:223-231); 인간 구리-아연 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자 프로모터 (Ceballos-Picot, et al., Brain Res. (1991) 552:198-214); 및 인간 POU-도메인 조절 유전자 패밀리의 멤버에 대한 프로모터 (Xi et al., (1989) Nature 340:35-42)를 포함한다.

프로모터 또는 인핸서를 포함하는 조절 요소는 조절의 성질에 따라 구성되거나 조절될 수 있다. 조절 서열 또는 조절 요소는 폴리뉴클레오타이드 서열과 조절 서열 사이의 물리적 및 기능적 관계가 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사를 허용하도록, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나에 작동가능하게 연결된다. 진핵 세포에서의 발현에 유용한 벡터는, 예를 들어 CAG 프로모터, SV40 초기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 스테로이드-유도성 프로모터, Pgtf, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MMLV) 프로모터, thy-1 프로모터 등이 포함될 수 있다.

원하는 경우, 벡터는 선별 마커를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "선별 마커"는 선별 마커가 도입된 세포에 선별 가능한 표현형을 제공하는 유전적 요소를 지칭한다. 선별 마커는 일반적으로 유전자 생성물이 세포 성장을 억제하거나 세포를 사멸시키는 물질에 대한 내성을 제공하는 유전자이다. 예를 들어, Ausubel 등의 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)) 및 미국특허 제5,981,830호에 기술된 바와 같이, 예를 들어 Neo, Hyg, hisD, Gpt 및 Ble 유전자를 포함하는 다양한 선별 마커가 본 발명의 DNA 구조물에서 사용될 수 있다. 선별 마커의 존재를 선별하는데 유용한 약물은, 예를 들어 Neo에 대한 G418, Hyg에 대한 하이그로마이신, hisD에 대한 히스티딘올, Gpt에 대한 크산틴 및 Ble에 대한 블레오마이신을 포함한다 ((see Ausubel et al, supra, (1999); 미국특허 제5,981,830호). 본 발명의 DNA 구조물은 양성 선별 마커, 음성 선별 마커 또는 이들 모두를 포함할 수 있다 (예를 들어, 미국특허 제5,981,830호 참조).

다양한 포유동물 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예는, 문헌 (Gluzman, Cell, 23: 175 (1981))에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 계통을 포함한다. 호환 가능한 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주는, 예를 들어 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 일반적으로 복제의 기원, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열 및 5' 인접 비전사 서열을 포함할 것이다. SV40 스플 라이스로부터 유래된 DNA 서열 및 폴리아데닐화 부위는 필수 비전사 유전 인자를 제공하는데 사용될 수 있다.

폴리펩타이드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실 아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 폴리펩타이드가 세포 표면에서 발현되면 회수가 촉진될 수 있지만, 이는 필수 조건은 아니다. 회수는 또한 더 긴 형태의 폴리펩타이드의 발현 후에 절단되는 절단 산물에 바람직할 수 있다. 성숙한 단백질의 구성을 완성하기 위해 필요한 경우, 당업계에 공지된 단백질 리폴딩 단계를 사용할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 최종 정제 단계에 사용할 수 있다.

인간 불변 영역 DNA 서열은 다양한 인간 세포로부터 공지된 절차에 따라 단리 될 수 있다.

본 발명은 특히 Aβ N3pE 펩타이드에 높은 친화성으로 결합하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 Aβ N3pE 펩타이드 또는 이의 면역학적으로 활성인 단편과 높은 친화성으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체에 관한 것이다. 상기 높은 친화성은 본 발명의 맥락에서 10^-5M, 10^-6M 또는 10^-7M 또는 그보다 이상의 KD 값, 바람직하게는 10^-8M 또는 그 이상의 KD 값, 및 더욱더 바람직하게는 10^-9M 내지 10^-12M의 KD 값을 의미한다. 따라서, 본 발명의 항체는 이전에 공지된 항체보다 높은 친화성을 갖는 단량체 Aβ N3pE에 결합한다.

바람직하게는, Aβ N3pE 결합에서 본 발명의 인간화 항체의 결합 에피토프는 N- 말단에서 피로글루타메이트를 가지는 에피토프이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 인간화 항체의 결합 에피토프는 하기로 이루어지는 그룹:

pEFRHDSGYEVHHQKLV (서열번호 50),

pEFRHDSGYEVHHQKL (서열번호 54),

pEFRHDSGYEVHHQK (서열번호 55),

pEFRHDSGYEVHHQ (서열번호 56),

pEFRHDSGYEVHH (서열번호 57),

pEFRHDSGYEVH (서열번호 58),

pEFRHDSGYEV (서열번호 59),

pEFRHDSGYE (서열번호 60),

pEFRHDSGY (서열번호 61),

pEFRHDSG (서열번호 62),

pEFRHDS (서열번호 63),

pEFRHD (서열번호 72),

pEFRH (서열번호 64), 및

pEFR (서열번호 65)

으로부터 선택된다.

가장 바람직하게는, 본 발명의 인간화 항체는 N-말단에서 피로글루타메이트를 가지지 않은 결합 에피토프에 결합하지 않는다.

더욱더 바람직하게는, 앞서 언급된 결합 에피토프에 결합할 때, 본 발명의 인간화 항체는 N-말단에 피로글루타메이트를 함유하는 서열의 서열 또는 부분에 항상 결합한다. 본 발명의 인간화 항체는 N-말단에서 피로글루타메이트를 함유하지 않는 서열의 서열 또는 부분에 결합하지 않는다.

또한, 본 발명의 인간화 항체는 Aβ N3pE 변이체에 EH한 결합할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, Aβ N3pE 변이체는 특히

pE-Aβ₃ _-38,

pE-Aβ₃ _-40, 및

pE-Aβ₃ _-42

이다.

Aβ N3pE 펩타이드의 다른 변이체는 모두 Aβ N3pE 변이체이며, 이는 알츠하이머병 또는 선행 알츠하이머병의 결과로서 뇌에 축적되는 것으로 나타났다. 이들은 pE-Aβ₃ _-X 펩타이드이고, x는 19 내지 42의 정수로 정의되며, 예를 들어 상기 pE-Aβ_3-42에서 "42"는 "x"의 정수가 된다.

본 발명의 맥락에서, 본 발명의 인간화 항체의 "기능적 변이체"는 결합능, 특히 pE-Aβ₃ _-x 펩타이드에 높은 친화성을 갖는 결합능을 보유하는 항체이다. 그러한 기능적 변이체의 제공은 당업계에 공지되어 있고, 항체 및 이의 단편의 정의하에 표시된 상기 언급된 가능성을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 인간화 항체는 상기 정의된 것과 같은 항체 단편이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 상기 정의된 항체의 상보성-결정 영역 (CDR)을 갖는 인간화 항체이다. 바람직하게는, 항체는 표지될 수 있다; 가능한 표지는 상기 언급된 바와 같은 것들과 특히 항체의 진단적 용도의 당업자에게 잘 알려진 것들이다.

또 다른 실시양태에서, 인간화 항체는 고체상에 고정될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 인간화 항체 및 본원에 기재된 바와 같은 인간화 항체 또는 이의 단편은, Aβ N3pE 올리고머, 섬유, 피브릴 또는 필라멘트에 대한 결합 친화성이 적어도 2배, 바람직하게는 4배, 특히 바람직하게는 10배, 특히 바람직하게는 15배, 더욱 바람직하게는 20배를 나타내며, 특히 Aβ N3pE 모노머에 대한 결합 친화성 보다 적어도 25배 더 높다.

또 다른 실시양태에서, 인간화 항체 또는 이의 단편은 포유동물, 특히 인간 뇌에서 Aβ N3pE를 포함하는 Aβ 플라크를 포함하는 응집된 Aβ에 실질적으로 결합하지만, 바람직하게는, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)에 임의의 유의미한 교차-반응성을 나타내지 않는다.

본 발명의 다른 양태에서, 인간화 항체 또는 이의 단편은 본원에 기재된 바와 같이 포유동물, 특히 인간 뇌에서, Aβ N3pE, 특히 아밀로이드 β (Aβ)를 포함하는 올리고머성 또는 폴리머성 아밀로이드에 실질적으로 결합하지만, 바람직하게는, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)에 임의의 유의미한 교차-반응성을 나타내지 않는다.

본 발명은 또한 상기 인간화 항체 및 포유동물, 특히 인간에서 아밀로이드증, 특히 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 상기 조성물을 포함하는 조성물에 관련한다. 상기 신경퇴행성 질환은 특히 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병이다.

따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 Aβ N3pE를 포함하는 플라크의 형성을 특징으로 하는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 치료를 필요로하는 인간에게 본 발명의 인간화 단일 클론 항체 또는 이의 면역학적으로 반응성인 단편을 치료적으로 또는 예방적으로 투여하는 것을 포함하며, 상기 항체는 N-말단에 피로글루타메이트를 갖는 Aβ N3pE 펩타이드의 에피토프에 특이적으로 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 아밀로이드 플라크의 형성을 억제하고 아밀로이드 플라크를 클리어 또는 제거하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 억제를 필요로하는 인간 대상에게 체액 또는 조직, 특히 뇌에서 순환 중의 Aβ N3pE에 결합하고, 더욱 바람직하게는 혈장 및 뇌에서 Aβ N3pE의 제거를 유도하는 인간화 항체의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

또한 따라서, 본 발명은, 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행 및 임상 또는 전-임상 뇌 아밀로이드 혈관병증으로 진단된 개체에서 인지 저하의 반전, 인지 개선 또는 인지 저하의 예방의 방법을 제공하고, 바람직하게는 알츠하이머병은 본 발명의 인간화 항체의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행 및 임상 또는 전-임상 뇌 아밀로이드 혈관병증, 바람직하게는 알츠하이머병의 치료, 예방 또는 반전를 위해; 또는 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행 및 임상 또는 전-임상 뇌 아밀로이드 혈관병증, 바람직하게는 알츠하이머병으로 진단된 개체에서 인지 저하의 반전, 인지 개선 또는 인지 저하 치료 및 인지 저하를 방지하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 인간화 항체의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행 및 임상 또는 전-임상 뇌 아밀로이드 혈관병증, 바람직하게는 알츠하이머병의 예방, 치료 또는 반전에 사용하기 위해; 또는 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행 및 임상 또는 전-임상 뇌 아밀로이드 혈관병증, 바람직하게는 알츠하이머병으로 진단된 개체에서 인지 저하의 반전, 인지 개선 또는 인지 저하의 치료 및 인지 저하 방지를 치료, 예방 또는 반전를 위해; 또는 포유동물, 바람직하게는 인간에서 아밀로이드 플라크의 형성 또는 Aβ N3pE의 효과의 억제를 위를 위해 본원에 기재된 인간화 항체를 제공한다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 인지 기억 용량을 유지 또는 증가시키는 방법을 제공하지만, 동물, 특히 포유동물 또는 인간에서 기억 장애를 가진 포유동물, 특히 인간의 인지 기억 능력을 회복시키는 방법을 제공하는 인간화 항체 또는 본원에 기재된 본 발명의 인간화 항체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 Aβ N3pE 또는 이의 변이체에 결합하는 인간화 항체로 치료하기 위한 인간 개체의 반응을 평가하는 방법을 제공하며,

a) 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 단편을 개체에게 투여하는 단계; 및

b) 개체로부터 채취된 생물학적 샘플에서 Aβ N3pE의 농도를 측정하는 단계

를 포함한다.

본 발명은 또한 Aβ N3pE 또는 이의 변이체에 결합하는 항체로 인간 개체를 치료하는 방법을 제공하며,

a) 개체에게 제1의 양의 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계;

b) 제1 투여량을 투여한 후 3시간 내지 2주 이내에, 개체로부터 채취된 생물학적 샘플 중의 Aβ N3pE의 농도를 측정하는 단계;

c) 필요하다면, 제2양이 제1양과 동일하거나 상이한 단계 b)의 결과에 기초하여 항체 또는 이의 단편의 제2양을 계산하는 단계; 및

d) 제2양의 항체 또는 단편을 투여하는 단계

를 포함한다.

본 발명은 Aβ N3pE 또는 이의 단편에 결합하는 항체의 Aβ N3pE 관련 아밀로이드 플라크 형성을 억제 또는 예방, 플라크를 함유하는 Aβ N3pE의 부하를 감소, 독성 Aβ N3pE 및 이의 변이체의 효과를 감소, 또는 Aβ N3pE를 함유하는 플라크와 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위해 포유동물, 바람직하게는 사람 개체에서 평가하는 방법:

a) 개체로부터 제1 생물학적 샘플을 수득하는 단계;

b) 첫 번째 샘플에서 Aβ N3pE의 기준 농도를 측정하는 단계;

c) 본 발명의 인간화 항체 또는 이의편 단을 개체에게 투여하는 단계;

d) 항체 또는 이의 단편을 투여한 후 3시간 내지 2주 이내에, 상기 개체로부터 제2 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및

e) 제2 생물학적 샘플에서 Aβ N3pE의 농도를 측정하는 단계; (여기서 효능은 제1 생물학적 샘플과 비교하여 제2 생물학적 샘플에서 Aβ N3pE의 혈중 항체 및 Aβ N3pE의 농도, 특히 농도의 감소와 관련이 있다)

을 포함한다.

생물학적 샘플은 임의의 샘플, 예를 들어 인간으로부터의 샘플일 수 있다. 하나의 구체적인 실시예에서, 샘플은 조직 샘플, 체액 샘플 또는 세포 샘플이다. 일 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 뇨, 뇌척수액 (CSF), 혈장, 림프액, 타액, 땀, 흉수, 활액, 눈액, 담즙 및 췌장 분비로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈장이다. 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 CSF이다.

생물학적 샘플은 당업자에게 공지된 방식으로 개체로부터 수득 될 수 있다. 특히, 혈액 샘플은 개체로부터 수득 될 수 있고, 혈액 샘플은 통상적인 방법에 의해 혈청 및 혈장으로 분리될 수 있다. 생물학적 샘플을 수득하는 개체는 바람직하게는 아밀로이드증의 질병 또는 상태, 바람직하게는 알츠하이머병의 발병 위험 및/또는 다른 어떤 종류의 치매의 위험에 있는 알츠하이머병을 앓고 있는 것으로 의심되는 개체이다. 특히, 샘플은 경도 인지 장애 (MCI)가 의심되는 환자 및/또는 알츠하이머병의 초기 단계에 있는 환자로부터 수득한다.

경도 인지 장애, 알츠하이머병, 가족성 영국형 치매 또는 가족성 덴마크형 치매 및 다운 증후군에서의 신경 변성과 같은 아밀로이드증의 진단, 예방 및/또는 치료에 있어서의 본 발명의 인간화 항체의 효능은 알츠하이머병의 기존 동물 모델에서 시험할 수 있다.

알츠하이머병의 적합한 동물 모델은 문헌 (McGowan et al. TRENDS in Genetics, Vol. 22, No. May 2006, pp 281-289)에서 리뷰되었으며, 하기 기재된 바와 같은 PDAPP, Tg2576, APP23, TgCRND8, PSEN_1M146V 또는 PSEN_1M146L, PSAPP, APP_Dutch, BRI-Aβ40 및 BRI-Aβ42, JNPL3, Tau_P301S, Tau_V337M, Tau_R406W, rTg4510, H_tau, TAPP, 3 x TgAD로부터 선택된다.

PDAPP: 견고한 플라크 병리를 가진 최초의 돌연변이 APP 형질전환 모델. 마우스는 인디아나 돌연변이 (APP_V717F)로 인간 APP cDNA를 발현한다. 플라크의 병리는, 반접합 PDAPP 생쥐에서 6-9 개월 사이에 시작된다. 시냅스 손실이 있지만 세포 변이가 없고 NFT 병리는 관찰되지 않는다. 이 모델은 백신 접종 치료 전략에 널리 사용되었다.

Tg2576 : 햄스터 프리온 프로모터의 제어하에 돌연변이 APP_SWE를 발현하는 마우스. 플라크 병리는 9개월부터 관찰된다. 이 마우스는 인지적 결손이 있지만 세포 손실이나 NFT 병리는 없다. 이 모델은 알츠하이머병 분야에서 가장 널리 사용되는 형질전환 모델 중 하나이다.

APP23 : Thy1 프로모터의 제어하에 돌연변이 APP_SWE를 발현하는 마우스. 눈에 띄는 뇌혈관 아밀로이드, 아밀로이드 침착은 6개월부터 관찰되며, 일부 해마의 신경 세포 손실은 아밀로이드 플라크 형성과 관련이 있다.

TgCRND8 : 다수의 APP 돌연변이 (스웨덴 + 인디아나)를 발현하는 마우스. 인지적 결함은 3개월에 빠른 세포 외 플라크 발달과 동시에 일어난다. 인지적 결함은 Aβ 백신 접종 요법으로 바꿀 수 있다.

PSEN _1M146V 또는 PSEN _1M146L (각각 라인 6.2 및 8.9): 돌연변이 PSEN1이 Aβ42를 선택적으로 상승시키는 생체 내에서 최초로 제시한 모델. 명백한 플라크 병리는 관찰되지 않는다.

PSAPP (Tg2576 x PSEN_1M146L, PSEN1-A246E + APP_SWE): PSEN1에 의한 Aβ42의 증가가 플라크 병리를 향상시킨다는 것을 입증하는 단일 형질전환 돌연변이 APP 마우스와 비교하여 아밀로이드 병리를 현저하게 촉진시키는 돌연변이 PSEN1 형질 전환 유전자를 첨가 한 Bigenic 형질전환 마우스.

APP _Dutch : 인간에서 아밀로이드증-네덜란드형을 가진 유전성 뇌출혈을 일으키는 네덜란드 변이로 APP를 발현하는 마우스. APP_Dutch 마우스는 심한 아밀로이드 혈관병증을 일으킨다. 돌연변이 PSEN1 형질전환 유전자의 첨가는 혈관 및 실질 아밀로이드 병리에서 Aβ40 및 Aβ42에 대한 상이한 역할을 나타내는 실질에 아밀로이드 병리를 재분배한다.

BRI- Aβ40 및 BRI- Aβ42 : APP 과다 발현 없이 개별 Aβ 이소형을 발현하는 마우스. Aβ42를 발현하는 마우스만 노인성 플라크 및 CAA를 발현하는 반면, BRI-Aβ40 마우스는 플라크 형성을 일으키지 않아, Aβ42가 플라그 형성에 필수적임을 시사한다.

JNPL3 : P301L 돌연변이를 갖는 4R0N MAPT를 발현하는 마우스. 이것은 MAPT 단독으로 세포 손상과 손실을 일으킬 수 있다는 것을 증명하는, 현저한 탱글 병리 (tangle pathology) 및 세포 손실을 가진 최초의 형질전환 모델이다. JNPL3 마우스는 척수 내 중증 병리 및 운동 중성자 손실로 인해 나이에 따라 운동 장애를 일으킨다.

Tau _P301S : P301S 돌연변이를 갖는 4R MAPT의 가장 짧은 이소형을 발현하는 형질전환 마우스. 동종 접합체 마우스는 뇌 및 척수에서 광범위한 심경 ㅅ서섬of유 ㅁ매듭 병리 및 척수에서의 연결 손실로 5-6 개월에 심각한 하반신 불완전 마비를 ㅇ일으킬 수 있다.

Tau _V337M : 혈소판-유도 성장 인자 (PDGF)의 촉진제에 의해 유도된 V337M 돌연변이 (1/10 내인성 MAPT)를 갖는 4R MAPT의 저 레벨 합성. 이 마우스에서 신경 섬유 매듭 병리의 발달은 절대 MAPT 세포 내 농도가 병리학을 유도하기보다는 MAPT의 특성을 암시한다.

Tau _R406W : CAMKII 프로모터의 제어하에 R406W 돌연변이를 갖는 4R 인간 MAPT를 발현하는 마우스. 마우스는 18개월부터 전뇌에 MAPT 봉입체가 발달하고, 연상 기억이 손상된다.

rTg4510 : TET-off 시스템을 사용하는 유도성 MAPT 형질절환 마우스. 비정상적인 MAPT 병리가 한 달이내에 발생한다. 마우스는 진행성 NFT 병리학과 심각한 세포 손실을 갖는다. 인지 결함은 2.5 개월에 분명해진다. 형질전환을 오프 (turning off) 하면 인지 기능이 향상되지만 NT 병리는 나 빠지게된다.

H _tau : 인간 게놈 MAPT만 발현하는 (마우스 MAPT 녹아웃) 형질전환 마우스. Htau 마우스는 6개월부터 고인산화된 MAPT를 축적하고, 15개월이 될 때까지 Thio-S 양성 NFT를 생성한다.

TAPP (Tg2576 x JNPL3): 돌연변이 APP 및/또는 Aβ가 하류 MAPT 병리에 영향을 줄 수 있음을 제시하는 JNPL3과 비교하여, TAPP 마우스에서 증가된 MAPT 전뇌 병리.

3xTgAD : PSEN1_M146V 'knock-in' 백그라운드 (PSNE1-KI) 상에서 돌연변이 APP_SWE, MAPT_P301L을 발현하는 트리플 형질전환 모델. 마우스는 6개월부터 플라크가 생성되고, 12개월까지 MAPT 병리에서 플라크를 생성하여, APP 또는 Aβ가 신경 섬유 매듭 병리에 직접 영향을 줄 수 있다는 가설을 강화시킨다.

또한, 국제특허 WO2009/034158은 AβN3E-42, AβN3Q-42, AβN3E-40 및 AβN3Q-40으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아밀로이드 베타 (Aβ) 펩타이드를 코딩하는 비-인간 형질전환 동물 모델을 개시한다. 이들 Aβ 펩타이드는 QC 및 QPCTL의 기질이며, N-말단 글루타민 (Q) 또는 글루타메이트 (N)가 피로글루타메이트 (pGlu)로 고리화된다. 따라서, 이들 형질전환 동물 모델은 신경 퇴행의 진행 과정 상의 pGlu-Aβ 펩타이드의 효과를 조사하기 위한 모델 시스템을 제공한다.

항-Aβ PN3pE 항체는 또한 Aβ pN3pE에 대한 진단학적 분석에 유용할 수 있으며, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 그 발생을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 인간화 항체는 아밀로이드증, 특히 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행 및 임상 또는 전-임상 뇌 아밀로이드 혈관병증, 바람직하게는 알츠하이머병을 검출하는 진단 방법에 특히 유용하다.

진단 용도의 경우, 항체는 전형적으로 검출 가능한 모에티로 표지될 것이다. 일반적으로 하기와 같은 카테고리로 그룹화할 수 있는 수많은 레이블을 사용할 수 있다:

(a) ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, 및 ¹³¹I와 같은 방사성 동위 원소. 항체는 문헌 (Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Gutigen et al., Ed., Wiley-Interscience. New York, New York. Pubs., (1991))에 기재된 기술을 사용하여 항체를 방사성 동위 원소로 표지할 수 있으며, 방사능은 섬광 계수를 사용하여 측정할 수 있다.

(b) 희토류 킬레이트 (유러피움 킬레이트) 또는 플루오레신 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드와 같은 형광 라벨을 이용할 수 있다. 형광 라벨은, 예를 들어 Current Protocols in Immunology 에 개시된 기술을 사용하여 항체에 접합 될 수 있다. 형광은 형광 측정기를 사용하여 정량화할 수 있다.

(c) 다양한 효소-기질 라벨을 이용할 수 있다. 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정할 수 있는 발색 기질의 화학적 변형을 촉매한다. 예를 들어, 효소는 분광 광도계로 측정할 수 있는 기질의 색 변화를 촉매 할 수 있다. 대안으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학 발광을 변화시킬 수 있다. 형광 변화를 정량화하기 위한 기술은 상기에 기술되어 있다. 화학 발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되고, 측정될 수 있는 광을 방출하거나 (예를 들어, 화학 발광계를 사용하여) 또는 형광 수용체에 에너지를 제공할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시퍼 라제 (예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; 미국특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온 (2,3-dihydrophthalazinediones), 말산 탈수소효소, 우레아제, 겨자무과산화효소 (HRPO), 알칼리 포스파타아제와 같은 퍼옥시다아제를 포함한다. O-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소좀, 사카라이드 옥시다아제 (예를 들어, 글루코스 옥시다아제, 갈락토스 옥시다아제 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나아제), 헤테로 사이클릭 옥시다아제 (예컨대, 우레아제 및 크산틴 옥시다아제), 락토페록시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 효소를 항체에 결합시키는 기술은 문헌 (O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym (ed Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73: 147-166 (1981))에 기재되어있다.

효소-기질 조합의 예는:

(i) 기질로서 수소 퍼옥시다아제를 갖는 겨자무과산화효소 (HRPO), 여기서 수소 퍼옥시다아제는 염료 전구체를 산화한다 (예: 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'- 테트라메틸벤지딘 하이드로클로라이드 (TMB));

(ii) 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 갖는 알칼리 포스파타제 (AP); 및

(iii) 발색 기질 (예: p-니트로페닐-β-D-갈락토시다아제) 또는 형광 기질인 4-메틸앰블벨리 1-β-D- 갈락토시다아제를 갖는 β-D-갈락토시다아제 (β-D-Gal)

를 포함한다.

수많은 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용 가능하다.

때로는 표지가 간접적으로 항체와 결합된다. 당업자라면 이를 달성하기 위한 다양한 기술을 알 것이다. 예를 들어, 항체는 바이오틴과 결합될 수 있으며, 상술한 세 가지 광범위한 카테고리의 표지 중 임의의 표지는 아비딘과 결합될 수 있거나 그 반대일 수 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하여, 간접적인 방식으로 항체와 결합될 수 있다. 또는, 항체와 라벨의 간접 결합을 달성하기 위해, 상기 항체는 작은 합텐 (예: 디곡신)과 결합되고, 상술한 상이한 유형의 표지 중 하나는 항-합텐 항체 (예: 항-디곡신 항체)와 결합된다. 따라서, 표지와 항체의 간접적인 결합이 성취 될 수 있다.

본 발명의 인간화 항체는 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석 및 면역 침강 분석과 같은 임의의 공지된 분석 방법에 사용될 수 있다. 문헌 (Zola, Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press. Inc., 1987)).

경쟁적 결합 분석은 제한된 양의 항체와의 결합을 위해 시험 샘플 분석물과 경쟁하는 표지 표준의 능력에 의존한다. 시험 샘플에서 Aβ N3pE의 양은 항체에 결합하는 표준량에 반비례한다. 결합되는 표준 물질의 양을 결정하기 쉽게하기 위해, 항체는 일반적으로 경쟁 이전 또는 이후에 불용화되어, 항체에 결합된 표준 물질 및 분석물은 편리하게 결합되지 않은 표준 및 분석 물질로부터 분리될 수 있다.

샌드위치 분석은 검출할 단백질의 상이한 면역 원성 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 두 개의 항체의 사용을 포함한다. 샌드위치 분석에서, 시험 샘플 분석물은 고체 지지체 상에 고정화된 제1항체에 의해 결합되고, 그 후 제2항체는 분석물에 결합하여 불용성 3-부분 복합체를 형성한다. 제2항체 자체는 검출 가능한 부분으로 표지될 수 있거나 (직접 샌드위치 분석), 검출 가능한 부분으로 표지된 항-면역글로불린 항체 (간접 샌드위치 분석)를 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 샌드위치 분석의 하나의 바람직한 유형은 ELISA 분석이고, 이 경우 검출 가능한 부분은 효소이다.

면역 조직 화학 검사의 경우, 조직 샘플은 신선하거나 동결될 수 있거나, 또는 파라핀에 포매되고, 예를 들어 포르말린과 같은 방부제로 고정될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 인간화 항체를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 진단 용도, 특히 특히 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행 및 임상 또는 전-임상 뇌 아밀로이드 혈관병증, 바람직하게는 알츠하이머병; 특히 생물학적 샘플에서의 Aβ N3pE 또는 이의 변이체의 검출에 의해 수행된다.

진단 키트

편리성의 문제로서, 본 발명의 항체는 키트, 즉 진단 분석을 실시하기 위한 지시 사항과 소정량의 시약 패키지된 조합을 포함하는 키트를 제공할 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 키트는 효소 (예를 들어, 검출 가능한 발색단 또는 형광 발색단을 제공하는 기질 전구체)에 의해 요구되는 기질 및 보조 인자를 포함할 것이다. 또한, 안정화제, 완충액 (예를 들어, 블록 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 분석의 민감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양 할 수 있다. 특히, 시약은 용해시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함하는 건조 분말로서 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 진단 키트는 하기 기재된 바와 같은 생물학적 활성 물질을 추가로 함유할 수 있다. 상기 추가적 생물학적 활성 물질이 글루타미닐 시클라제의 억제제인 경우, 진단 키트에서의 사용이 특히 바람직하다.

본 발명의 진단 키트는 특히 아밀로이드-관련 질환 및 병태, 특히 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행 및 임상 또는 전-임상 뇌 아밀로이드 혈관병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경퇴행성 질환의 검출 및 진단에 특히 유용하며, 바람직하게는 알츠하이머병이다.

본 발명은 또한 시험관 내 진단 방법에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 인간화 항체 또는 인간화 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 이 진단 방법은 특히 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행 및 임상 또는 전-임상 뇌 아밀로이드 혈관병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경퇴행성 질환의 직접 진단이며, 바람직하게는 알츠하이머병; 특히 생물학적 샘플에서 Aβ N3pE 또는 이의 변이체를 검출함으로써 발견된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 방법에 관한 것이다 :

아밀로이드-관련 질환 또는 상태, 바람직하게는 알츠하이머병의 진단을 위한 시험관 내 또는 원위치 진단 방법으로서, 하기 단계:

바람직하게는 혈청, 액 또는 CSF 샘플, 가장 바람직하게는 혈청 샘플로부터 선택되는 샘플과 본 발명에 따른 인간화 항체를 접촉시키는 단계; 또는 상기 증상 또는 질환에 걸린 것으로 의심되는 개체의 특정 신체 부위 또는 신체 영역, 및

샘플로부터 Aβ N3pE에 대한 항체의 결합을 검출하는 단계

를 포함한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 아밀로이드-관련 질환 또는 상태, 바람직하게는 알츠하이머병의 진단 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 면역학적으로 활성인 단편의 Aβ N3pE에 대한 면역 특이적 결합을 샘플 또는 원위치에서

(a) 샘플 또는 아밀로이드 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 특정 신체 부위 또는 신체 영역을 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계;

(b) 항체 및/또는 이의 기능적 부분을 Aβ N3pE에 결합시켜 면역학적 복합체를 형성시키는 단계;

(c) 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및

(d) 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 샘플 또는 특정 신체 부위 또는 영역에서 Aβ N3pE의 존재 또는 부재와 상관시키는 단계

를 포함한다.

또한, 조직 및/또는 체액에서 아밀로이드 생성성 플라크 부담의 정도를 측정하는 방법이 포함되며,

(a) 조사 중인 조직 및/또는 체액을 나타내는 샘플을 수득하는 단계;

(b) 본 발명에 따른 인간화 항체, 또는 키메라 항체 또는 이의 단편으로 아밀로이드 단백질의 존재에 대해 상기 샘플을 시험하는 단계;

(c) 단백질에 결합된 인간화 항체의 양을 결정하는 단계; 및

(d) 조직 및/또는 체액에서의 플라크 부담을 계산하는 단계를 포함한다.

특히, 본 발명은 조직 및/또는 체액에서 아밀로이드 생성성 플라크 부담의 정도를 결정하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 단계 c)에서 면역학적 복합체의 형성은 면역학적 복합체의 존재 또는 부재가 아밀로이드 단백질, 특히 Aβ N3pE의 존재 또는 부재와 관련있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간화 항체, 또는 키메라 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 기능적으로 동일 항체 또는 그 임의의 유도체 또는 이의 기능적인 부분을 포함하는 본원에 기재된 조성물, 특히 경우에 따라서는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 치료적 유효량의 인간화 항체를 포함한다.

또한, 본 발명의 인간화 항체 또는 키메라 항체 또는 그 단편을 포함하는 혼합물이며, 기능상 동등한 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 기능적인 부분을 치료학적으로 유효한 양으로 포함하고, 경우에 따라서는 생물학적 활성 물질 및/또는 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제를 추가로 포함한다.

특히, 본 발명은 추가의 생물학적 활성 물질이 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 예를 들어 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD), 예를 들어 가족성 영국형 치매 (FBD), 가족성 덴마크형 치매 (FDD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행 및 임상 또는 전-임상 뇌 아밀로이드 혈관병증, 바람직하게는 알츠하이머병과 같은 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질과 관련된 질환 또는 장애군인 아밀로이드증의 치료에 사용되는 화합물인 혼합물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 다른 생물학적 활성 물질 또는 화합물은 또한 Aβ N3pE에 의해 유발된 아밀로이드증의 치료에 사용될 수 있거나, 또는 다른 신경학적 장애의 약물 투여에 사용될 수있는 치료제일 수 있다.

다른 생물학적 활성 물질 또는 화합물은 본 발명에 따른 항체와 동일하거나 유사한 메카니즘에 의해, 또는 관련되지 않은 메카니즘에 의해, 또는 다수의 관련 작용 및/또는 관련되지 않은 작용 메카니즘에 의해 그 생물학적 효과를 발휘할 수 있다.

일반적으로, 다른 생물학적 활성 화합물은 중성자-전달 증강제 (neutron-transmission enhancer), 정신요법제 (psychotherapeutic drug), 아세틸콜린 에스테라아제 억제제 (acetylcholine esterase inhibitor), 칼슘-채널 차단제 (calcium-channel blocker), 생원성 아민 (biogenic amine), 벤조디아제핀 진정제 (benzodiazepine tranquillizer), 아세틸콜린 합성제 (acetylcholine synthesis), 저장 또는 방출 증강제 (storage or release enhancer), 아세틸콜린 시냅스후 수용체 아고니스트 (acetylcholine postsynaptic receptor agonist), 모노아민 산화효소-A 또는 -B 억제제 (monoamine oxidase-A or -B inhibitor), N-메틸-D-아스파테이트 글루타메이트 수용체 안타고니스트 (N-methyl-D-aspartate glutamate receptor antagonist), 비-스테로이드성 항염증제 (non-steroidal anti-inflammatory drug), 산화 방지제 (antioxidant) 및 세로토닌성 수용체 안타고니스트 (serotonergic receptor antagonist)를 포함한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 산화 스트레스, 항-아폽토시스 화합물, 금속 킬레이트, DNA 회복 억제제, 예컨대 피렌제핀 및 대사 산물, 3-아미노-1-프로판술폰산 (3 APS), 1,3-프로판디술폰산염 (1,3PDS), α-세크레타제 활성제, β- 및 γ-세크레타제 억제제, tau 단백질, 신경 전달 물질, β-시트 브레이커, 아밀로이드 베타 클리어링/고갈 세포 성분 유인 물질, 피로글루타메이트화된 아밀로이드 베타 3-42를 포함하는 N-말단 절단된 아밀로이드 베타 억제제, 예컨대 글루타미닐 시클라제 억제제, 항-염증 분자, 또는 콜린에스테라제 억제제 (ChEI), 예컨대 타크린, 리바스티그민, 도네페질 및/또는 갈란타민, MI 아고니스트 및 임의의 아밀로이드 또는 tau 변형 약제를 포함하는 다른 약제 및 본 발명에 따른 항체 및 임의로 약제학상 허용 가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 투여할 수 있는 영양 보충제에 대해 효과적인 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 혼합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 화합물이 콜린에스테라아제 억제제 (ChEIs), 특히 혼합물이 타크린, 리바스티그민, 도네페질, 갈란타민, 니아신 및 메만틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 혼합물에 관한 것이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 혼합물은, 본 발명에 따른 항체 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 니아신 또는 메만틴을 포함할 수 있다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 혼합물은, 본 발명에 따른 항체 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 글루타미닐 시클라제 저해제를 포함할 수 있다.

글루타미닐 시클라제의 바람직한 억제제는 국제특허 WO2005/075436, WO2008/055945, WO2008/055947, WO2008/055950, WO2008/065141, WO2008/110523, WO2008/128981, WO2008/128982, WO2008/128983, WO2008/128984, WO2008/128985, WO2008/128986, WO2008/128987, WO2010/026212, WO2011/131748, WO2011/029920, WO2011/107530, WO2011/110613, WO2012/123563 및 WO2014/140279에 기재되어 있으며, 이의 개시 내용은 본원에 참고로 통합된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 환각, 망상, 사고 장애 (현저한 불일치 탈선, 사고 이탈로 표시), 및 본 발명에 따른 항체, 특히 단일 클론 항체, 특히 키메라 항체 또는 이의 단편, 또는 본원에 기재된 바와 같은 인간화 항체 또는 단편, 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제로, 무쾌감증 (anhedonia), 정서적 둔마 (flattened affect), 무관심증 (apathy) 및 사회적 위축 (social withdrawal)뿐만 아니라 기괴하거나 혼란스러운 행동을 포함하는 양성 및 음성 정신병적 증상의 치료를 위한, 예를 들어 클로자핀 (clozapine), 지프라시돈 (ziprasidone), 리스페리돈 (risperidone), 아리피프라졸 (aripiprazole) 또는 올란자핀 (olanzapine)과 같은 "비정형적 정신병 약물"을 포함하는 혼합물이 제공된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물 및 혼합물은 본 발명의 인간화 항체 및 생물학적 활성 물질을 각각 치료학적 유효량으로 포함한다.

본 발명에 따른 인간화 항체와 조합하여 혼합물로 적절하게 사용될 수 있는 기타 화합물은 PEP-억제제 (pp. 43/44), LiCl, 디펩티딜 아미노펩티다아제, 바람직하게는 DP IV 또는 DP IV-유사 효소 (pp. 48/49 참조); 아세틸콜린에스테라제 (ACE) 억제제 (p. 47 참조), PIMT 인핸서, 베타 세크레타제 억제제 (p. 41 참조), 감마 세크레타제 억제제 (pp. 41/42 참조), 중성 엔도펩티다아제 억제제, 포스포디에스테라제-4 (PDE-4) 억제제 (pp. 42/43 참조), TNF알파 억제제, 무스카린 M1 수용체 안타고니스트 (p. 46 참조), NMDA 수용체 안타고니스트 (pp. 47/48 참조), 시그마-1 수용체 억제제, 히스타민 H3 안타고니스트 (p. 43 참조), 면역 조절제, 면역 억제제 또는 안테그렌(antegren) (natalizumab), 뉴레란(Neurelan) (fampridine-SR), 캠패스(campath) (alemtuzumab), IR 208, NBI 5788/MSP 771 (tiplimotide), 파클리탁셀(paclitaxel), Anergix.MS (AG 284), SH636, 디페린(Differin) (CD 271, adapalene), BAY 361677 (interleukin-4), 매트릭스-메탈로프로테이나제-억제제(matrix-metalloproteinase-inhibitor) (예: BB 76163), 인터페론-tau(interferon-tau) (trophoblastin) 및 SAIK-MS로부터 선택된 약제; 베타-아밀로이드 항체 (p. 44 참조), 시스테인 프로테아제 억제제 (p. 44 참조); MCP-1 안타고니스트 (pp. 44/45 참조), 아밀로이드 단백질 침착물 억제제 (42 참조) 및 베타 아밀로이드 합성 억제제 (p. 42 참조)를 포함하는 국제특허 WO2008/065141 (pp. 37/38 참조)에 기재되어 있으며, 이 문서는 참조로서 본원에 통합된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간화 항체 또는 키메라 항체 또는 이의 단편, 및/또는 치료 유효량의 생물학적 활성 물질을 포함하는 혼합물에 관한 것이다.

약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 보조제 및 부형제, 예를 들어 문헌 (Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2005)에 기재된 것과 같은 종래의 기술에 따라 처리될 수 있다.

화학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 보조제 및 부형제는 본 발명의 선택된 인간화 항체 및 선택된 투여 방식에 적합해야 한다. 약학적 조성물의 담체 및 다른 성분에 대한 적합성은 선택된 인간화 항체 또는 항원 결합에 대한 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 생물학적 성질에 대한 심각한 부정적 영향의 부재 (예를 들어, 실질적인 영향보다 적음 (10% 이하의 상대적 억제, 5% 이하의 상대적 억제 등))에 기초하여 결정된다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 희석제, 충전제, 염류, 완충제, 세정제 (예를 들어, Tween-20 또는 Tween-80과 같은 비이온성 세정제), 안정화제 (예를 들어, 당 또는 단백질-프리 아미노산), 보존제, 조직 고정제, 가용화제 및/또는 약학적 조성물에 포함시키기에 적합한 다른 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여 수준은 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 다양할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성 또는 그의 아미드, 투여 경로, 투여 시간, 특정 인간화 항체의 배설 속도, 사용된 특정 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 병력 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사 요인을 포함하는 약동학적 요인의 다양성에 의존한다.

약학적 조성물은 임의의 적합한 경로 및 형태로 투여될 수 있다. 생체 내 및 시험관 내에서 본 발명의 인간화 항체를 투여하는 적합한 경로는 당 업계에 잘 알려져 있으며 당업자에 의해 선택될 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여된다.

본원에서 사용되는 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"이라는 문구는 일반적으로 주사에 의한 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 표피, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 척수강 내, 피막 내, 안와 내, 심장 내, 피 내, 복강 내, 경혈, 피하 (subcutaneous), 피하 (subcuticular), 관절 내, 피막 하, 지주막 하, 척수 내, 두개 내, 흉강 내, 경막 외 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함할 수 있다.

일 실시양태에서, 약학적 조성물은 정맥 내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다.

약학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 인간화 항체와 생리학적으로 호환가능한 임의의 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장제, 항산화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 에탄올, 덱스트로스, 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물, 올리브유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 및 참기름과 같은 식물성유, 카르복시메틸 셀룰로오스 콜로이드성 용액, 트라가칸트 검 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르 및/또는 다양한 완충제를 포함한다. 다른 담체는 약학 분야에서 잘 알려져 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균된 수용액 또는 분산액 및 멸균된 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 그러한 매질 및 제제의 용도는 당 업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 배지 또는 제제가 활성화 인간화 항체와 양립 불가능한 경우를 제외하고는, 본 발명의 약학적 조성물에서 그의 용도가 고려된다.

적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 항산화제, 예를 들어 (1) 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트 및 알파-토코페롤 등과 같은 유용성 산화 방지제; 및 (3) 구연산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트제를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 또는 염화나트륨과 같은 등장성 제제를 조성물 중에 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 약학적 조성물의 저장 수명 또는 유효성을 향상시킬 수 있는 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 방부제 또는 완충제와 같은 선택된 투여 경로에 적합한 하나 이상의 보조제를 함유할 수 있다. 본 발명의 인간화 항체는 임플란트, 경피 패치 및 미세 캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어된 방출 제형과 같은 급속 방출에 대해 인간화 항체를 보호하는 담체로 제조될 수 있다. 이러한 담체는 젤라틴, 글리세릴모노스테아레이트, 글리세릴디스테아레이트, 에틸렌비닐아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생물 분해성, 생체 적합성 중합체 및 왁스 또는 당 업계에 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 상기 제제의 제조 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어있다. 문헌 (Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)을 참조한다.

일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 생체 내에서의 적절한 분포를 보장하도록 제형화 될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균된 수용액 또는 분산액 및 멸균된 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 그러한 매질 및 제제의 용도는 당 업계에 공지되어있다. 임의의 통상적인 배지 또는 제제가 인간화 항체와 양립 불가능한 경우를 제외하고는, 본 발명의 약학 조성물에서의 그의 용도가 고려된다.

주사용 약학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에서 무균 및 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로 에멀젼, 리포솜, 또는 고약물 농도에 적합한 다른 규칙 구조로 제제화 될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성유, 예를 들어 올리브유, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들면 당, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨과 같은 폴리알콜을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아린산 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 초래될 수 있다. 멸균 주사용 용액은 적절한 용매에 필요한 양의 인간화 항체를 성분들 중 하나 또는 조합물과 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 열거한 바와 같이, 필요에 따라 멸균 미세 여과를 수행한다. 일반적으로, 분산액은 인간화 항체를, 기본적인 분산 매질 및 필요한 다른 성분, 예를 들어 상기 열거된 것을 포함하는 멸균 비히클에 통합시킴으로써 제조될 수 있다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예는 활성 성분의 분말에 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 (동결 건조)를 첨가하는 것이다.

필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합물을 적절한 용매에 필요한 양으로 인간화 항체를 통합시킨 후 멸균 미세 여과를 실시하여 멸균 주사 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 인간화 항체를 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들 중 필요한 다른 성분을 함유하는 무균 비히클에 통합시킴으로써 제조될 수 있다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예는 활성 성분의 분말에 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 (동결 건조)를 첨가하는 것이다.

상기 치료 및 사용 방법에서 투약 요법은 최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단회 투여로 투여될 수 있고, 여러번 분할된 용량이 시간이 지남에 따라 투여될 수 있거나, 투여량은 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례하여 감소되거나 증가 될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이함 및 투여량의 균일성을 위해 투약 단위 형태로 제형화 될 수 있다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료될 개체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다; 각 단위는 요구되는 약학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 인간화 항체의 소정량을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 명세서는 (a) 인간화 항체의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 (b) 개체의 감수성을 치료하기 위한 그러한 인간화 항체를 합성하는 기술에 내재된 한계에 직접 결정됨에 의해 지시된다.

본 발명의 인간화 항체에 대한 유효 투여량 및 투여량은 치료될 질환 또는 상태에 의존하고 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 항체의 치료적 유효량에 대한 예시적인 비제한적인 범위는 약 0.1-10 mg/kg/체중, 예를 들어 약 0.1-5 mg/kg/체중, 예를 들어 약 0.1-2 mg/kg/체중, 예를 들어 0.1-1 mg/kg/체중, 예를 들어 약 0.15, 약 0.2, 약 0.5, 약 1, 약 1.5 또는 약 2 mg/kg/체중이다.

당 업계의 통상적인 기술을 가진 의사 또는 수의사는 필요한 약학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 원하는 치료 효과를 달성하고 원하는 효과가 달성될 때까지 점차적으로 투여량을 증가시키기 위해 요구되는 것보다 낮은 수준으로 약학적 조성물에 사용되는 8-AβpE3 항체의 투여를 시작할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 생성시키는데 가장 효과적인 최소 투여량인 인간화 항체의 양일 것이다. 그러한 유효 선량은 일반적으로 상기 설명된 요인들에 달려있다. 투여는 예를 들면. 정맥 내, 근육 내, 복강 내 또는 피하, 예를 들어 표적 부위의 근위에 투여될 수 있다. 필요에 따라, 약학적 조성물의 유효 일일 투여량은 하루 동안 적절한 간격으로 개별적으로 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 하위 투여량으로 투여될 수 있고, 선택적으로는 단위 투여형으로 투여될 수 있다. 본 발명의 인간화 항체는, 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 상기한 바와 같이 약학적 조성물로서 투여하는 것이 바람직하다.

실시예

1. N3pE - Aβ 특이적 인간화 항체를 생성하기 위한 인간화 접근법

N3pE-Aβ 특이적 마우스 단일 클론 항체인 클론 #6, #17 및 #24는 2008년 6월 17일자에 부다페스트 조약에 의거하여 기탁되었으며, Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) (Braunschweig, DE)에서 이용 가능한 하이브리도마 세포주 6-1-6, 17-4-3, 및 24-2-3로부터 획득하였고, 각 기탁 번호는 하기와 같다:

(클론 6-1-6): DSM ACC2924

(클론 17-4-3): DSM ACC2925

(클론 24-2-3): DSM ACC2926.

항체 클론 #6, #17 및 #24의 인간화 프로세스의 첫 번째 단계는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인에서의 CDR의 정의이다. Rosetta 항체 모델링 서버 (http://antibody.graylab.jhu.edu)에 의해 CDR이 예측되었다. 도 1은 클론 #6에 대해 예측된 CDR의 예를 나타낸다.

CDR-그라프팅에 적합한 프레임 워크를 선택하기 위해 비-인간 항체와 가장 높은 유사성을 갖는 인간 서열을 확인할 필요가 있다. 블라스트 분석에 의해, 경쇄 (Lv) 및 중쇄 (Hv)의 가변 도메인이 공개된 인간 서열의 풀(pool)과 개별적으로 피팅되었다. 경쇄의 경우, 카파 LC 클래스에 속하는 82%의 동일성을 갖는 인간 항체 서열이 발견되었다. 중쇄의 가장 높은 상동성은 62% 동일성을 갖는 인간 아미노산 서열을 갖는다.

선택된 인간 항체 프레임워크 서열을 생식 세포 유전자 서열로 그룹화하기 위해, 생식 세포 라이브러리 IMGT에서 블라스트 검색을 수행하였다. 경쇄 클론 #6 및 클론 #24의 경우, 서열 코드 IGKV2-30*01을 갖는 서열이 발견되었다. 클론 #17의 경쇄 가변 영역은 IGKV2-30*02와 가장 유사했다. 중쇄 가변 영역 코드는 클론 #6, 클론 #17 및 클론 #24에 각각 상응하는 IGHV1-3*01, IGHV1-69*13 및 IGHV3-48*01로 동정 될 수 있다. 표 1은 인간화 항체의 가변 영역의 프레임워크 파라미터를 나타낸다.

aa =아미노산 서열, acc nr. = 어세션 넘버, family = 유전자 패밀리

CDR 그라프팅에 의해 마우스 항체 클론 #6, #17 및 #24의 CDR은 각각의 인간 항체 프레임워크에 결합되어 인간화 항체를 생성하였다. 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역은 전체 항체를 재구성하는데 사용되었다. 경쇄 가변 도메인은 인간 κ 사슬 불변 영역에 융합되었다.

2. RNA 분리 및 cDNA 합성

일정한 서열의 원천으로서, 인간 B 세포의 RNA는 5 ㎖ 1x FACS 용해 용액 (Becton Dickinson)으로 실온에서 10분 동안 500 ㎕ 전혈을 용해시켜 분리하였다. 용해물은 300g에서 5분간 원심분리 하고; 펠릿은 PBS로 2회 세척한 후 Nucleo Spin ® RNA II (Macherey-Nagel)의 350 ㎕ RA1 버퍼에서 분해하고, 3.5 ㎕ 0.5 M TCEP (SIGMA)를 첨가하였다. RNA는 제조자의 지시에 따라 분리되었다. RNA 10 ㎕를 먼저 1 ㎕ 0.5 ㎍/㎕ OligodT 프라이머 (Invitrogen) 및 1 ㎕ 10 mM dNTP와 65℃에서 5분 동안 배양하였다. 그런 다음 5 X First Strand 버퍼 (Invitrogen) 4 ㎕, 100 mM DTT 2 ㎕ 및 SuperScript III 역전사 효소 (Invitrogen) 0.5 ㎕를 20 ㎕에 넣고, 25℃에서 5분간, 50℃에서 50분간, 70℃에서 15분간 배양했다. 표 2에 나타낸 프라이머 쌍을 이용한 PCR에 의해, 경쇄 및 중쇄의 불변 영역의 합성 cDNA를 증폭할 수 있었다. 표 2 불변 영역 복제를 위한 프라이머

인간화된 경쇄 클론 #6의 PCR 산물의 증폭을 위해 하기 정방향 및 역방향 프라이머:

RT_chim_humKl6f: CAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTG (서열번호 48);

RT_chim_humKl6r: GTACCTTGCACGCAGTAATAAAC (서열번호 49).

가 사용되었다.

참조 유전자 마우스의 증폭을 위해 HPRT 프라이머가 사용되었다.

증폭을 수행하기 위해, 7.5 ㎕ Sybergreen (Firma), 1 ㎕ 프라이머 전방 (25 pmol/㎕), 1 ㎕ 프라이머 후방 (25 pmol/㎕), 5.5 ㎕ ddH₂O 및 1 ㎕ cDNA를 사이클러에서 사용하였다.

3. LC 및 HC를 두 개의 상이한 발현 플라스미드로 개별적으로 클로닝함으로써 CHO 세포에서 재조합 항체의 발현

인간화된 항체의 경쇄 및 중쇄의 서열을 두 개의 상이한 포유동물 발현 벡터인 pCDNA3.1 및 HC-pOptiVEC에 각각 클로닝 하였다. CHO 세포 배양에서 재조합 항체를 발현시키기 위한 벡터의 최적 조합을 확인하기 위해, 상이한 플라스미드 조합이 부착 CHO 세포에서 일시적인 발현을 수행하기 위해 사용되었다. 두 번째 단계에서는 LC 및 HC 플라스미드 사이의 상이한 DNA 비율이 발현 수준에 영향을 미치는지 조사했다. 3 μg LC-pCDNA3.1 및 1 μg HC-pOptiVEC의 형질 감염으로 증가된 발현 수준이 발견되었다.

인간화된 항체의 추가적인 CHO 세포 발현을 위해, LC-pCDNA3.1 및 1 ㎍ HC-pOptiVEC의 플라스미드 조합 및 LC 3:1 HC의 플라스미드 DNA 비가 사용되었다.

Freesylte ™ CHO 현탁액 세포는 재조합 항체를 생성하는 보다 많은 양의 과도 발현 세포를 배양하기 위해 다음의 형질 감염에 사용되었다. 먼저, 과량의 LC 플라스미드가 부착 세포의 경우와 같이 항체 발현을 향상시킬 수 있는지 시험하였다. 부착 CHO 세포에서와 마찬가지로, 1:1 및 3.1의 LC 대 HC 플라스미드 DNA 비율이 사용되었다. 웨스턴 블랏 분석은 부착 CHO 세포의 경우와 같이 과량의 LC 플라스미드가 인간화 항체의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 세포 생존율 측정에 의해, 세포 생존율은 6일 후 형질전환된 세포의 약 50%로 감소한다는 것이 명백해졌다. 6일 후, 상층액 중의 항체 수준의 더 이상의 증가는 감지되지 않았다. 결과적으로, 배양 상층액은 이후의 형질감염의 경우 6일째에 수확하였다.

생산된 항체가 세포 상층액으로 효율적으로 수송되는지 조사하기 위해, 세포 용해물 샘플을 SDS PAGE에 적용하고, 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 비교 가능한 양의 세포 용해물 단백질을 SDS 겔에 참조 로딩하기 위해, 하우스 키핑 세포 단백질인 GAPDH를 사용하였다. CHO 세포를 발현하는 인간화 항체의 세포 용해물에서, 120 kDa의 강한 밴드가 세포 상층액에서 검출된 것과 동일한 크기로 이동한다.

4. 단백질 G 크로마토그래피에 의한 재조합 항체의 정제

인간화된 항체 클론 #6을 원래의 쥐 항체와 비교하여 단백질의 항원 결합 특성을 조사하기 위해 정제하였다. 따라서 발현된 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함하는 300 ml의 상층액을 단백질 G 크로마토그래피 (도 2)로 생성하고 정제했다. 발현된 항체의 양은 매우 적기 때문에, 총 25 ㎍의 정제된 단백질에서 수율은 0.1 μg/ml 미만이었다. 용출된 항체를 약 200 μg/ml로 농축하고, 쿠마시 염색 후 2 μg의 단백질을 SDS-PAGE에 적용하였다 (도 2).

5. 쥐 및 인간화 항체의 항원 결합을 비교하기 위한 표면 플라즈몬 공명 측정

표면 플라즈몬 공명 측정은 AβpE3-18에 대한 인간화 항체의 결합 효능을 조사하기 위해 사용되었다 (도 3). 측정 도중에 물질 전달 및 결합 활성 효과를 방지하기 위해, 이하의 절차가 사용되었다.

먼저, 반응 유니트가 1000 이상이 될 때까지 인간화 항체를 로딩한 후 SPR-Chip에 폴리클로날 α-인간 항체를 결합시켰다.

동력학적 측정은 AβpE3-18- 펩타이드의 상이한 농도 (5 내지 1000 nM)에서 수행하였다. 측정된 시리즈의 그래프는 센소그램이 있는 오버레이 플롯으로 표시되며, 상기 러닝 버퍼를 측정하는 상기 센소그램에 의해 보정되고, 주입시 정렬되고 기준선은 주입 전에 0으로 조정된다. 결과는 k_off 및 k_on 속도 상수를 향상시키는 간단한 1:1 상호 작용 모델 (Langmuir fit)에 따라 평가된다. 도 3에, 결합 및 해리 곡선으로 이루어진 SPR-결합 곡선이 나타난다.

1:1 Langmuir 피팅에 따른 겉보기 동력학적 상수를 표 3에 정렬하였다. 인간화 항체가 칩 표면에 비공유 결합되어 있기 때문에, 측정 중에 소량의 항체 분자가 씻겨 나갔다. 그러므로 Rmax 값은 모든 단일 센소그램에 대해 국소적으로 피팅시켰다.

펩타이드 결합 중의 곡선의 플롯 (도 3A, 상부 삽입도)은 매우 잘 맞는 반면, 펩타이드 해리 곡선의 플롯 (도 3A, 하부 삽입도)은 실험 곡선상에서 정확하게 국소화 되지 않는다. 피팅으로 동력학적 파라미터 22.2 10^-3 1/s의 k_off가 계산되었다 (표 2). 이 파마리터는 결합된 펩타이드의 절반을 제거하는 데 필요한 시간을 나타낸다. 이는 1/0.022s = 45s 동안 주입된 펩타이드의 절반이 제거됨을 의미한다 (도 3A, 하단 삽입도 참조). 해리 단계에서 Langmuir fit이 잘 일치하지 않기 때문에 K_D 결정은 하기식: R_equ = R_max·K_A·c/(1+K_A·c)을 사용하여 펩타이드 농도 (도 3B)에 대한 R_equ 값을 피팅하여 수행하였고, R_equ 대응하는 농도 c와 평형을 이루는 신호를 R_equ는 가변적이고, R_max 및 K_A 는 일정한 상수이다. K_D는 1/K_A로 계산할 수 있다.

마우스 Fab 단편 항체 클론 #6의 구조적 분석에 의해, HC 중의 Thr97이 AβpE3에 대한 결합 친화력에 중요한 영향을 미칠 수 있다고 결론지었다. 인간화 항체 클론 #6에서 Ala97을 Thr97으로 대체 한 후에, 마우스 항체 클론 #6과 비교하여 거의 동일한 KD 값으로 개선된 결합 친화도가 산출되었다. 추가적인 ITC 측정을 통해 이러한 결과를 증명하기 위해서는 더 많은 양의 발현된 항체가 필요했다. 따라서, 쥐 서열에 의한 인간화 항체 T97 변이체의 LC 및 HC 신호 서열의 대체에 의해 발현 수준이 증가되었다. 두 번째 단계에서는 항체 생성을 증가시키기 위해 안정한 세포주를 생성시켰다.

6. 인간화 항체 변이체 HC T97의 안정한 세포주 생성

안정한 세포주 발달을 위해서, 먼저 상이한 농도의 메토트렉세이트 (MTX)로 처리하여 안정한 CHO-DG44 세포주 풀을 생성시켰다. 최선의 발현은 0.5 μM MTX의 농도에서 소량으로 사멸되는 세포와 함께 검출되었다 (도 14A, lane2). 따라서, 0.5 μM MTX로 전처리한 세포는 희석을 제한함으로써 클론 선별에 사용되었다.

100개의 잠재적 항체를 발현하는 클론이 클론 선별 후 발견되었다. 이들 클론의 상층액을 HBS-EP 버퍼로 1:20으로 희석하고, AβpE3-18 결합 칩을 사용하여 SPR로 분석하였다. 검량선은 상층액 중의 항체 농도를 측정하는데 사용하였다. 18개의 클론은 분리되고, 발현 3일 후에 0.15 μg/ml 이상의 항체 농도를 나타냈다. 이들 클론을 24 웰 포맷으로 스케일 업하고, 상층액을 수집하여 웨스턴 블롯으로 분석 하였다 (도 4B). 이들 클론 중 5개는 양호한 발현을 나타내었고, 30 ml까지 추가로 스케일 업하고 진탕 배양하였다. 7일 발현 후, 발현 수준을 SPR에 의해 측정하였다 (도 4C). 클론 9A는 배양 7일 후에 가장 높은 항체 농도를 나타냈다. 따라서 이 클론은 상층액의 더 많은 양의 발현에 사용되었다. 보다 높은 세포 생존율을 얻기 위해 추가적인 선택 압력을 가하지 않고 배양을 실시했다. 3 리터의 항체 함유 상층액을 수집하였다.

7. 단백질 G 크로마토그래피에 의한 인간화 항체 클론 #6의 정제

1 리터의 상층액을 1 리터의 40 mM Na₂HPO₄ pH 7로 희석하고, 4℃에서 5 ml 단백질 G 칼럼에 밤새 적용하였다. 그 후 컬럼을 결합 버퍼 (20 mM Na₂HPO₄, pH 7, 분획 A1-A3)로 세척한 다음 고-염 버퍼 (2 M NaCl, 40 mM Na₂HPO₄ pH 7, 분획 A4-A7)로 세척하여 비특이적 결합 단백질을 제거하였다. 항체를 컬럼에서 0.1 M 글리신-HCl (pH 2.7)로 용출시키고, 1 M Tris pH 9로 즉시 중화시켰다. 분획을 수집하고, 24 ㎕를 12% SDS PAGE에 각각 로딩하였다. 분획 A12 + B1을 모으고, ITC에 의한 KD 결정에 사용하였다. 전체적으로, 2.5 ㎎ 항체를 1 리터 배양 상층액으로부터 정제하였다.

8. AβpE3 -18을 이용한 인간화 항체 클론 #6의 ITC 측정

K_D-값의 결정을 위해, 인간화 항체 클론 #6을 1 μM의 농도로 희석하였다. 20 μM 농도의 리간드 AβpE3-18을 293.15 K에서 적정하였다. ITC-측정의 미가공 데이터 (도 5B, 하단)의 통합 후, 1.5의 화학양론을 계산했다. 계산된 K_D-값은 높은 아핀 상호 작용으로서 용매에서 인간화 클론 #6 HC T97 리간드 결합을 특성화하는 SPR 데이터로부터 계산된 5.3 nM의 값과 굉장히 일치하는 2.7 nM이었다. 상호 작용은 주로 엔탈피 기여 (ΔH = -23.45 kcal/mol)에 의해 주도되고, 엔트로피 페널티 (TΔS = -11.96 kcal/mol)에 의해 반대되는데, 이것은 수소 결합의 형성에 의한 결합 부위에서의 구조적 재배치에 있어서 전형적인 것이며, 자유도의 유의미한 손실이다.

9. 두 개의 추가적인 AβpE3 -특이적 항체 클론 #17 및 클론 #24의 인간화, 발현 및 정제

두 개의 추가적인 AβpE3-특이적 항체 클론 #17 및 클론 #24의 인간화, 발현 및 정제는 클론 #6에서 사용된 실험 조건 뿐만 아니라, 동일한 프로토콜, 재료 및 방법을 사용하여 실시하였다.

10. 인간화 항체 클론 #24 및 클론 #17을 사용한 SPR 측정

pE3-Aβ18 리간드를 사용한 SPR 측정은, 두 인간화 항체 모두 pE3-Aβ 펩타이드에 결합할 수 있음이 밝혀졌다. 속도 상수 및 K_D 값은 Langmuir 1:1 모델 피팅에 의해 매우 잘 계산 될 수 있다. pE3-Aβ에 대한 마우스 항체의 오리진 KD 값을 표 5에 나타내었다. 인간화 항체 클론 #24의 k_off 값은 마우스 항체 클론 #24의 k_off 값보다 20배 더 높다는 것이 명백해졌다. 이는 인간화 후에 pE3-Aβ 펩타이드가 항체의 항원 결합 포켓으로부터 더 빨리 해리된다는 것을 의미한다.

11. Fc 감마 수용체에의 결합

서열번호 73의 인간 IgG1 Fc 야생형 영역 또는 이의 K322A 돌연변이 변이체 (서열번호 74)가 포함된 두 항체의 결합을 상이한 Fc 감마 수용체 (CD16A, CD32A, CD32B 및 CD64)에 대해 비교하였다.

K322A 돌연변이는 부위-특이적 변이에 의해 생성되었다. 결합은 전장의 인간 CD16A, CD32A, CD32B 또는 CD64를 안정적으로 발현하는 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese Hamster Ovary: CHO)에 대한 FACS 기반의 생물 검정에서 측정되었다. 두 항체를 1간 동안 7개의 상이한 농도에서 각 세포주에 대해 배양하고, 이어서 세척하였다. 수용체-결합된 H6 또는 H67이 형광 색소 결합-항-Fab'로 검출되었다. 결합 능력은 FACS에 의해 측정되었고, Kd 및 Bmax는 비-선형 반전에 의해 계산되었다.

결과: 두 항체 모두 모든 수용체에 대해 유사한 결합을 보였다. 도 6, 7, 8 및 9 참조.

12. C1q에의 결합

서열번호 73의 인간 IgG1 Fc 야생형 영역 또는 이의 K322A 돌연변이 변이체 (서열번호 74)가 포함된 두 항체의 결합을 항체의 이펙터 기능을 보다 특징화 하기 위해 C1q에 대해 비교하였다.

C1q에 대한 항체의 결합에 대한 여러 분석 형식이 시험되었고, 하기를 포함한다:

a) 두 개의 항체가 플레이트에 직접 결합된 후, 용액에서 C1q에 결합; 및

b) 스트렙타아비딘 코팅된 플레이트를 먼저 비오틴화 된 pE-Aβ 펩타이드로 먼저 배양한 후, 항체에 결합시킨 다음 C1q에 결합시킴.

요약하면, 형식 a)은 최상의 결과를 산출했다. 절차는 다음과 같이 요약된다:

ELISA 플레이트를 서열번호 73의 인간 IgG1 Fc 야생형 영역, 이의 K322A 돌연변이 변이체 (서열번호 74) 및 K322A 대조군 (hu14.18K322A)을 포함하는 항체로 코팅하고, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1 및 0 μg/ml에서 C1q를 3배로 결합시키지 않고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 플레이트를 1% BSA로 3회 세척 한 다음, 50 ㎕/웰에서 1X PBS 중의 1% BSA로 차단하였다. C1q (Sigma, Cat. # C1740)을 각 웰에 블로킹 완충액 2 μg/ml을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 플레이트를 200 ㎕의 1x PBS로 3회 세척하였다. 항-C1q-HRP (Thermo, Cat. # PA1-84324)를 첨가하여, 블로킹 완충액 (50 ㎕/웰)에서 1:250으로 희석하여 결합을 1시간 동안 검출하였다. 플레이트를 다시 200 ㎕의 1x PBS로 3회 세척하였다. 50 ㎕의 TMB (Invitrogen, Cat. # 002023)를 각 웰에 첨가하여 2분 동안 상호 작용을 시각화하였다 (Invitrogen, Cat. # 002023). 정지 용액 (1 M 황산) 50 ㎕를 각 웰에 첨가한 후, 450 nm에서의 흡광도를 읽었다.

결과: 서열번호 73의 인간 IgG1 Fc 야생형 영역을 포함하는 항체는 C1q에 결합하였다. 이의 K322A 돌연변이 변이체 (서열번호 74의 IgG1 Fc 영역을 포함하는)는 C1q에 결합하지 않았다. 도 10 참조.

13. 면역 조직 화학

IHC를 이용하면 항원 Aβ N3pE는 뇌 조직 절편에 국재화 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 인간화 항체를 Aβ N3pE의 검출에 사용하였다.

AD 환자의 해마 및 전두엽 피질의 IHC 인간 대뇌 조직 절편, 및 본원에 기재된 알츠하이머병에 대한 기존 동물 모델의 해마 대뇌 조직 절편을 사용할 수 있다. 이 마우스 모델은 증가된 뇌 Aβ 수준을 나타내고, 이어서 신경반 발생을 보여준다. 조직 절편은 파라핀-포매되었고, 연속 절단되었다. 세포의 핵을 착색시키기 위해 절편을 헤마톡실린으로 염색한 다음, 본 발명의 항 Aβ N3pE 항체로 면역 염색시켰다. 조직 절편 제조 및 염색은 표준 방법론에 따라 실시하였다.

14. 생체 내 알츠하이머 마우스의 치료

본 연구에서는 총 62마리의 수컷 마우스를 이용하였다. 예방 접종을 시작하기 전에, 치료 개시시 대뇌 Aβ 플라크 부하를 평가하기 위한 기준 대조군으로서 알츠하이머병 (평균 5.6개월±0.45)을 가진 기존의 마우스 모델 4마리를 희생시켰다. 나머지 마우스를 4그룹으로 나누어 다음 치료를 받았다: 250 ㎕의 멸균 PBS (n=12, 평균 5.89개월±0.13), 본 발명의 인간화 항체 200 μg. 연령 및 성별이 일치하는 Wt littermate 그룹에 250 ㎕ PBS (n=12, 평균 5.80개월±0.12)를 주사하여 행동 제어군으로 사용하였다. 마우스에 28주 동안 복강 내 주사를 통해 총 250 ㎕ (항체 또는 PBS)를 처리하였다.

안락사 및 조직 제조

생후 6개월 (기준선) 또는 13개월 마우스를 안락사시키고 관류하여 혈장을 수확하였다. 뇌를 시상적으로 분리하고 추출하였다. 해마, 피질 및 소뇌를 한쪽 반구에서 절개하고 생화학 분석을 위해 급속 동결시켰다. 다른 반구를 4% 파라포름 알데하이드 (전자 현미경 과학)에서 4℃에서 24시간 동안 드랍-고정시키고, 4℃에서 등급화된 수크로스 용액으로 동결 보존하고, OCT 화합물 (Tissue Tek)에 포매시켰다.

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SEQUENCE LISTING <110> PROBIODRUG AG <120> ANTI-PYROGLUTAMATED AMYLOID BETA HUMANIZED ANTIBODIES <130> IPA171428-DE <150> US 62/193,356 <151> 2015-07-16 <150> US 62/209,650 <151> 2015-08-25 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Human <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> Human <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 3 <211> 38 <212> PRT <213> Human <400> 3 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly 35 <210> 4 <211> 40 <212> PRT <213> Human <400> 4 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 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Variant <222> (7)..(7) <223> Xaa is Gly, Thr, Ala or Glu <220> <221> Variant <222> (16)..(16) <223> Xaa is Lys and Gln <400> 19 Leu Ile Asn Pro Xaa Asn Xaa Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Xaa 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 20 Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Ile Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 22 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn 1 5 10 <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 23 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 24 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 25 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His Thr Met Asn 1 5 10 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 26 Leu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 29 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 30 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 31 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 32 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Tyr Asp Asn Ile Leu Asp Tyr Val Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 33 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Ala 1 5 10 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 34 Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Thr 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 35 Tyr Asp Tyr Asp Asn Ile Leu Asp Tyr Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 36 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 36 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Val Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 37 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 38 Val Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 39 Val Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 40 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 41 Gly Tyr Ile Phe Asn Asn Tyr 1 5 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 42 Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 43 Glu Gly Tyr Ile Val Tyr 1 5 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 44 actgtggctg caccatctgt cttc 24 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 45 ctaacactct cccctgttga agctc 25 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 46 agggaaccct ggtcaccgtc tcc 23 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 47 tcatttaccc ggagacaggg agagg 25 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 48 caagtcagag cctcttatat agtg 24 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 49 gtaccttgca cgcagtaata aac 23 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 50 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 51 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 52 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 1 5 10 15 Val <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 53 Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 54 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 1 5 10 15 <210> 55 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 55 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 <210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 56 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 57 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His 1 5 10 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 58 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 59 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 60 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu 1 5 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 61 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 62 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly 1 5 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 63 Glu Phe Arg His Asp Ser 1 5 <210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 64 Glu Phe Arg His 1 <210> 65 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 65 Glu Phe Arg 1 <210> 66 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 66 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Thr Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 67 Leu Ile Asn Pro Ser Asn Thr Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 68 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 68 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Ala Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 69 Leu Ile Asn Pro Ser Asn Ala Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 70 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Glu Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 71 Leu Ile Asn Pro Ser Asn Glu Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 72 Glu Phe Arg His Asp 1 5 <210> 73 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Glu Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 74 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 74 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Glu Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys

Claims

인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
상기 인간화 항체가 AβN3pE 에피토프의 N-말단을 가지는 피로글루타메이트에 특이적으로 결합하며, AβN3pE 에피토프는 Aβ의 아미노산 서열에서 3번 위치의 글루탐산 잔기에서 시작하는 Aβ의 N-말단 절단된 형태를 지칭하며, 상기 글루탐산 잔기는 피로글루탐산 잔기 형태로 고리화되며,
상기 항체의 경쇄 가변부는 아미노산 서열:
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLAYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK (서열번호 13), 및
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK (서열번호 14)
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지며,
상기 서열번호 13 및 서열번호 14의 경쇄 가변부가 하기 CDR 영역:
V_L CDR1: KSSQSLLYSDGKTYLN (서열번호 12),
V_L CDR2: LVSKLDS (서열번호 9), 및
V_L CDR3: VQGTHFP (서열번호 10);
을 포함하며,
상기 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 가변부가 하기 CDR 영역:
V_H CDR1: GYSFTGHTMN (서열번호 25),
V_H CDR2: LINPSNGVTRYNQKFQG (서열번호 26), 및
V_H CDR3: EAKREWDETY (서열번호 20)
을 포함하는 것인, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서, 경쇄 가변부가 아미노산 서열:
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLAYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK (서열번호 13)
로 이루어진 것인, 인간화 항체.
제1항에 있어서, 경쇄 가변부가 아미노산 서열:
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK (서열번호 14)
로 이루어진 것인, 인간화 항체.
제1항에 있어서, 중쇄 가변부가 아미노산 서열:
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTAVYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS (서열번호 24)
로 이루어진 것인, 인간화 항체.
제1항에 있어서, 중쇄 가변부가 아미노산 서열:
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS (서열번호 27)
로 이루어진 것인, 인간화 항체.
제1항에 있어서, 경쇄 가변부는 아미노산 서열:
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK (서열번호 14)
로 이루어지고,
중쇄 가변부는 아미노산 서열:
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS (서열번호 27)
로 이루어진 것인, 인간화 항체.
제1항에 있어서, 인간 IgG1 Fc 영역을 갖는, 인간화 항체.
제7항에 있어서, 인간 IgG1 Fc 영역이 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 인간화 항체.
제7항에 있어서, 경쇄 가변부가 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지고; 중쇄 가변부가 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지고; 인간 IgG1 Fc 영역이 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 인간화 항체.
제1항에 있어서, 상기 인간화 항체가,
pEFRHDSGYEVHHQKLV (서열번호 50)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인, 인간화 항체.
제1항에 있어서, 상기 인간화 항체가 N-말단에 피로글루타메이트를 갖지 않은 에피토프에 결합하지 않는 것인, 인간화 항체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제를 포함하는, 아밀로이드증 치료용 약학 조성물.
제12항에 있어서, 중성자-전달 증강제 (neutron-transmission enhancer), 아세틸콜린 에스테라아제 억제제 (acetylcholine esterase inhibitor), 칼슘-채널 차단제 (calcium-channel blocker), 생원성 아민 (biogenic amine), 벤조디아제핀 진정제 (benzodiazepine tranquillizer), 아세틸콜린 합성제 (acetylcholine synthesis), 저장 또는 방출 증강제 (storage or release enhancer), 모노아민 산화효소-A 또는 -B 억제제 (monoamine oxidase-A or -B inhibitor), N-메틸-D-아스파테이트 글루타메이트 수용체 안타고니스트 (N-methyl-D-aspartate glutamate receptor antagonist), 비-스테로이드성 항염증제 (non-steroidal anti-inflammatory drug), 산화 방지제 (antioxidant) 및 세로토닌성 수용체 안타고니스트 (serotonergic receptor antagonist)로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성 물질을 더 포함하는, 약학 조성물.
제12항에 있어서, 금속 킬레이트, DNA 회복 억제제, 3-아미노-1-프로판술폰산, 1,3-프로판디술폰산염, α-세크레타제 활성제, β- 및 γ-세크레타제 억제제, β-시트 브레이커, 아밀로이드 베타 클리어링/고갈 세포 성분용 유인 물질, 피로글루타메이트화된 아밀로이드 베타 3-42 억제제, 및 콜린에스테라제 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성 물질을 더 포함하는, 약학 조성물.
제12항에 있어서, 피렌제핀, 글루타미닐 시클라제 억제제, 타크린, 리바스티그민, 도네페질, 및 갈란타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성 물질을 더 포함하는, 약학 조성물.
제13항에 있어서, 콜린에스테라제 억제제, 메만틴, 및 글루타미닐 시클라제 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성 물질을 더 포함하는, 약학 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제를 포함하는, 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 신경퇴행성 질병의 치료를 위한, 약학 조성물.
제17항에 있어서, 알츠하이머병 (AD)은 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD)인, 약학 조성물.
제18항에 있어서, 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD)는 가족성 영국형 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크형 치매 (FDD)인, 약학 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체를 포함하는, 아밀로이드증의 진단에 사용하기 위한 진단 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체를 포함하는, 아밀로이드증의 진단에 사용하기 위한 진단 키트.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체를 포함하는, 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 신경퇴행성 질병의 진단에 사용하기 위한, 진단 조성물.
제22항에 있어서, 알츠하이머병 (AD)은 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD)인, 조성물.
제23항에 있어서, 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD)는 가족성 영국형 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크형 치매 (FDD)인, 조성물.
제12항에 있어서, 인간화 항체 또는 약학 조성물의 투여가, 경도 인지 장애 (MCI), 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군에서의 신경 퇴행 및 임상 또는 전-임상 뇌 아밀로이드 혈관병증으로 진단된 개체에서 인지 저하의 반전, 인지 개선 또는 인지 저하의 예방을 유도하는 것인, 약학 조성물.
제25항에 있어서, 알츠하이머병 (AD)은 산발적 알츠하이머병 (SAD) 또는 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD)인, 약학 조성물.
제26항에 있어서, 가족성 알츠하이머형 치매 (FAD)는 가족성 영국형 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크형 치매 (FDD)인, 약학 조성물.
제12항에 있어서, 인간화 항체 또는 약학 조성물의 투여가, 아밀로이드 플라크로부터 Aβ N3pE의 클리어런스 또는 제거를 유도하는 것인, 약학 조성물.
제12항에 있어서, 인간화 항체 또는 약학 조성물의 투여가, 영향을 받는 조직으로부터 아밀로이드 플라크 로드의 감소 및/또는 완전한 아밀로이드 플라크의 제거를 유도하는 것인, 약학 조성물.
제29항에 있어서, 영향을 받는 조직은 뇌 조직인, 약학 조성물.
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