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KR102764707B1 - 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법 - Google Patents

3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법 Download PDF

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KR102764707B1
KR102764707B1 KR1020220050737A KR20220050737A KR102764707B1 KR 102764707 B1 KR102764707 B1 KR 102764707B1 KR 1020220050737 A KR1020220050737 A KR 1020220050737A KR 20220050737 A KR20220050737 A KR 20220050737A KR 102764707 B1 KR102764707 B1 KR 102764707B1
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윤재승
김도희
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Abstract

본 발명은 기존에 널리 사용되는 세포 배양액 교체법에 의해 발생되는 세포 응집체의 유실을 최소화할 수 있는 새로운 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법을 제공하는 것으로, 보다 상세하게는 개구부, 다공성 박막 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버, 및 상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하며, 하단에 유체 배출구가 포함된 하부 챔버를 포함하며, 상기 상부 챔버의 상부로 유입된 유체는 상기 상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부 챔버의 배출구를 통해 배출되어 유동되는, 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법을 제공한다.

Description

3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법{3D cell aggregate culture apparatus and 3D cell aggregate culture method using the same}
본 발명은 3차원 세포 응집체의 분화 및 배양에 활용할 수 있는 마이크로웰 플랫폼에 관한 것이며, 세포 응집체의 유실을 감소시킬 수 있고 다공성 마이크로웰 및 이를 수직 투과하는 세포 배양액의 유동에 기초함으로 인해 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변 미세환경을 제공하는 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 활용한 3차원 세포 응집체 배양 방법에 관한 것이다.
실제 몸 속의 세포는 3차원의 형상이며, 이러한 세포는 세포의 미세환경과도 3차원적으로 상호작용 한다. 한편, 세포 배양 시 종래의 기술과 같이 체외에서 세포를 3차원 구조가 아닌 2차원의 단일 층(Monolayer)으로 배양할 경우 체내의 세포와 형태적인 측면에서 유사성이 크게 결여 되며, 3차원 배양하는 경우 약물 스크리닝(Drug screening) 및 세포 치료제(Cell therapy)로 활용 시 실제 생체 내 현상과 보다 유사한 현상을 확인할 수 있다.
이와 같이, 상기와 같은 2차원 단일 층 세포배양의 한계를 극복하기 위해, 3차원 세포 응집체(3D cell aggregation) 배양 및 분화가 가능한 마이크로웰 플랫폼에 대한 요구가 전 세계적으로 증가하고 있으며, 다만 이와 같은 마이크로 웰 플랫폼 상에서 3차원 세포 응집체를 약물 스크리닝 및 세포 치료제로 활용 하기 위해서는 성숙화 과정이 필수적이며, 이러한 기간은 일반적으로 수 주 또는 수 개월이 소요되므로, 이 기간 동안 반복적인 세포 배양액 교체가 요구된다.
상술한 세포 배양액 교체 시 일반적으로 사용되는 방법은 마이크로 웰의 상면인 세포 배양면의 상부에서 파이펫팅을 수행하여, 대사물이 포함되어 있는 사용된 세포 배양액은 수거하고 신선한 세포 배양액을 주입 하는 것인데, 이와 같은 방법의 경우 세포 배양액 교체 과정에서 세포 응집체의 유실이 발생할 수 있으며, 이와 같은 유실은 실험의 최초 설계와 실험 결과 간의 격차를 유발하게 된다. 또한, 일반적으로 세포 응집체 배양 과정에서 파이펫팅은 24시간 또는 48시간의 간격으로 수행되는데, 파이펫팅 수행 직후의 신선한 세포 배양액은 충분한 환경을 제공하지만 이에 비하여 다음 파이펫팅 직전의 세포 응집체 주변 환경은 영양분이 충분 하지 못한 한계점이 존재한다.
한편, 등록특허 제10-1403536호와 같이 유동을 이용하여 노폐물을 배출하고 영양분을 공급하는 세포 배양 시스템에 대한 연구가 수행되고 있기는 하나, 이는 마이크로웰 플렛폼이 아니기 때문에 다수의 3차원 세포 응집체를 생산하기에는 적합하지 못하는 단일의 3차원 세포 응집체 밖에 생산하지 못하는 한계점이 있다.
따라서, 세포 배양액 교체 과정에서 세포 및 세포 응집체의 유실을 감소시킬 수 있는 배양 방법과 이와 동시에 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변 미세환경을 제공할 수 있는 기술이 제공되는 경우 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 기존에 널리 사용되고 있는 반복적인 세포 배양액 교체를 위해 마이크로 웰의 상면인 세포 배양면에 대한 파이펫팅에 의해 발생되는 세포 및 3차원 세포 응집체 유실 등을 최소화하며 이와 동시에 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변환경을 제공 할 수 있는 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 있어서, 본 발명은 개구부, 다공성 박막 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버; 및 상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하는 하부 챔버를 포함하며, 상기 상부 챔버의 상부로 유입된 유체는 상기 상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부 챔버로 유입되고, 하부 챔버의 유체는 배출되어 유체가 유동되는, 3차원 세포 응집체 배양 장치를 제공한다.
본 발명의 다른 견지에 있어서, 본 발명은 상기 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치를 이용하여, 상부 챔버의 다공성 박막 상에 세포를 접종하는 단계; 세포 배양액을 상부 챔버의 상부로 개구부를 통해 투입하는 단계; 및 상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 하부 챔버로 유입된 세포 배양액을 하부 챔버로부터 배출하는 단계를 포함하는, 3차원 세포 응집체 배양 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 세포를 배양하는 과정 중 세포 및 세포 응집체의 유실 가능성을 현저히 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변 미세환경을 제공 할 수 있다. 또한 배양액 저장소의 높이는 하부 챔버 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정하여 배양 과정에서 배양액의 높이를 일정하고 유지할 수 있다.
또한, 투수계수(Hydraulic conductivity)가 매우 우수한 다공성 마이크로웰을 사용하여 다공성 마이크로웰 및 그 내부에서 배양중인 3차원 세포 응집체에 인가되는 수압을 최소화 하여 유동의 흐름 외의 불필요한 자극을 최소화 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치를 나타낸 것으로, 도 1(a)는 세포 배양 장치의 전체적인 형태를 나타내며, 도 1(b)는 하나의 상부 챔버 및 하부 챔버의 조합을 확대하여 나타낸 것이고, 도 1(c)는 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치의 개략도를 나타낸 것으로, 배출구와 연결된 배양액 저장소를 포함하는 경우의 단면도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 예시적인 세포 배양장치에서 다공성 박막을 통해 투과되는 배양액의 흐름을 유동 관련 시뮬레이션 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치에 있어서 다공성 박막이 오목부를 구비하는 형태로 구성된 다공성 마이크로웰의 현미경 사진을 나타낸다. 도 3(a)는 4배, 도 3(b)는 220배의 배율로 확대한 이미지이다. 도 3(c)는 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치에 있어서 다공성 박막이 오목부를 구비하는 또 다른 형태로 구성된 다공성 마이크로웰의 사진을 나타내는 것으로, 도 3 (c) a)는 DSLR 카메라, 도 3(c) b) 와 (c) c)는 각각 4배와 20배의 배율로 확대한 현미경이미지이다. 도 4는 전기 방사 시간에 따른 다공성 박막의 나노섬유 네트워크의 구조 및특성 변화를 나타낸다. 보편적인 상용 다공성 멤브레인인 8 μm 공극 사이즈의 Transwell insert (Corning, USA) 제품의 멤브레인을 참조를 위해 함께 첨부하였다(가장 좌측, TW). 도 4(a)는 상용 멤브레인, 전기방사 시간 변화에 따른 각 나노섬유 네트워크 구조를 20배의 배율로 확대한 현미경 이미지이다. 도 4(b), (c) 및 (d)는 상용 멤브레인과 전기방사 시간에 따른 각 나노섬유 네트워크 구조의 공극률(Porosity)(도 4(b)), 투수계수(Hydraulic conductivity)(도 4(c)), 및 수압(Induced pressure)을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치를 사용할 경우의 세포 응집체 유실 정도와 종래 파이펫팅에 의한 세포 배양액 교체 방법을 통해 세포를 배양할 경우의 세포 응집체 유실 정도를 비교한 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치를 사용할 경우의 세포 응집체 주변 영양분 농도(Glucose concentration)와 종래 파이펫팅에 의한 세포 배양액 교체 방법을 통해 세포를 배양할 경우의 세포 응집체 주변 영양분 농도를 수치 시뮬레이션을 통해 비교한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치에 존재하던 유체가 새롭게 주입되는 유체로 원활하게 교체되며, 이러한 과정에서 하부 챔버 내 배양액의 수위가 일정하게 유지 되는 것을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치에 사용되는 다공성 마이크로웰을 제조 하는 방법을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치에 사용되는 하부챔버(a)와 하부챔버 내부에 삽입된 상부챔버(b)를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 상부 챔버의 하면을 이루는 다공성 박막이 오목부를 구비하도록 형성된 예시적인 형태를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 11은 상부 챔버와 하부 챔버의 사이의 간극 영역을 통해 유체가 배출되도록 하여 유체의 흐름을 형성하는 과정이 사진(a), 도식적으로 나타낸 이미지(b) 및 이 경우 형성되는 유체의 유속(c)을 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면 세포를 배양하는 과정에서 마이크로웰 상부에서 파이펫팅을 통해 사용된 세포 배양액을 제거하고 새로운 세포 배양액을 주입하는 기존 세포 배양액 교체법을 사용하여 세포를 배양 및 분화하는 경우, 파이펫팅에 의한 배양액 유동에 의해 세포 및 세포 응집체의 유실이 발생할 수 있는 문제를 해결할 수 있는 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 배양 방법이 제공된다. 또한 지속적으로 다공성 마이크로웰을 투과하여 유도되는 세포 응집체 주변의 유동에 의해 영양분과 같은 균일한 세포 미세 환경의 구현이 가능한 세포 응집체 배양 방법이 제공된다.
따라서, 본 발명에 의하면 배양 과정에서 상기와 같은 세포의 유실을 최소화할 수 있으며 이와 동시에 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변 미세 환경을 유도하여, 2차원 배양에 비하여 생체 내 현상과 더욱 유사한 현상을 나타내는 3차원의 세포 응집체를 배양할 수 있는 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치는 개구부, 다공성 박막 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버; 및 상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하는 하부 챔버를 포함하며, 상기 상부 챔버의 상부로 유입된 유체는 상기 상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부 챔버로 유입되고, 하부 챔버의 유체는 배출되어 유체가 유동되는 것이다.
또한, 본 발명은 상술한 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치를 이용하여, 상부 챔버의 다공성 박막 상에 세포를 접종하는 단계; 및 세포 배양액을 상부 챔버의 상부로 개구부를 통해 투입하는 단계를 포함하는, 3차원 세포 응집체 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치는 상부 챔버의 상부로 유입된 유체가 상기 상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부 챔버로 유입되고, 나아가 하부 챔버의 유체는 배출되어 유체가 유동되도록 하는 것으로, 이때 상기 하부 챔버의 유체는, 하부 챔버에 구비된 유체 배출구를 통해 배출되거나 또는 상부 챔버와 하부 챔버의 사이의 간극 영역을 통해 배출되는 것일 수 있으며, 예를 들어 상기 간극 영역의 상부 측을 통해 배출되는 것일 수 있다.
상기 유체 배출구는 하부 챔버의 어떠한 위치에서도 형성될 수 있으며, 예를 들어 도 1(c)와 같이 하부 챔버 하단에 구비될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 하부 챔버에 이와 같은 유체 배출구가 구비되지 않는 경우 도 11(a) 내지 도 11(c)와 같이 상부 챔버와 하부 챔버의 사이의 간극 영역을 통해 유체가 배출되도록 하여 유체의 흐름을 형성할 수 있다. 이때 상부 챔버와 하부 챔버의 사이의 간극 영역이 존재하기 위해 상부 챔버와 하부 챔버의 각 측면의 벽 사이에 간극이 존재하도록 각 챔버의 사이즈를 조절할 수 있으며, 이들 사이의 간극 영역에서 공기와 접하는 계면의 상부로부터 유체가 배출되도록 할 수 있다.
상기 다공성 마이크로웰은 복수개의 고분자 나노섬유가 무작위로 얽혀짐으로써 이루어진 다공성 박막을 하단에 포함하며, 상기 다공성 박막은 나노섬유 네트워크로 이루어진 것 일 수 있는 것으로, 이에 따라, 상기 나노섬유들의 사이 영역에 형성된 다수의 공극을 포함할 수 있는 것이다.
바람직하게 상기 다공성 박막은 나노섬유 네트워크로 이루어진 것으로, 공극률이 20 % 내지 60 %의 다공성 박막인 것이며, 예를 들어 공극률이 30 % 내지 50 % 의 다공성 박막일 수 있다. 상기 공극률이 20% 미만인 경우에는 투수 계수가 낮아지고, 이에 따라 다공성 박막에 가해지는 수압이 증가함으로써, 다공성 박막상에 배양 중인 세포 응집체의 생존률이 저하되는 문제를 발생시킬 수 있다.
이때, 상기 다공성 박막은 10 nm 내지 10 μm의 평균 공극의 입경 크기를 가질 수 있다. 즉, 상기 다공성 박막은 상기와 같은 범위의 평균 공극의 크기를 포함하므로, 단일 세포들은 투과시키지 않으면서 세포 배양액 내 영양분, 성장인자 등의 타 물질들은 선택적으로 투과시키는 선택적 투과막으로 작용할 수 있다. 이로 인해 다공성 박막 상에서 단일 세포의 응집을 유도하여 3차원 응집체 형성을 가능하게 하며, 응집체 형성 후에는 물질 이동 장벽 및 통로의 역할을 수행할 수 있다.
이때, 상기 유체가 투과되는 다공성 박막은 상술한 본 발명의 공극률 및 평균 공극의 입경 크기 범위 내에서 높은 투수계수의 특성을 보유 할 수 있다. 본 발명의 상기 다공성 박막은 1 내지 20 μm s-1의 투수계수(Hydraulic conductivity)를 갖는 것이다. 상기 투수 계수가 1 μm s-1 미만인 경우에는 다공성 박막에 높은 수압이 야기되며, 1000Pa 이상의 수압이 다공성 박막 및 박막 상에 배양 중인 세포 응집체에 인가될 수 있으며, 이와 같은 경우 세포의 생존률을 저하시키는 등의 악영향이 예상된다.
본 발명의 다공성 박막은 세포 배양용 나노섬유 네트워크인 것으로, 이의 제조 방법은 특히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 전기 방사에 의해 형성되는 고분자 나노섬유로 이루어진 것일 수 있다.
이때, 상기 고분자 나노섬유는 예를 들어 열가소성 수지, 열경화성 수지, 탄성 중합체 및 생체 고분자 중 적어도 하나 이상을 포함하는 고분자 수지로 이루어진 것일 수 있으며, 예를 들어 폴리카프로락톤(Polycaprolactone), 폴리우레탄(Polyurethane), 폴리비닐리덴 플로라이드 (Polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리스티렌(Polystyrene), 콜라겐(Collagen), 젤라틴(Gelatin), 및 키토산(Chitosan) 중 적어도 하나 이상을 포함하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 나노섬유 네트워크의 제조 방법은 예를 들어 폴리카프로락톤을 4 내지 10 wt% 농도가 되도록 클로로포름/메탄올(3/1 vol/vol) 혼합물의 용매에 용해한 용액을 전기방사하는 단계에 의해 획득되는 것일 수 있다.
한편, 상기 전기 방사는 10 내지 30 kV 전압 하에서 0.1 내지 2.0 ml hr-1의 고분자 용액의 토출 속도로 수행되는 것이 바람직하며, 전압이 상기 범위 미만인 경우에는 균일한 나노섬유 제조에 문제가 있고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 나노섬유의 적층이 불균일해 지는 등 안정적인 나노섬유 제조에 문제가 있을 수 있다.
상기 다공성 마이크로웰은 하부 방향으로 오목하게 형성된 함몰부의 전체 또는 일부분이 다공성 박막일 수 있으며, 바람직하게는 다공성 마이크로웰, 즉 상부 챔버의 개구부가 위를 향하도록 배치하는 경우 바닥을 형성하는 면이 다공성 박막으로 형성된다.
한편, 상기 본 발명의 상부 챔버의 하면을 이루는 다공성 박막은 돌출부 및/또는 오목부를 구비하도록 형성될 수 있다. 예를 들어, 도 10과 같이 다공성 박막을 이용하여 오목부를 형성하거나, 또는 도 8과 같이 다공성 박막 상에 오목부에 상응하는 구획을 형성할 수 있는 측벽 또는 돌출부를 추가로 부가하여 오목부를 형성할 수 있으며, 이때 측벽 또는 돌출부의 재질은 다공성이거나 또는 다공성이 아닐 수 있는 것으로 특히 제한되지 않는다. 바람직하게는 오목부의 하면은 다공성 박막인 것이며, 측벽 또는 돌출부는 다공성이거나 또는 다공성이 아닐 수도 있다. 예를 들어 도 3(a) 및 도 3(b)는 관통 구멍이 형성된 추가의 층을 적층함으로써 오목부의 측벽이 다공성 재질이 아닌 경우의 형태를 나타낸 예시이며, 도 3(c)는 다공성 박막 자체에 오목부가 형성된 것으로 오목부 및 오목부가 아닌 부분이 전체적으로 모두 다공성인 재질인 경우이다.
상기 다공성 마이크로웰은 예를 들어 도 8에 나타낸 바와 같이 전기 방사로 제작된 다공성 박막을 쓰루홀 (Thru-hole)의 배열과 결합하여 제조 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 도 3(c)와 같이 다공성 재질의 오목부 및 돌출부 형성은 예를 들어 도 10과 같이 몰드를 활용한 압축 공정을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 다공성 마이크로웰의 다공성 박막의 상면은 세포 배양층으로 작용하는 영역으로, 상술한 바와 같이 다공성 박막이 돌출부 및 오목부를 구비하는 경우에는 형성된 오목부에 세포가 더욱 용이하게 안착하게 되며, 상기 다공성 마이크로웰 내에서 단일 세포의 응집을 유도하여 3차원 세포 응집체가 안정적으로 형성된 후 배양 될 수 있게 된다. 보다 바람직한 본 발명의 다공성 박막은 돌출부 및 오목부를 구비하며, 모든 면이 다공성 박막으로 이루어진 것이다.
한편, 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치의 상기 하부 챔버는 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하며, 하부 챔버에 유체 배출구가 구비되는 경우 이와 같이 유체가 배출될 수 있는 유체 배출구를 통해 상기 상부 챔버가 내부에 배치된 상태로 배양액을 담고 있는 하부 챔버의 유체가 하부 챔버 외부로 배출되면서 배양액이 유동할 수 있다.
이를 위해, 상기 상부 및/또는 하부 챔버에는 유동을 일으킬 수 있는 장치가 추가로 연결될 수 있으며, 예를 들어 상기 상부 챔버에 세포 배양액을 일정한 유속으로 주입하는 장치가 추가될 수 있으며, 상기 하부 챔버는 상기 상부 챔버에 유입된 유체가 상기 상부 챔버의 다공성 박막을 투과해 상기 하부 챔버로 흐르면서 일정한 유속으로 배출되도록 하는, 유체의 흐름을 제어하는 장치와 연결될 수 있으며, 이는 예를 들어 배양액 저장소일 수 있다. 이때, 상기 유체의 유동을 일으킬 수 있는 것이라면, 유체 흐름을 유도하는 장치는 제한되지 않으며, 예를 들어, 상기 유체 흐름 유도 장치는 시린지 펌프(Syringe pump), 튜브연동펌프(Peristaltic pump) 또는 교반기 등을 사용할 수 있다.
예를 들어 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양장치는 상기 하부 챔버와 동일한 평면 상에 배치되며, 하부 챔버와 유체 연통된, 배양액 저장소를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 배양액 저장소 내 배양액의 높이는 하부 챔버 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정되는 것일 수 있다.
이때, 상기 하부 챔버 내 배양액의 수위는 상부 챔버 하단의 다공성 박막을 기준으로 상부 방향으로 1 내지 20 mm 의 높이인 것일 수 있으며, 예를 들어 1 내지 19 mm, 바람직하게는 1 내지 18 mm, 예를 들어 1 내지 8mm일 수 있다. 배양액의 수위가 상기 바람직한 범위 미만인 경우 배양중인 세포 응집체에 원활한 영양분 공급이 불가 해 질 수 있으며, 상기 바람직한 범위를 초과 할 경우 배양액의 범람 및 과용을 초래 할 수 있다.
또한, 상기 상부 챔버 하단의 다공성 박막과 하부 챔버 바닥의 간격은 0.1 내지 8 mm인 것일 수 있으며, 예를 들어 0.2 내지 7 mm, 바람직하게는 1 내지 5 mm일 수 있다. 간격이 상기 바람직한 범위 미만인 경우 세포 배양액의 유동이 제한되어 배출구를 통한 배출이 불가능 할 수 있다. 또한, 상기 바람직한 범위를 초과할 경우 배양액의 과용을 초래 할 수 있다.
이때, 상기 유체, 즉 세포 배양액은 일정한 속도를 유지하면서 유동할 수 있다. 이를 위해 상기 유체의 유입과 배출을 일정한 속도로 조절할 수 있다. 이때, 예를 들어, 상기 유체는 0.0001 내지 1 ml hr-1, 예를 들어, 0.001 내지 1 ml hr-1의 속도로, 바람직하게는 0.01 내지 1 ml hr-1의 속도로 유동할 수 있다. 상기 유체의 유동 속도가 0.0001 ml hr-1 미만인 경우에는 세포 응집체가 필요한 양의 세포 배양액이 공급되지 않는 문제가 생길 수 있으며, 1 ml hr-1를 초과하는 경우에는 세포 응집체에 유동에 의한 과도한 전단응력이 작용해 세포 응집체에 악영향이 미칠 수 있다. 세포에 악영향을 미치지 않는 전단응력 예를 들어 0.001 내지 10 dyne cm-2의 전단응력은 세포에 분화 및 증식에 긍정적인 영향을 끼칠 수 있다.
한편, 상기 세포 배양액은 1000 Pa 미만의 수압을 상기 다공성 박막에 인가하는 것이 바람직하며, 압력이 적을수록 보다 바람직하고, 예를 들어 1 Pa 내지 100 Pa일 수 있다. 한편, 1000 Pa 초과인 경우 세포 생존률이 저하되는 문제가 있다.
상기 유체는 세포 배양액을 사용할 수 있으며, 상기 세포 배양액에는 FBS, 글루코스 및 성장인자 등이 포함될 수 있으나, 당업계에서 사용되는 세포 배양액이라면 제한되지 않으며, 배양하고자 하는 세포에 적합한 세포 배양액을 선정하여 세포 배양액을 사용할 수 있다.
본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 상기 장치를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법에서는 세포주 예를 들면 근아세포(Myoblasts), 태아 섬유아세포(Embryo fibroblasts), 제정맥 내피세포(Umbilical vein endothelial cells), 간암 세포(HepG2 세포), 표피 세포(Epidermal cells) 또는 이 중 적어도 일종 이상의 혼합 등을 사용 할 수 있다. 또한, 세포주뿐만 아니라 간, 췌장, 소장 등의 1차 세포 또한 사용 될 수 있다. 마지막으로, 줄기세포 예를 들면, 유도만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cell), 중간엽유래 줄기세포(Mesenchymal stem cell) 또는 이 중 적어도 일종 이상의 혼합 등의 세포를 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 3차원 세포 응집체인 스페로이드 또는 오가노이드를 배양 할 수 있다.
한편, 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 방법은 상기 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치를 이용하여, 상부 챔버의 다공성 박막 상에 세포를 접종하는 단계; 세포 배양액을 상부 챔버의 상부로 개구부를 통해 투입하는 단계; 및 상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 하부 챔버로 유입된 세포 배양액을 하부 챔버로부터 배출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
하부 챔버로부터 배출되는 세포 배양액에 의해 세포 배양액이 유동하게 되며, 나아가 상기 세포 배양액을 하부 챔버로 투입하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
상기 세포는 상기 다공성 박막 상에 접종되어 배양될 수 있으며, 상기 접종은, 상기 상부 챔버에 유체를 유입하는 단계에 선행하여 배양할 세포를 상기 다공성 박막 상에 접종하여 수행될 수 있다.
이에 의해 세포는 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치에 적용될 수 있으며, 상기 세포를 접종하는 방법은 당업계에서 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 마이크로파이펫을 이용하여 접종할 수 있다.
상기 방법으로 접종된 세포는 수 시간에서 수 일 내에 3차원 세포 응집체를 형성 한다. 세포 응집체 형성 후에 개발된 장치에 의한 세포 배양액의 유동은 인가 될 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 다공성 박막의 제조
폴리카프로락톤(Polycaprolactone; PCL; Mn = 80,000 g mol-1), 클로로포름 및 메탄올은 Sigma-Aldrich (미국)에서 구입하였다. 전기 방사를 위한 PCL 용액은 7.5 wt% 농도의 클로로포름/메탄올(3/1 vol/vol)의 혼합물에 PCL을 용해하여 준비하였다. 준비된 PCL 용액을 5 ml 정밀 주사기(Gastight syringe; Hamilton)에 넣고 상업용 전기 방사 기계(ES-robot, NanoNC)를 사용하여 직경 5 cm의 고리 모양 전극 위에 10cm 거리를 두고 배치된 23 게이지 금속 바늘을 통하여 1ml h-1 의 유속으로 토출하였다. 금속 바늘과 고리 모양의 전극 사이에 상기 상업용 전기방사 기계를 활용하여 15kV의 고전압을 가하여 전기 방사를 수행하였다. 전기 방사된 PCL 나노섬유(As-electrospun PCL nanofiber)는 고리 모양 전극 사이에 증착 되어 기체 및 질량 투과성 나노섬유 멤브레인을 생성하였다. 전기 방사는 상대 습도 50 ~ 60 %, 온도 20 ~ 25 ℃에서 실시하였다. 나노섬유 네트워크 제조 시 방사 시간에 따른 현미경 사진을 도4에 나타내었으며, 나노섬유 직경은 약 800-1000 nm인 것을 확인 하였으며, 방사시간이 증가함에 따라 평균 공극의 크기 및 공극률(Porositiy)은 감소하며 반대로 평균 두께는 증가하였다.
상기 나노섬유 네트워크 제조 시 방사 시간에 따른 나노섬유 네트워크의 구조 변화(도 4(a)), 공극률 변화(도 4(b)), 다공성 박막의 투수 계수(Hydraulic conductivity)(도 4(c)), 및 수압(Induced pressure)(도 4(d))을 각각 도 4에 나타내었다.
이때, 공극률의 계산 방법은 확대 된 현미경 이미지를 이진 이미지로 (Binary image) 변환 한 다음 Image J 소프트웨어 (NIH, USA)를 사용하여 나노섬유 네트워크 면적 대비 나노섬유 네트워크에 의해 생성된 공극의 면적 분율을 계산하여 나타낸 것이다.
2. 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버 제조
상기 1.에서 획득된 다공성 박막 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버를 제조하기 위해서 일련의 공정을 수행했으며 이를 도 8에 나타내었다. 상세하게, 상부 챔버 하단의 다공성 박막 영역은 500μm 두께의 폴리 메틸메타크릴레이트 플레이트 (PMMA, Acryl Choika, South Korea)에 접착제를 도포 한 후 레이저 절단기 (ML-7050A, Machineshop, South Korea)를 사용하여 접착제가 도포된 PMMA 플레이트에 쓰루홀의 배열을 천공하였으며 도포된 접착제를 활용하여 쓰루홀과 다공성 박막을 결합함으로써 최종적으로 도 3과 같이 바닥 면이 다공성 박막으로 이루어진 오목부를 형성하여 완성하였다.
또 다른 형태의 상부 챔버 하단의 다공성 박막 영역을 제작하기 위한 일련의 공정을 도 10에 나타내었다. 보다 상세하게는, 상기 1.에서 획득된 평평한 다공성 박막을 돌출 몰드 및 오목 몰드를 활용한 압축 공정을 통해 모든 면이 다공성 박막으로 이루어진 돌출부 및 오목부가 형성된 다공성 박막을 구비하는 상부 챔버 하단을 완성하였다. 이때 오목 몰드는 10mm 두께의 폴리 메틸메타크릴레이트 플레이트 (PMMA, Acryl Choika, South Korea)에 기계가공장비(EGX-350, Roland, USA)를 활용하여 드릴링을 통해 제작 하였으며, 폴리디메틸실록산 (Polydimethylsiloxane; PDMS)로 구성된 돌출 몰드를 제작하기 위해 10:1의 중량비로 PDMS와 경화제의 혼합물(Sylgard 184, Dow Corning, USA)을 함몰 몰드에 붓고 55℃에서 12 시간 동안 경화하여 완성했다.
상부 챔버 중 개구부 형태를 갖는 나머지 측면 부분은 사출성형기(SE50D, Sumitomo, Japan)를 활용해 제작하였다. 이렇게 획득된 상기 측면 부분과 상기에서 획득된 상부 챔버 하단을 접착제를 활용하여 결합하여 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버를 완성하였다.
3. 3차원 세포 응집체 배양 장치 제조
폴리디메틸실록산 (Polydimethylsiloxane; PDMS)로 구성된 하부 챔버와 이의덮개를 제작하기 위해 10:1의 중량비로 PDMS와 경화제의 혼합물(Sylgard 184, Dow Corning, USA)을 몰드에 붓고 55℃에서 12 시간 동안 경화했다. 하부 챔버와 덮개의 몰드는 20 mm 두께의 PMMA 플레이트를 기계가공 장비 (EGX-350, Roland, USA)를 활용하여 제작하였다. 하부 챔버는 30 mm × 30 mm × 30 mm 의 크기로 제작 되었으며, 이때 윗면에 2 mm 깊이의 홈을 설계하여 (도 9(a)) 하부 챔버 바닥 면으로부터 상기 2.에서 제작된 다공성 마이크로웰의 다공성 박막까지의 거리 간격은 8 mm 로 설정하였다(도 9(b)). 하부 챔버 바닥 면과 덮개의 정 중앙에 Biopsy punch (Miltex, USA)를 활용하여 1 mm 크기로 천공하여 배출구를 형성하였다.
개구부 덮개의 천공을 통해 튜브(Biokonvision, South Korea)가 연결되었으며 syringe pump (KDS200, KD Scientific, USA)는 상기 튜브를 통해 0.062 ml h-1의 유속(flow rate)으로 세포배양액을 주입하였다. 하부 챔버 바닥 면의 천공 또한 튜브와 연결되어 세포 배양액이 배양액 저장소로 이송될 수 있도록 하였다. 또한, 상기 배양액 저장소 하부에 Z-스테이지(stage)를(Sciencetown, South Korea) 구비해 저장소의 높이는 하부 챔버 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정하여, 배양 과정에서 시린지 펌프로부터 지속적으로 배양액이 유입됨에도 하부 챔버 배양액의 수위를 일정하게 유지할 수 있도록 설계되었다.
4. 응집체 배양 장치를 이용한 세포 배양
실시예 1
상기 1에서 제조된 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버 및 하부 챔버에 더하여 배출된 배양액을 저장할 수 있는 배양액 저장소를 포함하는 3차원 세포 응집체 배양 장치를 도 1과 같이 마련하였다. 이때 배양액 저장소의 높이는 하부 챔버 바닥면으로부터 하부 챔버의 수위가 12 mm에 상응 하도록 설정하였다. 이렇게 획득된 차원 세포 응집체 배양 장치를 '본 발명의 세포 배양장치'및 '실시예 1의 세포 배양장치'와 상호호환적으로 지칭한다.
상기 3차원 세포 응집체 배양 장치에서, 다공성 마이크로웰에 간 세포(HepG2) 및 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Media, FBS 10%) 배양액과 함께 주입한 후 이를 37℃에서 48 시간동안 유동을 인가하지 않고 정적인 환경에서 3차원 HepG2 응집체 즉 HepG2 스페로이드를 형성하였다. 그 후 시린지 펌프를 이용하여 일정한 유속인 0.062 ml hr-1으로 상부 챔버에 세포 배양액을 지속적으로 주입 하였다. 그 후 상기 주입된 유량만큼 유체를 배출하기 위해 하부 방향으로 유체 배출구가 형성된 하부 챔버를 통해 배양액 저장소로 배출 되도록 하여 8일 동안 HepG2 스페로이드를 배양 하였다.
비교예 1
다공성 박막이 아닌 불투과성 PMMA 플레이트의 바닥면으로 구성된 불투과성 마이크로웰을 사용한 것과 시린지 펌프, 배양액 저장소 등의 세포 배양액의 유동을 인가하는 장치를 사용하지 않고 파이펫팅을 이용한 세포 배양액 교체를 수행한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 HepG2 스페로이드를 배양 하였다.
실험예
(1) 시간의 흐름에 따른 3차원 세포 응집체 배양 장치 내의 유체 교환 확인
실시예 1의 3차원 세포 응집체 배양 장치에서, 상부 챔버로 새롭게 유체가 0.062ml hr-1의 유속으로 주입될 때 3차원 세포 응집체 배양장치 내의 유동 변화 (유체 교환 확인)를 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
도 7에 보이는 바와 같이, 세포 배양 응집체 내부에 기존에 존재하던 푸른 용액이 새롭게 주입되는 투명한 색의 용액으로 점진적으로 교환되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이 과정에서 하부 챔버의 수위는 일정하게 유지 되는 것을 확인 할 수 있었다.
(2) 실시예 1에서 세포 배양액의 흐름 해석
본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치에서 세포 배양액의 흐름을 측정하기 위한 전산유체해석 방법을 적용하기 위해 COMSOL Multiphysics 소프트웨어 (Version 5.0, USA)을 통해서 실시예 1의 3차원 세포 응집체 배양 장치에서 내의 유속(Surface velocity: 0 m s-1 ~ 8.11 e-6 m s-1), 유동방향(검정색 콘 모양), 유선(흰색 선)에 해당하는 내용을 해석 및 계산하였다.
그 결과, 도 2에 보이는 바와 같이, 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치에서, 세포 배양액은 상부 챔버에서 하부 챔버로 원활하게 흐르는 것을 확인할 수 있었다.
(3) 세포 배양 시 세포가 유실되는 정도의 비교
실시예 1 및 비교예 1에서 2일 간격으로 간 세포 스페로이드의 유실 정도를 비교하였으며, 그 결과를 도 5에 나타냈다.
도 5에 보이는 바와 같이, 실시예 1에서는 간 세포 스페로이드의 유실이 전혀 없었으나, 비교예 1에서는 지속적으로 스페로이드가 유실되고, 8일 째에는 약 15 % 가량의 HepG2 세포 스페로이드의 유실이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
(4) 시간의 흐름에 따른 3차원 세포 응집체 주변 영양분 농도 비교
실시예 1 및 비교예 1에서 시간에 흐름에 따른 HepG2 스페로이드 주변의 영양분(Glucose) 농도를 측정하여 비교 분석하기 위하여 COMSOL Multiphysics 소프트웨어 (Version 5.0, USA)을 활용 하였다. 이 과정에서 활용된 수치는 하기 표 1에 나타내었다.
분자(Molecules) MW [kDA] 확산 계수 [μm2s-1] 배양액 내 초기 농도[mol m-3] 소비율[mol m-3s-1]
글루코스 0.18 580 11.1 5.2E-3
도 6에 보이는 바와 같이, 실시예 1의 본 발명의 세포 배양장치에서는 36시간 이후 균일한 영양분 농도가 HepG2 세포 응집체 주변에 유도되는 것이 수치 예측되었으나, 비교예 1에서는 파이펫팅 간격 전후로 영양분 농도의 변화가 심하며 세포 응집체 주변에 불균일한 영양분 농도가 유도되는 것이 수치 예측되었다.
(5) 실시예 1의 3차원 세포 응집체 배양 장치에서 다공성 박막의 투수 계수 및 수압 측정
상부 챔버로 새롭게 유체가 0.062 ml hr-1의 유속으로 주입될 때 3차원 세포 응집체 배양장치 내의 다공성 박막에 인가되는 수압(Applied pressure on membrane)을 확인하기 위한 실험을 진행 하였다. 이를 확인하기 위해서, 사전에 투수 계수의 측정은 발명된 장치 외부에서 하기와 같이 Falling-head method를 활용하여 진행하였다.
구체적으로, 초기 수두(Initial pressure head, h i) 를 갖는 물이 다공성 박막을 투과하여 최종 수두(Final pressure head, h f )에 도달하기 까지의 시간을 확인하여 Darcy 's law를 기반하는 공식을 통해 투수 계수를 측정하였다.
여기서 K는 다공성 박막의 투수 계수, L은 다공성 박막의 두께, t는 h i 에서 h f 까지 도달하는 시간 이며 본 실험에서는 각 각 100mm 와 10mm의 h i 및 h f 를 활용 하였다. 계산된 투수 계수를 기초로 다공성 박막의 투과도(Permeability)를 다음과 같은 수식을 활용하여 계산하였다.
여기서 k는 현재 다공성 박막의 투과도, μ는 세포 배양액의 점도, ρ는 세포 배양액의 밀도, g는 중력 가속도이다.
0.062 ml hr-1의 유속으로 다공성 박막을 투과하는 세포 배양액, 측정된 투수계수 와 계산된 투과도를 기반하여 다음과 같은 수식(Kozeny-Carman equation)을 활용하여 다공성 박막에 인가되는 수압을 계산 하였다.
여기서 v는 현재 다공성 박막을 투과하는 유체의 유속 k는 현재 다공성 박막의 투과성, μ는 세포 배양액의 점도, L는 다공성 박막의 두께 이며 p는 다공성 박막에 인가되는 수압이다.
도 4에 보이는 바와 같이, 다공성 박막에 인가되는 수압 즉, 수력반발력은 다공성 박막을 구성하는 나노섬유의 네트워크가 성길수록 즉, 전기 방사 수행 시간이 짧을수록, 즉 공극률 및 투수 계수가 높을수록 낮은 것을 확인 하였다. 이를 본 발명의 다공성 박막이 아닌 상용 다공성 멤브레인과 비교 분석 하였을 때, 본 발명의 다공성 박막에 훨씬 낮은 수력 반발력이 인가 되는 것을 확인 할 수 있었으며 나노섬유 네트워크로 구성된 다공성 박막이 본 발명의 장치에 더 적합함을 확인 할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (12)

  1. 3차원 세포 응집체 배양 장치에 있어서,
    개구부, 다공성 박막 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버; 및
    상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하는 하부 챔버;
    상기 하부 챔버의 하단에 구비되는 배출구; 및
    상기 하부 챔버와 동일한 평면 상에 배치되며, 상기 배출구와 유체 연통된 배양액 저장소;
    를 포함하며,
    상기 상부 챔버의 상부로 유입된 유체는 상기 상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부 챔버로 유입되고,
    하부 챔버의 유체는 상기 배출구를 통해 배출되며,
    상기 배양액 저장소 내 배양액의 수위는 하부 챔버 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정되는,
    3차원 세포 응집체 배양 장치.
  2. 3차원 세포 응집체 배양 장치에 있어서,
    개구부, 다공성 박막 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버;
    상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하는 하부 챔버; 및
    상기 하부 챔버의 간극 영역 -상기 간극 영역은, 상기 상부 챔버의 측면 벽과 상기 하부 챔버의 측면 벽 사이에 존재하는 것임 - 으로부터 배출된 배양액이 저장되는 배양액 저장소;
    를 포함하며,
    상기 3차원 세포 응집체 배양 장치는,
    상기 상부 챔버에 배양액을 주입하는 장치; 및
    상기 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부 챔버로 유입된 배양액을 배출시키는 장치;와 연결되고,
    상기 상부 챔버의 상부로 유입된 배양액은 상기 상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부 챔버로 유입되고,
    상기 하부 챔버의 배양액은 상기 간극 영역에서 공기와 접하는 계면의 상부로부터 배출되며,
    배양액이 유입되는 초기시점부터 적어도 90시간 이상 측정한 시간별 세포주변 영양분 농도의 그래프는, 상기 초기시점부터 90시간까지 형상을 가지며, 36시간 이후에는, 36시간이 경과한 시점에 측정된 농도값보다 작고 0보다 큰 특정 농도값으로 수렴하는 것을 특징으로 하는,
    3차원 세포 응집체 배양 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 다공성 박막은 오목부가 형성된 다공성 박막이거나, 또는 다공성 박막 상에 구획을 형성할 수 있는 측벽 또는 돌출부를 추가로 포함하여 오목부가 형성된 것인, 3차원 세포 응집체 배양 장치.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 다공성 박막은 나노섬유 네트워크로 이루어진 것으로, 공극률이 20% 내지 60%의 다공성 박막인, 3차원 세포 응집체 배양 장치.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양액의 유동은 0.0001 내지 1mL hr-1 의 유속으로 유입되고 배출되는, 3차원 세포 응집체 배양 장치.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양액은 1000 Pa 미만의 수압을 상기 다공성 박막에 인가하는, 3차원 세포 응집체 배양 장치.
  7. 삭제
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하부 챔버 내 배양액의 수위는 상부 챔버 하단의 다공성 박막을 기준으로 1 내지 20 mm인, 3차원 세포 응집체 배양 장치.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 상부 챔버 하단의 다공성 박막과 하부 챔버 바닥의 간격은 0.1 내지 8mm인, 3차원 세포 응집체 배양 장치.
  10. 제1항 또는 제2항의 3차원 세포 응집체 배양 장치를 이용하여,
    상부 챔버의 다공성 박막 상에 세포를 접종하는 단계;
    세포 배양액을 상부 챔버의 상부로 개구부를 통해 투입하는 단계; 및
    상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 하부 챔버로 유입된 세포 배양액을 하부 챔버로부터 배출하는 단계를 포함하는, 3차원 세포 응집체 배양 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포는 유도만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cell) 및 중간엽유래 줄기세포(Mesenchymal stem cell)를 포함하는 줄기세포; 근아세포(Myoblasts), 태아 섬유아세포(Embryo fibroblasts), 제정맥 내피세포(Umbilical vein endothelial cells), 간암 세포(HepG2 세포), 및 표피 세포(Epidermal cells)를 포함하는 세포주; 및 간, 췌장 또는 소장으로부터 획득된 1차 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나 이상인, 3차원 세포 응집체 배양 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 세포 배양액을 하부 챔버로 투입하는 단계를 추가로 포함하는, 3차원 세포 응집체 배양 방법.
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