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KR102700499B1 - 만능성 줄기 세포의 현탁 배양 - Google Patents

만능성 줄기 세포의 현탁 배양 Download PDF

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KR102700499B1
KR102700499B1 KR1020237011455A KR20237011455A KR102700499B1 KR 102700499 B1 KR102700499 B1 KR 102700499B1 KR 1020237011455 A KR1020237011455 A KR 1020237011455A KR 20237011455 A KR20237011455 A KR 20237011455A KR 102700499 B1 KR102700499 B1 KR 102700499B1
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Abstract

본 발명은 현탁 클러스터링(suspension clustering)을 사용하여 만능성 세포를 베타 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 pH, 세포 농도, 및 레티노이드 농도 중 하나 이상의 제어를 사용하여, 조기 NGN3 발현을 억제하고 NKX6.1 발현을 촉진함으로써 PDX1/NKX6.1 동시발현 세포들의 거의 균질한 집단을 생성한다. 또한, PDX1/NKX6.1 동시발현 세포들의 거의 균질한 집단은 시험관내에서 추가로 분화되어, PDX1, NKX6.1, 인슐린 및 MAFA를 동시발현하는 췌장 내분비 세포들의 집단을 형성할 수 있다.

Description

만능성 줄기 세포의 현탁 배양{SUSPENSION CULTURING OF PLURIPOTENT STEM CELLS}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2014년 12월 19일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/094,509호의 이익을 주장하며, 이는 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 만능성(pluripotent) 세포의 췌장 내분비 선조 세포(progenitor cell) 및 췌장 내분비 세포로의 분화에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 분화 과정에서 pH, 세포 농도 및 레티노이드 농도의 제어를 이용하여, NKX6.1 및 PDX1 동시발현 췌장 내분비 선조 세포들의 균질한 집단의 생성을 촉진하는 방법에 관한 것이며, 상기 NKX6.1 및 PDX1 동시발현 췌장 내분비 선조 세포들의 균질한 집단은 시험관내(in vitro)에서 추가로 분화될 때, 종래의 분화 방법과 비교하여, PDX1, NKX6.1, 인슐린 및 MAFA를 동시발현하는 췌장 내분비 세포들의 더 성숙한 집단을 생성한다.
제I형 진성 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 요법에서의 진전은 생착(engraftment)에 적절한 인슐린-생성 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되어 왔다. 한 가지 접근법은 배아 줄기 세포와 같은 만능성 줄기 세포로부터의 기능성 β 세포의 생성이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능성 세포는 낭배형성(gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 갑상선, 흉선, 췌장, 장, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽(definitive endoderm)의 형성이다.
낭배형성 마지막까지, 내배엽은 내배엽의 전방, 중간 및 후방 영역을 독특하게 표시하는 인자들의 패널의 발현에 의해 인식될 수 있는 전방-후방 도메인(anterior-posterior domain)으로 나누어진다. 예를 들어, HHEX, 및 SOX2는 전방 영역을 확인해주며, 한편 CDX1, 2, 및 4는 내배엽의 후방 영역을 확인해준다.
내배엽 조직의 이주에 의해 내배엽은 상이한 중배엽 조직들과 아주 근접해지게 되며, 이는 장관(gut tube)의 국지화를 돕는다. 이는 다수의 분비된 인자들, 예컨대 섬유아세포 성장 인자("FGF"), 윙리스 유형 MMTV 통합 부위(wingless type MMTV integration site, "WNTS"), 형질전환 성장 인자 베타("TGF-β"), 레틴산("RA"), 및 골 형성 단백질("BMP") 리간드 및 이들의 길항제에 의해 달성된다. 예를 들어, FGF4 및 BMP는 추정 후장 내배엽에서 CDX2 발현을 촉진하며 전방 유전자 HHEX 및 SOX2의 발현을 억제하는 것으로 보고되어 있다(문헌[2000 Development, 127:1563-1567]). 또한, WNT 신호전달(signaling)은 후장 발달을 촉진하고 전장 운명을 억제하도록 FGF 신호전달과 병행하여 작동하는 것으로 밝혀져 있다(문헌[2007 Development, 134:2207-2217]). 마지막으로, 중간엽에 의해 분비된 레틴산은 전장-후장 경계부를 조절한다(문헌[2002 Curr Biol, 12:1215―1220]).
특정 전사 인자들의 발현 수준은 조직의 정체(identity)를 지정하는 데 사용될 수 있다. 완성 내배엽이 원시 장관(primitive gut tube)으로 형질전환하는 동안, 장관은 제한된 유전자 발현 패턴에 의해 분자 수준에서 관찰될 수 있는 폭넓은 도메인들로 국지화되게 된다. 예를 들어, 장관 내의 국지화된 췌장 도메인은 PDX1의 매우 높은 발현 및 CDX2 및 SOX2의 매우 낮은 발현을 나타낸다. PDX1, NKX6.1, 췌장 전사 인자 1 하위단위 알파("PTF1A"), 및 NKX2.2는 췌장 조직에서 고도로 발현되며; CDX2의 발현은 장 조직에서 높다.
췌장의 형성은 완성 내배엽에서 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 배측(dorsal) 및 복측(ventral) 췌장 도메인은 전장 상피에서 생긴다. 또한, 전장은 식도, 기관, 폐, 갑상선, 위, 간, 췌장 및 담관계를 생기게 한다.
췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자 PDX1을 발현한다. PDX1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 및 배측 원기(bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, PDX1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 표시한다. 성숙한 췌장은 췌장 내배엽의 분화로부터 생기는 외분비 조직 및 내분비 조직 둘 모두를 함유한다.
드아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈 및 저 혈청의 존재 하에서의 인간 배아 줄기 세포 유래 완성 내배엽의 풍부화된(enriched) 배양물의 생성을 기술하고 있다(문헌[Nature Biotechnol 2005, 23:1534-1541]; 미국 특허 제7,704,738호). 보고된 바에 의하면, 마우스의 신장 피막 아래에 이들 세포를 이식함으로써 내배엽 조직의 특징을 갖는 더 성숙한 세포로 분화되었다고 한다(미국 특허 제7,704,738호). 인간 배아 줄기 세포 유래 완성 내배엽 세포는 FGF10 및 레티노산의 첨가 후에 PDX1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다(미국 특허 출원 공개 제2005/0266554A1호). 후속하여, 면역 결핍 마우스의 지방 패드 내에 이들 췌장 전구 세포(precursor cell)를 이식함으로써 3 내지 4개월의 성숙기 후에 기능적 췌장 내분비 세포의 형성을 가져왔다(미국 특허 제7,993,920호 및 미국 특허 제7,534,608호).
피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터의 췌장 소도 세포의 생성 시스템을 보고한다(미국 특허 제7,033,831호). 또한, 소분자 억제제가 췌장 내분비 전구 세포의 유도에 사용되어 왔다. 예를 들어, TGF-β 수용체 및 BMP 수용체(문헌[Development 2011, 138:861-871]; 문헌[Diabetes 2011, 60:239-247])의 소분자 억제제가 췌장 내분비 세포의 수를 유의하게 향상시키는 데 사용되어 왔다. 게다가, 소분자 활성화제가 완성 내배엽 세포 또는 췌장 전구 세포를 생성하는 데 또한 사용되어 왔다(문헌[Curr Opin Cell Biol 2009, 21:727-732]; 문헌[Nature Chem Biol 2009, 5:258-265]).
만능성 줄기 세포와 같은 선조 세포를 배양하기 위한 프로토콜을 개선하는 데에 있어서 큰 진전이 이루어져 왔다. 국제 특허 출원 공개 WO2007/026353호(아미트(Amit) 등)는 2차원 배양 시스템 내에서 미분화된 상태로 인간 배아 줄기 세포를 유지하는 것을 개시하고 있다. 문헌[루드비히(Ludwig) 등, 2006 (Nature Biotechnology, 24:185-7)]은 매트릭스 상에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하기 위한 TeSR1 한정된 배지를 개시하고 있다. 미국 특허 출원 공개 제2007/0155013호(아카이케(Akaike) 등)는 만능성 줄기 세포에 부착하는 캐리어를 사용하여 현탁 상태로 만능성 줄기 세포를 성장시키는 방법을 개시하고 있으며, 미국 특허 출원 공개 제2009/0029462호(버드슬레이(Beardsley) 등)는 마이크로캐리어 또는 세포 캡슐화를 사용하여 현탁 상태로 만능성 줄기 세포를 증폭(expand)시키는 방법을 개시하고 있다. 미국 특허 출원 공개 WO 2008/015682호(아미트 등)는 기질 부착성이 없는 배양 조건 하에서 현탁 배양물 중에서 인간 배아 줄기 세포를 증폭 및 유지하는 방법을 개시하고 있다. 미국 특허 출원 공개 제2008/0159994호(만탈라리스(Mantalaris) 등)는 3차원 배양 시스템 내에서 알기네이트 비드(bead) 내에 캡슐화된 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시하고 있다.
문헌[Rezania et. al. (Nature Biotechnology, 32:1121-1133 (2014))], 문헌[Pagliuca et al (Cell, 159: 428-439 (2014))] 및 미국 특허 제8,859,286호(아굴닉(Agulnick))를 포함하여 당업계는 BMP 결합제, 예를 들어 노긴(Noggin), 또는 BMP 수용체 억제제, 예컨대 (6-(4-(2-(피페리딘-1-일)에톡시)페닐)-3-(피리딘-4-일)피라졸로[1,5-a]피리미딘, 하이드로클로라이드와 같은 성분을 사용함으로써 BMP를 직접적으로 차단함을 통해, 또는 대안적으로 TGF-β 패밀리 구성원을 첨가하여 이러한 수용체를 점유하고 BMP 신호전달을 간접적으로 차단함을 통해 TGF-β 또는 BMP 신호전달을 조절하기 위한 성분의 첨가에 대한 필요성을 교시한다. 마지막으로, 3기에서의 소닉 헤지호그(sonic hedgehog) 억제제, 예컨대 SANT-1 또는 사이클로파민의 사용이 유리한 것으로 교시되어 있는데, 이는 소닉 헤지호그 신호전달의 억제가 PDX1 및 인슐린 발현을 허용할 수 있기 때문이다(문헌[Hebrok et al, Genes & Development, 12:1705-1713 (1998)]).
이러한 진전에도 불구하고, 기능적 내분비 세포로 분화될 수 있는 만능성 줄기 세포를 3차원 배양 시스템 내에서 배양하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
도 1a는 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸쳐 시간(분화 일수)의 함수로서 도표로 나타낸 일일 배양 배지 샘플로부터의 부분 산소 압력의 그래프이다.
도 1b는 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸쳐 시간(분화 일수)의 함수로서 도표로 나타낸 일일 배양 배지 샘플로부터의 글루코스 수준의 그래프이다.
도 1c는 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸쳐 시간(분화 일수)의 함수로서 도표로 나타낸 일일 배양 배지 샘플로부터의 락테이트 수준의 그래프이다.
도 1d는 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸쳐 시간(분화 일수)의 함수로서 도표로 나타낸 일일 배양 배지 샘플로부터의 pH 수준의 그래프이다.
도 2a는 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PDX1의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 2b는 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX6.1의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 2c는 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PAX4의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 2d는 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PAX6의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 2e는 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROG3(NGN3)의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 2f는 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ABCC8의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 2g는 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 A(CHGA)의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 2h는 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 G6PC2의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 2i는 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 IAPP의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 2j는 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 인슐린의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 2k는 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 GC6의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 2l은 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PTF1A의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 2m은 1기부터 5기 1일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROD1의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3a는 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PDX1의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3b는 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX6.1의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3c는 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PAX6의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3d는 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROD1의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3e는 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROG3(NGN3)의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3f는 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 SLC2A1의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3g는 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PAX4의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3h는 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PCSK2의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3i는 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 A(CHGA)의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3j는 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 B(CHGB)의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3k는 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 췌장 폴리펩티드의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3l은 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PCSK1의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3m은 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 G6PC2의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3n은 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 글루카곤의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 3o는 5기 3일째부터 6기 7일째까지의 실시예 1의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 인슐린의 발현에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 4는, 실시예 1의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 1기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: CD9(X축)와 동시염색된 CD184/CXCR4(Y축); 및 CD99(X축)와 동시염색된 CD184/CXCR4(Y축).
도 5a는, 실시예 1의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 4기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: NKX6.1(Y축)과 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); 및 Ki67(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축).
도 5b는, 실시예 1의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 4기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: NKX2.2(Y축)와 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); 및 APC-A(Y축)와 동시염색된 NEUROD1(X축).
도 6a는, 실시예 1, 조건 A의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 5기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: NKX6.1(Y축)과 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); NKX.2(Y축)와 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 C-펩티드(X축); 및 글루카곤(Y축)과 동시염색된 인슐린(X축).
도 6b는, 실시예 1, 조건 A의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 5기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: Ki67(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축); OCT4(Y축)와 동시염색된 PAX6(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 NEUROD1(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 인슐린(X축); 및 NKX6.1(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축).
도 7a는, 실시예 1, 조건 B의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 5기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: NKX6.1(Y축)과 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); NKX2.2(Y축)와 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 C-펩티드(X축); 및 글루카곤(Y축)과 동시염색된 인슐린(X축).
도 7b는, 실시예 1, 조건 B의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 5기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: Ki67(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축); OCT4(Y축)와 동시염색된 PAX6(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 NEUROD1(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 인슐린(X축); 및 NKX6.1(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축).
도 8a는, 실시예 1, 조건 C의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 5기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: NKX6.1(Y축)과 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); NKX2.2(Y축)와 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 C-펩티드(X축); 및 글루카곤(Y축)과 동시염색된 인슐린(X축).
도 8b는, 실시예 1, 조건 C의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 5기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: Ki67(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축); OCT4(Y축)와 동시염색된 PAX6(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 NEUROD1(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 인슐린(X축); 및 NKX6.1(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축).
도 9a는, 실시예 1, 조건 A의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 6기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: NKX6.1(Y축)과 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); NKX2.2(Y축)와 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); 글루카곤(Y축)과 동시염색된 인슐린(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 C-펩티드(X축); 및 인슐린(Y축)과 동시염색된 C-펩티드(X축).
도 9b는, 실시예 1, 조건 A의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 6기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: Ki67(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축); OCT4(Y축)와 동시염색된 PAX6(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 NEUROD1(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 인슐린(X축); 및 NKX6.1(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축).
도 10a는, 실시예 1, 조건 B의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 6기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: NKX6.1(Y축)과 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); NKX.2(Y축)와 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); 글루카곤(Y축)과 동시염색된 인슐린(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 C-펩티드(X축); 및 인슐린(Y축)과 동시염색된 C-펩티드(X축).
도 10b는, 실시예 1, 조건 B의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 6기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: Ki67(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축); OCT4(Y축)와 동시염색된 PAX6(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 NEUROD1(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 인슐린(X축); 및 NKX6.1(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축).
도 11a는, 실시예 1, 조건 C의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 6기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: NKX6.1(Y축)과 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); NKX.2(Y축)와 동시염색된 크로모그라닌 A(X축); 글루카곤(Y축)과 동시염색된 인슐린(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 C-펩티드(X축); 및 인슐린(Y축)과 동시염색된 C-펩티드(X축).
도 11b는, 실시예 1, 조건 C의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 6기 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: Ki67(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축); OCT4(Y축)와 동시염색된 PAX6(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 NEUROD1(X축); NKX6.1(Y축)과 동시염색된 인슐린(X축); 및 NKX6.1(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축).
도 12는 실시예 1의 프로토콜에 따라 분화된, 4기 세포(15일째), 5기 세포(19일째 및 22일째), 및 6기 세포(25일째 및 29일째)의 MAFA의 발현에 대한 정량적인 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 결과의 그래프이다.
도 13은 6기 세포의 7일째에서의 MAFA의 발현의 현미경 사진이다.
도 14는 실시예 2의 3기부터 4기까지 동안의 pH, 용존 산소, 및 세포 농도에 대한 설정점의 흐름도이다.
도 15a는 실시예 2에 따라 수행된 분화에 대하여 3기의 개시부터 4기 3일째까지의 pH의 연속 모니터링 동안의 pH 수준을 보여주는 2개의 그래프를 나타낸다.
도 15b는 실시예 2에 따라 수행된 분화에 대하여 3기의 개시부터 4기 3일째까지의 DO의 연속 모니터링 동안의 용존 산소 수준을 보여주는 2개의 그래프를 나타낸다.
도 16a는 실시예 2에 따라 수행된 분화에 대하여 3기의 개시부터 4기 3일째까지 시간의 함수로서 도표로 나타낸 일일 배양 배지 샘플로부터의 글루코스 수준의 그래프이다.
도 16b는 실시예 2에 따라 수행된 분화에 대하여 3기의 개시부터 4기 3일째까지 시간의 함수로서 도표로 나타낸 일일 배양 배지 샘플로부터의 락테이트 수준의 그래프이다.
도 17은 실시예 2에 따라 수행된 분화에 대하여 3기의 개시부터 4기 3일째까지 시간의 함수로서 도표로 나타낸 일일 배양 배지 샘플로부터의 세포 카운트의 그래프이다.
도 18a는 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PDX1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18b는 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX6.1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18c는 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PAX4의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18d는 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PAX6의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18e는 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROG3(NGN3)의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18f는 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ABCC8의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18g는 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 A의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18h는 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 B의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18i는 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ARX의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18j는 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 그렐린의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18k는 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 IAPP의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18l은 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PTF1A의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18m은 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROD1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 18n은 3기 1일째부터 4기 2일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX2.2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 19는, 3기에서의 pH 설정점이 7.0 및 7.4인 실시예 2의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 3기 세포의 FACS 프로파일의 그래프를 나타낸다: NEUROD1(X축)과 동시염색된 NKX6.1(Y축).
도 20은, 3기에서의 pH 설정점이 7.0 및 7.4인 실시예 2의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 4기 세포의 FACS 프로파일의 그래프를 나타낸다: NEUROD1(X축)과 동시염색된 NKX6.1(Y축).
도 21a는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROG3의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21b는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROD1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21c는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX2.2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21d는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ARX의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21e는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 A의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21f는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PCSK2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21g는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ABCC8의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21h는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 G6PC2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21i는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 인슐린의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21j는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ISL1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21k는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 SLC2A1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21l은 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 SLC30A8의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21m은 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX6.1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21n은 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 UCN3의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21o는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 MAFA의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21p는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PPY의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21q는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 그렐린의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21r은 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 GCG의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 21s는 4기 2일째부터 5기 7일째까지의 실시예 2의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 SST의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 22는 6기 7일째 세포에서의 인슐린 및 MAFA의 발현의 현미경 사진을 나타낸다.
도 23은, 실시예 2의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 5기 6일째 세포의 FACS 프로파일의 그래프를 나타낸다: NEUROD1(Y축)과 동시염색된 NKX6.1(X축), 세포 카운트(Y축)의 함수로서의 NKX6.1(X축), 및 세포 카운트(Y축)의 함수로서의 NEUROD1(X축). 상단 그래프는 조건 A에 관한 것이고, 하단 그래프는 조건 C에 관한 것이다.
도 24a는 실시예 3에 따라 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서 수행된 분화에 대하여 3기의 개시부터 5기까지의 pH의 연속 모니터링 동안의 pH 수준의 그래프를 나타낸다.
도 24b는 실시예 3에 따라 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서 수행된 분화에 대하여 3기의 개시부터 5기까지의 DO의 연속 모니터링 동안의 용존 산소 수준을 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 25는 실시예 3에 따라 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서 수행된 분화에 대하여 3기의 개시부터 5기까지 시간의 함수로서 도표로 나타낸 일일 배양 배지 샘플로부터의 세포 카운트의 그래프이다.
도 26a는 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PDX1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26b는 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX6.1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26c는 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PAX4의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26d는 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PAX6의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26e는 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROG3의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26f는 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ABCC8의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26g는 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 A의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26h는 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 B의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26i는 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ARX의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26j는 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 그렐린의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26k는 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 IAPP의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26l은 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PFT1A의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26m은 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROD1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 26n은 3기 1일째부터 5기 1일째까지의 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 실시예 3의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX2.2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27a는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROG3의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27b는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROD1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27c는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 A의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27d는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 B의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27e는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 GCG의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27f는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 IAPP의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27g는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ISL1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27h는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 MAFB의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27i는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 췌장 폴리펩티드의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27j는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 소마토스타틴의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27k는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 인슐린의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27l은 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 G6PC2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27m은 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PCSK1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27n은 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PCSK2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27o는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 SLC30A8의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27p는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX6.1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27q는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX2.2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27r은 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 MNX1(HB9)의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 27s는 5기 1일째부터 6기 7일째까지의 실시예 4의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 UCN3의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28a는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROG3의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28b는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROD1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28c는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX6.1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28d는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 A의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28e는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 B의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28f는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 GCG의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28g는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 IAPP의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28h는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 MAFB의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28i는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PAX6의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28j는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 소마토스타틴의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28k는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 인슐린의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28l은 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 G6PC2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28m은 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PCSK1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28n은 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 SLC30A8의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28o는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 MNX1(HB9)의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 28p는 5기 1일째부터 6기 4일째까지의 실시예 5의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 UCN3의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 29는 NSG 마우스의 신장 피막 아래에 이식된 실시예 5의 6기 1일째 세포의 복막내 글루코스 주사에 대한 C-펩티드 반응의 그래프이다.
도 30a는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ABCC8의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30b는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ALB의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30c는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ARX의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30d는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 CDX2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30e는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 A의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30f는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 크로모그라닌 B의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30g는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 G6PC2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30h는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 GCG의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30i는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 그렐린의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30j는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 IAPP의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30k는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 인슐린의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30l은 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 ISL1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30m은 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 MAFB의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30n은 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 MNX1(HB9)의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30o는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROD1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30p는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NEUROG3의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30q는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX2.2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30r은 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 NKX6.1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30s는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PAX4의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30t는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PAX6의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30u는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PCSK1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30v는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PCSK2의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30w는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PDX1의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30x는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 췌장 폴리펩티드의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30y는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 PTF1A의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30z는 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 SLC30A8의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30aa은 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 SST의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30bb은 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 UCN3의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 30cc은 3기 1일째부터 분화 프로토콜의 종료까지의 실시예 6의 분화 프로토콜의 경과에 걸친 WNT4A의 발현에 대한 실시간 qRT-PCR 결과의 그래프이다.
도 31은 분화의 5기 7일째의 NSG 마우스의 신장 피막 아래에 이식된 실시예 5의 세포(표준(Standard), N = 7, 및 스킵(Skip) 4, N = 7)의 복막내 글루코스 주사에 대한 평균 C-펩티드 반응의 그래프(+/- 표준편차)이다.
도 32는, 실시예 7의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 5기 7일째 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: NEUROD1(Y축)과 동시염색된 NKX6.1(X축).
도 33은, 실시예 7의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 5기 7일째 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: NKX6.1(Y축)과 동시염색된 PDX1(X축).
도 34는, 실시예 7의 프로토콜에 따라 분화되고, 하기에 대해 염색된, 5기 7일째 세포의 FACS 프로파일의 그래프이다: 인슐린(Y축)과 동시염색된 NKX6.1(X축).
도 35는 NSG 마우스(N = 7)의 신장 피막 아래에 이식된 실시예 7의 5기 8일째 세포에 대한, 이식 후 6주째의 복막내 글루코스 주사 전과 후의 C-펩티드 반응의 그래프이다.
도 36은 NSG 마우스(N = 7)의 신장 피막 아래에 이식된 실시예 7의 5기 8일째 세포에 대한, 이식 후 12주째의 복막내 글루코스 주사 전과 후의 C-펩티드 반응의 그래프이다.
도 37a 및 도 37b는 실시예 8의 스피너 플라스크 내의 배지의 pH 프로파일의 그래프이다.
도 38은 실시예 8의 세포의 락테이트 생성의 그래프이다.
도 39는 실시예 8의 세포에 대한 LIVE/DEAD 형광 이미징을 나타낸다.
본 발명은 내분비 선조 세포 및 췌장 내분비 세포로의 분화를 위한 응집된 세포 클러스터에서 만능성을 유지하는 배아 줄기 세포 및 다른 만능성 세포를 제조하는 것에 관한 것이다. 특히 PDX1 및 PDX1/NKX6.1 동시발현 세포가 생성되는 분화 단계 동안, pH, 세포 농도 및 레티노이드 농도 중 하나 이상을 제어함으로써, 조숙(precocious) NGN3 발현을 억제하고 NKX6.1 발현을 촉진함으로써 PDX1/NKX6.1 동시발현 세포의 거의 균질한 집단 - 이는 세포 집단의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상을 의미함 - 을 생성할 수 있다는 것이 본 발명의 발견이다. PDX1/NKX6.1 동시발현 세포들의 거의 균질한 집단이 시험관내에서 추가로 분화될 때, 그것은 성숙되어 PDX1, NKX6.1, 인슐린 및 MAFA를 동시발현하는 췌장 내분비 세포들의 집단을 형성한다.
하나 이상의 분화 단계 동안 pH 7.4의 항상성 수준 내지 약 7.2 이하의 수준보다 낮은, 바람직하게는 약 7.2 내지 약 7.0, 더 바람직하게는 약 7.0의 pH를 사용하면서, 또한 mL당 세포수가 약 150만개 이상 내지 약 300만개, 바람직하게는 mL당 세포수가 약 180만개 내지 약 300만개, 더 바람직하게는 mL당 세포수가 약 200만개 내지 약 300만개인 세포 밀도를 사용함으로써, TGF-β 또는 BMP 신호전달을 억제, 차단, 활성화 또는 효능화(agonize)하는 성분의 첨가 및 소닉 헤지호그 억제제의 사용에 대한 필요성을 없앨 수 있다는 것이 본 발명의 추가의 발견이다.
본 발명의 방법에서, 전장 내배엽 세포는 PTF1A 또는 NGN3의 발현이 부재하는 췌장 내배엽 세포로 분화될 수 있다. 약 7.2 내지 약 7.0 이하를 의미하는 낮은 pH의 사용은 NGN3의 발현을 차단하는 것으로 여겨진다. PTF1A 또는 NGN3 음성 세포는 후속 단계에서, (96% 이상 양성인) 고수준의 PDX1 및 NKX6.1을 갖고 약간의 PTF1A를 발현하지만 여전히 NGN3 발현을 갖지 않는 췌장 내배엽 세포 집단으로 추가로 풍부화될 수 있다. 세포는 PTF1A 또는 NGN3의 발현이 부재하는 췌장 내배엽 단계로부터, 췌장 내분비 전구 세포가, 높은 NGN3 발현과 함께, 종료까지 췌장 내분비 세포로 이행하는 단계로 직접 이동될 수 있다. 더욱이, PTF1A 또는 NGN3n 세포의 발현이 부재하는 췌장 내배엽 세포가, 췌장 내분비 세포가 형성되는 이 단계로 이동되자마자, 세포는 MAFA의 발현(PCR에 의함)을 나타내기 시작하고, 이 발현은 이 단계의 종료까지 단백질로서 검출가능하다.
본 발명에 유용한 줄기 세포는 단일 세포 수준에서 그의 자기-재생 및 분화 능력 둘 모두에 의해 규정되는 미분화된 세포이다. 줄기 세포는 자기-재생 선조체, 비재생 선조체, 및 최종 분화된 세포를 포함하는 자손 세포를 생성할 수 있다. 줄기 세포는 또한 시험관내에서 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능적 세포로 분화하는 그의 능력을 특징으로 한다. 또한, 줄기 세포는 이식 후에 다수의 배엽층의 조직을 생기게 하며, 배반포 내로의 주입 이후, 비록 전부는 아니더라도, 사실상 대부분의 조직에 기여한다.
줄기 세포는 그의 발생능(developmental potential)에 따라 분류된다. "세포 배양물" 또는 "배양"은 일반적으로 살아있는 유기체로부터 취해져서 제어된 조건 하에서 성장된 ("배양 중" 또는 "배양된") 세포를 지칭한다. "1차 세포 배양물"은 첫 번째 계대배양(subculture) 전에 유기체로부터 직접 취해진 세포, 조직, 또는 기관의 배양물이다. 세포는 세포 성장 및 분열 중 하나 또는 둘 모두를 촉진하는 조건 하에서 성장 배지 중에 놓여질 때, 배양 중 증폭되어 더 큰 세포 집단을 생성한다. 세포가 배양 중 증폭되는 경우, 세포 증폭의 속도는 때때로, 세포의 수가 2배가 되는 데 필요한 시간의 양("배가 시간(doubling time)"으로 지칭됨)으로 측정된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "증폭"은, 배양에 의해 만능성 줄기 세포의 수를, 예를 들어 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 75%, 90%, 100%, 200%, 500%, 1000% 또는 그 이상, 및 이들 백분율 이내의 수준으로 증가시키는 과정이다. 단일의 만능성 줄기 세포로부터 얻어질 수 있는 만능성 줄기 세포의 수는 만능성 줄기 세포의 증식 능력에 의존하는 것으로 이해된다. 만능성 줄기 세포의 증식 능력은 세포의 배가 시간, 즉, 세포가 배양물 중에서 유사분열을 거치는 데 필요한 시간, 및 만능성 줄기 세포가 미분화된 상태로 유지될 수 있는 기간 - 이는 계대배양의 횟수에 각각의 계대배양 사이의 일수를 곱한 값에 상당함 - 에 의해 계산될 수 있다.
분화는 특화되지 않은("미수임된(uncommitted)") 또는 덜 특화된 세포가 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 세포 또는 분화-유도된 세포는 세포 계통 내에서 더 특화된(수임된("committed")) 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "수임된"은 분화 경로에서, 정상 환경 하에 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 계속 분화될 것이며, 정상 환경 하에 상이한 세포 유형으로 분화될 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행된 세포를 지칭한다. "탈분화(de-differenciation)"는 세포가 세포의 계열 내의 덜 특화된(또는 수임된) 위치로 되돌아가는 과정을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉, 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포를 생기게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 그 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 관심 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미수임 세포가 관심 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심 세포에서 차별적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차별적 발현(differential expression)은 미분화된 세포에 비하여 양성 마커에 대한 증가된 수준 및 음성 마커에 대한 감소된 수준을 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 수준은 다른 세포에 비하여 관심 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아서, 관심 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 특정 마커가 세포에서 충분히 검출될 때, 그 세포는 그 특정 마커에 "대하여 양성"이거나 그 세포는 "양성"이다. 유사하게, 특정 마커가 세포에서 충분히 검출되지 않을 때, 그 세포는 그 특정 마커에 "대하여 음성"이거나 그 세포는 "음성"이다. 특히, FACS에 의한 양성은 통상 2% 초과인 반면, FACS에 의한 음성 역치(threshold)는 통상 1% 미만이다. OpenArray® PCR 시스템을 사용하는 경우, PCR에 의한 양성은 통상 30회 미만의 주기(Ct)이고, 음성은 통상 30회 이상의 주기이다. TaqMan® PCR 검정을 사용하는 경우, PCR에 의한 양성은 통상 34회 미만의 주기(Ct)이고, PCR에 의한 음성은 통상 34.5회 초과의 주기이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "세포 밀도" 및 "시딩 밀도(seeding density)"는 상호교환가능하게 사용되며, 고체 또는 반고체 평면 또는 곡면 기질의 단위 면적당 시딩된 세포의 수를 지칭한다.
"세포 농도"는 주어진 단위 부피당 세포의 수를 지칭하기 위해 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "현탁 배양물"은 표면에 부착되기보다는 오히려 배지 중에 현탁된 세포, 단일 세포, 클러스터, 또는 단일 세포와 클러스터의 혼합물의 배양물을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "무혈청(serum free)"은 인간 또는 동물 혈청이 없음을 지칭한다. 따라서, 무혈청 배양 배지는 혈청 또는 혈청의 일부분을 포함하지 않는다.
세포 배양물 중에서 만능성 줄기 세포의 기능적 췌장 내분비 세포로의 분화를 반복 수행하기 위한 시도에서, 분화 과정은 종종 다수의 연속 단계를 통해 처리되는 것으로 여겨진다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 다양한 단계들은 본 명세서에 포함된 실시예에 기재된 배양 시간, 및 시약에 의해 규정된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽"은, 낭배형성 동안 상배엽(epiblast)으로부터 생기는 세포의 특징을 보유하고 위장관 및 그의 파생물을 형성하는 세포를 지칭한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현한다: FOXA2(간세포 핵 인자 3-β(HNF3β)로도 알려짐), GATA4, GATA6, MNX1, SOX17, CXCR4, 세르베루스(Cerberus), OTX2, 단미증(brachyury), 구스코이드(goosecoid), C-Kit, CD99, 및 MIXL1. 완성 내배엽 세포에 특징적인 마커는 CXCR4, FOXA2 및 SOX17을 포함한다. 따라서, 완성 내배엽 세포는 그의 CXCR4, FOXA2, 및 SOX17 발현을 특징으로 할 수 있다. 게다가, 세포가 분화의 제1기에서 유지되게 하는 시간의 길이에 따라, HNF4α의 증가가 관찰될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전장 내배엽 세포"는 식도, 폐, 위, 간, 췌장, 담낭, 및 십이지장의 일부가 생기게 하는 내배엽 세포를 지칭한다. 전장 내배엽 세포는 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현한다: PDX1, FOXA2, CDX2, SOX2, 및 HNF4α. 전장 내배엽 세포는 장관 세포에 비하여 PDX1의 발현 증가를 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 전장 전구 세포"는 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 지칭한다: PDX1, NKX6.1, HNF6, NGN3, SOX9, PAX4, PAX6, ISL1, 가스트린(gastrin), FOXA2, PTF1A, PROX1 및 HNF4α. 췌장 전장 전구 세포는 PDX1, NKX6.1, 및 SOX9의 발현에 대해 양성인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 세포"는 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 지칭한다: PDX1, NKX6.1, HNF1β, PTF1A, HNF6, HNF4α, SOX9, NGN3; 가스트린; HB9, 또는 PROX1. 췌장 내배엽 세포는 그의 사실상의 CDX2 또는 SOX2 발현의 결여를 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 전구 세포"는 췌장 호르몬 발현 세포가 될 수 있는 췌장 내배엽 세포를 지칭한다. 췌장 내분비 전구 세포는 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현한다: NGN3; NKX2.2; NeuroD1; ISL1; PAX4; PAX6; 또는 ARX. 췌장 내분비 전구 세포는 그의 NKX2.2 및 NEUROD1 발현을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 세포"는 하기 호르몬들 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 지칭한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 그렐린, 및 췌장 폴리펩티드. 이들 호르몬 외에, 췌장 내분비 세포에 특징적인 마커는 NGN3, NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2, 및 PAX6 중 하나 이상을 포함한다. β 세포에 특징적인 마커를 발현하는 췌장 내분비 세포는 인슐린 및 하기 전사 인자들 중 적어도 하나의 발현을 특징으로 할 수 있다: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD1, ISL1, HNF3β, MAFA, PAX4, 및 PAX6.
"레티노이드"는 레틴산을 의미하거나 레틴산 수용체 효능제(retinoic receptor agonist)인 화합물을 의미한다.
"d1", "d 1", 및 "1일째"; "d2", "d 2", 및 "2일째"; "d3", "d 3", 및 "3일째" 등은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 이들 숫자 문자 조합은 본 출원의 단계적 분화 프로토콜 중의 상이한 단계에서의 인큐베이션의 특정 일을 지칭한다.
"글루코스" 및 "D-글루코스"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 천연 상태에서 일반적으로 발견되는 당인 덱스트로스를 지칭한다.
만능성 줄기 세포는 지정된 TRA-1-60 및 TRA-1-81 항체들 중 하나 이상을 발현할 수 있다(문헌[Thomson et al. 1998, Science 282:1145-1147]). 시험관내에서의 만능성 줄기 세포의 분화는 TRA-1-60, 및 TRA-1-81 발현의 손실로 이어진다. 미분화된 만능성 줄기 세포는 전형적으로 알칼리성 포스파타제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고, 이어서 기질로서 Vector® 레드(Red)를 사용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있는데, 이는 제조사(Vector Laboratories, Inc., 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재)에 의해 기재된 바와 같다. 미분화된 만능성 줄기 세포는 또한 RT-PCR에 의해 검출될 때, 전형적으로 OCT4 및 TERT를 발현한다.
증식된 만능성 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 3개의 모든 배엽층, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직의 세포로 분화될 잠재력이다. 줄기 세포의 만능성은, 예를 들어 중증 복합형 면역결핍증("SCID") 마우스 내로 세포를 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 고정시키고, 이어서 이들 3개의 배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 조직학적으로 검사함으로써 확인될 수 있다. 대안적으로, 만능성은 배양체(embryoid body)를 생성하여 3개의 배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
증식된 만능성 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 바람직한데, 이때 정상 핵형이란, 세포가, 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다. 만능성 세포는 다양한 영양세포 층(feeder layer)을 사용하여 또는 매트릭스 단백질 코팅된 용기를 사용함으로써 배양 중 용이하게 증폭될 수 있다. 대안적으로, 세포의 일상적 증폭을 위해, mTeSR®1 배지(Stem Cell Technologies, 캐나다 브리티시컬럼비아주 밴쿠버 소재)와 같은 한정 배지와 조합하여 화학적으로 한정된 표면이 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시 형태의 방법에 따른 현탁 배양물 중에서의 배양은 세포 생존 및 증식은 촉진하지만 분화는 제한하는 세포 농도로 만능성 줄기 세포를 배양 용기 내에 시딩함으로써 달성된다. 전형적으로, 만능성의 미분화된 상태로 세포를 유지하기에 충분한 시딩 밀도가 사용된다. 줄기 세포의 단일-세포 현탁액이 시딩될 수 있지만, 세포의 작은 클러스터가 유리할 수 있음이 이해될 것이다.
현탁 배양물 중에 있는 동안에 만능성 줄기 세포에 영양물 및 성장 인자의 충분하고 지속적인 공급을 제공하기 위하여, 배양 배지가 매 1일 내지 5일과 같은 소정의 스케줄로 또는 일일 기준으로 교체 또는 보충될 수 있다. 만능성 줄기 세포의 큰 클러스터는 세포 분화를 야기할 수 있으며, 이에 따라 조치를 취하여 큰 만능성 줄기 세포 응집체를 피할 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태에 따르면, 형성된 만능성 줄기 세포 클러스터는, 예를 들어 매 2 내지 7일마다 해체되고, 단일 세포 또는 작은 세포 군집은 추가의 배양 용기 내로 분할되거나(즉, 계대배양되거나) 동일한 배양 용기 내에 유지되고 대체 또는 추가 배양 배지로 처리된다.
원심분리로부터 얻어진 만능성 줄기 세포의 펠릿을 포함하는 큰 만능성 줄기 세포 군집은 효소적 분해 및 기계적 해체 중 하나 또는 둘 모두를 거칠 수 있다. 만능성 줄기 세포 군집의 효소적 분해는 이 군집을 제IV형 콜라게나제, Dispase® 또는 Accutase®와 같은 효소에 노출시킴으로써 수행될 수 있다. 큰 만능성 줄기 세포 군집의 기계적 해체는 이 군집을 소정의 크기로 부수도록 설계된 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 니들(needle) 또는 피펫을 사용하여 기계적 해체가 수동으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일부 실시 형태의 방법에 따라서 현탁 상태로 만능성 줄기 세포를 배양하는 데 사용된 배양 용기는, 내부에서 배양된 만능성 줄기 세포가 부착하거나 접착할 수 없도록 설계된 내부 표면을 갖는 (예를 들어, 만능성 줄기 세포를 배양하는 데 적합한 순도 등급을 가진) 임의의 조직 배양 용기(예를 들어, 그 표면에 대한 접착 또는 부착을 방지하기 위하여, 비조직 배양물 처리된 용기)일 수 있다. 바람직하게는 스케일 조정가능한(scalable) 배양물을 얻기 위하여, 본 발명의 일부 실시 형태에 따른 배양은 제어된 배양 시스템(바람직하게는 컴퓨터로 제어되는 배양 시스템)을 사용하여 달성되는데, 여기서는 적합한 장치를 사용하여 온도, 교반, pH, 및 산소와 같은 배양 파라미터가 자동적으로 모니터링되고 제어된다. 일단 원하는 배양 파라미터가 결정되면, 만능성 줄기 세포 증폭 및 분화를 향상시키기 위해 필요에 따라 배양 파라미터의 자동 조절을 위해 시스템을 설정할 수 있다.
만능성 줄기 세포는 동적 조건 하에서(즉, 만능성 줄기 세포가 현탁 배양물 중에, 예를 들어 교반 현탁 배양 시스템 내에 있는 동안에 일정하게 움직이는 조건 하에서) 또는 비동적 조건(즉, 정치 배양) 하에서, 다회의 계대배양에 걸쳐 이들의 증식성, 만능성 능력 및 핵형 안정성을 보존하면서 배양될 수 있다.
만능성 줄기 세포의 비동적 배양의 경우, 만능성 줄기 세포는 코팅되거나 코팅되지 않은 페트리 디시, T-플라스크, HyperFlask®(Corning Incorporated, 미국 뉴욕주 코닝 소재), CellStack®(Corning Incorporated, 미국 뉴욕주 코닝 소재) 또는 Cell Factory(NUNC™ Cell Factory™ 시스템(Thermo Fisher Scientific, Inc., 미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재)) 중에서 배양될 수 있다. 만능성 줄기 세포의 동적 배양을 위해, 만능성 줄기 세포는 스피너 플라스크 또는 삼각 플라스크, 스테인리스 강, 유리 또는 일회용 플라스틱 진탕기 또는 교반 탱크 용기와 같은 적합한 용기 내에서 배양될 수 있다. 배양 용기는 제어 유닛에 연결되고, 이에 따라 제어된 배양 시스템을 제공할 수 있다. 배양 용기(예를 들어, 스피너 플라스크 또는 삼각 플라스크)는 연속적으로 또는 간헐적으로 교반될 수 있다. 바람직하게는, 배양 용기는 현탁 상태로 만능성 줄기 세포를 유지하기 위해 충분히 교반된다.
만능성 줄기 세포는 성장 및 증폭을 촉진하기에 충분한 영양물 및 환경적 자극을 제공하는 임의의 배지 중에서 배양될 수 있다. 적합한 배지는 E8™, IH3 및 mTeSR®1 또는 mTeSR®2를 포함한다. 배지는 새로 영양물 공급을 하고 세포 부산물을 제거하기 위해 주기적으로 교체될 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태에 따르면, 배양 배지는 매일 교체된다.
임의의 만능성 줄기 세포가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 만능성 줄기 세포의 예시적 유형은 임신 동안 임의의 시점에서, 전형적으로 그러나 반드시 그렇지는 않지만, 대략 임신 10 내지 12주 전에 취해진 태아 조직, 배아 조직, 또는 전-배아 조직(예를 들어, 배반포)을 비롯하여, 임신 후에 형성된 조직으로부터 유래된 확립된 만능성 세포주를 포함한다. 비제한적인 예는, 예를 들어 인간 배아 줄기 세포주(hESC) H1, H7, 및 H9(WiCell Research Institute, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)와 같은, 확립된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아생식 세포주이다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능성 줄기 세포 집단으로부터 취해진 세포가 또한 적합하다.
다수의 만능성 관련 전사 인자들, 예를 들어 OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, 및 ZFP42의 강제 발현을 사용하여 성체 체세포로부터 유래될 수 있는 유도성 만능성 세포(inducible pluripotent cell, IPS) 또는 재프로그래밍된 만능성 세포가 또한 적합하다(문헌[Annu Rev Genomics Hum Genet 2011, 12:165-185]). 본 발명의 방법에 사용되는 인간 배아 줄기 세포는 또한 톰슨(Thomson) 등에 의해 기재된 바와 같이 제조될 수 있다(미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science, 1998, 282:1145-1147]; 문헌[Curr Top Dev Biol 1998, 38:133-165]; 문헌[Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1995, 92:7844-7848]). 또한, 예를 들어 BG01v(브레사겐(BresaGen), 미국 조지아주 애선스 소재), 또는 성체 인간 체세포로부터 유래된 세포, 예를 들어 문헌[Takahashi et al., Cell 131:1-12 (2007)]에 개시된 세포와 같은 돌연변이체 인간 배아 줄기 세포주가 적합하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 만능성 줄기 세포는 문헌[Li et al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009)]; 문헌[Maherali et al. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007)]; 문헌[Stadtfeld et al. (Cell Stem Cell 2: 230-240)]; 문헌[Nakagawa et al. (Nature Biotechnology 26: 101-106, 2008)]; 문헌[Takahashi et al. (Cell 131: 861-872, 2007)]; 및 미국 특허 출원 공개 제2011-0104805호에 기재된 방법에 따라 유래될 수 있다. 만능성 줄기 세포의 다른 공급원은 유도 만능성 세포(IPS, 문헌[Cell, 126(4):663-676])를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 세포의 다른 공급원은 인간 제대 조직 유래 세포, 인간 양수 유래 세포, 인간 태반 유래 세포, 및 인간 반수성 개체(parthenote)를 포함한다. 일 실시 형태에서, 제대 조직 유래 세포는 미국 특허 제7,510,873호의 방법을 사용하여 얻어질 수 있으며, 이의 개시 내용은 세포의 단리 및 특징규명에 관한 것인 바와 같이 전체적으로 참고로 포함된다. 다른 실시 형태에서, 태반 조직 유래 세포는 미국 특허 출원 공개 제2005/0058631호의 방법을 사용하여 얻어질 수 있으며, 이의 개시 내용은 세포의 단리 및 특징규명에 관한 것인 바와 같이 전체적으로 참고로 포함된다. 다른 실시 형태에서, 양수 유래 세포는 미국 특허 출원 공개 제2007/0122903호의 방법을 사용하여 얻어질 수 있으며, 이의 개시 내용은 세포의 단리 및 특징규명에 관한 것인 바와 같이 전체적으로 참조로 포함된다.
만능성 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능성 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능성 줄기 세포 마커는, 예를 들어 하기 중의 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 모두)의 발현을 포함한다: ABCG2, 크립토(cripto), FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81. 일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 만능성 줄기 세포는 유세포측정에 의해 검출될 때 CD9, SSEA4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3개 또는 모두)을 발현하며, 분화 마커인 CXCR4(CD184로도 알려짐)의 발현은 결여되어 있다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 만능성 줄기 세포는 RT-PCR에 의해 검출될 때 CD9, NANOG 및 POU5F1/OCT4 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2개 또는 모두)을 발현한다.
예시적인 만능성 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포주 H9(NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1(NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7(NIH 코드: WA07) 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002(Cellartis, 스웨덴 소재)를 포함한다. 일 실시 형태에서, 만능성 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포, 예를 들어 H1 hES 세포이다. 대안적인 실시 형태에서, 비배아 기원의 만능성 줄기 세포가 사용된다.
하기에 기술된 바와 같은 실시 형태들 중 일부에서, 본 발명은 줄기 세포들을 단리 및 배양하는 것, 특히 줄기 세포 클러스터들을 배양하는 것에 관한 것으로, 이들은 동적 현탁 배양 시스템 내에서 만능성을 유지한다. 만능성 세포 클러스터는 분화되어 기능적 β 세포를 생성할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 만능성 줄기 세포는 바람직하게는, 원하는 종점을 향한 분화 전에 동적 현탁 배양물 중에서 증폭된다. 유리하게도, 만능성 줄기 세포가 만능성의 손실 없이 적합한 배지 중에서 현탁 상태로 세포의 클러스터로서 배양 및 증폭될 수 있는 것으로 확인되었다. 그러한 배양은 동적 현탁 배양 시스템 내에서 일어날 수 있는데, 여기서는 세포 또는 세포 클러스터가 만능성의 손실을 방지하기 충분하게 계속 움직임이 유지되고 있다. 유용한 동적 현탁 배양 시스템은 배양 성분들을, 예를 들어 교반(stirring), 진탕, 재순환 또는 배지를 통한 가스의 버블링(bubbling)을 통해, 교반(agitate)하기 위한 수단이 구비된 시스템을 포함한다. 그러한 교반은, 세포 클러스터의 충분한 움직임이 유지되어 증폭을 촉진하고 미성숙 분화를 방지하는 한, 간헐적이거나 연속적일 수 있다. 바람직하게는, 교반은, 예컨대 특정 속도로 회전하는 임펠러를 통한, 연속 교반을 포함한다. 임펠러는 환형 또는 평탄형 바닥을 가질 수 있다. 임펠러의 교반 속도는, 클러스터가 현탁 상태로 유지되고 침강(settling)이 최소화되도록 하는 것이어야 한다. 또한, 임펠러 블레이드의 각은 세포 및 클러스터의 상향 운동을 보조하여 침강을 피하도록 조절될 수 있다. 또한, 임펠러 유형, 각 및 회전 속도는 모두, 세포 및 클러스터가 균일한 콜로이드성 현탁액으로서 나타나도록 조정될 수 있다.
만능성 줄기 세포 클러스터의 현탁 배양 및 증폭은 일회용 플라스틱, 재사용가능한 플라스틱, 스테인리스 강 또는 유리 용기, 예를 들어 스피너 플라스크 또는 삼각 플라스크와 같은 적절한 동적 배양 시스템에 정치 배양된 줄기 세포를 옮김으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 부착성 정치 환경, 즉, 플레이트 또는 디시 표면에서 배양된 줄기 세포를 먼저 킬레이트제 또는 효소로 처리하여 표면으로부터 회수할 수 있다. 적합한 효소는 제I형 콜라게나제, Dispase®(Sigma Aldrich LLC, 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 또는 상표명 Accutase®(Sigma Aldrich LLC, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)로 시판되는 구매가능한 제형을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. Accutase®는 콜라겐분해성 및 단백질분해성 효소(갑각류로부터 단리됨)를 포함하는 세포 탈착 용액(cell detachment solution)이고 포유류 또는 세균 유래 생성물을 함유하지 않는다. 따라서, 일 실시 형태에서, 효소는 콜라겐분해성 효소 또는 단백질분해성 효소이거나 콜라겐분해성 및 단백질분해성 효소를 포함하는 세포 탈착 용액이다. 적합한 킬레이트제는 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 만능성 줄기 세포 배양물은 효소 또는 킬레이트제와 함께, 바람직하게는 콜로니 가장자리가 컬링되고 리프팅되기 시작하지만, 배양 표면으로부터 콜로니의 완전한 탈착이 일어나기 전까지 인큐베이션된다. 일 실시 형태에서, 세포 배양물은 실온에서 인큐베이션된다. 일 실시 형태에서, 세포는 20℃ 초과, 25℃ 초과, 30℃ 초과 또는 35℃ 초과의 온도에서, 예를 들어 약 20℃ 내지 약 40℃의 온도, 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도, 약 30℃ 내지 약 40℃의 온도, 예를 들어 약 37℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일 실시 형태에서, 세포는 적어도 약 1분, 적어도 약 5분, 적어도 약 10분, 적어도 약 15분, 적어도 약 20분, 예를 들어 약 1분 내지 약 30분, 약 5분 내지 약 30분, 약 10분 내지 약 25분, 약 15분 내지 약 25분, 예를 들어 약 20분 동안 인큐베이션된다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 처리 후의 세포 배양물로부터 효소 또는 킬레이트제를 제거하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 세포 배양물은 효소 또는 킬레이트제의 제거 후, 1회 또는 2회 또는 그 이상 세척된다. 일 실시 형태에서 세포 배양물은 mTeSR®1(Stem Cell Technologies, 캐나다 브리티시컬럼비아주 벤쿠버 소재)과 같은 적절한 배양 배지로 세척된다. 일 실시 형태에서, Rho-키나제 억제제(예를 들어, Y-27632, Axxora 카탈로그 번호 ALX-270-333, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재). Rho-키나제 억제제는 약 1 내지 약 100 μM, 약 1 내지 90 μM, 약 1 내지 약 80 μM, 약 1 내지 약 70 μM, 약 1 내지 약 60 μM, 약 1 내지 약 50 μM, 약 1 내지 약 40 μM, 약 1 내지 약 30 μM, 약 1 내지 약 20 μM, 약 1 내지 약 15 μM, 약 1 내지 약 10 μM, 또는 약 10 μM의 농도일 수 있다. 일 실시 형태에서, Rho-키나제 억제제는 적어도 1 μM, 적어도 5 μM 또는 적어도 10 μM로 첨가된다. 세포는 정치 배양 시스템의 표면으로부터 스크레이퍼(scraper) 또는 고무 폴리스맨(rubber policeman)을 사용하여 리프팅될 수 있다. 배지 및 세포는 유리 피펫 또는 다른 적합한 수단을 사용하여 동적 배양 시스템에 옮겨질 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 동적 배양 시스템 내의 배지는 매일 교체된다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 3차원 현탁 배양물 중에서 만능성 줄기 세포를 배양 및 증폭시키는 방법을 제공한다. 특히, 본 방법은 이들 만능성 줄기 세포의 응집된 세포 클러스터를 형성함으로써 배양 및 증폭 만능성 줄기 세포를 제공한다. 세포 클러스터는 세포를 배양하기 전에 만능성 줄기 세포 배양물을 효소(예를 들어, 중성 프로테아제, 예를 들어 Dispase®) 또는 킬레이트제로 처리한 결과로서 형성될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 교반 또는 진탕 현탁 배양 시스템 내에서 배양될 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 만능성 줄기 세포의 그러한 클러스터로부터 췌장 내배엽 계통에 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성을 추가로 제공한다.
바람직하게는, 세포 클러스터는 응집된 만능성 줄기 세포이다. 응집된 줄기 세포는 하나 이상의 만능성 마커, 예를 들어 마커 CD9, SSEA4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3개 또는 모두)을 발현하고, 하나 이상의 분화 마커의 발현은 결여되어 있는데, 예를 들어 CXCR4의 발현은 결여되어 있다. 일 실시 형태에서, 응집된 줄기 세포는 만능성 마커 CD9, SSEA4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81을 발현하고, 분화 마커 CXCR4의 발현은 결여되어 있다.
일 실시 형태는 현탁 배양물 중에서 세포 클러스터로서 만능성 줄기 세포를 배양하는 방법이다. 세포 클러스터는 동적 교반 또는 진탕 현탁 배양 시스템 내에서 배양된 응집된 만능성 줄기 세포이다. 세포 클러스터는 세포 리프팅제로서 중성 프로테아제, 예를 들어 Dispase와 같은 효소를 사용하여 평면 부착성 배양물(planar adherent culture)로부터 교반 또는 진탕 현탁 배양 시스템에 옮겨질 수 있다. 예시적인 적합한 효소는 제IV형 콜라게나제, Dispase® 또는 Accutase®를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 세포는 교반 또는 진탕 현탁 배양 시스템, 특히 교반 현탁 배양 시스템 내에서 만능성을 유지한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 현탁 배양물 중에서 세포 클러스터로서 만능성 줄기 세포를 배양하는 방법이며, 여기서 세포 클러스터는 킬레이트제, 예를 들어 EDTA를 사용하여 평면 부착성 배양물로부터 옮겨져서 교반 또는 진탕 현탁 배양 시스템 내에서 배양된 응집된 만능성 줄기 세포이다. 세포 클러스터는 교반 또는 진탕 현탁 배양 시스템, 특히 교반(동적 교반) 현탁 배양 시스템 내에서 만능성을 유지한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 현탁 배양물 중에서 세포 클러스터로서 만능성 줄기 세포를 배양하는 방법이며, 여기서 세포 클러스터는 효소 Accutase®를 사용하여 평면 부착성 배양물로부터 옮겨져서 교반 또는 진탕 현탁 배양 시스템 내에서 배양된 응집된 만능성 줄기 세포이다. 세포 클러스터는 동적 교반 현탁 배양 시스템 내에서 만능성을 유지한다.
본 발명의 세포 클러스터는 중배엽 세포, 예를 들어 심장 세포, 외배엽 세포, 예를 들어 신경 세포, 단일 호르몬 양성 세포 또는 췌장 내배엽 세포로 분화될 수 있다. 본 방법은 분화, 예를 들어 췌장 내배엽 세포의 췌장 전구 세포 및 췌장 호르몬 발현 세포로의 분화를 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 췌장 전구 세포는 β 세포 전사 인자 PDX1 및 NKX6.1의 발현을 특징으로 한다.
일 실시 형태에서, 분화의 단계는 현탁 배양 시스템 내에 있은 지 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 적어도 120시간, 적어도 144시간, 적어도 168시간, 적어도 196시간 이상, 바람직하게는 약 48시간 내지 약 72시간 후에 수행된다. 분화는 실시예 또는 하기 표 A에 기재된 것과 같은 배지 성분들의 단계적 진행을 사용하여 수행될 수 있다.
일 실시 형태에서, 3차원 세포 클러스터는 평면 부착성 배양물 중에서 만능성 줄기 세포를 성장시키는 단계; 만능성 줄기 세포를 응집된 세포 클러스터로 증폭시키는 단계; 및 평면 부착성 배양물로부터의 만능성 줄기 세포의 클러스터를 효소 또는 킬레이트제를 사용하여 동적 현탁 배양물에 옮기는 단계에 의해 생성된다. 추가의 실시 형태는 동적 교반 현탁 배양 시스템 내에서 만능성 줄기 세포를 증폭 및 분화시키는 방법으로서, 본 방법은 평면 부착성 배양물 중에서 만능성 줄기 세포를 성장시키는 단계; 만능성 줄기 세포를 응집된 세포 클러스터로 증폭시키는 단계; 및 평면 부착성 배양물로부터의 만능성 줄기 세포의 클러스터를 효소 또는 킬레이트제를 사용하여 동적 현탁 배양물에 옮기는 단계; 및 동적 교반 현탁 배양 시스템 내에서 만능성 세포 클러스터를 분화시켜 췌장 전구 세포 집단을 생성하는 단계에 의한다.
다른 실시 형태는 췌장 전구 세포로 분화되는 증폭된 만능성 줄기 세포 클러스터의 현탁으로부터 제조된 분화된 줄기 세포를 포함하는 이식가능한 줄기 세포 유래 세포 생성물이다. 더 상세하게는, 이식가능한 줄기 세포 유래 생성물은 평면 부착성 배양물 중에서 만능성 줄기 세포를 성장시키는 단계; 만능성 줄기 세포를 응집된 세포 클러스터로 증폭시키는 단계; 및 평면 부착성 배양물로부터의 만능성 줄기 세포의 클러스터를 효소 또는 킬레이트제를 사용하여 동적 현탁 배양물에 옮기는 단계; 및 동적 교반 현탁 배양 시스템 내에서 만능성 세포 클러스터를 분화시키는 단계에 의해 생성된다. 이식가능한 줄기 세포 유래 세포 생성물은 바람직하게는 당뇨병을 치료하는 데 사용된다.
다른 실시 형태에서, 본 방법은 기능적 췌장 내분비 세포로의 추가의 생체내(in vivo) 성숙을 위해 당뇨병 동물에의 이식을 포함한다.
다른 실시 형태는 현탁 배양 시스템 내에서 만능성 줄기 세포를 증폭 및 분화시키는 방법으로서, 평면 부착성 배양물 중에서 만능성 줄기 세포를 성장시키는 단계; 효소를 사용하여 평면 부착성 배양물로부터 만능성 줄기 세포를 회수하는 단계; 만능성 줄기 세포를 정치 배양으로 마이크로캐리어에 부착시키는 단계; 동적 교반 현탁 배양 시스템 내에서 만능성 세포를 증폭시키는 단계; 및 동적 교반 현탁 배양 시스템 내에서 만능성 세포를 분화시켜 췌장 전구 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법이다.
마이크로캐리어는 세포를 부착시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 형태일 수 있으며, 특히 마이크로캐리어는 비드일 수 있다. 마이크로캐리어는 천연 물질 또는 합성 유래 물질로 구성될 수 있다. 예에는 콜라겐-기반 마이크로캐리어, 덱스트란-기반 마이크로캐리어, 또는 셀룰로스-기반 마이크로캐리어가 포함된다. 예를 들어, 마이크로캐리어 비드는 양으로 하전된 표면을 마이크로캐리어에 제공하기 위해 양이온성 트라이메틸 암모늄이 표면에 부착된, 개질된 폴리스티렌 비드일 수 있다. 비드 직경은 약 90 내지 약 200 μm, 대안적으로 약 100 내지 약 190 μm, 대안적으로 약 110 내지 약 180 μm, 대안적으로 약 125 내지 175 μm 직경의 범위일 수 있다. 마이크로캐리어 비드는 또한 가교결합된 덱스트란의 매트릭스에 화학적으로 커플링된 변성된 콜라겐의 얇은 층일 수 있다. 마이크로캐리어 비드는 유리, 세라믹, 중합체(예컨대, 폴리스티렌), 또는 금속일 수 있다. 또한, 마이크로캐리어는 코팅되지 않거나, 규소 또는 콜라겐과 같은 단백질로 코팅될 수 있다. 추가의 태양에서, 마이크로캐리어는 마이크로캐리어에 대한 세포의 결합을 향상시키고 마이크로캐리어로부터의 세포의 방출을 향상시키는 화합물로 구성되거나 이로 코팅될 수 있으며, 이러한 화합물에는 소듐 하이알루로네이트, 폴리(모노스테아로일글리세라이드 코-석신산), 폴리-D,L-락타이드-코-글리콜라이드, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 라이신, n-아이소프로필 아크릴아미드, 비트로넥틴, 및 콜라겐이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 예에는 저수준의 생물학적으로 관련된 전기를 생산하는 아연과 구리의 미립자상 갈바닉 커플(particulate galvanic couple)을 갖는 마이크로캐리어; 또는 상자성 칼슘-알기네이트 마이크로캐리어와 같은 상자성체인 마이크로캐리어와 같은, 미세전류를 갖는 마이크로캐리어가 추가로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포의 집단은 만능성 세포 클러스터의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 만능성 세포는 인간 배아 만능성 줄기 세포이다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 동적 현탁 배양물 중에서 3 내지 5기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 만능성 세포를 분화시키는 단계적 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 생성된 췌장 내배엽 집단은 기능적 췌장 내분비 세포로의 추가의 생체내 성숙을 위해 당뇨병 동물에 이식된다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 시스템 또는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 세포 또는 세포 집단을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 얻어진 세포 또는 세포 집단을 제공한다.
본 발명은 치료 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 당뇨병을 앓고 있거나, 이것이 발병될 위험에 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있거나 얻어진 세포 또는 세포 집단을 제공한다. 특히, 본 발명은 당뇨병을 앓고 있거나, 이것이 발병될 위험에 있는 환자를 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있거나 얻어진 세포 또는 세포 집단을 제공한다. 당뇨병은 제1형 또는 제2형 당뇨병일 수 있다.
일 실시 형태에서, 치료 방법은 본 발명의 방법에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 세포를 환자에 이식하는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, 치료 방법은 만능성 줄기 세포를, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 시험관내에서 1기, 2기, 3기, 4기, 5기 또는 6기 세포로 분화시키는 단계, 및 분화된 세포를 환자에 이식하는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 방법은 만능성 줄기 세포를 분화시키는 단계 전에, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이 만능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 방법은 이식 단계 후에, 생체내에서 세포를 분화시키는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시 형태에서, 환자는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
일 실시 형태에서, 세포는 분산된 세포로서 이식될 수 있거나, 또는 클러스터로 형성되어 간문맥 내로 이식되거나 대안적으로 주입될 수 있다. 대안적으로, 세포는 숙주 면역 반응으로부터 보호하기 위해 캡슐화되거나 생체적합성의 분해성 중합체 지지체, 다공성 비분해성 장치 내에 제공될 수 있다. 세포는 수령체의 임의의 적절한 부위 내로 이식될 수 있다. 이식 부위는, 예를 들어 간, 천연 췌장, 신장 피막하 공간, 장막, 복막, 장막하 공간, 장, 위, 또는 피하 주머니를 포함한다.
생체내에서 이식된 세포의 추가 분화, 생존 또는 활성을 향상시키기 위해, 성장 인자, 산화방지제 또는 항염증제와 같은 추가의 인자가 세포 투여 전에, 세포 투여와 동시에, 또는 세포 투여 후에 투여될 수 있다. 이들 인자는 내인성 세포에 의해 분비되어 원위치(in situ)에서 투여된 세포에 노출될 수 있다. 이식된 세포는 당업계에 알려진 내인성 성장 인자 및 당업계에 알려진 외부로부터 투여된 성장 인자의 임의의 조합에 의해 분화되도록 유도될 수 있다.
이식에 사용되는 세포의 양은 환자의 상태 및 요법에 대한 반응을 포함한 많은 다양한 인자에 의존하며, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일 실시 형태에서, 치료 방법은 세포를 이식 전에 3차원 지지체 내로 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 세포는 환자 내로 이식되기 전에 이 지지체 상에서 시험관내에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 세포를 함유한 지지체는 추가의 시험관내 배양 없이 환자 내에 직접 이식될 수 있다. 지지체에는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 적어도 하나의 약제학적 작용제가 선택적으로 혼입될 수 있다.
본 발명의 소정 실시 형태에서, 표 A에 열거된 성분들 중 하나 이상이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
[표 A]
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "MCX 화합물"은 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6- ~.1~8,12.~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온이며, 이는 하기 화학식(화학식 1)을 갖는다:
다른 환형 아닐린-피리디노트라이아진이 또한 전술된 MCX 화합물 대신 사용될 수 있다. 그러한 화합물은 14-메틸-3,5,7,14,18,24,28-헵타아자테트라사이클로[20.3.1.1~2,6~.- 1~8,12 ~]옥타코사-1(26),2(28),3,5,8(27),9,11,22,24-노나엔-17-온 및 5-클로로-1,8,10,12,16,22,26,32-옥타아자펜타사이클로[24.2.2.1~3,7~-1~9,13~.1 ~14,18~]트라이트라이아콘타-3(33),4,6,9(32),10-,12,14(31),15,17-노나엔-23-온을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 이들 화합물은 하기에 나타나 있다(화학식 2 및 화학식 3):
예시적인 적합한 화합물은 미국 특허 출원 공개 제2010/0015711호에 개시되어 있으며, 이의 개시 내용은 MCX 화합물, 관련 환형 아닐린-피리디노트라이아진, 및 이들의 합성에 관한 것인 바와 같이 전체적으로 포함된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
실시예
본 발명은 하기의 비제한적 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예 1
이 실시예는 0.5 리터 스피너 플라스크를 사용하여 교반 현탁 배양 시스템 중에서의 인슐린 발현 세포의 형성을 보여준다. 배지 및 가스를 탈착식 사이드-아암 캡을 통해 교환하였다. 세포가 먼저 PDX1을 발현하고, 이어서 또한 췌장 베타 세포 형성 및 기능에 필요한 단백질 전사 인자인 NKX6.1을 동시발현하는 단계적 과정으로 인슐린 양성 세포를 형성하였다. 이어서, 이들 동시발현 세포는 현탁 배양물 중에 있는 동안에 인슐린 및 추후에는, PDX1 및 NKX6.1과 조합하여, MAFA의 발현을 획득하였다. 이 세포 집단을 면역-손상된 마우스의 신장 피막 내로 이식하였을 때, 이 이식편은 4주의 생착 이내에 검출가능한 혈액 수준의 인간 C-펩티드를 생성하였다.
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(WA01 세포, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 WiCell Research Institute)를 둥근 응집된 클러스터로서 4회 계대 이상 동안 동적 현탁 상태로 0.5% 중량 대 부피("w/v")의 무지방산 소혈청 알부민("FAF-BSA")(미국 아이다호주 분 소재의 Proliant, Inc.; 카탈로그 번호 68700)이 보충된 Essential 8™("E8™") 배지(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Life Technologies Incorporated; 카탈로그 번호 A15169-01) 중에서 성장시켰다. 이어서, 클러스터를 하기 방법에 따라 단일 세포로서 그리고 2 내지 10개의 세포들의 클러스터로서 동결시켰다. 응집된 클러스터로의 대략 6억개 내지 10억개 세포를 원심분리 튜브에 옮기고, 칼슘 또는 마그네슘을 함유하지 않는 100 mL의 1X 둘베코 인산염 완충 식염수(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, "DPS -/-")(Life Technologies; 카탈로그 번호 14190-144)를 사용하여 세척하였다. 세척 후에, 이어서 50 부피% StemPro®Accutase® 효소(Life Technologies, 카탈로그 번호 A11105-01) 및 50 부피% DPBS -/-의 30 mL 용액을 풀어진(loosened) 세포 응집체 펠릿에 첨가함으로써 세포 응집체를 효소적으로 해체시켰다. 세포 클러스터를 1 내지 3회 상하로 피펫팅하고, 이어서 실온에서 대략 4분 동안 간헐적으로 와동시킨 다음, 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 이어서, 세포 펠릿을 교란시키지 않으면서 가능한 한 완전히 Accutase® 상층액을 흡인하였다. 이어서, 원심분리 튜브를 대략 4분 동안 단단한 표면에 대고 탭핑하여, 클러스터를 단일 세포 및 2 내지 10개의 세포로 구성된 클러스터로 해체시켰다. 4분 후에, 세포를 10 μM Y-27632(미국 뉴욕주 파밍데일 소재의 Enzo Life Sciences, Inc.; 카탈로그 번호 ALX-270-333) 및 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 100 mL의 E8™ 배지 중에 재현탁시키고, 80 내지 200 rcf로 5 내지 12분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상층액을 흡인하고, 차가운(4℃ 이하) Cryostor® 세포 보존 배지 CS10(미국 미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma-Aldrich; 카탈로그 번호 C2874 - 100 mL)을 적가하여 mL당 1억개 내지 1억5000만개 세포의 최종 농도를 달성하였다. 이 세포 용액을 2 mL 냉동 바이알(cryogenic vial)(미국 뉴욕주 코닝 소재의 Corning Incorporated; 카탈로그 번호 430488)에 분취하는 동안 빙조 중에서 유지하고, 이후에 세포를 프로그램화 동결기(controlled rate freezer)(CryoMed™ 34L 프로그램화 동결기(Controlled-Rate Freezer), 미국 뉴욕주 버팔로 소재의 Thermo Fischer Scientific, Inc.; 카탈로그 번호 7452)를 사용하여 동결시켰는데, 이는 하기와 같다. 챔버를 4℃로 냉각시키고, 샘플 바이알 온도가 6℃에 도달할 때까지 이 온도를 유지하고, 이어서 샘플이 -7℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 분당 2℃로 낮추고, 이 시점에서 챔버가 -45℃에 도달할 때까지 챔버를 20℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도가 -25℃에 도달할 때까지 그 온도를 10℃/min으로 짧은 시간에 상승되게 한 다음, 샘플 바이알이 -40℃에 도달할 때까지 챔버를 0.8℃/min으로 추가로 냉각시켰다. 이어서, 챔버가 -100℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 10℃/min으로 냉각시킨 다음, 이 시점에서 챔버가 -160℃에 도달할 때까지 챔버를 35℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도를 -160℃에서 적어도 10분 동안 유지하고, 이후에 바이알을 가스상 액체 질소 저장소에 옮겼다. 이어서, 고농도의 이들 냉동보존된 단일 세포를 중간/인-프로세스 시드 재료(intermediate/in-process seed material, "ISM")로서 사용하였다.
ISM의 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내고, 해동시키고, 이를 사용하여 3 리터 유리 교반 현탁 탱크 생물반응기(독일 쥬엘리히 소재의 DASGIP Information and Process Technology GMBH)에 접종하였다. 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내어서 120초 동안 37℃ 수조에 신속히 옮겨두어서 해동시켰다. 이어서, 바이알을 생물안전 캐비닛(biosafety cabinet, "BSC")으로 이동시키고, 해동된 내용물을 2 mL 유리 피펫을 통해 50 mL 원추형 튜브에 옮겼다. 이어서, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Rho 키나제 억제제 Y-27632가 보충된 10 mL의 E8™ 배지를 튜브에 적가하였다. 세포를 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 튜브로부터의 상층액을 흡인하고, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 10 mL의 신선한 E8™ 배지를 첨가하고, 세포를 함유하는 부피를 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 450 mL의 E8™ 배지가 담긴 배지 전달병(Cap2V8®, 미국 캘리포니아 소재의 무어파크 소재의 Sanisure, Inc.) 내로 피펫팅하였다. 이어서, 병의 내용물을 연동 펌프를 사용하여 멸균 C-Flex® 튜빙 웰드(tubing weld)를 통해 생물반응기 내로 직접 펌핑하였다. 생물반응기에는 70 rpm으로 교반된, 37℃로 예비가온된, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 1000 mL의 E8™ 배지가 준비되어 있었는데, 이때 30%의 용존 산소 설정점(공기 O2, 및 N2가 조절됨), 및 5%의 제어된 CO2 부분 압력을 가졌다. 반응기에 접종하여 0.225 x 106개 세포/mL(농도 범위: 0.2 내지 0.5 x 106개 세포/mL)의 목표 농도를 제공하였다.
일단 반응기에 접종하면, 세포는 교반 반응기 내에 둥근 응집된 클러스터를 형성하였다. 배양물 중에 있은 지 24시간 후에, 원래 부피의 80% 넘게 제거하고 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 1.5 L의 E8™ 배지(신선한 배지)를 다시 첨가함으로써 배지를 부분 교체하였다. 이러한 배지 교체 과정을 접종 후 48시간째에 반복하였다. 둥근 응집된 클러스터로서 현탁 배양물 중에 있은 지 3일 후에, 분화를 위하여 세포를 생물반응기로부터 펌핑하여 3개의 0.5 L 일회용 스피너 플라스크(Corning; 카탈로그 번호 3153) 내로 옮겼다. 모든 스피너 플라스크를 60 RPM(55 내지 65 RPM)의 일정 교반 속도 및 5% CO2가 보충된 37℃의 가습된 인큐베이터 내에서 유지하였다. 분화 프로토콜이 조건 A, 조건 B 및 조건 C로서 하기에 기재되어 있다.
분화 과정 전체에 걸쳐, 배지 교체를 위하여 스피너를 인큐베이터에서의 동적 교반으로부터 BSC로 이동하였다. 스피너를 6분 동안 교반 없이 유지하여, 대부분의 세포 클러스터가 용기의 바닥에 침강되게 하였다. 6분 후에, 스피너 플라스크 사이드 아암 캡을 탈착하고, 폐배지(spent medium)의 90% 이상을 흡인을 통해 제거하였다. 폐배지가 제거되면, 300 mL의 신선한 배지를 열린 사이드 아암을 통해 스피너 플라스크에 다시 첨가하였다. 이어서, 스피너 캡을 다시 덮고, 앞서 기재된 조건 하에서의 인큐베이터에서의 동적 현탁 상태로 복귀시켰다.
1기(3일):
조건 A의 경우, 1.18 g/L의 중탄산나트륨(Life Technologies; 카탈로그 번호 10372-019)을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨(Sigma Aldrich; 카탈로그 번호 S3187); MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™(Life Technologies; 카탈로그 번호 35050-079); 2.5 mM 글루코스(물 중 45%; Sigma Aldrich; 카탈로그 번호 G8769); 및 1:50,000 희석의 인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민("ITS-X")(Life Technologies; 카탈로그 번호 51500056)이 보충된 MCDB-131 배지를 사용하여 기본 배지("1기 기본 배지")를 제조하였다. 100 ng/ml의 성장/분화 인자 8("GDF8")(미국 뉴저지주 록키힐 소재의 Peprotech, Inc.; 카탈로그 번호 120-00); 및 2 μM 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온("MCX 화합물")이 보충된 300 mL의 1기 기본 배지 중에서 1일 동안 세포를 배양하였다. 24시간 후에, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하고, 100 ng/mL의 GDF8이 보충되지만 MCX 화합물은 보충되지 않은 신선한 300 mL의 1기 기본 배지를 플라스크에 첨가하였다. 세포를 추가의 배지 교체 없이 48시간 동안 유지하였다.
조건 B에서는, 3 μM MCX 화합물을 첫째 날 동안 사용한 것을 제외하고는 조건 A에 대해 기재된 바와 같이 세포를 배양하였다.
조건 C에서는, GDF8 대신 100 ng/mL의 액티빈 A를 사용하고, MCX 화합물 대신 30 μM 글리코겐 신타제 키나제 3β 억제제 (6-[[2-[[4-(2,4-다이클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)- 2 피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴("CHIR99021")(미국 매사추세츠주 케임브리지 소재의 Stemgent Inc, 카탈로그 번호 04004-10)을 사용한 것을 제외하고는 조건 A에 대해 기재된 바와 같이 세포를 배양하였다.
2기(3일):
조건 A의 경우, 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 1.2 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:50,000 희석의 ITS-X가 보충된 MCDB-131 배지를 사용하여 기본 배지("2기 기본 배지")를 제조하였다. 1기의 완료 후에, 1기 폐배지를 제거하고, 50 ng/mL의 섬유아세포 성장 인자 7("FGF7")(미국 미네소타주 미니애폴리스 소재의 R&D Systems; 카탈로그 번호 251-KG)이 보충된 300 mL의 2기 기본 배지로 대체하여, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하였다. 배지 교체 후 48시간째에, 폐배지를 다시 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 300 mL의 신선한 2기 기본 배지로 교체하였다.
조건 B에서는, 조건 A의 경우와 같이 세포를 배양하였다.
조건 C에서는, 250 μL의 1 M 아스코르브산(Sigma Aldrich; 카탈로그 번호 A4544; 물 중에서 재구성됨)을 1 L의 2기 기본 배지에 추가로 첨가하면서, 조건 A 및 조건 B의 경우와 같이 세포를 배양하였다.
3기(조건 A 및 조건 B의 경우 3일 및 조건 C의 경우 2일):
조건 A의 경우, 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 1.2 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 MCDB-131 배지를 사용하여 기본 배지("3기 또는 4기 기본 배지")를 제조하였다. 2기의 완료 후에, 폐배지를 50 ng/mL의 FGF-7; 100 nM의 골 형성 단백질("BMP") 수용체 억제제((6-(4-(2-(피페리딘-1-일)에톡시)페닐)-3-(피리딘-4-일)피라졸로[1,5-a]피리미딘 하이드로클로라이드))("LDN-193189", 중국 상하이 소재의 Shanghai ChemPartner Co Ltd.); 2 μM 레틴산("RA")(Sigma Aldrich; 카탈로그 번호 R2625); 0.25 μM N-[(3,5-다이메틸-1-페닐-1H-피라졸-4-일)메틸렌]-4-(페닐메틸)-1-피페라진아민("SANT-1") (Sigma Aldrich; 카탈로그 번호 S4572); 및 400 nM의 PKC 활성화제 ((2S, 5S-(E,E)-8-(5-(4-트라이플루오로메틸)페닐-2,4-펜타다이에노일아미노)벤조락탐("TPB")(중국 상하이 소재의 Shanghai ChemPartner Co Ltd.)이 보충된 300 mL의 3기 또는 4기 기본 배지로 교체하여 배지 교체를 완료하였다. 배지 교체 후 24시간째에, 폐배지를, LDN-193189를 제외하고는 상기 보충제를 함유하는 300 mL의 신선한 3기 또는 4기 기본 배지로 다시 대체하였다. 세포를 48시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
조건 B에서는, 조건 A의 경우와 같이 세포를 배양하였다.
조건 C에서는, 250 μL/L의 1 M 아스코르브산 용액을 3기 또는 4기 기본 배지에 추가로 첨가하면서, 조건 A 및 조건 B의 경우와 같이 세포를 배양하였다. 더욱이, 3기 개시 후 48시간째에, 하기에 기재된 바와 같이 세포를 4기 배지로 이동하였다.
4기(조건 A 및 조건 B의 경우 3일 및 조건 C의 경우 4일):
조건 A의 경우, 3기의 완료 후에, 폐배지를 제거하고, 0.25 μM SANT-1 및 400 nM TPB가 보충된 300 mL의 3기 또는 4기 기본 배지로 대체하였다. 4기 개시 후 48시간째에, 3.2 mL/L의 45% 글루코스 용액(8 mM 글루코스 볼루스)을 플라스크에 첨가하고, 세포를 추가 24시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
조건 B에서는, 조건 A의 경우와 같이 세포를 배양하였다.
조건 C에서는, 3기 또는 4기 기본 배지에 0.1 μM RA, 50 ng/mL의 FGF7, 및 250 μL/L의 1 M 아스코르브산 용액이 추가로 보충된 것을 제외하고는 조건 A 및 조건 B의 경우와 같이 세포를 배양하였다. 48시간 후에, 폐배지를 (조건 C 배지 보충제를 함유하는) 동일한 신선한 배지로 교체하고, 세포를 추가 48시간 동안 배양하였다.
5기(7일):
조건 A, 조건 B 및 조건 C의 경우, 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 1.75 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 20 mM 글루코스; 1:200 희석의 ITS-X; 250 μL/L의 1 M 아스코르브산; 10 mg/L의 헤파린(Sigma Aldrich; 카탈로그 번호 H3149-100KU)으로 보충된 MCDB-131 배지 베이스를 사용하여 기본 배지("5기+ 기본 배지")를 제조하였다. 4기의 완료 후에, 3,3′,5-트라이요오도-L-티로닌 나트륨 염으로서의 1 μM T3("T3")(Sigma Aldrich; 카탈로그 번호 T6397), 10 μM 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘("ALK5 억제제 II")(Enzo Life Sciences, Inc.; 카탈로그 번호 ALX-270-445), 100 nM의 감마 세크레타제 억제제 XX(미국 뉴저지주 깁스타운 소재의 EMD Millipore Corporation, 카탈로그 번호 565789); 20 ng/mL의 베타셀룰린(R&D Systems, 카탈로그 번호 261-CE-050); 0.25 μM SANT-1; 및 100 nM RA가 보충된 300 mL의 5기+ 기본 배지로 배지 교체를 완료하였다. 5기의 개시 후 48시간째에, 폐배지를 제거하고, 300 mL의 동일한 배지 및 보충제로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 제거하고, 1 μM T3, 10 μM ALK5 억제제 II, 20 ng/mL의 베타셀룰린, 및 100 nM RA가 보충된 5기+ 기본 배지로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 다시 교체하여 1 μM T3, 10 μM ALK5 억제제 II, 20 ng/mL의 베타셀룰린, 및 100 nM RA가 보충된 5기+ 기본 배지로 대체하였다.
6기(7일):
마지막 5기 배지 교체 후 24시간째에, 조건 A, 조건 B, 및 조건 C에 대한 배지를 1 μM T3 및 10 μM ALK5 억제제 II가 보충된 5기+ 기본 배지로 교체하였다. 6기의 2일째, 4일째 및 6일째의 종료 시점에서 이 보충된 배지를 사용하여 배지 교체를 행하였다.
분화 과정 전체에 걸쳐, 일일 기준으로 현탁 배양물로부터 샘플을 수집하였다. 일일 세포 샘플을 mRNA(qRT-PCR)를 위해 단리하고, 폐배지를 대사 분석을 위하여 수집하였다. 선택된 단계의 종료 시점에서, 유세포측정 또는 형광 면역-조직화학을 통해 단백질 발현을 측정하였다. NOVA® BioProfile® FLEX 생물분석기(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 Nova Biomedical Corporation)를 사용하여 폐배지를 분석하였다.
도 1a 내지 도 1d는 매 분화일의 종료 시점에서 폐배지 샘플로부터 획득된 NOVA® BioProfile FLEX 분석기로부터의 데이터를 나타낸다(도 1a - pO2/부분 산소 압력; 도 1b - 글루코스 농도; 도 1c - 락테이트 농도; 도 1d - 배지 pH). 이들 데이터는, 분화의 1기의 처음 3일 동안, 이후의 분화 단계와 비교하여, 세포가 가장 산소 소비적이었음을 보여준다. 1기의 세포는 NOVA® 분석기에 의해 검출된 바와 같이 pO2 수준을 140+ mmHg의 포화 수준으로부터 100 mmHg 미만까지 감소시켰다(도 1a). 더욱이, 1기 세포는 이 과정의 처음 3일에 배지 중의 거의 모든 글루코스를 소비하고(도 1b) 리터당 1 그램 초과의 락테이트를 생성하였다(도 1c).
세포가 분화의 2기 및 3기로 이동함에 따라, 그의 산소 및 글루코스 소비 및 락테이트 생성은 1기와 비교하여 변화하였다. 1기에서 GDF8 및 MCX 화합물(조건 A 또는 조건 B)로 처리된 세포는 1기에서 액티빈 A 및 CHIR99021(조건 C)로 처리된 세포보다 2기에서 더 산소 소비적이었다(도 1a). 증가된 산소 소비의 이러한 관찰은, 조건 A 또는 조건 B를 조건 C와 비교할 때, 폐배지에서의 더 낮은 pH(도 1d 및 표 1), 증가된 락테이트 생성(도 1c), 및 더 높은 글루코스 소비(도 1b)와 상관되었다.
세포가 4기(조건 A 및 조건 B의 경우 10일째, 11일째, 및 12일째; 조건 C의 경우 9일째, 10일째, 11일째, 및 12일째)로 진행됨에 따라, 조건 A 및 조건 B로 처리된 세포는, 조건 C로 처리된 세포와 비교하여, 증가된 수준의 글루코스 소비 및 더 낮은 배지 pH를 유지하였다(도 1b 및 표 1). 그러나, 14일째(5기의 둘째 날)부터 19일째(5기의 종료일)까지, 글루코스 수준이 모든 처리 조건에서 리터당 3 그램 미만으로 하락되지 않은 것으로 관찰되었다. 일단 6기가 시작되면, 모든 3개의 조건에서(도 1b, 20일째 이후), 폐배지 글루코스 수준은 리터당 2.4 그램 미만으로 되는 경향이 있었다. 글루코스 소비에 있어서의 이러한 증가에는 리터당 0.5 그램을 초과하는 총 락테이트 생성의 증가도 동반되지 않고(도 1c), 폐배지의 산성화도 동반되지 않았는데(도 1d), 이는 세포가, 췌도 내분비 호르몬 세포 집단과 일치하는, 덜 해당적(glycolytic)이고 더 성숙된 대사로 변환되고 있음을 시사한다.
일일 샘플링을 통해 폐배지의 대사 프로파일을 모니터링하는 것에 더하여, 분화 과정 전체에 걸쳐 세포의 대표적인 샘플을 획득하고, Applied Biosystems® OpenArray®(Life Technologies)를 통해 유전자 패널의 mRNA 발현에 대해 시험하고, 실험의 시작으로부터 배양물 중에 있은 지 24시간 후에 만능성 ISM 세포와 대비하여 발현에 있어서의 배수 차이로서 계산하였다. 도 2a 내지 도 2m은 5기의 첫째 날에 걸쳐 분화된 세포에서의 하기 유전자의 발현에 대한 데이터를 나타낸다: PDX1(도 2a); NKX6.1(도 2b); PAX4(도 2c); PAX6(도 2d); NEUROG3(NGN3)(도 2e); ABCC8(도 2f); 크로모그라닌-A("CHGA")(도 2g); G6PC2(도 2h); IAPP(도 2i); 인슐린("INS")(도 2j); 글루카곤("GCG")(도 2k); PTF1a(도 2l); 및 NEUROD1(도 2m).
도 2a에 나타낸 바와 같이, 모든 3개의 분화 조건에서, 2기 3일째("S2D3")의 종료까지, 세포는 PDX1을 발현하고 췌장 운명을 채택하기 시작하였다. 세포가 3기에 진입됨에 따라, 세포는 내분비 췌장 특수화(specification)를 나타내는 유전자(NGN3, NEUROD1, 및 CHGA; 도 2e, 도 2m, 및 도 2g)를 발현하기 시작하였으며, 3기의 종료 및 4기의 시작까지, 이것은 베타 세포 형성에 필요한 유전자(PAX4, PAX6, 및 NKX6.1; 도 2c, 도 2d, 및 도 2b)를 발현하기 시작하였다. 5기의 시작까지, 세포는 섬(islet) 및 베타 세포의 형성 및 기능에 필요한 마커(GCG, INS, IAPP, G6PC2, 및 ABCC8; 도 2k, 도 2j, 도 2i, 도 2h, 및 도 2f)를 발현하기 시작하였다.
5기 및 6기 전체에 걸쳐 샘플을 또한 수집하고, PDX1의 유전자 발현에 대한 OpenArray® 실시간 PCR 분석에 의해 분석하였다(도 3a); NKX6.1(도 3b); PAX6(도 3c); NEUROD1(도 3d); NEUROG3(NGN3)(도 3e); SLC2A1(도 3f); PAX4(도 3g); PCSK2(도 3h); 크로모그라닌-A(도 3i); 크로모그라닌-B(도 3j); PPY(도 3k); PCSK1(도 3l); G6PC2(도 3m); 글루카곤(도 3n); 및 인슐린(도 3o). 도 3a 내지 도 3d에 나타낸 바와 같이, PDX1, NKX6.1, PAX6, 및 NEUROD1 발현 수준은 5기 3일째("S5D3")부터 6기 7일째(S6D7)의 종료까지 안정한 것으로 관찰되었다. NGN3, SLC2A1, 및 PAX4에 대한 mRNA 발현 수준은, 세포가 감마 세크레타제 억제제에 노출되어 있는 동안(5기 1일째부터 4일째까지)에 최고 수준이었으며, 감마 세크레타제 억제제의 제거에 따라 발현 수준이 저하하였다(도 3e 내지 도 3g). 유전자 PCSK2, CHGA, 및 CHGB는 5기의 종료 시점에 발현에 있어서의 증가를 나타내었으며(도 3m 내지 도 3o), 한편 유전자 PPY, PCSK1, G6PC2, GCG, 및 INS는 5기 시작부터 6기 종료까지 연속적으로 상승하였다(도 3k, 도 3l, 도 3m, 도 3n, 도 3o).
다양한 단계들의 추가 특징규명을 위해, 1기, 4기, 5기, 및 6기의 종료 시점에서 세포를 회수하고 유세포측정에 의해 분석하였다. 간략하게 말하면, 세포 응집체를 37℃에서 3 내지 5분 동안 TrypLE™ Express(Life Technologies; 카탈로그 번호 12604)를 사용하여 단일 세포로 해체하였다. 표면 염색을 위하여, 풀어진 단일 세포를 200만개 세포/mL의 최종 농도로 염색 완충액 중에 1:4로 희석된 0.5% 인간 감마 글로불린 중에 재현탁시켰다. 직접 접합된 1차 항체를 1:20의 최종 희석으로 세포에 첨가한 후 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 염색된 세포를 염색 완충액 중에서 2회 세척하고, 이어서 300 μL 염색 완충액 중에 재현탁한 후, BD FACSCanto™ II에서의 유세포측정 분석 전에 생/사 식별을 위해 10 μL의 7-AAD 중에서 인큐베이션하였다. 세포내 항체 염색을 위하여, 먼저 단일 세포를 자색 형광 LIVE/DEAD 세포 염료(Violet Fluorescent LIVE/DEAD cell dye, Life Technologies, 카탈로그 번호 L34955)와 함께 4℃에서 20 내지 30분 동안 인큐베이션하고, 이후에 차가운 PBS-/- 중에서 1회 세척을 행하였다. 이어서, 세척된 세포를 4℃에서 30분 동안 280 μL의 Cytofix/Cytoperm™ 고정 및 투과화 용액(Fixation and Permeabilization Solution)(BD 카탈로그 번호 554722) 중에 고정시켰다. 이어서, 세포를 1x Perm/Wash 완충액(BD 카탈로그 번호 51-2091 KZ) 중에서 2회 세척한 후, 200만개 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다. 이어서, 고정된 세포 현탁액을 실온에서 10 내지 15분 동안 20% 정상 염소 혈청을 사용하여 차단하였다. 세포를 경험적으로 사전-결정된 희석으로 1차 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, Perm/Wash 완충액으로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 적절한 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, BD FACSCanto™ II에서의 분석 전에 2회 세척하였다. 사용된 항체의 농도가 표 II에 나타나 있다. 췌장 마커에 대한 항체를 양성 대조군으로서의 미분화 H1 세포 또는 인간 섬을 사용하여 특이성에 대해 시험하였다. 2차 항체의 경우, 하기, 즉 1:4,000의 항마우스 Alexa Fluor® 647(Life Technologies, 카탈로그 번호 A21235) 또는 1:100, 1:200 또는 1:800의 염소 항토끼 PE(Life Technologies, 카탈로그 번호 A10542)를 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, Perm/Wash 완충액 중에서 최종 세척하고 BD FACSDiva™ 소프트웨어를 사용하여 BD FACSCanto™ II에서 분석하였는데, 이때 적어도 30,000개 사건이 획득되었다.
도 4는 표면 마커 CD184와 CD9; 또는 CD184와 CD99에 대해 동시염색된 1기 종료로부터의 살아있는 세포에 대한 유세포측정 점 도표를 나타낸다(표 IIIA에 요약되어 있음). 도 5는 하기의 쌍을 이룬 세포내 마커에 대해 동시염색된 4기 종료로부터의 고정 및 투과화된 세포에 대한 유세포측정 점 도표를 나타낸다: NKX6.1과 크로모그라닌-A; Ki67과 PDX1; 및 NKX2.2와 PDX1(표 IIIA에 요약되어 있음). 도 6a 및 도 6b(조건 A), 도 7a 및 도 7b(조건 B), 및 도 8a 및 도 8b(조건 C)는 하기의 쌍을 이룬 세포내 마커에 대해 동시염색된 5기 종료로부터의 고정 및 투과화된 세포에 대한 유세포측정 점 도표를 나타낸다: NKX6.1과 크로모그라닌-A; NKX2.2와 크로모그라닌-A; NKX6.1과 C-펩티드; 글루카곤과 인슐린; Ki67과 PDX1; OCT4와 PAX6; NKX6.1과 NEUROD1; NKX6.1과 인슐린; 및 NKX6.1과 PDX1. 도 9a 및 도 9b(조건 A), 도 10a 및 도 10b(조건 B), 및 도 11a 및 도 11b(조건 C)는 염색된 6기 종료로부터의 고정 및 투과화된 세포를 나타내는데, 이는 동시염색되고 쌍을 이룬 세포내 마커에 대해 유세포측정에 의해 측정된 것이다: NKX6.1과 크로모그라닌-A; NKX2.2와 크로모그라닌-A; 글루카곤과 인슐린; NKX6.1과 C-펩티드; 인슐린과 C-펩티드; Ki67과 PDX1; OCT4와 PAX6; NKX6.1과 NEUROD1; NKX6.1과 인슐린; 및 NKX6.1과 PDX1.
5기 종료 시점에서는, 도 6a, 도 7a, 및 도 8a에 나타나 있고 표 IIIB에 요약되어 있는 바와 같이, 조건 A, 조건 B, 또는 조건 C에 대해 각각 분화된 세포의 17%, 12%, 또는 10%가 인슐린과 NKX6.1을 동시발현하였다. 6기의 완료 시점에서, NKX6.1과 인슐린 동시발현 세포의 수에 있어서 증가가 관찰되었다(31% 조건 A; 15% 조건 B; 14% 조건 C). 더욱이, 6기 종료 시점에서는 상당 대다수의 세포가 베타 세포 전구체 마커 NKX6.1, 내분비 전구체 마커 NKX2.2, 및 내분비 전구체 마커 NEUROD1을 발현한 것으로 확인되었다(조건 A - 74% NKX6.1, 82% NKX2.2, 74% NEUROD1; 조건 B- 75% NKX6.1, 76% NKX2.2, 67% NEUROD1; 조건 C- 60% NKX6.1, 64% NKX2.2, 53% NEUROD1).
베타 세포 성숙 및 기능에 필요한 마커의 증가된 발현에 더하여, PDX1과 Ki-67에 대한 동시발현에 의해 측정된 바와 같은 활성 세포 주기에서의 PDX1 양성 세포의 백분율이 5기부터 6기까지 하락된 것으로 관찰되었다(26%부터 9%로 하락, 조건 A; 22%부터 10%로 하락, 조건 B; 43%부터 19%로 하락, 조건 C). 더욱이, 유세포측정에 의해 측정된 Ki-67의 발현이 모든 3개의 시험 조건에서 5기 및 6기의 경과에 걸쳐 하락함에 따라, TaqMan® qRT-PCR에 의해, 증가하는 수준의 베타-세포 특이적 전사 인자 MAFA가 검출되었다. 6기의 종료 시점에서의 MAFA 발현은 미분화된 만능성 줄기 세포보다 40+배 더 높았으며, 인간 섬 조직에서 관찰된 발현의 대략 25%인 수준에 도달하였다(도 12). MAFA의 단백질 발현은 도 13에 나타낸 바와 같이 면역-형광 세포화학에 의해 확인되었는데, 이 도면은 면역-형광 핵 MAFA 염색, 면역-형광 세포질 인슐린 염색, 및 팬-핵 염색(pan-nuclear stain)("DAPI")의 20x 대물렌즈에 의해 획득된 현미경 사진을 나타낸다.
전술된 이들 결과는 5기로부터 6기로 이동하는 세포가 증식성 췌장 내분비 선조체로부터 내분비 세포로 변환되었음을 나타낸다. 이들 내분비 조직, 및 구체적으로 인슐린 양성 세포는 기능적 베타 세포와 관련되고 이에 필요한 핵심 마커를 발현하였다. 3기 및 4기의 경우 조건 C에서보다 유의하게 더 낮은 pH에서 세포를 배양하는 조건 A 및 조건 B는, 조건 C와 비교하여, 6기 분화 과정의 종료까지 더 많은 크로모그라닌 양성, C-펩티드/NKX6.1 동시-양성(co-positive) 세포 및 NEUROD1/NKX6.1 동시-양성 세포를 생성하였다. 조건 C는 당업계에 알려져 있고 문헌[Cell, 159: 428-439 (2014)]에 개시된 방법이다.
조건 A 및 조건 C에 의해 6기까지 분화된 세포를 50 mL 원추형 튜브 내에서 배지로부터 단리하고, 이어서 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고 추가 1.2 g/L의 중탄산나트륨 및 0.2% w/v FAF-BSA로 보충된 MCDB-131 배지로 2회 세척하였다. 이어서, 세척 배지 중에 세포를 재현탁시키고, NSG 마우스(N=7)의 신장 피막 아래에 이식 전에 대략 5시간 동안 실온에서 유지하였다. 동물을 생착 후 4주째, 8주째, 10주째, 및 14주째에 혈당 및 C-펩티드 수준에 대해 모니터링하였다. 동물을 하룻밤 절식시키고, 글루코스의 복막내 주사를 제공하고, IP 글루코스 볼루스 주사 이후("후") 60분째에 후안와동 채혈을 통해 혈액을 채취하였다(표 III). 가장 일찍이 측정된 시점에서(생착 후 4주째에), 이식편은 검출가능한 수준의 C-펩티드의 분비에 의해 측정된 바와 같이 기능하였다(표 IV). 더욱이, C-펩티드 수준이 4주째부터 14주째까지 상승되었다.
이식 후 10주째에, 글루코스 볼루스 주사 직전("전")에 그리고 직후("후")에 각각의 동물을 채혈하였다. 참고로, "전" C-펩티드 수준보다 더 높은 "후" C-펩티드 수준은 글루코스 자극 인슐린 분비를 나타낼 것이다. 조건 C에 의해 분화된 이식편으로 처리된 동물 7 마리 중 6 마리가 더 높은 "후" C-펩티드 수준을 나타내었으며, 조건 A에 의해 분화된 이식편으로 처리된 동물 7 마리 중 3 마리가 더 높은 "후" C-펩티드 수준을 갖는 것으로 확인되었다.
[표 I]
[표 II]
[표 IIIA]
[표 IIIB]
[표 IV]
실시예 2
이 실시예는 반응기 내의 피드백 pH 및 DO 센서를 통한 배지 pH 및 용존 산소 농도의 직접 컴퓨터 제어를 가능하게 한 교반-탱크 폐쇄 루프에서 PDX1을 발현하는 세포들의 집단으로부터의 인슐린 발현 세포의 형성을 보여준다. 이 과정으로부터 생성된 인슐린 양성 세포는 PDX1 발현을 유지하고 NKX6.1을 동시발현하였다. 3기부터 5기까지 4개의 상이한 조건(A, B, C, 및 D)에 노출된 세포로부터 인슐린 양성 세포를 생성하였다(표 V). 조건 C(3기의 시작 시점에서 pH 7.0 및 200만개/mL의 세포 농도)에 따라 분화된 세포를 면역-손상된 마우스의 신장 피막 내로 이식하였을 때, 이식편은 4주의 생착 이내에 검출가능한 혈액 수준의 인간 C-펩티드를 생성한 것으로 관찰되었다.
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(WA01 세포, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 WiCell Research Institute)를 둥근 응집된 클러스터로서 4회 계대 이상 동안 동적 현탁 상태로 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 E8™ 중에서 성장시켰다. 이어서, 클러스터를 하기 방법에 따라 단일 세포로서 그리고 2 내지 10개의 세포들의 클러스터로서 동결시켰다. 응집된 클러스터로의 대략 6억개 내지 10억개 세포를 원심분리 튜브에 전달하고, 100 mL의 1X DPS -/-를 사용하여 세척하였다. 세척 후에, 이어서 50 부피% StemPro®Accutase® 효소 및 50 부피% DPBS -/-의 30 mL 용액을 풀어진 세포 응집체 펠릿에 첨가함으로써 세포 응집체를 효소적으로 해체시켰다. 세포 클러스터를 1 내지 3회 상하로 피펫팅하고, 이어서 실온에서 대략 4분 동안 간헐적으로 와동시킨 다음, 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 이어서, 세포 펠릿을 교란시키지 않으면서 가능한 한 완전히 Accutase® 상층액을 흡인하였다. 이어서, 원심분리 튜브를 대략 4분 동안 단단한 표면에 대고 탭핑하여, 클러스터를 단일 세포 및 2 내지 10개의 세포로 구성된 클러스터로 해체시켰다. 4분 후에, 세포를 10 μM Y-27632(미국 뉴욕주 파밍데일 소재의 Enzo Life Sciences, Inc.; 카탈로그 번호 ALX-270-333) 및 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 100 mL의 E8™ 배지 중에 재현탁시키고, 80 내지 200 rcf로 5 내지 12분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상층액을 흡인하고, 차가운(4℃ 이하) Cryostor® 세포 보존 배지 CS10을 적가하여 mL당 1억개 내지 1억5000만개 세포의 최종 농도를 달성하였다. 이 세포 용액을 2 mL 냉동 바이알에 분취하는 동안 빙조 중에서 유지하고, 이후에 세포를 프로그램화 동결기(CryoMed™ 34L 프로그램화 동결기)를 사용하여 동결시켰는데, 이는 하기와 같다. 챔버를 4℃로 냉각시키고, 샘플 바이알 온도가 6℃에 도달할 때까지 이 온도를 유지하고, 이어서 샘플이 -7℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 분당 2℃로 낮추고, 이 시점에서 챔버가 -45℃에 도달할 때까지 챔버를 20℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도가 -25℃에 도달할 때까지 그 온도를 10℃/min으로 짧은 시간에 상승되게 한 다음, 샘플 바이알이 -40℃에 도달할 때까지 챔버를 0.8℃/min으로 추가로 냉각시켰다. 이어서, 챔버가 -100℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 10℃/min으로 냉각시킨 다음, 이 시점에서 챔버가 -160℃에 도달할 때까지 챔버를 35℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도를 -160℃에서 적어도 10분 동안 유지하고, 이후에 바이알을 가스상 액체 질소 저장소에 옮겼다. 이어서, 고농도의 이들 냉동보존된 단일 세포를 중간/인-프로세스 시드 재료 ISM으로서 사용하였다.
ISM의 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내고, 해동시키고, 이를 사용하여 3 리터 유리 교반 현탁 탱크 DASGIP 생물반응기에 접종하였다. 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내어서 120초 동안 37℃ 수조에 신속히 옮겨두어서 해동시켰다. 이어서, 바이알을 BSC로 이동시키고, 해동된 내용물을 2 mL 유리 피펫을 통해 50 mL 원추형 튜브에 옮겼다. 이어서, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Rho 키나제 억제제 Y-27632가 보충된 10 mL의 E8™ 배지를 튜브에 적가하였다. 세포를 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 튜브로부터의 상층액을 흡인하고, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 10 mL의 신선한 E8™ 배지를 첨가하고, 세포를 함유하는 부피를 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 450 mL의 E8™ 배지가 담긴 배지 전달병(Cap2V8) 내로 피펫팅하였다. 이어서, 병의 내용물을 연동 펌프를 사용하여 멸균 C-Flex® 튜빙 웰드를 통해 생물반응기 내로 직접 펌핑하였다. 생물반응기에는 70 rpm으로 교반된, 37℃로 예비가온된, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 1000 mL의 E8™ 배지가 준비되어 있었는데, 이때 30%의 용존 산소 설정점(공기 O2, 및 N2가 조절됨), 및 5%의 제어된 CO2 부분 압력을 가졌다. 반응기에 접종하여 0.225 x 106개 세포/mL(농도 범위: 0.2 내지 0.5 x 106개 세포/mL)의 목표 농도를 제공하였다.
일단 반응기에 접종하면, 세포는 교반 반응기 내에 둥근 응집된 클러스터를 형성하였다. 배양물 중에 있은 지 24시간 후에, 원래 부피의 80% 넘게 제거하고 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 1.5 L의 E8™ 배지(신선한 배지)를 다시 첨가함으로써 배지를 부분 교체하였다. 이러한 배지 교체 과정을 접종 후 48시간째에 반복하였다. 둥근 응집된 클러스터로서 현탁 배양물 중에 있은 지 3일 후에, 유도된 분화가 개시되었다. 분화를 개시하기 위하여, 폐배지를 제거하고, 분화 배지를 생물반응기 내로 펌핑하고, 하기에 기재된 바와 같은 배지 교체 및 분화 프로토콜을 사용하여 이 과정의 경과에 걸쳐 교체하였다.
1기(3일):
1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스(물 중 45%); 및 1:50,000 희석의 ITS-X가 보충된 MCDB-131 배지를 사용하여 기본 배지를 제조하였다. 100 ng/ml의 GDF8 및 3 μM MCX 화합물이 보충된 1.5 L의 기본 배지 중에서 1일 동안 세포를 배양하였다. 24시간 후에, 폐배지를 제거하고, 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 신선한 1.5 L의 기본 배지를 반응기에 첨가하였다. 세포를 추가의 배지 교체 없이 48시간 동안 유지하였다.
2기(3일):
1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:50,000 희석의 ITS-X가 보충된 MCDB-131 배지를 사용하여 기본 배지를 제조하였다. 1기의 완료 후에, 1기 폐배지를 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 1.5 L의 2기 기본 배지로 대체하여, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하였다. 배지 교체 후 48시간째에, 폐배지를 다시 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 1.5 L의 신선한 2기 기본 배지로 교체하였다.
3기(3일):
2기의 완료 시점에서, 그리고 배지 교체 직전에, 9억개의 세포를 멸균 웰드 및 연동 펌프를 통해 3 리터 반응기로부터 회수하였다. 이어서, 3 리터 반응기 내의 배지를 앞서 기재된 바와 같이 교체하여 하기 3기 배지로 대체하였다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 MCDB-131 배지. 3기 배지에 50 ng/mL의 FGF-7; 100 nM LDN-193189; 2 μM RA; 0.25 μM SANT-1; 및 400 nM TPB를 보충하였다. 이어서, 회수된 세포를 멸균 원추형 튜브 내에서 스핀 다운하고, 폐배지를 제거하고, 세포를 3기 배지 및 상층액 중에 재현탁시켰다. 이어서, 이들 세포를 멸균 웰드 및 연동 펌프를 통해 DASGIP™로부터의 4개의 별개의 0.2 리터 유리 교반 현탁 탱크 반응기(반응기 A, 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D)에 옮겼다. 0.2 리터 생물반응기 및 3 리터 대조 생물반응기 내의 세포를 3기부터 5기까지 동안 도 14 및 표 V에 나타낸 바와 같이 세포 농도 및 배지 pH의 상이한 조합에 노출시켰다. 배지 교체 후 24시간째에, 폐배지를, 대조 반응기 및 반응기 A 내지 반응기 D 각각에서, LDN-193189를 제외하고는 상기 보충제를 함유하는 300 mL의 신선한 3기 배지로 다시 대체하였다. 세포를 48시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
[표 V]
4기(3일):
3기의 완료 후에, 폐배지를 제거하고, 150 mL의 하기 4기 배지로 대체하였다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 150 mL의 MCDB-131 배지. 배지에 0.25 μM SANT-1 및 400 nM TPB를 보충하였다. 4기 개시 후 48시간째에, 3.2 mL/L의 45% 글루코스 용액(8 mM 글루코스 볼루스)을 각각의 생물반응기에 첨가하고, 세포를 추가 24시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
5기(7일):
1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 1.754 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 20 mM 글루코스; 1:200 희석의 ITS-X; 250 μL/L의 1 M 아스코르브산; 및 10 mg/L의 헤파린(Sigma Aldrich; 카탈로그 번호 H3149-100KU)으로 보충된 150 mL의 MCDB-131 배지 베이스를 사용하여 각각의 생물반응기에 대한 5기 기본 배지를 제조하였다. 4기의 완료 후에, 각각의 생물반응기 내의 폐배지를 1 μM T3, 10 μM ALK5 억제제 II, 1 μM 감마 세크레타제 억제제 XXI(EMD Millipore; 카탈로그 번호 565790); 20 ng/mL의 베타셀룰린; 0.25 μM SANT-1; 및 100 nM RA가 보충된 150 mL의 5기 기본 배지로 교체하였다. 5기의 개시 후 48시간째에, 폐배지를 제거하고, 150 mL의 동일한 신선한 배지 및 보충제로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 제거하고, 1 μM T3, 10 μM Alk5 억제제 II, 20 ng/ml의 베타셀룰린 및 100 nM RA가 보충된 5기 기본 배지로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 다시 교체하여 동일한 신선한 배지 및 보충제로 대체하였다. 5기의 종료를 나타내는 24시간 후에, 생성된 세포를 특징규명 및 분석을 위하여 처리하였다.
분화 과정 전체에 걸쳐, pH 및 용존 산소("DO")에 대한 실시간 연속 모니터링에 더하여, 배지 샘플을 일일 기준으로 반응기로부터 수집하였다. 매일의 종료 시점에서의 폐배지를 NOVA 생물분석기에 의해 분석하였다. 샘플을 또한 세포수(Nucleocounter 100), mRNA 발현(qRT-PCR), 및 단백질 발현(유세포측정 및 형광 면역-조직화학)에 대해 분석하였다.
도 15a 및 도 15b는 3기 및 4기의 경과에 걸쳐 반응기 1, 반응기 A, 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에 대한 배지 중에서의 pH(도 15a) 및 용존 산소 수준(도 15b)의 연속 모니터링 그래프를 나타낸다. 도 16a 및 도 16b는 3기 및 4기에서의 매 분화일의 종료 시점에서 폐배지 샘플로부터 획득된 NOVA® BioProfile FLEX 분석기로부터의 데이터를 나타낸다(도 16a - 글루코스 농도; 도 16b - 락테이트 농도). 도 17은 반응기 및 조건 A, B, C, 및 D(BxA, BxB, BxC, 및 BxD로도 열거됨)에 대한 세포 카운트 트렌드 라인을 나타낸다. 이들 데이터는, pH 7.0으로 설정된 반응기에서는, 3기의 경과에 걸쳐 세포 손질이 존재함을 보여주는데, 이러한 세포 손실은 낮은 pH(생물반응기 C 및 생물반응기 D) 설정점과 상관된다. 그러나, mL당 2x106개 세포로 시딩된 반응기 C는 4기의 종료까지 세포 집단을 회수한 반면, pH가 7.0이지만 mL당 1x106개 세포의 시딩을 가진 반응기 D는 그렇지 않았다. 또한, pH가 7.4이고 각각 mL당 2x106개 및 1.0x106개 세포로 시딩된 반응기 A 및 반응기 B는 4기에서 유의한 세포 손실을 나타내었지만, 이들 둘 모두는 3기까지 세포 농도를 유지하였다(도 17). 이들 데이터는, 3기에서, mL당 세포수가 약 1.5x106개 이상, 바람직하게는 mL당 세포수가 약 2.0x106개 이상인 농도와 조합하여 7.0의 pH 설정점의 사용이, 3기에서 pH 7.4로 유지된 세포와 비교하여, 후속 분화 단계 전체에 걸쳐 더 높은 세포 농도를 촉진시킴을 나타낸다.
글루코스 및 락테이트의 일일 폐배지 수준에 의해 세포 농도에 있어서의 효과를 반영하였다. 반응기 C 및 반응기 D 둘 모두는, 각각 이들의 농도와 쌍을 이룬 pH 7.4 대조군, A 및 B보다 매일의 종료 시점에서 더 많은 잔류 글루코스 및 더 적은 락테이트를 가졌다. 이들 결과는 반응기 C 및 반응기 D가 3기 동안 더 적은 대사 활성을 가짐을 나타내었다. 그러나, 반응기 C가 4기까지 진행됨에 따라, 잔류 글루코스 수준은 4기의 첫째 날 및 둘째 날의 종료까지 반응기 A에서의 것과 비견되었지만, 락테이트 수준은 반응기 C에서 더 낮게 유지되었다. 이들 데이터로부터, 반응기 C에서의 세포가 반응기 A에서의 것보다 더 많은 분화된, 성숙된, 그리고 더 적은 해당 표현형(glycolytic phenotype)을 채택하기 시작하였다는 것을 추론할 수 있다.
3기의 종료 시점에서, 1x106개(반응기 D) 또는 2x106개(반응기 C) 세포/mL의 출발 농도에서 pH 7.0으로 유지된 거의 모든 세포는 내배엽 전사 인자(FOXA2) 및 췌장 특이적 전사 인자(PDX1) 둘 모두를 발현하는 것으로 관찰되었는데, 이는 1M(반응기 B) 또는 2M(반응기 A)의 출발 밀도에서 pH 7.4로 유지된 세포와 마찬가지인 것으로, 이는 낮은 pH로 처리된 세포가 췌장 내배엽 특수화를 유지함을 나타낸다. 더욱이, 5개의 시험된 조건 모두에서, NKX6.1을 발현하는 세포의 백분율은 3기의 종료 시점에서 유사하게 낮았다(범위: 5.4 내지 13.6%). pH 7.4(반응기 A 및 반응기 B와, 대조 반응기, "1")로 유지된 세포는 3기의 종료 시점에서 NEUROD1을 발현하기 시작하였으며, 한편 pH 7.0(반응기 C 및 반응기 D)으로 유지된 세포는 유세포측정에 의해 측정된 바와 같이 감소된 수준의 NEUROD1 발현을 나타내었다(표 Vi). 4기의 개시 시점에서, 반응기 C 및 반응기 D에 대한 pH 설정점을 7.4로 복귀시켰다(도 14 및 도 15a). 3일 후에, 4기의 종료 시점에서, 각각의 반응기로부터의 샘플을 NKX6.1, NEUROD1, PDX1, FOXA2, CDX2, 및 Ki67의 발현에 대해 유세포측정에 의해 분석하였다. 3기에서 pH 7.0(반응기 C 및 반응기 D)으로 유지된 세포는, 세포내 유세포분석에 의해 검출된 바와 같이, pH 7.4로 설정된 반응기(생물반응기 1, 생물반응기 A, 및 생물반응기 B)에서 유지된 세포와 비교하여, 4기의 종료 시점에서 사실상 더 많은 NKX6.1 양성 세포 및 활성 세포 주기에 있는 세포(Ki67 양성)를 갖는 것으로 관찰되었으며, 이는 표 VI에 요약되어 있는 바와 같다.
유세포측정에 의해 세포 단백질 발현을 결정하는 것에 더하여, 분화 과정의 3기 및 4기 전체에 걸친 샘플을 OpenArray® qRT-PCR을 사용하여 유전자 패널의 mRNA 발현에 대해 시험하였다. 도 18a 내지 도 18n은, 4기의 둘째 날까지 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 나타낸다: PDX1(도 18a); NKX6.1(도 18b); PAX4(도 18c); PAX6(도 18d); NeuroG3(NGN3)(도 18e); ABCC8(도 18f); 크로모그라닌-A(도 18g); 크로모그라닌-B(도 18h); ARX(도 18i); 그렐린(도 18j); IAPP(도 18k); PTF1a(도 18l); NEUROD1(도 18m); 및 NKX2.2(도 18n).
도 18a에 나타낸 바와 같이, 낮은(7.0) 또는 표준(7.4) pH 분화 조건 둘 모두 하에서, 세포는 세포가 췌장 운명을 채택함에 따라 3기 전체에 걸쳐 유사한 수준의 PDX1을 발현하였다. NKX6.1 발현의 상대적인 부재 하에서, pH 7.4 반응기로부터의 세포가 3기까지 진행됨(반응기 BX A 및 반응기 BX B)에 따라(도 18b), 이들은 조숙 내분비 췌장 세포 발달에 필요하고 그에 특징적인 다수의 유전자, 즉 도 18c, 도 18d, 도 18e, 도 18m, 도 18n, 도 18i, 도 18j, 도 18g, 및 도 18h에 나타낸 바와 같은 PAX4, PAX6, NGN3, NEUROD1, NKX2.2, ARX, 그렐린, CHGA 및 CHGB를 발현하기 시작하였다. 낮은 NKX6.1 발현과 조합된 유전자 발현의 이러한 패턴은 일부 조숙(비-베타 세포) 내분비 췌장 특수화를 나타내었다.
대조적으로, OpenArray® qRT-PCR에 의해 측정될 때 반응기 C 및 반응기 D(3기 pH 7.0)로부터의 세포는, 반응기 A 및 반응기 B와 비교할 때, 3기에서 내분비 발달에 필요한 전사 인자(PAX4, PAX6, NGN3, NEUROD1, NKX2.2, 및 ARX)를 유의하게 더 낮은 수준으로 발현하였다(도 18c, 도 18d, 도 18e, 도 18m, 도 18n, 및 도 18i). 더욱이, 반응기 C 및 반응기 D로부터의 세포는, 4기의 첫째 날에 NKX6.1(베타 세포 형성에 필요한 전사 인자)의 증가를 가진 후, 4기의 둘째 날에 PAX6, NEUROD1, 및 NKX2.2의 증가된 발현이 이어지는 것으로 관찰되었다(도 18d, 도 18m, 도 18n, 및 도 18b). 이들 qRT-PCR 데이터는, 3기에서 pH 7.0으로 유지된 세포의 경우, 3기 및 4기의 종료 시점에서 NEUROD1을 발현하는 세포의 감소된 백분율 및 NKX6.1을 발현하는 세포의 증가된 수를 입증한 유세포측정 결과와 상관되었다(표 VI, 도 19, 및 도 20). 이들 데이터는 3기에서의 낮은 pH(7.0)가 조숙(비-베타 세포) 내분비 췌장 특수화를 억제하고, 베타 세포를 형성하는 데 필요한 전사 인자 발현 서열을 촉진함을 시사한다.
3기에서의 감소된 배지 pH를 통해 비-베타 세포 내분비 췌장 특수화에 관여하는 유전자의 지연 또는 감소된 발현의 효과는 분화의 5기까지 지속되었다. NGN3 유전자 발현은 적절한 내분비 호르몬 세포 발달을 위하여 발달 중인 췌장에 필요하고, 조건 A(pH 7.4) 및 조건 C(3기에서 pH 7.0) 둘 모두에서, 감마 세크레타제 억제제를 함유하는 5기 배지에 의한 세포의 처리에 따라 NGN3의 발현을 유도하였다. 그러나, 조건 C 세포에 따라 분화된 세포의 경우, 피크 NGN3 발현(도 21a)에 있어서의 1일의 지연이 확인되었다. 더욱이, NGN3 발현에 의해 유도 또는 조절된 다수의 유전자가 또한 조건 C(3기에서 pH 7.0)에 의해 분화된 세포에서 지연되었다. 내분비 특이적 유전자, 예컨대 NEUROD1(도 21b), NKX2.2(도 21c), ARX(도 21d), 크로모그라닌 A/CHGA(도 21e), 및 PCSK2(도 21f)는 모두 NGN3과 유사하게 발현에 있어서 지연(lag)을 나타내었다. 그러나, 베타 세포 - ABCC8(도 21g), G6CP2/글루코스 6 포스파타제(도 21h), 인슐린/INS(도 21i), 섬1/ISL1(도 21j), 글루코스 수송체 1/SLC2A1(도 21k), 아연 수송체/SLC30A8(도 21l), 및 NKX6.1(도 21m)과 특이적으로 관련된 유전자는 조건 A와 조건 C로부터의 세포에서 동일한 시간에 그리고 동일한 크기로 출현된다. 더욱이, 도 21n에 나타낸 바와 같이 pH 7.4(반응기 A)로 유지된 세포와 비교하여, 반응기 C(3기에서 pH 7.0)에서 분화된 세포에서 5기까지 UCN3 - 기능적 베타 세포의 적절한 성숙과 관련된 유전자 - 의 발현이 증가되었는데, 이는 3기에서의 pH 7.0에 대한 노출이 이 과정에서 베타-유사 세포로의 이후 단계의 성숙을 촉진시킴을 나타낸다.
UCN3 발현의 증가에 더하여, qRT-PCR에 의한 베타-세포 특이적 전사 인자, MAFA의 발현의 증가가 또한 관찰되었다. MAFA 발현은, 감마 세크레타제 억제제의 첨가 후에, 5기 1일째에 단일 프라이머-프로브 qRT-PCR 검정에 의해 시험된 모든 3개의 조건(A, B, 및 C)에서 최초로 검출가능하였다(도 21o). 4기 3일째부터 5기 5일째까지, MAFA의 검출가능한 mRNA 발현은 조건 A 또는 조건 B에서보다 조건 C에서 더 높았다. MAFA의 단백질 발현이 면역-형광 세포화학에 의해 6기 종료 시점에서 확인되었다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 20x 대물렌즈에 의해 획득된 현미경 사진은 핵 MAFA에 대한 면역-형광 염색 및 세포질 인슐린 염색을 보여준다.
이들 유전자 발현 패턴은, 베타 세포 특이적 전사 인자의 발현 전에, 3기에서의 낮은 pH에 대한 노출을 통한 조숙 내분비 특수화의 억제가 조숙 비-베타 세포 운명 채택을 감소시킴으로써 베타 세포 유사 운명으로의 이후의 분화를 촉진시킬 수 있음을 시사한다. 유세포측정 결과는 이러한 가설을 뒷받침하였는데, 반응기 C에서 분화된 세포가, NKX6.1/인슐린 동시-양성 세포의 증가와 함께(21.3%, 조건 C vs. 15.6%, 조건 A), 조건 A 세포(20.3%, 표 VI)와 비교할 때, 증가된 백분율의 인슐린 양성 세포(27.3%, 표 VI)를 가졌기 때문이다.
흥미롭게도, 3기에서의 낮은 pH 및 베타-세포 유사 운명으로의 이후의 분화는 다른 췌장 내분비 운명에 특징적인 유전자 발현을 억제하지 않았다. 5기의 종료 시점에서 검정된 샘플에서, qRT-PCR에 의한 유전자 발현이 내분비 호르몬인 췌장 폴리펩티드("PPY"), 그렐린, 글루카곤("GCG"), 및 소마토스타틴("SST")에 대해 관찰되었다(도 21p - PPY, 도 21q - 그렐린, 도 21r - GCG, 및 도 21s - SST). 이러한 관찰은, 분화된 세포가 팬-내분비 전사 인자, NEUROD1(조건 C의 경우 63.1% NEUROD1 양성, 및 세포의 56.1%가 NEUROD1/NKX6.1 동시-양성; 조건 A의 경우 51.6% NEUROD1 양성, 및 43% NEUROD1/NKX6.1 동시-양성)에 대해 양성임을 보여주는 유세포측정 데이터에 의해 추가로 뒷받침되었으며; 이는 표 VII 및 도 23에 나타낸 바와 같다.
5기의 일곱째 날의 종료 시점에서, 3기에서 pH 7.0의 설정점(조건 C)을 사용하여 분화된 5x106개의 세포를 50 mL 원추형 튜브 내에서 배지로부터 단리하고, 이어서 총 2.4 g/L의 중탄산나트륨 및 0.2% w/v FAF-BSA를 함유하는 MCDB-1313 배지로 2회 세척하였다. 세척 배지 중에 세포를 재현탁시키고, NSG 마우스의 신장 피막 아래에 이식 전에 대략 5시간 동안 실온에서 유지하였다. 이식 후 4주째인 가장 일찍이 측정된 시점에서, 하룻밤 절식, 복막내 글루코스 주사, 및 IP 글루코스 볼루스 후 60분째에 후안와동 채혈이 행해진 후에, 0.3 ng/mL의 평균 인간 C-펩티드 혈액 수준이 관찰되었다(N=7 마리의 동물).
[표 VI]
[표 VII]
실시예 3
이 실시예는 교반 탱크형의 무균적으로 폐쇄된 생물반응기에서 PDX1을 발현하는 세포들의 집단으로부터의 인슐린 발현 세포의 형성을 보여준다. 3기 동안 3개의 조건 중 하나의 조건에 노출된 세포로부터 인슐린 양성 세포를 생성하였다. 3개의 조건: 반응기 B - 3기 전체에 걸쳐 pH 7.0(레틴산에 의한 처리); 반응기 C - 3기의 첫째 날에 pH 7.4, 이어서 3기의 2일째 및 3일째에 대해 pH 7.0; 또는 반응기 D - 3기 전체에 걸쳐 pH 7.4. 3기에서의 pH 7.0에 대한 더 긴 노출은 Ki67을 감소시키고, NEUROD1, NKX6.1, PAX6, 섬1, 및 PDX1/NKX6.1 - 나중의 분화 과정에서의 단백질 - 과 동시-양성인 NEUROD1의 발현을 증가시키는 것으로 관찰되었다.
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(WA01 세포, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 WiCell Research Institute)를 둥근 응집된 클러스터로서 4회 계대 이상 동안 동적 현탁 상태로 0.5% w/v의 무지방산 소혈청 알부민이 보충된 Essential 8™ 배지 중에서 성장시켰다. 이어서, 클러스터를 하기 방법에 따라 단일 세포로서 그리고 2 내지 10개의 세포들의 클러스터로서 동결시켰다. 응집된 클러스터로의 대략 6억개 내지 10억개 세포를 원심분리 튜브에 전달하고, 100 mL의 1X DPS -/-를 사용하여 세척하였다. 세척 후에, 이어서 50 부피% StemPro®Accutase® 효소 및 50 부피% DPBS -/-의 30 mL 용액을 풀어진 세포 응집체 펠릿에 첨가함으로써 세포 응집체를 효소적으로 해체시켰다. 세포 클러스터를 1 내지 3회 상하로 피펫팅하고, 이어서 실온에서 대략 4분 동안 간헐적으로 와동시킨 다음, 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 이어서, 세포 펠릿을 교란시키지 않으면서 가능한 한 완전히 Accutase® 상층액을 흡인하였다. 이어서, 원심분리 튜브를 대략 4분 동안 단단한 표면에 대고 탭핑하여, 클러스터를 단일 세포 및 2 내지 10개의 세포로 구성된 클러스터로 해체시켰다. 4분 후에, 세포를 10 μM Y-27632 및 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 100 mL의 E8™ 배지 중에 재현탁시키고, 80 내지 200 rcf로 5 내지 12분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상층액을 흡인하고, 차가운(4℃ 이하) Cryostor® 세포 보존 배지 CS10을 적가하여 mL당 1억개 내지 1억5000만개 세포의 최종 농도를 달성하였다. 이 세포 용액을 2 mL 냉동 바이알(Corning)에 분취하는 동안 빙조 중에서 유지하고, 이후에 세포를 프로그램화 CryoMed™ 34L 동결기를 사용하여 동결시켰는데, 이는 하기와 같다. 챔버를 4℃로 냉각시키고, 샘플 바이알 온도가 6℃에 도달할 때까지 이 온도를 유지하고, 이어서 샘플이 -7℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 분당 2℃로 낮추고, 이 시점에서 챔버가 -45℃에 도달할 때까지 챔버를 20℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도가 -25℃에 도달할 때까지 그 온도를 10℃/min으로 짧은 시간에 상승되게 한 다음, 샘플 바이알이 -40℃에 도달할 때까지 챔버를 0.8℃/min으로 추가로 냉각시켰다. 이어서, 챔버가 -100℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 10℃/min으로 냉각시킨 다음, 이 시점에서 챔버가 -160℃에 도달할 때까지 챔버를 35℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도를 -160℃에서 적어도 10분 동안 유지하고, 이후에 바이알을 가스상 액체 질소 저장소에 옮겼다. 이어서, 고농도의 이들 냉동보존된 단일 세포를 ISM으로서 사용하였다.
ISM 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내고, 해동시키고, 이를 사용하여 3 리터 유리 교반 현탁 탱크 생물반응기(DASGIP)에 mL당 29만5000개의 생존가능한 세포의 시딩 농도로 접종하였다. 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내어서 120초 동안 37℃ 수조에 신속히 옮겨두어서 해동시켰다. 이어서, 바이알을 BSC로 이동시키고, 해동된 내용물을 2 mL 유리 피펫을 통해 50 mL 원추형 튜브에 옮겼다. 이어서, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Rho 키나제 억제제 Y-27632가 보충된 10 mL의 E8™ 배지를 튜브에 적가하였다. 세포를 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 튜브로부터의 상층액을 흡인하고, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 10 mL의 신선한 E8™ 배지를 첨가하고, 세포를 함유하는 부피를 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 450 mL의 E8™ 배지가 담긴 배지 전달병(Cap2V8®) 내로 피펫팅하였다. 이어서, 병의 내용물을 연동 펌프를 사용하여 멸균 C-Flex® 튜빙 웰드를 통해 생물반응기 내로 직접 펌핑하였다. 생물반응기에는 70 rpm으로 교반된, 37℃로 예비가온된, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 1000 mL의 E8™ 배지가 준비되어 있었는데, 이때 30%의 용존 산소 설정점(공기 O2, 및 N2가 조절됨), 및 5%의 제어된 CO2 부분 압력을 가졌다. 반응기에 접종하여 0.225 x 106개 세포/mL(농도 범위: 0.2 내지 0.5 x 106개 세포/mL)의 목표 농도를 제공하였다.
일단 반응기에 접종하면, 세포는 교반 반응기 내에 둥근 응집된 클러스터를 형성하였다. 배양물 중에 있은 지 24시간 후에, 원래 부피의 80% 넘게 제거하고 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 1.5 L의 E8™ 배지(신선한 배지)를 다시 첨가함으로써 배지를 부분 교체하였다. 이러한 배지 교체 과정을 접종 후 48시간째에 반복하였다. 둥근 응집된 클러스터로서 현탁 배양물 중에 있은 지 3일 후에, E8™ 폐배지를 제거하고 분화 배지를 첨가함으로써 3 리터 반응기 내에서의 분화가 개시되었다. 분화 프로토콜이 하기에 기재되어 있다.
1기(3일):
반응기를 37℃의 온도로 설정하고, 70 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 10%의 용존 산소 설정점으로 설정하고(공기, 산소, 및 질소가 조절됨), CO2 조절을 통해 pH를 7.4로 설정하였다. 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스(물 중 45%); 및 1:50,000 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지를 사용하여 기본 배지를 제조하였다. 100 ng/ml의 GDF8 및 3 μM MCX 화합물이 보충된 1.5 L의 기본 배지 중에서 1일 동안 세포를 배양하였다. 24시간 후에, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하고, 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 신선한 1.5 L의 기본 배지를 반응기에 첨가하였다. 세포를 추가의 배지 교체 없이 48시간 동안 유지하였다.
2기(3일):
반응기를 37℃의 온도로 설정하고, 70 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 30%의 용존 산소 설정점으로 설정하고(공기, 산소, 및 질소가 조절됨), CO2 조절을 통해 pH를 7.4로 설정하였다. 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:50,000 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지를 사용하여 기본 배지를 제조하였다. 1기의 완료 후에, 1기 폐배지를 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 1.5 L의 2기 기본 배지로 대체하여, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하였다. 배지 교체 후 48시간째에, 폐배지를 다시 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 1.5 L의 신선한 2기 기본 배지로 교체하였다.
3기(3일):
2기의 완료 시점에서, 그리고 배지 교체 직전에, 모든 세포를 멸균 웰드 및 연동 펌프를 통해 3 리터 반응기로부터 회수하였다. 세포를 계수하고, 중력 침강시키고, 200만개 세포/mL의 정규화된 분포로 하기의 3기 배지 중에 재현탁시켰다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지. 3기 배지에 50 ng/mL의 FGF-7; 100 nM LDN-193189; 2 μM RA; 0.25 μM SANT-1; 및 400 nM TPB를 보충하였다. 세포를 멸균 웰드 및 연동 펌프를 통해 3개의 0.2 리터 유리 교반 현탁 탱크 DASGIP™ 생물반응기 B, C 및 D(BxB, BxC, 및 BxD로도 지칭됨) 내로 200만개 세포/mL 세포 농도의 정규화된 분포로 시딩하였다. 이들 반응기를 37℃의 온도로 설정하고, 55 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 30%의 용존 산소 설정점으로 설정하고(공기, 산소, 및 질소가 조절됨), 3기에 대한 pH를 표 VIII에 열거된 바와 같이 3개의 상이한 배지 pH 변수로 설정하였다. 배지 교체 후 24시간째에, 폐배지를, 반응기 B 내지 반응기 D 각각에서, LDN-193189를 제외하고는 상기 보충제를 함유하는 150 mL의 신선한 3기 배지로 다시 대체하였다. 이후에, 세포를 3기가 종료될 때까지 48시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
[표 VIII]
4기(3일):
3기의 완료 시점에서, 폐배지를 제거하고, 각각의 생물반응기에서 150 mL의 하기 4기 배지로 대체하였다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 150 mL의 MCDB-131 배지. 배지에 0.25 μM SANT-1 및 400 nM TPB를 보충하였다. 반응기를 37℃로 유지하고, 55 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 30%의 용존 산소 설정점으로 조절하고(공기, 산소, 및 질소가 조절됨), CO2 조절을 통해 7.4의 pH 설정점으로 조절하였다. 4기 개시 후 48시간째에, 3.2 mL/L의 45% 글루코스 용액(8 mM 글루코스 볼루스)을 각각의 생물반응기에 첨가하고, 세포를 추가 24시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
5기(7일):
1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 1.754 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 20 mM 글루코스; 1:200 희석의 ITS-X; 250 μL/L의 1 M 아스코르브산; 및 10 mg/L의 헤파린(Sigma Aldrich; 카탈로그 번호 H3149-100KU)으로 보충된 150 mL의 MCDB-131 배지 베이스를 사용하여 각각의 생물반응기에 대한 5기 기본 배지를 제조하였다. 4기의 완료 후에, 각각의 생물반응기 내의 폐배지를 1 μM T3, 10 μM ALK5 억제제 II, 1 μM 감마 세크레타제 억제제 XXI; 20 ng/mL의 베타셀룰린; 0.25 μM SANT-1; 및 100 nM RA가 보충된 150 mL의 5기 배지로 대체하였다. 5기의 개시 후 48시간째에, 폐배지를 제거하고, 동일한 신선한 기본 배지 및 보충제로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 다시 교체하여, 감마 세크레타제 XXI 및 SANT를 제외시킨 것을 제외하고는 동일한 신선한 배지 및 보충제로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 다시 교체하여 동일한 신선한 배지 및 보충제로 대체하고, 세포를 5기의 종료까지 추가 24시간 동안 배양하였다. 5기 전체에 걸쳐, 30% DO 및 pH 7.4를 유지하였다.
분화 과정 전체에 걸쳐, pH 및 DO에 대한 실시간 연속 모니터링에 더하여, 배지 샘플을 일일 기준으로 반응기로부터 수집하였다. 샘플을 세포수, mRNA 발현, 및 단백질 발현에 대해 분석하였다.
도 24a 및 도 24b는 3기, 4기 및 5기의 경과에 걸쳐 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에 대한 배지 중에서의 pH(도 24a) 및 용존 산소 수준(도 24b)의 연속 모니터링 그래프를 나타낸다. 이들 데이터는, 3기 전체에 걸쳐 pH 7.0으로 설정된 반응기 B에서의 세포가, 반응기 C 및 반응기 D와 비교하여 더 낮은 수준의 용존 산소(도 24b)에 의해 측정된 바와 같이, 4기 및 5기에서 증가된 산소 소비를 나타내었음을 보여준다. 더욱이, 반응기 B, 반응기 C, 및 반응기 D에서의 세포 농도가 5기까지 비견된 바와 같이(도 25 및 표 VIII), 산소 소비의 차이는 세포 밀도의 유의한 차이에 기인되지 않았다. 이는, 3기 동안 pH 7.0으로 처리된 반응기 B에서의 세포가, 4기 종료까지 (3기 동안 각각 1일 또는 3일이 pH 7.4에 노출된) 반응기 C 또는 반응기 D로부터의 세포보다 더 성숙된 그리고 산소 소비적인 표현형을 채택하기 시작하였음을 시사한다.
3기의 완료 시점에서 그리고 다시 4기의 종료 시점인 3일 후에, 각각의 반응기로부터의 샘플을 단백질 발현에 대한 유세포측정에 의해 분석하였다. NKX6.1, NEUROD1, PDX1, 및 CDX2의 발현을 보여주는 데이터가 표 IX에 나타나 있다. 3기 전체에 걸쳐 또는 3기의 마지막 2일 동안(각각 반응기 B 및 반응기 C) pH 7.0으로 유지된 세포가, (3기까지 pH 7.4로 설정된) 반응기 D에서 유지된 세포와 비교할 때, 4기의 종료 시점에서 비례적으로 더 많은 NKX6.1 양성 세포 및 더 적은 NEUROD1 양성 세포를 가진 것으로 세포내 유세포측정에 의해 관찰되었다. 이들 데이터는, 심지어 3기에서의 pH 7.0에 대한 부분적인 노출이 NEUROD1 발현을 억제하는 데 충분함을 나타낸다.
유세포측정에 의해 세포 단백질 발현을 결정하는 것에 더하여, 분화 과정의 3기 및 4기 전체에 걸친 샘플을 OpenArray® qRT-PCR을 사용하여 유전자 패널의 mRNA 발현에 대해 시험하였다. 도 26a 내지 도 26n은, 5기의 첫째 날까지 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 나타낸다: PDX1(도 26a); NKX6.1(도 26b); PAX4(도 26c); PAX6(도 26d); NeuroG3(NGN3)(도 26e); ABCC8(도 26f); 크로모그라닌-A(도 26g); 크로모그라닌-B(도 26h); ARX(도 26i); 그렐린(도 26j); IAPP(도 26k); PTF1a(도 26l); NEUROD1(도 26m); 및 NKX2.2(도 26n).
도 26a에 나타낸 바와 같이, 낮은 3기 pH(7.0) 또는 표준 3기 pH(7.4) 분화 조건 둘 모두 하에서, 세포는 3기에서 유사한 수준의 PDX1을 발현하였는데, 이는 세포가 췌장 운명을 채택하였음을 나타낸다. 그러나, 반응기 B 및 반응기 C(pH 7.0에 노출됨)로부터의 세포가 4기에 진입됨에 따라, pH 7.4(반응기 D)로 일정하게 유지된 세포와 비교하여 PDX1 발현이 증가하였다. PDX 발현의 이러한 증가는 NKX6.1 발현에서의 유도에 의해 매칭되었다(도 26b). 흥미롭게도, 3기 및 4기의 반응기 D로부터의 세포는 조숙 내분비 췌장 세포 발달에 필요하고 그에 특징적인 다수의 유전자, 즉 도 26c, 도 26d, 도 26e, 도 26m, 도 26n, 도 26i, 도 26j, 도 26g, 및 도 26h에 나타낸 바와 같은 PAX4, PAX6, NGN3, NEUROD1, NKX2.2, ARX, 그렐린, CHGA 및 CHGB를 발현하기 시작하였다. 상대적으로 더 낮은 NKX6.1 발현과 조합된 유전자 발현의 이러한 패턴은, 반응기 B 및 반응기 C와 비교하여, 반응기 D에서 증가된 조숙(비-베타 세포) 내분비 췌장 특수화를 나타내었다.
대조적으로, qRT-PCR에 의해 측정될 때 반응기 B 및 반응기 C로부터의 세포는, 반응기 D와 비교할 때, 3기에서 조숙 내분비 발달에 특징적인 전사 인자(PAX4, PAX6, NGN3, NEUROD1, NKX2.2, 및 ARX)를 유의하게 더 낮은 수준으로 발현하였다(도 26c, 도 26d, 도 26e, 도 26m, 도 26n, 및 도 26i). 더욱이, 반응기 B 및 반응기 C로부터의 세포는, 4기의 첫째 날에 베타 세포 형성에 필요한 전사 인자인 NKX6.1 메시지(도 26b)의 증가를 가진 후, 4기의 둘째 날에 PAX6, NEUROD1, 및 NKX2.2의 증가된 mRNA 발현이 이어지는 것으로 관찰되었다(도 26d, 도 26m, 및 도 26n). 이들 OpenArray® qRT-PCR 데이터는, 3기에서 2일 또는 3일 동안 pH 7.0으로 유지된 세포가 3기 및 4기의 종료 시점에서 NEUROD1을 발현할 가능성이 더 낮고 NKX6.1을 발현할 가능성이 더 높았음을 보여주는 유세포측정 결과와 상관되었다(표 XI). 이들 결과는 3기의 전부 또는 심지어 일부 동안의 낮은 pH(7.0)에 대한 노출이 조숙(비-베타 세포) 내분비 췌장 특수화를 억제하고, 베타 세포를 형성하는 데 필요한 전사 인자 발현 서열을 촉진하였음을 나타낸다.
3기에서의 감소된 배지 pH를 통해 비-베타 세포 내분비 췌장 특수화에 관여하는 유전자의 지연 또는 감소된 발현의 효과는 분화의 5기의 종료까지 지속되었다. 반응기 B(3기의 전부 동안 pH 7.0)에서 분화된 세포가, NKX6.1/인슐린 동시-양성 세포의 증가와 함께(17.9%, 조건 B vs. 14%, 조건 D), 반응기 D 세포(19.5%, 표 XIV)와 비교할 때, 증가된 백분율의 인슐린 양성 세포(25.4%, 표 XIV)를 가졌다. 이들 결과는, 반응기 B가 반응기 D - 44.9%의 PAX6 및 24.7%의 섬1 양성 세포 - 와 비교하여 53.8%의 PAX6 및 31%의 섬1 양성 세포를 생성한 바와 같이, PAX6 및 섬1 발현(표 XIV)과 같은 적절한 내분비 섬 형성에 필요한 마커의 증가에 의해 반영되었다. 증식의 척도인 Ki67 발현이 또한, 반응기 D로부터의 세포와 비교하여, 3기에서 pH 7.0으로 처리된 세포에서 감소되는데(표 XIV), 이는 성장 중이고 덜 분화된 집단으로부터 더 최종으로 분화된 조직으로의 이행을 나타낸다.
흥미롭게도, 3기에서의 낮은 pH가 조숙 내분비 분화를 억제하였지만, 반응기 B 및 반응기 C로부터의 세포는 4기 및 5기에서 팬-췌장 전사 인자 - PDX1 - 의 높은 발현을 유지하였다. 더욱이, 반응기 B 및 반응기 C의 세포가, 반응기 D와 비교하여, 3기 및 4기에서 낮은 NEUROD1 발현(팬-내분비 전사 인자)을 가졌지만(표 XI), 이들은 5기 종료까지 더 높은 백분율의 NEUROD1 및 NEUROD1/NKX6.1 동시-양성 세포(표 X)를 나타내었다. 이들 결과는 3기에서의 낮은 pH가 내분비 운명으로의 조숙한 조기 분화를 억제하였으며; 이후에 적절한 베타 세포 특수화에 필요한 전사 인자들의 증가된 동시발현을 촉진시켰으며; 5기의 종료까지 섬 조직 및 베타 세포에 특징적인 마커 및 전사 인자의 전체적인 발현을 증가시켰음을 나타낸다.
[표 IX]
[표 X]
실시예 4
이 실시예는 3 리터 교반 탱크형의 무균적으로 폐쇄된 생물반응기에서 PDX1을 발현하는 세포들의 집단으로부터의 인슐린 발현 세포의 형성을 보여준다. 인슐린 양성 세포가 이 과정으로부터 생성되고, PDX1 발현을 유지하고, NKX6.1을 동시발현하였다. 5기의 종료 시점에서, 인슐린 양성 세포를 500 mL 스피너 플라스크에 옮기고, 6기 동안 이 스피너 플라스크를 55 RPM으로 교반하고, 5% CO2의 가습된 37℃ 인큐베이터 내에서 고 글루코스(25.5 mM) 또는 저 글루코스(5.5 mM)를 함유하는 배지 중에 유지하였다. 6기에서 어느 쪽이든 글루코스 농도를 사용한 대부분의 세포는 PDX1, NKX6.1 또는 NEUROD1 양성이었으며, 반응기 내의 모든 세포의 거의 절반은 NKX6.1/PDX1/인슐린 동시-양성이었다.
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(WA01 세포, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 WiCell Research Institute)를 둥근 응집된 클러스터로서 4회 계대 이상 동안 동적 현탁 상태로 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 E8™ 배지 중에서 성장시켰다. 이어서, 클러스터를 하기 방법에 따라 단일 세포로서 그리고 2 내지 10개의 세포들의 클러스터로서 동결시켰다. 클러스터로의 대략 6억개 내지 10억개의 응집된 세포를 원심분리 튜브에 전달하고, 100 mL의 1X DPS -/-를 사용하여 세척하였다. 세척 후에, 이어서 50 부피% StemPro®Accutase® 효소 및 50 부피% DPBS -/-의 30 mL 용액을 풀어진 세포 응집체 펠릿에 첨가함으로써 세포 응집체를 효소적으로 해체시켰다. 세포 클러스터를 1 내지 3회 상하로 피펫팅하고, 이어서 실온에서 대략 4분 동안 간헐적으로 와동시킨 다음, 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 이어서, 세포 펠릿을 교란시키지 않으면서 가능한 한 완전히 Accutase® 상층액을 흡인하였다. 이어서, 원심분리 튜브를 대략 4분 동안 단단한 표면에 대고 탭핑하여, 클러스터를 단일 세포 및 2 내지 10개의 세포로 구성된 클러스터로 해체시켰다. 4분 후에, 세포를 10 μM Y-27632 및 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 100 mL의 E8™ 배지 중에 재현탁시키고, 80 내지 200 rcf로 5 내지 12분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상층액을 흡인하고, 차가운(4℃ 이하) Cryostor® 세포 보존 배지 CS10을 적가하여 mL당 1억개 내지 1억5000만개 세포의 최종 농도를 달성하였다. 이 세포 용액을 2 mL 냉동 바이알에 분취하는 동안 빙조 중에서 유지하고, 이후에 세포를 프로그램화 동결기인 CryoMed™ 34L 프로그램화 동결기를 사용하여 동결시켰는데, 이는 하기와 같다. 챔버를 4℃로 냉각시키고, 샘플 바이알 온도가 6℃에 도달할 때까지 이 온도를 유지하고, 이어서 샘플이 -7℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 분당 2℃로 낮추고, 이 시점에서 챔버가 -45℃에 도달할 때까지 챔버를 20℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도가 -25℃에 도달할 때까지 그 온도를 10℃/min으로 짧은 시간에 상승되게 한 다음, 샘플 바이알이 -40℃에 도달할 때까지 챔버를 0.8℃/min으로 추가로 냉각시켰다. 이어서, 챔버가 -100℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 10℃/min으로 냉각시킨 다음, 이 시점에서 챔버가 -160℃에 도달할 때까지 챔버를 35℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도를 -160℃에서 적어도 10분 동안 유지하고, 이후에 바이알을 가스상 액체 질소 저장소에 옮겼다. 이어서, 고밀도의 이들 냉동보존된 단일 세포를 ISM으로서 사용하였다.
ISM의 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내고, 해동시키고, 이를 사용하여 3 리터 유리 교반 현탁 탱크 생물반응기(DASGIP)에 mL당 29만5000개의 생존가능한 세포의 시딩 농도로 접종하였다. 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내어서 120초 동안 37℃ 수조에 신속히 옮겨두어서 해동시켰다. 이어서, 바이알을 BSC로 이동시키고, 해동된 내용물을 2 mL 유리 피펫을 통해 50 mL 원추형 튜브에 옮겼다. 이어서, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Rho 키나제 억제제 Y-27632가 보충된 10 mL의 E8™ 배지를 튜브에 적가하였다. 세포를 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 튜브로부터의 상층액을 흡인하고, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 10 mL의 신선한 E8™ 배지를 첨가하고, 세포를 함유하는 부피를 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 450 mL의 E8™ 배지가 담긴 Cap2V8® 배지 전달병 내로 피펫팅하였다. 이어서, 병의 내용물을 연동 펌프를 사용하여 멸균 C-Flex® 튜빙 웰드를 통해 생물반응기 내로 직접 펌핑하였다. 생물반응기에는 70 rpm으로 교반된, 37℃로 예비가온된, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 1000 mL의 E8™ 배지가 준비되어 있었는데, 이때 30%의 용존 산소 설정점(공기 O2, 및 N2가 조절됨), 및 5%의 제어된 CO2 부분 압력을 가졌다. 반응기에 접종하여 0.225 x 106개 세포/mL(농도 범위: 0.2 내지 0.5 x 106개 세포/mL)의 목표 농도를 제공하였다.
일단 반응기에 접종하면, 세포는 교반 반응기 내에 둥근 응집된 클러스터를 형성하였다. 배양물 중에 있은 지 24시간 후에, 원래 부피의 80% 넘게 제거하고 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 1.5 L의 E8™ 배지(신선한 배지)를 다시 첨가함으로써 배지를 부분 교체하였다. 이러한 배지 교체 과정을 접종 후 48시간째에 반복하였다. 둥근 응집된 클러스터로서 현탁 배양물 중에 있은 지 3일 후에, 임펠러 및 가열 재킷을 5 내지 20분 동안 정지하여 클러스터가 침강되게 하였으며, 배지를 제거하고, 폐쇄 시스템을 유지하기 위하여 Terumo™ 튜브 웰더를 사용하여 C-Flex® 튜빙에 연결된 딥 튜브를 통해 연동 펌프에 의해 대체하였다. 일단 충분한 배지를 첨가하여 임펠러가 잠기면, 임펠러 및 가열 재킷에 재동력공급하였다. 분화 프로토콜이 하기에 기재되어 있다.
1기(3일):
1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 3.6 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA 100 mL; 1X 농도의 GlutaMAX™ 10 mL; 2.5 mM 글루코스(물 중 45%) 1 mL; 및 1:50,000 희석의 ITS-X가 보충된 900 mL의 MCDB-131 배지를 사용하여 1기 기본 배지를 제조하였다. 100 ng/ml의 GDF8 및 3 μM MCX 화합물이 보충된 기본 배지 중에서 1일 동안 세포를 배양하였다. 24시간 후에, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하고, 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 신선한 기본 배지를 플라스크에 첨가하였다. 세포를 추가의 배지 교체 없이 48시간 동안 유지하였다. 1기 전체에 걸쳐, 용존 산소 함량을 10%로 유지하고 pH를 7.4로 유지하였다.
2기(3일):
1기의 완료 후에, 1기 폐배지를 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 것을 제외한 1기의 기본 배지로 대체하여, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하였다. 배지 교체 후 48시간째에, 폐배지를 다시 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 신선한 기본 배지로 교체하였다. 2기 전체에 걸쳐, DO를 30% DO로 유지하고 pH를 7.4%로 유지하였다.
3기(3일):
2기의 완료 후에, 2기 폐배지를 제거하고, 하기의 기본 배지로 대체하여, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하였다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 3.6 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA 100 mL; 1X 농도의 GlutaMAX™ 10 mL; 2.5 mM 글루코스(물 중 45%) 1 mL; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 900 mL의 MCDB-131 배지. 3기 기본 배지에 50 ng/mL의 FGF-7; 100 nM LDN-193189; 2 μM RA; 0.25 μM SANT-1; 및 400 nM TPB를 보충하였다. 배지 교체 후 24시간째에, 폐배지를, LDN-193189를 제외하고는 상기 보충제를 함유하는 신선한 배지로 다시 대체하였다. 세포를 48시간 동안 배지 중에서 배양하였다. 3기 전체에 걸쳐, 30% DO 및 pH 7.0을 유지하였다.
4기(3일):
3기의 완료 후에, 3기 폐배지를 제거하고, 0.25 μM SANT-1 및 400 nM TPB가 보충된 것을 제외하고는 3기에서 사용된 것과 동일한 기본 배지로 대체하여, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하였다. 4기 개시 후 48시간째에, 3.2 mL/L의 45% 글루코스 용액(8 mM 글루코스 볼루스)을 각각의 생물반응기에 첨가하고, 세포를 추가 24시간 동안 배지 중에서 배양하였다. 4기 전체에 걸쳐, 30% DO 및 pH 7.4를 유지하였다.
5기(7일):
4기의 완료 후에, 4기 폐배지를 제거하고, 하기의 5기 기본 배지로 대체하여, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하였다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 1.754 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA 100 mL; 1X 농도의 GlutaMAX™; 8 mL/L의 45% 글루코스 용액; 1:200 희석의 ITS-X; 250 μL/L의 1 M 아스코르브산; 및 10 mg/L 헤파린 용액 1 mL가 보충된 900 mL의 MCDB-131 배지 베이스. 5기 기본 배지에 1 μM T3, 10 μM ALK5 억제제 II, 1 μM 감마 세크레타제 억제제 XXI; 20 ng/mL의 베타셀룰린; 0.25 μM SANT-1; 및 100 nM RA를 보충하였다. 5기의 개시 후 48시간째에, 폐배지를 제거하고, 동일한 신선한 기본 배지 및 보충제로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 다시 교체하여 동일한 신선한 배지 및 보충제로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 다시 교체하여, 감마 세크레타제 억제제 XXI 및 SANT를 제외시킨 것을 제외하고는 동일한 신선한 배지 및 보충제로 대체하였다. 48시간 후에, 폐배지를 제거하고, 동일한 신선한 배지 및 보충제로 대체하였다. 세포를 5기의 종료까지 추가 24시간 동안 배양하였다. 5기 전체에 걸쳐, 30% DO 및 pH 7.4를 유지하였다.
6기(7일):
5기의 종료 시점(분화 일수 19)에서, 세포를 멸균 웰드 및 연동 펌프를 통해 3 리터 반응기로부터 회수하였다. 이어서, 세포를 계수하고, 중력 침강시키고, 50만개 세포/mL의 정규화된 분포로 6기 배지(하기에 상세히 설명됨) 중에 재현탁시키고, 2개의 0.5 리터 일회용 스피너 플라스크(Corning)에 첨가하고, 이들 스피너 플라스크를 55 RPM으로 교반하고, 5% CO2의 가습된 37℃ 인큐베이터 내에서 고 글루코스(25.5 mM) 또는 저 글루코스(5.5 mM)를 함유하는 배지 중에 드리프트 조건 하에서 7일 동안 유지하였다. 하나의 플라스크에는 하기 배지 및 보충제가 담겨 있었다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 1.754 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA 100 mL; 1X 농도의 GlutaMAX™; 8 mL/L의 45% 글루코스 용액(25.5 mM 최종 글루코스 농도); 1:200 희석의 ITS-X; 250 μL/L의 1 M 아스코르브산; 및 10 mg/L 헤파린 용액 1 mL; 및 10 μM ALK5 억제제 II가 보충된 300 mL의 MCDB-131 배지 베이스. 제2 플라스크에는 하기 배지 및 보충제가 담겨 있었다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨 및 5.5 mM의 기본 글루코스 농도를 함유하고, 추가 1.754 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA 100 mL; 1X 농도의 GlutaMAX™; 1:200 희석의 ITS-X; 250 μL/L의 1 M 아스코르브산; 및 10 mg/L 헤파린 용액 1 mL; 및 10 μM ALK5 억제제 II가 보충된 300 mL의 MCDB-131 배지 베이스. 5기의 개시 후 48시간째, 96시간째, 그리고 120시간째에, 폐배지를 제거하고, 동일한 신선한 기본 배지 및 보충제로 대체하였다. 6기를 개시 후 144시간째에(분화 일수 26에서) 종료하였다.
분화 과정 전체에 걸쳐, 샘플을 반응기로부터 수집하고, 총 세포수(표 X에 나타낸 바와 같음) 및 mRNA 발현(OpenArray® qRT-PCR)(도 27에 나타낸 바와 같음)에 대해 분석하였다. 3기, 4기, 5기, 및 6기의 종료 시점에서, 샘플을 유세포측정을 사용하여 단백질 발현에 대해 검정하였다(표 XII).
3기의 완료 시점에서, 거의 모든 세포가 내배엽 전사 인자(FOXA2) 및 췌장 특이적 전사 인자(PDX1) 둘 모두를 발현한 것으로 관찰되었다. 유세포측정에 의해, NKX6.1을 발현하는 소수의 세포(약 20%)가 검출되었으며, NEUROD1을 발현하는 세포는 거의 없었다(표 XII). 4기의 종료 시점에서, 샘플을 NKX6.1, NEUROD1, PDX1, FOXA2, CDX2, 및 Ki67의 발현에 대해 유세포측정에 의해 다시 분석하였다(표 XII). 흥미롭게도, 3기의 종료부터 4기의 종료까지, NKX6.1 발현 집단이 세포의 91%를 초과하여 증가하였으며, 이들 세포는 내배엽 및 췌장 특수화를 유지하였다(99% 초과의 PDX1 및 FOXA2 발현 세포). 그러나, 단지 제한된 세포 집단(8% 미만)만이 내분비 호르몬 세포(섬1, CHGA, NEUROD1, 및 NKX2.2)에 특징적인 마커를 발현하였다. 5기의 완료 시점에서, 내분비 호르몬 세포에 특징적인 마커에 대해 양성인 세포의 백분율이 사실상 증가하였는데, 4기의 종료 시점에서 10% 미만으로부터 NEUROD1에 대해 양성인 세포가 76%로 그리고 인슐린에 대해 양성인 세포가 57%로 상승하였다. 더욱이, 총 세포 집단은 주로 NKX6.1(81%) 및 PDX1(97% 초과) 발현을 유지하였다. Ki67에 대해 양성인 세포의 %에 의해 측정된 바와 같은 증식 수준은 약 18%였으며, 내배엽 장 세포에 대한 마커인 CDX2는 3.0% 미만으로 매우 낮았다. 이들 데이터는 섬-유사, 그리고 특히 베타 세포-유사 집단이 반응기 내에 형성되고 있음을 나타낸다.
5기의 완료 시점에서, 세포를 3 리터 교반 탱크 반응기로부터 회수하고, 500 mL 스피너 플라스크들 내로 분할하여 넣고, 이들 스피너 플라스크를 5% CO2, 37℃, 가습된 인큐베이터 내에 유지하였다. 이들 스피너 플라스크를 기본 배지 글루코스 농도를 제외하고는 유사한 조건 하에서 처리하였다. 시험된 2개의 글루코스 조건은 하기와 같았다: 저 글루코스 - 5.5 mM 출발 기본 글루코스 농도("LG"), 또는 고 글루코스 - 25.5 mM 출발 기본 글루코스 농도("HG")(표 XIV). 어느 것인가 한쪽 조건에서 6기에서 7일 동안 처리된 세포는 내분비 호르몬 세포, 그리고 특히 췌장 베타 섬 세포에 특징적인 마커의 사실상의 증가를 보여주었다. 6기의 7일째의 종료 시점에서, 세포의 거의 절반이 PAX6에 대해 양성이었으며, 한편 60%가 NEUROD1과 NKX6.1, 또는 인슐린과 NKX6.1에 대해 동시-양성이었다(표 XIII). 추가적으로, 이 시스템에서 생성된 세포는 고수준의 PDX1(81% 초과)을 유지하였으며, Ki67에 대해 양성인 세포의 %에 의해 측정된 바와 같이 감소된 수준의 증식을 보여주었다(표 XIV에 따라 약 12%).
이들 결과는 OpenArray®qRT-PCR 데이터에 의해 뒷받침되었는데, 이 데이터는 세포가 5기에 진입됨에 따라 NGN3의 대폭적이고 일시적인 유도가 존재함을 보여준다(도 27a). 이후에, NEUROD1 발현(도 27b), 및 섬 형성 및 내분비 호르몬 세포와 관련된 다른 유전자, 예컨대, 각각 도 27c 내지 도 27j에 나타낸 바와 같은 크로모그라닌 A(CHGA), 크로모그라닌 B(CHGB), 글루카곤(GCG), 섬 관련 폴리펩티드(IAPP), 섬1(ISL1), MAFB, PAX6, 및 소마토스타틴(SST)에 있어서의 지속된 유도가 뒤따랐다. 섬 특이적 유전자의 유도에 더하여, 베타 세포 특이적 유전자가 또한 5기에서 유도되어 6기까지 지속되었는데, 이는 인슐린(INS; 도 27k), 글루코스 6 포스파타제 2(G6PC2; 도 27l), PCSK1 및 2(도 27m 및 도 27n), 아연 수송체(SLC30A8; 도 27o)에 대해 관찰된 바와 같으며, 베타 세포 형성 및 기능에 필요한 전사 인사, 예컨대 NKX6.1, NKX2.2, MNX1/HB9, 및 UCN3(각각 도 27p 내지 도 27s)도 마찬가지이다. 대체 운명의 형성을 나타내는, CDX2 및 ZIC1과 같은 유전자의 발현은 qRT-PCR에 의한 검출 한계 부근이거나 그 미만이었다(데이터는 제시되어 있지 않음).
[표 XI]
[표 XII]
[표 XIII]
[표 XIV]
실시예 5
이 실시예는 교반 탱크형의 무균적으로 폐쇄된 생물반응기에서 전사 인자인 PDX1을 발현하는 세포들의 집단으로부터의 인슐린 발현 세포의 형성을 보여준다. 이 과정으로부터 생성된 인슐린 양성 세포는 PDX1 발현을 유지하고 NKX6.1을 동시발현하였다. 이 세포 집단을 면역-손상된 마우스의 신장 피막 내로 이식하였을 때, 이 이식편은 4주의 생착 이내에 검출가능한 혈액 수준의 인간 C-펩티드를 생성하였다.
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(WA01 세포, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 WiCell Research Institute)를 둥근 응집된 클러스터로서 4회 계대 이상 동안 동적 현탁 상태로 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 E8™ 배지 중에서 성장시켰다. 이어서, 클러스터를 하기 방법에 따라 단일 세포로서 그리고 2 내지 10개의 세포들의 클러스터로서 동결시켰다. 클러스터로의 대략 6억개 내지 10억개의 응집된 세포를 원심분리 튜브에 전달하고, 100 mL의 1X DPS -/-를 사용하여 세척하였다. 세척 후에, 이어서 50 부피% StemPro®Accutase® 효소 및 50 부피% DPBS -/-의 30 mL 용액을 풀어진 세포 응집체 펠릿에 첨가함으로써 세포 응집체를 효소적으로 해체시켰다. 세포 클러스터를 1 내지 3회 상하로 피펫팅하고, 이어서 실온에서 대략 4분 동안 간헐적으로 와동시킨 다음, 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 이어서, 세포 펠릿을 교란시키지 않으면서 가능한 한 완전히 Accutase® 상층액을 흡인하였다. 이어서, 원심분리 튜브를 대략 4분 동안 단단한 표면에 대고 탭핑하여, 클러스터를 단일 세포 및 2 내지 10개의 세포로 구성된 클러스터로 해체시켰다. 4분 후에, 세포를 10 μM Y-27632(Enzo Life Sciences) 및 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 100 mL의 E8™ 배지 중에 재현탁시키고, 80 내지 200 rcf로 5 내지 12분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상층액을 흡인하고, 차가운(4℃ 이하) Cryostor® 세포 보존 배지 CS10을 적가하여 mL당 1억개 내지 1억5000만개 세포의 최종 농도를 달성하였다. 이 세포 용액을 2 mL 냉동 바이알(Corning)에 분취하는 동안 빙조 중에서 유지하고, 이후에 세포를 프로그램화 CryoMed™ 34L 동결기를 사용하여 동결시켰는데, 이는 하기와 같다. 챔버를 4℃로 냉각시키고, 샘플 바이알 온도가 6℃에 도달할 때까지 이 온도를 유지하고, 이어서 샘플이 -7℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 분당 2℃로 낮추고, 이 시점에서 챔버가 -45℃에 도달할 때까지 챔버를 20℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도가 -25℃에 도달할 때까지 그 온도를 10℃/min으로 짧은 시간에 상승되게 한 다음, 샘플 바이알이 -40℃에 도달할 때까지 챔버를 0.8℃/min으로 추가로 냉각시켰다. 이어서, 챔버가 -100℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 10℃/min으로 냉각시킨 다음, 이 시점에서 챔버가 -160℃에 도달할 때까지 챔버를 35℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도를 -160℃에서 적어도 10분 동안 유지하고, 이후에 바이알을 가스상 액체 질소 저장소에 옮겼다. 이어서, 고밀도의 이들 냉동보존된 단일 세포를 ISM으로서 사용하였다.
ISM 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내고, 해동시키고, 이를 사용하여 3 리터 유리 교반 현탁 탱크 생물반응기(DASGIP)에 mL당 29만5000개의 생존가능한 세포의 시딩 농도로 접종하였다. 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내어서 120초 동안 37℃ 수조에 신속히 옮겨두어서 해동시켰다. 이어서, 바이알을 BSC로 이동시키고, 해동된 내용물을 2 mL 유리 피펫을 통해 50 mL 원추형 튜브에 옮겼다. 이어서, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Rho 키나제 억제제 Y-27632가 보충된 10 mL의 E8™ 배지를 튜브에 적가하였다. 세포를 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 튜브로부터의 상층액을 흡인하고, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 10 mL의 신선한 E8™ 배지를 첨가하고, 세포를 함유하는 부피를 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 450 mL의 E8™ 배지가 담긴 배지 전달병(Cap2V8®, Sanisure, Inc) 내로 피펫팅하였다. 이어서, 병의 내용물을 연동 펌프를 사용하여 멸균 C-Flex® 튜빙 웰드를 통해 생물반응기 내로 직접 펌핑하였다. 생물반응기에는 70 rpm으로 교반된, 37℃로 예비가온된, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 1000 mL의 E8™ 배지가 준비되어 있었는데, 이때 30%의 용존 산소 설정점(공기 O2, 및 N2가 조절됨), 및 5%의 제어된 CO2 부분 압력을 가졌다. 반응기에 접종하여 0.225 x 106개 세포/mL(농도 범위: 0.2 내지 0.5 x 106개 세포/mL)의 목표 농도를 제공하였다.
일단 반응기에 접종하면, 세포는 교반 반응기 내에 둥근 응집된 클러스터를 형성하였다. 배양물 중에 있은 지 24시간 후에, 원래 부피의 80% 넘게 제거하고 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 1.5 L의 E8™ 배지(신선한 배지)를 다시 첨가함으로써 배지를 부분 교체하였다. 이러한 배지 교체 과정을 접종 후 48시간째에 반복하였다. 둥근 응집된 클러스터로서 현탁 배양물 중에 있은 지 3일 후에, E8™ 폐배지를 제거하고 분화 배지를 첨가함으로써 3 리터 반응기 내에서의 분화가 개시되었다. 분화 프로토콜이 하기에 기재되어 있다.
1기(3일):
반응기를 37℃의 온도로 설정하고, 70 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 10%의 용존 산소 설정점으로 설정하고(공기, O2, 및 N2가 조절됨), CO2 조절을 통해 pH를 7.4로 설정하였다. 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스(물 중 45%); 및 1:50,000 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지를 사용하여 1기 기본 배지를 제조하였다. 100 ng/ml의 GDF8 및 3 μM MCX 화합물이 보충된 1.5 L의 기본 배지 중에서 1일 동안 세포를 배양하였다. 24시간 후에, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하고, 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 신선한 1.5 L의 기본 배지를 반응기에 첨가하였다. 세포를 추가의 배지 교체 없이 48시간 동안 유지하였다.
2기(3일):
반응기를 37℃의 온도로 설정하고, 70 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 30%의 용존 산소 설정점으로 설정하고(공기 O2, 및 N2가 조절됨), CO2 조절을 통해 pH를 7.4로 설정하였다. 1기의 완료 후에, 1기 폐배지를 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 것을 제외하고는 1.5 L의 동일한 배지로 대체하여, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하였다. 배지 교체 후 48시간째에, 폐배지를 다시 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 300 mL의 신선한 2기 기본 배지로 교체하였다.
3기(3일):
2기의 완료 시점에서, 그리고 배지 교체 직전에, 세포를 계수하고, 중력 침강시키고, 1.5 리터 중 200만개 세포/mL의 정규화된 분포로 하기의 3기 기본 배지 중에 재현탁시켰다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지. 3기 기본 배지에 50 ng/mL의 FGF-7; 100 nM LDN-193189; 2 μM RA; 0.25 μM SANT-1; 및 400 nM TPB를 보충하였다. 반응기를 37℃의 온도로 설정하고, 70 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 30%의 용존 산소 설정점으로 설정하고(공기 O2, 및 질소가 조절됨), CO2 조절을 통해 pH를 7.0으로 설정하였다. 배지 교체 후 24시간째에, 폐배지를, LDN-193189를 제외하고는 상기 보충제를 함유하는 1.5 L의 신선한 3기 배지로 다시 대체하였다. 이후에, 세포를 3기가 종료될 때까지 48시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
4기(3일):
3기의 완료 시점에서, 폐배지를 제거하고, 각각의 생물반응기에서 하기로 구성된 1.5 L의 4기 기본 배지로 대체하였다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지. 4기 기본 배지에 0.25 μM SANT-1 및 400 nM TPB를 보충하였다. 반응기를 37℃로 유지하고, 70 rpm으로 교반하였다. 가스 및 pH를 30%의 용존 산소 설정점으로 조절하고(공기, O2, 및 N2가 조절됨), CO2 조절을 통해 7.4의 pH 설정점으로 조절하였다. 4기 개시 후 48시간째에, 3.2 mL/L의 45% 글루코스 용액(8 mM 글루코스 볼루스)을 생물반응기에 첨가하고, 세포를 추가 24시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
5 및 6기:
4기의 셋째 날의 종료 시점에서, 둥근 응집된 클러스터를 생물반응기로부터 펌핑하여 2개의 별개의 0.5 리터 Corning 일회용 스피너 플라스크에 옮기고, 이들 스피너 플라스크를 55 RPM으로 교반하고, 5% CO2가 보충된 37℃ 가습된 인큐베이터 내에서 유지하였다. 이후에, 각각의 용기 내의 세포를 하기로 구성된 300 mL 작업 부피의 5기 기본 배지 중에 유지하였다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 1.75 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 20 mM 글루코스; 1:200 희석의 ITS-X; 250 μL/L의 1 M 아스코르브산; 10 mg/L의 헤파린; 3,3′,5-트라이요오도-L-티로닌 나트륨 염으로서의 1 μM T3 및 10 μM ALK5 억제제 II가 보충된 300 mL의 MCDB-131 배지.
사용된 5기 기본 배지를 하기와 같이 2개의 상이한 조건 A 또는 B에 따라 보충하였다:
a. 조건 A의 경우, 100 nM LDN, 100 nM SANT, 및 10 μM 황산아연이 보충된 5기+ 기본 배지를 적용함으로써 5기를 개시하였다. 이 배지를 단계 시작 후 24시간째 및 48시간째에 교체하였다. 5기 시작 후 72시간째에, 폐배지를 제거하고, 세포를 100 nM XX 감마 세크레타제 억제제, 100 nM LDN, 및 10 μM 황산아연이 보충된 5기 기본 배지로 처리함으로써 6기를 개시하였다. 이후에, 8일째, 9일째, 및 11일째의 시작 시점에서를 제외하고, 이 배지를 11일 동안 매 24시간마다 대체하였다.
b. 조건 B의 경우, 100 nM 감마 세크레타제 억제제, XX; 20 ng/mL의 베타셀룰린; 0.25 μM SANT-1; 및 100 nM RA가 보충된 5기 기본 배지를 적용함으로써 5기를 개시하였다. 5기의 개시 후 48시간째에, 폐배지를 제거하고, 300 mL의 동일한 배지 및 보충제로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 제거하고, 20 ng/mL의 베타셀룰린, 및 100 nM RA가 보충된 5기 기본 배지로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 다시 교체하여 동일한 배지로 대체하였다.
분화 과정 전체에 걸쳐, 분석을 위하여 현탁 배양물로부터 세포 샘플을 수집하였다. 샘플을 mRNA 발현(OpenArray® qRT-PCR) 및 단백질 발현(유세포측정 및 형광 면역-조직화학)에 대해 분석하였다.
4기의 종료 후 6일째(조건 A - 6기 3일째; 조건 B - 5기 6일째)에, 두 처리 모두로부터의 세포가, 내분비 췌장 및 베타 세포의 형성과 일치하는, 유세포측정에 의해 검출가능한, 단백질 패널을 발현한 것으로 관찰되었다(표 XV). 두 처리 모두 높은 백분율(91% 초과)의 PDX1 발현 세포를 생성하였으며, 세포는 인슐린과 NKX6.1을 동시발현하기 시작하였다(제시되어 있지 않음). 흥미롭게도, 조건 A에 따라 처리된 세포는 감소된 수준의 증식을 갖는 것으로 관찰되었다 - A의 경우 세포의 15.5% 그리고 B의 경우 27.3%가 Ki67을 발현하였음(표 XV). 더욱이, 조건 A로 처리된 세포는 조건 B보다 더 많은 NKX6.1 발현 세포, NEUROD1 발현 세포, 및 NKX6.1/NEUROD1 동시발현 세포를 가졌는데(표 XV), 이는 조건 A에 의한 처리가 내분비 췌장에 특징적이고 베타 세포를 형성할 수 있는 유전자를 발현하는 세포들의 더 큰 집단을 생성하였음을 나타낸다.
이들 유세포측정 데이터는 OpenArray qRT-PCR 데이터에 의해 뒷받침되었는데, OpenArray qRT-PCR 데이터는 세포가 5기에 진입됨에 따라, 두 조건 모두 하에서 NGN3의 유도(도 28a)가 있었음을 보여주었으며, 이때 NGN3의 유도는 NEUROD1 발현의 지속된 유도(도 28b)와 상관되었다. 조건 A에서는, 5기에서의 NGN3의 초기 유도 후, 6기의 시작 시점에서 NGN3의 두 번째 유도가 있었는데, 이러한 두 번째 유도는 감마 세크레타제 억제제, XX에 의한 처리에 상응하였다. 조건 A에 대한 NGN3 발현의 이러한 이중 피크는 NKX6.1(도 28c)의 지속된 발현과 함께 발생되었으며, 섬 형성 및 내분비 호르몬 세포와 관련된 다수의 유전자, 예컨대 크로모그라닌 A(CHGA), 크로모그라닌 B(CHGB), 글루카곤(GCG), 섬 관련 폴리펩티드(IAPP), MAFB, PAX6, 및 소마토스타틴(SST)(각각 도 28d 내지 도 28j)의 발현과 상관되었다. 더욱이, 베타 세포 기능에 필요한 유전자가 또한 5기에서 유도되어 6기까지 지속되었는데, 이는 인슐린(INS; 도 28k), 글루코스 6 포스파타제 2(G6PC2; 도 28l), PCSK1(도 28m), 및 아연 수송체(SLC30A8; 도 28n)에 대해 관찰된 바와 같으며, 베타 세포 형성, 성숙, 및 기능에 필요한 MNX1/HB9, 및 UCN3- 전사 인자(각각 도 28o 및 도28p)도 마찬가지이다.
6기의 11일째 날의 종료 시점에서, 조건 A로부터의 5x107개의 분화된 세포를 50 mL 원추형 튜브 내에서 배지로부터 단리하고, 이어서 1.18 g/L의 중탄산나트륨 및 0.2% w/v FAF-BSA를 함유하는 MCDB-1313 배지로 2회 세척하였다. 세척 배지 중에 세포를 재현탁시키고, NSG 마우스의 신장 피막 아래에 이식 전에 대략 5시간 동안 실온에서 유지하였다. 각각의 동물은 5x106개의 세포의 용량을 투여받았다. 이식 전에, 이들 세포는 내분비 췌장 및 베타 세포와 일치하는 단백질을 발현하였으며(표 XVI), 이식 후 4주째인 가장 일찍이 측정된 시점에서, 그리고 이 연구의 18주 과정 전체에 걸쳐, 하룻밤 절식 후 복막내 글루코스 주사 및 IP 글루코스 볼루스 후 60분째의 후안와동 채혈에 따라 인간 C-펩티드를 검출하였다(N=7 마리의 동물, 도 29).
[표 XV]
[표 XVI]
실시예 6
이 실시예는 교반 탱크형의 무균적으로 폐쇄된 생물반응기에서 PDX1을 발현하는 세포들의 집단으로부터의 인슐린 발현 세포의 형성을 보여준다. 이 과정으로부터 생성된 인슐린 양성 세포는 PDX1 발현을 유지하고 NKX6.1을 동시발현하였다. 이 세포 집단을 면역-손상된 마우스의 신장 피막 내로 이식하였을 때, 이 이식편은 2주의 생착 이내에 검출가능한 혈액 수준의 인간 C-펩티드를 생성하였다.
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(WA01 세포, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 WiCell Research Institute)를 둥근 응집된 클러스터로서 4회 계대 이상 동안 동적 현탁 상태로 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 E8™ 배지 중에서 성장시켰다. 이어서, 클러스터를 하기 방법에 따라 단일 세포로서 그리고 2 내지 10개의 세포들의 클러스터로서 동결시켰다. 클러스터로의 대략 6억개 내지 10억개의 응집된 세포를 원심분리 튜브에 전달하고, 100 mL의 1X DPS -/-를 사용하여 세척하였다. 세척 후에, 이어서 50 부피% StemPro®Accutase® 효소 및 50 부피% DPBS -/-의 30 mL 용액을 풀어진 세포 응집체 펠릿에 첨가함으로써 세포 응집체를 효소적으로 해체시켰다. 세포 클러스터를 1 내지 3회 상하로 피펫팅하고, 이어서 실온에서 대략 4분 동안 간헐적으로 와동시킨 다음, 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 이어서, 세포 펠릿을 교란시키지 않으면서 가능한 한 완전히 Accutase® 상층액을 흡인하였다. 이어서, 원심분리 튜브를 대략 4분 동안 단단한 표면에 대고 탭핑하여, 클러스터를 단일 세포 및 2 내지 10개의 세포로 구성된 클러스터로 해체시켰다. 4분 후에, 세포를 10 μM Y-27632(Enzo Life Sciences) 및 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 100 mL의 E8™ 배지 중에 재현탁시키고, 80 내지 200 rcf로 5 내지 12분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상층액을 흡인하고, 차가운(4℃ 이하) Cryostor® 세포 보존 배지 CS10을 적가하여 mL당 1억개 내지 1억5000만개 세포의 최종 농도를 달성하였다. 이 세포 용액을 2 mL 냉동 바이알(Corning)에 분취하는 동안 빙조 중에서 유지하고, 이후에 세포를 프로그램화 CryoMed™ 34L 동결기를 사용하여 동결시켰는데, 이는 하기와 같다. 챔버를 4℃로 냉각시키고, 샘플 바이알 온도가 6℃에 도달할 때까지 이 온도를 유지하고, 이어서 샘플이 -7℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 분당 2℃로 낮추고, 이 시점에서 챔버가 -45℃에 도달할 때까지 챔버를 20℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도가 -25℃에 도달할 때까지 그 온도를 10℃/min으로 짧은 시간에 상승되게 한 다음, 샘플 바이알이 -40℃에 도달할 때까지 챔버를 0.8℃/min으로 추가로 냉각시켰다. 이어서, 챔버가 -100℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 10℃/min으로 냉각시킨 다음, 이 시점에서 챔버가 -160℃에 도달할 때까지 챔버를 35℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도를 -160℃에서 적어도 10분 동안 유지하고, 이후에 바이알을 가스상 액체 질소 저장소에 옮겼다. 이어서, 고밀도의 이들 냉동보존된 단일 세포를 ISM으로서 사용하였다.
ISM 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내고, 해동시키고, 이를 사용하여 3 리터 유리 교반 현탁 탱크 생물반응기(DASGIP)에 mL당 29만5000개의 생존가능한 세포의 시딩 농도로 접종하였다. 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내어서 120초 동안 37℃ 수조에 신속히 옮겨두어서 해동시켰다. 이어서, 바이알을 BSC로 이동시키고, 해동된 내용물을 2 mL 유리 피펫을 통해 50 mL 원추형 튜브에 옮겼다. 이어서, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Rho 키나제 억제제 Y-27632가 보충된 10 mL의 E8™ 배지를 튜브에 적가하였다. 세포를 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 튜브로부터의 상층액을 흡인하고, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 10 mL의 신선한 E8™ 배지를 첨가하고, 세포를 함유하는 부피를 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 450 mL의 E8™ 배지가 담긴 배지 전달병(Cap2V8®, Sanisure, Inc) 내로 피펫팅하였다. 이어서, 병의 내용물을 연동 펌프를 사용하여 멸균 C-Flex® 튜빙 웰드를 통해 생물반응기 내로 직접 펌핑하였다. 생물반응기에는 70 rpm으로 교반된, 37℃로 예비가온된, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 1000 mL의 E8™ 배지가 준비되어 있었는데, 이때 30%의 용존 산소 설정점(공기 O2, 및 N2가 조절됨), 및 5%의 제어된 CO2 부분 압력을 가졌다. 반응기에 접종하여 0.225 x 106개 세포/mL(농도 범위: 0.2 내지 0.5 x 106개 세포/mL)의 목표 농도를 제공하였다.
일단 반응기에 접종하면, 세포는 교반 반응기 내에 둥근 응집된 클러스터를 형성하였다. 배양물 중에 있은 지 24시간 후에, 원래 부피의 80% 넘게 제거하고 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 1.5 L의 E8™ 배지(신선한 배지)를 다시 첨가함으로써 배지를 부분 교체하였다. 이러한 배지 교체 과정을 접종 후 48시간째에 반복하였다. 둥근 응집된 클러스터로서 현탁 배양물 중에 있은 지 3일 후에, E8™ 폐배지를 제거하고 분화 배지를 첨가함으로써 3 리터 반응기 내에서의 분화가 개시되었다. 분화 프로토콜이 하기에 기재되어 있다.
1기(3일):
반응기를 37℃의 온도로 설정하고, 70 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 10%의 용존 산소 설정점으로 설정하고(공기, O2, 및 N2가 조절됨), CO2 조절을 통해 pH를 7.4로 설정하였다. 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스(물 중 45%); 및 1:50,000 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지를 사용하여 1기 기본 배지를 제조하였다. 100 ng/ml의 GDF8 및 3 μM MCX 화합물이 보충된 1.5 L의 기본 배지 중에서 1일 동안 세포를 배양하였다. 24시간 후에, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하고, 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 신선한 1.5 L의 기본 배지를 반응기에 첨가하였다. 세포를 추가의 배지 교체 없이 48시간 동안 유지하였다.
2기(3일):
반응기를 37℃의 온도로 설정하고, 70 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 30%의 용존 산소 설정점으로 설정하고(공기 O2, 및 N2가 조절됨), CO2 조절을 통해 pH를 7.4로 설정하였다. 1기의 완료 후에, 1기 폐배지를 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 것을 제외하고는 1기 기본 배지로서 사용된 것과 동일한 배지 1.5 L로 대체하여, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하였다. 배지 교체 후 48시간째에, 폐배지를 다시 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 300 mL의 신선한 기본 배지로 교체하였다.
3기(3일):
2기의 완료 시점에서, 그리고 배지 교체 직전에, 세포를 계수하고, 중력 침강시키고, 1.5 리터 중 200만개 세포/mL의 정규화된 농도로 하기의 3기 기본 배지 중에 재현탁시켰다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지. 3기 기본 배지에 50 ng/mL의 FGF-7; 100 nM LDN-193189; 2 μM RA; 0.25 μM SANT-1; 및 400 nM TPB를 보충하였다. 반응기를 37℃의 온도로 설정하고, 70 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 30%의 용존 산소 설정점으로 설정하고(공기, O2, 및 N2가 조절됨), CO2 조절을 통해 pH를 7.0으로 설정하였다. 배지 교체 후 24시간째에, 폐배지를, LDN-193189를 제외하고는 상기 보충제를 함유하는 1.5 L의 신선한 3기 기본 배지로 다시 대체하였다. 이후에, 세포를 3기가 종료될 때까지 48시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
기의 종료 시점에서, 150 mL의 세포(1.05 x106 개의 생존가능한 세포/mL)를 모(parent) 3 리터 반응기로부터 회수하고, 0.2 L 반응기에 무균적으로 옮겼다. 나머지 1.35 L의 반응기 부피는 하기에 기재된 4기에 따라 추가로 분화시켰으며, 이하, 이 과정 및 세포는 "표준 과정" 및 "표준 세포"로 지칭된다. 그러나, 대신 0.2 L 반응기에 옮겨진 세포는 하기의 4기에 따라 분화시키지 않고, 오히려 하기에 기재된 바와 같이 5기에 따라 추가로 분화시켰으며, 이하, 이 과정 및 세포는 "스킵 4 과정" 및 "스킵 4 세포"로 지칭된다. 스킵 4 과정의 경우, 응집된 세포 클러스터를 3기 후에 멸균 웰드 및 연동 펌프를 사용하여 0.2 L 생물반응기("스킵 4"로 라벨링됨)에 회수하여 1.05x106개 세포/mL의 5기 배지 노출을 시작하였다.
4기(3일):
3기의 완료 시점에서, 폐배지를 제거하고, 각각의 생물반응기에서 하기로 구성된 1.5 L의 4기 기본 배지로 대체하였다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지. 4기 기본 배지에 0.25 μM SANT-1 및 400 nM TPB를 보충하였다. 반응기를 37℃로 유지하고, 70 rpm으로 교반하였다. 가스 및 pH를 30%의 용존 산소 설정점으로 조절하고(공기, O2, 및 N2가 조절됨), CO2 조절을 통해 7.4의 pH 설정점으로 조절하였다. 4기 개시 후 48시간째에, 3.2 mL/L의 45% 글루코스 용액(8 mM 글루코스 볼루스)을 생물반응기에 첨가하고, 세포를 추가 24시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
응집된 세포 클러스터(150 mL, 0.9x106개의 생존가능한 세포/mL)를 4기의 셋째 날의 종료 시점에서 표준 과정을 위하여 멸균 웰드 및 연동 펌프를 사용하여 회수하고 0.2 L 생물반응기("표준"으로 라벨링됨)에 옮겨서 5기 배지 노출을 시작하였다. 추가적으로, 일부의 4기 3일째 세포(45x106개 세포/mL)를 50 mL 원추형 튜브 내에서 배지로부터 단리하고, 이어서 1.18 g/L의 중탄산나트륨 및 0.2% w/v FAF-BSA를 함유하는 MCDB-1313 배지로 2회 세척하였다. 세포를 세척 배지 중에 재현탁시키고, 대략 5시간 동안 실온에서 유지하고, 이어서 동물당 5x106개의 세포를, 하룻밤 절식 후 복막내 글루코스 주사 및 IP 글루코스 볼루스 후 60분째의 후안와동 채혈에 따른 인간 C-펩티드 검출을 사용한 생체내 기능의 검정을 위하여 NSG 마우스의 신장 피막 아래에 이식하였다(N=7 마리의 동물).
5기(7일):
표준 및 스킵 4 0.2 L 생물반응기 내로의 세포의 접종 후에, 폐배지를 제거하고, 하기로 구성된 150 mL의 5기+ 기본 배지로 대체하였다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 1.75 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 20 mM 글루코스; 1:200 희석의 ITS-X; 250 μL/L의 1 M 아스코르브산; 10 mg/L의 헤파린(Sigma Aldrich; 카탈로그 번호 H3149-100KU)으로 보충된 MCDB-131 배지 베이스. 이 5기 기본 배지에 1 μM T3, 10 μM 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘("ALK5 억제제 II"), 1 μM 감마 세크레타제 억제제 XXI; 20 ng/mL의 베타셀룰린(R&D Systems, 카탈로그 번호 261-CE-050); 0.25 μM SANT-1; 및 100 nM RA를 보충하였다. 5기의 개시 후 48시간째에, 폐배지를 제거하고, 150 mL의 동일한 배지 및 보충제로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 제거하고, 1 μM T3, 10 μM ALK5 억제제 II, 20 ng/mL의 베타셀룰린, 및 100 nM RA가 보충된 5기+ 기본 배지로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 다시 교체하여 1 μM T3, 10 μM ALK5 억제제 II, 20 ng/mL의 베타셀룰린, 및 100 nM RA가 보충된 5기+ 기본 배지로 대체하고, 5기의 종료까지 24시간 동안 배양하였다. 전술된 방법에 의해 생체내 기능에 대해 검정하기 위하여, 5기의 7일째의 종료 시점에서, 표준 및 스킵 4 과정 각각으로부터의 세포를 NSG 마우스의 신장 피막 내로 이식하였다.
분화 과정 전체에 걸쳐, 분석을 위하여 현탁 배양물로부터 세포 샘플을 수집하였다. 샘플을 mRNA 발현(OpenArray® qRT-PCR)에 대해 그리고 유세포측정에 의해 단백질 발현에 대해 분석하였다. 3기 배지로부터 5기 배지, 즉 스킵 4 과정으로 직접 분화를 이동시키는 것은, 표준 과정에 따라 분화된 세포와 비교하여, 섬 세포, 내분비 호르몬 발현 세포, 및 베타 세포와 관련된 유전자의 증가된 발현을 가져온 것으로 관찰되었다. 스킵 4 과정을 사용하는 경우, 대체 장 운명과 관련된 유전자는 더 낮은 발현을 보여주었으며(ALB 및 CDX2; 도 30b 및 도 30d), 한편 내분비 호르몬 세포 형성 및 기능에 필요한 유전자는 표준 과정에서 발견된 것보다 더 많은 발현을 가졌다(도 30a, 도 30c, 도 30e, 도 30f, 도 30g, 도 30h, 도 30j, 도 30m, 도 30o, 도 30q, 도 30s, 도 30t, 도 30x, 및 도 30aa에 나타낸 바와 같은 ABCC8, ARX, CHGA, CHGB, G6PC2, GCG, IAPP, MAFB, NEUROD1, NKX2.2, PAX4, PAX6, PPY 및 SST). 더욱이, 베타 세포 형성에 필요한 유전자(NKX6.1 및 PDX1; 도 30r 및 도 30w)가 스킵 4 및 표준 과정 세포 둘 모두에 대해 5기의 여섯째 날까지 유사한 수준으로 발현되었다. 베타 세포 기능 및 유지에 필요한 유전자(IAPP, INS, ISL1, HB9, PCSK1, PCSK2, SLC30A8, 및 UNC3; 도 30j, 도 30k, 도 30l, 도 30m, 도 30u, 도 30v, 도 30z, 및 도 30bb) 또는 베타 세포 증식에 필요한 유전자(WNT4A, 도 30cc)가 5기 배지로 처리된 스킵 4 세포에서 유사하거나 더 높은 수준으로 발현되었다.
이들 데이터는, 스킵 4 세포에서 더 이른 시점에서 그리고 더 긴 기간 동안 더 높은 수준의 NGN3 유도(내분비 특수화에 필요함)를 보여주는데, PTF1A 발현(외분비 췌장에 필요함)은 표준 과정에 의해 생성된 수준의 단지 1/20에서 피크에 도달한 데이터와 상관되었다. 이들 데이터는 스킵 4 반응기에서의 세포가, PTF1A의 심지어 짧은 유도의 부재 하에서 내분비 췌장 운명으로 확실하게 특수화되었음을 나타내는데, 이는 PTF1A가 시험관내에서 베타 세포를 형성하는 데 필요하지 않음을 시사한다. 이러한 관찰은, PTF1A가 추가의 분화 전에 4기에서 발현된 당업계에서 관찰되었거나, 4기 세포가 4기에서의 PDX1/NKX6.1/PTF1A 시그니처(signature)를 특징으로 하고, 이어서 시험관내에서 베타-유사 세포로 추가로 발달되는 미국 특허 출원 공개 제2014/0271566 A1호에 기재된 가상의 발달 모델에서 관찰된 결과와 그것이 상이하기 때문에 의미가 있다.
4기 3일째에 존재하는 PTF1A 발현(도 30y) 세포 집단은 거의 균질한 PDX1/NKX6.1 동시발현 집단 및 매우 소수의 NEUROD1 양성 세포(유세포측정에 의해 96.2% KX6.1, 99.6% PDX1 및 2.4% NEUROD1)를 가졌다. 이들 세포를 NSG 마우스의 신장 피막 내로 삽입하였으며(500만개 세포/동물; N=7), 16주 기간에 걸쳐, 혈액 샘플 중 인간 C-펩티드(데이터는 제시되어 있지 않음)는 검출되지 않았다. 이 결과는 예기치 않은 것이었는데, 4 단계 분화 과정에서 유래된 풍부화된 NXK6.1/PDX1/PTF1A 발현 세포 집단이 생착 3개월 이내에 당뇨병을 역전시킬 수 있다고 당업계에서 이전에 입증되었기 때문이다.
4기 3일째(PTF1A 발현) 세포가 표준 과정에 따라 5기까지 추가로 분화되었을 때, 이식편은 2주까지 검출가능한 혈액 수준의 인간 C-펩티드를 분비하고(도 31), 이식 후 12주까지 0.5 ng/mL 초과의 인간 C-펩티드에 도달하였는데, 이는 스킵 4 과정(저/무 PTF1A)의 세포와 유사하였다. 이들 데이터는 PTF1A 발현이 기능적 베타 세포로의 추가의 성숙을 보장하는 데 필요하지도 않고 충분하지도 않음을 나타낸다. 오히려, PTF1A 발현의 상승은, 표준 4기를 스킵하고 0.5 μM 이상의 레틴산, FGF7, 및 PKC 효능제(TPPB)를 함유하는 배지로부터 ALK5 억제제와 함께 또는 이것 없이 감마 세크레타제 억제제 및 갑상선 호르몬(T3)을 함유하는 배지로 직접 세포를 이행함으로써 회피될 수 있는 대체 세포 집단의 출현을 나타낼 가능성이 높다.
이들 결과는 3기에서의 pH의 7.2 이하로의 조절이 적어도 80%만큼 NGN3 발현을 억제하고(도 26e 참조: BxB 및 BxC vs. BxD), PDX1/NKX6.1 동시-양성, PTF1A 음성 세포를 촉진할 수 있음을 입증하는데, PDX1/NKX6.1 동시-양성, PTF1A 음성 세포는 PTF1A 양성 4기 세포 집단을 통해 계대하지 않고서, PDX1/NKX6.1/인슐린 양성 베타-유사 세포를 함유하는 섬-유사 세포 집단으로 추가로 직접 분화될 수 있다.
실시예 7
이 실시예는 저 배지 pH(7.2 미만), FGF7, 레틴산, 및 PKC 길항제(TPPB)를 사용하는 교반 탱크형의 무균적으로 폐쇄된 생물반응기에서의 5 단계 분화 과정을 통한 인슐린 발현 세포의 형성을 보여준다. 3기에서의 낮은 pH의 사용이 3기에서의 임의의 소닉 헤지호그 억제제(예컨대, SANT01 또는 사이클로파민) 또는 TGF-베타/BMP 신호전달 억제제 또는 활성화제의 사용에 대한 필요성을 없앴으며, 4기의 종료 시점에서 PDX1(94%) 및 NKX6.1(87%) 발현 세포들의 집단을 생성하였음을 알아내었다. 이들 세포로부터 생성된 5기 반응기 집단은 높은 백분율의 NEUROD1/NKX6.1 동시-양성 세포, 및 PDX1 및 NKX6.1 동시발현을 갖는 인슐린 양성 세포를 가졌으며, 이 트리오(trio)(NEUROD1, PDX1, NKX6,1)는 적절한 췌장 베타 세포 기능을 위하여 인슐린과 동시발현되어야 한다. 이와 일치되게, 이 5기 세포 집단을 동결보존시키고, 해동시키고, 면역-손상된 마우스의 신장 피막 내로 이식하였을 때, 이 이식편은 2주의 생착 이내에 검출가능한 혈액 수준의 인간 C-펩티드를, 그리고 4주의 생착까지 평균 1 ng/mL 초과의 C-펩티드를 생성하였다.
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(WA01 세포, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 WiCell Research Institute)를 둥근 응집된 클러스터로서 4회 계대 이상 동안 동적 현탁 상태로 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 E8™ 배지 중에서 성장시켰다. 이어서, 클러스터를 하기 방법에 따라 단일 세포로서 그리고 2 내지 10개의 세포들의 클러스터로서 동결시켰다. 클러스터로의 대략 6억개 내지 10억개의 응집된 세포를 원심분리 튜브에 전달하고, 100 mL의 1X DPS -/-를 사용하여 세척하였다. 세척 후에, 이어서 50 부피% StemPro®Accutase® 효소 및 50 부피% DPBS -/-의 30 mL 용액을 풀어진 세포 응집체 펠릿에 첨가함으로써 세포 응집체를 효소적으로 해체시켰다. 세포 클러스터를 1 내지 3회 상하로 피펫팅하고, 이어서 실온에서 대략 4분 동안 간헐적으로 와동시킨 다음, 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 이어서, 세포 펠릿을 교란시키지 않으면서 가능한 한 완전히 Accutase® 상층액을 흡인하였다. 이어서, 원심분리 튜브를 대략 4분 동안 단단한 표면에 대고 탭핑하여, 클러스터를 단일 세포 및 2 내지 10개의 세포로 구성된 클러스터로 해체시켰다. 4분 후에, 세포를 10 μM Y-27632(Enzo Life Sciences) 및 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 100 mL의 E8™ 배지 중에 재현탁시키고, 80 내지 200 rcf로 5 내지 12분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상층액을 흡인하고, 차가운(4℃ 이하) Cryostor® 세포 보존 배지 CS10을 적가하여 mL당 1억개 내지 1억5000만개 세포의 최종 농도를 달성하였다. 이 세포 용액을 2 mL 냉동 바이알(Corning)에 분취하는 동안 빙조 중에서 유지하고, 이후에 세포를 프로그램화 CryoMed™ 34L 동결기를 사용하여 동결시켰는데, 이는 하기와 같다. 챔버를 4℃로 냉각시키고, 샘플 바이알 온도가 6℃에 도달할 때까지 이 온도를 유지하고, 이어서 샘플이 -7℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 분당 2℃로 낮추고, 이 시점에서 챔버가 -45℃에 도달할 때까지 챔버를 20℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도가 -25℃에 도달할 때까지 그 온도를 10℃/min으로 짧은 시간에 상승되게 한 다음, 샘플 바이알이 -40℃에 도달할 때까지 챔버를 0.8℃/min으로 추가로 냉각시켰다. 이어서, 챔버가 -100℃에 도달할 때까지 챔버 온도를 10℃/min으로 냉각시킨 다음, 이 시점에서 챔버가 -160℃에 도달할 때까지 챔버를 35℃/min으로 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도를 -160℃에서 적어도 10분 동안 유지하고, 이후에 바이알을 가스상 액체 질소 저장소에 옮겼다. 이어서, 고밀도의 이들 냉동보존된 단일 세포를 ISM으로서 사용하였다.
ISM 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내고, 해동시키고, 이를 사용하여 3 리터 유리 교반 현탁 탱크 생물반응기(DASGIP)에 mL당 29만5000개의 생존가능한 세포의 시딩 밀도로 접종하였다. 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내어서 120초 동안 37℃ 수조에 신속히 옮겨두어서 해동시켰다. 이어서, 바이알을 BSC로 이동시키고, 해동된 내용물을 2 mL 유리 피펫을 통해 50 mL 원추형 튜브에 옮겼다. 이어서, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Rho 키나제 억제제 Y-27632가 보충된 10 mL의 E8™ 배지를 튜브에 적가하였다. 세포를 5분 동안 80 내지 200 rcf로 원심분리하였다. 튜브로부터의 상층액을 흡인하고, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 10 mL의 신선한 E8™ 배지를 첨가하고, 세포를 함유하는 부피를 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 450 mL의 E8™ 배지가 담긴 배지 전달병(Cap2V8®, Sanisure, Inc) 내로 피펫팅하였다. 이어서, 병의 내용물을 연동 펌프를 사용하여 멸균 C-Flex® 튜빙 웰드를 통해 생물반응기 내로 직접 펌핑하였다. 생물반응기에는 70 rpm으로 교반된, 37℃로 예비가온된, 0.5% w/v FAF-BSA 및 10 μM Y-27632가 보충된 1000 mL의 E8™ 배지가 준비되어 있었는데, 이때 30%의 용존 산소 설정점(공기 O2, 및 N2가 조절됨), 및 5%의 제어된 CO2 부분 압력을 가졌다. 반응기에 접종하여 0.225 x 106개 세포/mL(농도 범위: 0.2 내지 0.5 x 106개 세포/mL)의 목표 농도를 제공하였다.
일단 반응기에 접종하면, 세포는 교반 반응기 내에 둥근 응집된 클러스터를 형성하였다. 배양물 중에 있은 지 24시간 후에, 원래 부피의 80% 넘게 제거하고 0.5% w/v FAF-BSA가 보충된 1.5 L의 E8™ 배지(신선한 배지)를 다시 첨가함으로써 배지를 부분 교체하였다. 이러한 배지 교체 과정을 접종 후 48시간째에 반복하였다. 둥근 응집된 클러스터로서 현탁 배양물 중에 있은 지 3일 후에, E8™ 폐배지를 제거하고 분화 배지를 첨가함으로써 3 리터 반응기 내에서의 분화가 개시되었다. 분화 프로토콜이 하기에 기재되어 있다.
1기(3일):
반응기를 37℃의 온도로 설정하고, 70 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 10%의 용존 산소 설정점으로 설정하고(공기, O2, 및 N2가 조절됨), CO2 조절을 통해 pH를 7.4로 설정하였다. 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스(물 중 45%); 및 1:50,000 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지를 사용하여 1기 기본 배지를 제조하였다. 100 ng/ml의 GDF8 및 2 μM MCX 화합물이 보충된 1.5 L의 1기 기본 배지 중에서 1일 동안 세포를 배양하였다. 24시간 후에, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하고, 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 신선한 1.5 L의 기본 배지를 반응기에 첨가하였다. 세포를 추가의 배지 교체 없이 48시간 동안 유지하였다.
2기(3일):
반응기를 37℃의 온도로 설정하고, 70 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 30%의 용존 산소 설정점으로 설정하고(공기 O2, 및 N2가 조절됨), CO2 조절을 통해 pH를 7.4로 설정하였다. 1기의 완료 후에, 1기 폐배지를 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 것을 제외하고는 1기 기본 배지로서 사용된 것과 동일한 배지 1.5 L로 대체하여, 전술된 바와 같이 배지 교체를 완료하였다. 배지 교체 후 48시간째에, 폐배지를 다시 제거하고, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 1.5 L의 신선한 기본 배지로 교체하였다.
3기(3일):
2기의 완료 시점에서, 그리고 배지 교체 직전에, 세포를 계수하고, 중력 침강시키고, 1.5 리터 중 200만개 세포/mL의 정규화된 농도로 하기의 3기 기본 배지 중에 재현탁시켰다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지. 3기 기본 배지에 50 ng/mL의 FGF-7; 1 μM RA; 및 400 nM TPB를 보충하였다. 반응기를 37℃의 온도로 설정하고, 70 rpm으로 연속 교반하였다. 가스 및 pH 제어를 30%의 용존 산소 설정점으로 설정하고(공기 O2, 및 N2가 조절됨), CO2 조절을 통해 pH를 7.0으로 설정하였다. 배지 교체 후 24시간째에, 폐배지를, 상기 보충제를 함유하는 1.5 L의 신선한 3기 기본 배지로 다시 대체하였다. 이후에, 세포를 3기가 종료될 때까지 48시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
4기(3일):
3기의 완료 시점에서, 폐배지를 제거하고, 각각의 생물반응기에서 하기로 구성된 1.5 L의 4기 기본 배지로 대체하였다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지. 4기 기본 배지에 0.25 μM SANT-1 및 400 nM TPB를 보충하였다. 반응기를 37℃로 유지하고, 70 rpm으로 교반하였다. 가스 및 pH를 30%의 용존 산소 설정점으로 조절하고(공기, O2, 및 N2가 조절됨), CO2 조절을 통해 7.4의 pH 설정점으로 조절하였다. 4기 개시 후 48시간째에, 3.2 mL/L의 45% 글루코스 용액(8 mM 글루코스 볼루스)을 생물반응기에 첨가하고, 세포를 추가 24시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
5기(8일):
4기의 셋째 날의 종료 시점에서, 폐배지를 제거하고, 하기로 구성된 1.5 L의 5기 기본 배지로 대체하였다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 1.75 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 20 mM 글루코스; 1:200 희석의 ITS-X; 250 μL/L의 1 M 아스코르브산; 10 mg/L의 헤파린으로 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지. 최초 피딩(feeding)을 위하여, 5기 기본 배지에 3,3′,5-트라이요오도-L-티로닌 나트륨 염으로서의 1 μM T3, 10 μM ALK5 억제제 II, 1 μM 감마 세크레타제 억제제 XXI; 20 ng/mL의 베타셀룰린; 0.25 μM SANT-1; 및 100 nM RA를 보충하였다. 5기의 시작 후 48시간째에, 폐배지를 제거하고, 1.5 L의 동일한 신선한 배지 및 보충제로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 제거하고, 1 μM T3, 10 μM ALK5 억제제 II, 20 ng/mL의 베타셀룰린, 및 100 nM RA가 보충된 5기 기본 배지로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 다시 교체하여 1 μM T3, 10 μM ALK5 억제제 II, 20 ng/mL의 베타셀룰린, 및 100 nM RA가 보충된 5기 기본 배지로 대체하고, 5기의 종료까지 48시간 동안 배양하였다.
5기의 8일째의 종료 시점에서(마지막 피딩 후 48시간째에), 응집된 세포 클러스터를 멸균 웰드 및 연동 펌프를 통해 반응기로부터 회수하고, 원심분리하여 펠릿을 형성하였다. 세포를 동결보존시키기 위해, 이를 2.43 g/L의 중탄산나트륨을 함유하는 57.5% MCDB131, 30% Xeno-무함유 KSR, 10% DMSO, 및 2.5% HEPES(최종 농도 25 mM)로 구성된 동결보존 배지에 옮겼다. 일단 세포 클러스터를 주위 온도에서 동결보존 배지 중에 현탁시키면, 냉동-바이알을 프로그램화 동결기(CRF)로 15분 이내로 이동해 두었다. 이어서, 챔버 온도를 45분 동안 4℃로 감소시키고, 추가로 2.00℃/min으로 -7.0℃(샘플)로 감소시켰다. 이어서, 챔버의 온도를 25.0℃/min의 속도로 -45.0℃까지 감소시켜 샘플을 신속하게 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도를 10.0℃/min으로 -25.0℃(챔버)까지 증가시킴으로써 보상 증가를 제공하였다. 이어서, 온도가 -40.0℃에 도달할 때까지 0.2℃/min으로 샘플을 냉각시켰다. 이어서, 챔버를 35.0℃/min의 속도로 -160℃까지 냉각시키고 그 온도에서 15분 동안 유지하였다. 샘플을 CRF 실시의 종료 시에 가스상 액체 질소 저장 용기로 이동하였다.
세포를 가스상 액체 질소 중에 저장한 후에, 세포를 저장소로부터 꺼내어서 해동시키고 37℃ 수욕으로 옮겼다. 작은 빙정이 바이알 내에 남을 때까지, 바이알을 수욕 중에서 2분 미만 동안 온화하게 와동시켰다. 이어서, 바이알 내용물을 50 ml 원추형 튜브에 옮기고, 2.43 g/L의 중탄산나트륨 및 2% BSA를 함유하는 MCDB131 배지를 사용하여 총 20 ml의 최종 부피가 될 때까지 2분에 걸쳐 적가하여 희석시켰다. 이어서, Nucleocounter®에 의해 총 세포수를 결정하였다. 이어서, 세포를 50 ml 원추형 튜브 내에서 배지로부터 단리하고, 상층액을 제거하고, 2.43 g/L의 중탄산나트륨 및 2% BSA를 함유하는 신선한 MCDB131 배지 중에 세포를 재현탁시키고, mL당 세포수가 100만개인 세포 농도로 75 mL 부피까지 채워진 125 mL Corning® 스피너 플라스크에 옮겼다. 세포를 55 RPM으로 교반되는 가습된 5% CO2 인큐베이터 내에서 하룻밤 유지하고, 다음날 세포를 유세포측정에 의해 분석하였다. 세포는, 3회의 반복 시험에서, 해동 후에 NKX6.1/NEUROD1 동시-양성이 50% 초과이고(도 32), NKX6.1/NEUROD1 동시-양성이 80% 초과이고(도 33), NKX6.1/인슐린 동시-양성이 적어도 35%였다. 더욱이, 이들 세포를 NSG 마우스의 신장 피막 아래에 이식하였을 때(용량당 500만개의 세포; N=7), 모든 동물은 검출가능한 수준의 C-펩티드를 가졌으며, 이들은 이식 4주 이내에 평균 1 ng/mL 초과의 C-펩티드를 분비하였다. 이식 후 6주째에, 이식된 동물 7 마리 중 5 마리가 비자극 수준보다 더 높게 글루코스 반응성 인슐린(인간 C-펩티드) 분비를 나타내었으며(도 35), 12주까지 모든 7 마리의 동물이 글루코스 반응성 인슐린(인간 C-펩티드) 분비를 나타내었다(도 36).
이들 데이터는 NKX6.1/인슐린 동시발현 세포가 3기에서 pH 및 용존 산소 조절을 사용하여 생성되어, TGF-베타/BMP 또는 소닉 헤지호그 신호전달을 차단하기 위한 단백질 또는 소분자에 대한 필요성을 제거할 수 있으면서, 또한 4기에서의 NKX6.1/PDX1 양성 세포의 수율을 최대화할 수 있음을 나타내며, 이때 NKX6.1/PDX1 양성 세포는 교반 탱크 반응기에서 제5기를 통해 NEUORD1/NKX6.1/PDX1/인슐린 동시발현으로 추가로 분화될 수 있다. 세포는 동결보존되고, 해동되고, 이식될 수 있으며, 이식 4주 이내에 글루코스 유도된 인슐린 분비(1 ng/mL 초과의 C-펩티드)에 의해 측정된 바와 같이 생체내에서 기능하고, 이식 후 12주까지 글루코스 반응성을 보여줄 것이다.
실시예 8
이 실시예는 3 리터 일회용 스피너 플라스크를 사용하여 교반 현탁 배양물 중에서의 인슐린 발현 세포의 형성을 보여준다. 배지 및 가스를 탈착식 통기형 사이드-아암 캡을 통해 교환하였다. 세포가 먼저 PDX1을 발현하고, 이어서 또한 NKX6.1을 동시발현하는 단계적 과정으로 인슐린 양성 세포를 형성하였다. 이어서, 이들 동시발현 세포는 현탁 배양물 중에 있는 동안에 인슐린 및 추후에는, PDX1 및 NKX6.1과 조합하여, MAFA의 발현을 획득하였다.
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(WA01 세포, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 WiCell Research Institute)를 4회 계대 동안 부착 매트릭스로서 Matrigel™을 사용하여 mTeSR1™ 배지 중에서 부착성 배양 조건에서 성장시키고, 더 큰 용기 내로 연속적으로 증폭시켰다. 세포를 제4 계대에서 다수의 5층 세포 스택("CS5") 내로 시딩하였다. 계대 후 72시간째에, 각각의 CS5에서의 세포 컨플루언시(confluency)는 70 내지 80%에 도달하였다. 폐배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하였다. 이어서, 37℃로 예비가온된 300 mL의 Versene™을 세포에 첨가한 다음, 세포를 8.5분 동안 37℃(5% CO2)에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간 후에, EDTA를 플라스크로부터 조심스럽게 제거하여, 플라스크 내에 대략 50 mL의 잔류 Versene™이 남게 하였다. 이어서, 세포 층들을 잔류 Versene™과 함께 3분 동안 계속 인큐베이션되게 하였는데, 이 동안에는 용기의 간헐적인 탭핑을 거쳐서 세포 클러스터를 해체시켰다. 3분의 이러한 잔류 인큐베이션 후에, 10 μM Y-27632(Enzo Life Sciences)를 함유하는 250 mL의 mTeSR1™을 플라스크에 첨가하여, 세포 해체 과정을 켄칭(quenching)하고 리프팅된 세포 클러스터를 수집하였다. 이어서, 세척 배지를 둥근병에 옮기고, 150 μM Y-27632를 함유하는 추가 150 mL의 mTeSR1™로 CS5를 세척하고, 첫 번째 세척액과 풀링(pooling)하였다. 이어서, 2억개의 세포를, 코팅되지 않았지만 조직 배양물 처리된 CS1에 옮기고, 추가 배지를 보충하여 mL당 세포수가 100만개인 세포 밀도로 200 mL의 최종 부피를 얻었다.
리프팅된 세포를 함유하는 CS1을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2개의 CELI 스택 포트들 사이에 펌프 튜빙이 부착된 폐쇄-루프 C-flex 튜빙을 사용하여, 세포 현탁액을 연동 펌프에 의해 5분 동안 75 rpm으로 분쇄하여 응집체를 균질화하였다. 이어서, 펌프 튜빙 조립체를 0.2 μM 통기형 캡으로 대체하고, 12 내지 22시간의 하룻밤 인큐베이션을 위하여 37℃ 인큐베이터에 반송시켰다. 인큐베이션 후에, 세포는 만능성 세포들의 둥글게 된 구형의 응집된 클러스터를 형성하였다.
이어서, 600 mL의 새로 형성된 클러스터가 담긴 3개의 CS1 용기를 각각, 10 μM Y-27632를 함유하는 추가 1200 mL의 신선한, 예비가온된 mTeSR1™이 담긴 3 L 일회용 스피너 플라스크에 옮겼으며, 이때 결과적인 세포 밀도는 mL당 세포수가 대략 30만개였다. 이어서, 스피너 플라스크를 37℃ 및 40 rpm의 교반 속도로 인큐베이션하였다. 24시간의 인큐베이션 후에, 세포를 교반으로부터 해제하고, 클러스터가 8분 동안 플라스크의 바닥에 침강되게 하였으며, 이후에 클러스터가 용기의 바닥에 안치되는 것을 회피하면서 1.5 L의 폐배지를 상부로부터 흡인하였다. 1.5 mL의 신선한 mTeSR1™ 배지를 세포에 첨가하고, 이것을 추가 24시간의 성장을 위하여 40 rpm의 인큐베이터 내에 되돌려 놓았다. 72시간의 종료 시점에서, 만능성 클러스터를 분화 배지로 옮겼다. 분화 프로토콜이 하기에 기재되어 있다.
1기(3일):
4개의 스피너 플라스크 각각을 동적 현탁액으로부터 교반을 갖지 않는 BSC 내의 인큐베이터에 옮겼다. 하기에 기재된 바와 같이 완전 배지 교체를 수행하여, 단지 잔류 폐배지만이 새로운 배지로 교체됨을 보장하였다. 완전 배지 교체를 수행하기 위하여, 클러스터가 8분 동안 플라스크의 바닥에 침강되게 두었다. 이어서, 진공 흡인을 사용하여, 액체의 상부로부터 출발하여 단지 300 mL만이 남아 있을 때까지 폐배지를 제거하였다. 남아 있는 세포 부피를 150 mL의 원추형 튜브에 옮기고, 3분 동안 800 rpm으로 원심분리하였다. 진공식 흡인 시스템을 사용하여, 세포 클러스터 펠릿을 파괴하지 않고서, 남아 있는 폐배지를 제거하였다. 이어서, 펠릿을 하기를 함유하는 1.8 L의 기본 배지 중에 재현탁시켰다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스(물 중 45%); 및 1:50,000 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지. 1.8 ml의 GDF8 및 540 μL의 MCX 화합물이 보충된 1.8 L의 1기 기본 배지 중에서 1일 동안 세포를 배양하였다. 세포 카운트를 구하여, 분화 시작 시점에서 mL당 50만개 세포의 출발 밀도를 확인하였다. 이어서, 플라스크를 하기 표 XVII에 나타낸 바와 같은 조건에 따라 2개의 속도의 스피너 플레이트 상의 인큐베이터 내에 되돌려 놓았다. 스피너 플라스크를 하룻밤 인큐베이션하였다.
[표 XVII]
대략 24시간 후에, 배지 교체를 완료하여 폐배지로부터 대략 90%를 제거하고 1.8 mL의 GDF8이 보충된 신선한 1.8 L의 기본 배지로 교체하였다. 배지 교체를 수행하기 위하여, 클러스터가 8분 동안 플라스크 바닥에 침강되게 두었고, 단지 300 mL만이 남아 있을 때까지 진공 흡인을 사용하여 폐배지를 제거하였다. 남아 있는 세포를 250 mL 둥근병 내로 옮기고, 클러스터가 6분 동안 침강되게 하였으며, 이후에 피펫을 사용하여 배지를 제거하여 세포를 함유하는 단지 180 mL의 배지만이 남도록 하여, 잔류 폐배지의 10% 이하가 다음 피드(feed)에 옮겨지는 것을 보장하였다. 이어서, 남아 있는 세포 및 배지를 1.8 L의 신선한 배지를 함유하는 스피너 플라스크에 반송시키고, 48시간 동안 인큐베이션되게 하였다.
2기(3일):
전술된 바와 같은 완료 배지 교체를 수행하여, 모든 1기 폐배지를 제거하고, 세포를, 1.8 mL의 FGF7이 보충된 것을 제외하고는 1기 기본 배지로서 사용된 것과 동일한 배지 1.8 L 내로 옮겼다. 이어서, 플라스크를 인큐베이터에 반송시키고, 배지 교체 없이 48시간 동안 동적 교반 상태로 유지되게 하였으며, 이후에 폐배지를 다시 제거하여, 180 mL의 폐배지가 남게 하고 1.8 mL의 FGF7이 보충된 1.8 L의 신선한 기본 배지를 첨가하였다. 이어서, 세포를 24시간 동안 인큐베이션하였다.
3기(3일):
2기의 완료 시점에서, 완료 배지 교체를 수행하여, 모든 2기 배지를 제거하고, 세포를 1.5 L의 배지에 옮겼다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지. 3기 기본 배지에 1.5 mL의 FGF-7; 75 μL의 RA; 및 120 uL의 TPB를 보충하였다. 배지를 "암(dark) 조건" 하에서 제조하였다. mL당 세포수가 대략 150만개 내지 200만개인 세포 밀도를 목표로 하기 위하여, 플라스크의 총 부피를 1.8 내지 2.0 L로부터 1.5 내지 1.65 L로 감소시켰다. 플라스크를 24시간 동안 인큐베이션하였으며, 이후에 배지 교체를 수행하여, 150 mL의 폐배지가 남게 하고, 상기 보충제를 함유하는 1.5 L의 신선한 3기 기본 배지를 첨가하였다. 이후에, 세포를 3기가 종료될 때까지 48시간 동안 배지 중에서 배양하였다.
4기(3일):
3기의 완료 시점에서, 완료 배지 교체를 수행하여 세포를 하기로 구성된 1.5 L의 4기 기본 배지 내로 옮겼다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 2.4 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 2.5 mM 글루코스; 및 1:200 희석의 ITS-X가 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지. 4기 기본 배지에 150 μL의 SANT-1 및 120 μL의 TPB를 보충하였다. 이어서, 플라스크를 인큐베이터에 반송시키고, 배지 교체 없이 48시간 동안 동적 교반 상태로 유지되게 하였다. 48시간의 종료 시점에서, 5.28 mL의 45% D-글루코스 용액을 스피너에 첨가하고, 플라스크를 추가 24시간 동안 인큐베이션에 복귀시켰다.
5기(3일):
4기의 셋째 날의 종료 시점에서, 폐배지를 제거하고, 하기로 구성된 1.5 L의 5기 기본 배지로 대체하였다: 1.18 g/L의 중탄산나트륨을 함유하고, 추가 1.75 g/L의 중탄산나트륨; MCDB-131 중에 미리 재구성된 2% w/v FAF-BSA; 1X 농도의 GlutaMAX™; 20 mM 글루코스; 1:200 희석의 ITS-X; 250 μL/L의 1 M 아스코르브산; 10 mg/L의 헤파린으로 보충된 1.5 L의 MCDB-131 배지. 5기 기본 배지에 3,3′,5-트라이요오도-L-티로닌 나트륨 염으로서의 1 μM T3, 10 μM ALK5 억제제 II, 1 μM 감마 세크레타제 억제제 XXI; 20 ng/mL의 베타셀룰린; 0.25 μM SANT-1; 및 100 nM RA를 보충하였다. 5기의 시작 후 48시간째에, 폐배지를 제거하고, 1.5 L의 동일한 신선한 배지 및 보충제로 대체하였다. 48시간 후에, 배지를 제거하여 1 μM T3, 10 μM ALK5 억제제 II, 20 ng/mL의 베타셀룰린, 및 100 nM RA가 보충된 5기 기본 배지로 대체하고, 5기의 종료까지 48시간 동안 분화를 계속하였다.
5기의 종료 시점에서, 응집된 세포 클러스터가 8분 동안 플라스크 바닥에 침강되게 두었고, 약 300 mL의 액체가 남아 있을 때까지 진공 흡인을 사용하여 배지를 제거하였다. 남아 있는 세포 부피를 150 mL의 원추형 튜브에 옮기고, 3분 동안 800 rpm으로 원심분리한 후, 남아 있는 폐배지를 제거하였다. 세포 펠릿을 세척 배지, 기본 MCDB1313 중에 재현탁시켰다. 세포를 다시 5분 동안 800 rpm으로 스핀 다운하였다. 세포를 동결보존시키기 위해, 이를 2.43 g/L의 중탄산나트륨을 함유하는 57.5% MCDB131, 20% Xeno-무함유 KSR, 10% DMSO, 및 2.5% HEPES(최종 농도 25 mM)로 구성된 동결보존 배지에 옮겼다. 일단 세포 클러스터를 주위 온도에서 동결보존 배지 중에 현탁시키면, 냉동-바이알을 프로그램화 동결기(CRF)로 15분 이내로 이동해 두었다. 이어서, 챔버 온도를 45분 동안 4℃로 감소시키고, 추가로 2.00℃/min으로 -7.0℃(샘플)로 감소시켰다. 이어서, 챔버의 온도를 25.0℃/min의 속도로 -45.0℃까지 감소시켜 샘플을 신속하게 냉각시켰다. 이어서, 챔버 온도를 10.0℃/min으로 -25.0℃(챔버)까지 증가시킴으로써 보상 증가를 제공하였다. 이어서, 온도가 -40.0℃에 도달할 때까지 0.2℃/min으로 샘플을 냉각시켰다. 이어서, 챔버를 35.0℃/min의 속도로 -160℃까지 냉각시키고 그 온도에서 15분 동안 유지하였다. 샘플을 CRF 실시의 종료 시에 가스상 액체 질소 저장 용기로 이동하였다.
세포를 가스상 액체 질소 중에 저장한 후에, 세포의 3개의 바이알을 저장소로부터 꺼내어서 해동시키고 37℃ 수욕으로 옮겼다. 작은 빙정이 바이알 내에 남을 때까지, 바이알을 수욕 중에서 2분 미만 동안 온화하게 와동시켰다. 이어서, 바이알 내용물을 스피너 플라스크에 옮기고, 1.6 g/L의 중탄산나트륨, 8 mM 글루코스, 1x ITS-X, 및 2% BSA의 최종 농도를 달성하도록 보충된 MCDB131 배지를 사용하여 수동으로 스피너를 연속 혼합하면서 10 mL의 해동 배지를 적가하였다. 모든 3개의 바이알을 해동시킨 후에, 추가의 해동 배지를 첨가하여 대략 80 mL의 목표 부피에 도달하게 하였다. 이어서, 스피너 플라스크를 38 내지 40 rpm의 온화한 교반 조건 하에서 5% CO2를 함유하는 가습된 인큐베이터 내에서 하룻밤(16 내지 24시간) 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 하기와 같이 세척하였다. 스피너를 6분 동안 후드 내에서 침강되게 두고, 대략 75 mL의 폐배지를 흡인하였으며, 한편 남아 있는 세포 현탁액을 10 mL 유리 피펫을 사용하여 50 mL 원추형 튜브에 옮기고 후속으로 3분 동안 600 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 흡인하고, 세포 펠릿을 10 mL의 세척 배지 중에 재현탁시켰으며, 이후에 세포를 3분 동안 600 rpm으로 재원심분리하였다. 흡인 및 10 mL의 세척 배지 중에의 세포 펠릿의 재현탁 후에, 펠릿을 스피너 플라스크에 다시 옮기고, 이 안으로 60 mL의 세척 배지를 첨가하였다. 이어서, 플라스크를 BSC 내에서 스핀 플레이트 상에 놓고, 샘플을 균질하게 잘 혼합된 스피너로부터 수집하여 세포 리커버리를 얻었을 뿐만 아니라 분석 및 수송을 위한 세포를 수집하였다.
도 37a 및 도 37b는 스피너 플라스크 내에서의 배양 배지로부터의 pH 프로파일을 나타낸다. 배지의 pH는 인큐베이터 내의 CO2(설정점, 5%)에 의해 조절되고, 세포의 대사 활성, 구체적으로는 락테이트 생성이 도 38에 나타나 있다. 최저 pH 환경, 구체적으로는 조건 A를 갖는 배양물이 또한 최고의 락테이트 농도를 갖는 것으로 제시되어 있다. 도 37a 및 도 37b에 나타나 있는 바와 같이, 2기 동안의 모든 스피너의 pH는 약 6.8 내지 7.2의 범위이고, 3기 전체에 걸쳐서는 약 7.0 내지 7.2의 범위였다. 3기의 완료 후에, 거의 모든 세포가 내배엽 전사 인자 FOXA2 및 췌장 특이적 전사 인자 PDX1 둘 모두를 발현한 것으로 관찰되었다. 또한, 적어도 50%가 NKX6.1을 발현하며, 이때 소집단이 NEUOD1 양성인 것으로 검출되었다. 4기 2일째의 완료 시점인 3기 후 추가 48시간째에, NKX6.1 집단은, Accutase(조건 C 및 조건 D)로 원래 리프팅된 집단의 약 65%로, 그리고 EDTA로 원래 리프팅된 세포들의 집단의 대략 70 내지 75%로 증가하였는데, 이는 표 XVIII에 나타나 있는 바와 같다.
[표 XVIII]
5기의 6일째의 완료 시에, 동결보존시키기 전에 세포를 유세포측정에 의해 다시 분석하였다.
[표 XIX]
신선한 상태(동결보존 전)의 분석과 비교하기 위하여, 해동된 세포를 유세포측정에 의해 평가하였으며, 이는 표 XX에 나타낸 바와 같다. 최종 세포 집단을 해동 시, t=0의 원래의 집단과 대비함으로써 세포 리커버리를 평가하였다. 도 39에 나타낸 바와 같이, LIVE/DEAD 형광 이미징을 통해 세포 생존력을 정성적으로 평가하고, t=0에서의 것과 대비하였다.
[표 XX]
본 발명을 다양한 특정한 재료, 절차 및 실시예를 참고로 하여 본 명세서에서 설명하고 예시하였지만, 본 발명은 그러한 목적을 위해 선택된 재료 및 절차의 특정한 조합에 제한되지 않음이 이해된다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 이러한 상세 사항에 대한 다양한 변화가 암시될 수 있다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되는 것으로 의도되며, 이때 본 발명의 실제 범주 및 사상은 하기 청구범위에 의해 나타난다. 본 출원에서 언급되는 모든 참고 문헌, 특허 및 특허 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

Claims (23)

  1. 세포 배양물(cell culture)로서,
    7.0 내지 7.4 미만인 범위 내의 pH를 갖는 배지 내에서 배양된 췌장 내배엽 계통 세포를 포함하며,
    상기 세포가, 7.4 이상의 pH에서 배양된 췌장 내배엽 계통 세포에 비하여, 적어도 PAX4, PAX6, NGN3, NEUROD1, NKX2.2, 및 ARX의 감소된 수준을 발현시키는,
    세포 배양물.
  2. 제1항에 있어서, 동적 현탁 배양물을 포함하는, 세포 배양물.
  3. 제1항에 있어서, 세포수 1 x 106 개/ml 또는 그 이상의 세포 농도를 포함하는, 세포 배양물.
  4. 제1항에 있어서, 세포수 1.5 x 106 개/ml 또는 그 이상의 세포 농도를 포함하는, 세포 배양물.
  5. 제1항에 있어서, 세포수 2 x 106 개/ml 또는 그 이상의 세포 농도를 포함하는, 세포 배양물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 췌장 내배엽 계통 세포가 PTF1A 및 NGN3의 발현에 대해 음성인, 세포 배양물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 레틴산으로 보충되는, 세포 배양물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 배지가 2 μM 레틴산을 포함하는, 세포 배양물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 췌장 내배엽 계통 세포가 7.2 내지 7.0의 pH를 갖는 배지 내에서 배양되는, 세포 배양물.
  10. 제9항에 있어서, 동적 현탁 배양물을 포함하는, 세포 배양물.
  11. 제9항에 있어서, 세포수 1 x 106 개/ml 또는 그 이상의 세포 농도를 포함하는, 세포 배양물.
  12. 제9항에 있어서, 세포수 1.5 x 106 개/ml 또는 그 이상의 세포 농도를 포함하는, 세포 배양물.
  13. 제9항에 있어서, 세포수 2 x 106 개/ml 또는 그 이상의 세포 농도를 포함하는, 세포 배양물.
  14. 제9항에 있어서, 상기 췌장 내배엽 계통 세포가 PTF1A 및 NGN3의 발현에 대해 음성인, 세포 배양물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 췌장 내배엽 계통 세포가 7.0의 pH를 갖는 배지 내에서 배양되는, 세포 배양물.
  16. 제15항에 있어서, 동적 현탁 배양물을 포함하는, 세포 배양물.
  17. 제15항에 있어서, 세포수 1 x 106 개/ml 또는 그 이상의 세포 농도를 포함하는, 세포 배양물.
  18. 제15항에 있어서, 세포수 1.5 x 106 개/ml 또는 그 이상의 세포 농도를 포함하는, 세포 배양물.
  19. 제15항에 있어서, 세포수 2 x 106 개/ml 또는 그 이상의 세포 농도를 포함하는, 세포 배양물.
  20. 제15항에 있어서, 상기 췌장 내배엽 계통 세포가 PTF1A 및 NGN3의 발현에 대해 음성인, 세포 배양물.
  21. 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 레틴산으로 보충되는, 세포 배양물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 배지가 2 μM 레틴산을 포함하는, 세포 배양물.
  23. 제2항 내지 제5항, 제10항 내지 제13항 및 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 췌장 내배엽 계통 세포가 PTF1A 및 NGN3의 발현에 대해 음성인, 세포 배양물.
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