CN108348637B - 由经天然结构的生物形态转变获得的活性羟基磷灰石制成的大型3d多孔支架及其获得工艺 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及一种由多孔木材获得的羟基磷灰石，其具有适合于临床应用的高压缩强度和尺寸。多孔木材具有在约60％和约95％之间的孔隙率，所述孔隙率是在使木材经受热解的步骤之后测量的，并且该多孔木材选自藤木、松木、阿巴西木、轻木、桃花心木、橡木、红木、甘巴豆木和胡桃木。羟基磷灰石可以被一种或更多种离子例如镁、锶、硅、钛、碳酸根、钾、钠、银、镓、铜、铁、锌、锰、铕、钆取代。还公开了一种包含由多孔木材获得的羟基磷灰石的骨替代物。骨替代物用于骨或骨部分的替代和再生，优选地用于经受机械载荷的骨，例如腿部和臂部的长骨，优选地胫骨、腓骨、股骨、肱骨和桡骨。本发明还涉及一种用于由木材制造生物形态的羟基磷灰石支架的工艺。

Description

由经天然结构的生物形态转变获得的活性羟基磷灰石制成的 大型3D多孔支架及其获得工艺

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描述

本公开内容涉及从多孔木材获得的羟基磷灰石。具体而言，本公开内容涉及用作骨替代物的从多孔木材获得的生物形态的羟基磷灰石支架(biomorphic hydroxyapatitescaffold)。本公开内容还涉及一种将木材转化成可以用作骨替代物的生物形态的羟基磷灰石支架的工艺。

背景

目前的陶瓷加工和工程是基于良好建立的工艺顺序，使得能够生产大型3D本体。更具体地，创新的陶瓷相可以合成为粉末，其中特定的特征例如化学计量/离子取代、纳米尺寸和表面活性是特定功能的原因。目前用于获得具有适当形状和孔隙率的宏观3D陶瓷体的陶瓷加工意味着将合成的陶瓷粉末的热处理(烧结)适当地形成为3D本体(以固结本体)。所有这些步骤都需要获得具有足够的物理化学和机械性能的3D陶瓷，其中大部分在上述陶瓷工艺(特别是烧结处理)期间降解。与目前的陶瓷工艺相关的功能陶瓷材料发展中的严重局限性阻碍了该领域的进一步发展。当今，随着现代社会的发展，技术产品在人们的生活和生产力中扮演着越来越重要的角色，因此对能够在各种应用领域例如健康、环境、能源中为复杂的和个性化的需求提供解决方案的智能工具存在强大需求。因此，人们普遍认为，对在宏观尺度上具有复杂结构组织，但是同时具有以纳米级并且甚至以晶体尺度限定的复杂结构的宏观装置的可重复和大规模生产需要新的方法。这样的宏观结构和纳米结构与诱导有意义的、但是智能的功能效应有关。

针对关于陶瓷材料的上述问题，为了开发具有复杂的微观和宏观结构的大型高活性陶瓷，需要进行范例改变。

骨支架、特别集中于大的承重的骨缺损的再生，可以视为代表性实例，因为它们应该是具有高生物活性的多孔3D陶瓷，以便能够被细胞定植并最终被再生为大的骨缺损。事实上，目前还没有找到足够的解决方案来解决这一临床需求。

几十年来，羟基磷灰石(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)已经被认为是用于骨支架的主要材料，因为它非常类似于骨矿物质的组成，并且已经表现出优异的生物相容性和骨传导性。然而，羟基磷灰石的仿生与其纳米尺寸和多种离子的存在有关，部分取代磷灰石晶格中的钙和磷酸盐，这是新组织形成、重塑和再吸收期间骨的生物活性的来源。

将烧结处理应用于羟基磷灰石支架使相邻的羟基磷灰石晶粒之间的界面处的表面反应和本体反应活化，这产生晶体有序，其中从磷灰石晶格中排出外来离子，并且粒子聚结达到数微米，同时减小比表面积、亲水性和与蛋白质和细胞的亲和力。

通过烧结工艺活化的大量的晶粒聚结通过降低晶粒间的孔隙率且进而降低总体积而使整个羟基磷灰石本体固结。这也会产生残余应力，这是陶瓷材料中的结构缺陷的主要来源之一。事实上，由于陶瓷材料的高的刚性(与金属和聚合物相比)，因此陶瓷材料中的残余应力的调节是困难的，并且是损害陶瓷材料的机械性能的最重要因素之一，特别是在以复杂形状和多孔结构为特征的大块的情况下，其中加热/冷却循环之后的体积变化容易引起严重的结构损伤。

出于上述原因，经典的陶瓷合成工艺不允许制造陶瓷材料，特别是具有仿生组成和结构、高生物活性和可再吸收性的羟基磷灰石。当大的多孔3D陶瓷被合成用于再生临界尺寸的骨缺损(即，≥2cm)时，情况尤其如此。

仿生组成和结构对于诱导体内再生级联(regenerative cascade)具有关键的相关性，其可以唯一地确定和促进大的、承重的骨部分例如肢体的长骨的再生。这些相互密切相关的且必须协同作用才能激活和维持骨的全部功能的再生的现象，为：i)快速的成骨、骨传导和骨整合；ii)广泛的血管形成；iii)进行性生物再吸收的能力。

快速的成骨和骨传导使得能够实现广泛的骨形成和渗透入支架中，从而导致紧密的骨/支架界面和最佳的骨整合。为了达到这些效果，需要骨样的化学组成以及宽的开放和相互连接的孔隙，使得除了新骨组织的广泛渗透之外，还可以实现协助新骨的形成和成熟的血管网络的同时形成。支架的不完全定植可能导致空隙、纤维组织或坏死区域的形成，并且会降低骨/支架构造的整体强度和生物力学性能。

在与新骨形成相容的时间内，支架应该逐渐被再吸收，以在损伤或疾病之后实现骨的最佳再生。迄今为止所开发的所有3D骨支架都是基于与纳米晶体的、纳米尺寸的、离子取代的磷灰石相比是烧结的钙磷酸盐(calcium phosphates)，所述烧结的钙磷酸盐是阻碍破骨细胞活性的结晶材料；因此，尽管多孔骨羟基磷灰石支架可以通过表面粘附很好地被整合到周围的骨中，但是缺乏生物吸收不允许完全重塑过程，即用新骨代替支架。这导致患病骨的功能能力的不完全恢复，特别是在非常长的、承重的骨节段的情况下。

特别是在长的、承重的骨的情况下，支架还必须表现出足够的机械性能，同时保持大的开放的大孔隙率，考虑到这些特征通常是反向相关的(即孔隙率越高，机械阻力越低)并且需要高孔隙率程度(porosity extent)来提供足够的支架定植和骨整合，这是一种挑战。这是限制当前支架在大部分的长的、承重的骨的再生中的应用的最相关因素之一。在这方面，具有分层次地组织化的多孔结构的支架与具有类似但随机组织化的孔隙率的材料相比可以展现出优异的机械性能。在这方面，只有具有这种组织化的结构的支架可以有效地激活以细胞水平的机械转导过程，从而触发成熟的、组织化的和有机械能力的骨的再生。

所提出的创新是基于从经典的陶瓷合成工艺到反应性烧结的新方式的范例变化，使得能够从分层次地组织化的天然结构开始产生具有限定的化学组成、组织化成具有复杂形态、分层结构且同时具有优化的机械性能的大型3D本体的陶瓷相。在这方面，生物形态转变是这种创新方法的支点，其可以应用于分层次地组织化的天然结构(例如，木材、植物、外骨骼)。

木质结构向骨模拟陶瓷的生物形态转变成功地尝试使用具有多孔结构的木材例如松木和藤、以及致密的木材例如红橡木和桃花心木(sipo)，分别作为用于再现海绵状和皮质的骨的结构和机械性能的模板。

Anna Tampieri等人在Journal of Material Chemistry，2009,19,4973-4980中报告了木材在形成仿生羟基磷灰石支架中的应用。在该出版物中，Tampieri等人描述了将1cm长的藤木和松木的块(因此小块，不足以用于再生临界尺寸缺陷)转化为羟基磷灰石的过程。该工艺涉及在1000℃的温度使用缓慢加热速率对木材样品进行热解，随后进行渗碳，其中碳模板被转变为碳化钙。通过液相渗透或气相渗透实现渗碳。蒸气渗透在高于钙的沸点(1484℃)的温度进行。渗碳工艺涉及将热解的木材初始加热到800℃，然后加热到1100℃，并且最后加热到1650℃，持续3小时。有必要将热解的木材加热至该温度持续3小时以确保反应完成。在渗碳之后，三维碳化钙支架被氧化以将碳化钙转变成氧化钙，同时保持天然木材的形态。在氧化之后，将三维氧化钙支架碳酸化以将氧化钙支架转变为碳酸钙支架。采用高压值(2.2MPa)以允许CO₂穿过形成的CaCO₃垢，直到CaO结构的芯。最后，进行磷化(phosphatization)步骤，以将碳酸钙支架转变为羟基磷灰石支架，该羟基磷灰石支架具有与天然木材类似的分层次地组织化的各向异性形态。在此步骤期间，将源自木材的CaCO₃模板在200℃的温度在1.2MPa的压力下浸泡在KH₂PO₄的水溶液中持续24小时。

上述工艺产生具有分层次地组织化的各向异性形态的天然木材的羟基磷灰石陶瓷支架。

源自松木的支架的压缩强度，在纵向方向上测量为在2.5MPa和4MPa之间的范围内，而在横向方向上测量为在0.5MPa和1MPa之间的范围内。因此，通过所述工艺仅能获得典型地小于1cm的有限尺寸的支架。压缩强度的低值，也与尺寸≤1cm有关，使这些支架与骨再生无关，特别是在承重骨的情况下。事实上，可接受的至关重要的是，骨缺损的长度应该是受影响的骨的直径的2倍-3倍。因此，在这方面，1cm大小的支架不能被认为是有用的。

Ruffini等人在Chemical Engineering Journal 217(2013)150-158中更详细地报告了上述将木材转化为羟基磷灰石中的磷化步骤。在该出版物中，使用直径为8mm且长度为10mm的源自藤的碳酸钙的圆柱形模板作为起始材料。磷化处理使用磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和氨的水溶液进行。

2012年5月18日公开的专利申请WO2012/063201描述了一种骨替代物，其包含芯和壳，所述芯基于由至少一种多孔木材获得的羟基磷灰石，所述壳基于由具有比芯的至少一种木材低的孔隙率的至少一种木材获得的羟基磷灰石或碳化硅。壳被制备成适于容纳芯的中空圆柱形状，其可以被制备为插入到壳的腔体中的实心圆柱体。在本申请中还描述了用于从木材获得骨替代物的工艺。第一步是通过将天然木材加热到800℃和2000℃之间的温度使天然木材例如藤或松木热解。从该过程中，获得碳材料。在第二步中，将碳材料在1500℃至1700℃之间的温度转变为碳化钙。接着，将碳化钙在900℃和1000℃之间的温度下进行氧化。为了将氧化钙材料转化成碳酸钙，在400℃的温度，在2.2MPa的CO₂压力的高压釜中进行碳酸化持续24小时。然后通过磷化将碳酸钙材料转变成部分被碳酸根取代的羟基磷灰石。源自藤的得到的羟基磷灰石支架在纵向方向上具有4MPa和5MPa之间的压缩强度(compressive strength)，并且在横向方向上具有1MPa的压缩强度。

尽管上面提到的出版物描述了木材例如藤和松木成功地转变为羟基磷灰石，同时相当地复制了木材的三维形态，但是不能获得足以使长段承重骨再生的特征的支架。

事实上，所有提及的出版物均指从木材获得的具有小尺寸(即小于1cm³的体积)的羟基磷灰石支架，其不能具有真正的临床应用，特别是用于大的、承重的骨部位的再生。现有技术中描述的工艺不适合于制造具有便于临床应用的尺寸的羟基磷灰石支架，例如用于临界尺寸的承重的骨缺损的再生，其中大的支架即尺寸至少等于2cm是需要的。

因此，本领域仍需要具有仿生化学组成的生物形态的支架、特别是多孔3D支架，其展现出足够的机械性能、有利于细胞定植和血管生长的形态，并且同时具有适合于临床应用的尺寸。

这样的生物形态的支架将特别适合于骨再生，特别是用于植入承重的骨缺损，例如肢体的长骨(例如股骨、胫骨、肱骨、腓骨、桡骨)中，而且还用于替代和再生脊骨(例如椎体、椎间盘)、头盖骨部分或颌面骨部分。

本公开内容通过提供生物形态的支架、优选地特别适合于骨的替代和再生的、特别地用于长的承重的骨的替代和再生的羟基磷灰石支架来满足上述需求。

本公开内容还通过提供用于制造生物形态的支架、优选地3D生物形态支架的工艺来满足上述需求。具体地，生物形态的支架是羟基磷灰石支架。

公开内容的简述

一般而言，本公开内容描述了一种羟基磷灰石支架，所述羟基磷灰石支架由具有在60％和95％之间的总孔隙率的木材获得，所述孔隙率是在使所述木材经受热解的步骤之后测量的，所述支架具有沿着其中所述支架的尺寸是最大的方向测量的大于或等于2cm的长度。

更具体地，本公开内容描述了一种生物形态的羟基磷灰石，所述生物形态的羟基磷灰石由具有在60％和95％之间的总孔隙率的木材获得(所述孔隙率是在使木材经受热解的步骤之后测量的)，所述羟基磷灰石的特征在于分层次地组织化的孔结构和在沿着通道状孔隙的方向(纵向方向)上测量的大于5MPa、优选地在10MPa和20MPa之间的压缩强度。

优选地，本公开内容的羟基磷灰石显示出沿着通道的长轴的垂直方向(横向方向)的高至10MPa的压缩强度。

优选地，从木材获得的生物形态的羟基磷灰石支架具有分层次地组织化的孔结构(hierarchically organized pore structure)，该分层次地组织化的孔结构源自木材的分层次地组织化的孔结构，由该木材(天然木材)获得生物形态的羟基磷灰石支架。

本公开内容还涉及源自木材的生物形态的羟基磷灰石支架，其中羟基磷灰石部分地被选自包括以下的组的一种或更多种离子取代(掺杂)：镁、锶、硅、钛、碳酸根、钠、钾、镓、银、铜、铁、锌、锰、铕和钆。

生物形态的羟基磷灰石源自其的木材具有在60％和95％之间、优选地在65％和85％之间的总孔隙率(所述孔隙率是在使木材经受热解的步骤之后进行测量的)。表现出这些范围内的孔隙率的木材包括藤木、松木、阿巴西木、轻木、桃花心木、橡木、红木、甘巴豆木和胡桃木。优选地，生物形态的羟基磷灰石由藤木获得。

由本公开内容的木材获得的生物形态的羟基磷灰石支架具有结构内聚力和机械性能，这使其特别适合用作骨替代物。

因此，本公开内容涉及使用生物形态的羟基磷灰石支架作为骨替代物，以及涉及包含所述生物形态的羟基磷灰石支架的骨替代物。本公开内容还涉及一种由所述生物形态的羟基磷灰石支架组成的骨替代物。

源自木材的生物形态的羟基磷灰石支架可以用作用于使骨或骨部分，特别是人类和动物的骨再生的骨替代物。优选地，源自木材的生物形态的羟基磷灰石支架可以用作用于经受机械负荷的骨或骨部分的骨替代物。更优选地，骨或骨部分是腿部和臂部的长骨，例如胫骨、腓骨、股骨、肱骨和桡骨。

源自木材的生物形态的羟基磷灰石支架也可以用于头盖骨部分、颌面骨部分和脊骨(例如椎体、椎间盘)的替代和/或重建。

本公开内容的生物形态的羟基磷灰石支架也可以用作用于液体或气体的过滤器。

本公开内容还描述了一种用于获得源自木材的生物形态的羟基磷灰石支架的工艺。

更具体地，本公开内容描述了一种用于生产具有沿着其中支架的尺寸是最大的方向测量的大于或等于2cm的长度的生物形态的羟基磷灰石支架的工艺，该工艺包括对一块木材(天然木材)进行热解、渗碳、氧化、水合、碳酸化和磷化的步骤，该木材具有至少20％、优选地至少40％、更优选地包括在60％和95％之间的总孔隙率，其中所述孔隙率是在使木材经受热解的步骤之后进行测量的。

可以经受本发明的工艺的天然木材的实例是：藤木、松木、阿巴西木、轻木、桃花心木、橡木、红木、甘巴豆木和胡桃木。

虽然公开了多种实施方案，但是根据以下详细描述，另外的其他实施方案对于本领域技术人员将变得明显。如将明显的是，如本文所公开的某些实施方案能够在各种明显的方面进行修改，所有这些均不背离本公开内容。因此，附图和详细描述被认为本质上是例证性的并且不是限制性的。

附图简述

以下附图图示了本文公开的主题的优选实施方案。所要求保护的主题可以通过参考以下结合附图的描述来理解，在附图中：

图1示出了以中心通道为特征的生物形态的支架的特定实施方案。

图2示出了描绘在8周之后的移植的小鼠颅盖骨的照片。当被单独植入或与成骨基质细胞一起被植入时，支架孔隙的广泛的骨形成和渗透达到相似的程度，其中a)代表木材且无细胞(cell)，b)代表羟基磷灰石且无细胞，c)代表木材和细胞，以及d)代表羟基磷灰石和细胞。图2f)中的箭头指向模拟哈佛氏系统(Haversian system)的支架的通道状孔隙。哈佛氏系统或骨单位是致密骨的功能单位，以由同心层中组织化的骨薄片(lamellae)制成的圆柱的形式。在骨单位的中间，存在包含骨神经和血液供应的通道。

图3示出了经受压缩载荷的生物形态的支架的应力-应变曲线，其中y＝应力(N)，且x＝应变(mm)。

图4示出了与用本领域已知的方法获得的分层次结构化的羟基磷灰石的孔体积相比，本公开内容的生物形态的羟基磷灰石的内部孔体积的分布。

图5示出了描绘在24小时、48小时、72小时、7天和14天之后，与无锶支架(BC)相比，当与包含2mol％和5mol％的Sr的支架接触时，间充质干细胞的增强的生存力的图。y＝相对于BC的％。

图6示出了描绘含有2mol％(Sr2％-BC)和5mol％(Sr5％-BC)的锶的支架中的骨生成相关的基因的表达的图，例如(a)RUNX2和(b)ALP。y＝相对于BC的倍数变化表达，且x＝天数。

图7示出了描绘在24小时、48小时、72小时、7天和14天之后，与无锶支架(BC)相比，当与包含2mol％(Sr2％-BC)和5mol％(Sr5％-BC)的Sr的支架接触时的成骨细胞生存力的图。y＝相对于BC的％。

图8示出了描绘在含有2mol％(Sr2％-BC)和5mol％(Sr5％-BC)的锶的支架中的骨生成相关的基因的表达的图，例如(a)Osterix，(b)BGlap和c)IBSP。y＝相对于CT的倍数变化表达，且x＝天数。

图9示出了描绘在含有2mol％(Sr2％-BC)和5mol％(Sr5％-BC)的锶的支架中的破骨细胞相关的基因的图，例如(a)Osacr，(b)CTSK和c)Itgβ3。y＝相对于CT的倍数变化表达，且x＝天数。可以看到参与破骨细胞的主要分子途径的基因随着时间的显著减少；从而表明支架中Sr²⁺离子的存在抑制了破骨细胞的形成和活性；在图a)中，14天数据低于检测限度。

图10示出了在现有技术的渗碳步骤和本发明的渗碳步骤之后获得的两种碳化钙支架的孔隙分布的比较，进一步与起始热解的木材的孔隙分布进行比较。在图中还报告了两种碳化钙支架的比表面积。

图11、图12和图13-顶部两幅图分别示出了用本发明的工艺和现有技术工艺获得的两种碳化钙支架的SEM图像；

图13-底部两幅图示出了碳化钙晶粒的尺寸的比较；

图14示出了分别用本发明的工艺和现有技术工艺获得的用x射线-XRD测量的两种碳化钙支架的晶相的比较。

图15示出了在本发明的氧化步骤和现有技术的氧化步骤之后获得的氧化钙支架的SEM图像；

图16分别描述了在本发明的氧化步骤和现有技术的氧化步骤之后获得的两种氧化钙支架的孔隙分布；

图17和图18分别示出了在根据本发明的碳酸化步骤和现有技术的碳酸化步骤之后获得的碳酸钙的SEM图像；

图19分别示出了在根据本发明的碳酸化步骤和现有技术的碳酸化步骤之后获得的两种碳酸钙支架的孔隙分布；

图20示出了用本公开内容的工艺获得的最终生物形态的羟基磷灰石支架(在磷化之后)的孔隙分布与现有技术的最终生物形态的羟基磷灰石支架的孔隙分布之间的比较；

图21示出了在以下所获得的结果：在使具有沿着其中支架的尺寸是最大的方向测量的等于或大于2cm的长度的藤木块经受根据现有技术中描述的条件的工艺步骤之后：甚至在磷化步骤之前，支架就可能分解；

图22示出了在以下所获得的结果：在使具有沿着其中支架的尺寸是最大的方向测量的等于或大于2cm的长度的藤木块经受根据现有技术中描述的条件的工艺步骤之后：即使支架在工艺步骤直到磷化步骤仍残存，但是在磷化之后，支架分解；

图23示出了在用所有测试样品在动态条件下培养的mMSCs 3D 14天之后，基因表达相对于用作校准物的未掺杂的现有技术支架的表达的相对定量(2^-ΔΔCt)；

图24示出了具有长方体形状的生物形态的支架的实施方案。

图25示出了用本公开内容的工艺获得的生物形态的羟基磷灰石支架的通道状结构的独特特征在于具有能被通过(pervious)的大通道(直径100微米-300微米)(显微CT扫描)。这样的通道允许形成支持骨再生的合适血管。

公开内容的详细描述

如在本描述和所附权利要求中所使用的，“分层次的孔结构”或“分层次地组织化的孔结构”表示具有各向异性三维孔结构的材料，其中通道状孔隙通过横向通道相互连接，并且其中微米孔隙和纳米孔隙存在于通道状孔隙周围的区域中。

如在本描述和所附权利要求中所使用的，利用在下面的描述中描述的方法，通过相对于通道状孔隙沿着纵向方向和横向方向施加机械力来获得“压缩强度”的值。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，“骨缺损”是指骨的缺失部位或部分或缺失的整个骨并且需要完全被本公开内容的支架替代。

如在本说明书中所使用的，“生物形态的羟基磷灰石”是指这样的材料：1)由羟基磷灰石组成或2)包含羟基磷灰石或3)是包含羟基磷灰石和磷酸三钙的材料或者是由羟基磷灰石和磷酸三钙组成的材料。在材料由羟基磷灰石和磷酸三钙组成的情况下，材料是双相材料。在本发明的实施方案中，当“生物形态的羟基磷灰石”是包含羟基磷灰石和磷酸三钙的材料或者是由羟基磷灰石和磷酸三钙组成的材料时，羟基磷灰石掺杂有选自由以下组成的组的一种或更多种离子：镁、锶、硅、钛、碳酸根、钾、钠、银、镓、铜、铁、锌、锰、铕、钆及其混合物。

本专利申请的发明人已经令人惊讶地发现，可以从木材中获得生物形态的羟基磷灰石支架，其表现出仿生的化学组成、适当的机械性能、有利于细胞定植(cellcolonization)和血管生长的形态，并且同时具有适合于临床应用的尺寸。

在第一方面，本公开内容描述了一种生物形态的羟基磷灰石支架，所述生物形态的羟基磷灰石支架由具有至少20％、优选地至少40％、更优选地包括在60％和95％之间的总孔隙率的木材获得，其中所述孔隙率是在使木材经受热解的步骤之后进行测量的，支架具有沿着其中支架的尺寸是最大的方向测量的大于或等于2cm的长度。

在本公开内容的工艺之后获得的生物形态的羟基磷灰石支架的总孔隙率与在使木材经受热解的步骤之后测量的起始木材的总孔隙率相同。特别地，在本公开内容的工艺之后获得的生物形态的羟基磷灰石支架的总孔隙率为至少20％、优选地至少40％、更优选地包括在60％和95％之间。

优选地，所述支架具有沿着其中支架的尺寸是最大的方向测量的大于或等于2cm的长度，并且达到根据临床应用确定的最终值。例如，在例如胫骨、股骨、腓骨、肱骨、桡骨的长骨的骨替代物的情况下，沿着其中支架的尺寸是最大的方向测量的支架的长度可以包括在2cm和20cm之间。

优选地，本公开内容的支架具有在纵向方向上测量的大于5MPa、优选地在10MPa和20MPa之间的压缩强度。

优选地，本公开内容的支架示出沿着横向方向的高至10MPa的压缩强度。

优选地，生物形态的羟基磷灰石支架的特征在于分层次地组织化的孔结构。

本公开内容的羟基磷灰石支架的“分层孔结构”或“分层次地组织化的孔结构”源自获得支架的起始木材的复杂的三维分层结构，并且因此具有一定范围的不同尺寸的孔隙。分层结构中的不同尺寸的孔隙使其适合用作骨替代物。

例如，具有直径≥200μm、优选地在150μm-300μm之间、更优选地在200μm-300μm之间的孔隙将允许细胞定植和增殖以及形成合适的血管化树。与通道状孔隙部分相互连接的具有直径≤10μm、优选地<1μm、更优选地在0.01μm和0.1μm之间的孔隙(微米孔隙和纳米孔隙)允许营养液的交换和细胞新陈代谢的废物的排出。

在羟基磷灰石中保留木材的分层孔结构，为支架提供了最佳的机械特征，并且使得能够有效地卸下机械载荷。

由于从木材获得的羟基磷灰石详细地再现了天然材料的结构，因此可以将其称为生物形态的(biomorphic)。

特别地，本公开内容的支架的分层次地组织化的孔结构包括在30％和80％之间(总孔隙率)的具有直径低于150μm的孔隙，100％的总孔隙率的剩余部分是具有大于150μm的直径的孔隙。

在一种实施方案中，优选地当起始木材为藤时，支架的总孔隙率的30％和60％之间归因于具有直径≤10μm的孔隙。

在一种实施方案中，优选地，当起始木材为藤时，羟基磷灰石支架的总孔隙率的至少25％、优选地总孔隙率的25％和50％之间归因于具有直径≤1μm、优选地≤0.1μm、特别地在0.01μm和0.1μm之间的孔隙。

在一种实施方案中，优选地当起始木材是藤时，羟基磷灰石支架的总孔隙率的至少20％归因于具有直径≥150μm的孔隙。

优选地，羟基磷灰石支架具有的比表面积(SSA)为>9m²/g，优选地为9m²/g至20m²/g。

用于获得羟基磷灰石支架的木材可以是具有至少20％、优选地至少40％、更优选地包括在60％和95％之间的总孔隙率、甚至更优选地在65％和85％之间的孔隙率的任何木材(所述孔隙率是在使木材经受热解的步骤之后测量的)。

用于获得羟基磷灰石的合适木材的实例包括藤木、松木、阿巴西木、轻木、桃花心木、橡木、红木、甘巴豆木和胡桃木，优选地，使用的木材是藤木。

从木材获得的羟基磷灰石支架可以包含部分地被一个或更多个离子取代的羟基磷灰石。这样的离子的实例是碳酸根、镁、锶、硅、钛、钠、钾、银、镓、铜、铁、锌、锰、铕和钆。在磷酸根位点中引入碳酸根提高了生物-溶解度并且增强了与成骨细胞的表面亲和力。

镁的引入提供了新骨的并置和形成的增强的能力。锶的引入有助于重新建立骨生产，受诸如骨质疏松的代谢性疾病的影响，使得其存在可以增强骨再生。

银、镓、铜和锌的引入提供了抗菌性能。

当从木材获得的羟基磷灰石支架包含部分地被一个或更多个离子取代的羟基磷灰石时，支架是包含掺杂的羟基磷灰石和磷酸三钙的材料或者由是掺杂的羟基磷灰石和磷酸三钙组成的材料。根据另外的实施方案，本公开内容的生物形态的羟基磷灰石支架可以包括：

-0-15重量％的镁，优选地1重量％-10重量％；和/或

-0-15重量％的碳酸根(carbonate)，优选地1重量％-10重量％；和/或

-0-15重量％的锶，优选地1重量％-10重量％；和/或

-0-20重量％的钛，优选地1重量％-10重量％；和/或

-0-15重量％的钾，优选地1重量％-10重量％；和/或

-0-15重量％的钠，优选地1重量％-10重量％；和/或

-0-15重量％的硅，优选地1重量％-10重量％和/或；

-0-15重量％的银，优选地1重量％-10重量％和/或；

-0-15重量％的镓，优选地1重量％-10重量％和/或；

-0-15重量％的铜，优选地1重量％-10重量％和/或；

-0-30重量％的铁，优选地1重量％-10重量％；和/或

-0-15重量％的锌，优选地1重量％-10重量％和/或；

-0-15重量％的锰，优选地1重量％-10重量％和/或；

-0-15重量％的铕，优选地1重量％-10重量％和/或；

-0-15重量％的钆，优选地1重量％-10重量％和/或。

根据本公开内容的由木材获得的生物形态的羟基磷灰石支架具有与机械强度特性和尺寸相结合的生物活性和生物可吸收性特性，使得其特别适合临床用作骨替代物，特别是在人类和动物中。这种骨替代物可以用来替代和/或重建和/或再生骨、骨部分或骨缺损。例如，骨替代物可以用来替代或再生受到机械负荷的骨或骨部分。例如，骨替代物可以用来替代或再生臂部和腿部的长骨。这样的长骨可以包括胫骨、股骨、腓骨、肱骨、桡骨等。

骨替代物也可以用于头盖骨部分、颌面骨部分和脊骨(例如椎体、椎间盘)的替代和/或重建以及脊柱融合手术过程中。

当被用作骨替代物时，生物形态的羟基磷灰石支架可以具有适应骨缺损的形状的形状，该骨缺损需要以大体上填充骨空隙的方式被重建。因此，本公开内容的支架和骨替代物可以具有适合于重建和再生骨缺损或适合于替代骨的任何缺失部分的任何形状。

例如，本公开内容的支架或骨替代物可以采取圆柱体、直棱柱或长方体或楔形的形式。在一种实施方案中，支架或骨替代物包含中心通道，其直径在支架或骨替代物的直径的约20％至约60％之间。特别地，支架或骨替代物具有管状形状。

在一种实施方案中，本公开内容进一步涉及具有大于或等于2cm的高度的具有圆柱形、直棱柱、长方体或管状形状的支架或骨替代物。

在本公开内容的实施方案中，支架或骨替代物可以用基于羟基磷灰石和/或胶原蛋白的薄层涂覆以增加细胞粘附和增殖，并且因此增加周围骨组织中的骨整合。层可以另外包含羟基磷灰石，所述羟基磷灰石被与刺激骨再生有关的一种或更多种离子例如碳酸根、镁、硅、钾、钠和锶取代或具有抗菌作用例如镓、银、铜或锌。

在本公开内容的另一种实施方案中，可以将支架或骨替代物浸泡在天然聚合物(选自包括明胶、胶原蛋白、藻酸盐、壳聚糖、胶凝糖、纤维素的组)中以进一步增加机械性能并进一步促进细胞粘附。

对于支架或骨替代物细胞，可以加入富含血小板的血浆、抗体、生长因子蛋白、DNA片段、miRNA、siRNa以便帮助细胞粘附。

也可以将药物例如抗生素或抗癌药物添加到支架或骨替代物中。

本公开内容还涉及一种具有骨缺损的人或动物骨的重建和/或再生的方法，包括以下步骤：

-提供包含本公开内容的生物形态的羟基磷灰石支架或由其组成的骨替代物，该生物形态的羟基磷灰石支架具有对应于骨缺损的形状的形状；

-将骨替代物植入患者的骨缺损中。

优选地，重建和/或再生的方法包括以下步骤：提供骨缺损的3D模型，并且基于所获得的3D模型，赋予支架与骨缺损的形状对应的形状。赋予支架形状的步骤可以被应用于起始的木材片或在本公开内容的转变过程结束时获得的羟基磷灰石支架，或应用于在该工艺的每个步骤之后获得的支架(例如在碳酸化步骤之后)。优选地，赋予形状的步骤被应用在起始的木材片上。

本公开内容的生物形态的羟基磷灰石支架和部分地被一种或更多种离子取代的生物形态的羟基磷灰石支架由包括以下步骤的多步骤转变工艺获得：

1)热解：将天然木材在惰性气氛下在600℃至1000℃范围内的温度加热，以允许所有有机物质分解并且消除。从该过程中，获得了碳模板。

2)渗碳：碳模板在900℃至1200℃范围内的温度和<1000毫巴、优选地<600毫巴、更优选地在0.05毫巴-100毫巴范围内的压力用以蒸汽状态的钙渗透，因此将碳模板转变成碳化钙(CaC₂)。

3)氧化：在空气中在750℃-1300℃、优选地1000℃-1200℃的范围内的温度对碳化钙模板进行加热，从而使碳化钙能够转变成氧化钙(CaO)。

4)水合：将所述氧化钙模板暴露于水，从而使水吸收的量为1摩尔％-25摩尔％，优选地5摩尔％-15摩尔％；

5)碳酸化(carbonation)：通过在500℃至900℃的范围内的温度、优选地在750℃至850℃的范围内的温度在CO₂压力或CO₂与惰性气体(例如氩气、氮气)的混合物压力加热而将氧化钙模板转变成碳酸钙。压力范围为从4MPa至20MPa。

6)磷化：用至少一种磷酸盐处理碳酸钙模板。

在多步骤工艺的热解步骤1)中，天然木材优选地选自藤木、松木、阿巴西木、轻木、桃花心木、橡木、红木、甘巴豆木和胡桃木。更优选地，天然木材是藤木。

天然木材具有至少20％、优选地至少40％、更优选地包括在60％和95％之间的总孔隙率，其中所述孔隙率是在使木材经受热解的步骤之后测量的。

在热解步骤1)之前，起始天然木材可以任选地在50℃和90℃之间的温度、优选地在60℃和80℃之间的温度、更优选地在65℃和75℃之间的温度干燥。天然木材可以被干燥持续多于6小时、优选地持续多于12小时、优选地持续多于18小时、优选地持续包括在20小时和30小时之间的时间。

在多步骤工艺的热解步骤中，惰性气氛可以是选自包含氮气和氩气的组的气体的气氛。

在多步骤工艺的热解步骤中，天然木材可以在600℃至1000℃之间的温度、优选地在800℃和1000℃之间的温度加热。热解步骤可以持续多于6小时、优选地多于12小时、优选地多于18小时、优选地所述步骤可以持续包括在20小时和30小时之间的时间。

热解步骤1)的热循环可以通过以不高于5℃/min、优选地不高于3℃/min的速率加热天然木材并且通过以不高于3℃/min、优选地不高于2℃/min的速率冷却，以防止材料的裂纹形成和内部断裂。

在热解步骤1)之前，多步骤方法可以另外包括选择和制备天然木材的步骤i)，其中所述天然木材可以被切割成具有对应于待被重建的骨缺损形状的形状的块。特别地，天然木材被成形为具有沿着其中木材的尺寸是最大的方向测量的大于或等于2cm的长度的木材块。优选地，木材的尺寸达到根据临床应用确定的最终值。

例如，天然木材可以以圆柱体、直棱柱或长方体的形式被成形。天然木材也可以以这样的方式被成形，以致包括中心通道，该中心通道具有在木材块的直径的约20％至约60％之间的直径。特别地，天然木材可以被切割成管状形状。

优选地，选择和制备天然木材的步骤i)包括以下步骤：提供骨缺损的3D模型，并且基于获得的3D模型，赋予天然木材与骨缺损的形状相对应的形状。赋予天然木材形状的步骤可以被应用于起始天然木材或被应用于在多步骤转变过程结束时获得的羟基磷灰石支架。优选地，赋予形状的步骤被应用在起始天然木材上以避免支架的内部和外部损坏(断裂)。

在多步骤工艺的渗碳步骤2)中，(在反应开始时)以在1.10至2.50的范围内、优选地在1.50至2.00的范围内的Ca/C摩尔比进行。Ca/C摩尔比是重要的，因为低于该范围的比率导致不完全反应，并且高于该范围的比率导致孔隙被Ca的残余物阻塞。

在多步骤工艺的渗碳步骤中，碳模板以在1℃/min至10℃/min的范围内的加热速率加热、优选地以在1℃/min至7℃/min的范围内的加热速率加热。

本专利申请的发明人已惊讶地发现，如上所述的在减压下进行渗碳步骤对于后续工艺步骤的成功应用是有利的，特别是当需要生产大的生物形态的支架时。

事实上，通过使用上述压力条件，钙的蒸发可以在比室温的钙的沸点(即，1484℃)低约400℃-500℃的温度进行，因此出乎意料地导致，在比本领域已知的任何其他工艺低的温度将热解的木材完全转变为碳化钙。特别地，使用在0.5毫巴-600毫巴、或者优选地0.05毫巴至100毫巴的范围内的压力导致热解的木材大体上完全转变为碳化钙。

热解的木材大体上完全转变为碳化钙将导致对随后的转变步骤的收率有利。

相对于使用已知工艺从木材获得的已知支架，本公开内容的渗碳条件还改善了渗碳后的支架和最终生物形态的支架二者中的天然木材的具有直径≤1μm(优选地0.01μm至0.1μm)的微米孔隙和纳米孔隙的保持。

渗碳阶段是该工艺中的关键步骤，因为在此步骤之后微孔隙率和纳孔隙率(micro-and nano-porosity)的良好保持将确保最终的生物形态的支架表现出类似的纳/微-孔隙率。在最终的生物形态的支架中高比例的良好相互连接的微米孔隙和纳米孔隙的存在允许营养液的交换和细胞代谢的废物的排出。

除了改善具有直径≤1μm的微米孔隙和纳米孔隙的保持外，本文所述的渗碳条件在比表面积(SSA)为从9m²/g至20m²/g的渗碳之后产生支架(并且还有最终的生物形态的支架)。这种比表面积比用本领域已知的工艺获得的支架的SSA高约2倍-其为约5m²/g-6m²/g(参见比较实施例4和图10-图13)。

本公开内容的渗碳条件还产生了含有碳化钙晶粒的多孔碳化钙支架，所述碳化钙晶粒比用已知工艺(参见比较实施例4和图13-底部照片)获得的支架的晶粒小。

比较实施例示出，根据本公开内容的渗碳之后的支架中的碳化钙晶粒的尺寸为约5μm-15μm(优选地约10μm)，而用已知工艺获得的渗碳之后的支架的晶体尺寸为约100μm。

本专利申请的发明人已令人惊讶地发现，用上述的渗碳条件获得的且通过先前公开的方法不能获得的较高的比表面积(SSA)和较小的晶粒尺寸，对于确保在工艺的每个步骤之后高收率的天然木材的转变是重要的。

比较实施例4和图14也示出了，根据本公开内容的渗碳之后的支架含有具有四方晶格和立方晶格的混合晶格的碳化钙，而用已知工艺获得的支架仅含有具有四方晶格的碳化钙。由于氧化钙仅具有立方晶体结构，所以可以发生从部分地呈立方形式的碳化钙向氧化钙的转变，而在支架中具有产生微裂缝的较低风险。这对于最终的生物形态的支架的质量是极其有利的。

因此，渗碳步骤中采用的条件大大减少了在碳化钙的分层孔结构中可以观察到的缺陷的数目。

此外，本公开内容中所采用的低温(即远低于1500℃)防止了碳化钙的晶粒聚结和过度固结，这引起从起始木材的原始微结构的结构变形和偏差，从而损害以下工艺步骤的结果。

在多步骤工艺的氧化步骤3)中，可以将碳化钙模板加热至在800℃至1300℃的范围内的最终温度，优选地加热至在1000℃至1200℃的范围内的最终温度。

在氧化步骤中，碳化钙模板可以以在1℃/min至15℃/min的范围内的加热速率加热、优选地以在1℃/min至7℃/min的范围内的加热速率加热。根据上述渗碳步骤在压力下获得的碳化钙的氧化导致相对于用已知工艺可获得的支架(参见比较实施例4和图16)具有较高比表面积(SSA)和孔隙率(具有较高的微米孔隙和纳米孔隙的分数)的氧化钙的支架。比较实验示出，在氧化步骤之后，微米孔隙率和纳米孔隙率也保持不变。

在多步骤工艺的水合步骤4)中，将氧化钙模板暴露于水，从而使水吸收的量优选地包括在1摩尔％-25摩尔％的范围内、更优选地包括在5摩尔％-15摩尔％的范围内。该步骤导致含有以3D结构的按重量计≤50％的量的氢氧化钙的水合氧化钙的形成，其催化随后的CaO的碳酸化。必须严格控制作为中间产物的氢氧化钙(Ca(OH)₂)的量，以避免3D结构的坍塌。本文描述的水合条件允许保持氢氧化钙的量≤50％。

在优选的实施方案中，水合步骤与碳酸化步骤同时进行，例如通过使用富含水的CO₂。

在多步骤工艺的碳酸化步骤5)中，使用高温同时逐渐增加系统中的CO₂压力直至上述值，令人惊讶地使水合氧化钙大体上完全转化为碳酸钙模板，这表现出令人惊讶的高内聚力和机械强度。

多步骤工艺的碳酸化步骤可以根据以下热循环之一进行：

-在约10MPa-15MPa的恒定CO₂压力，将温度缓慢升高至在约750℃-850℃的范围内、优选地约800℃的值；

-在约750℃-850℃(或约700℃-800℃)、优选地在约800℃的恒定温度，将压力升高至约10MPa-15MPa；

-将压力保持在约4MPa-6MPa，同时将温度升高至约750℃-850℃(或约700℃-800℃)，优选地升高至约800℃，并且随后将压力升高至约10MPa-15MPa。

碳酸化过程通过形成反应性中间体例如氢氧化钙而发生。这导致最终的碳酸钙以细粒结构为特征，大体上没有任何大的碳酸钙立方晶体(>10μm)，这可能损害3D结构的结构完整性。比较实施例4和图17-图18示出了，由于应用水合步骤，在碳酸化步骤之后，与用本领域已知的工艺获得的中间体3D结构相比，获得了更细粒的结构。

在上述条件下进行的碳酸化步骤导致，当与本领域已知的类似工艺相比时，通过本公开内容的工艺可获得的生物形态的羟基磷灰石支架的优异的机械性能，其中碳酸化步骤在高温和低压或在高压和低温进行。

本专利申请的发明人已令人惊讶地发现，在碳酸钙中实现上述报告的特征是使得能够实现大块(即≥2cm)完全转变成最终的生物形态的支架的的重要条件，该最终的生物形态的支架具有所需的组成并维持原始木材微结构。

在多步骤工艺的磷化步骤6)中，至少一种磷酸盐可以选自由磷酸铵、磷酸钠和磷酸钾组成的组。使用磷酸铵使得能够更好地控制pH，因此转化过程是更有效的，并且所得到的物体具有有利的机械性能和物理内聚力。

在多步骤工艺的磷化步骤中，可以将碳酸钙模板浸入包含至少一种所述磷酸盐的溶液中。该溶液可以具有0.1M至5M的浓度，优选地具有0.5M至2M的浓度。

在多步骤工艺的磷化步骤中的PO₄/CO₃的起始比率优选地为理论化学计量值的1.5倍至5倍，优选地为理论化学计量值的2倍至4倍。

在多步骤工艺的磷化步骤中，浸入富含磷酸盐的溶液中的碳酸钙模板可以在0.1MPa至2.5MPa(水热条件)的范围内的蒸气压下从25℃加热至300℃。

磷化步骤可以持续约12小时至约180小时，优选地约48小时至约120小时，更优选地24小时至72小时。

在多步骤方法的磷化步骤中的富含磷酸盐的溶液的起始pH优选地在pH 7和12之间。

用其他离子取代羟基磷灰石可以通过在加工完成的期间或之后，优选地在磷化过程期间引入含有感兴趣的离子的合适的可溶性盐来实现。合适的离子可以包括锶、镁、硅、钛、碳酸根、钠、钾、镓、银、铜、铁、锌、锰、铕、钆、及其混合物。含有镁离子的溶液的实例是MgCl₂ ^*6H₂O，并且含有锶离子的溶液的实例是SrCl₂ ^*6H₂O。

作为离子掺杂的结果，最终的生物形态的支架包含以下材料或由以下材料组成，该材料包含掺杂的羟基磷灰石和磷酸三钙或由掺杂的羟基磷灰石和磷酸三钙组成。

根据不太优选的实施方案，在天然木材未被成形为适合用作骨替代物(即，如果未进行步骤i))的形式和尺寸的情况下，由多步骤工艺获得的生物形态的羟基磷灰石支架可以方便地通过已知技术成形为具有所需形式和形状的支架。

本公开内容还涉及由上述工艺获得(或可获得)的生物形态的羟基磷灰石支架，如果与通过本领域已知的类似工艺获得的分层次地结构化的羟基磷灰石相比具有改善的物理性能和机械性能。

具体地，由本公开内容的工艺获得(或可获得)的生物形态的羟基磷灰石支架具有上文针对本公开内容的支架或骨替代物所描述的所有特征。

具体地，就现有技术而言，用本文所述的工艺获得的最终的生物形态的支架具有孔隙率，该孔隙率由比通过本领域已知的类似工艺获得的支架更高百分比的微米孔隙和纳米孔隙构成。特别地，本公开内容的羟基磷灰石支架的总孔隙率的至少25％、优选地总孔隙率的25％和50％之间归因于具有直径≤1μm、优选地≤0.1μm、特别地在0.01μm和0.1μm之间的孔隙。

微孔隙和纳孔隙率的高百分比从临床观点来看是非常有利的，因为微米孔隙和纳米孔隙允许营养液的交换和细胞代谢废物的排出增强，从而改善骨再生。

此外，本公开内容的生物形态的支架示出了比用本领域已知的工艺获得的支架更高的比表面积(9m²/g至20m²/g相对于5m²/g-6m²/g)。较高的表面积决定了支架或骨替代物的增强的表面生物活性和增强的润湿性，从而改善了骨整合和生物再吸收过程。

此外，本公开内容的生物形态的支架还包括约100nm-200nm(即纳米晶粒)的羟基磷灰石晶粒，其比存在于烧结的羟基磷灰石中的羟基磷灰石晶粒(即，通常>1μm)小得多。小晶粒示出用于骨再生的临床优势，因为它们可以更容易地被细胞再吸收，从而相对于本领域已知的支架允许更好的骨再生。

另外，本公开内容的生物形态的支架表现出在沿着通道状孔隙的方向(纵向方向)测量的大于5MPa、优选地在10MPa和20MPa之间的压缩强度，以及沿着横向通道的方向(横向方向)测量的高至10MPa的压缩强度。本公开内容的发明人令人惊讶地发现，这些机械特征使得最终的羟基磷灰石支架作为独立的材料，因此其可以在承重的骨部分的再生程序中应用，而不使用任何增强或维持结构例如壳或棒。

在自然界中，纳米晶体、离子取代的羟基磷灰石是存在于硬体组织中的主要成分；实际上，骨中的矿物质相是由尺寸低于100nm的精细分散的羟基磷灰石片组成的纳米结构相，其在代表整个骨组织的3D分层次地组织化的多孔结构中组织化。

在这方面，本公开内容的发明人惊奇地发现，当与先前已知的技术相比时，通过上述工艺获得的天然木材结构的生物形态的转变可以独特地产生最终的羟基磷灰石骨支架，其同时表现出模拟骨的组合物、高度开放且相互连接的大/微/纳-孔隙率和优越的机械强度，与在承重的部位、特别是在肢体的长节段骨或大的颌面部区域或脊柱中的应用相关的尺寸有关。

所有这些从未被示出同时发生的特征对于在承重的部位实现广泛的骨再生是非常重要的。用根据本公开内容的方法可获得的生物形态的羟基磷灰石支架结构的差异产生了在比较实施例6中示出的重要的临床优点。特别地，就现有技术的支架而言，本发明的支架对成骨相关基因的表达示出较高的诱导力，这在骨再生方面转变为更好的临床表现。

通过以下非限制性实施例进一步说明了本公开内容。

实施例

测量方法

经受热解步骤的木材(热解的木材)的总孔隙率：称重成形为棱柱体或圆柱体的一块热解的木材块，然后通过测量直径和高度获得体积。热解的木材的绝对密度(A.D.)按重量/体积比获得；通过将热解的木材的A.D.除以碳的理论密度(即R.D.＝A.D./2.25)获得相对密度(R.D.)。总孔隙率(％)由(1-R.D.)*100获得。

在该过程的每个步骤之后获得的支架的总孔隙率以及在该过程结束时获得的生 物形态的羟基磷灰石支架的总孔隙率：

孔隙率通过应用与上述相同的方法，使用对于在每个步骤之后获得的每种材料的理论密度(即，CaC₂、CaO、CaCO₃、HA的理论密度)的适当的值来计算。

压缩强度：通过使用通用螺杆式测试机器使成形为棱柱体或圆柱体的最终的支架或骨替代物经受加载，以获得应力-应变曲线和断裂载荷。压缩强度由断裂载荷与经受压缩的区域之间的比率给出。

孔隙直径：通过压汞法(mercury intrusion porosimetry)和扫描电子显微镜(SEM)分别评估最终支架或在工艺的每个步骤之后的孔径分布和孔形态。压汞法分析是基于在各种压力使汞进入样品的孔隙中的测量。

晶相：鉴定和定量：通过X射线粉末衍射技术(XRD)进行支架上的晶相的鉴定和定量，以不同的和连续的角度对样品上入射的X-辐射的结果进行评估。

比表面积：使用BET方法评估每单位总体积的材料的总表面积(m²/g)，根据吸附的气体的量与其压力的关系估算。

实施例1

使用多步骤工艺制备源自木材的羟基磷灰石：

i)将天然藤木块成形为具有以下尺寸的圆柱形形式：直径＝2cm；高度＝3cm；

1)天然木材的热解

起始木块在70℃干燥持续24小时，然后在流动的氮气下在800℃处理持续超过30分钟，从而转变为纯碳模板。热循环：以1℃/min加热直至350℃，并且以2℃/min从350℃加热至800℃。将样品保持在800℃的温度持续约至少30分钟，并且然后将模板以1℃/min冷却。

2)渗碳

碳模板在1000℃在氩气和钙的气氛下在0.5毫巴经受加热，从而转变成碳化钙。在1000℃的停留时间＝30分钟。

3)氧化

碳化钙模板遵循以在1℃/min-7℃/min的范围内的加热速率在空气中加热直至1100℃，从而使模板能够完全转变为氧化钙。

4)水合

氧化钙本体通过暴露于水而被活化，从而使水吸收的量为约10摩尔％。

5)碳酸化

将预处理的水合的本体在逐渐增加的0.5MPa至10MPa的CO₂压力加热至800℃。这将氧化钙本体转变为碳酸钙。

6)磷化

在200℃的温度，在2MPa的水蒸气压下，将碳酸钙本体浸渍在0.5M的磷酸铵溶液中，并且起始的PO₄与CO₃的比率为理论化学计量值的2倍。

通过沿着垂直方向和横向方向施加机械力相对于通道状孔隙的取向来评估支架的压缩强度。

通过沿着孔隙方向(这是最具临床反射性的构型以模拟长节段骨的情况下的体内生物力学刺激)加载，支架(开发为具有外径＝15mm；内径＝6mm；高度＝20mm的中空圆柱体，并且孔隙程度为60vol％-65vol％)表现出高至16MPa的压缩强度(即250Kg的极限载荷(图1和图3))。在横向方向上，支架表现出高至4MPa的压缩强度。

支架也可以在1300℃的最高温度下在受控的气氛中经受热处理，以进一步增强支架的机械强度。

生物形态的支架的骨样微观结构特征使得能够将拓扑信息传递给细胞以构建具有组织化结构的新的骨组织。这通过体内测试证实，其中将支架植入兔股骨和小鼠颅盖中。

支架没有诱导任何毒性不良反应，也没有手术后的任何坏死或感染。支架在1个月后由新形成的骨产生广泛的定植，类似于商用多孔磷灰石支架的对照：EngiPore，Finceramica SpA，意大利。

从小鼠颅盖移植的组织示出了广泛的骨形成，并且当支架单独植入时以及另外当将成骨基质细胞添加到植入的支架(图2a-d)中时都渗透到支架孔隙中。支架的通道状孔隙率诱导形成模仿哈佛氏系统的骨结构(如通过图2f中的箭头所指示的)。此外，支架的通道状孔隙诱导快速血管生成，从而有助于新骨的形成和渗透。这一结果证实，与内源性血管网络的取向相关的孔隙率的合适取向可以有效地促进广泛的血管生成的早期发展。

实施例2

本公开内容的生物形态的羟基磷灰石与本领域已知的分层次地结构化的羟基磷灰石的比较

对于仅磷化步骤(NH₄H₂PO₄–(NH₄)₂HPO₄的混合物,pH＝9,T_最大＝60℃，时间＝80h)在由天然藤木获得的本公开内容的生物形态的羟基磷灰石的孔径分布和根据Anna Tampieri等人在Journal of Material Chemistry,2009,19,4973-4980中的教导使用Ruffini等人在Chemical Engineering Journal 217(2013)150-158中的教导的由相同的天然木材获得的分层次地结构化的羟基磷灰石的孔径分布之间进行比较测试。

在图4中示出了结果，其中黑色柱是指本公开内容的生物形态的羟基磷灰石并且深灰色柱是指本领域已知的羟基磷灰石。

明显的是，与已知的分层次地组织化的羟基磷灰石相比，本公开内容的生物形态的羟基磷灰石中具有包括在200μm-300μm的范围内的直径的孔隙的数目的增加，所述孔隙是当植入为骨替代物时具有促进生物形态的羟基磷灰石的生理学血管化的最合适尺寸的孔隙。

而且，相同的图4示出了具有在0.01微米-0.1微米的范围内的直径的孔隙的增加的数目，这清楚地表明天然木材的微结构被保留在最终产品中。

实施例3

源自木材的掺杂有Mg²⁺和/或Sr²⁺的羟基磷灰石的制备：

遵循如实施例1中所述的多步骤方法的步骤1至5以产生碳酸钙本体。掺杂Mg²⁺和/或Sr²⁺离子已经根据以下每种方法实现：

方法1

将Sr²⁺(以SrCl₂的形式)的溶液加入到1.0M富含磷酸盐的溶液中。然后将根据多步骤方法制备的碳酸钙本体浸入合并的溶液中，并且在2MPa的水蒸气压下加热至200℃的温度。这产生了具有起始木材块的形态的Sr²⁺掺杂的羟基磷灰石。

方法2

将碳酸钙本体浸入1.0M富含磷酸盐的溶液中。在0.1MPa的水蒸气压下加热至25℃-90℃的温度时，逐渐添加Sr²⁺溶液。这产生了具有起始木材块的形态的Sr²⁺掺杂的羟基磷灰石。

方法3

纯的碳酸钙本体(或者通过在室温或更高温度在1.5M富含磷酸盐的溶液中浸泡持续24小时而部分转化为羟基磷灰石)浸入含有Sr²⁺离子的水溶液或有机溶液中持续24小时。然后将其从溶液中除去并浸入1.5M富含磷酸盐的溶液中。同时在0.5MPa-1.5MPa的范围内的水蒸气压下加热至200℃的温度。这产生了具有起始木材块的形态的Sr²⁺掺杂的羟基磷灰石。

被锶取代的支架的性质

研发了被锶取代的羟基磷灰石支架，并且发现当与无锶支架相比时，其表现出增强的间充质干细胞(MSC)的生存力(图5)。

锶支架还表现出良好扩散的形态和增加的成骨相关的基因例如RUNX2和ALP的表达(图6)，从而用作成骨细胞分化的启动子。具体地，当与无Sr的支架相比时，检测到两种基因的mRNA水平的显著增加(p<0.05)。对于具有2mol％的Sr的支架，这种增加是特别高的。

当使用Sr-取代的羟基磷灰石支架时，观察到在14天的研究中的前成骨细胞的增强的增殖(图7)。事实上，支架中锶的增加从长远来看产生了更高的细胞生存力。这些结果意味着新骨形成可以被成功诱导并持续。

支架也证明在研究的两周期间维持成骨细胞表型的可能性(图8)。

还通过观察破骨细胞的行为来研究与锶取代的支架接触的细胞的行为。进行了初步的形态学分析，以确认和验证破骨细胞形成的模型。在支架表面上生长的破骨细胞表现出它们的典型的形态。

评估涉及破骨细胞活性和形成的主要标志物(Oscar、整合素β3和CatepsinK)的相对基因表达(图9)。分析示出，涉及破骨细胞的主要分子途径的所有基因随着时间的基因表达显著降低，由此表明支架中Sr²⁺离子的存在抑制破骨细胞形成和活性。

总之，用Sr²⁺离子取代羟基磷灰石对骨细胞产生生物学作用，具体地造成：i)对MCS成骨相关基因的显著诱导作用；ii)对成骨细胞增殖的诱导作用，和iii)对破骨细胞活性的抑制作用。

·在植入节段性骨缺损的情况下，新的支架被设计成存在中心通道，该中心通道沿平行于主要的单向孔隙的方向延伸，从而暴露于骨残端作为新骨髓发育的指导(图1)。通道大小是基于具体缺损定义的；然而，为了保持足够的强度，通道具有相对于整个支架宽度的在20％-60％的范围内的直径。

实施例4-本公开内容的生物形态的羟基磷灰石与本领域已知的分层次地结构化的羟基磷灰石的比较

比较测试在使用本公开内容的工艺制造的生物形态的羟基磷灰石与根据AnnaTampieri等人在Journal of Material Chemistry,2009,19,4973-4980中的教导从相同的天然木材(藤)获得的羟基磷灰石支架之间进行。在本公开内容的工艺中使用的藤木具有沿着其中支架的尺寸是最大的方向测量的等于2cm的长度。现有技术工艺中使用的藤木具有沿着其中支架的尺寸是最大的方向测量的等于1cm的长度。

在两种工艺的每个步骤之后，分析和比较中间和最终的支架的比表面积(SSA)和孔隙分布(参见图10、图16、图19和图20)。另外，在渗碳步骤之后，比较两种中间支架的碳化钙晶体尺寸(参见图13-底部图)。

比较在渗碳步骤之后两种碳化钙支架的晶格结构。在图14中示出了比较。

图10示出了在相应的渗碳步骤之后获得的两种碳化钙支架的孔隙分布的比较，进一步与起始热解的木材的孔隙分布进行比较。在图中还报告了两种碳化钙支架的比表面积。结果示出，仅在本公开内容的渗碳步骤之后获得的碳化钙支架保留了藤木的微孔和纳孔分布(孔隙尺寸<1μm)。此外，两种比表面积的比较示出了对根据本公开内容的支架的改进。

图11、图12和图13-上部两幅图示出了两种碳化钙支架的SEM图像，从中可以清楚地看到天然木材微孔隙率和纳孔隙率的更好的保存。

图13-底部两幅图示出了碳化钙晶体的尺寸的比较。根据本公开内容获得的碳化钙示出了平均尺寸为约10μm的晶粒，而用现有技术工艺获得的晶粒具有约100μm的平均尺寸。

图14示出了用x射线-XRD测量的两种碳化钙支架的晶相的比较。结果表明，根据本公开内容获得的碳化钙具有四方晶格和立方晶格两者，而现有技术的碳化钙仅具有四方晶格。本公开内容的碳酸钙支架相对于现有技术支架包含更高量的Ca(OH)₂。

图15示出了在各个氧化步骤之后获得的氧化钙支架的SEM图像。对应于根据本公开内容获得的支架的图片保留了CaO晶粒之间的微孔隙率，而在现有技术支架中，微孔隙率完全消失。

图16描绘了两种氧化钙支架的孔隙分布。比较清楚地示出，在本公开内容的支架中，氧化步骤之后获得的微孔隙率和纳孔隙率以及比表面积是更高的。

图17和图18示出了在相应的碳酸化之后获得的碳酸钙的SEM图像。与其中大的方解石晶体(高至约50μm)表征整体结构的现有技术相比，根据本公开内容的材料示出延长的精细结构。在磷化步骤期间，大晶体导致结构破裂或坍塌。

图19示出了在碳酸化步骤之后获得的两种碳酸钙支架的孔隙分布。孔隙分布和比表面积的比较示出了类似于上面针对氧化钙所讨论的结果的结果：利用本发明的工艺保持微孔结构和纳孔结构<1μm，并且相对于现有技术获得较高的SSA。

图20示出了用本公开内容的工艺获得的最终生物形态的羟基磷灰石支架(在磷化之后)的孔隙分布与现有技术的最终生物形态的羟基磷灰石支架的孔隙分布之间的比较。还示出了相应的SSA的比较。

结果示出了本公开内容的生物形态的支架具有比现有技术支架更高的微孔隙率和纳孔隙率分数以及更高的比表面积。

实施例5-适用于藤木块的现有技术工艺，藤木块具有沿着其中支架的尺寸是最大 的方向测量的等于2cm的长度。

进行测试以说明现有技术工艺(Anna Tampieri等人在Journal of MaterialChemistry，2009,19,4973-4980中)不允许制造具有沿着其中支架的尺寸是最大的方向测量的等于或大于2cm的长度的支架，即用于骨再生的临床感兴趣的支架。

为此，藤木块根据Tampieri等人所述的条件经受了工艺步骤。

图21示出了甚至在磷化步骤之前，支架就可能分解。图22示出了即使支架在工艺步骤直到磷化步骤仍残存，但是在磷化之后，支架分解。

该测试清楚地示出，陶瓷产品的规模经常不是简单的操作；相反，为了制备较大的产品，甚至当本领域已知用于制造小型陶瓷产品的工艺时，工艺条件也需要改变(有时是大幅改变)。

实施例6-比较测试

用小鼠间充质干细胞(mMSC)进行体外研究。分析基因表达谱以便测试由本公开内容的工艺获得的生物形态的羟基磷灰石支架和用现有技术工艺获得的生物形态的羟基磷灰石支架诱导的参与成骨分化的特定基因的过表达。

样品描述

两种测试的支架定义如下：

结果

与现有技术的支架相比，在所有本公开内容的支架中生长的细胞中，与成骨分化的早期(Runx2和ALP)和晚期(OPN)承诺有关的所测试的基因似乎被上调，其中对于Runx2和OPN有显著差异(p≤0.0001)。观察到所有测试的样品中的BMP2和Col15基因的表达均没有差异，可能是因为BMP2是分化途径的上游调节因子，在动态培养14天后，已经发挥其上调Runx2、Alp和OPN所提出的生物学功能[1]。相反，Col15是与矿化骨基质的产生相关的非常晚期的标志物[2]，并且可能培养时间不足以诱导其表达。在掺杂的或未掺杂的本公开内容的支架的诱导效应之间没有观察到差异(参见图23)。

图23示出了在用所有测试样品在动态条件下培养的mMSCs 3D 14天之后，基因表达相对于用作校准物的未掺杂的现有技术支架的表达的相对定量(2^-ΔΔCt)。指出了三个样品的平均值和标准误差。统计分析通过双因素方差分析(two-way ANOVA)，然后是Bonferroni的事后测试进行，并且在图中指示出显著性差异：****p≤0.0001。

根据以上测试，可能主张的是，相对于现有技术的支架，本公开内容的支架对成骨相关基因的表达示出了较高的诱导能力。

参考文献

[1]Arch Oral Biol.2013年1月；58(1):42-9.doi:10.1016/j.archoralbio.2012.07.010.Epub 2012年8月9日.Leader genes in osteogenesis:atheoretical study.Orlando B,Giacomelli L,Ricci M,Barone A,Covani U.

[2]J Cell Physiol.2012年8月；227(8):3151-61.doi:10.1002/jcp.24001.Extracellular calcium chronically induced human osteoblastseffects:specific modulation of osteocalcin and collagen type XV.Gabusi E,Manferdini C,Grassi F,Piacentini A,Cattini L,Filardo G,Lambertini E,Piva R,Zini N,Facchini A,Lisignoli G。

Claims (63)

1.一种用于生产生物形态的羟基磷灰石支架的工艺，所述生物形态的羟基磷灰石支架具有沿着其中所述生物形态的羟基磷灰石支架的尺寸是最大的方向测量的大于或等于2cm的长度，所述工艺包括以下步骤：

1)热解：将天然木材在惰性气氛下在600℃至1000℃的范围内的温度加热以产生碳模板；

2)渗碳：在900℃至1200℃范围内的温度和<1000毫巴的压力，用呈蒸气状态的钙渗透所述碳模板，以产生碳化钙模板；

3)氧化：在空气中在750℃至1300℃的范围内的温度对所述碳化钙模板(CaC₂)进行加热，以产生氧化钙模板；

4)水合：将所述氧化钙模板暴露于水，从而使水吸收的量为1摩尔％-25摩尔％；

5)碳酸化：通过在500℃至900℃的范围内的温度在从4MPa至20MPa的范围内的压力下加热，将所述氧化钙模板转变为碳酸钙；

6)磷化：用至少一种磷酸盐处理所述碳酸钙模板以产生所述生物形态的羟基磷灰石支架。

2.根据权利要求1所述的工艺，其中，在步骤3)中，所述温度在1000℃-1200℃的范围。

3.根据权利要求1所述的工艺，其中，在步骤4)中，所述水吸收的量为5摩尔％-15摩尔％。

4.根据权利要求1所述的工艺，其中，在步骤5)中，所述温度在750℃至850℃的范围。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的工艺，其中，在步骤1)之后，所述天然木材具有至少20％的总孔隙率。

6.根据权利要求5所述的工艺，其中，在步骤1)之后，所述天然木材具有至少40％的总孔隙率。

7.根据权利要求5所述的工艺，其中，在步骤1)之后，所述天然木材具有包括在60％和95％之间的总孔隙率。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的工艺，其中，在步骤1)中，所述天然木材选自藤木、松木、阿巴西木、轻木、桃花心木、橡木、红木、甘巴豆木和胡桃木。

9.根据权利要求8所述的工艺，其中，在步骤1)中，所述天然木材是藤木。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的工艺，其中在所述热解的步骤1)之前，所述工艺包括选择和制备所述天然木材的步骤i)，其中，将所述天然木材切割成具有沿着其中所述木材的尺寸是最大的方向测量的大于或等于2cm的长度的块。

11.根据权利要求10所述的工艺，其中选择和制备所述天然木材的步骤i)包括以下步骤：提供骨缺损的3D模型，并且基于获得的所述3D模型，赋予所述天然木材与所述骨缺损的形状相对应的形状。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的工艺，其中所述渗碳的步骤2)在反应开始时以在1.10至2.50的范围内的Ca/C摩尔比进行。

13.根据权利要求12所述的工艺，其中所述渗碳的步骤2)在反应开始时以在1.50至2.00的范围内的Ca/C摩尔比进行。

14.根据权利要求1-11中任一项所述的工艺，其中所述渗碳的步骤2)在900℃至1200℃的温度和<1000毫巴的压力进行。

15.根据权利要求14所述的工艺，其中所述渗碳的步骤2)在900℃至1200℃的温度和<600毫巴的压力进行。

16.根据权利要求14所述的工艺，其中所述渗碳的步骤2)在900℃至1200℃的温度和在0.05毫巴至100毫巴的范围内的压力进行。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的工艺，其中在所述水合的步骤4)中，将所述氧化钙模板暴露于水分湿气，从而使水吸收的量包括在1摩尔％-25摩尔％的范围内。

18.根据权利要求17所述的工艺，其中在所述水合的步骤4)中，将所述氧化钙模板暴露于水分湿气，从而使水吸收的量包括在5摩尔％-15摩尔％的范围内。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的工艺，其中所述碳酸化的步骤5)根据以下热循环之一进行：

-在约10MPa的恒定CO₂压力，将温度缓慢升高至在750℃-850℃的范围内的值；

-在750℃-850℃的恒定温度，将压力升高至约10MPa；

-将压力保持在4MPa-6MPa，同时将温度升高至750℃-850℃，并且随后将压力升高至约10MPa。

20.根据权利要求19所述的工艺，其中，所述碳酸化的步骤5)根据以下热循环进行：

在约10MPa的恒定CO₂压力，将温度缓慢升高至约800℃。

21.根据权利要求19所述的工艺，其中，所述碳酸化的步骤5)根据以下热循环进行：

在约800℃的恒定温度，将压力升高至约10MPa。

22.根据权利要求19所述的工艺，其中，所述碳酸化的步骤5)根据以下热循环进行：

将压力保持在4MPa-6MPa，同时将温度升高至约800℃，并且随后将压力升高至约10MPa。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的工艺，其中在所述磷化的步骤6)中，所述至少一种磷酸盐选自由以下组成的组：磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾及其混合物。

24.根据权利要求23所述的工艺，其中在所述磷化的步骤6)中，所述至少一种磷酸盐是磷酸铵。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的工艺，其中在所述磷化的步骤6)中，将所述碳酸钙模板浸入包含至少一种磷酸盐的水基溶液中，所述溶液具有0.1M至5M的磷酸盐浓度。

26.根据权利要求25所述的工艺，其中在所述磷化的步骤6)中，将所述碳酸钙模板浸入包含至少一种磷酸盐的水基溶液中，所述溶液具有0.5M至2.0M的浓度。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的工艺，其中所述磷化的步骤6)中的PO₄ ^3-/CO₃ ^2-的起始比率为理论化学计量值的1.5倍至5倍。

28.根据权利要求27所述的工艺，其中所述磷化的步骤6)中的PO₄ ^3-/CO₃ ^2-的起始比率为理论化学计量值的2倍至4倍。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的工艺，其中所述磷化的步骤6)是在选自包括以下的组的一种或更多种离子的存在下进行：镁、锶、硅、钛、碳酸根、钠、钾、银、镓、铜、铁、锌、锰、铕和钆。

30.一种由根据权利要求1至29中任一项所述的工艺生产的生物形态的羟基磷灰石支架，其中所述生物形态的羟基磷灰石支架由具有至少20％的总孔隙率的木材获得，所述孔隙率是在使所述木材经受热解的步骤之后测量的。

31.根据权利要求30所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中所述木材具有至少40％的总孔隙率。

32.根据权利要求30或31所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中所述木材的所述总孔隙率在60％和95％之间。

33.根据权利要求30或31所述的生物形态的羟基磷灰石支架，具有在纵向方向上测量的大于5MPa的压缩强度。

34.根据权利要求33所述的生物形态的羟基磷灰石支架，具有在纵向方向上测量的在10MPa和40MPa之间的压缩强度。

35.根据权利要求33所述的生物形态的羟基磷灰石支架，具有在纵向方向上测量的在10MPa和20MPa之间的压缩强度。

36.根据权利要求30至35中任一项所述的生物形态的羟基磷灰石支架，具有分层次地组织化的孔结构，所述分层次地组织化的孔结构源自所述木材的分层次地组织化的孔结构，由所述木材获得所述生物形态的羟基磷灰石支架。

37.根据权利要求30至36中任一项所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中所述木材选自藤木、松木、阿巴西木、轻木、桃花心木、橡木、红木、甘巴豆木和胡桃木。

38.根据权利要求37所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中所述木材是藤木。

39.根据权利要求36所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中所述分层次地组织化的孔结构占具有低于150μm的直径的孔隙的所述总孔隙率的30％和80％之间，100％的总孔隙率的剩余部分为具有大于150μm的直径的孔隙。

40.根据权利要求39所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中，当所述木材为藤木时，所述支架的所述总孔隙率的30％和60％之间归因于具有直径≤10μm的孔隙。

41.根据权利要求39所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中，当所述木材为藤木时，所述支架的所述总孔隙率的至少25％归因于具有直径≤1μm的孔隙。

42.根据权利要求41所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中，当所述木材为藤木时，所述支架的所述总孔隙率的至少25％归因于具有直径≤0.1μm的孔隙。

43.根据权利要求41所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中，当所述木材为藤木时，所述支架的所述总孔隙率的至少25％归因于具有直径在0.01μm和0.1μm之间的孔隙。

44.根据权利要求41所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中，当所述木材为藤木时，所述支架的所述总孔隙率的25％和50％之间归因于具有直径≤1μm的孔隙。

45.根据权利要求41所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中，当所述木材为藤木时，所述支架的所述总孔隙率的25％和50％之间归因于具有直径≤0.1μm的孔隙。

46.根据权利要求41所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中，当所述木材为藤木时，所述支架的所述总孔隙率的25％和50％之间归因于具有直径在0.01μm和0.1μm之间的孔隙。

47.根据权利要求39所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中，当所述木材为藤木时，所述支架的所述总孔隙率的至少20％归因于具有直径≥150μm的孔隙。

48.根据权利要求39至47中任一项所述的生物形态的羟基磷灰石支架，具有>9m²/g的比表面积(SSA)。

49.根据权利要求39至47中任一项所述的生物形态的羟基磷灰石支架，具有从9m²/g至20m²/g的比表面积(SSA)。

50.根据权利要求30至49中任一项所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中所述羟基磷灰石部分地被选自包括以下的组的一种或更多种离子取代：镁、锶、硅、钛、碳酸根、钠、钾、银、镓、铜、铁、锌、锰、铕和钆。

51.根据权利要求30至50中任一项所述的生物形态的羟基磷灰石支架，用于医学领域。

52.根据权利要求51所述的生物形态的羟基磷灰石支架，用作骨替代物。

53.根据权利要求52所述的生物形态的羟基磷灰石支架，具有与待重建的骨缺损的形状相对应的形状。

54.根据权利要求51-53中任一项所述的生物形态的羟基磷灰石支架，用于骨或骨部分的替代或再生。

55.根据权利要求54所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中所述骨或骨部分是经受机械载荷的骨或骨部分。

56.根据权利要求55所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中所述骨或骨部分是腿部和臂部的长骨。

57.根据权利要求55所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中所述骨或骨部分是胫骨、跖骨、腓骨、股骨、肱骨或桡骨。

58.根据权利要求55所述的生物形态的羟基磷灰石支架，其中所述骨或骨部分是头盖骨部分、脊骨或颌面骨部分。

59.一种骨替代物，包含根据权利要求30至50中任一项所述的生物形态的羟基磷灰石支架。

60.一种由根据权利要求1至29中任一项所述的工艺生产的生物形态的羟基磷灰石支架，其中所述生物形态的羟基磷灰石支架由木材获得。

61.一种由根据权利要求1至29中任一项所述的工艺生产的生物形态的羟基磷灰石，其中所述生物形态的羟基磷灰石由具有在60％和95％之间的总孔隙率的木材获得，所述孔隙率是在使所述木材经受热解的步骤之后测量的，所述羟基磷灰石的特征在于分层次地组织化的孔结构和沿着纵向方向测量的大于5MPa的压缩强度。

62.根据权利要求61所述的生物形态的羟基磷灰石，其中，所述羟基磷灰石的特征在于分层次地组织化的孔结构和沿着纵向方向测量的在10MPa和20MPa之间的压缩强度。

63.一种骨替代物，包含根据权利要求60所述的生物形态的羟基磷灰石支架。

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