KR102723401B1 - 천연 구조체의 생물형태 변형에 의해 얻은 활성 히드록시아파타이트로 만들어진 대형 3차원 다공성 골격 및 이의 제조방법 - Google Patents
천연 구조체의 생물형태 변형에 의해 얻은 활성 히드록시아파타이트로 만들어진 대형 3차원 다공성 골격 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 임상 적용에 적합한 높은 압축 강도 및 치수를 갖는, 다공성 목재로부터 얻은 히드록시아파타이트에 관한 것이다. 다공성 목재는 약 60% 내지 약 95%의 다공성을 갖고, 상기 다공성은 목재가 열분해 단계를 거친 후 측정되며, 라탄, 소나무, 아바치, 발사, 시포, 오크, 로즈우드, 켐파스 및 월넛 목재 중에서 선택된다. 히드록시아파타이트는 마그네슘, 스트론튬, 규소, 티타늄, 카보네이트, 포타시움, 소디움, 은, 갈륨, 구리, 철, 아연, 망간, 유로퓸, 가돌리늄과 같은 이온의 1종 이상으로 치환될 수 있다. 또한, 다공성 목재로부터 얻은 히드록시아파타이트를 포함하는 골 대체물이 개시된다. 골 대체물은 골 또는 골 부분, 좋기로는 기계적 하중을 받는 골, 예컨대 다리 및 팔의 장골, 좋기로는 경골, 비골, 대퇴골, 상완골 또는 요골의 대체 및 재생을 위하여 활용된다. 본 발명은 또한 목재로부터 생물형태의 히드록시아파타이트 골격을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 다공성 목재로부터 얻어진 히드록시아파타이트에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 골 대체물로 사용되기 위한, 다공성 목재로부터 얻어진 생물형태의 히드록시아파타이트 골격(scaffold)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 목재를 골 대체물로 사용될 수 있는 생물형태의 히드록시아파타이트 골격으로 전환시키는 방법에 관한 것이다.
현재의 세라믹 공정 및 엔지니어링은 대형 3차원 몸체의 생산을 가능하게 하는 잘 정립된 일련의 공정을 기반으로 한다. 보다 구체적으로, 혁신적인 세라믹 상은 화학량론적/이온 치환, 나노크기 및 표면 활성과 같은 특정한 성질이 특정한 기능을 담당하는 분말로서 합성될 수 있다. 적절한 형태 및 다공성을 갖는 거시적 3차원 몸체를 얻기 위하여 현재 사용되는 세라믹 공정은 (몸체를 강화시키기 위해) 3차원 몸체로 적절하게 형성된 합성 세라믹 분말의 열처리(소결)를 의미한다. 이러한 모든 단계는 적절한 물리화학적 및 기계적 특성을 갖는 3차원 세라믹을 얻기 위해 필요한데, 대부분의 특성들은 상기 세라믹 공정(특히, 소결 처리) 중에 열화된다. 기능성 세라믹 재료의 발전에 있어 현재 세라믹 공정과 관련된 심각한 제한은 이 분야의 발전을 저해한다.
오늘날, 현대 사회의 진화와 더불어, 기술 제품은 사람의 삶과 생산성을 꾸준히 증가시키는 역할을 담당하고 있으므로, 다양한 응용분야, 예컨대 건강, 환경, 에너지 분야에서 복잡하고 개인화된 요구에 대한 솔루션을 제공할 수 있는 영리한 도구가 절실히 필요하다. 따라서, 거시적-규모에서 복잡한 구조적 조직을 갖는 동시에, 나노 규모로 및 심지어 결정(crystal) 규모로 정의된 복잡한 구조를 갖는 거시적 장치의 반복가능한 대량 생산을 위해서는 새로운 접근법이 필요하다는 광범위한 의견이 있다. 이러한 거대 및 나노-구조는 중요하지만 영리한 기능적 효과를 유도하는데 적절하다.
세라믹 재료에 관한 전술한 문제들에 있어서, 복잡한 미세 및 거대-구조를 갖는 대형 고활성 세라믹을 개발하기 위하여 패러다임의 변화가 요구된다.
대형이고 하중을 받는(load-bearing) 골 결손의 재생에 특히 중점을 둔 골 골격은 세포에 의한 콜로니화가 가능하고 궁극적으로는 대형 골 결손을 재생하기 위하여 높은 생물활성을 갖는 다공성 3차원 세라믹이기 때문에 대표적인 예가 될 수 있다. 사실, 임상적 필요를 해결하기 위한 적절한 해결책은 현재까지 발견되지 않았다.
수십년 동안, 히드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2)는 골 무기질의 조성과 매우 흡사하고 우수한 생체적합성 및 골전도성(osteoconductivity)을 입증하였으므로, 골 지지를 위한 주요 재료로 인정받아왔다. 그러나, 히드록시아파타이트의 생체모방(biomimicry)은 그 나노크기 및 아파타이트 격자에서 칼슘 및 포스페이트를 부분적으로 대체하는 다중 이온의 존재와 관련되는데, 이들은 새로운 조직 형성, 재구성(remodeling) 및 재흡수 중의 골의 생물학적 활성의 원천이다.
소결 처리를 히드록시아파타이트 골격에 적용하면 표면 및 인접한 히드록시아파타이트 입자들 사이의 계면에서의 벌크 반응을 활성화시켜, 아파타이트 격자로부터 외래 이온의 방출 및 최대 수 마이크로미터까지의 입자 응집(coalescence), 및 비표면적의 감소, 친수성의 감소 및 단백질 및 세포와의 친화성의 감소가 일어난 결정 배치(crystal ordering)을 얻는다.
소결 공정에 의해 활성화된 광범위한 입자 응집은 입자들간(intergranular) 다공성의 감소 및 그 결과 전체 체적의 감소를 통해 전체 히드록시아파타이트 몸체의 강화를 초래한다. 또한, 이는 세라믹 재료에서 구조적 결함의 주요 원인 중 하나인 잔류 응력(residual stresses)을 발생시킨다. 실제로, 세라믹 재료에서 잔류 응력의 수용은 (금속 및 폴리머와 비교하여) 높은 강성으로 인해 어렵고, 세라믹 재료의 기계적 성능을 저해하는 가장 유용한 요인 중 하나이며, 특히 복잡한 형태 및 다공성 구조의 특징이 있는 대형 조각의 경우 그러한데, 이 경우 가열/냉각 순환 이후 체적 변화는 중대한 구조적 손상을 쉽게 유발한다.
상기 이유로, 고전적인 세라믹 합성 공정은 세라믹 재료, 특히 생체모방 조성 및 구조, 높은 생물활성 및 재흡수성(resorbability)을 갖는 히드록시아파타이트가 제조되는 것을 허용하지 않는다. 이는, 중대한 크기의 골 결손(즉, ≥ 2 cm)의 재생을 위하여 대형 다공성 3차원 세라믹이 합성될 경우 특히 정말이다.
생체모방 조성 및 구조는, 팔다리의 장골과 같은 하중을 받는 대형 골 부분의 재생을 독특하게 결정하고 촉진할 수 있는 생체내 재생 케스케이드를 유도함에 중추적으로 관련된다. 밀접하게 상호관련되어 있으며, 모든 기능을 갖는 골의 재생을 활성화하고 유지하기 위해 시너지를 발생시켜야 하는 이들 현상은 다음과 같다: i) 빠른 골생성(osteogenesis), 골전도 및 골결합(osteointegration); ii) 광범위한 혈관 형성; iii) 점진적 생체-재흡수 능력.
빠른 골생성 및 골전도는 골격 내로 광범위한 골 형성 및 침투를 가능하게 하여, 빈틈없는 골/골격 계면 및 최적의 골결합을 야기한다. 이러한 효과를 달성하기 위해서는, 새로운 골 조직의 광범위한 침투 외에 새로운 골의 형성 및 성숙을 돕는 혈관 네트워크의 동시 형성이 이루어질 수 있도록, 골-유사 화학 조성 뿐만 아니라 폭넓게 개방된 상호연결된 다공성이 요구된다. 골격의 불완전한 콜로니화는 공극, 섬유 조직 또는 괴사 부위 형성을 야기할 수 있으며, 골/골격 구조의 전반적인 강도 및 생체역학적 성능을 감소시킬 것이다.
새로운 골 형성과 양립가능한 시간 내에, 골격은 손상 또는 질병 후 최적의 골 재생을 이루기 위하여 점진적으로 재흡수되어야 한다. 지금까지 개발된 모든 3차원 골 골격은, 나노결정의, 나노크기의, 이온치환된 아파타이트와 비교하여, 파골세포 활성을 방해하는 결정질 재료인 소결된 칼슘 포스페이트를 기반으로 한다; 따라서, 다공성 골 히드록시아파타이트 골격이 표면 접착에 의해 주변 골 내로 잘 결합될 수 있다고 하더라도, 생체-재흡수의 결여는 완전한 재구성 과정, 즉 골격을 새로운 골로 대체하는 것을 허용하지 않는다. 이로 인해, 특히 매우 길고 하중을 받는 골 조각의 경우에는 병에 걸린 골의 기능적 능력을 불완전하게 회복한다.
특히, 길고 하중을 받는 골의 경우, 골격은 폭넓게 개방된 거대-다공성을 유지하면서 적절한 기계적 성능을 나타내야 하는데, 이들 성질이 일반적으로 반비례한다는 점(즉, 다공성이 클수록 기계적 저항성이 낮아짐)과, 적절한 골격 콜로니화 및 골결합을 제공하기 위해서는 높은 다공성 정도가 요구된다는 점을 고려하면, 하나의 도전이다. 이는 길고 하중을 받는 골의 광범위한 부분을 재생함에 있어 현재의 골격의 적용을 제한하는 가장 중요한 요소 중 하나이다. 이러한 측면에서, 계층적으로-구조화된 다공성 구조를 갖는 골격은, 유사하지만 무작위로 구조화된 다공성을 갖는 재료와 비교하여, 우수한 기계적 성능을 나타낼 수 있다. 이러한 측면에서, 이렇게 구조화된 구조를 갖는 골격만이 세포 수준에서 효율적으로 기계적-변환 과정을 활성화시켜, 성숙하고 구조화된, 기계적으로 만족할만한 골의 재생을 촉발시킬 수 있다.
상기 제안된 혁신은, 고전적인 세라믹 합성 공정으로부터, 정의된 화학 조성을 갖고, 계층적으로 조직화된 천연 구조로부터 시작하여 복잡한 형태 및 계층 구조를 갖고, 동시에 최적화된 기계적 성능을 갖는 대형 3차원 몸체로 구조화된 세라믹 상의 생성을 가능하게 하는 새로운 방식의 반응성 소결로의 패러다임 변화를 기반으로 한다. 이러한 측면에서, 생물형태 변형은 계층적으로 구조화된 천연 구조(예컨대, 목재, 식물, 외골격)에 적용할 수 있는 혁신적인 접근법의 지주이다.
각각 스펀지 및 피질골(cortical bone)의 구조 및 기계적 성능을 재현하기 위하여, 소나무 및 라탄과 같이 다공성 구조를 갖는 목재, 및 레드 오크 및 시포와 같이 보다 밀도있는 목재를 주형으로 사용하여, 목질 구조로부터 골-모방 세라믹으로의 생물형태 변형이 성공적으로 시도되었다.
생체모방 히드록시아파타이트 골격의 형성에 목재를 사용하는 것은 문헌에 보고되었다 (Anna Tampieri et al. in the Journal of Material Chemistry, 2009, 19, 4973-4980). 이 문헌에서, 탬피에리 등은 라탄 목재 및 소나무의 1 cm 길이 조각(따라서, 작은 조각으로서, 중대한 크기의 결손의 재생에는 적합하지 않음)을 히드록시아파타이트로 전환하는 공정을 기술한다. 이 과정은 완만한 가열 속도를 이용하여 1000℃의 온도에서 목재 시편을 열분해시킨 후, 탄소 주형이 칼슘 카바이드로 변형되는 침탄(carburization)을 포함한다. 침탄은 액상 침투 또는 증기상 침투에 의해 달성되었다. 증기 침투는 칼슘(1484℃)의 끓는점보다 높은 온도에서 수행되었다. 침탄 과정은 열분해된 목재를 800℃에서 초기 가열한 후, 1100℃로 가열 하고, 마지막으로 3시간 동안 1650℃로 가열하는 것을 포함한다. 반응이 완료될 수 있도록 열분해된 목재를 3시간 동안 이 온도로 가열하는 것이 필요하였다. 침탄 후, 천연 목재의 형태는 보존하면서, 3차원 칼슘 카바이드 골격은 산화되어 칼슘 카바이드가 칼슘 옥사이드로 변형되었다. 산화 후, 3차원 칼슘 옥사이드 골격은 탄산화되어 칼슘 옥사이드 골격이 칼슘 카보네이트 골격으로 변형되었다. 높은 압력 값(2.2 MPa)은 CaO 구조의 코어까지 성형 CaCO3 스케일을 통해 CO2의 침투를 허용하기 위해 사용되었다. 마지막으로, 인산염화(phosphatization) 단계는 칼슘 카보네이트 골격을, 천연 목재와 유사하게 계층적으로 구조화된 이방성(anisotropic) 형태를 갖는 히드록시아파타이트 골격으로 변형하기 위하여 수행되었다. 이 단계 중에, 목재-유래 CaCO3 주형은 1.2 MPa 압력 하에 200℃의 온도에서 KH2PO4 수용액에 24시간 동안 침지되었다.
상기 기술된 공정은 천연 목재의 계층적으로 구조화된 이방성 형태를 갖는 히드록시아파타이트 세라믹 골격을 얻었다.
소나무에서 유래한 골격의 압축 강도는 세로 방향으로 측정할 때 2.5 내지 4 MPa 범위이고, 가로 방향으로 측정할 때 0.5 내지 1 MPa 범위였다. 따라서, 상기 공정에 의해서는 제한된 치수, 전형적으로 1 cm 미만의 골격만이 얻어질 수 있다. 또한, 크기가 ≤ 1 cm인 것과 관련된 낮은 값의 압축 강도는 특히 하중을 받는 골의 경우에는 이들 골격을 골 재생에 적절하지 않게 만든다. 실제로, 골 결손은 영향을 받은 골의 지름의 2-3배의 길이를 갖는다는 것이 중요하게 받아들여진다. 따라서, 이러한 측면에서 1 cm 크기의 골격은 유용하다고 간주될 수 없다.
목재의 히드록시아파타이트로의 전환에서 전술한 인산염화 단계는 문헌에 더욱 자세하게 보고되었다 (uffini et al. in Chemical Engineering Journal 217 (2013) 150-158). 이 문헌에는, 직경 8 mm 및 길이 10 mm의 라탄-유래 칼슘 카보네이트의 원통형 주형이 출발 물질로 사용되었다. 인산염화 공정은 디암모늄 하이드로겐 포스페이트, 암모늄 디하이드로겐 포스페이트 및 암모니아의 수용액을 사용하여 수행되었다.
2012년 5월 18일에 공개된 특허 출원 WO 2012/063201은 적어도 하나의 다공성 목재로부터 얻어지는 히드록시아파타이트를 기반으로 하는 코어, 및 상기 코어의 적어도 하나의 목재보다 낮은 다공성을 갖는 적어도 하나의 목재로부터 얻어지는 히드록시아파타이트 또는 실리콘 카바이드를 기반으로 하는 쉘을 포함하는 골 대체물을 기술한다. 쉘은 코어를 수용하기에 적합한 중공 원통 형태로 제조되었고, 코어는 쉘의 공동 내로 삽입되는 단단한 원통으로 제조될 수 있었다. 골 대체물을 얻는 과정도 상기 출원에 기술되어 있다. 첫번째 단계는 라탄 또는 소나무와 같은 천연 목재를 800 내지 2000℃의 온도에서 가열하는 열분해이다. 이 공정으로부터 탄소 재료가 얻어진다. 두번째 단계에서, 탄소 재료는 1500 내지 1700℃에서 칼슘 카바이드로 변형된다. 다음으로, 칼슘 카바이드는 900 내지 1000℃의 온도에서 산화된다. 칼슘 옥사이드 재료를 칼슘 카보네이트로 전환시키기 위하여, 2.2 MPa의 CO2 압력 및 400℃의 온도에서 탄산화를 24시간 동안 수행한다. 그 다음, 칼슘 카보네이트 재료는 인산염화에 의해 카보네이트로 부분적으로 치환된 히드록시아파타이트로 변형된다. 생성된 라탄 유래의 히드록시아파타이트 골격은 압축 강도가 세로 방향으로 4 내지 5 MPa 이고, 가로 방향으로 1 MPa 이었다.
상기 문헌은 라탄 및 소나무와 같은 목재의 히드록시아파타이트로의 성공적인 변형을 기술하고 있지만, 목재의 3차원 형태를 잘 재현하는 반면, 하중을 받는 골의 긴 조각의 재생에 적합한 성질을 나타내는 골격은 얻을 수 없었다.
실제로, 상기 모든 문헌들은 실제 임상 적용, 특히 하중을 받는 대형 골 부분의 재생에 적용이 불가능한, 작은 치수(즉, 부피가 1 cm3 미만)를 갖는, 목재로부터 얻은 히드록시아파타이트 골격에 관한 것이다. 선행 기술에 기술된 공정들은 임상 적용, 특히 대형, 즉 적어도 2 cm 크기를 갖는 골격이 필요한, 하중을 받는 중대한 크기의 골 결손의 재생에 편리한 치수를 갖는 히드록시아파타이트 골격을 제조하는데 적합하지 않다.
따라서, 적절한 기계적 성능을 나타내는 생체모방 화학 조성을 갖고, 세포 콜로니화 및 혈관 성장에 유리한 형태를 갖고, 동시에 임상 적용에 적합한 치수를 갖는, 생체모방 골격, 특히 다공성 3차원 골격에 대한 기술이 여전히 요구된다.
이러한 생물형태 골격은 특히 골 재생, 특히 팔다리의 장골(예컨대, 대퇴골, 경골, 상완골, 비골)과 같이 하중을 받는 골 결손에 이식에 적합할 뿐만 아니라, 척추골(예컨대, 척추체, 추간판), 두개골-부분(cranial bone-parts) 또는 상악안면골-부분(maxillofacial bone-parts)의 대체 및 재생에 적합하다.
본 발명은 생물형태 골격, 좋기로는 특히 골 대체 및 재생에 적합한, 특히 하중을 받는 장골의 대체 및 재생에 적합한 히드록시아파타이트 골격을 제공함으로써 상기 요구를 충족시킨다.
본 발명은 또한 생체모방 골격, 좋기로는 3차원 생체모방 골격을 제조하는 방법을 제공함으로써 상기 요구를 충족시킨다. 특히, 생체모방 골격은 히드록시아파타이트 골격이다.
일반적으로, 본 발명은 전체 다공성이 60% 내지 95%인 목재로부터 얻은 히드록시아파타이트 골격을 기술하는데, 상기 다공성은 목재가 열분해 단계를 거친 후 측정되고, 상기 골격은 그 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm 이상이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 전체 다공성이 60% 내지 95% (상기 다공성은 목재가 열분해 단계를 거친 후 측정됨)인 목재로부터 얻은 생물형태의 히드록시아파타이트 골격을 기술하는데, 상기 히드록시아파타이트는 계층적으로 구조화된 기공 구조, 및 5 MPa 초과, 좋기로는 10 MPa 내지 20 MPa의 통로-유사 기공들을 따르는 방향(세로 방향)으로 측정된 압축 강도를 특징으로 한다.
좋기로는, 본 발명의 히드록시아파타이트는 통로 장축의 수직 방향(가로 방향)을 따라 압축 강도가 최대 10 MPa 이다.
좋기로는, 목재로부터 얻은 생물형태의 히드록시아파타이트 골격은 목재(천연 목재)로부터 얻어지는 목재의 계층적으로 구조화된 기공 구조로부터 유래하는, 계층적으로 구조화된 기공 구조를 갖는다.
또한, 본 발명은 목재로부터 유래된 생물형태의 히드록시아파타이트 골격에 관한 것으로, 여기서 히드록시아파타이트는 마그네슘, 스트론튬, 규소, 티타늄, 카보네이트, 소디움, 포타시움, 은, 갈륨, 구리, 철, 아연, 망간, 유로퓸 및 가롤리늄을 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상의 이온으로 부분적으로 치환(도핑)된다.
생물형태의 히드록시아파타이트가 유래되는 목재는 전체 다공성이 60% 내지 95%, 좋기로는 65% 내지 85%이다 (상기 다공성은 목재가 열분해 단계를 거친 후 측정됨). 이 범위 내에서 다공성을 나타내는 목재는 라탄, 소나무, 아바치(abachi), 발사(balsa), 시포(sipo), 오크, 로즈우드, 켐파스 및 월넛 목재를 포함한다. 좋기로는, 생물형태의 히드록시아파타이트는 라탄 목재로부터 얻어진다.
본 발명의 목재로부터 얻은 생물형태의 히드록시아파타이트 골격은 골 대체물로서 사용하기에 특히 적합하도록 만드는 구조적 응집력 및 기계적 특성을 갖는다.
따라서, 본 발명은 생물형태의 히드록시아파타이트 골격의 골 대체물로서의 용도, 및 상기 생물형태의 히드록시아파타이트 골격을 포함하는 골 대체물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 생물형태의 히드록시아파타이트 골격으로 이루어진 골 대체물에 관한 것이다.
목재로부터 유래된 생물형태의 히드록시아파타이트 골격은 골 또는 골 부분, 특히 인간 및 동물의 골의 재생을 위한 골 대체물로서 사용될 수 있다. 좋기로는, 목재로부터 유래된 생물형태의 히드록시아파타이트 골격은 기계적 하중을 받는 골 또는 골 부분을 위한 골 대체물로서 사용될 수 있다. 더욱 좋기로는, 골 또는 골 부분은 다리 및 팔의 장골, 예컨대 경골, 중족골, 비골, 대퇴골, 상완골 또는 요골이다.
또한, 목재로부터 유래된 생물형태의 히드록시아파타이트 골격은 두개골-부분, 상악안면골-부분 및 척추골(예를 들어, 척추체, 추간판)의 대체 및/또는 재건에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 생물형태의 히드록시아파타이트 골격은 액체 또는 가스용 필터로서 사용될 수도 있다.
또한, 본 발명은 목재로부터 유래된 생물형태의 히드록시아파타이트 골격을 얻기 위한 방법을 기술한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 그 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm 이상인, 생물형태의 히드록시아파타이트 골격을 제조하는 방법을 기술하며, 상기 방법은 전체 다공성이 적어도 20%, 좋기로는 적어도 40%, 더욱 좋기로는 60% 내지 95%인 목재(천연 목재)의 조각의 열분해, 침탄, 산화, 수화, 탄산화 및 인산염화의 단계들을 포함하며, 상기 다공성은 목재가 열분해 단계를 거친 후 측정된다.
본 발명의 방법에 적용될 수 있는 천연 목재의 예로는 다음을 들 수 있다: 라탄, 소나무, 아바치, 발사, 시포, 오크, 로즈우드, 켐파스 및 월넛.
다수의 구현예가 개시되고 있지만, 아래의 상세한 설명으로부터 또 다른 구현예들이 당업자에게 명백해질 것이다. 본원에 개시된 특정 구현예는 개시 내용을 벗어나지 않는 한, 다양하고 명백한 측면에서 수정이 가능하다. 따라서, 도면 및 상세한 설명은 본질적으로 예시적인 것이며 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
아래 도면은 본원에 개시된 주제의 바람직한 구현예를 예시한다. 청구된 주제는 첨부된 도면과 관련하여 취해진 아래의 설명을 참조함으로써 이해될 수 있다.
도 1은 중앙 통로를 특징으로 하는 생물형태 골격의 특정 일 구현예를 도시한다.
도 2는 8주 후에 외식한(explanted) 마우스 두개관(calvaria)의 조직을 묘사하는 사진이다. 골격 기공의 광범위한 골 형성 및 침투는 단독으로 또는 골생성 기질 세포와 함께 이식되었을 때 비슷한 정도로 달성되었고, 여기서 a)는 목재 및 무세포(no cells)을 나타내고, b)는 히드록시아파타이트 및 무세포를 나타내며, c)는 목재 및 세포, 및 d)는 히드록시아파타이트 및 세포를 나타낸다. 도 2에서 화살표는 Haversian 시스템을 모방하는 골격의 통로-유사 기공을 가리킨다. Haversian 시스템 또는 골단위(osteons)는 동심 층으로 조직화된 골 라멜라(lamellae)로 만들어진 원통 형태의 치밀뼈(compact bone)의 기능적 단위이다. 골단위의 가운데에는 골의 신경 및 혈액 공급을 포함하는 통로가 존재한다.
도 3은 압축 하중을 받는 생물형태 골격의 응력-변형(stress-strain) 곡선을 도시하는데, 여기서 y = 응력(N), 및 x = 변형률(deformation)(mm)이다.
도 4는 당업계에 공지된 공정으로 얻은 계층적으로 구조화된 히드록시아파타이트(HA)의 기공 부피와 비교하여 본 발명의 생물형태 히드록시아파타이트(HA)의 내부 기공 부피의 분포를 도시한다.
도 5는 24시간, 48시간, 72시간, 7일 및 14일 후 스트론튬-없는(Sr 0%) 골격(BC)과 비교하여, 2 및 5 몰%의 Sr을 포함하는 골격을 접촉할 경우 중간엽 줄기세포의 향상된 생존력을 나타내는 그래프이다. y = BC에 대한 %.
도 6은 스트로튬을 2 몰%(Sr2%-BC) 및 5 몰%(Sr5%-BC) 함유하는 골격에서 (a) RUNX2 및 (b) ALP와 같은 골생성-관련 유전자의 발현을 나타내는 그래프이다. y = BC에 대한 배수-변화(fold-change) 발현, 및 x = 일수(days).
도 7은 24시간, 48시간, 72시간, 7일 및 14일 후 스트론튬-없는 골격(BC)과 비교하여, 2 몰%(Sr2%-BC) 및 5 몰%(Sr5%-BC)의 Sr을 포함하는 골격을 접촉할 경우 골아세포 생존력을 나타내는 그래프이다. y = BC에 대한 %.
도 8은 스트로튬을 2 몰%(Sr2%-BC) 및 5 몰%(Sr5%-BC) 함유하는 골격에서 (a) Osterix, (b) BGlap, 및 c) IBSP와 같은 골생성-관련 유전자의 발현을 나타내는 그래프이다. y = CT에 대한 배수-변화 발현, 및 x = 일수.
도 9는 스트로튬을 2 몰%(Sr2%-BC) 및 5 몰%(Sr5%-BC) 함유하는 골격에서 (a) Osacr, (b) CTSK, 및 c) Itg β3와 같은 파골세포-관련 유전자의 발현을 나타내는 그래프이다. y = CT에 대한 배수-변화 발현, 및 x = 일수. 시간 경과에 따른 파골세포의 주요 분자 경로에 관여하는 유전자의 유의한 감소를 볼 수 있다; 따라서, 골격 내의 Sr2 + 이온의 존재는 파골세포 형성 및 활성을 억제한다는 것을 나타낸다; 도면 a)에서 14일 데이터는 검출 한계 미만이었다.
도 10은 선행 기술의 침탄 단계 및 본 발명의 침탄 단계 후 얻은 두 가지 칼슘 카바이드 골격의 기공 분포를 비교하여 도시하고, 또한 초기 열분해된 목재의 기공 분포와 비교하여 도시한다. 두 가지 칼슘 카바이드 골격의 비표면적도 도면에 보고되었다.
도 11, 도 12, 및 도 13의 상단의 두 사진은 각각 본 발명 및 선행 기술의 방법으로 얻은 두 가지 칼슘 카바이드 골격의 SEM 사진이다.
도 13의 하단의 두 사진은 칼슘 카바이드 입자의 치수를 비교하여 도시한다.
도 14는 각각 본 발명의 방법 및 선행 기술의 방법으로 얻은 두 가지 칼슘 카바이드 골격의 결정상(crystal phase)을 비교하여 도시한다.
도 15는 본 발명의 산화 단계 및 선행 기술의 산화 단계 후 얻은 칼슘 옥사이드 골격의 SEM 사진이다.
도 16은 각각 본 발명의 산화 단계 및 선행 기술의 산화 단계 후 얻은 두 가지 칼슘 옥사이드 골격의 기공 분포를 도시한다.
도 17 및 도 18은 각각 본 발명의 탄산화 단계 및 선행 기술의 탄산화 단계 후 얻은 칼슘 카보네이트 골격의 SEM 사진이다.
도 19는 각각 본 발명의 탄산화 단계 및 선행 기술의 탄산화 단계 후 얻은 두 가지 칼슘 카보네이트 골격의 기공 분포를 도시한다.
도 20은 본 발명의 방법으로 얻은 최종 생물형태 히드록시아파타이트 골격(인산염화 후) 및 선행 기술의 최종 생물형태 히드록시아파타이트 골격의 기공 분포를 비교하여 도시한다.
도 21은 골격 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm 이상인 라탄 목재 조각을 선행 기술에 기술된 조건에 따른 공정 단계들을 거치게 한 후 얻은 결과물을 도시한다; 인산염화 단계 전에도 골격은 부서질 수 있다.
도 22는 골격 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm 이상인 라탄 목재 조각을 선행 기술에 기술된 조건에 따른 공정 단계들을 거치게 한 후 얻은 결과물을 도시한다; 인산염화 단계까지 골격이 살아남더라도, 인산염화 후 골격은 부서진다.
도 23은 모든 시험된 시료로 동적 조건에서 mMSCs의 3차원 배양 14일 후, 캘리브레이터로 사용된 비도핑 선행 기술 골격의 발현에 대하여 유전자 발현의 상대적 정량화(2-ΔΔCt)를 도시한다.
도 24는 직육면체 형태를 갖는 생물형태 골격의 일 구현예를 도시한다.
도 25는 본 발명의 방법으로 얻은 생물형태 히드록시아파타이트 골격의 통로-유사 구조가 투과성 대형 통로(100-300 마이크론 직경)(마이크로 CT 스캔)를 고유한 특징으로 한다는 것을 보여준다. 이러한 통로는 골 재생을 지원하는 적절한 혈관의 형성을 허용한다.
도 2는 8주 후에 외식한(explanted) 마우스 두개관(calvaria)의 조직을 묘사하는 사진이다. 골격 기공의 광범위한 골 형성 및 침투는 단독으로 또는 골생성 기질 세포와 함께 이식되었을 때 비슷한 정도로 달성되었고, 여기서 a)는 목재 및 무세포(no cells)을 나타내고, b)는 히드록시아파타이트 및 무세포를 나타내며, c)는 목재 및 세포, 및 d)는 히드록시아파타이트 및 세포를 나타낸다. 도 2에서 화살표는 Haversian 시스템을 모방하는 골격의 통로-유사 기공을 가리킨다. Haversian 시스템 또는 골단위(osteons)는 동심 층으로 조직화된 골 라멜라(lamellae)로 만들어진 원통 형태의 치밀뼈(compact bone)의 기능적 단위이다. 골단위의 가운데에는 골의 신경 및 혈액 공급을 포함하는 통로가 존재한다.
도 3은 압축 하중을 받는 생물형태 골격의 응력-변형(stress-strain) 곡선을 도시하는데, 여기서 y = 응력(N), 및 x = 변형률(deformation)(mm)이다.
도 4는 당업계에 공지된 공정으로 얻은 계층적으로 구조화된 히드록시아파타이트(HA)의 기공 부피와 비교하여 본 발명의 생물형태 히드록시아파타이트(HA)의 내부 기공 부피의 분포를 도시한다.
도 5는 24시간, 48시간, 72시간, 7일 및 14일 후 스트론튬-없는(Sr 0%) 골격(BC)과 비교하여, 2 및 5 몰%의 Sr을 포함하는 골격을 접촉할 경우 중간엽 줄기세포의 향상된 생존력을 나타내는 그래프이다. y = BC에 대한 %.
도 6은 스트로튬을 2 몰%(Sr2%-BC) 및 5 몰%(Sr5%-BC) 함유하는 골격에서 (a) RUNX2 및 (b) ALP와 같은 골생성-관련 유전자의 발현을 나타내는 그래프이다. y = BC에 대한 배수-변화(fold-change) 발현, 및 x = 일수(days).
도 7은 24시간, 48시간, 72시간, 7일 및 14일 후 스트론튬-없는 골격(BC)과 비교하여, 2 몰%(Sr2%-BC) 및 5 몰%(Sr5%-BC)의 Sr을 포함하는 골격을 접촉할 경우 골아세포 생존력을 나타내는 그래프이다. y = BC에 대한 %.
도 8은 스트로튬을 2 몰%(Sr2%-BC) 및 5 몰%(Sr5%-BC) 함유하는 골격에서 (a) Osterix, (b) BGlap, 및 c) IBSP와 같은 골생성-관련 유전자의 발현을 나타내는 그래프이다. y = CT에 대한 배수-변화 발현, 및 x = 일수.
도 9는 스트로튬을 2 몰%(Sr2%-BC) 및 5 몰%(Sr5%-BC) 함유하는 골격에서 (a) Osacr, (b) CTSK, 및 c) Itg β3와 같은 파골세포-관련 유전자의 발현을 나타내는 그래프이다. y = CT에 대한 배수-변화 발현, 및 x = 일수. 시간 경과에 따른 파골세포의 주요 분자 경로에 관여하는 유전자의 유의한 감소를 볼 수 있다; 따라서, 골격 내의 Sr2 + 이온의 존재는 파골세포 형성 및 활성을 억제한다는 것을 나타낸다; 도면 a)에서 14일 데이터는 검출 한계 미만이었다.
도 10은 선행 기술의 침탄 단계 및 본 발명의 침탄 단계 후 얻은 두 가지 칼슘 카바이드 골격의 기공 분포를 비교하여 도시하고, 또한 초기 열분해된 목재의 기공 분포와 비교하여 도시한다. 두 가지 칼슘 카바이드 골격의 비표면적도 도면에 보고되었다.
도 11, 도 12, 및 도 13의 상단의 두 사진은 각각 본 발명 및 선행 기술의 방법으로 얻은 두 가지 칼슘 카바이드 골격의 SEM 사진이다.
도 13의 하단의 두 사진은 칼슘 카바이드 입자의 치수를 비교하여 도시한다.
도 14는 각각 본 발명의 방법 및 선행 기술의 방법으로 얻은 두 가지 칼슘 카바이드 골격의 결정상(crystal phase)을 비교하여 도시한다.
도 15는 본 발명의 산화 단계 및 선행 기술의 산화 단계 후 얻은 칼슘 옥사이드 골격의 SEM 사진이다.
도 16은 각각 본 발명의 산화 단계 및 선행 기술의 산화 단계 후 얻은 두 가지 칼슘 옥사이드 골격의 기공 분포를 도시한다.
도 17 및 도 18은 각각 본 발명의 탄산화 단계 및 선행 기술의 탄산화 단계 후 얻은 칼슘 카보네이트 골격의 SEM 사진이다.
도 19는 각각 본 발명의 탄산화 단계 및 선행 기술의 탄산화 단계 후 얻은 두 가지 칼슘 카보네이트 골격의 기공 분포를 도시한다.
도 20은 본 발명의 방법으로 얻은 최종 생물형태 히드록시아파타이트 골격(인산염화 후) 및 선행 기술의 최종 생물형태 히드록시아파타이트 골격의 기공 분포를 비교하여 도시한다.
도 21은 골격 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm 이상인 라탄 목재 조각을 선행 기술에 기술된 조건에 따른 공정 단계들을 거치게 한 후 얻은 결과물을 도시한다; 인산염화 단계 전에도 골격은 부서질 수 있다.
도 22는 골격 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm 이상인 라탄 목재 조각을 선행 기술에 기술된 조건에 따른 공정 단계들을 거치게 한 후 얻은 결과물을 도시한다; 인산염화 단계까지 골격이 살아남더라도, 인산염화 후 골격은 부서진다.
도 23은 모든 시험된 시료로 동적 조건에서 mMSCs의 3차원 배양 14일 후, 캘리브레이터로 사용된 비도핑 선행 기술 골격의 발현에 대하여 유전자 발현의 상대적 정량화(2-ΔΔCt)를 도시한다.
도 24는 직육면체 형태를 갖는 생물형태 골격의 일 구현예를 도시한다.
도 25는 본 발명의 방법으로 얻은 생물형태 히드록시아파타이트 골격의 통로-유사 구조가 투과성 대형 통로(100-300 마이크론 직경)(마이크로 CT 스캔)를 고유한 특징으로 한다는 것을 보여준다. 이러한 통로는 골 재생을 지원하는 적절한 혈관의 형성을 허용한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 "계층적 기공 구조" 또는 "계층적으로 구조화된 기공 구조"는 이방성 3차원 기공 구조를 갖는 재료를 지시하며, 여기서 통로-유사 기공은 가로 방향 통로를 통해 상호연결되고 마이크로 및 나노-기공이 통로-유사 기공을 둘러싸는 영역에 존재한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 "압축 강도" 값은 다음의 설명에 기재된 방법으로 통로-유사 기공에 대하여 세로 방향 및 가로 방향을 따라 기계적 힘을 가함으로써 얻어진다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 "골 결손"이라 함은 골의 손실된 부분 또는 일부 또는 손실되어 본 발명의 골격에 의해 완전히 대체될 필요가 있는 골 전체를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "생물형태 히드록시아파타이트"는: 1) 히드록시아파타이트로 구성되거나, 또는 2) 히드록시아파타이트를 포함하거나, 또는 3) 히드록시아파타이트 및 트리칼슘 포스페이트를 포함하거나 그들로 구성된 재료를 의미한다. 재료가 히드록시아파타이트 및 트리칼슘 포스페이트로 구성되는 경우, 재료는 2상 재료이다. 본 발명의 일 구현예에서, "생물형태 히드록시아파타이트"가 히드록시아파타이트 및 트리칼슘 포스페이트를 포함하거나 그들로 구성된 재료인 경우, 히드록시아파타이트는 마그네슘, 스트론튬, 규소, 티타늄, 카보네이트, 포타시움, 소디움, 은, 갈륨, 구리, 철, 아연, 망간, 유로퓸, 가롤리늄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 이온으로 부분적으로 도핑된다.
본 발명자들은 놀랍게도, 생체모방 화학 조성, 적절한 기계적 성능, 세포 콜로니화 및 혈관 성장에 유리한 형태를 나타내고, 및 동시에 임상 적용에 적합한 치수를 갖는, 생물형태의 히드록시아파타이트 골격을 목재로부터 얻을 수 있음을 발견하였다.
첫번째 측면에서, 본 발명은 전체 다공성이 적어도 20%, 좋기로는 적어도 40%, 더욱 좋기로는 60% 내지 95%인 목재로부터 얻은 생물형태의 히드록시아파타이트 골격을 기술하며, 여기서 상기 다공성은 목재가 열분해 단계를 거친 후 측정되고, 상기 골격은 그 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm 이상이다.
본 발명의 공정 후에 얻어진 생물형태의 히드록시아파타이트 골격의 전체 다공성은 목재가 열분해 단계를 거친 후 측정된 출발 목재의 전체 다공성과 동일하다. 특히, 본 발명의 공정 후에 얻어진 생물형태의 히드록시아파타이트 골격의 전체 다공성은 적어도 20%, 좋기로는 적어도 40%, 더욱 좋기로는 60% 내지 95%이다.
좋기로는, 골격은 그 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm 이상이고, 임상 적용에 따라 결정된 최종 값에 도달한다. 예를 들어, 경골, 대퇴골, 비골, 상완골, 요골과 같은 장골의 골 대체의 경우, 골격은 그 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 내지 20 cm일 수 있다.
좋기로는, 본 발명의 골격은 세로 방향으로 측정된 압축 강도가 5 MPa 초과, 좋기로는 10 MPa 내지 20 MPa이다.
좋기로는, 본 발명의 골격은 최대 10 MPa의 가로 방향을 따른 압축 강도를 보인다.
좋기로는, 생물형태의 히드록시아파타이트 골격은 계층적으로 구조화된 기공 구조를 특징으로 한다.
본 발명의 히드록시아파타이트 골격의 "계층적 기공 구조" 또는 "계층적으로 구조화된 기공 구조"는 출발 목재의 복잡한 3차원 계층적 구조에서 유래하는데, 이 구조로부터 골격이 얻어지므로 상이한 크기의 범위의 기공을 갖는다. 계층적으로 상이한 크기의 기공들은 골 대체물로서의 용도를 바람직하게 만든다.
예를 들어, 직경이 ≥ 200 ㎛, 좋기로는 150-300 ㎛, 더욱 좋기로는 200-300 ㎛인 기공은 세포 콜로니화 및 증식 및 적절한 혈관형성 트리(tree)를 허용할 것이다. 직경이 ≤ 10 ㎛, 좋기로는 < 1 ㎛, 더욱 좋기로는 0.01 내지 0.1 ㎛ (마이크로 및 나노-기공)인, 통로-유사 기공을 부분적으로 상호연결하는 기공들은 영양액의 교화 및 세포 대사 폐기물의 배출을 허용한다.
히드록시아파타이트에서 목재의 계층적 기공 구조의 보존은 최적의 기계적 성질을 골격에 제공하고, 기계적 하중의 효율적인 방출을 가능하게 한다.
목재로부터 얻은 히드록시아파타이트가 천연 재료의 구조를 상세하게 재현하므로, 이는 생물형태라고 지칭할 수 있다.
특히, 본 발명의 골격의 계층적으로 구조화된 기공 구조는 (전체 다공성의) 30 내지 80%에 해당하는, 150 ㎛ 미만의 직경을 갖는 기공, 및 전체 다공성 100%에 대한 그 나머지에 해당하는, 150 ㎛ 초과 직경을 갖는 기공을 포함한다.
일 구현예에서, 좋기로는 출발 목재가 라탄인 경우, 골격의 전체 다공성 중 30% 내지 60%는 직경이 ≤ 10 ㎛인 기공에 기인한다.
일 구현예에서, 좋기로는 출발 목재가 라탄인 경우, 히드록시아파타이트 골격의 전체 다공성 중 적어도 25%, 좋기로는 골격의 전체 다공성 중 적어도 25% 내지 50%는 직경이 ≤ 1 ㎛, 좋기로는 ≤ 0.1 ㎛, 특히 0.01 내지 0.1 ㎛인 기공에 기인한다.
일 구현예에서, 좋기로는 출발 목재가 라탄인 경우, 히드록시아파타이트 골격의 전체 다공성 중 적어도 20%는 직경이 ≥ 150 ㎛인 기공에 기인한다.
좋기로는, 히드록시아파타이트 골격은 비표면적(SSA)이 > 9 m2/g, 좋기로는 9 내지 20 m2/g이다.
생물형태의 히드록시아파타이트를 얻기 위한 목재는 전체 다공성이 적어도 25%, 좋기로는 적어도 40%, 더욱 좋기로는 60% 내지 95%, 더더욱 좋기로는 65% 내지 85%인 나무이면 모두 가능하다 (상기 다공성은 목재가 열분해 단계를 거친 후 측정됨).
히드록시아파타이트를 얻기 위하여 사용되는 적합한 목재의 예로는 라탄, 소나무, 아바치, 발사, 시포, 오크, 로즈우드, 켐파스 및 월넛 목재를 포함하고, 좋기로는, 사용되는 목재는 라탄 목재이다.
목재로부터 얻은 히드록시아파타이트 골격은 1종 이상의 이온에 의해 부분적으로 치환된 히드록시아파타이트를 포함할 수 있다. 이러한 이온의 예로는 마그네슘, 스트론튬, 규소, 티타늄, 카보네이트, 소디움, 포타시움, 은, 갈륨, 구리, 철, 아연, 망간, 유로퓸, 가롤리늄을 들 수 있다. 포스페이트 부위에 카보네이트를 도입하면 생체-용해도가 증가하고 조골세포에 대한 표면 친화성이 향상된다.
마그네슘의 도입은 새로운 골의 부가(apposition) 및 형성 능력을 향상시킨다. 스트론튬의 도입은 골다공증과 같은 대사성 질병에 영향을 받은 골 생성의 재건을 도와 골 재생을 향상시킬 수 있다.
은, 갈륨, 구리 및 아연의 도입은 향균 특성을 제공한다.
목재로부터 얻은 히드록시아파타이트 골격이 1종 이상의 이온에 의해 부분적으로 치환된 히드록시아파타이트를 포함할 경우, 골격은 도핑된 히드록시아파타이트 및 트리칼슘 포스페이트를 포함하거나 그들로 구성되는 재료이다. 추가적 일 구현예에 따르면, 본 발명의 생물형태의 히드록시아파타이트 골격은 다음을 포함할 수 있다:
- 0-15 wt%의 마그네슘, 좋기로는 1-10 wt%; 및/또는
- 0-15 wt%의 카보네이트, 좋기로는 1-10 wt%; 및/또는
- 0-15 wt%의 스트론튬, 좋기로는 1-10 wt%; 및/또는
- 0-20 wt%의 티타늄, 좋기로는 1-10 wt%; 및/또는
- 0-15 wt%의 포타시움, 좋기로는 1-10 wt%; 및/또는
- 0-15 wt%의 소디움, 좋기로는 1-10 wt%; 및/또는
- 0-15 wt%의 규소, 좋기로는 1-10 wt% 및/또는;
- 0-15 wt%의 은, 좋기로는 1-10 wt% 및/또는;
- 0-15 wt%의 갈륨, 좋기로는 1-10 wt% 및/또는;
- 0-15 wt%의 구리, 좋기로는 1-10 wt% 및/또는;
- 0-30 wt%의 철, 좋기로는 1-10 wt%; 및/또는
- 0-15 wt%의 아연, 좋기로는 1-10 wt% 및/또는;
- 0-15 wt%의 망간, 좋기로는 1-10 wt% 및/또는;
- 0-15 wt%의 유로퓸, 좋기로는 1-10 wt% 및/또는;
- 0-15 wt%의 가돌리늄, 좋기로는 1-10 wt% 및/또는.
본 발명에 따른 목재로부터 얻은 생물형태의 히드록시아파타이트 골격은 특히 인간 및 동물에 있어 골 대체물로서 임상 사용에 특히 적합하도록 만드는 기계적 강도 특성 및 치수와 조합된, 생체활성 및 생체 재흡수성의 특성을 갖는다.
이러한 골 대체물은 골 또는 골 부분 또는 골 결손을 대체 및/또는 재건 및/또는 재생하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 골 대체물은 기계적 하중을 받는 골 또는 골 부분을 대체 또는 재생하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 골 대체물은 다리 및 팔의 장골을 대체 또는 재생하는데 사용될 수 있다. 이러한 장골은 경골, 대퇴골, 비골, 상완골, 요골 등이다.
골 대체물은 두개골-부분, 상악안면골-부분 및 척추골(예를 들어, 척추체, 추간판)의 대체 및/또는 재건, 및 척추 융합술 과정에서 사용될 수도 있다.
골 대체물로서 사용될 경우, 생물형태 히드록시아파타이트 골격은 골 공백을 실직적으로 채우는 방식으로 재건될 필요가 있는 골 결손의 형태에 적합한 형태를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 골격 및 골 대체물은 골 결손을 재건 및 재생하기 위한 목적 또는 골의 손실 부분을 대체하기 위한 목적에 적합한 모든 형태를 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 골격 또는 골 대체물은 원통형, 직각 기둥, 또는 직육면체, 또는 웨지 형태를 취할 수 있다. 일 구현예에서, 골격 또는 골 대체물은 골격 또는 골 대체물 직경의 약 20% 내지 약 60%의 직경을 갖는 중앙 통로를 포함한다. 특히, 골격 또는 골 대체물은 관 형태를 갖는다.
일 구현예에서, 또한 본 발명은 원통형, 직각 기둥, 직육면체 또는 관 형태를 갖고, 높이가 2 cm 이상인 골격 또는 골 대체물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 골격 또는 골 대체물은 세포 부착 및 증식, 그 결과 주변 골 조직에서 골결합을 증가시키기 위하여 히드록시아파타이트 및/또는 콜라겐 기반의 얇은 층으로 코팅될 수 있다. 이 층은 추가적으로 카보네이트, 마그네슘, 규소, 포타시움, 소디움 및 스트론튬과 같은 골 재생의 자극과 관련된, 또는 갈륨, 은, 구리 또는 아연과 같은 항균 효과를 갖는 1종 이상의 이온으로 치환된 히드록시아파타이트를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가적 일 구현예에서, 골격 또는 골 대체물은 기계적 특성을 추가로 증가시키고 세포 접착을 추가로 촉진하기 위하여, 천연 폴리머(젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 키토산, 젤란, 셀룰로오스를 포함하는 군에서 선택됨)에 침지될 수 있다.
골격 또는 골 대체물에 세포 부착을 돕기 위해 세포, 혈소판이 풍부한 혈장(platelet rich plasma), 항체, 성장 인자 단백질, DNA 단편, miRNA, siRNa가 첨가될 수 있다.
또한, 항생제 또는 항암제와 같은 약물도 골격 또는 골 대체물에 첨가될 수 있다.
본 발명은 또한 골 결손을 갖는 인간 또는 동물의 재건 및/또는 재생 방법에 관한 것이고, 이는 다음 단계들을 포함한다:
- 골 결손의 형태에 대응하는 형태를 갖는, 본 발명의 생물형태 히드록시아파타이트 골격으로 포함하거나 그것으로 구성된 골 대체물을 제공하는 단계;
- 골 대체물을 환자의 골 결손에 이식하는 단계.
좋기로는, 재건 및/또는 재생 방법은 골 결손의 3차원 모델을 제공하는 단계, 및 얻어진 3차원 모델을 기반으로 골 결손에 대응하는 형태를 골격에 부여하는 단계를 포함한다. 골격에 형태를 부여하는 단계는 목재의 출발 조각, 또는 본 발명의 변형 방법의 마지막에서 얻어지는 히드록시아파타이트 골격, 또는 변형 방법의 각 단계 후(예컨데, 탄산화 단계 후)에 얻어지는 골격에 적용될 수 있다. 좋기로는, 형태를 부여하는 단계는 목재의 출발 조각에 적용된다.
본 발명의 생물형태 히드록시아파타이트 골격 및 1종 이상의 이온으로 부분적으로 치환된 생물형태 히드록시아파타이트 골격은 아래 단계들을 포함하는 다단계 변형 방법으로부터 얻어진다:
1) 열분해: 천연 목재를 불활성 대기하에서 600℃ 내지 1000℃ 범위의 온도로 가열하여 모든 유기 물질의 분해 및 제거를 허용한다. 이 과정에서, 탄소 주형(template)을 얻는다.
2) 침탄: 탄소 주형에 900 내지 1200℃ 범위의 온도 및 <1000 mbar, 좋기로는 < 600 mbar, 더욱 좋기로는 0.05 to 100 mbar 범위의 압력에서 증기 상태의 칼슘을 침투시켜, 카본 주형을 칼슘 카바이드(CaC2)로 변형시킨다;
3) 산화: 칼슘 카바이드 주형을 750 내지 1300℃, 좋기로는 1000 내지 1200℃ 범위의 온도에서 공기 중에 가열하여, 칼슘 카바이드의 칼슘 옥사이드(CaO)로의 변형을 가능하게 한다;
4) 수화: 칼슘 옥사이드 주형을 물에 노출시킴으로써 1-25 몰%, 좋기로는 5-15 몰%의 양으로 물을 흡수할 수 있게 한다;
5) 탄산화: 칼슘 옥사이드 주형을 CO2 압력 또는 CO2와 불활성 가스(예컨대, 아르곤, 질소)의 혼합물 압력하에 500 내지 900℃ 범위의 온도, 좋기로는 750 내지 850℃ 범위의 온도에서 열처리함으로써 칼슘 카보네이트로 변형시킨다. 압력 범위는 4 내지 20 MPa이다.
6) 인산염화: 칼슘 카보네이트 주형을 적어도 1종의 인산염(phosphate salt)으로 처리한다.
다단계 방법의 열분해 단계 1)에서, 천연 목재는 좋기로는 라탄, 소나무, 아바치, 발사, 시포, 오크, 로즈우드, 켐파스 및 월넛 목재 중에서 선택된다. 더욱 좋기로는, 천연 목재는 라탄 목재이다.
천연 목재는 전체 다공성이 적어도 20%, 좋기로는 적어도 40%, 더욱 좋기로는 60% 내지 95%이고, 상기 다공성은 목재가 열분해 단계를 거친 후 측정된다.
열분해 단계 1) 전에, 출발 천연 목재는 50℃ 내지 90℃의 온도, 좋기로는 60℃ 내지 80℃의 온도, 더욱 좋기로는 65℃ 내지 75℃의 온도에서 선택적으로 건조될 수 있다. 천연 목재는 6시간을 초과하여, 좋기로는 12시간을 초과하여, 좋기로는 18시간을 초과하여, 좋기로는 20 내지 30시간 동안 건조될 수 있다.
다단계 방법의 열분해 단계에서, 불활성 대기는 질소 및 아르곤을 포함하는 군으로부터 선택된 가스의 대기일 수 있다.
다단계 방법의 열분해 단계에서, 천연 목재는 600℃ 내지 1000℃의 온도, 좋기로는 800℃ 내지 1000℃의 온도에서 가열될 수 있다. 열분해 단계는 6시간을 초과하여, 좋기로는 12시간을 초과하여, 좋기로는 18시간을 초과하여 지속될 수 있고, 좋기로는 상기 단계는 20 내지 30시간 동안 지속될 수 있다.
열분해 단계 1)의 열 순환은 재료의 균열 형성 및 내부 파쇄를 방지하기 위하여, 천연 목재를 5℃/min 이하, 좋기로는 3℃/min의 속도로 가열하고, 3℃/min 이하, 좋기로는 2℃/min의 속도로 냉각시킴으로써 수행될 수 있다.
열분해 단계 1) 전에, 다단계 방법은 추가적으로 i) 천연 목재의 선택 및 준비 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 천연 목재는 재건될 골 결손의 형태에 대응하는 형태를 갖는 조각으로 절단될 수 있다.
특히, 천연 목재는 그 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm 이상인 목재 조각으로 성형된다. 좋기로는, 목재의 치수는 임상 적용에 따라 결정된 최종 값에 도달한다.
예를 들어, 천연 목재는 원통형, 직각 기둥, 또는 직육면체 형태로 성형될 수 있다. 또한, 천연 목재는 목재 조각 직경의 약 20% 내지 약 60%의 직경을 갖는 중앙 통로를 포함하도록 성형될 수 있다. 특히 천연 목재는 관 형태로 절단될 수 있다.
좋기로는, 천연 목재의 선택 및 준비의 단계 i)은; 골 결손의 3차원 모델을 제공하는 단계, 및 얻어진 3차원 모델을 기반으로 골 결손에 대응하는 형태를 천연 목재에 부여하는 단계를 포함한다. 천연 목재에 형태를 부여하는 단계는 출발 천연 목재 또는 다단계 변형 방법의 마지막에서 얻어지는 히드록시아파타이트 골격에 적용될 수 있다. 좋기로는, 형태를 부여하는 단계는 골격의 내부 및 외부 손상(파쇄)을 피하기 위하여 출발 천연 목재에 적용된다.
다단계 방법의 침탄 단계 2)에서, 반응은 좋기로는 (반응 초기에) 1.10 내지 2.50 범위, 좋기로는 1.50 내지 2.00 범위의 Ca/C 몰비로 수행된다. Ca/C 몰비는, 상기 범위 미만의 비율이 불완전한 반응을 일으키고, 상기 범위를 초과하는 비율이 Ca의 잔류물에 의해 기공을 막히게 하므로, 중요하다.
다단계 방법의 침탄 단계에서, 탄소 주형은 1 내지 10℃/min 범위의 가열 속도, 좋기로는 1 내지 7℃/min 범위의 가열 속도로 가열된다.
본 발명자들은 놀랍게도, 전술한 바와 같은 감압에서 침탄을 수행하면, 특히 대형의 생물형태 골격을 제조할 필요가 있을 경우, 후속공정 단계의 성공적인 적용에 유리하다는 것을 발견하였다.
실제로, 전술한 압력 조건을 이용하면, 칼슘의 증발이 실내 대기에서의 칼슘의 끓는점(즉, 1484℃) 보다 약 400-500℃ 낮은 온도에서 일어날 수 있으므로, 예기치않게, 당업계에 공지된 다른 어떤 공정보다 훨씬 낮은 온도에서 열분해된 목재를 칼슘 카바이드로 완전하게 변형시키는 결과를 얻는다. 특히, 0.5-600 mbar, 또는 좋기로는 0.05 내지 100 mbar 범위의 압력을 사용하면 열분해된 목재가 실질적으로 완전히 칼슘 카바이드로 변형된다.
열분해된 목재가 칼슘 카바이드로 실질적으로 완전히 변형되면, 후속 변형 단계들의 수율에 유리할 것이다.
본 발명의 침탄 조건은, 공지된 공정을 사용하여 목재로부터 얻은 공지된 골격에 대하여, 침탄 후의 골격 및 최종 생물형태 골격 모두에서 천연 목재의 ≤1 ㎛ (좋기로는 0.01 내지 0.1 ㎛) 직경을 갖는 마이크로- 및 나노-기공의 보존을 개선한다.
침탄 단계 후의 마이크로- 및 나노-다공성의 우수한 보존성은 최종 생물형태 골격이 유사한 나노/마이크로-다공성을 나타내는 것을 보장하기 때문에, 침탄 단계는 중요한 단계이다. 최종 생물형태 골격에서 상호연결이 잘된 마이크로 및 나노-기공들이 높은 비율로 존재하면 영양액의 교환 및 세포 대사 폐기물의 배출이 가능하다.
직경이 ≤1 ㎛인 마이크로- 및 나노-기공의 보존을 개선하는 것 외에, 여기에 기술된 침탄 조건은 침탄 후 얻은 골격 (및 최종 생물형태 골격)은 비표면적(SSA)이 9 내지 20 m2/g이다. 이러한 비표면적은 당업계에 공지된 공정으로 얻은 골격의 SSA (약 5-6 m2/g) 보다 약 2배 높다 (비교예 4 및 도 10-13 참조).
본 발명의 침탄 조건은 또한 공지된 공정으로 얻은 골격의 입자 보다 작은 칼슘 카바이드 입자를 함유하는 다공성 칼슘 카바이드 골격을 얻는다 (비교예 4 및 도 13 하단 사진 참조).
비교예들은, 본 발명에 따른 침탄 후 골격에서 칼슘 카바이드 입자의 치수가 약 5-15 ㎛인 반면, 공지된 공정으로 얻은 침탄 후 골격의 결정 치수는 약 100㎛임을 보여준다.
본 발명자들은 놀랍게도, 전술한 침탄 조건으로 얻은 더 높은 비표면적(SSA) 및 더 작은 입자 치수는 변형 방법의 각 단계 후 천연 목재의 높은 변형 수율을 보장하는데 있어 중요하다는 것을 발견하였다.
또한, 비교예 4 및 도 14는, 본 발명에 따른 침탄 후 골격은 정방정계(tetragonal) 및 입방체 결정 격자의 혼합물을 갖는 칼슘 카바이드를 함유하는 반면, 공지된 공정으로 얻은 골격은 정방정계 결정 격자만을 갖는 칼슘 카바이드를 함유하므로, 부분적으로 입방체 형태인 칼슘 카바이드로부터의 변형은 골격에서 미세균열의 발생 위험이 낮은 상태에서 이루어질 수 있다는 것을 보여준다. 이는 최종 생물형태 골격의 품질에 매우 유리하다.
따라서, 침탄 단계에서 이용된 조건은 칼슘 카바이드의 계층적 기공 구조에서 관찰될 수 있는 결함의 수를 강하게 감소시킨다.
또한, 본 발명에 이용된 저온(즉, 1500℃ 훨씬 미만)은, 출발 목재의 원래 미세구조로부터의 구조적 왜곡 및 변형을 유발하여, 후속 공정 단계의 결과물을 손상시키게 되는 입자의 응집 및 칼슘 카바이드의 과도한 압밀을 방지한다.
다단계 방법의 산화 단계 3)에서, 칼슘 카바이드 주형은 800 내지 1300℃ 범위의 최종 온도, 좋기로는 1000 내지 1200℃ 범위의 최종온도로 가열될 수 있다.
산화 단계에서, 칼슘 카바이드 주형은 1 내지 15℃/min 범위의 가열 속도, 좋기로는 1 내지 7℃/min의 가열 속도로 가열될 수 있다.
전술한 침탄 단계에 따른 압력 하에 얻어진 칼슘 카바이드의 산화는, 공지된 공정으로 얻을 수 잇는 골격에 대하여(비교예 4 및 도 16 참조), 더 높은 비표면적(SSA) 및 더 높은 마이크로- 및 나노-기공 분율을 갖는 칼슘 옥사이드 골격을 유도한다. 비교 실험은 마이크로 및 나노-다공성이 산화 단계 후에도 보존된다는 것을 보여준다.
다단계 방법의 수화 단계 4)에서, 칼슘 옥사이드는 물에 노출되고, 이는 좋기로는 1-25 몰% 범위, 더욱 좋기로는 5-15 몰% 범위로 물을 흡수할 수 있게 한다. 이 단계는 CaO의 후속 탄산화를 촉매하는, 3차원 구조의 ≤ 50 중량%의 양으로 칼슘 하이드록사이드를 함유하는 수화된 칼슘 옥사이드의 형성을 유도한다. 중간 생성물인 칼슘 하이드록사이드(Ca(OH)2)의 양은 3차원 구조의 붕괴를 피하기 위하여 엄격하게 제어되어야 한다. 여기에 기술된 수화 조건은 칼슘 하이드록사이드의 양을 ≤ 50 %로 유지하도록 허용한다.
바림직한 일 구현예에서, 수화 단계는 예를 들어, 물이 강화된 CO2를 사용함으로써 탄산화 단계와 동시에 수행된다.
다단계 방법의 탄산화 단계 5)에서, 고온을 사용하면서 시스템에서 CO2 압력을 전술한 값까지 점진적으로 증가시키는 것은 놀랍게도, 수화된 칼슘 옥사이드를 놀랍게도 높은 응집력과 기계적 강도를 보이는 칼슘 카보네이트로 실질적으로 완전히 전환시키는 것을 가능하게 한다.
다단계 방법의 탄산화 단계는 다음 열 순환 중 하나에 따라 수행될 수 있다;
- 약 10-15 MPa의 일정한 CO2 압력에서, 온도를 약 750-850℃ 범위 중의 한 수치, 좋기로는 약 800℃로 천천히 상승시키는 것;
- 약 750-850℃(또는 약 700-800℃), 좋기로는 약 800℃의 일정한 온도에서, 압력을 약 10-15 MPa로 높이는 것;
- 온도를 약 750-850℃(또는 약 700-800℃)까지, 좋기로는 약 800℃까지 높이면서 압력을 약 4-6 MPa에 유지시키고, 이어서 압력을 약 10-15 MPa까지 상승시키는 것.
탄산화 공정은 칼슘 하이드록사이드와 같은 반응 중간물질의 형성을 통해 일어난다. 이는 3차원 구조의 구조적 완전성을 손상시킬 수 있는 칼슘 카보네이트의 큰 입방 결정(>10㎛)이 실질적으로 존재하지 않는, 미세 입자구조를 특징으로 하는 최종 칼슘 카보네이트를 유도한다. 비교예 4 및 도 17-18은, 수화 단계의 덕분에, 탄산화 단계 후, 당업계에 알려진 공정으로 얻은 중간물질의 3차원 구조에 비하여, 더 미세한 입자 구조가 얻어진다는 것을 보여준다.
전술한 조건에서 수행된 탄산화 단계는, 당업계에 공지된 공정과 비교하면, 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 생물형태 히드록시아파타이트 골격의 우수한 기계적 특성을 가져오며, 여기서 탄산화 단계는 고온 및 저압 또는 고압 및 저온에서 수행된다.
본 발명자들은 놀랍게도, 칼슘 카보네이트에서 상기 보고된 성질의 달성이, 커다란 조각(즉, ≥ 2 cm)을 원하는 조성을 갖고 원래 목재의 미세구조를 유지하는 최종 생물형태 골격으로 완전히 변형시키는 것을 가능하게 하는 중요한 조건이라는 것을 발견하였다.
다단계 방법의 인산염화 단계 6)에서, 적어도 1종의 인산염은 암모늄 포스페이트, 소디움 포스페이트, 및 포타시움 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 암모늄 포스페이트를 사용하면, pH를 더 잘 조절할 수 있으므로, 전환 공정이 보다 효율적이고, 결과물의 기계적 특성 및 물리적 응집력이 우수하다.
다단계 방법의 인산염화 단계에서, 칼슘 카보네이트 주형을 적어도 1종의 상기 인산염을 포함하는 용액에 침지시킨다. 상기 용액은 0.1 내지 5M의 농도, 좋기로는 0.5 내지 2.0M의 농도를 갖는다.
다단계 방법의 인산염화 단계에서, PO4/CO3의 출발 비율은 좋기로는 이론적 화학량론 값의 1.5 내지 5배이고, 좋기로는 이론적 화학량론 값의 2 내지 4배이다.
다단계 방법의 인산염화 단계에서, 포스페이트가 풍부한 용액(phosphate-rich solution)에 침지된 칼슘 카보네이트 주형을 0.1 내지 2.5 MPa 범위의 증기 압력 하에 25℃ 내지 300℃로 가열할 수 있다 (열수 조건).
인산염화 단계는 약 12 내지 약 180시간, 좋기로는 약 48 내지 약 120시간, 더욱 좋기로는 24 내지 72시간 동안 지속될 수 있다.
다단계 방법의 인산염화 단계에서, 포스페이트가 풍부한 용액의 초기 pH는 좋기로는 pH 7 내지 12이다.
다른 이온으로 히드록시아파타이트를 치환하는 것은 상기 방법 중에 또는 완료된 후에, 좋기로는 인산염화 공정 중에, 관심대상 이온을 함유하는 적합한 가용성 염을 도입함으로써 성취될 수 있다. 적합한 이온은 스트론튬, 마그네슘, 규소, 티타늄, 카보네이트, 소디움, 포타시움, 갈륨, 은, 구리, 철, 아연, 망간, 유로퓸, 가롤리늄 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 마그네슘 이온을 함유하는 용액의 일례로는 MgCl2 *6H2O,을 들 수 있고, 스트론튬 이온을 함유하는 용액의 일례로는 MgCl2 *6H2O을 들 수 있다.
이온 도핑의 결과로서, 최종 생물변형 골격은 도핑된 히드록시아파타이트 및 트리칼슘 포스페이트를 포함하거나 그들로 구성되는 재료를 포함하거나 그것으로 구성된다.
덜 바람직한 일 구현예에 따르면, 천연 목재가 골 대체물로 사용되기에 적합한 형태 및 치수로 성형되지 않은 경우 (즉, 단계 i)가 수행되지 않은 경우), 다단계 방법으로부터 얻은 생물형태 히드록시아파타이트 골격은 공지된 기술에 의해 필요한 모양 및 형태를 갖는 골격으로 편리하게 성형될 수 있다.
또한, 본 발명은, 당업계에 공지된 유사한 공정에 의해 얻은 계층적 구조의 히드록시아파타이트에 비교하면, 개선된 물리적 및 기계적 특성을 갖는, 전술한 방법으로 얻은(얻을 수 있는) 생물형태 히드록시아파타이트 골격에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 방법으로 얻은(또는 얻을 수 있는) 생물형태의 히드록시아파타이트 골격은 본 발명의 골격 또는 골 대체물에 대하여 전술된 모든 성질을 갖는다.
특히, 전술한 방법으로 얻은 최종 생물형태 골격은, 선행기술에 대하여, 당업계에 공지된 유사한 공정에 의해 얻어진 골격에 비해 높은 비율의 마이크로 및 나노-기공으로 이루어진 다공성을 갖는다. 특히, 히드록시아파타이트 골격의 전체 다공성의 적어도 25%, 좋기로는 전체 다공성의 25 내지 50%는 직경 ≤ 1 ㎛, 좋기로는 ≤ 0.1 ㎛, 특히 0.01 내지 0.1 ㎛를 갖는 기공에 기인한다.
이러한 높은 비율의 마이크로 및 나노-다공성은, 마이크로 및 나노-기공이 영양액의 교환 및 세포 대사 폐기물의 배출을 허용하므로 골 재생을 개선하기 때문에, 임상적인 관점에서 매우 유리하다.
더욱이, 본 발명의 생물형태 골격은 당업계에 공지된 공정으로 얻은 골격에 비해 더 높은 비표면적을 나타낸다 (9 내지 20 m2/g vs 5-6 m2/g). 더 높은 비표면적은 골격 또는 골 대체물의 강화된 표면 생체활성 및 강화된 습윤성을 결정함으로써, 골결합 및 생체-재흡수 과정을 개선한다.
또한, 본 발명의 생물형태 골격은 소결된 히드록시아파타이트에 존재하는 것(즉, 전형적으로 > 1 mm) 보다 훨씬 작은 약 100-200 nm (즉, 나노-입자)의 히드록시아파타이트 입자를 포함한다. 작은 입자는 세포에 의해 보다 쉽게 재흡수될 수 있어, 당업계에 공지된 골격에 대하여 더 나은 골 재생을 허용하므로, 골 재생에 있어 임상적인 이점을 나타낸다.
또한, 본 발명의 생물형태 골격은 통로-유사 기공을 따르는 방향(세로 방향)으로 측정된 압축 강도가 5 MPa 초과, 좋기로는 10 MPa 내지 20 MPa이고, 가로 통로 방향을 따른(가로 방향) 압축 강도가 최대 10 MPa이다. 본 발명자들은 놀랍게도, 이들 기계적 성질이 최종 히드록시아파타이트 골격을 독자적인 재료로 만듦으로써, 쉘(shell)이나 바(bar)와 같은 보강 또는 유지 구조를 사용하지 않고도 하중을 받는 골 부분의 재생 과정에 적용할 수 있다는 것을 발견하였다.
본질적으로, 나노결정의, 이온-치환된 히드록시아파타이트는 경질의 신체 조직에 존재하는 주성분이다; 실제로, 골의 무기질 상은 전체 골 조직을 대표하는 3차원 계층적으로 구조화된 다공성 구조로 조직화된, 100 nm 미만 치수의 미세하게 분산된 히드록시아파타이트 혈소판으로 구성된 나노구조 상이다.
이러한 측면에서, 본 발명자들은 놀랍게도, 공지된 기술과 비교하여, 전술한 방법에 의해 얻은 천연 목재 구조의 생물형태 변형은, 동시에 골-모방 조성, 크게 개방되고 상호연결된 거대/마이크로/나노-다공성, 및 하중을 받는 부위, 특히 팔다리의 긴 분절성 골(segmental bone) 또는 대형 상악안면 부위, 또는 척추에 적용하기에 적합한 크기와 관련된, 우수한 기계적 강도를 나타내는 최종 히드록시아파타이트 골 골격을 유일하게 생성시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
동시에 발생한 것이 공지된 바 없는 이러한 모든 성질들은 하중을 받는 부위에서 광범위한 골 재생을 가능하게 하는데 가장 중요하다. 본 발명에 따른 방법으로 얻을 수 있는 생물형태 히드록시아파타이트 골격 구조의 차이는 비교예 6에서 나타낸 중요한 임상적 이점을 성취한다. 특히, 본 발명의 골격은 선행기술의 골격과 비교하여, 골생성 관련 유전자의 발현에 있어 더 높은 유도능을 나타내는데, 이는 골 재생에 있어서 더 나은 임상적 성능을 의미한다.
본 발명은 다음의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
측정 방법
열분해 단계를 거친 목재(열분해된 목재)의 전체 다공성 : 각기둥 또는 원통 형태의 열분해된 목재 조각을 칭량한 다음, 직경 및 높이를 측정함으로써 부피를 구한다. 열분해된 목재의 절대 밀도(A.D.)는 중량/부피 비율에 의해 얻고; 상대 밀도(R.D.)는 열분해된 목재의 A.D.를 탄소의 이론 밀도로 나눔으로써 얻는다 (즉, R.D.=A.D./2.25). 전체 다공성(%)은 (1-R.D)*100에 의해 얻는다.
상기 방법의 각 단계 후에 얻은 골격의 전체 다공성 및 상기 방법의 마지막에 얻은 생물형태 히드록시아파타이트 골격의 전체 다공성 :
다공성은 각 단계 후에 얻은 각 재료의 이론 밀도(즉, CaC2, CaO, CaCO3, HA의 이론 밀도)에 대한 적절한 값을 사용하여 위와 동일한 방법을 적용하여 계산된다.
압축 강도 : 응력-변형 곡선 및 파쇄 하중을 얻기 위하여, 보편적 나사형(screw-type) 시험기를 이용하여 각기둥 또는 원통 형태의 최종 골격 또는 골 대체물에 하중을 가한다. 압축 강도는 파괴 하중과 압축을 가한 면적 사이의 비율에 의해 주어진다.
기공 직경 : 최종 골격 또는 상기 방법의 각 단계 후의 기공 크기 분포 및 기공 형태는 수은 침입 다공성 측정(mercury intrusion porosimetry) 및 주사 전자 현미경(SEM)에 의해 각각 평가된다. 수은 침입 다공도측정 분석은 다양한 압력에서 시료의 기공 내로 수은 침입의 측정을 기반으로 한다.
결정상(Crystalline phases) : 골격에 대한 결정상의 식별 및 정량화는 X선 분말 회전 기법(XRD), 및 X선 방사 결과를 서로 다른 연속 각도로 평가함에 의해 수행된다.
비표면적 : 벌크 부피 단위(m2/g)당 재료의 전체 표면적은 BET 방법으로 평가되고, 압력과 관계하여 흡수된 가스의 양으로부터 추정된다.
실시예 1
다단계 방법을 사용하는, 목재에서 유래된 히드록시아파타이트의 제조:
i) 천연 라탄 목재 조각을 다음 치수를 갖는 원통형으로 성형한다: 직경= 2 cm; 높이 = 3 cm;
1) 천연 목재의 열분해
출밞 목재 조각을 70℃에서 24시간 동안 건조한 다음, 질소 하에서 800℃에서 30분 동안 처리함으로써, 순수 탄소 주형으로 변형시킨다. 열 순환: 1℃/min로 350℃까지 가열하고, 2℃/min로 350℃로부터 800℃까지 가열함. 시료를 800℃ 온도에 적어도 약 30분 동안 유지시킨 후, 주형을 1℃/min로 냉각한다.
2) 침탄
탄소 주형을 0.5 mbar의 아르곤 및 칼슘 대기 하에서 1000℃에서 열처리함으로써, 칼슘 카바이드로 변형시킨다. 1000℃에서 체류시간 = 30분.
3) 산화
칼슘 카바이드 주형을 공기 중에서 1-7℃/min 범위의 가열속도에 따라 1100℃까지 가열하면, 주형을 칼슘 산화물로 변형시킬 수 있다.
4) 수화
칼슘 옥사이드 몸체는 물에 노출됨으로써 활성화되어, 약 10 몰%의 양으로 물의 흡수를 가능하게 한다.
5) 탄산화
사전조절된 수화된 몸체를 점진적으로 상승하는 0.5 내지 10 MPa의 CO2 압력 하에 800℃로 가열한다. 이는 칼슘 옥사이드 몸체를 칼슘 카보네이트로 변형시킨다.
6) 인산염화
칼슘 카보네이트 바디를 2 MPa의 수증기압 하에 200℃의 온도에서 PO4 대 CO3의 출발 비율이 이론적 화학량론 값의 2배인 0.5 M 암모늄 포스페이트 용액에 침지시킨다.
골격의 압축 강도는 통로-유사 기공의 배향에 대하여 수직 및 가로 방향을 따라 기계적 힘을 가함으로써 평가되었다.
(긴 분절성 골의 경우 생체내 생체역학적 자극을 모방함에 있어 가장 임상을 반영하는 배열인) 기공 방향을 따라 하중을 가함으로써, 골격 (외경 = 15 mm; 내경 = 6 mm, 높이 = 20 mm, 기공 크기 60-65 vol%의 중공 원통으로 개발됨)은 최대 16 MPa의 압축 강도(즉, 250 Kg의 최종 하중)를 나타내었다 (도 1 및 3). 가로 방향에서, 골격의 압축 강도는 최대 4 MPa이었다.
또한, 상기 골격은 골격의 기계적 강도를 더욱 높이기 위하여, 제어된 대기 하에 1300℃의 최고 온도에서 열처리할 수 있다.
생물형태 골격의 골-유사 미세구조 성질은 조직화된 구조를 갖는 새로운 골 조직을 만들기 위해 위상(topological) 정보를 세포에 전달하는 것을 가능하게 한다. 이는 골격이 토끼 대퇴골 및 마우스 두개관에 이식된 생체내 시험에 의해 확인되었다.
상기 골격은 수술 후 독성 부작용 또는 괴사 또는 감염을 유도하지 않았다. 상기 골격은 시판되는 다공성 아파타이트 골격 EngiPore(Finceramica S.p.A.사 제품, 이탈리아)인 대조군과 유사하게, 1개월 후 새로 형성된 골에 의해 광범위한 콜로니화를 이루었다.
골격이 단독으로 이식되었을 경우, 및 골생성 간질(stromal) 세포가 이식된 골격에 추가되었을 경우, 마우스 두개관으로부터 외식된 조직은 광범위한 골 형성 및 골격 기공으로의 침투를 나타냈다 (도 2a-d). 골격의 통로-유사 다공성은 Haversian 시스템을 모방하는 골 구조의 형성을 유도하였다 (도 2f에서 화살포로 표시됨). 더욱이, 골격의 통로-유사 기공은 빠른 혈관신생을 유도하여 새로운 골의 형성 및 침투를 돕는다. 이 결과는 내인성 혈관 네트워크의 배향과 관련하여 적합한 배향의 다공성은 광범위한 혈관신생의 조기 발달을 촉진시키는데 효과적일 수 있음을 확인시킨다.
실시예
2
본 발명의 생물형태
히드록시아파타이트와
당업계에
공지된 계층적 구조의 히드록시아파타이트의 비교
라탄 천연 목재로부터 얻은 본 발명의 생물형태 히드록시아파타이트의 기공 크기 분포와, Anna Tampieri 등의 교시(Anna Tampieri et al. in the Journal of Material Chemistry, 2009, 19, 4973-4980)에 따르고, 인산염화 단계에 대해서만은 Ruffini 등의 교시(Ruffini et al. in Chemical Engineering Journal 217 (2013) 150-158)를 이용하여(NH4H2PO4-(NH4)2HPO4 혼합물, pH=9, Tmax=60℃, 시간=80h), 동일한 라탄 천연 목재로부터 얻은 계층적 구조의 히드록시아파타이트의 기공 크기 분포 사이의 비교 시험을 수행하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었는데, 여기서 흑색 기둥은 본 발명의 생물형태 히드록시아파타이트를 나타내고, 어두운 회색 기둥은 당업계에 공지된 히드록시아파타이트를 나타낸다.
공지된 계층적 구조의 히드록시아파타이트와 비교하면, 본 발명의 생물형태 히드록시아파타이트에서 200-300 ㎛ 범위의 직경을 갖는 기공의 수가 증가함이 명백하며, 상기 기공은, 골 대체물로서 이식할 경우 생물형태 히드록시아파타이트의 생리학적 혈관형성을 촉진하는데 가장 적절한 치수를 갖는 기공이다.
더욱이, 동일한 도 4에서 0.01 - 0.1 미크론 범위의 직경을 갖는 기공의 수가 증가하는 것이 보이는데, 이는 천연 목재의 미세구조가 최종 생성물에 보존됨을 명확하게 나타낸다.
실시예
3
Mg
2
+
및/또는
Sr
2
+
에 의해
도핑된
, 목재에서
유래된
히드록시아파타이트의
제조:
실시예 1에 기재된 다단계 방법의 단계 1 내지 5를 수행하여 칼슘 카보네이트 몸체를 얻는다. Mg2 + 및/또는 Sr2 + 이온으로 도핑하는 것은 다음의 각 방법에 따라 달성되었다:
방법 1
Sr2 +의 용액(SrCl 형태)을 1.0 M의 포스페이트-풍부 용액에 첨가한다. 다단계 방법에 따라 제조된 칼슘 카보네이트 몸체를 조합된 용액에 침지시키고 2 MPa의 수증기압 하에 200℃의 온도로 가열한다. 그 결과, 출발 목재 조각의 형태를 갖는 Sr2-도핑된 히드록시아파타이트를 얻는다.
방법 2
칼슘 카보네이트 몸체를 1.0 M의 포스페이트-풍부 용액에 침지시킨다. 0.1 MPa의 수증기압 하에 25-90℃의 온도로 가열하면서, Sr2 + 용액을 점진적으로 첨가한다. 그 결과, 출발 목재 조각의 형태를 갖는 Sr2-도핑된 히드록시아파타이트를 얻는다.
방법 3
순수한 칼슘 카보네이트 몸체(또는 실온 이상의 온도에서 1.5 M의 포스페이트-풍부 용액에 24시간 동안 침지시킴으로써 히드록시아파타이트에서 부분적으로 전환된 것)를 Sr2 + 이온을 함유하는 수용액 또는 유기용액에 24시간 동안 침지시킨다. 그런 다음, 이를 용액에서 제거하고 1.5 M의 포스페이트-풍부 용액에 침지시킨다. 0.5-1.5 MPa 범위의 수증기압 하에 200℃의 온도로 가열하는 동안. 그 결과, 출발 목재 조각의 형태를 갖는 Sr2-도핑된 히드록시아파타이트를 얻는다.
스트론튬으로 치환된 골격의 특성
스트론튬으로 치환된 히드록시아파타이트 골격이 개발되었고, 스트론튬이 없는 골격과 비교하면 중간엽 줄기세포(MSCs)의 향상된 생존력을 보이는 것으로 드러났다.
또한, 스트론튬 골격은 잘 분포된 형태 및 RUNX2 및 ALP와 같은 골생성 관련 유전자의 발현을 나타내어(도 6), 골아세포 분화의 촉진제 역할을 한다. 특히, Sr이 없는 골격과 비교할 때, 두 유전자의 mRNA 수준의 유의한 증가(p<0.05)가 검출되었다. 이러한 증가는 2 mol%의 Sr을 갖는 골격에서 특히 높았다.
Sr-치환된 히드록시아파타이트 골격이 사용된 경우, 14일간의 조사에서 전조골세포(pre-osteoblasts)의 향상된 증식이 관찰되었다 (도 7). 실제로, 골격에서 스트론튬의 증가는 장기간에서 훨씬 더 높은 세포 생존력을 얻었다. 이러한 결과는 새로운 골 형성이 성공적으로 유도되고 지속될 수 있음을 암시한다.
또한, 골격은 2주의 조사 동안 조골세포의 표현형을 유지할 가능성을 보여주었다 (도 8).
스트론튬-치환된 골격을 접촉한 세포의 거동은 파골세포의 거동을 관찰함에 의해서도 조사되었다. 파골세포 생성 모델을 확인하고 검증하기 위하여 예비 형태학적 분석을 수행하였다. 골격 표면에서 성장한 파골세포는 전형적인 형태를 나타낸다.
파골세포 활성 및 형성에 관여하는 주요 마커의 관련 유전자 발현(Oscar, Integrin β3 및 CatepsinK)을 평가하였다(도 9). 분석 결과, 파골세포의 주요 분자 경로에 관여하는 모든 유전자의 시간에 따른 유전자 발현의 유의한 감소가 나타났는데, 이는 골격 내의 Sr2 + 이온의 존재가 파골세포의 형성 및 활성을 억제한다는 것을 나타낸다.
결론적으로, Sr2 + 이온으로 히드록시아파타이트를 치환하면 골 세포에 생물학적 영향을 주어, 구체적으로 다음을 초래한다: i) MCSs 골생성 관련 유전자에 대한 유의한 유도 효과; ii) 조골세포 증식에 대한 유도 효과 및 iii) 파골세포 활성에 대한 억제 효과.
분절성 골 결손에 이식할 경우, 새로운 골격은 새로운 골수 발생을 위한 가이드로서, 주요 단방향 다공성과 평행한 방향으로 연장되는 중앙 통로를 제공하여 골 그루터기(stump)에 노출되도록 설계된다 (도 1). 통로 크기는 특정 결함을 기준으로 정의되지만; 적절한 강도를 유지하기 위하여 통로는 전체 골격의 폭에 대하여 20 - 60 % 범위의 직경을 갖는다.
실시예
4 - 본 발명의 생물형태
히드록시아파타이트와
당업계에
공지된 계층적 구조의
히드록시아파타이트의
비교
비교 시험은 본 발명의 방법을 이용하여 제조된 생물형태 히드록시아파타이트와, Anna Tampieri 등(Anna Tampieri et al. in the Journal of Material Chemistry, 2009, 19, 4973-4980)의 교시에 따라 동일한 천연 목재(라탄)로부터 얻은 히드록시아파타이트 골격 사이의 비교 시험을 수행하였다. 본 발명의 방법에서 사용된 라탄 목재는 골격 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm이다. 선행 기술에서 사용된 라탄 목재는 골격 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 1 cm이다.
상기 두 가지 방법의 각 단계 후에, 중간 및 최종 골격의 비표면적(SSA) 및 기공 분포를 분석하여 비교하였다 (도 10, 16, 19 및 20 참조). 또한, 침탄 단계 후, 두 가지 중간 골격의 칼슘 카바이드 결정 치수를 비교하였다 (도 13-하단 사진 참조).
침탄 단계 후 두 가지 칼슘 카바이드 골격의 결정 격자 구조를 비교하였다. 비교는 도 14에 나타내었다.
도 10은 각각의 침탄 단계 후에 얻은 두 가지 칼슘 카바이드 골격의 기공 분포를 비교하고, 추가로 출발 열분해 목재의 기공 분포와 비교한 것이다. 두 가지 칼슘 카바이드 골격의 비표면적 역시 상기 도면에 보고되어 있다. 이 결과는 본 발명의 침탄 단계 후에 얻은 칼슘 카바이드 골격만이 라탄 목재의 마이크로 및 나노-기공 분포(기공 치수 <1 ㎛)를 보존한다는 것을 보여준다. 또한, 두 비표면적의 비교는 본 발명에 따른 골격이 개선되었음을 보여준다.
도 11, 12 및 13-상단의 두 사진은 두 가지 칼슘 카바이드 골격의 SEM 사진을 나타내는데, 이로부터 천연 목재의 마이크로 및 나노-다공성의 보다 우수한 보존성을 분명히 알 수 있다.
도 13-하단의 두 사진은 칼슘 카바이드 결정의 치수를 비교한 것이다. 본 발명에 따라 얻은 칼슘 카바이드는 약 10 ㎛의 평균 크기를 갖는 입자를 나타내는 반면, 선행기술에 의해 얻은 입자는 약 100 ㎛의 평균 크기를 갖는다.
도 14는 X선-XRD로 측정한 2가지 칼슘 카바이드 골격의 결정상을 비교한 것이다. 이 결과는 본 발명에 따라 얻은 칼슘 카바이드는 정방정계 및 입방체 결정 격자를 둘다 갖는 반면, 선행 기술로 얻은 골격은 정방정계 결정 격자만을 갖는다는 것을 보여준다. 본 발명의 칼슘 카바이드 골격은 선행 기술의 골격에 비해 더 많은 양의 Ca(OH)2을 함유한다.
도 15는 각 산화 단계 후에 얻은 칼슘 옥사이드 골격의 SEM 사진이다. 본 발명에 따라 얻은 골격에 해당하는 사진들은 CaO 입자들 사이에 미세다공성을 유지하는 반면, 선행 기술의 골격에서는 미세다공성이 완전히 상실되었다.
도 16은 두 가지 칼슘 옥사이드 골격의 기공 분포를 도시한다. 이들을 비교하면, 산화 단계 후에 얻은 마이크로 및 나노-다공성 분획 뿐만 아니라 비표면적은 본 발명에 따른 골격에서 더 높다는 것을 분명히 알 수 있다.
도 17 및 18은 각각의 탄산화 후에 얻은 칼슘 카보네이트의 SEM 사진이다. 방해석(calcite)의 큰 결정(최대 50 ㎛)이 전체 구조를 특징짓는 선행 기술과 비교하여, 본 발명에 따른 재료는 보다 미세한 구조를 나타낸다. 이러한 큰 결정은 인산염화 단계 중에 구조물이 부서지거나 붕괴되도록 한다.
도 19는 탄산화 단계 후에 얻은 두 가지 칼슘 카보네이트 골격의 기공 분포를 보여준다. 기공 분포 및 비표면적의 비교는 칼슘 옥사이드에 대하여 앞서 논의한 것와 유사한 결과를 나타낸다: 1 ㎛ 미만의 마이크로 및 나노-기공 구조가 본 발명의 방법으로 유지되고, 선행 기술에 비해 더 높은 SSA가 얻어진다.
도 20은 본 발명의 방법으로 (인산염화 후) 얻은 최종 생물형태 히드록시아파타이트 골격의 기공 분포와 선행 기술의 최종 생물형태 히드록시아파타이트 골격 사이를 비교하여 나타낸 것이다. 각 SSA의 비교도 표시되었다.
상기 결과는 선행 기술의 골격에 비해 본 발명의 생물형태 골격이 더 높은 마이크로 및 나노-다공성 분획뿐만 아니라 더 높은 비표면적을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예
5 - 골격의 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가
2 cm인
라탄
목재 조각에 적용된 선행 기술의 방법
선행 기술의 방법(Anna Tampieri et al. in the Journal of Material Chemistry, 2009, 19, 4973-4980)은 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm 이상이 되는 골격, 즉, 골 재생을 위하여 임상적 중요성이 있는 골격의 제조를 허용하지 않는다는 것을 입증하기 위하여 시험을 실시하였다.
이러한 목적으로, 라탄 목재 조각을 Tampieri 등의 문헌에 기재된 조건에 따라 공정 단계들을 거쳤다.
도 21은 심지어 인산염화 단계 전에도 골격이 부서질 수 있음을 나타낸다. 도 22는 골격이 인산염화 단계까지 살아남더라도, 인산염화 후에 골격이 부서졌음을 보여준다.
이 시험은 세라믹 제품의 스케일 업이 종종 간단한 작업이 아님을 분명히 보여준다; 대신, 작은 세라믹 제품의 제조공정이 당업계에 공지되어 있더라도, 더 큰 제품을 제조하기 위해서는 공정 조건이 변경될(때로는 크기 변경될) 필요가 있다.
실시예
6 - 비교 시험
생체외 연구는 마우스 중간엽 줄기세포(mMSCs)를 사용하여 수행하였다. 본 발명의 방법으로 얻은 생물형태 히드록시아파타이트 골격 및 선행 기술의 방법으로 얻은 생물형태 히드록시아파타이트 골격에 의해 유도된 골생성 분화에 관여하는 특정 유전자의 발현을 시험하기 위하여 유전자 발현 프로파일링을 분석하였다.
시료 설명
시험된 두 개의 골격은 다음과 같이 정의된다:
결과
골생성 분화의 조기 단계(Runx2 및 ALP) 및 후기 단계(OPN) 수행과 관련하여 시험된 유전자들은 선행 기술의 골격과 비교하여, 본 발명의 모든 골격에서 성장한 세포에서 Runx2 및 OPN 에 대한 유의한 차이(p≤0.0001)로 상향조절된(upregulated) 것으로 보인다. 시험된 모든 시료에서 BMP2 및 Col15 유전자 발현에서는 차이가 관찰되지 않았는데, 이는 아마도 분화 경로의 상류 조절자인 BMP2가 동적 배양(dynamic culture) 14일 후에, Runx2, Alp 및 OPN [1]의 상향조절에 의해 제시된 바와 같이 생물학적 기능을 이미 수행했기 때문일 것이다. 이와는 반대로, Col15는 무기질화 골 매트릭스[2]의 생성에 관련된 아주 후반의 마커이므로, 아마도 배양 시간은 발현을 유도하기에 충분하지 않았을 것이다. 도핑되거나 도핑되지 않은 본 발명의 골격의 유도 효과 사이에는 아무런 차이가 발견되지 않았다 (도 23 참조).
도 23은 모든 시험된 시료로 동적 조건에서 mMSCs의 3차원 배양 14일 후, 캘리브레이터로 사용된 비도핑 선행 기술 골격의 발현에 대하여 유전자 발현의 상대적 정량화(2- ΔΔCt)를 도시한다. 3개 시료의 평균 및 표준 오차가 표시되었다. 통계적 분석은 양방향 ANOVA에 이어서 Bonferroni의 사후(post-hoc) 시험에 의해 수행되었고, 유의한 차이가 그래프에 표시되었다:****p≤0.0001.
상기 시험으로부터, 선행 기술의 골격에 비하여 본 발명의 골격은 골생성 관련 유전자의 발현에 있어서 더 높은 유도 능력을 나타내는 것으로 주장하는 것이 가능하다.
참고문헌
[1] Arch Oral Biol. 2013 Jan;58(1):42-9. doi: 10.1016/j.archoralbio.2012.07.010. Epub 2012 Aug 9. Leader genes in osteogenesis: a theoretical study. Orlando B, Giacomelli L, Ricci M, Barone A, Covani U.
[2] J Cell Physiol. 2012 Aug;227(8):3151-61. doi: 10.1002/jcp.24001. Extracellular calcium chronically induced human osteoblasts effects: specific modulation of osteocalcin and collagen type XV. Gabusi E, Manferdini C, Grassi F, Piacentini A, Cattini L, Filardo G, Lambertini E, Piva R, Zini N, Facchini A, Lisignoli G.
Claims (35)
- 전체 다공성이 적어도 20%, 또는 적어도 40%, 또는 60% 내지 95%인 목재로부터 얻은 생물형태(biomorphic)의 히드록시아파타이트 골격(scaffold)으로서, 상기 다공성은 목재가 열분해 단계를 거친 후 측정되고, 상기 골격은 그 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm 이상이며, 상기 생물형태의 히드록시아파타이트 골격은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인, 생물형태의 히드록시아파타이트 골격:
1) 열분해: 천연 목재를 불활성 대기하에서 600℃ 내지 1000℃ 범위의 온도로 가열하여 탄소 주형(template)을 얻는 단계;
2) 침탄(carburization): 탄소 주형에 900 내지 1200℃ 범위의 온도 및 <1000 mbar, 또는 < 600 mbar, 또는 0.05 내지 100 mbar의 압력에서 증기 상태의 칼슘을 침투시켜 칼슘 카바이드 주형을 얻는 단계;
3) 산화: 칼슘 카바이드 주형(CaC2)을 750 내지 1300℃, 또는 1000 내지 1200℃ 범위의 온도에서 공기 중에 가열하여 칼슘 옥사이드 주형을 얻는 단계;
4) 수화: 칼슘 옥사이드 주형을 물에 노출시킴으로써 1-25 몰% 범위, 또는 5-15 몰% 범위의 양으로 물을 흡수할 수 있게 하는 단계;
5) 탄산화: 칼슘 옥사이드 주형을 4 내지 20 MPa 범위의 압력 하에 500 내지 900℃ 범위의 온도, 또는 750 내지 850℃ 범위의 온도에서 열처리함으로써 칼슘 카보네이트로 변형시키는 단계;
6) 인산염화(phosphatization): 칼슘 카보네이트 주형을 적어도 1종의 인산염(phosphate salt)으로 처리하여 생물형태의 히드록시아파타이트 골격을 얻는 단계. - 제1항에 있어서, 세로 방향으로 측정된 압축 강도는 5 MPa 초과, 또는 10MPa 내지 40 MPa, 또는 10 MPa 내지 20 MPa인 것인 생물형태의 히드록시아파타이트 골격.
- 제1항에 있어서, 상기 골격은 목재로부터 얻어지는 목재의 계층적으로(hierarchically) 구조화된 기공 구조로부터 유래하는, 계층적으로 구조화된 기공 구조를 갖는 것인 생물형태의 히드록시아파타이트 골격.
- 제1항에 있어서, 목재는 라탄, 소나무, 아바치(abachi), 발사(balsa), 시포(sipo), 오크, 로즈우드, 켐파스 및 월넛 목재 중에서 선택되는 것인 생물형태의 히드록시아파타이트 골격.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 계층적으로 구조화된 기공 구조는 전체 다공성의 30 내지 80%에 해당하는, 150 ㎛ 미만의 직경을 갖는 기공, 및 전체 다공성 100%에 대한 그 나머지에 해당하는, 150 ㎛ 초과 직경을 갖는 기공을 포함하는 것인 생물형태의 히드록시아파타이트 골격.
- 제5항에 있어서, 골격의 전체 다공성 중 30% 내지 60%는 직경이 ≤ 10 ㎛인 기공에 기인하는 것인 생물형태의 히드록시아파타이트 골격.
- 제5항에 있어서, 골격의 전체 다공성 중 적어도 25%, 또는 골격의 전체 다공성 중 적어도 25% 내지 50%는 ≤ 1 ㎛, 또는 ≤ 0.1 ㎛, 또는 0.01 내지 0.1 ㎛의 직경을 갖는 기공에 기인하는 것인 생물형태의 히드록시아파타이트 골격.
- 제5항에 있어서, 골격의 전체 다공성 중 적어도 20%는 ≥ 150 ㎛의 직경을 갖는 기공에 기인하는 것인 생물형태의 히드록시아파타이트 골격.
- 제5항에 있어서, 비표면적(SSA)은 > 9 m2/g, 또는 9 내지 20 m2/g인 것인 생물형태의 히드록시아파타이트 골격.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 히드록시아파타이트는 마그네슘, 스트론튬, 규소, 티타늄, 카보네이트, 소디움, 포타시움, 은, 갈륨, 구리, 철, 아연, 망간, 유로퓸 및 가롤리늄을 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상의 이온으로 부분적으로 치환되는 것인 생물형태의 히드록시아파타이트 골격.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 의약 용도, 또는 골 대체물로서 사용되기 위한 것이거나, 또는 재건하고자 하는 골 결손의 형태에 대응하는 형태를 갖는 골 대체물로서 사용되기 위한 것인 생물형태의 히드록시아파타이트 골격.
- 제11항에 있어서, 골 또는 골 부분의 대체 또는 재생에 사용되기 위한 생물형태의 히드록시아파타이트 골격.
- 제12항에 있어서, 상기 골 또는 골 부분은 기계적 하중을 받는 골 또는 골 부분, 또는 다리 및 팔의 장골, 또는 경골, 중족골, 비골, 대퇴골, 상완골 또는 요골이거나, 또는 상기 골 또는 골 부분은 두개골-부분, 척추골 또는 상악-안면골-부분인 것인 생물형태의 히드록시아파타이트 골격.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 생물형태의 히드록시아파타이트 골격을 포함하는 골 대체물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 생물형태의 히드록시아파타이트 골격 또는 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 생물형태의 히드록시아파타이트 골격을 포함하는 골 대체물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 다음 단계들을 포함하는 것인, 방법:
1) 열분해: 천연 목재를 불활성 대기하에서 600℃ 내지 1000℃ 범위의 온도로 가열하여 탄소 주형(template)을 얻는 단계;
2) 침탄(carburization): 탄소 주형에 900 내지 1200℃ 범위의 온도 및 <1000 mbar, 또는 < 600 mbar, 또는 0.05 내지 100 mbar의 압력에서 증기 상태의 칼슘을 침투시켜 칼슘 카바이드 주형을 얻는 단계;
3) 산화: 칼슘 카바이드 주형(CaC2)을 750 내지 1300℃, 또는 1000 내지 1200℃ 범위의 온도에서 공기 중에 가열하여 칼슘 옥사이드 주형을 얻는 단계;
4) 수화: 칼슘 옥사이드 주형을 물에 노출시킴으로써 1-25 몰% 범위, 또는 5-15 몰% 범위의 양으로 물을 흡수할 수 있게 하는 단계;
5) 탄산화: 칼슘 옥사이드 주형을 4 내지 20 MPa 범위의 압력 하에 500 내지 900℃ 범위의 온도, 또는 750 내지 850℃ 범위의 온도에서 열처리함으로써 칼슘 카보네이트로 변형시키는 단계;
6) 인산염화(phosphatization): 칼슘 카보네이트 주형을 적어도 1종의 인산염(phosphate salt)으로 처리하여 생물형태의 히드록시아파타이트 골격을 얻는 단계. - 제15항에 있어서, 단계 1) 후 천연 목재의 전체 다공성은 적어도 20%, 또는 적어도 40%, 또는 60% 내지 95%인 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 열분해 단계 1) 전에 상기 방법은 천연 목재의 선택 및 준비의 단계 i)을 포함하고, 상기 천연 목재는 그 치수가 최대인 방향을 따라 측정된 길이가 2 cm 이상이고, 상기 단계 i)은 골 결손의 3차원 모델을 제공하는 단계, 및 얻어진 3차원 모델을 기반으로 골 결손의 형태에 대응하는 형태를 천연 목재에 부여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 침탄 단계 2)는 반응 초기에 1.10 내지 2.50 범위, 또는 1.50 내지 2.00 범위의 Ca/C 몰비로 수행되는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 탄산화 단계 5)는 다음 열순환 중 하나에 따라 수행되는 것인 방법:
- 10 MPa의 일정한 CO2 압력에서, 온도를 750-850℃ 범위 중의 한 수치, 또는 800℃로 천천히 상승시키는 것;
- 750-850℃, 또는 800℃의 일정한 온도에서, 압력을 10 MPa로 높이는 것;
- 온도를 750-850℃까지, 또는 800℃까지 높이면서 압력을 4-6 MPa에 유지시키고, 이어서 압력을 10 MPa까지 상승시키는 것. - 제15항에 있어서, 인산염화 단계 6)에서, 칼슘 카보네이트 주형을 적어도 1종의 인산염을 포함하는 수성 용액에 침지시키되, 상기 용액은 0.1 내지 5M의 포스페이트 농도, 또는 0.5 내지 2.0M의 농도를 갖고, PO4/CO3의 출발 비율은 이론적 화학량론 값의 1.5 내지 5배, 또는 이론적 화학량론 값의 2 내지 4배인 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 인산염화 단계 6)은 마그네슘, 스트론튬, 규소, 티타늄, 카보네이트, 소디움, 포타시움, 은, 갈륨, 구리, 철, 아연, 망간, 유로퓸, 가돌리늄 이온, 또는 이들의 혼합물의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 천연 목재는 라탄, 소나무, 아바치(abachi), 발사(balsa), 시포(sipo), 오크, 로즈우드, 켐파스 및 월넛 목재로부터 선택되거나, 또는 천연 목재는 라탄 조각이고; 인산염은 암모늄 포스페이트, 소디움 포스페이트, 포타시움 포스페이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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