KR102748455B1 - 정량분석이 가능한 신속 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치 - Google Patents
정량분석이 가능한 신속 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 종래 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치에 있어서, 본 발명의 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치는 다음과 같은 차이점이 있다.
본 발명의 정량분석이 가능한 신속 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치는, 검체에 표준물질(Standard material)을 추가한 것을 검체패드(1)에 투하하여,
i) 표적물질의 농도가 신호 최대값을 나타내는 농도보다도 높은 경우에 나타나는 신호 미약(소멸)의 경우와;
원래부터 검체에 표적물질의 농도가 신호 최소값을 나타내는 농도보다 낮은 경우에 나타나는 신호 미약(소멸)의 경우를 구별하기 위하여,
별도의 단일 스트립에, 검체에 일정 농도의 표준물질(SHook)을 혼합 후 투여하여, 검 사선의 검출신호가 강해지면 원래 검체 표적물질의 농도가 아주 낮은 것으로 판단하며;
반대로 검사선의 검출신호가 더 약해지면(혹은 소멸 지속) 검체 표적물질의 농도가 과도하게 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 한다.
ii) 또한, 여러 농도의 표준물질에 따른 신호세기를 측정하고, 그 검량선을 구하여 표적물질의 농도를 결정하는 것을 특징으로 한다.
iii) 또한, 검체 표적물질의 신호세기는 반복하여 측정하고 그 평균값을 사용하여 재현성과 분석실험에 따른 오차를 줄이는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 정량분석이 가능한 신속 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치는, 검체에 표준물질(Standard material)을 추가한 것을 검체패드(1)에 투하하여,
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원래부터 검체에 표적물질의 농도가 신호 최소값을 나타내는 농도보다 낮은 경우에 나타나는 신호 미약(소멸)의 경우를 구별하기 위하여,
별도의 단일 스트립에, 검체에 일정 농도의 표준물질(SHook)을 혼합 후 투여하여, 검 사선의 검출신호가 강해지면 원래 검체 표적물질의 농도가 아주 낮은 것으로 판단하며;
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ii) 또한, 여러 농도의 표준물질에 따른 신호세기를 측정하고, 그 검량선을 구하여 표적물질의 농도를 결정하는 것을 특징으로 한다.
iii) 또한, 검체 표적물질의 신호세기는 반복하여 측정하고 그 평균값을 사용하여 재현성과 분석실험에 따른 오차를 줄이는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 생체에서 단백질과 같은 표적물질을 정량하는 데 있어서, 현장에서 신속하게 검사하는, 다중스트립을 활용한 표준물질(standard material)의 검량선(calibration curve)을 이용하는 면역크로마토그피 분석방법 및 장치에 관한 것이다.
래피드 테스트(rapid test) 또는 측면유동 면역분석법(lateral flow immunochrmatography assay, LFIA)으로 알려진 면역크로마토그래피 분석법(chromatographic immunoassay)은 항원-항체 반응을 이용하여, 미량의 표적물질(target analyte)을 단시간에 분석할 수 있는 방법으로서, 각종 질병의 진단 또는 검사를 비롯하여, 의학, 농업, 축산업, 식품, 군사, 환경 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 이러한 면역크로마토그래피 분석에는 검출하고자 하는 표적물질과 반응하여 변화를 나타낼 수 있는 반응물질을 포함하는 분석 스트립(assay strip) 또는 상기 분석 스트립을 플라스틱 케이스에 장착한 디바이스(device) 형태의 분석 장치가 일반적으로 사용되고 있다.
통상적인 분석 스트립은 액상 검체를 수용하는 검체패드, 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 신호를 발생시키는 표지체를 항원 또는 항체 등의 리간드에 접합시킨 접합체(conjugate)를 함유하는 접합체패드, 검체 중의 표적물질 또는 상기 접합체와 특이적으로 결합하는 리간드(항원 또는 항체)를 고정시킨 검사선과 검체의 전개를 확인할 수 있는 대조선이 형성된 검출패드, 그리고 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습패드로 구성된다.
면역크로마토그래피 분석법은 혈액, 오줌, 침, 척수액, 세포배양액, 미생물 배양액과 같은 검체에서 표적물질(예컨대, 단백질)을 측정하는데, 시간과 비용이 많이 드는 장비를 필요로 하지 않는 간편한 측정장치이다. 그래서 면역크로마토그래피 분석법은 집이나 의료현장 등 신속한 검사가 필요한 곳에서 많이 사용된다. 예를 들면, 일반 가정에서 많이 사용하는 임신 진단키트는 임신과 관련된 호르몬을 측정하는 신속 검사장치이고, 최근 코로나 바이러스 감염(COVID-19) 여부를 신속하게 파악하기 위해서 신속진단키트가 사용되었음은 잘 알려진 사실이다.
본 발명의 배경기술로, 대한민국 등록특허 제10-1941090호(공고일 2019. 01. 16)에는 “멀티 진단키트”(이하, “종래기술 1”이라 한다)가 공개되어 있다. 종래기술 1의 멀티 진단키트는 복수 개의 검출 스트립을 포함하고 있다. 이때, 복수 개의 검출 스트립에 각각 별도의 검체가 제공될 수 있다. 예를 들어, 제1검체패드에는 소변이 검체로 제공될 수 있고, 제2 검체패드에는 혈액이 검체로 제공될 수 있다. 또한, 각각의 테스트 라인에는 서로 다른 질병의 항체가 제공될 수 있다. 그래서 하나의 검출 스트립에 테스트 라인의 수에 따라 여러 가지 질병이 진단 가능할 수 있다. 도 5는 종래기술 1을 나타낸 것이다.
종래기술 1은 여러 개의 검체와 여러 개의 질병진단을 위하여 복수 개의 스트립을 이용하였으나 실제로 정량적인 측정이 가능하지 않다는 문제점이 있다.
본 발명은 표준물질 검량선을 구하고 이에 기반하여 표적물질을 정량하기 위하여 복수 개의 검출 스트립을 이용한다는 점에서 차이가 있다.
또 다른 배경기술로, 대한민국 등록특허 제10-1540608호(공고일 2015. 08. 03.)에는 “가변 대조선을 구비한 분석 스트립 및 이를 구비한 진단키트”(이하, “종래기술 2”라 한다)가 공개되어 있다.
종래기술 2의 분석 스트립은 가변 대조선을 구비함으로써, 후크 현상(Hook Effect, Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Hook_effect)으로 인한 표적물질 측정(단, 정성적 측정만 가능함)의 어려움을 극복하고 있다. 즉, 면역크로마토그래피 분석법의 샌드위치 방법 적용에서 오는 신호의 위음성 여부를 확인하기 위해 표준물질을 대조선(가변 대조선)에 고정시켰다. 도 6은 종래기술 2를 나타낸 것이다.
종래기술 3으로서, 특허 공개번호 제10-2017-0023589호, 3차원 단백질 나노입자 프로브 기반 복수 질환의 동시검출 방법 및 키트가 알려져 있다.
또한, 종래기술 4로서, 특허 공개번호 제10-2019-0067741호, 멀티 진단키트가 알려져 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술들과는 달리 가변 대조선을 따로 두지 않고 별도의 독립된 스트립을 마련하였다. 즉, 별도 독립된 스트립에서는 검체에 표준물질(SHook)을 추가로 투입하여,
(i) 검체에 표적물질이 존재하지 않는 경우는, 표지화된 검출리간드에 결합한 표준물질이 고정된 포획리간드와 결합하여 검출 신호가 나타나며,
(ii) 검체에 표적물질이 다량 존재하는 경우는, 표지화된 검출리간드가 표적물질로 포화현상, 즉, 후크현상(이때 추가된 표준물질은 검출리간드 포화를 가속화 시킴)으로 고정된 포획리간드에 결합되어 있는 표적물질과 반응하지 못하게 된다.
이와 같은 방법으로 표적물질이 과도하게 많아, 검량선으로 측정하는 범위 (동적범위, dynamic range)의 최대값을 넘어서 검출신호가 더 약해지거나 소멸되는 경우(위음성 신호)를 감별할 수 있게 한 것이다.
본 발명의 목적은 종래의 다중스트립 면역크로마토그래피에 있어서,
검체 표적물질이 "과도"하게 많아서 검출신호가 소멸되는 경우(후크현상)를 검체에 표적물질이 "미약하거나 존재하지 않아서" 검출신호가 소멸된 경우와 구별하는 방법 및 장치를 제공하는 데 있다.
또한, 표준물질의 검량화를 적용하여 정확하고 재현성 있는, 즉, 정량 검사가 가능한 신속 면역크로마토그래피 분석(rapid chromatograpic immunoassay) 방법 및 장치를 제공하는 데에 있다.
본 발명은 검체가 위음성을 나타내는 경우를 구별할 목적으로 하는 검체패드를 다중스트립 중 별도의 하나의 스트립으로 형성하는 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치를 제공한다.
또한, 상기 다중스트립은 다양한 농도의 표준물질(standard material)의 신호세기를 측정하기 위한 다수개의 스트립들을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치를 제공한다.
또한, 상기 다중스트립은 표적물질(target analyte)을 반복 측정하기 위한 다수개의 스트립들을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석 장치를 제공한다.
또한, 상기 다중스트립은 표지체(label)를 포함하고, 상기 표지체(label)는 형광성 염료, 금콜로이드, 라텍스 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자 또는 효소 중 어느 하나로 형성된 표지체(label)를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치를 제공한다.
또한, 상기 다중스트립은 표지체(label)를 포함하고, 상기 표지체(label)의 신호를 측정하는 장치는 CCD 또는 CMOS인 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치를 제공한다.
상기 다중스트립으로 측정하는 표적물질은 단백질, 항원, 항체, DNA, RNA, PNA 또는 압타머 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치를 제공한다.
또한, 상기 다중스트립으로 측정하는 검체는 혈액, 오줌, 침, 척수액, 세포배양액 또는 미생물 배양액 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치를 제공한다.
또한, 검체와 표준물질(Standard material)을 혼합한 혼합물을 검체패드(1)에 투하 하여,
검사선(3)에 나타나는 표지체(8)의 검출신호가 강해지면 표적물질(Target analyte)의 농도가 신호 최소값을 나타내는 농도보다 낮아 음성을 나타낸 것으로 판단하고;
반대로 검사선(3)에 나타나는 표지체(8)의 검출신호가 더 약해지거나 소멸이 지속되면 표적물질(Target analyte)의 농도가 과도하게 높아 위음성을 나타낸 것으로 판단함에 있어서,
상기 혼합물은 다중스트립 중 별도의 하나의 독립된 스트립인 검체패드(1)에 투하하는 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석방법을 제공한다.
또한, 상기 다중스트립에 다양한 농도의 상기 표준물질(Standard material)의 신호 세기를 측정하여 상기 신호세기로 농도에 따른 검량선을 구하고;
상기 표적물질(Target analyte)을 정량하는데 상기 검량선을 이용하는 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석방법을 제공한다.
또한, 상기 표적물질(Target analyte)의 신호세기는 반복하여 측정하고 그 평균값을 이용하여 상기 검량선 기반의 농도를 결정하는 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석방법을 제공한다.
또한, 상기 표지체에 신호를 나타내는 방법으로서, 형광성 염료, 금콜로이드, 라텍스 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자 또는 효소 중 어느 하나를 이용하여 신호를 나 타내는 방법인 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석방법을 제공한다.
또한, 상기 표준물질 또는 표적물질과 결합되어 있는 표지체의 신호를 측정하는 방법은, CCD 또는 CMOS로 측정하는 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석방법을 제공한다.
또한, 상기 표적물질은 단백질, 항원, 항체, DNA, RNA, PNA 또는 압타머 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석방법을 제공한다.
또한, 상기 검체는 혈액, 오줌, 침, 척수액, 세포배양액 또는 미생물 배양액 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석방법을 제공한다.
본 발명의 정량분석이 가능한 신속 다중스트립 면역크로마토그래피 분석 방법 및 장치는 액상 검체(sample)를 수용하는 검체패드(sample pad); 상기 검체패드의 일측에 연결되며 표지체(label) 및 검출리간드(detection ligand)를 수용하는 접합체패드(conjugate pad); 상기 접합체패드의 일측에 연결되며 검사선(test line), 대조선(control line)을 포함하는 검출패드(detection pad) 및 상기 검출패드의 일측에 연결되며 반응 후 잔존하는 액상을 수용하는 흡습패드(absorption pad)를 포함하는 단위 스트립을 여러 개 병렬로 연결하여 다중의 스트립으로 구성 된 면역크로마토그래피 분석 방법 및 장치에 있어서,
상기 접합체패드(conjugate pad)는 검체의 표적물질(target analyte) 또는 표준물질(standard material)과 반응하는 제1검출리간드(1st detection ligand)와 표지체(label)로 구성된 제1접합체(1st labeled-ligand conjugate)와, 검체의 표적물질과는 반응하지 않는 제2검출리간드(2nd detection ligand)와 표지체(label)로 구성된 제2접합체(2nd labeled-ligand conjugate)를 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
또한 본 발명에서 상기 검출패드(detection pad)는 검사선(test line) 및 대조선(control line)을 포함하며, 상기 검사선은 검체 내 표적물질(target analyte) 또는 표준물질(standard material)과 반응하는 포획리간드(capture ligand)가 고정되어 있고, 대조선은 검체와 반응하지 않고 제2검출리간드(2nd detection ligand)와 반응하는 외부물질(foreign material)이 고정되어 있다. 그리고 흡습패드(absorption pad)는 검체의 전개액을 흡수하여 구동력을 제공하는 것을 특징으로 하고 있다.
또한 본 발명에서 접합체패드에 흡수되는 제1검출리간드와 표지체의 접합체는 검체 내 표준물질 또는 표적물질과 결합하고, 이어서 검출패드로 진행하여 검사 선에서 해당 포획리간드와 결합하여 제1접합체-표준물질(표적물질)-포획리간드의 3중 구조물을 형성하고; 접합체패드에 흡수되는 제2접합체, 즉 제2 리간드와 표지 체의 접합체는 검출패드로 진행하여 대조선에서 해당 외부물질(foreign material)과 결합하여 제2접합체-외부물질의 2중 구조물을 형성한다.
또한 본 발명에서 표적물질을 정량(또는 측정)하는 경우, 먼저 몇 개의 스트립을 활용하여 여러 농도 수준에서(S0, S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7)에서 표준물질의 신호세기를 측정하여 검량선(calibration curve)을 구하고; 이를 이용하여 검체의 표적물질을 정량(quantification)한다. 즉, 표준물질의 농도에 따른 신호세기는 일차함수, 이차함수, 4-매개변수 로지스틱 함수, 5-매개변수 로지스틱 함수와 같은 모델에 적용하여, 농도에 따른 신호세기의 예측값과 실제 값의 오차가 가장 작은 모델(함수)을 채택하여 검량선으로 선택하며; 검체의 표적물질의 신호세기를 상기의 검량선에 적용하여 그 농도를 결정하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명과 같은 일반적인 면역측정법(immunoassay) 기반의 농도측정에서는 표적물질의 농도가 동적범위(dynamic range; 신호의 측정량의 최댓값과 최솟 값의 폭)의 최대값을 벗어날 경우에는 흔히 검출 신호세기가 감소하거나 또는 소멸하는 후크 현상(Hook effect: Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Hook_effect)이 일어날 수 있다.
한편 중앙기기분석실이 갖추어진 장소에서 흔히 사용되는 면역분석법인 효소 결합면역흡착분석법(ELISA)에서는 분석실험과정에 세척하는 스텝이 있어, 가장 일반적인 방법인 샌드위치 효소결합면역흡착분석법의 경우를 예로 들면, 표적물질을 포획리간드와 반응시키고, 결합하지 못한 표적물질은 세척해주어 이후에 표지화된 검출리간드를 반응시킴으로서 후크현상은 발생하지 않게 할 수 있다.
반면에 분석실험과정 중에 세척하는 스텝이 없는 면역크로마토그래피 분석에 있어서는 후크현상이 발생하여 신호가 소멸한 경우와 원래부터 검체에 표적물질이 존재하지 않아 신호가 미약한 경우와 구분할 필요가 있다.
이를 해결하기 위하여 후크 효과가 발생한 것이 의심되는 검체에 일정 농도의 표준물질(SHook)을 혼합하여 검체패드에 투하하여; 검사선의 검출신호가 강해지면 원래 검체에 표적물질이 없거나 미량으로 존재하는 것으로 판단하며, 반대로 검사선의 검출신호가 약해지거나 전적으로 없는 것이 지속된다면 표적물질의 농도가 너무 높아 후크 효과가 발생된 것으로 판단하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에서는 표준물질을 이용하여 검체 표적물질의 검량선을 찾기 위한 다중스트립(S0-S7)과 미약한 신호의 저농도 표적물질 검량을 과도한 표적물질에 의한 후크 효과와 구분하기 위한 별도의 스트립(SHook)을 두는 것과 함께 검체의 반복 측정(정량)을 위하여 검체 투입구를 여러 개 마련하는 것을 특징으로 한다. 이는 검체의 반복 측량을 통해 재현성을 확인함과 더불어 평균값을 선택함으로써 모든 측정에서 동반하는 오차를 최소화하는 효과가 있다.
또한 본 발명에서 상기 표지체의 물질은 형광성 염료, 금콜로이드, 라텍스 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자, 효소 중 어느 하나이고; 표지체의 신호를 측정하는 장치는 CCD 또는 CMOS인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에서 상기 표적물질은 단백질, 항원, 항체, DNA, RNA, RNA 또는 압타머 중 어느 하나이고; 검체는 혈액, 오줌, 침, 척수액, 세포배양액 또는 미생물 배양액 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
종래의 단일 스트립 신속검사법은 검체 용액의 전개를 포함한 디바이스의 작동여부를 확인하고 검사(표적물질 측정)의 위음성 여부를 확인하는데 각각의 대조선을 이용하는 등 개선된 점이 있으나, 정확한 정량에 필요한 검량선을 구하는 것은 단일 스트립으로는 다양한 농도의 표준물질에 대한 신호값을 얻을 수 없어 불가능하였다.
그러나 본 발명에 의하면, 기존 정량적인 검사가 힘들었던 단일 스트립 면역 크로마토그래피 분석법에 다중스트립을 통한 표준물질의 검량선을 적용하여 재현성 있는 정량검사를 현장에서 신속하게 검사할 수 있는 생체물질 정량 측정장치를 제공할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 분석 장치는 검체 표적물질이 다량 존재하여 후크 효과가 발생하여 신호가 미약하게 나오는 것이 의심되는 경우, 이를 확인하기 위해 마련된 별도의 스트립에 검체와 함께 일정량의 표준물질(SHook)을 투하하여 그 신호세기의 증가하거나 감소(혹은 소멸 지속)하는 것을 관찰하여 검체 신호의 위음성 여부를 판정할 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명에서는 검체를 반복하여 측정하게 함으로써 정량 결과가 재현성이 있는가를 확인할 수 있게 하며, 사후 분석에 사용되는 검사값을 단일값 대신에 평균값을 사용함으로써 분석에 따른 오차(분산)을 줄일 수 있는 장점이 있다.
또한 본 발명에 따른 다중스트립 면역크로마토그래피 장치는 정량적 측정에 흔히 사용되는 효소결합 면역흡착검사(ELISA)와 같이 중앙검사실이 필요한 기기에 비해 검사시간, 검사비용 및 기기비용을 획기적으로 단축시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 검체의 표적물질을 측정하기 위한 본 발명의 단위 스트립 구조에 대한 사시도이다.
도 2는 본 발명의 다중스트립의 검출패드 위의 검사선에 결합하는 결합체에 대한 설명도이다.
도 3은 본 발명의 다중스트립을 이용한 표준물질의 검량을 통한 검체 표적물질의 정량적 측정을 위한 개념도이다.
도 4는 본 발명에서 사람의 혈청에 존재하는 표적물질 platelet factor 4(PF-4)의 면역분석법에서 나타나는 대표적인 검량선이다.
도 5와, 도 6은 종래기술을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 다중스트립의 검출패드 위의 검사선에 결합하는 결합체에 대한 설명도이다.
도 3은 본 발명의 다중스트립을 이용한 표준물질의 검량을 통한 검체 표적물질의 정량적 측정을 위한 개념도이다.
도 4는 본 발명에서 사람의 혈청에 존재하는 표적물질 platelet factor 4(PF-4)의 면역분석법에서 나타나는 대표적인 검량선이다.
도 5와, 도 6은 종래기술을 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 도면을 중심으로 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어의 혼동을 피하고, 명확히 하기 위하여 영어로 표기하면 다음과 같다.
검체패드: Sample pad
검출패드: Detection pad
접합체패드: Conjugate pad
흡습패드: Absorption pad
검사선: Test line
대조선: Control line
외부물질: Foreign material
지지대: Support
제1검출리간드: 1st Detection ligand
제2검출리간드: 2nd Detection ligand
포획리간드: Capture ligand
표적물질: Target analyte
표준물질: Standard material
표지체: Label
우선 면역크로마토그래피 분석법은 표적물질을 측정하는 정밀도에 있어서 정성적 검사(qualitative test)와 정량적 검사(quantitative test)를 고려할 수 있다. 정성적인 검사는 임산반응 검사키트나 코로나 신속 진단키트에서 보듯이 키트의 정상적인 작동을 보여주는 대조선(control line)과 함께 검사선(test line)이 있는데, 이 검사선은 임신 반응이나 코로나 감염반응에 따라 나타나거나 또는 나타나지 않는 두 가지 형태이다. 이는 검사하려는 표적물질의 농도가 어느 임계점 이하에서는 신호가 나타나지 않으며, 그 임계점을 넘어서야만 신호가 나타난다. 실제로 신호는 표지체로 콜로이드 금을 사용하는 경우 발색되어 시각적으로 확인할 수 있다.
한편, 정량적인 검사는 정성적인 측정에서와 같이 모든 신호를 ‘양성’ 또는 ‘음성’으로 판단하는 것이 아니라, 측정되는 신호를 연속적인 양으로 측정하여 취급하는 것으로 측정량의 정확성과 재현성이 요구된다. 예를 들면 혈액 속의 암표지자와 같이 실제 농도가 요구되는 상황은, 임신반응 경우나 코로나 감염의 경우와 같이 그 존재하는 양이 큰 차이를 보여 정성적인 분석만으로 충분한 상황과 다른 것이다.
현재까지 면역크로마토그래피 분석법에서 효과적인 정량적 검사법을 마련하기 위해서 시도되었던 연구들은 검사선상의 표적물질 농도와 표지신호 측정치의 상관관계 개선을 위한 광학장치의 고도화(예를 들면, complementary metal-oxide- semiconductor; CMOS, charge-coupled device; CCD)나 비광학적 측정법(예를 들면, magnetic immunoassay; MIA)를 들 수 있다. 또한 샘플 용액의 모세관 펌핑의 변동성을 줄이기 위하여 일정한 유속을 유지하기 위한 장치 등을 들 수 있다. 이와 같은 기술적인 연구는 면역크로마토그래피 분석법의 정량적 측정에 대한 기기적인 부분을 개선시켰다고 할 수 있다.
하지만 면역크로마토그래피 분석법과 같이 항원항체 반응을 기반으로 하는 면역분석법(immunoassay)에서 자동화 장치와 같은 장치적인 개선 외에도 표준물질을 사용한 검량을 반드시 먼저 수행해야 하는 것은 일종의 ‘0점 조정’과 같은 당연한 과정이다. 즉 실험 당시에 여러 농도의 표준물질을 마련하여 검출 신호를 측정하고 검량선을 구한 후 이를 기반으로 검체 표적물질의 농도를 정확하게 측정해야 한다.
본 발명의 실시예에 따른 도 1은 혈액과 같은 체액 속에 존재하는 표적물질을 측정하기 위한 단위 스트립의 구조에 대한 사시도로서, 접착성 플라스틱 지지체(6) 상에 검체패드(1), 접합체패드(2), 검사선(3), 대조선(4), 검출패드(5), 흡습패드(7)를 포함하여 구성된다. 상기 검체패드(1)는 검체(액상시료 또는 분석시료 또는 분석물)를 흡수하고 검체의 균일한 유동을 보장한다. 전혈, 혈장, 혈청, 눈물, 침, 소변, 콧물, 체액 등의 검체가 사용될 수 있다. 검체패드(1)는 검체에 대한 선택성을 보다 향상시키기 위해 또는 검체에 포함될 수 있는 간섭물질에 의한 영향을 최소화하기 위해 필터링 기능을 추가로 포함할 수 있다.
검체패드(1)에 투하된 검체는 검체 표적물질과 반응하는 제1검출리간드(9)-표지체(8)로 구성된 제1접합체와, 검체 표적물질과는 반응하지 않는 제2검출리간드(12)-표지체(8)로 구성된 제2접합체를 포함하는 접합체패드(2)를 통과하며, 표지화된 접합체(labeled conjugate)들은 검출결과를 나타내는 검출패드(5)로 이동한다.
상기 검출패드(5)는 서로 이격되어 위치하는 검사선(3) 및 대조선(4)을 포함하며, 상기 검사선(3)은 검체 내 표적물질과 반응하는 포획리간드(11)가 고정되어 있다.
상기 대조선(4)은 검체와 반응하지 않고 제2검출리간드(12)와 반응하는 외부물질(13)이 고정되어 있다.
도 2는 본 발명의 검출패드(5)상의 검사선(3)에 결합하는 결합체에 대한 설명도이다. 도 2에서 (a)는 검량선을 구하기 위해 일정 농도의 표준물질이 검체패드에 투하된 경우, (b)는 표적물질을 측정하기 위해 검체가 검체패드에 투하된 경우, (c1)은 표적물질이 존재하지 않는 검체와 일정량의 표준물질(SHook)이 함께 투하된 경우, 그리고 (c2)는 최대 신호값을 벗어난 과량의 표적물질이 존재하는 검체와 일정량의 표준물질(SHook)이 함께 투하된 경우이다.
도 2의(a)에서 검사선(3)은 S0에서 S7까지 투하된 표준물질(14) 부위 가운데 표지체(8)가 접합된 제1접합체의 제1검출리간드(9)가 결합하는 부위와는 다른 부위(에피토프: epitope)에 결합하는 포획리간드(11)를 포함한다.
도 2의(b)에서 검사선(3)은 검체의 표적물질(10) 부위 가운데 표지체(8)가 접합된 제1검출리간드(9)가 결합하는 부위와는 다른 부위(에피토프: epitope)에 결합하는 포획리간드(11)를 포함한다.
도 2의(c1)에서 검사선(3)은 일정량의 표준물질(SHook)과 표적물질을 함유하지 않는 검체가 함께 투여되었을 때 표지화된 제1검출리간드(9)와 결합하는 표준물질(14)의 부위와는 다른 부위와 결합하는 포획리간드(11)를 포함한다.
도 2의(c2)에서 검사선(3)은 일정량의 표준물질(SHook)과 표적물질을 과량(최 대측정량 초과) 함유하는 검체가 함께 투여되었을 때 표지화된 제1검출리간드(9)가 결합하는 표적물질(10)의 부위와는 다른 부위와 결합하는 포획리간드(11)를 포함한다.
도 3은 본 발명의 다중스트립을 이용한 표준물질의 검량을 통한 검체 표적물질의 정량적 측정을 위한 개념도로서, 표준물질의 투여를 위한 부분인 표준물질스트립(S0-Sn), 과량의 표적물질에서 나타나는 위음성 신호를 구별하기 위한 부분인 위음성스트립(SHook + 검체), 그리고 검체를 반복 투여하는 부분인 검체스트립(15)으로 구성되어 있다.
실시예로서, 표준물질(S0-S7)은 완충액(buffer)의 배경잡음(background noise) 신호를 계상하기 위해 표준물질이 들어가지 않은 상태(S0)를 마련하고, 동적범위(dynamic range: 신호값의 최소값과 최대값 범위)에 해당하는 표준물질의 농도를 최소 농도(S1)에서 시작하여 최대 농도(S7)까지 투하한다.
일정량의 표준물질(SHook)과 검체를 함께 투하하는 것은 과량의 표적물질이 존재하여 표지화된 검출리간드를 포화시켜 검출신호가 미약해지거나 측정되지 않는 경우(후크 효과)와 애초 표적물질이 미량이거나 존재하지 않는 경우를 구별하기 위함이며, 검출신호가 약해지거나 소멸된 신호가 지속되면 과량의 표적물질이 있는 것으로 판단하며 미약하거나 없던 검출신호가 강해지게 되면 애초 표적물질이 없었던 것으로 판단한다.
검체 투하를 위한 복수의 투입구는 검체 표적물질의 측정을 반복하기 위함이며 검사선의 검출신호가 재현성있게 나타나는지 관찰하여 그 평균값을 사용하여 분석실험에 의한 오차를 감소시키도록 한다.
본 발명에서 다양한 농도의 표준물질을 이용하여 검량선(calibration curve)을 구하고자 할 때 적용할 수 있는 모델 혹은 함수는 다음과 같다.
(1) 일차함수 모델(Linear model): (a, b: 계수, error: 오차항, concentration: 농도)
2) 이차함수 모델(Quadratic model): (a,b,c: 계수, error: 오차항, concentration: 농도)
(3) 4-매개변수 로지스틱함수 모델(Four parameter logistic model):
(Top: 상부 점근선, Bottom: 하부 점근선, EC50: 최대반응의 50%를 나타내는 유효 농도, Slope: 기울기, concentration: 농도)
(4) 5-매개변수 로지스틱함수 모델(Five parameter logistic model):
(Top: 상부 점근선, Bottom: 하부 점근선, EC50: 최대반응의 50%를 생산하는 유효 농도,
Slope: 기울기, concentration: 농도, Asymmetry: 시그모이드 곡선의 EC50에 대한 비대칭도)
표준물질의 농도에 따른 신호세기는 일차함수, 이차함수, 4-매개변수 로지스틱 함수, 5-매개변수 로지스틱 함수와 같은 모델에 적용하여, 농도에 따른 신호세기의 예측값과 실제 값의 오차가 가장 적은 모델(함수)을 채택하여 검량선으로 선택하며; 검체의 표적물질의 신호세기를 상기의 검량선에 적용하여 그 농도를 결정한다.
다음으로 본 발명의 실시예로서 사람 혈청 PF4를 정량적으로 측정하는 신속 다중스트립 면역크로마토그래피 분석방법 및 장치를 상세히 설명한다.
단위 스트립(unit strip)은 검출패드(5)인 니트로셀룰로스 막의 검사선(3)에 마우스 항-PF4 항체(monoclonal antibody; R&D Systems, 미국)를 포획리간드(11)로, 대조선(4)에 토끼 IgG(polyclonal antibody; R&D Systems, 미국)를 외부물질(13)로 고정하여 제조한다.
제1접합체는 검사선(3)에 사용한 항체(포획리간드(11))와 다른 부위의 에피토프(epitope)를 인식하는 마우스 항-PF4 항체(polyclonal antibody; R&D Systems, 미국)(제1검출리간드(9))에 형광 표지체(8)가 접합된 것을 사용한다.
제2접합체는 염소 항-토끼 IgG 항체(polyclonal antibody; R&D Systems, 미국)(제2검출리간드(12))에 형광 표지체(8)가 접합된 것을 사용한다.
그리고 제1접합체와 제2접합체를 접합체패드(Millipore, 미국)(2)에 건조시킬 때 인산염 완충액으로 희석하여 사용한다.
접착물질이 포함된 플라스틱 지지대(6)에 검출패드(5)로서 니트로셀룰로스 막을 붙이고, 아래쪽으로 접합체패드(2)와 검체패드(1)를 순서대로 중첩하여 부착하며, 위쪽으로는 흡습패드(7)를 중첩하여 부착한 후 절단기로 잘라 면역크로마토 그래피 스트립을 제조하여 완성한다.
이러한 단위 스트립을 총 12개를 도 3과 같이 병렬로 연결하여 최종적으로 정량 가능한 다중스트립 면역크로마토그래피 분석 장치를 마련한다.
표준물질 PF4를 완충액에 희석하여 0 μg/mL (S0), 0.8 μg/mL (S1), 1.6 μg/mL (S2), 3.2 μg/mL (S3), 6.4 μg/mL (S4), 12.8 μg/mL (S5), 25.6 μg/mL (S6), 51.2 μg/mL (S7)가 되도록 준비하여 ‘S0’부터 S7’까지 각각 표시된 검체패드 위에 차례로 투하한다.
또한 완충액에 희석된 일정량의 표준물질(SHook; 예를 들면 최대 신호값의 절반 반응을 나타내는 농도인 EC50 / Half maximal effective concentration을 사용함)에 사람 혈청 검체를 함께 섞은 것을 준비하여 도 3의 ‘SHook + 검체’로 표시된 검체패드 위에 투하한다.
마지막으로 반복 투하를 위한 동일한 양의 혈청(완충액에 희석)도 준비하여, 도 3의 ‘검체’로 표시된 각각의 해당 검체패드에 투하한다.
검사선과 대조선 반응 결과인 검출신호는 형광 광원을 사용하여 발생하는 표지체(8)의 형광을 검출하는 장치로 측정할 수 있다.
도 4는 본 발명에서 사람의 혈청에 존재하는 표적물질 platelet factor 4(PF-4)를 측정하기 위하여 표준물질(PF4 단백질)에 대한 검량선(log-log 선형함수 적용)을 구한 예이다. 그래프 X축은 로그 농도(ng/mL)이고, Y축은 로그 신호세기(unit)이다. 즉, 표준물질 검량선(calibration curve)을 X 좌표는 로그 스케일의 농도로, Y좌표는 로그 스케일의 신호 세기로 잡은 일차함수 모델(linear model)이다.
혈액 검체에서 측정한 형광 신호세기를 나타내는 단백질 PF-4의 농도는 상기 검량선(도 4)에서 PF-4의 형광 신호세기에 해당하는 X-좌표를 읽어서 결정한다.
표준물질의 검량을 위한 투입구와 별도로 있는 3개의 검체 투입구를 통하여 표적물질의 형광 신호세기를 반복측정하고 그 평균값을 검량을 위한 최종 신호세기로 활용한다.
본 발명의 표준물질의 검량선을 이용한 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치는 기존에 생체물질의 신속한 정량측정이 어려웠던 것을 가능하게 함으로써 검사 장소, 검사 장비, 검사 시간 등에 제한이 있는 현장검사(POCT, point-of-care testing), 특히 정량검사가 필요한 경우에 해결책을 제공함으로써 새로운 의료 시장을 개척할 수 있다.
1: 검체패드(sample pad)
2: 접합체패드(conjugate pad)
3: 검사선(test line)
4: 대조선(control line)
5: 검출패드(detection pad)
6: 지지대(support)
7: 흡습패드(absorption pad)
8: 표지체(label)
9: 제1검출리간드(1st detection ligand)
10: 표적물질(target analyte)
11: 포획리간드(capture ligand)
12: 제2검출리간드(2nd detection ligand)
13: 외부물질(foreign material)
14: 표준물질(standard material)
15: 검체스트립(sample strip)
2: 접합체패드(conjugate pad)
3: 검사선(test line)
4: 대조선(control line)
5: 검출패드(detection pad)
6: 지지대(support)
7: 흡습패드(absorption pad)
8: 표지체(label)
9: 제1검출리간드(1st detection ligand)
10: 표적물질(target analyte)
11: 포획리간드(capture ligand)
12: 제2검출리간드(2nd detection ligand)
13: 외부물질(foreign material)
14: 표준물질(standard material)
15: 검체스트립(sample strip)
Claims (8)
- 검체패드(1), 접합체패드(2), 검출패드(5), 흡습패드(7)를 포함하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치에 있어서,
검체와 표준물질(Standard material)을 혼합한 혼합물이 투하되는 상기 검체패드(1)는 다중스트립 중 별도의 하나의 독립된 스트립으로 형성하고;
상기 접합체패드(2)는 표지체(8)를 포함하며, 상기 표지체(8)는,
검사선(3)에 나타나는 검출신호가 강해지면 표적물질(Target analyte)의 농도가 신호 최소값을 나타내는 농도보다 낮은 것으로 확인하기 위한 상기 표지체(8)이고,
반대로 상기 검사선(3)에 나타나는 상기 검출신호가 더 약해지거나 소멸이 지속되면 상기 표적물질(Target analyte)의 농도가 과도하게 높아 위음성을 나타내는 것으로 확인하기 위한 상기 표지체(8)이며;
상기 검출패드(5)는 검사선(3)과, 대조선(4)을 포함하며;
상기 혼합물을 흡수하는 흡습패드(7)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치.
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 표지체(8)에 신호를 나타내는 수단으로서 형광성 염료, 금콜로이드, 라텍스 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자 또는 효소 중 어느 하나를 이용하여 신호를 나타내는 장치인 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표준물질(Standard material) 또는 상기 표적물질(Target analyte)과 결합되어 있는 상기 표지체(8)의 신호를 측정하는 장치는, CCD 또는 CMOS로 측정하는 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표적물질(Target analyte)은 단백질, 항원, 항체, DNA, RNA, PNA 또는 압타머 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치.
- 청구항 1에 있어서, 상기 검체는 혈액, 오줌, 침, 척수액, 세포배양액 또는 미생물 배양액 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치.
- 다중스트립 면역크로마토그래피를 구성하는 각각의 단일 스트립은 검체패드(1), 접합체패드(2), 검출패드(5), 흡습패드(7)로 구성되며,
검체와 표준물질(Standard material)을 혼합한 혼합물을 상기 검체패드(1)에 투하하여,
검사선(3)에 나타나는 검출신호가 강해지면 표적물질(Target analyte)의 농도가 신호 최소값을 나타내는 농도보다 낮은 것으로 확인하기 위한 표지체(8);
반대로, 검사선(3)에 나타나는 상기 검출신호가 더 약해지거나 소멸이 지속되면 상기 표적물질(Target analyte)의 상기 농도가 과도하게 높아 위음성을 나타내는 것으로 확인하기 위한 상기 표지체(8)로 구성되며;
상기 혼합물이 투하되는 상기 검체패드(1)는 다중스트립 중 별도의 하나의 독립된 스트립에 형성된 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치에 있어서,
상기 접합체패드(2)는 제1검출리간드(9)-표지체(8)로 구성된 제1접합체와, 상기 표적물질(Target analyte)과는 반응하지 않는 제2검출리간드(12)-표지체(8)로 구성된 제2접합체를 포함하며;
상기 검출패드(5)는 상기 검체 내 표적물질과 반응하는 포획리간드(11)가 고정되어 있는 검사선(3)과;
상기 검체 내 표적물질과 반응하지 않고 제2검출리간드(12)와 반응하는 외부물질(13)이 고정되어 있는 대조선(4)을 포함하며;
상기 흡습패드(7)는 용액을 흡수하여 상기 면역 크로마토그래피 장치에 동력을 제공하는 것을 특징으로 하는 다중스트립 면역크로마토그래피 분석장치.
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Arpasiri Srisrattakarn et al., Diagnostics, 2020, Vol. 10, pp 1-16. 1부.* * |
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