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CN107250349A - 多能干细胞的悬浮培养 - Google Patents

多能干细胞的悬浮培养 Download PDF

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CN107250349A
CN107250349A CN201580076646.0A CN201580076646A CN107250349A CN 107250349 A CN107250349 A CN 107250349A CN 201580076646 A CN201580076646 A CN 201580076646A CN 107250349 A CN107250349 A CN 107250349A
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B.弗耶
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Centocor Ortho Biotech Inc
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Abstract

本发明提供了使用悬浮群集将多能细胞分化成β细胞的方法。本发明的方法利用对pH、细胞浓度和类视黄醇浓度中的一种或多种的控制，通过抑制早熟NGN3表达并促进NKX6.1表达，从而产生几乎同质的PDX1/NKX6.1共表达细胞群。另外，所述几乎同质的PDX1/NKX6.1共表达细胞群可在体外进一步分化，以形成共表达PDX1、NKX6.1、胰岛素和MAFA的胰腺内分泌细胞群。

Description

多能干细胞的悬浮培养
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年12月19日提交的序列号为62/094,509的美国临时专利申请的权益，该申请全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明涉及多能细胞向胰腺内分泌祖细胞和胰腺内分泌细胞的分化。具体地讲，本发明涉及利用对分化过程中pH、细胞浓度和类视黄醇浓度的控制来促进制备NKX6.1和PDX1共表达胰腺内分泌祖细胞的同质群体的方法，当在体外进一步分化时，与常规分化方法相比，胰腺内分泌祖细胞产生共表达PDX1、NKX6.1、胰岛素和MAFA的更成熟胰腺内分泌细胞群。
背景技术
用于Ⅰ型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得人们把注意力集中在开发适于移植的胰岛素分泌细胞或β细胞的来源上。一种方法是由多能干细胞诸如胚胎干细胞生成功能性β细胞。
在脊椎动物胚胎发育中，多能细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群。组织(诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏)将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是定形内胚层的形成。
到原肠胚形成为止，内胚层划分成可通过一组因子的表达来识别的前-后结构域，所述因子唯一地标记内胚层的前、中和后区。例如，HHEX和SOX2识别内胚层的前区，而CDX1、CDX2和CDX4识别内胚层的后区。
内胚层组织的迁移使内胚层与不同的中胚层组织紧密接近，这有助于肠管的分区。这通过多种分泌因子，诸如成纤维细胞生长因子(“FGF”)、无翼型MMTV整合位点(“WNTS”)、转化生长因子β(“TGF-β”)、视黄酸(“RA”)和骨形态发生蛋白质(“BMP”)配体以及它们的拮抗剂来实现。例如，据报道，FGF4和BMP促进假定后肠内胚层中的CDX2的表达并阻遏前基因HHEX和SOX2的表达(2000Development,127:1563–1567)。WNT信号转导也已显示与FGF信号转导平行工作，以促进后肠发育并抑制前肠命运(2007Development,134:2207–2217)。最后，由间充质分泌的视黄酸调控前肠-后肠边界(2002Curr Biol,12:1215-1220)。
特异性转录因子的表达水平可用于指定组织的身份。在定形内胚层转化成原肠管的过程中，肠管变得分区成广泛结构域，所述广泛结构域可通过限制性基因表达模式在分子水平上进行观察。例如，肠管中分区的胰腺域显示PDX1的极高表达以及CDX2和SOX2的极低表达。PDX1、NKX6.1、胰腺转录因子1α亚基(“PTF1A”)和NKX2.2在胰腺组织中高度表达；而CDX2在肠组织中高度表达。
胰腺形成源于定形内胚层分化成胰腺内胚层。背侧和腹侧胰腺域产生自前肠上皮。前肠也产生食道、气管、肺、甲状腺、胃、肝、胰腺和胆管系统。
胰腺内胚层的细胞表达胰-十二指肠同源盒基因PDX1。在不存在PDX1的情况下，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，PDX1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。成熟的胰腺包括由胰腺内胚层的分化产生的外分泌组织和内分泌组织两者。
D’Amour等人描述了在高浓度激活素和低血清的存在下，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物的产生(Nature Biotechnol 2005,23:1534-1541；美国专利7,704,738)。将这些细胞移植在小鼠的肾包膜下据报道导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟的细胞(美国专利7,704,738)。在添加FGF10和视黄酸后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞还可以分化成PDX1阳性细胞(美国专利申请公布2005/0266554A1)。这些胰腺前体细胞在免疫缺陷小鼠的脂肪垫中的后续移植导致在3-4个月成熟期后形成功能性胰腺内分泌细胞(美国专利7,993,920和美国专利7,534,608)。
Fisk等人报道用于由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(美国专利7,033,831)。小分子抑制剂也已用于诱导胰腺内分泌前体细胞。例如，TGF-β受体和BMP受体的小分子抑制剂(Development 2011,138:861-871；Diabetes 2011,60:239-247)已用于显著提高胰腺内分泌细胞的数目。另外，小分子活化剂也已用于生成定形内胚层细胞或胰腺前体细胞(Curr Opin Cell Biol2009,21:727-732；Nature Chem Biol2009,5:258-265)。
在改善用于培养祖细胞(诸如多能干细胞)的方案中已取得巨大进展。PCT公布WO2007/026353(Amit等人)公开了在二维培养系统中将人胚胎干细胞保持在未分化状态下。Ludwig等人在2006年(Nature Biotechnology,24:185-7)公开了用于在基质上培养人胚胎干细胞的TeSR1确定成分培养基。美国专利申请公布2007/0155013(Akaike等人)公开了使用粘附到多能干细胞的载体在悬浮液中培养多能干细胞的方法，并且美国专利申请公布2009/0029462(Beardsley等人)公开了使用微载体或细胞封装在悬浮液中扩增多能干细胞的方法。PCT公布WO 2008/015682(Amit等人)公开了在没有基底粘合性的培养条件下在悬浮培养物中扩增和保持人胚胎干细胞的方法。美国专利申请公布2008/0159994(Mantalaris等人)公开了在三维培养系统中培养包封在藻酸盐微球内的人胚胎干细胞的方法。
包括Rezania等人(NatureBiotechnology,32:1121-1133(2014))、Pagliuca等人(Cell,159:428-439(2014))和美国专利8,859,286(Agulnick)的文章提出了添加组分来调节TGF-β或BMP信号转导的需要，这通过使用诸如BMP粘合剂(例如头蛋白(Noggin))或BMP受体抑制剂(例如(6-(4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯基)-3-(吡啶-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶盐酸盐)的组分来直接阻断BMP，或者另选地添加TGF-β家族成员来占据受体从而间接地阻断BMP信号转导来实现。最后，提出了在第3阶段使用诸如SANT-1或环杷明的音猬因子抑制剂是有利的，因为音猬因子信号转导的抑制作用能够使PDX1和胰岛素表达(Hebrok等人，Genes&Development,12:1705-1713(1998))。
尽管有这些进展，但仍然需要在三维培养系统中培养可分化成功能性内分泌细胞的多能干细胞的改进方法。
附图说明
图1A为在实施例1的分化方案的过程中每日培养基样品的氧分压随时间(分化天数)变化的绘制图。
图1B为在实施例1的分化方案的过程中每日培养基样品的葡萄糖水平随时间(分化天数)变化的绘制图。
图1C为在实施例1的分化方案的过程中每日培养基样品的乳酸盐水平随时间(分化天数)变化的绘制图。
图1D为在实施例1的分化方案的过程中每日培养基样品的pH水平随时间(分化天数)变化的绘制图。
图2A为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天PDX1表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图2B为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天NKX6.1表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图2C为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天PAX4表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图2D为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天PAX6表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图2E为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天NEUROG3(NGN3)表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图2F为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天ABCC8表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图2G为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天嗜铬粒蛋白A(CHGA)表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图2H为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天G6PC2表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图2I为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天IAPP表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图2J为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天胰岛素表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图2K为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天GC6表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图2L为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天PTF1A表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图2M为在实施例1的分化方案的过程中从第1阶段到第5阶段第1天NEUROD1表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3A为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天PDX1表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3B为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天NKX6.1表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3C为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天PAX6表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3D为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天NEUROD1表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3E为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天NEUROG3(NGN3)表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3F为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天SLC2A1表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3G为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天PAX4表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3H为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天PCSK2表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3I为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天嗜铬粒蛋白A(CHGA)表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3J为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天嗜铬粒蛋白B(CHGB)表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3K为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天胰多肽表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3L为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天PCSK1表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3M为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天G6PC2表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3N为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天胰高血糖素表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图3O为在实施例1的分化方案的过程中从第5阶段第3天到第6阶段第7天胰岛素表达的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图4为根据实施例1的方案分化并且针对以下各项进行染色的第1阶段细胞的FACS分布图：CD184/CXCR4(Y轴)与CD9(X轴)共染色；并且CD184/CXCR4(Y轴)与CD99(X轴)共染色。
图5A为根据实施例1的方案分化并且针对以下各项进行染色的第4阶段细胞的FACS分布图：嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且PDX1(X轴)与Ki67(Y轴)共染色。
图5B为根据实施例1的方案分化并且针对以下各项进行染色的第4阶段细胞的FACS分布图：嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX2.2(Y轴)共染色；并且NEUROD1(X轴)与APC-A(Y轴)共染色。
图6A为根据实施例1的方案、条件A分化并且针对以下各项进行染色的第5阶段细胞的FACS分布图：嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX.2(Y轴)共染色；C-肽(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且胰岛素(X轴)与胰高血糖素(Y轴)共染色。
图6B为根据实施例1的方案、条件A分化并且针对以下各项进行染色的第5阶段细胞的FACS分布图：PDX1(X轴)与Ki67(Y轴)共染色；PAX6(X轴)与OCT4(Y轴)共染色；NEUROD1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；胰岛素(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且PDX1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色。
图7A为根据实施例1的方案、条件B分化并且针对以下各项进行染色的第5阶段细胞的FACS分布图：嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX2.2(Y轴)共染色；C-肽(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且胰岛素(X轴)与胰高血糖素(Y轴)共染色。
图7B为根据实施例1的方案、条件B分化并且针对以下各项进行染色的第5阶段细胞的FACS分布图：PDX1(X轴)与Ki67(Y轴)共染色；PAX6(X轴)与OCT4(Y轴)共染色；NEUROD1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；胰岛素(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且PDX1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色。
图8A为根据实施例1的方案、条件C分化并且针对以下各项进行染色的第5阶段细胞的FACS分布图：嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX2.2(Y轴)共染色；C-肽(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且胰岛素(X轴)与胰高血糖素(Y轴)共染色。
图8B为根据实施例1的方案、条件C分化并且针对以下各项进行染色的第5阶段细胞的FACS分布图：PDX1(X轴)与Ki67(Y轴)共染色；PAX6(X轴)与OCT4(Y轴)共染色；NEUROD1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；胰岛素(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且PDX1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色。
图9A为根据实施例1的方案、条件A分化并且针对以下各项进行染色的第6阶段细胞的FACS分布图：嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX2.2(Y轴)共染色；胰岛素(X轴)与胰高血糖素(Y轴)共染色；C-肽(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且C-肽(X轴)与胰岛素(Y轴)共染色。
图9B为根据实施例1的方案、条件A分化并且针对以下各项进行染色的第6阶段细胞的FACS分布图：PDX1(X轴)与Ki67(Y轴)共染色；PAX6(X轴)与OCT4(Y轴)共染色；NEUROD1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；胰岛素(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且PDX1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色。
图10A为根据实施例1的方案、条件B分化并且针对以下各项进行染色的第6阶段细胞的FACS分布图：嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX.2(Y轴)共染色；胰岛素(X轴)与胰高血糖素(Y轴)共染色；C-肽(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且C-肽(X轴)与胰岛素(Y轴)共染色。
图10B为根据实施例1的方案、条件B分化并且针对以下各项进行染色的第6阶段细胞的FACS分布图：PDX1(X轴)与Ki67(Y轴)共染色；PAX6(X轴)与OCT4(Y轴)共染色；NEUROD1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；胰岛素(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且PDX1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色。
图11A为根据实施例1的方案、条件C分化并且针对以下各项进行染色的第6阶段细胞的FACS分布图：嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；嗜铬粒蛋白A(X轴)与NKX.2(Y轴)共染色；胰岛素(X轴)与胰高血糖素(Y轴)共染色；C-肽(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且C-肽(X轴)与胰岛素(Y轴)共染色。
图11B为根据实施例1的方案、条件C分化并且针对以下各项进行染色的第6阶段细胞的FACS分布图：PDX1(X轴)与Ki67(Y轴)共染色；PAX6(X轴)与OCT4(Y轴)共染色；NEUROD1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；胰岛素(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色；并且PDX1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色。
图12为根据实施例1的方案分化的第4阶段细胞(第15天)、第5阶段细胞(第19天和第22天)和第6阶段细胞(第25天和第29天)的MAFA表达的定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)结果的图。
图13为第6阶段第7天细胞的MAFA表达的显微图。
图14为实施例2的第3阶段到第4阶段的pH、溶解氧和细胞浓度的设定点的流程图。
图15A示出了两幅图，其中示出针对根据实施例2进行的分化从第3阶段的开始到第4阶段第3天持续监测pH期间的pH水平。
图15B示出了两幅图，其中示出针对根据实施例2进行的分化从第3阶段的开始到第4阶段第3天持续监测DO期间的溶解氧水平。
图16A为针对根据实施例2进行的分化从第3阶段的开始到第4阶段第3天每日培养基样品的葡萄糖水平随时间变化的绘制图。
图16B为针对根据实施例2进行的分化从第3阶段的开始到第4阶段第3天每日培养基样品的乳酸盐水平随时间变化的绘制图。
图17为针对根据实施例2进行的分化从第3阶段的开始到第4阶段第3天每日培养基样品的细胞计数随时间变化的绘制图。
图18A为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天PDX1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18B为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天NKX6.1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18C为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天PAX4表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18D为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天PAX6表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18E为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天NEUROG3(NGN3)表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18F为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天ABCC8表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18G为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天嗜铬粒蛋白A表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18H为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天嗜铬粒蛋白B表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18I为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天ARX表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18J为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天生长素释放肽表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18K为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天IAPP表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18L为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天PTF1A表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18M为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天NEUROD1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图18N为在实施例2的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第4阶段第2天NKX2.2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图19示出了根据实施例2的方案分化的第3阶段细胞的FACS分布图，第3阶段的pH设定点为7.0和7.4，并且针对以下各项进行染色：NKX6.1(Y轴)与NEUROD1(X轴)共染色。
图20示出了根据实施例2的方案分化的第4阶段细胞的FACS分布图，第3阶段的pH设定点为7.0和7.4，并且针对以下各项进行染色：NKX6.1(Y轴)与NEUROD1(X轴)共染色。
图21A为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天NEUROG3表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21B为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天NEUROD1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21C为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天NKX2.2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21D为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天ARX表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21E为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天嗜铬粒蛋白A表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21F为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天PCSK2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21G为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天ABCC8表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21H为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天G6PC2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21I为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天胰岛素表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21J为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天ISL1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21K为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天SLC2A1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21L为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天SLC30A8表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21M为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天NKX6.1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21N为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天UCN3表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21O为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天MAFA表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21P为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天PPY表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21Q为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天生长素释放肽表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21R为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天GCG表达的实时qRT-PCR结果的图。
图21S为在实施例2的分化方案的过程中从第4阶段第2天到第5阶段第7天SST表达的实时qRT-PCR结果的图。
图22示出了第6阶段第7天细胞中胰岛素和MAFA表达的显微图。
图23示出了根据实施例2的方案分化并且针对以下各项进行染色的第5阶段第6天细胞的FACS分布图：NKX6.1(X轴)与NEUROD1(Y轴)共染色，NKX6.1(X轴)随细胞计数(Y轴)的变化，并且NEUROD1(X轴)随细胞计数(Y轴)的变化。上图涉及条件A，而下图涉及条件C。
图24A示出了针对根据实施例3在反应器B、C和D中进行的分化从第3阶段的开始到第5阶段持续监测pH期间的pH水平的图。
图24B为示出针对根据实施例3在反应器B、C和D中进行的分化从第3阶段的开始到第5阶段持续监测DO期间的溶解氧水平的图。
图25为针对根据实施例3在反应器B、C和D中进行的分化从第3阶段的开始到第5阶段每日培养基样品的细胞计数随时间变化的绘制图。
图26A为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中PDX1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26B为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中NKX6.1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26C为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中PAX4表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26D为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中PAX6表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26E为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中NEUROG3表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26F为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中ABCC8表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26G为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中嗜铬粒蛋白A表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26H为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中嗜铬粒蛋白B表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26I为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中ARX表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26J为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中生长素释放肽表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26K为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中IAPP表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26L为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中PFT1A表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26M为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中NEUROD1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图26N为在实施例3的分化方案的过程中从第3阶段第1天到第5阶段第1天在反应器B、C和D中NKX2.2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27A为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天NEUROG3表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27B为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天NEUROD1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27C为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天嗜铬粒蛋白A表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27D为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天嗜铬粒蛋白B表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27E为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天GCG表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27F为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天IAPP表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27G为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天ISL1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27H为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天MAFB表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27I为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天胰多肽表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27J为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天生长抑素表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27K为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天胰岛素表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27L为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天G6PC2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27M为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天PCSK1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27N为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天PCSK2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27O为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天SLC30A8表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27P为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天NKX6.1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27Q为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天NKX2.2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图2Y7R为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天MNX1(HB9)表达的实时qRT-PCR结果的图。
图27S为在实施例4的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第7天UCN3表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28A为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天NEUROG3表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28B为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天NEUROD1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28C为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天NKX6.1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28D为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天嗜铬粒蛋白A表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28E为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天嗜铬粒蛋白B表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28F为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天GCG表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28G为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天IAPP表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28H为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天MAFB表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28I为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天PAX6表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28J为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天生长抑素表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28K为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天胰岛素表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28L为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天G6PC2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28M为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天PCSK1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28N为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天SLC30A8表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28O为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天MNX1(HB9)表达的实时qRT-PCR结果的图。
图28P为在实施例5的分化方案的过程中从第5阶段第1天到第6阶段第4天UCN3表达的实时qRT-PCR结果的图。
图29为响应于移植到NSG小鼠肾包膜下的实施例5第6阶段第1天细胞的腹膜内葡萄糖注射的c-肽的图。
图30A为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束ABCC8表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30B为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束ALB表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30C为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束ARX表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30D为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束CDX2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30E为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束嗜铬粒蛋白A表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30F为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束嗜铬粒蛋白B表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30G为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束G6PC2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30H为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束GCG表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30I为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束生长素释放肽表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30J为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束IAPP表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30K为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束胰岛素表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30L为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束ISL1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30M为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束MAFB表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30N为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束MNX1(HB9)表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30O为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束NEUROD1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30P为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束NEUROG3表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30Q为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束NKX2.2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30R为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束NKX6.1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30S为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束PAX4表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30T为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束PAX6表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30U为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束PCSK1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30V为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束PCSK2表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30W为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束PDX1表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30X为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束胰多肽表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30Y为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束PTF1A表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30Z为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束SLC30A8表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30A′为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束SST表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30B′为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束UCN3表达的实时qRT-PCR结果的图。
图30C′为在实施例6的分化方案的过程中从第3阶段第1天到分化方案结束WNT4A表达的实时qRT-PCR结果的图。
图31为在分化的第5阶段第7天移植到NSG小鼠肾包膜下的实施例5细胞(标准，N＝7；以及跳过4，N＝7)的腹膜内葡萄糖注射的平均c-肽响应的图(+/-标准偏差)。
图32为根据实施例7的方案分化并且针对以下项进行染色的第5阶段第7天细胞的FACS分布图：NKX6.1(X轴)与NEUROD1(Y轴)共染色。
图33为根据实施例7的方案分化并且针对以下项进行染色的第5阶段第7天细胞的FACS分布图：PDX1(X轴)与NKX6.1(Y轴)共染色。
图34为根据实施例7的方案分化并且针对以下项进行染色的第5阶段第7天细胞的FACS分布图：NKX6.1(X轴)与胰岛素(Y轴)共染色。
图35为针对移植到NSG小鼠(N＝7)肾包膜下的实施例7的第5阶段第8天细胞在植入后6周、腹膜内葡萄糖注射之前和之后的c-肽响应的图。
图36为针对移植到NSG小鼠(N＝7)肾包膜下的实施例7的第5阶段第8天细胞在植入后12周、腹膜内葡萄糖注射之前和之后的c-肽响应的图。
图37A和图37B为实施例8的转瓶内的培养基的pH曲线图。
图38为实施例8的细胞的乳酸盐生成量的图。
图39示出了实施例8的细胞的活/死荧光成像。
具体实施方式
本发明涉及制备胚胎干细胞和其它多能细胞，该多能细胞保持聚集细胞群集的多能性以便分化成内分泌祖细胞和胰腺内分泌细胞。本发明的一个发现是，通过控制pH、细胞浓度和类视黄醇浓度中的一者或多者，尤其是在其中产生PDX1和PDX1/NKX6.1共表达细胞的分化阶段期间，人们可通过抑制早熟NGN3表达并促进NKX6.1表达来生成几乎同质的PDX1/NKX6.1共表达细胞群，即≥80％、优选≥90％的细胞群。当几乎同质的PDX1/NKX6.1共表达细胞群在体外进一步分化时，它成熟以形成共表达PDX1、NKX6.1、胰岛素和MAFA的胰腺内分泌细胞群。
本发明的另一个发现是，在分化的一个或多个阶段期间，使用低于pH7.4的稳态水平至约7.2或更小的水平、优选约7.2至约7.0、更优选约7.0的pH，同时使用等于或大于约150万个细胞/mL至约300万个细胞/mL、优选约180万个细胞/mL至约300万个细胞/mL、更优选约200万个细胞/mL至约300万个细胞/mL的细胞密度，可消除对于加入组分以抑制、阻断、激活或激动TGF-β或BMP信号转导以及使用音猬因子抑制剂的需要。
在本发明的方法中，前肠内胚层细胞可分化成缺少PTF1A或NGN3表达的胰腺内胚层细胞。据信使用低pH(即，等于或小于约7.2至约7.0)会阻断NGN3的表达。PTF1A或NGN3阴性细胞可在后续阶段进一步富集为胰腺内胚层细胞群，该胰腺内胚层细胞群具有高水平的PDX1和NKX6.1(等于或大于96％阳性)并且表达一些PTF1A，但仍不具有NGN3表达。细胞可直接从缺少PTF1A或NGN3表达的胰腺内胚层阶段直接进入其中在高NGN3表达的情况下胰腺内分泌前体细胞在阶段结束时转变为胰腺内分泌细胞的阶段。此外，一旦缺少PTF1A或NGN3表达的胰腺内胚层细胞进入该阶段(其中形成了胰腺内分泌细胞)，细胞便开始显示出MAFA的表达(通过PCR确认)，并且这种表达可在阶段结束时以蛋白质形式被检测。
可用于本发明的干细胞是通过其在单细胞水平上既自我更新又分化的能力来定义的未分化细胞。干细胞可产生子代细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞的特征还在于其在体外分化成来自多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的多种细胞谱系的功能性细胞的能力。干细胞还在移植后产生多种胚层的组织，并且在注射到胚泡内之后，促成基本上至大部分(如果不是所有的话)组织。
干细胞是根据其发育潜能分类的。“细胞培养”或“培养”一般是指从活生物体取得并且在受控的条件下生长(“培养”或“被培养”)的细胞。“原代细胞培养”是在第一传代培养之前培养从生物体直接取得的细胞、组织或器官。当在有利于细胞生长和分裂中的一者或两者条件下，将细胞放置在生长培养基中时，它们在培养中扩增产生更大的细胞群。当细胞在培养中扩增时，有时通过细胞数目翻倍所需的时间量(称为“倍增时间”)来测量细胞增殖率。
如本文所用，“扩增”是通过培养增加多能干细胞的数目的过程，诸如增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、75％、90％、100％、200％、500％、1000％或更多，以及这些百分比内的水平。应当理解，可从单个多能干细胞获得的多能干细胞的数目取决于多能干细胞的增殖能力。多能干细胞的增殖能力可以通过细胞的倍增时间(即，细胞在培养中经历有丝分裂所需的时间)，以及多能干细胞可保持在未分化状态中的周期(其等于传代数目乘以每次传代之间的天数)来计算。
分化是这样一个过程，通过该过程，非特化的(“非定向的”)或少特化的细胞可获得特化细胞(诸如神经细胞或肌细胞)的特征。分化的细胞或分化诱导的细胞是已在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用于分化过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型亚群，且在正常环境下不能分化成不同的细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。“去分化”指细胞回复到细胞谱系中特化(或定向)程度较低的位置的过程。如本文所用，“细胞谱系”限定细胞的遗传，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传方案内。谱系特异性标记物指与所关注谱系的细胞的表型明确相关的特征，并且可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。
如本文所用，“标记物”是在所关注的细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在该语境中，差异表达意指与未分化细胞相比阳性标记物的水平升高并且阴性标记物的水平下降。与其他细胞相比，标记物核酸或多肽在所关注细胞中的可检测水平充分地较高或较低，使得可使用本领域已知的多种方法中的任何一种将所关注细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
如本文所用，当在细胞中充分地检测到特定标记物时，细胞“对于特定标记物呈阳性”或是“阳性的”。相似地，当在细胞中未充分检测到特定标记物时，细胞“对于特定标记物呈阴性”或是“阴性的”。具体地讲，用FACS检测到的阳性通常大于2％，而用FACS检测到的阴性阈值通常小于1％。使用PCR系统的PCR检测到的阳性通常小于30个循环(Ct)，并且阴性通常为30个循环或以上。使用PCR分析的PCR检测到的阳性通常小于34个循环(Ct)，并且用PCR检测到的阴性通常大于34.5个循环。
如本文所用，“细胞密度”和“接种密度”可互换使用，并且是指每单位面积的固体或半固体平坦或弯曲培养基所接种的细胞的数量。
“细胞浓度”用于指每给定单位体积的细胞数量。
如本文所用，“悬浮培养物”是指悬浮在培养基中而不是粘附到表面的细胞、单个细胞、群集、或单个细胞和群集的混合物的培养物。
如本文所用，“无血清”是指不含人或动物血清。因此，无血清培养基不包含血清或血清的部分。
在复制将多能干细胞分化成细胞培养物中的功能性胰腺内分泌细胞的尝试中，分化过程通常被视为通过多个连续阶段进行。如本文所用，各个阶段由培养时间，以及本文所包含的示例中列出的试剂限定。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下述标记物中的至少一种：FOXA2(也称为肝细胞核因子3-β(HNF3β))、GATA4、GATA6、MNX1、SOX17、CXCR4、Cerberus、OTX2、brachyury、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。定形内胚层细胞的特征性标记物包括CXCR4、FOXA2和SOX17。因此，定形内胚层细胞可通过其对CXCR4、FOXA2和SOX17的表达来表征。此外，取决于细胞能保持在分化的第一阶段中的时长，可能观察到HNF4α增多。
如本文所用，“前肠内胚层细胞”是指产生食道、肺、胃、肝、胰腺、胆囊和一部分十二指肠的内胚层细胞。前肠内胚层细胞表达下列标记物中的至少一种：PDX1、FOXA2、CDX2、SOX2和HNF4α。前肠内胚层细胞的特征可在于与肠管细胞相比，PDX1表达提高。
如本文所用，“胰腺前肠前体细胞”是指表达下列标记物中的至少一种的细胞：PDX1、NKX6.1、HNF6、NGN3、SOX9、PAX4、PAX6、ISL1、胃泌素、FOXA2、PTF1A、PROX1和HNF4α。胰腺前肠前体细胞可通过对于PDX1、NKX6.1和SOX9的表达呈阳性来表征。
如本文所用，“胰腺内胚层细胞”是指表达下列标记物中的至少一种的细胞：PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1A、HNF6、HNF4α、SOX9、NGN3；胃泌素；HB9或PROX1。胰腺内胚层细胞的特征可在于没有CDX2或SOX2大量表达。
如本文所用，“胰腺内分泌前体细胞”是指能够变成胰腺激素表达细胞的胰腺内胚层细胞。胰腺内分泌前体细胞表达以下标记物中的至少一种：NGN3、NKX2.2、NeuroD1、ISL1、PAX4、PAX6、或ARX。胰腺内分泌前体细胞的特征可在于其表达NKX2.2和NEUROD1。
如本文所用，“胰腺内分泌细胞”指能够表达下列激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、生长素释放肽和胰多肽。除了这些激素以外，胰腺内分泌细胞特征性标记物还包括以下标记物：NGN3、NeuroD1、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、ARX、NKX2.2和PAX6中的一种或多种。表达β细胞的特征性标记物的胰腺内分泌细胞可通过其对胰岛素以及至少一种下列转录因子的表达来表征：PDX1、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD1、ISL1、HNF3β、MAFA、PAX4和PAX6。
所谓“类视黄醇”是指视黄酸或为类视黄醇受体激动剂的化合物。
在本文中可互换使用的是“d1”、“d1”和“第1天”；“d2”、“d2”和“第2天”；“d3”、“d3”和“第3天”等。这些数字字母组合是指在本专利申请的逐步分化方案过程中的不同阶段中温育的具体天数。
“葡萄糖”和“D-葡萄糖”在本文中可互换使用，并且指右旋糖，在自然界中通常发现的糖。
多能干细胞可表达指定的TRA-1-60和TRA-1-81抗体(Thomson等人，1998，Science282:1145-1147)中的一种或多种。多能干细胞在体外的分化导致TRA-1-60和TRA-1-81表达的丧失。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，这种活性可以通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Red作为底物显色来检测，如制造商(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)描述的那样。未分化的多能干细胞通常也表达OCT4和TERT，这通过RT-PCR检测。
增殖的多能干细胞的另一理想表型是分化成所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞的潜能。可以例如通过如下方式来确认干细胞的多能性：将细胞注射入重症联合免疫缺陷(“SCID”)小鼠中，使用4％的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后对其进行组织学检测，找出来自该三个胚层的细胞类型的证据。作为另一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中与三个胚层相关的标记物的存在来确定多能性。
增殖的多能干细胞系可用标准G显带技术进行核型分析并与公开的相应灵长类物种的核型相比较。希望获得具有“正常核型”(其意指细胞是整倍体的)的细胞，其中所有人染色体都存在并且无明显的改变。多能细胞在培养物中可使用多种饲养层或通过使用基质蛋白质涂覆的容器容易地扩增。另选地，可使用与成分确定的培养基例如1培养基(StemCell Technologies,Vancouver,BC,Canada)组合的化学成分确定的表面来执行常规细胞扩增。
根据本发明的一些实施方案的方法在悬浮培养物中培养通过以允许细胞存活和增殖但限制分化的细胞浓度在培养容器中接种多能干细胞而实现。通常，使用足以将细胞维持在多能未分化状态的接种密度。应当理解，虽然可接种干细胞的单细胞悬液，但小的细胞群集可能是有利的。
为了在悬浮培养时提供足够且持续供给营养物质和生长因子的多能干细胞，可每天或在预定的时间表，诸如每1天至5天替换或补充培养基。大的多能干细胞群集可导致细胞分化，因此可采取措施以避免大的多能干细胞聚集体。根据本发明的一些实施方案，所形成的多能干细胞群集例如每2天至7天被解离，并且单个细胞或小细胞团块被分到另外的培养容器中(即，传代)，或者保持在相同的培养容器中并且用置换培养基或另外的培养基处理。
包括由离心产生的多能干细胞粒料的大多能干细胞团块可经受酶消化和机械解离中的一者或两者。多能干细胞团块的酶消化可通过使团块经受酶，诸如IV型胶原酶、分散酶或的处理来进行。大的多能干细胞团块的机械解离可使用被设计成使团块破裂成预定尺寸的装置来进行。除此之外或作为另一种选择，机械解离可使用针或移液管手动进行。
用于在悬浮液中根据本发明的一些实施方案的方法培养多能干细胞的培养容器可为任何组织培养容器(例如，具有适于培养多能干细胞的纯度级)，该培养容器具有被设计成使得在其中培养的多能干细胞不能粘附或附接到此表面的内表面(例如，未用组织培养物处理的容器，用于防止附接或粘附到表面)。优选地，为了获得可扩展培养物，使用控制培养系统(优选地为计算机控制的培养系统)来实现根据本发明的一些实施方案的培养，在控制培养系统中使用合适的装置自动监测和控制培养参数，诸如温度、搅动、pH和氧气。一旦确定所需的培养参数，系统可被设置为根据需要自动调整培养参数以增强多能干细胞扩增和分化。
可在动态条件下(即，在多能干细胞在悬浮培养时经受持续运动的条件下，例如搅拌悬浮培养系统)或在非动态条件(即，静态培养)下培养多能干细胞，同时保留其增殖能力、多能性能力以及在多次传代中的染色体核型稳定性。
对于多能干细胞的非动态培养，多能干细胞可以在以下项中培养：培养皿、T-烧瓶、(Corning Incorporated,Corning,NY)、(CorningIncorporated,Corning,NY)或涂覆或未涂覆的细胞工厂(NUNCTMCell FactoryTMSystemsThermo Fisher Scientific,Inc.,Pittsburgh,PA)。对于多能干细胞的动态培养，可在合适的容器(诸如转瓶或锥形瓶、不锈钢、玻璃或单次使用塑料振动器或搅拌罐容器)中培养多能干细胞。培养容器可连接到控制单元，从而呈现控制培养系统。可连续或间歇地搅动培养容器(例如，转瓶或锥形瓶)。优选地，充分搅动培养容器以保持多能干细胞悬浮。
多能干细胞可在提供足够营养物质和环境刺激以促进生长和扩增的任何培养基中培养。合适的培养基包括E8TM、IH3和1或2。可定期更换培养基以更新营养物质供应并移除细胞副产物。根据本发明的一些实施方案，培养基每天更换。
任何多能干细胞均可用于本发明的方法中。可使用的多能干细胞的示例性类型包括衍生自妊娠后形成的组织的建立的多能细胞系，包括在妊娠期间的任何时间取得的胚胎前组织(例如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织，所述时间通常但不一定是在约10至12周妊娠前。非限制性示例是建立的人胚胎干细胞(“hESC”)系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell Research Institute,Madison,WI,USA)。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群的细胞。
另外合适的是诱导多能细胞(IPS)或重新编程的多能细胞，其可使用多种多能相关的转录因子的被迫表达而衍生自成人体细胞，所述转录因子诸如OCT4、NANOG、SOX2、KLF4和ZFP42(Annu Rev Genomics Hum Genet 2011,12:165-185)。在本发明的方法中使用的人胚胎干细胞也可如Thomson等人(美国专利5,843,780；Science,1998,282:1145-1147；CurrTop Dev Biol 1998,38:133-165；Proc Natl Acad Sci U.S.A.1995,92:7844-7848)所述进行制备。同样合适的是突变的人胚胎干细胞系，诸如例如BG01v(BresaGen,Athens,Ga.)，或衍生自成人体细胞的细胞，诸如例如在Takahashi等人，Cell 131:1-12(2007)中公开的细胞。适用于本发明的多能干细胞可以根据在以下文献中描述的方法来获得：Li等人(CellStem Cell 4:16-19,2009)；Maherali等人(Cell Stem Cell 1:55-70,2007)；Stadtfeld等人(CellStem Cell2:230-240)；Nakagawa等人(NatureBiotechnology 26:101-106,2008)；Takahashi等人(Cell 131:861-872,2007)；以及美国专利申请公布2011-0104805。多能干细胞的其他来源包括诱导的多能细胞(IPS,Cell,126(4):663-676)。适于在本发明的方法中使用的细胞的其他来源包括人脐带组织衍生的细胞、人羊水衍生的细胞、人胎盘衍生的细胞，以及人孤雌生殖体。在一个实施方案中，脐带组织衍生的细胞可以使用美国专利7,510,873的方法来获得，由于该专利涉及细胞的分离和表征，其公开内容全文以引用方式并入。在另一个实施方案中，胎盘组织衍生的细胞可使用美国专利申请公布2005/0058631的方法来获得，由于该专利涉及细胞的分离和表征，其公开内容全文以引用方式并入本文。在另一个实施方案中，羊水衍生的细胞可使用美国专利申请公布号2007/0122903的方法来获得，由于该专利涉及细胞的分离和表征，其公开内容全文以引用方式并入本文。
多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且多能干细胞的其他特征有待继续鉴定。多能干细胞标记物包括例如一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或全部)下列标记物的表达：ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81。在一个实施方案中，适于在本发明的方法中使用的多能干细胞表达CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81中的一种或多种(例如，1、2、3种或全部)，但缺少如通过流式细胞术检测到的分化CXCR4(也称为CD184)的标记物的表达。在另一个实施方案中，适于在本发明的方法中使用的多能干细胞表达由RT-PCR检测到的CD9、NANOG和POU5F1/OCT4中的一种或多种(例如，1、2种或全部)。
示例性的多能干细胞包括人胚胎干细胞系H9(NIH代码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH代码：WA07)，以及人胚胎干细胞系SA002(Cellartis,Sweden)。在一个实施方案中，多能干细胞是人胚胎干细胞，例如H1hES细胞。在另选实施方案中，使用非胚胎来源的多能干细胞。
在下述实施方案的一些中，本发明涉及分离和培养干细胞，具体地讲，涉及培养干细胞群集，其保持动态悬浮培养系统的多能性。多能细胞群集可被分化以产生功能性β细胞。
用于本发明的方法中的多能干细胞在朝向所需终点分化之前优选地在动态悬浮培养物中扩增。有利的是，已经发现多能干细胞可作为悬浮液中的细胞群集在合适的培养基中培养和扩增，而不损失多能性。这种培养可在动态悬浮培养系统中进行，其中细胞或细胞群集保持充分地移动以防止多能性损失。可用的动态悬浮培养系统包括配备有用于搅动培养内容物的装置的系统，诸如通过搅拌、摇动、再循环或使气体鼓泡通过培养基来进行搅动。只要保持足够的细胞群集运动以促进扩增并防止过早分化，这种搅动便可为间歇的或连续的。优选地，搅动包括诸如通过以特定速率旋转的叶轮来进行连续搅拌。叶轮可具有圆形底部或平坦底部。叶轮的搅拌速率应使得群集保持在悬浮液中并使沉降最小化。另外，叶轮叶片的角度可被调整成有助于细胞和群集的向上运动以避免沉降。此外，叶轮类型、角度和旋转速率可全部被协调成使得细胞和群集位于呈现为均匀胶态悬浮液的物质中。
可通过将静态培养的干细胞转移到适当的动态培养系统(诸如一次性塑料、可重复使用塑料、不锈钢或玻璃容器，例如转瓶或锥形瓶)来实现多能干细胞群集的悬浮培养和扩增。例如，在贴壁静态环境(即，板或培养皿表面)中培养的干细胞可首先通过用螯合剂或酶处理来从表面移除。合适的酶包括但不限于，I型胶原酶、分散酶(Sigma Aldrich LLC,St.Louis,MO)或以商品名(Sigma Aldrich LLC,St.Louis,MO)销售的可商购的市售配方。是包含胶原蛋白酶和蛋白水解酶的细胞分离溶液(从甲壳类动物中分离)，并且不包含哺乳动物衍生产物或细菌衍生产物。因此，在一个实施方案中，酶为胶原蛋白酶或蛋白水解酶，或者包含胶原蛋白酶和蛋白水解酶的细胞分离溶液。合适的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(“EDTA”)。在一些实施方案中，用酶或螯合剂温育多能干细胞培养物，优选地直到菌落边缘开始卷曲和提升，但在菌落从培养物表面完全分离之前。在一个实施方案中，在室温下温育细胞培养物。在一个实施方案中，在高于20℃、高于25℃、高于30℃或高于35℃的温度下，例如在介于约20℃和约40℃之间、约25℃和约40℃之间、约30℃和约40℃之间的温度下，例如在约37℃下温育细胞。在一个实施方案中，将细胞温育至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟，例如介于约1分钟和约30分钟之间、约5分钟和约30分钟之间、约10分钟和约25分钟之间、约15分钟和约25分钟之间，例如约20分钟。在一个实施方案中，该方法涉及在处理后从细胞培养物中移除酶或螯合剂的步骤。在一个实施方案中，在移除酶或螯合剂之后，将细胞培养物洗涤一次或两次或更多次。在一个实施方案中，用适当的培养基，诸如1(Stem Cell Technologies,Vancouver,BC,Canada)洗涤细胞培养物。在一个实施方案中，提供了Rho-激酶抑制剂(例如，Y-27632，Axxora目录号ALX-270-333，San Diego,CA)。Rho-激酶抑制剂的浓度可为约1至约100μM、约1至90μM、约1至约80μM、约1至约70μM、约1至约60μM、约1至约50μM、约1至约40μM、约1至约30μM、约1至约20μM、约1至约15μM、约1至约10μM、或约10μM。在一个实施方案中，添加至少1μM、至少5μM或至少10μM的Rho-激酶抑制剂。可用刮刀或橡胶淀帚从静态培养系统的表面提升细胞。可使用玻璃移液管或其他合适的装置将培养基和细胞转移到动态培养系统。在优选的实施方案中，每日更换动态培养系统中的培养基。
在一个实施方案中，本发明提供了在三维悬浮培养物中培养和扩增多能干细胞的方法。具体地讲，该方法提供了通过形成这些多能干细胞的聚集细胞群集来培养和扩增多能干细胞。细胞群集可通过在培养细胞之前用酶(例如，中性蛋白酶，例如分散酶)或螯合剂处理多能干细胞培养物而形成。可优选地在搅拌或摇动悬浮培养系统中培养细胞。在一个实施方案中，本发明还提供由多能干细胞的此类群集形成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞。
优选地，细胞群集为聚集的多能干细胞。聚集的干细胞表达一个或多个多能性标记物，例如标记物CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81中的一个或多个(例如，1个、2个、3个或全部)，但缺少对一个或多个分化标记物的表达，例如缺少对CXCR4的表达。在一个实施方案中，聚集的干细胞表达多能性标记物CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81，但缺少对分化标记物CXCR4的表达。
一个实施方案为在悬浮培养物中将多能干细胞培养为细胞群集的方法。细胞群集为在动态搅拌或摇动悬浮培养系统中培养的聚集多能干细胞。可使用作为细胞提升剂的酶(诸如中性蛋白酶，例如分散酶)将细胞群集从平面贴壁培养物转移到搅拌或摇动悬浮培养系统。示例性合适的酶包括但不限于IV型胶原酶、分散酶或细胞在搅拌或摇动悬浮培养系统(具体地讲，搅拌悬浮培养系统)中保持多能性。
本发明的另一个实施方案为在悬浮培养物中将多能干细胞培养为细胞群集的方法，其中细胞群集为使用螯合剂(例如EDTA)从平面贴壁培养物中转移并在搅拌或摇动悬浮培养系统中培养的聚集多能干细胞。细胞群集在搅拌或摇动悬浮培养系统(具体地讲，搅拌(动态搅动)悬浮培养系统)中保持多能性。
本发明的另一个实施方案为在悬浮培养物中将多能干细胞培养为细胞群集的方法，其中细胞群集为使用酶从平面贴壁培养物中转移并在搅拌或摇动悬浮培养系统中培养的聚集多能干细胞。细胞群集在动态搅动悬浮培养系统中保持多能性。
本发明的细胞群集可分化成中胚层细胞诸如心脏细胞，外胚层细胞诸如神经细胞、单激素阳性细胞或胰腺内胚层细胞。该方法还可包括分化，例如将胰腺内胚层细胞分化成胰腺前体细胞和胰腺激素表达细胞。在另一个实施方案中，胰腺前体细胞通过表达β细胞转录因子PDX1和NKX6.1来表征。
在一个实施方案中，分化步骤在悬浮培养系统中至少12小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少144小时、至少168小时、至少196小时或更多个小时之后，优选地在约48小时至约72小时之后进行。可使用培养基组分的逐步发展诸如实例或下表A中所描述的来进行分化。
在一个实施方案中，三维细胞群集通过以下步骤产生：使多能干细胞在平面贴壁培养物中生长；将多能干细胞扩增成聚集细胞群集；以及使用酶或螯合剂将多能干细胞群集从平面贴壁培养物转移到动态悬浮培养物。另一个实施方案为通过以下步骤在动态搅动悬浮培养系统中扩增并分化多能干细胞的方法：使多能干细胞在平面贴壁培养物中生长；将多能干细胞扩增成聚集细胞群集；并使用酶或螯合剂将多能干细胞群集从平面贴壁培养物转移到动态悬浮培养物；以及在动态搅动悬浮培养系统中分化多能细胞群集以产生胰腺前体细胞群。
另一个实施方案为包含由扩增多能干细胞群集的悬浮液制备的分化干细胞的可移植干细胞衍生的细胞产物，所述扩增多能干细胞群集分化成胰腺前体细胞。更具体地，可移植干细胞衍生的产物通过以下步骤而产生：使多能干细胞在平面贴壁培养物中生长；将多能干细胞扩增成聚集细胞群集；并使用酶或螯合剂将多能干细胞群集从平面贴壁培养物转移到动态悬浮培养物；以及在动态搅动悬浮培养系统中分化多能细胞群集。可移植干细胞衍生的细胞产物优选地用于治疗糖尿病。
在另一个实施方案中，该方法包括移植到糖尿病动物体内，以在体内进一步成熟为功能性胰腺内分泌细胞。
另一个实施方案为在悬浮培养系统中扩增和分化多能干细胞的方法，该方法包括以下步骤：使多能干细胞在平面贴壁培养物中生长；使用酶从平面贴壁培养物移除多能干细胞；将多能干细胞贴壁到静态培养物中的微载体；在动态搅动悬浮培养系统中扩增多能细胞；以及在动态搅动悬浮培养系统中分化多能细胞以产生胰腺前体细胞群。
微载体可为本领域中已知的用于粘附细胞的任何形式，具体地讲，微载体可为微珠。微载体可由天然来源的材料或合成来源的材料构成。微载体的示例包括基于胶原蛋白的微载体、基于葡聚糖的微载体或基于纤维素的微载体。例如，微载体珠可为具有附接到表面以向微载体提供正电荷表面的阳离子三甲基铵的改性聚苯乙烯珠。珠直径可在约90μm至约200μm、或者约100μm至约190μm、或者约110μm至约180μm、或者约125μm至175μm的直径范围内。微载体珠还可为化学地耦合到交联葡聚糖基质的变性胶原蛋白的薄层。微载体珠可为玻璃、陶瓷、聚合物(诸如聚苯乙烯)、或金属。另外，微载体可为未涂布的，或者诸如用硅或诸如胶原蛋白的蛋白质涂布的。在又一个方面，微载体可由增强细胞与微载体的结合并增强细胞从微载体脱离的化合物构成或涂有所述化合物，所述化合物包括但不限于透明质酸钠、聚(单硬脂酰甘油酯共-丁二酸)、聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、赖氨酸、n-异丙基丙烯酰胺、玻连蛋白以及胶原蛋白。示例还包括具有微电流的微载体，诸如具有产生低水平生物相关电力的锌和铜颗粒电偶的微载体；或顺磁性的微载体，诸如顺磁性藻酸钙微载体。
在一些实施方案中，胰腺内胚层细胞群通过多能细胞群集的逐步分化获得。在一些实施方案中，多能细胞是人胚胎多能干细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞为原条前体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞是中内胚层细胞。
在一些实施方案中，本发明涉及逐步分化多能细胞的方法，该方法包括在动态悬浮培养物中培养第3-5阶段细胞。在一些实施方案中，将所产生的胰腺内胚层群移植到糖尿病动物体内，以在体内进一步成熟为功能性胰腺内分泌细胞。本发明还提供了用于在本发明的方法中使用的系统或试剂盒。
本发明还提供可通过本发明的方法获得的细胞或细胞群。本发明还提供已通过本发明的方法获得的细胞或细胞群。
本发明提供治疗方法。具体地讲，本发明提供了用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法。
本发明还提供可通过本发明的方法获得或已通过本发明的方法获得以用于治疗方法的细胞或细胞群。具体地讲，本发明提供可通过本发明的方法获得或已通过本发明的方法获得以用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法的细胞或细胞群。糖尿病可为1型糖尿病或2型糖尿病。
在一个实施方案中，治疗方法包括将已通过本发明的方法获得或可通过本发明的方法获得的细胞植入患者体内。
在一个实施方案中，治疗方法包括使多能干细胞在体外分化成第1阶段、第2阶段、第3阶段、第4阶段、第5阶段或第6阶段细胞，例如如本文所述，以及将分化的细胞植入患者体内。
在一个实施方案中，该方法还包括在使多能干细胞分化的步骤之前，例如如本文所述的培养多能干细胞的步骤。
在一个实施方案中，该方法还包括植入步骤之后的在体内分化细胞的步骤。
在一个实施方案中，患者是哺乳动物，优选地是人类。
在一个实施方案中，可将这些细胞作为分散的细胞植入，或可使这些细胞形成可植入或另选地输注到肝门静脉内的群集。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主免疫应答的破坏。可将细胞植入到受体中的任何适当部位内。植入部位包括例如肝脏、天然的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。
为了增强植入细胞在体内的进一步分化、存活率或活性，可在施用细胞之前、与之同时或之后施用额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。这些因子可由内源性细胞分泌，并原位接触施用的细胞。可通过本领域已知的内源施用的生长因子和外源施用的生长因子的任意组合来诱导植入细胞分化。
移植中所用的细胞量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应，并且可由本领域技术人员确定。
在一个实施方案中，治疗方法还包括在移植前将所述细胞掺入三维支持物中。在移植到患者体内之前，可将该细胞体外保持在该支持物上。作为另一种选择，可将包含该细胞的支持物直接植入到患者体内而无需进行另外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。
在本发明的某些实施方案中，表A所列出组分中的一种或多种可用于本发明的方法中：
表A
如本文所用，“MCX化合物”为14-丙-2-烯-1-基-3,5,7,14,17,23,27-七氮杂四环[19.3.1.1～2,6-～.1～8,12.～]二十七烷-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-壬烷-16-酮，其具有下式(式1)：
其他环状苯胺-吡啶三嗪也可代替上述MCX化合物使用。此类化合物包括但不限于14-甲基-3,5,7,14,18,24,28-七氮杂四环[20.3.1.1～2,6～.-1～8,12～]二十八烷-1(26),2(28),3,5,8(27),9,11,22,24-壬烷-17-酮、和5-氯-1,8,10,12,16,22,26,32-八氮杂五环[24.2.2.1～3,7～-1～9,13～.1～14,18～]三十-3(33),4,6,9(32),10-,12,14(31),15,17-壬烷-23-酮。这些化合物在下文中示出(式2和式3)：
示例性的合适的化合物在美国专利申请公布2010/0015711中公开，由于该专利涉及MCX化合物、相关环状苯胺-吡啶三嗪，以及它们的合成物，其公开内容全文并入。
该文档中通篇引用的出版物据此全文以引用方式并入。
实施例
通过下列非限制性实施例可以对本发明进行进一步说明。
实施例1
该实施例展示了使用0.5升转瓶在搅拌悬浮培养系统中形成胰岛素表达细胞。培养基和气体通过可移除侧臂盖交换。胰岛素阳性细胞在分步过程中形成，在该过程中细胞首先表达PDX1，然后还共表达NKX6.1，其为胰腺β细胞形成和发挥功能所需的蛋白质转录因子。然后这些共表达细胞在悬浮培养时获得胰岛素和随后的MAFA、以及PDX1和NKX6.1的表达。当该细胞群被移植到免疫受损小鼠的肾包膜中时，移植物在移植后四周产生了可检测血液水平的人C-肽。
在Essential 8TM(“E8TM”)培养基(Life Technologies Incorporated,Carlsbad,California；目录号A15169-01)中，使人胚胎干细胞系H1细胞(WA01细胞，WiCell ResearchInstitute,Madison,Wisconsin)作为圆形聚集群集动态悬浮培养≥4个传代，该培养基补充有0.5％重量体积比(“w/v”)的无脂肪酸牛血清白蛋白(“FAF-BSA”)(Proliant,Inc.,Boone,Idaho；目录号68700)。然后按照以下方法以单个细胞和2至10个细胞的群集的形式冷冻群集。将大约60000-100000万个细胞的聚集群集转移至离心管，并使用100mL的不含钙或镁的1X Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(“DPS-/-”)(Life Technologies；目录号14190-144)洗涤。洗涤之后，然后通过向松散的细胞聚集体沉淀物加入30mL的50体积％酶(Life Technologies，目录号A11105-01)和50体积％DPBS-/-的溶液，以酶促方法解聚细胞聚集体。将细胞群集抽吸1至3次，然后在室温下间歇旋动大约4分钟，接着在80-200rcf下离心5分钟。然后在不干扰细胞沉淀物的情况下尽可能完全地抽出上清液。接着轻敲离心管的硬表面大约4分钟，以使群集解聚成单个细胞和包含2-10个细胞的群集。4分钟之后，将细胞重新悬浮在100mL的E8TM培养基中，该培养基补充有10μM Y-27632(Enzo Life Sciences,Inc.,Farmingdale,NY；目录号ALX-270-333)和0.5％w/v FAF-BSA，并且在80–200rcf下离心5至12分钟。然后抽出上清液，并逐滴加入冷(≤4℃)细胞保存培养基CS10(Sigma-Aldrich；St.Louis,MO；目录号C2874-100mL)以实现10000-15000万个细胞/mL的最终浓度。将该细胞溶液保持在冰浴中，并将其等分到2mL冷冻小瓶(Corning Incorporated,Corning,NY；目录号430488)中，之后使用可控速率冷冻器(CryoMedTM34L可控速率冷冻器，Thermo Fischer Scientific,Inc.,Buffalo,NY；目录号7452)如下所述冷冻细胞。将室冷却至4℃，并且保持该温度直至样品小瓶温度达到6℃，然后将室温度每分钟降低2℃直至样品达到-7℃，此时以20℃/min的速率冷却室，直至室达到-45℃。然后使室温度以10℃/min短暂上升，直至温度达到-25℃，再以0.8℃/min进一步冷却室，直至样品小瓶达到-40℃。然后以10℃/min冷却室温度，直至室达到-100℃，此时再以35℃/min冷却室，直至室达到-160℃。然后将室温度保持在-160℃至少10分钟，之后将小瓶转移至气相液氮储存器。然后将这些高浓度的冷冻保存的单个细胞用作中间产物/中间种子产物(“ISM”)。
从液氮储存器中取出ISM的小瓶，将其解冻，并用于接种3升玻璃搅拌悬浮罐生物反应器(DASGIP Information and Process Technology GMBH,Juelich,Germany)。从液氮储存器中取出小瓶，并迅速转移至37℃水浴，保持120秒以解冻。然后将小瓶移至生物安全柜(“BSC”)，并将解冻的内容物通过2mL玻璃移液管转移至50mL锥形管。接着将补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Rho激酶抑制剂Y-27632的10mL E8TM培养基以逐滴方式加入管中。在80-200rcf下离心细胞5min。从管中抽出上清液，加入补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632的10mL新鲜E8TM培养基，并将包含细胞的部分移取到培养基转样瓶(Sanisure,Inc.,Moorpark,California)中，该转样瓶中包含450mL E8TM培养基，其补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632。然后通过使用蠕动泵焊接的无菌管将瓶内容物直接泵送到生物反应器中。生物反应器中准备有1000mL E8TM培养基，该培养基补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632并被预热至37℃，在70rpm下搅拌，其中溶解氧设定点为30％(调节空气、O2和N2)，并且可控CO2分压为5％。在反应器中接种以得到0.225×106个细胞/mL的目标浓度(浓度范围：0.2至0.5×106个细胞/mL)。
接种反应器之后，细胞在搅拌反应器中形成圆形聚集群集。培养24小时之后，培养基被部分交换，因为移除了超过80％的初始体积并且重新加入了补充有0.5％w/v FAF-BSA的1.5L E8TM培养基(新鲜培养基)。接种之后48小时重复该培养基交换过程。作为圆形聚集群集悬浮培养三天之后，将细胞从生物反应器泵出并转移到三个0.5L一次性转瓶(Corning；目录号3153)中进行分化。将所有转瓶保持在补充有5％CO2并且恒定搅拌速度为60RPM(55-65RPM)的37℃潮湿培养箱中。分化方案在下文中描述为条件A、B和C。
在分化过程中，将转瓶从培养箱中的动态搅拌移至BSC以进行培养基交换。在无搅拌的情况下将转瓶保持6分钟，从而使大部分细胞群集沉降到容器的底部。6分钟之后，拆下转瓶侧臂盖，并且通过抽吸移除90％或更多的废培养基。移除废培养基之后，通过开放的侧臂向转瓶中重新加入300mL新鲜培养基。然后替换转瓶盖，并且在前述条件下返回到培养箱中的动态悬浮。
第1阶段(3天)：
对于条件A，使用包含1.18g/L碳酸氢钠(Life Technologies；目录号10372-019)的MCDB-131培养基制备基础培养基(“第1阶段基础培养基”)；该MCDB-131培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠(Sigma Aldrich；目录号S3187)，预先重构于MCDB-131中的2％w/vFAF-BSA；1X浓度的GlutaMAXTM(Life Technologies；目录号35050-079)；2.5mM葡萄糖(45％水溶液；Sigma Aldrich；目录号G8769)；以及胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(“ITS-X”)(LifeTechnologies；目录号51500056)的1:50,000稀释液。在300mL的第1阶段基础培养基中培养细胞一天，该培养基补充有100ng/mL的生长/分化因子8(“GDF8”)(Peprotech,Inc.,RockyHill,New Jersey；目录号120-00)；和2μM的14-丙-2-烯-1-基-3,5,7,14,17,23,27-七氮杂四环[19.3.1.1～2,6～.1～8,12.～]二十七烷-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-壬烷-16-酮(“MCX化合物”)。24小时之后，如上所述完成培养基交换，并且向烧瓶中加入300mL新鲜的第1阶段基础培养基，其补充有100ng/mL的GDF8但无MCX化合物。在无进一步培养基交换的情况下保持细胞48小时。
在条件B中，如针对条件A所述培养细胞，不同的是第一天使用了3μM MCX化合物。
在条件C中，如针对条件A所述培养细胞，不同的是使用100ng/mL的激活素A代替GDF8，并且使用30μM的糖原合成酶激酶3β抑制剂(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(“CHIR99021”)(Stemgent Inc,Cambridge Massachusetts，目录号04004-10)代替MCX化合物。
第2阶段(3天)：
对于条件A，使用包含1.18g/L碳酸氢钠的MCDB-131培养基制备基础培养基(“第2阶段基础培养基”)，该MCDB-131培养基补充有另外的1.2g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:50,000稀释液。在第1阶段完成后，如上所述完成培养基交换，由此移除废第1阶段培养基，并替换为补充有50ng/mL纤维母细胞生长因子7(“FGF7”)(R&D Systems,Minneapolis,Minnesota；目录号251-KG)的300mL第2阶段基础培养基。培养基交换48小时之后，再次移除废培养基并替换为补充有50ng/mLFGF7的300mL新鲜第2阶段基础培养基。
在条件B中，如针对条件A所述培养细胞。
在条件C中，如针对条件A和B所述培养细胞，其中另外添加250μL的1M抗坏血酸(Sigma Aldrich；目录号A4544，重构于水中)至1L的第2阶段基础培养基中。
第3阶段(条件A和B为3天，条件C为2天)：
对于条件A，使用包含1.18g/L碳酸氢钠的MCDB-131培养基制备基础培养基(第3-4阶段基础培养基)，该MCDB-131培养基补充有另外的1.2g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。在第2阶段完成后，完成培养基交换，将废培养基替换为300mL第3-4阶段基础培养基，该培养基补充有50ng/mL FGF-7；100nM的骨形态发生蛋白(“BMP”)受体抑制剂((6-(4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯基)-3-(吡啶-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶盐酸盐))(“LDN-193189”，ShanghaiChemPartner Co Ltd.,Shanghai,China)；2μM视黄酸(“RA”)(Sigma Aldrich；目录号R2625)；0.25μM N-[(3,5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)亚甲基]-4-(苯基甲基)-1-哌嗪胺(“SANT-1”)(Sigma Aldrich；目录号S4572)；以及400nM的PKC活化剂((2S,5S-(E,E)-8-(5-(4-三氟甲基)苯基-2,4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺(“TPB”)(Shanghai ChemPartnerCo Ltd.,Shanghai,China)。培养基交换后24小时，再次用包含除LDN-193189以外的上述补充物的300mL新鲜第3-4阶段基础培养基替换废培养基。在培养基中培养细胞48小时。
在条件B中，如针对条件A所述培养细胞。
在条件C中，如针对条件A和B所述培养细胞，其中向第3-4阶段基础培养基中另外添加250μL/L的1M抗坏血酸溶液。此外，第3阶段开始48小时后，将细胞移至第4阶段培养基，如下文所述。
第4阶段(条件A和B为3天，条件C为4天)：
对于条件A，在第3阶段完成之后，移除废培养基，并替换为补充有0.25μM SANT-1和400nM TPB的300mL第3-4阶段基础培养基。在第4阶段开始48小时之后，向烧瓶中加入3.2mL/L的45％葡萄糖溶液(8mM葡萄糖推注)，并且在培养基中再培养细胞24小时。
在条件B中，如针对条件A所述培养细胞。
在条件C中，如针对条件A和B所述培养细胞，不同的是第3-4阶段基础培养基还补充有0.1μM RA、50ng/mL的FGF7、以及250μL/L的1M抗坏血酸溶液。48小时之后，用新鲜的相同培养基(具有条件C培养基补充物)交换废培养基，并且培养细胞48小时以上。
第5阶段(7天)：
对于条件A、B和C，使用包含1.18g/L碳酸氢钠的MCDB-131培养基基础制备基础培养基(第5+阶段基础培养基)，该MCDB-131培养基补充有另外的1.75g/L碳酸氢钠；2％w/vFAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X的1:200稀释液；250μL/L的1M抗坏血酸；10mg/L肝素(Sigma Aldrich；目录号H3149-100KU)。在第4阶段完成之后，完成培养基交换，将废培养基替换为300mL第5+阶段基础培养基，该培养基补充有1μMT3，即3,3',5-三碘代-L-甲状腺原氨酸钠盐(“T3”)(Sigma Aldrich；目录号T6397)；10μM的2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(“ALK5抑制剂II”)(Enzo LifeSciences,Inc.；目录号ALX-270-445)；100nM的γ分泌酶抑制剂XX(EMD MilliporeCorporation,Gibbstown,NJ，目录号565789)；20ng/mL的β细胞素(R&D Systems，目录号261-CE-050)；0.25μM SANT-1；以及100nM RA。第5阶段开始48小时之后，移除废培养基并替换为300mL相同培养基和补充物。48小时之后，移除培养基并替换为补充有1μM T3、10μMALK5抑制剂II、20ng/mL的β细胞素以及100nM RA的第5+阶段基础培养基。48小时之后，再次交换培养基并替换为补充有1μM T3、10μM ALK5抑制剂II、20ng/mL的β细胞素以及100nM RA的第5+阶段基础培养基。
第6阶段(7天)：
最后的第5阶段培养基交换24小时之后，用补充有1μM T3和10μM ALK5抑制剂II的第5+阶段基础培养基交换条件A、B和C的培养基。培养基交换在第6阶段的第2、4和6天结束时用该补充培养基进行。
在分化过程中，每天从悬浮培养物收集样品。分离每日细胞样品的mRNA(qRT-PCR)，并收集废培养基以进行代谢分析。在所选阶段结束时，通过流式细胞术或荧光免疫组织化学染色法测量蛋白质表达。使用FLEX生物分析仪(NovaBiomedical Corporation,Waltham,MA)分析废培养基。
图1A至图1D示出BioProfile FLEX分析仪从每天分化结束时的废培养基样品获得的数据(图1A-pO2/氧分压；图1B-葡萄糖浓度；图1C-乳酸盐浓度；图1D-培养基pH)。这些数据表明，相比于分化后期，分化第1阶段前3天的细胞大部分为耗氧型。按照分析仪所检测，第1阶段的细胞使pO2水平从140+mm Hg的饱和水平降低至低于100mm Hg(图1A)。此外，第1阶段细胞消耗了培养基中几乎所有的葡萄糖(图1B)，并且在过程的前三天产生超过1g/L的乳酸盐(图1C)。
在细胞进入分化的第2阶段和第3阶段时，其氧和葡萄糖消耗量以及乳酸盐生成量与第1阶段相比发生了变化。在第1阶段已用GDF8和MCX化合物(条件A或B)处理过的细胞在第2阶段中(图1A)比在第1阶段用激活素A和CHIR99021(条件C)处理过的细胞更耗氧。将条件A或B与条件C相比时，所观察到的增加的氧消耗与废培养基中降低的pH(图1D和表1)、增加的乳酸盐生成量(图1C)以及更高的葡萄糖消耗量(图1B)相关联。
随着细胞进入第4阶段(条件A和B的第10、11、和12天；条件C的第9、10、11、和12天)，相比于用条件C处理过的细胞，用条件A和B处理过的细胞保持增加水平的葡萄糖消耗量和降低的培养基pH(图1B和表1)。然而，在第14天(第5阶段的第2天)至第19天(第5阶段结束)观察到所有处理条件中葡萄糖水平不下降至3g/L以下。第6阶段开始之后，在所有三种条件中(图1B，第20天以后)，废培养基的葡萄糖水平趋于低于2.4g/L。这种葡萄糖消耗量的增加不伴有超过0.5g/L的总乳酸盐生成量的增加(图1C)，也无废培养基的酸化(图1D)，表明细胞正在转变为符合胰岛内分泌激素细胞群的更少糖酵解且更成熟的新陈代谢。
除了通过每日取样监测废培养基的代谢特征之外，在分化过程中获取细胞的代表性样品并通过Applied(Life Technologies)测试一组基因的mRNA表达，并且根据与从实验开始培养24小时之后的多能ISM细胞相比的表达倍数差异进行计算。图2A至图2M示出以下基因在分化至第5阶段第1天的细胞中表达的数据：PDX1(图2A)；NKX6.1(图2B)；PAX4(图2C)；PAX6(图2D)；NEUROG3(NGN3)(图2E)；ABCC8(图2F)；嗜铬粒蛋白A(“CHGA”)(图2G)；G6PC2(图2H)；IAPP(图2I)；胰岛素(“INS”)(图2J)；胰高血糖素(“GCG”)(图2K)；PTF1a(图2L)；以及NEUROD1(图2M)。
如图2A所示，在所有三种分化条件中，在第2阶段第3天(“S2D3”)结束时，细胞开始表达PDX1并采取胰腺命运。随着细胞进入第3阶段，细胞开始表达表明内分泌胰腺特化的基因(NGN3、NEUROD1和CHGA；图2E、图2M和图2G)，并且在第3阶段结束和第4阶段开始时，它们开始表达β细胞形成所需的基因(PAX4、PAX6和NKX6.1；图2C、图2D和图2B)。在第5阶段开始时，细胞开始表达胰岛细胞和β细胞的形成和发挥功能所需的标记物(GCG、INS、IAPP、G6PC2和ABCC8；图2K、图2J、图2I、图2H和图2F)。
在第5阶段和第6阶段同样收集了样品并通过实时PCR分析来分析PDX1(图3A)；NKX6.1(图3B)；PAX6(图3C)；NEUROD1(图3D)；NEUROG3(NGN3)(图3E)；SLC2A1(图3F)；PAX4(图3G)；PCSK2(图3H)；嗜铬粒蛋白A(图3I)；嗜铬粒蛋白B(图3J)；PPY(图3K)；PCSK1(图3L)；G6PC2(图3M)；胰高血糖素(图3N)；以及胰岛素(图3O)的基因表达。如图3A至图3D所示，观察到从第5阶段第3天(“S5D3”)到第6阶段第7天结束(S6D7)，PDX1、NKX6.1、PAX6和NEUROD1表达水平很稳定。在细胞暴露于γ分泌酶抑制剂时(第5阶段第1天到第4天)，NGN3、SLC2A1和PAX4的mRNA表达水平处于最高水平，并且在移除γ分泌酶抑制剂之后表达水平下降(图3E至图3G)。基因PCSK2、CHGA和CHGB在第5阶段结束时显示出表达增加(图3M至图3O)，而基因PPY、PCSK1、G6PC2、GCG和INS从第5阶段开始到第6阶段结束持续上升(图3K、图3L、图3M、图3N、图3O)。
对于各个阶段的另外表征，在第1阶段、第4阶段、第5阶段和第6阶段结束时收获细胞，并通过流式细胞术分析。简言之，使用TrypLETMExpress(Life Technologies；目录号12604)将细胞聚集体解离成单个细胞(37℃，3-5分钟)。对于表面染色，将释放的单个细胞重新悬浮于在染色缓冲液中以1:4稀释的0.5％人γ球蛋白中，最终浓度为200万个细胞/mL。以1:20的最终稀释度向细胞中加入直接缀合的一抗，然后在4℃下温育30分钟。将染色的细胞在染色缓冲液中洗涤两次，随后在300μL染色缓冲液中重新悬浮，然后在10μL的7-AAD中温育以进行活/死鉴别，之后在BD FACSCantoTMII上进行流式细胞术分析。对于细胞内抗体染色，首先在4℃下用紫色荧光死/活细胞染料(Life Technologies，目录号L34955)温育单个细胞20-30分钟，随后在冷PBS-/-中单次洗涤。然后在4℃下将洗涤后的细胞固定在280μL Cytofix/CytopermTM固定和透化溶液(BD目录号554722)中30分钟。然后在1x Perm/Wash缓冲液(BD目录号51-2091KZ)中洗涤细胞2次，再以2百万细胞/mL的最终浓度重新悬浮。然后在室温下使用20％正常山羊血清封闭固定的细胞悬浮液10-15分钟。细胞在4℃下与以凭经验预先确定的稀释度的一抗一起温育30分钟，随后在Perm/Wash缓冲液中洗涤两次。然后将细胞与合适的抗体在4℃下一起温育30分钟，随后洗涤两次，之后在BDFACSCantoTMII上进行分析。所用抗体的浓度示于表II中。使用人胰岛或未分化的H1细胞作为阳性对照测试胰腺标记物的抗体的特异性。对于二抗，加入以下物质并在4℃下温育30分钟：1:4,000的抗小鼠Alexa647(Life Technologies，目录号A21235)或1:100、1:200或1:800的山羊抗兔PE(Life Technologies，目录号A10542)，随后在Perm/Wash缓冲液中最后洗涤，并且使用BD FACSDivaTM软件在BD FACSCantoTMII上进行分析，获得至少30,000个事件。
图4示出了第1阶段结束时的活细胞的流式细胞术点阵图，针对表面标记物CD184和CD9、或CD184和CD99的共染色(汇总于表IIIA中)。图5示出了第4阶段结束时的固定和透化的细胞的流式细胞术点阵图，针对以下配对的细胞内标记物共染色：NKX6.1和嗜铬粒蛋白A；Ki67和PDX1；以及NKX2.2和PDX1(汇总于表IIIA中)。图6A和图6B(条件A)、图7A和图7B(条件B)以及图8A和图8B(条件C)示出了第5阶段结束时的固定和透化的细胞的流式细胞术点阵图，针对以下配对的细胞内标记物共染色：NKX6.1和嗜铬粒蛋白A；NKX2.2和嗜铬粒蛋白A；NKX6.1和C-肽；胰高血糖素和胰岛素；Ki67和PDX1；OCT4和PAX6；NKX6.1和NEUROD1；NKX6.1和胰岛素；以及NKX6.1和PDX1。图9A和图9B(条件A)、图10A和图10B(条件B)以及图11A和图11B(条件C)示出了第6阶段结束时的固定和透化的细胞，其针对以下共染色和配对的细胞内标记物通过流式细胞术染色和测量：NKX6.1和嗜铬粒蛋白A；NKX2.2和嗜铬粒蛋白A；胰高血糖素和胰岛素；NKX6.1和C-肽；胰岛素和C-肽；Ki67和PDX1；OCT4和PAX6；NKX6.1和NEUROD1；NKX6.1和胰岛素；以及NKX6.1和PDX1。
在第5阶段结束时，如图6A、图7A和图8A所示并且汇总于表IIIB中，采用条件A、B或C分化的细胞分别有17％、12％或10％共表达了胰岛素和NKX6.1。在第6阶段完成时，观察到NKX6.1和胰岛素共表达细胞数量的增加(条件A为31％；条件B为15％；条件C为14％)。此外，需注意第6阶段结束时的很大一部分细胞表达了β细胞前体标记物NKX6.1、内分泌前体标记物NKX2.2和内分泌前体标记物NEUROD1(条件A：74％NKX6.1、82％NKX2.2、74％NEUROD1；条件B：75％NKX6.1、76％NKX2.2、67％NEUROD1；条件C：60％NKX6.1、64％NKX2.2、53％NEUROD1)。
除β细胞成熟和发挥功能所需标记物的增加表达之外，据观察，如通过PDX1和Ki-67的共表达所测得，处于活跃细胞周期的PDX1阳性细胞的百分比从第5阶段到第6阶段有所下降(26％下降至9％，条件A；22％下降至10％，条件B；43％下降至19％，条件C)。此外，在所有3个测试条件中通过流式细胞术所测得的Ki-67表达在第5阶段和第6阶段的过程中有所下降时，我们通过qRT-PCR检测到增加水平的β细胞特异性转录因子MAFA。第6阶段结束时的MAFA表达比未分化的多能干细胞高40+倍，并达到在人胰岛组织中所观察到的表达水平的大约25％(图12)。免疫荧光细胞化学证实了MAFA的蛋白质表达，如图13所示，其中示出通过免疫荧光核MAFA染色、免疫荧光细胞质胰岛素染色和泛核染色(“DAPI”)的20x物镜获得的显微图。
上述这些结果表明，从第5阶段进入第6阶段的细胞从增殖胰腺内分泌祖细胞转变成了内分泌细胞。这些内分泌组织(并且具体地为胰岛素阳性细胞)表达了与功能性β细胞相关联的并且为功能性β细胞所需的关键标记物。与条件C相比，条件A和B(其中细胞在比第3阶段和第4阶段的条件C显著更低的pH下培养)在分化过程的第6阶段结束时产生了更多嗜铬粒蛋白阳性、C-肽/NKX6.1共阳性细胞和NEUROD1/NKX6.1共阳性细胞。条件C是本领域已知的方法并且在Cell,159:428-439(2014)中有所公开。
从50mL锥形管中的培养基分离在条件A和C下分化至第6阶段的细胞，然后用包含1.18g/L碳酸氢钠并且补充有另外的1.2g/L碳酸氢钠和0.2％w/v FAF-BSA的MCDB-131培养基洗涤2次。然后将细胞重新悬浮于洗涤培养基中，并在室温下保持大约5小时，再植入到NSG小鼠(N＝7)的肾包膜下。在移植后4、8、10和14周监测动物的血糖和C-肽水平。使动物禁食过夜，进行腹膜内葡萄糖注射，并且在IP葡萄糖推注之后(“后”)60分钟通过眶后取血抽取血液(表III)。在最早测量的时间点(移植后4周)，根据对可检测水平的C-肽分泌所测得，移植物起了作用(表IV)。此外，第4周至第14周，C-肽水平上升。
植入之后10周，在葡萄糖推注之前(“前”)和之后(“后”)立即对每个动物抽血。为便于参考，比“前”水平高的“后”C-肽水平将指示葡萄糖刺激的胰岛素分泌。我们注意到用通过条件C分化的移植物处理过的7只动物中有6只表现出更高“后”水平的C-肽，并且用通过条件A分化的移植物处理过的7只动物中有3只具有更高“后”水平的C-肽。
表I：废培养基的每日pH测量值；实施例1，第3阶段第1天到第5阶段第2天。
表IIIA
表IIIB
表IV
实施例2
该实施例展示了在搅拌罐闭环中由表达PDX1的细胞群形成胰岛素表达细胞，该搅拌罐闭环允许通过反应器中的反馈式pH和DO传感器对培养基pH和溶解氧浓度直接进行计算机控制。从该过程产生的胰岛素阳性细胞保持PDX1表达并且共表达NKX6.1。胰岛素阳性细胞由在第3阶段到第5阶段暴露于四种不同条件(A、B、C和D)的细胞产生(表V)。据观察，当根据条件C(在第3阶段开始时pH为7.0并且细胞浓度为200万/mL)分化的细胞被移植到免疫受损小鼠的肾包膜中时，移植物在移植后四周产生了可检测血液水平的人C-肽。
将人胚胎干细胞系H1细胞(WA01细胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在补充有0.5％w/v FAF-BSA的E8TM中作为圆形聚集群集动态悬浮培养≥4个传代。然后按照以下方法以单个细胞和2至10个细胞的群集的形式冷冻群集。将聚集群集中的大约60000-100000万个细胞转移至离心管，并使用100mL的1X DPS-/-洗涤。洗涤之后，然后通过向松散的细胞聚集体沉淀物加入30mL的50体积％酶和50体积％DPBS-/-的溶液，以酶促方法解聚细胞聚集体。将细胞群集抽吸1至3次，然后在室温下间歇旋动大约4分钟，接着在80至200rcf下离心5分钟。然后在不干扰细胞沉淀物的情况下尽可能完全地抽出上清液。接着轻敲离心管的硬表面大约4分钟，以使群集解聚成单个细胞和包含2至10个细胞的群集。4分钟之后，将细胞重新悬浮在100mL的E8TM培养基中，该培养基补充有10μM Y-27632(Enzo Life Sciences,Inc.,Farmingdale,NY；目录号ALX-270-333)和0.5％w/v FAF-BSA，并且在80至200rcf下离心5至12分钟。然后抽出上清液，并逐滴加入冷(≤4℃)细胞保存培养基CS10以实现10000至15000万个细胞/mL的最终浓度。将该细胞溶液保持在冰浴中，同时将其等分到2mL冷冻小瓶中，之后使用可控速率冷冻器(CryoMedTM34L可控速率冷冻器)如下所述冷冻细胞。将室冷却至4℃，并且保持该温度直至样品小瓶温度达到6℃，然后将室温度每分钟降低2℃直至样品达到-7℃，此时以20℃/min的速率冷却室，直至室达到-45℃。然后使室温度以10℃/min短暂上升，直至温度达到-25℃，再以0.8℃/min进一步冷却室，直至样品小瓶达到-40℃。然后以10℃/min冷却室温度，直至室达到-100℃，此时再以35℃/min冷却室，直至室达到-160℃。然后将室温度保持在-160℃至少10分钟，之后将小瓶转移至气相液氮储存器。然后将这些高浓度的冷冻保存的单个细胞用作中间产物/中间种子产物ISM。
从液氮储存器中取出ISM的小瓶，将其解冻，并用于接种3升玻璃搅拌悬浮罐DASGIP生物反应器。从液氮储存器中取出小瓶，并迅速转移至37℃水浴，保持120秒以解冻。然后将小瓶移至BSC，并将解冻的内容物通过2mL玻璃移液管转移至50mL锥形管。接着将补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Rho激酶抑制剂Y-27632的10mL E8TM培养基以逐滴方式加入管中。在80-200rcf下离心细胞5min。从管中抽出上清液，加入补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632的10mL新鲜E8TM培养基，并将包含细胞的部分移取到培养基转样瓶(Cap2V8)中，该转样瓶中包含450mL E8TM培养基，其补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632。然后通过使用蠕动泵焊接的无菌管将瓶内容物直接泵送到生物反应器中。生物反应器中准备有1000mL E8TM培养基，该培养基补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632并被预热至37℃，在70rpm下搅拌，其中溶解氧设定点为30％(调节空气、O2和N2)，并且可控CO2分压为5％。在反应器中接种以得到0.225×106个细胞/mL的目标浓度(浓度范围：0.2至0.5×106个细胞/mL)。
接种反应器之后，细胞在搅拌反应器中形成圆形聚集群集。培养24小时之后，培养基被部分交换，因为移除了超过80％的初始体积并且重新加入了补充有0.5％w/v FAF-BSA的1.5L E8TM培养基(新鲜培养基)。接种之后48小时重复该培养基交换过程。作为圆形聚集群集悬浮培养3天之后，引发了定向分化。为了引发分化，移除废培养基，并使用下述培养基交换和分化方案在该方法的过程中将分化培养基泵送到生物反应器中并交换。
第1阶段(3天)：
使用包含1.18g/L碳酸氢钠的MCDB-131培养基制备基础培养基；该MCDB-131培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖(45％水溶液)；以及ITS-X的1:50,000稀释液。将细胞在补充有100ng/mL GDF8和3μM MCX化合物的1.5L基础培养基中培养一天。24小时之后，移除废培养基并向反应器中加入补充有100ng/mL GDF8的1.5L新鲜基础培养基。在无进一步培养基交换的情况下保持细胞48小时。
第2阶段(3天)：
使用包含1.18g/L碳酸氢钠的MCDB-131培养基制备基础培养基，该MCDB-131培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:50,000稀释液。在第1阶段完成后，如上所述完成培养基交换，由此移除废第1阶段培养基，并替换为补充有50ng/mL FGF7的1.5L第2阶段基础培养基。培养基交换48小时之后，再次移除废培养基并替换为补充有50ng/mL FGF7的1.5L新鲜第2阶段基础培养基。
第3阶段(3天)：
在第2阶段完成时，并且在马上要进行培养基交换之前，通过无菌管和蠕动泵从3升反应器中移除90000万个细胞。然后如前所述交换3升反应器中的培养基，并替换为以下第3阶段培养基：包含1.18g/L碳酸氢钠的MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。第3阶段培养基补充有50ng/mL FGF-7；100nM LDN-193189；2μMRA；0.25μM SANT-1；以及400nM TPB。然后将移取的细胞在无菌锥形管中快速离心，移除废培养基，并且将细胞重新悬浮在第3阶段培养基和补充物中。然后通过无菌管和蠕动泵将这些细胞转移至得自DASGIPTM的四个独立的0.2升玻璃搅拌悬浮罐生物反应器(反应器A、B、C和D)。将0.2升生物反应器和3升对照生物反应器中的细胞暴露于细胞浓度和培养基pH的不同组合，如图14和表V中针对第3阶段至第5阶段所示。培养基交换后24小时，再次用包含除LDN-193189以外的上述补充物的300mL新鲜第3阶段培养基在对照和反应器A至D中的每一个中替换废培养基。在培养基中培养细胞48小时。
表V
第4阶段(3天)：
第3阶段完成之后，移除废培养基并替换为150mL的以下第4阶段培养基：包含1.18g/L碳酸氢钠的150mL MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。该培养基补充有0.25μM SANT-1和400nM TPB。在第4阶段开始48小时之后，向每个生物反应器中加入3.2mL/L的45％葡萄糖溶液(8mM葡萄糖推注)，并且在培养基中再培养细胞24小时。
第5阶段(7天)：
使用包含1.18g/L碳酸氢钠的150mL MCDB-131培养基基础为每个生物反应器制备第5阶段基础培养基，该MCDB-131培养基补充有另外的1.754g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X的1:200稀释液；250μL/L的1M抗坏血酸；以及10mg/L肝素(Sigma Aldrich；目录号H3149-100KU)。在第4阶段完成之后，将每个生物反应器中的废培养基交换为150mL第5阶段基础培养基，该培养基补充有1μM T3，10μM ALK5抑制剂II，1μMγ分泌酶抑制剂XXI(EMD Millipore；目录号565790)；20ng/mL的β细胞素；0.25μM SANT-1；以及100nM RA。第5阶段开始48小时之后，移除废培养基并替换为150mL新鲜的相同培养基和补充物。48小时之后，移除培养基并替换为补充有1μM T3、10μM Alk5抑制剂II、20ng/mL的β细胞素以及100nM RA的第5阶段基础培养基。48小时之后，再次交换培养基并替换为新鲜的相同培养基和补充物。24小时之后，标记第5阶段的结束，并且处理所产生的细胞以进行表征和分析。
在分化过程中，除了实时持续监测pH和溶解氧(“DO”)之外，每天还从反应器收集培养基样品。通过NOVA生物分析仪分析每天结束时的废培养基。还分析样品的细胞数(Nucleocounter 100)、mRNA表达(qRT-PCR)和蛋白质表达(流式细胞术和荧光免疫组织化学)。
图15A和图15B示出了第3阶段和第4阶段的过程中反应器1、A、B、C和D的培养基中的pH(图15A)和溶解氧水平(图15B)的持续监测图。图16A和图16B示出了BioProfile FLEX分析仪从第3阶段和第4阶段的每天分化结束时的废培养基样品获得的数据(图16A：葡萄糖浓度；图16B：乳酸盐浓度)。图17示出了反应器和条件A、B、C和D的细胞计数趋势线(同样以BxA、BxB、BxC和BxD列出)。这些数据表明，在设定为pH 7.0的反应器中，第3阶段的过程中存在与低pH(生物反应器C和D)设定点相关联的细胞损失。然而，以2×106个细胞/mL接种的反应器C在第4阶段结束时恢复了细胞群，而pH为7.0但细胞接种仅为1.0×106个细胞/mL的反应器D未恢复。另外，虽然反应器A和B(pH为7.4，分别以2×106个细胞/mL和1.0×106个细胞/mL接种)都将细胞浓度保持到了第3阶段，但它们在第4阶段表现出显著的细胞损失(图17)。这些数据表明，与在第3阶段保持在pH7.4的细胞相比，使用7.0的pH设定点，结合等于或大于约1.5×106个细胞/mL、优选等于或大于约2.0×106个细胞/mL的浓度，在第3阶段促进了后续分化阶段中的更高细胞浓度。
细胞浓度的效果由每日废培养基的葡萄糖和乳酸盐水平反映。反应器C和D在每天结束时均分别比其浓度匹配的pH7.4对照、A和B具有更多残留葡萄糖和更少乳酸盐。这些结果表明，反应器C和D在第3阶段具有更少的代谢活动。然而，随着反应器C进行至第4阶段，残留葡萄糖水平与反应器A在第4阶段第1天和第2天结束时的水平相当，但反应器C中乳酸盐水平仍然更低。从这些数据我们可以推断，反应器C中的细胞开始采取比反应器A中的细胞更分化、成熟并且更少糖酵解的表型。
在第3阶段完成时，观察到几乎所有在1×106(反应器D)或2×106(反应器C)个细胞/mL的起始浓度下保持为pH7.0的细胞与在1M(反应器B)或2M(反应器A)的起始密度下保持为pH7.4的细胞一样，能够同时表达内胚层转录因子(FOXA2)和胰腺特异性转录因子(PDX1)，表明经低pH处理的细胞保持胰腺内胚层特化。此外，在所有五个测试条件中，表达NKX6.1的细胞的百分比在第3阶段结束时同样很低(范围：5.4％-13.6％)。保持在pH7.4的细胞(反应器A和B，以及对照反应器“1”)在第3阶段结束时开始表达NEUROD1，而保持在pH7.0的细胞(反应器C和D)表现出降低水平的NEUROD1表达，如通过流式细胞术所测得(表Vi)。在第4阶段开始时，反应器C和D的pH设定点恢复到7.4(图14和图15A)。三天后，在第4阶段结束时，通过流式细胞术分析来自每个反应器的样品的NKX6.1、NEUROD1、PDX1、FOXA2、CDX2和Ki67表达。据观察，当与保持在pH设定为7.4的反应器(生物反应器1、A和B)中的细胞相比时，在第3阶段保持在pH7.0的细胞(反应器C和D)在第4阶段结束时具有显著更多的NKX6.1阳性细胞和处于活跃细胞周期的细胞(Ki67阳性)，如通过细胞内流式细胞术所检测，汇总于表VI中。
除通过流式细胞术测得细胞蛋白质表达之外，还使用qRT-PCR测试分化过程的第3阶段和第4阶段中样品的一组基因的mRNA表达。图18A至图18N示出了分化至第4阶段第2天的人胚胎干细胞系H1的细胞中以下基因的实时PCR分析的数据：PDX1(图18A)；NKX6.1(图18B)；PAX4(图18C)；PAX6(图18D)；NeuroG3(NGN3)(图18E)；ABCC8(图18F)；嗜铬粒蛋白A(图18G)；嗜铬粒蛋白B(图18H)；ARX(图18I)；生长素释放肽(图18J)；IAPP(图18K)；PTF1a(图18L)；NEUROD1(图18M)；以及NKX2.2(图18N)。
如图18A所示，在低(7.0)或标准(7.4)pH分化条件两者下，由于细胞采取了胰腺命运，因此细胞在第3阶段表达相似水平的PDX1。随着来自pH7.4反应器的细胞进行至第3阶段(反应器BX A和BX B)，在相对无NKX6.1表达的情况下(图18B)，细胞开始表达早期内分泌胰腺细胞发育所需的多个基因和特征：PAX4、PAX6、NGN3、NEUROD1、NKX2.2、ARX、生长激素释放肽、CHGA和CHGB，如图18C、图18D、图18E、图18M、图18N、图18I、图18J、图18G和图18H所示。这种基因表达的模式结合低NKX6.1表达，表明一些早熟(非β细胞)内分泌胰腺特化。
相比之下，当通过qRT-PCR测量时，与反应器A和B相比，来自反应器C和D的细胞(第3阶段pH7.0)在第3阶段表达显著更低水平的内分泌发育所需转录因子(PAX4、PAX6、NGN3、NEUROD1、NKX2.2和ARX)(图18C、图18D、图18E、图18M、图18N和图18I)。此外，据观察，来自反应器C和D的细胞在第4阶段第1天具有NKX6.1(β细胞形成所需的转录因子)增加，之后在第4阶段第2天PAX6、NEUROD1和NKX2.2表达增加(图18D、图18M、图18N和图18B)。这些qRT-PCR数据与流式细胞术结果相关联，流式细胞术结果表明，对于在第3阶段保持在7.0的细胞，在第3阶段和第4阶段结束时表达NEUROD1的细胞的百分比降低并且表达NKX6.1的细胞的数量增加(表VI，图19和图20)。这些数据表明，第3阶段的低pH(7.0)抑制了早熟(非β细胞)内分泌胰腺特化，并且促进了形成β细胞所需的转录因子表达序列。
通过在第3阶段降低培养基pH，涉及非β细胞内分泌胰腺特化的基因的延迟表达或降低表达的效果持续至分化的第5阶段。NGN3基因表达对形成正常内分泌的胰腺激素细胞发育是必需的，并且在条件A(pH7.4)和C(在第3阶段时pH7.0)两者下，均响应于用包含γ分泌酶抑制剂的第5阶段培养基对细胞进行的处理而诱导NGN3的表达。然而，对于根据条件C细胞分化的细胞，观察到峰值NGN3表达(图21A)延迟了一天。此外，在通过条件C(在第3阶段时pH7.0)分化的细胞中由NGN3表达诱导或调控的多个基因同样发生了延迟。内分泌特异性基因诸如NEUROD1(图21B)、NKX2.2(图21C)、ARX(图21D)、嗜铬粒蛋白A/CHGA(图21E)和PCSK2(图21F)均表现出类似于NGN3的表达延迟。然而，与β细胞特异性相关的基因ABCC8(图21G)、G6CP2/葡萄糖6磷酸酶(图21H)、胰岛素/INS(图21I)、Islet1/ISL1(图21J)、葡萄糖转运蛋白1/SLC2A1(图21K)、锌转运体/SLC30A8(图21L)以及NKX6.1(图21M)在条件A和C的细胞中以相同时间和大小出现。此外，与保持在pH7.4(反应器A)的细胞相比，在反应器C(在第3阶段pH7.0)中分化的细胞中UCN3(与功能性β细胞的正常成熟相关的基因)的表达在第5阶段增加了，如图21N所示，从而表明在第3阶段暴露于pH7.0促进了该过程中向类β细胞的随后阶段成熟。
除了UCN3表达增加之外，还通过qRT-PCR观察到β细胞特异性转录因子MAFA的表达增加。MAFA表达首先可在加入γ分泌酶抑制剂之后通过在第5阶段第1天(图21O)的单引物探针qRT-PCR分析在测试的所有三种条件(A、B和C)中检测到。从第4阶段第3天到第5阶段第5天，可检测的MAFA的mRNA表达在条件C中比在条件A或B中高。通过免疫荧光细胞化学在第6阶段结束时证实了MAFA的蛋白质表达。如图22所示，通过20x物镜获得的显微图示出了核MAFA和细胞质胰岛素染色的免疫荧光染色。
这些基因表达模式表明，在β细胞特异性转录因子表达之前通过在第3阶段暴露于低pH对早期内分泌特化的抑制可通过减少早期非β细胞命运采取来促进随后向类β细胞命运的分化。流式细胞术结果支持该假说，因为与条件A的细胞(20.3％，表VI)相比，反应器C中分化的细胞具有增加的胰岛素阳性细胞百分比(27.3％，表VI)，并且NKX6.1/胰岛素共阳性细胞增加(条件C为21.3％，而条件A为15.6％)。
有趣的是，第3阶段的低pH和随后向类β细胞命运的分化并不会抑制其它胰腺内分泌命运的基因表达特征。通过qRT-PCR在第5阶段结束时在所分析样品中观察到了内分泌激素胰多肽(“PPY”)、生长素释放肽、胰高血糖素(“GCG”)和生长抑素(“SST”)的基因表达(图21P：PPY，图21Q：生长素释放肽，图21R：GCG，图21S：SST)。该观察结果还得到流式细胞术数据支持，流式细胞术数据显示分化的细胞对于泛内分泌转录因子NEUROD1呈阳性(在条件C下，63.1％NEUROD1阳性，56.1％的细胞表现出NEUROD1/NKX6.1共阳性；在条件A下，51.6％NEUROD1阳性，43％NEUROD1/NKX6.1共阳性)；如表VII和图23所示。
在第5阶段第7天结束时，将5×106个在第3阶段以pH 7.0的设定点(条件C)分化的细胞从培养基分离到50mL锥形管中，然后用包含共计2.4g/L碳酸氢钠和0.2％w/v FAF-BSA的MCDB-1313培养基洗涤2次。将细胞重新悬浮于洗涤培养基中，并在室温下保持大约5小时，再植入到NSG小鼠的肾包膜下。在最早测量的时间点，移植后4周，在禁食过夜、腹膜内葡萄糖注射后，并在IP葡萄糖推注之后60分钟进行眶后取血，观察到0.3ng/mL的平均人C-肽血液水平(N＝7只动物)。
表VI：流式细胞术结果(对于标记物呈阳性的细胞％)
NKX6.1 NEUROD1 PDX1 FOXA2 CDX2 Ki67
S3D3 BX1 8.3 30.9 99.9 99.7 0.3 43.8
S3D3 BXA 13.6 36.5 99.8 99.4 5.2 41.8
S3D3 BXB 6.1 37.3 99.6 99.8 1.5 46.7
S3D3 BXC 11.6 15.8 99.5 99.1 8.3 51.2
S3D3 BXD 5.8 0.6 99.9 99.8 5.9 78.9
NKX6.1 NEUROD1 PDX1 FOXA2 CDX2 Ki67
S4D3 BX1 45 44.7 98.2 98.6 5.7 39.9
S4D3 BXA 60.5 35.1 99.3 99.3 4.3 45.6
S4D3 BXB 39.7 37.5 98.8 99.3 4.2 47.5
S4D3 BXC 80 13.6 99.7 99.8 2.7 58.9
S4D3 BXD 89.8 5.3 98.3 98 5.1 68
表VII：第5阶段第6天(S5D6)结束时的流式细胞术结果(对于标记物呈阳性的细 胞％)
实施例3
该实施例展示了在搅拌罐式无菌封闭的生物反应器中，从表达PDX1的细胞群形成胰岛素表达细胞。胰岛素阳性细胞从在第3阶段期间暴露于三个条件中的一者的细胞产生。三个条件为：反应器B—在第3阶段中pH为7.0(用视黄酸处理)；反应器C—在第3阶段第1天pH为7.4，然后在第3阶段第2天和第3天pH为7.0；或反应器D—在第3阶段中pH为7.4。据观察，在第3阶段越长时间暴露于pH7.0，随后在分化过程中Ki67减少，并且NEUROD1、NEUROD1与NKX6.1共阳性、PAX6、Islet 1和PDX1/NKX6.1蛋白质的表达增加。
在Essential 8TM培养基中，使人胚胎干细胞系H1细胞(WA01细胞，WiCellResearch Institute,Madison,Wisconsin)作为圆形聚集群集动态悬浮培养≥4个传代，该培养基补充有0.5％w/v的无脂肪酸牛血清白蛋白。然后按照以下方法以单个细胞和2至10个细胞的群集的形式冷冻群集。将聚集群集中的大约60000-100000万个细胞转移至离心管，并使用100mL的1X DPS-/-洗涤。洗涤之后，然后通过向松散的细胞聚集体沉淀物加入30mL的50体积％酶和50体积％DPBS-/-的溶液，以酶促方法解聚细胞聚集体。将细胞群集抽吸1至3次，然后在室温下间歇旋动大约4分钟，接着在80至200rcf下离心5分钟。然后在不干扰细胞沉淀物的情况下尽可能完全地抽出上清液。接着轻敲离心管的硬表面大约4分钟，以使群集解聚成单个细胞和包含2至10个细胞的群集。4分钟之后，将细胞重新悬浮在100mL的E8TM培养基中，该培养基补充有10μM Y-27632和0.5％w/v FAF-BSA，并且在80至200rcf下离心5至12分钟。然后抽出上清液，并逐滴加入冷(≤4℃)细胞保存培养基CS10以实现100至150百万个细胞/mL的最终浓度。将该细胞溶液保持在冰浴中，同时将其等分到2mL冷冻小瓶(Corning)中，之后使用可控速率CryoMedTM34L冷冻器如下所述冷冻细胞。将室冷却至4℃，并且保持该温度直至样品小瓶温度达到6℃，然后将室温度每分钟降低2℃直至样品达到-7℃，此时以20℃/min的速率冷却室，直至室达到-45℃。然后使室温度以10℃/min短暂上升，直至温度达到-25℃，再以0.8℃/min进一步冷却室，直至样品小瓶达到-40℃。然后以10℃/min冷却室温度，直至室达到-100℃，此时再以35℃/min冷却室，直至室达到-160℃。然后将室温度保持在-160℃至少10分钟，之后将小瓶转移至气相液氮储存器。然后将这些高浓度的冷冻保存的单个细胞用作ISM。
从液氮储存器中取出ISM的小瓶，将其解冻，并用于以29.5万个活细胞/mL的接种浓度接种3升玻璃搅拌悬浮罐生物反应器(DASGIP)。从液氮储存器中取出小瓶，并迅速转移至37℃水浴，保持120秒以解冻。然后将小瓶移至BSC，并将解冻的内容物通过2mL玻璃移液管转移至50mL锥形管。接着将补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Rho激酶抑制剂Y-27632的10mL E8TM培养基以逐滴方式加入管中。在80-200rcf下离心细胞5min。从管中抽出上清液，加入补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632的10mL新鲜E8TM培养基，并将包含细胞的部分移取到培养基转样瓶中，该转样瓶中包含450mL E8TM培养基，其补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632。然后通过使用蠕动泵焊接的无菌管将瓶内容物直接泵送到生物反应器中。生物反应器中准备有1000mL E8TM培养基，该培养基补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632并被预热至37℃，在70rpm下搅拌，其中溶解氧设定点为30％(调节空气、O2和N2)，并且可控CO2分压为5％。在反应器中接种以得到0.225×106个细胞/mL的目标浓度(浓度范围：0.2至0.5×106个细胞/mL)。
接种反应器之后，细胞在搅拌反应器中形成圆形聚集群集。培养24小时之后，培养基被部分交换，因为移除了超过80％的初始体积并且重新加入了补充有0.5％w/v FAF-BSA的1.5L E8TM培养基(新鲜培养基)。接种之后48小时重复该培养基交换过程。作为圆形聚集群集悬浮培养3天之后，通过移除废E8TM培养基并加入分化培养基，在3升反应器中开始进行分化。下文描述了分化方案。
第1阶段(3天)：
将反应器设定为37℃的温度，并以70rpm持续搅拌。将气体和pH对照设定为10％的溶解氧设定点(调节空气、氧气和氮气)，并且通过CO2调节将pH设定为7.4。使用包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基制备基础培养基；该MCDB-131培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖(45％水溶液)；以及ITS-X的1:50,000稀释液。将细胞在补充有100ng/mL GDF8和3μMMCX化合物的1.5L基础培养基中培养一天。24小时之后，如上所述完成培养基交换，并向反应器中加入补充有100ng/mL GDF8的1.5L新鲜基础培养基。在无进一步培养基交换的情况下保持细胞48小时。
第2阶段(3天)：
将反应器设定为37℃的温度，并以70rpm持续搅拌。将气体和pH对照设定为30％的溶解氧设定点(调节空气、氧气和氮气)，并且通过CO2调节将pH设定为7.4。使用包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基制备基础培养基，该MCDB-131培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:50,000稀释液。在第1阶段完成后，如上所述完成培养基交换，由此移除废第1阶段培养基，并替换为补充有50ng/mL FGF7的1.5L第2阶段基础培养基。培养基交换48小时之后，再次移除废培养基并替换为补充有50ng/mL FGF7的1.5L新鲜第2阶段基础培养基。
第3阶段(3天)：
在第2阶段完成时，并且在马上要进行培养基交换之前，通过无菌管和蠕动泵从3升反应器中移除全部细胞。对细胞进行计数、重力沉淀，并且以200万个细胞/mL的归一化分布重新悬浮在以下第3阶段培养基中：包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。第3阶段培养基补充有50ng/mL FGF-7；100nM LDN-193189；2μM RA；0.25μM SANT-1；以及400nM TPB。通过无菌管和蠕动泵，以200万个细胞/mL的细胞浓度归一化分布，将细胞接种到三个0.2升玻璃搅拌悬浮罐DASGIPTM生物反应器B、C和D(也称为BxB、BxC和BxD)中。将反应器设定为37℃的温度，并以55rpm持续搅拌。将气体和pH对照设定为30％的溶解氧设定点(调节空气、氧气和氮气)，并且将第3阶段的pH设定为三个不同培养基pH变量，如表VIII中所列出。培养基交换后24小时，再次用包含除LDN-193189以外的上述补充物的150mL新鲜第3阶段培养基在反应器B至D中的每一个中替换废培养基。然后在培养基中培养细胞48小时，直至第3阶段结束。
表VIII
第4阶段(3天)：
第3阶段完成时，移除每个生物反应器中的废培养基并替换为150mL的以下第4阶段培养基：包含1.18g/L碳酸氢钠的150mL MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。该培养基补充有0.25μM SANT-1和400nM TPB。将反应器保持在37℃，并以55rpm持续搅拌。将气体和pH对照调节至30％的溶解氧设定点(调节空气、氧气和氮气)，并且通过CO2调节将pH设定点调节至7.4。在第4阶段开始48小时之后，向每个生物反应器中加入3.2mL/L的45％葡萄糖溶液(8mM葡萄糖推注)，并且在培养基中再培养细胞24小时。
第5阶段(7天)：
使用以下项为每个生物反应器制备第5阶段基础培养基：包含1.18g/L碳酸氢钠的150mL MCDB-131培养基基础，该培养基补充有另外的1.754g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X的1:200稀释液；250μL/L的1M抗坏血酸；以及10mg/L肝素(Sigma Aldrich；目录号H3149-100KU)。在第4阶段完成之后，将每个生物反应器中的废培养基替换为150mL第5阶段培养基，该培养基补充有1μM T3，10μM ALK5抑制剂II，1μMγ分泌酶抑制剂XXI；20ng/mL的β细胞素；0.25μM SANT-1；以及100nM RA。第5阶段开始48小时之后，移除废培养基并替换为新鲜的相同基础培养基和补充物。48小时之后，再次交换培养基并替换为新鲜的相同培养基和补充物，不同的是不含γ分泌酶XXI和SANT。48小时之后，再次交换培养基并替换为新鲜的相同培养基和补充物，并且再培养细胞24小时至第5阶段结束。在第5阶段中，保持30％DO和7.4pH。
在分化过程中，除了实时持续监测pH和DO之外，每天还从反应器收集培养基样品。分析样品的细胞数、mRNA表达和蛋白质表达。
图24A和图24B示出了第3阶段、第4阶段和第5阶段的过程中反应器B、C和D的培养基中的pH(图24A)和溶解氧水平(图24B)的持续监测图。这些数据表明，与反应器C和D相比，在第3阶段设定为pH7.0的反应器B中的细胞在第4阶段和第5阶段表现出增加的氧消耗，如通过较低水平的溶解氧(图24B)所测得。此外，由于反应器B、C和D中的细胞浓度在第5阶段相当(图25和表VIII)，因此氧消耗的差异并非由于细胞密度的显著差异而造成。这表明，与反应器C或D的细胞(在第3阶段期间分别暴露于pH 7.4一天或三天)相比，在第3阶段期间以pH7.0处理过的反应器B中的细胞在第4阶段结束时已开始采取更成熟和更耗氧的表型。
在第3阶段完成时以及第4阶段结束3天后，通过流式细胞术分析来自各个反应器的样品的蛋白质表达。证实NKX6.1、NEUROD1、PDX1和CDX2表达的数据示于表IX中。据观察，通过细胞内流式细胞术，与保持在反应器D中的细胞(在第3阶段中设定为7.4的pH)相比，在第3阶段或第3阶段中的最后2天保持在pH7.0的细胞(分别为反应器B和C)在第4阶段结束时具有成比例地更多的NKX6.1阳性细胞和更少的NEUROD1阳性细胞。这些数据表明，即使在第3阶段部分暴露于pH7.0，也足以抑制NEUROD1表达。
除通过流式细胞术确定细胞蛋白质表达之外，我们还使用qRT-PCR测试分化过程的第3阶段和第4阶段中样品的一组基因的mRNA表达。图26A至图26N示出了分化至第5阶段第1天的人胚胎干细胞系H1的细胞中以下基因的实时PCR分析的数据：PDX1(图26A)；NKX6.1(图26B)；PAX4(图26C)；PAX6(图26D)；NeuroG3(NGN3)(图26E)；ABCC8(图26F)；嗜铬粒蛋白A(图26G)；嗜铬粒蛋白B(图26H)；ARX(图26I)；生长素释放肽(图26J)；IAPP(图26K)；PTF1a(图26L)；NEUROD1(图26M)；以及NKX2.2(图26N)。
如图26A所示，在第3阶段低pH(7.0)或第3阶段标准pH(7.4)分化条件两者下，细胞在第3阶段表达了相似水平的PDX1，表明细胞采取了胰腺命运。然而，随着来自反应器B和C的细胞(暴露于pH7.0)进入第4阶段，与持续保持在pH7.4的细胞(反应器D)相比，PDX1表达有所增加。这种PDX表达的增加与NKX6.1表达诱导(图26B)匹配。有趣的是，来自反应器D的细胞在第3阶段和第4阶段开始表达早期内分泌胰腺细胞发育所需的多个基因和特征：PAX4、PAX6、NGN3、NEUROD1、NKX2.2、ARX、生长激素释放肽、CHGA和CHGB，如图26C、图26D、图26E、图26M、图26N、图26I、图26J、图26G和图26H所示。这种基因表达的模式结合相对较低的NKX6.1表达，表明反应器D中具有比反应器B和C更多的早熟(非β细胞)内分泌胰腺特化。
相比之下，当通过qRT-PCR测量时，与反应器D相比，来自反应器B和C的细胞在第3阶段表达显著更低水平的早熟内分泌发育的转录因子特征(PAX4、PAX6、NGN3、NEUROD1、NKX2.2和ARX)(图26C、图26D、图26E、图26M、图26N和图26I)。此外，我们观察到来自反应器B和C的细胞在第4阶段第1天具有NKX6.1(β细胞形成所需的转录因子)信息增加(图26B)，之后在第4阶段第2天PAX6、NEUROD1和NKX2.2的mRNA表达增加(图26D、图26M和图26N)。这些qRT-PCR数据与流式细胞术结果相关联，流式细胞术结果表明，在第3阶段在7.0pH保持两天或三天的细胞在第3阶段和第4阶段结束时更不可能表达NEUROD1并且更可能表达NKX6.1(表XI)。这些结果表明，在所有第3阶段或甚至一部分暴露于低pH(7.0)抑制了早熟(非β细胞)内分泌胰腺特化，并且促进了形成β细胞所需的转录因子表达序列。
通过在第3阶段降低培养基pH，涉及非β细胞内分泌胰腺特化的基因的延迟表达或降低表达的效果持续至分化的第5阶段结束。与反应器D细胞(19.5％，表XIV)相比，反应器B中分化的细胞(在所有第3阶段中pH为7.0)具有增加的胰岛素阳性细胞百分比(25.4％，表XIV)，并且NKX6.1/胰岛素共阳性细胞增加(条件B为17.9％，而条件D为14％)。这些结果由正常内分泌胰岛形成所需标记物(诸如PAX6和Islet1表达)的增加反映(表XIV)，如反应器B产生了53.8％PAX6和31％islet1阳性细胞，而反应器D产生了44.9％PAX6和24.7％Islet1阳性细胞。与来自反应器D的细胞相比，Ki67表达(增殖的量度)在第3阶段用pH7.0处理的细胞中同样减少了(表XIV)，表明从正在生长的并且较少分化的群体向更终末分化的组织的转变。
有趣的是，虽然第3阶段的低pH抑制了早熟内分泌分化，但是来自反应器B和C的细胞在第4阶段和第5阶段保持了泛胰腺转录因子PDX1的高表达。此外，虽然与反应器D相比，反应器B和C细胞在第3阶段和第4阶段具有低NEUROD1(泛内分泌转录因子)表达(表XI)，但它们在第5阶段结束时表现出更高百分比的NEUROD1和NEUROD1/NKX6.1共阳性细胞(表X)。这些结果表明，第3阶段的低pH抑制了向内分泌命运的早熟早期分化；随后促进了正常β细胞特化所需转录因子的共表达的增加；并且在第5阶段结束时，胰岛组织和β细胞的标记物和转录因子特征的总体表达也有所增加。
表IX：流式细胞术结果(对于标记物呈阳性的细胞％)
表X：第5阶段流式细胞术结果(对于标记物呈阳性的细胞％)
实施例4
该实施例展示了在3升搅拌罐式无菌封闭的生物反应器中，从表达PDX1的细胞群形成胰岛素表达细胞。从该过程产生的胰岛素阳性细胞保持PDX1表达并且共表达NKX6.1。在第5阶段结束时，将胰岛素阳性细胞转移至以55RPM搅拌的500mL转瓶，并且在第6阶段期间保持在5％CO2潮湿37℃培养箱中的包含高葡萄糖(25.5mM)或低葡萄糖(5.5mM)的培养基中。在第6阶段使用任一种葡萄糖浓度的大部分细胞为PDX1、NKX6.1或NEUROD1阳性的，并且反应器中所有细胞中的几乎一半为NKX6.1/PDX1/胰岛素共阳性。
将人胚胎干细胞系H1细胞(WA01细胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在补充有0.5％w/v FAF-BSA的E8TM培养基中作为圆形聚集群集动态悬浮培养≥4个传代。然后按照以下方法以单个细胞和2至10个细胞的群集的形式冷冻群集。将群集中的大约60000-100000万个聚集细胞转移至离心管，并使用100mL的1X DPS-/-洗涤。洗涤之后，然后通过向松散的细胞聚集体沉淀物加入30mL的50体积％酶和50体积％DPBS-/-的溶液，以酶促方法解聚细胞聚集体。将细胞群集抽吸1至3次，然后在室温下间歇旋动大约4分钟，接着在80至200rcf下离心5分钟。然后在不干扰细胞沉淀物的情况下尽可能完全地抽出上清液。接着轻敲离心管的硬表面大约4分钟，以使群集解聚成单个细胞和包含2至10个细胞的群集。4分钟之后，将细胞重新悬浮在100mL的E8TM培养基中，该培养基补充有10μM Y-27632和0.5％w/v FAF-BSA，并且在80至200rcf下离心5至12分钟。然后抽出上清液，并逐滴加入冷(≤4℃)细胞保存培养基CS10以实现100至150百万个细胞/mL的最终浓度。将该细胞溶液保持在冰浴中，同时将其等分到2mL冷冻小瓶中，之后使用可控速率冷冻器CryoMedTM34L可控速率冷冻器如下所述冷冻细胞。将室冷却至4℃，并且保持该温度直至样品小瓶温度达到6℃，然后将室温度每分钟降低2℃直至样品达到-7℃，此时以20℃/min的速率冷却室，直至室达到-45℃。然后使室温度以10℃/min短暂上升，直至温度达到-25℃，再以0.8℃/min进一步冷却室，直至样品小瓶达到-40℃。然后以10℃/min冷却室温度，直至室达到-100℃，此时再以35℃/min冷却室，直至室达到-160℃。然后将室温度保持在-160℃至少10分钟，之后将小瓶转移至气相液氮储存器。然后将这些高密度的冷冻保存的单个细胞用作ISM。
从液氮储存器中取出ISM的小瓶，将其解冻，并用于以29.5万个活细胞/mL的接种浓度接种3升玻璃搅拌悬浮罐生物反应器(DASGIP)。从液氮储存器中取出小瓶，并迅速转移至37℃水浴，保持120秒以解冻。然后将小瓶移至BSC，并将解冻的内容物通过2mL玻璃移液管转移至50mL锥形管。接着将补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Rho激酶抑制剂Y-27632的10mL E8TM培养基以逐滴方式加入管中。在80-200rcf下离心细胞5min。从管中抽出上清液，加入补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632的10mL新鲜E8TM培养基，并将包含细胞的部分移取到培养基转样瓶中，该转样瓶中包含450mL E8TM培养基，其补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632。然后通过使用蠕动泵焊接的无菌管将瓶内容物直接泵送到生物反应器中。生物反应器中准备有1000mL E8TM培养基，该培养基补充有0.5％w/vFAF-BSA和10μM Y-27632并被预热至37℃，在70rpm下搅拌，其中溶解氧设定点为30％(调节空气、O2和N2)，并且可控CO2分压为5％。在反应器中接种以得到0.225×106个细胞/mL的目标浓度(浓度范围：0.2至0.5×106个细胞/mL)。
接种反应器之后，细胞在搅拌反应器中形成圆形聚集群集。培养24小时之后，培养基被部分交换，因为移除了超过80％的初始体积并且重新加入了补充有0.5％w/v FAF-BSA的1.5L E8TM培养基(新鲜培养基)。接种之后48小时重复该培养基交换过程。作为圆形聚集群集悬浮培养3天之后，使叶轮和加热套停止5-20分钟以使群集沉淀，移除培养基，并通过蠕动泵穿过使用TerumoTM焊管机连接至管的浸料管来进行替换以维持封闭的系统。一旦添加足够的培养基以浸没叶轮，便对叶轮和加热套重新通电。下文描述了分化方案。
第1阶段(3天)：
使用包含1.18g/L碳酸氢钠的900mL MCDB-131培养基制备第1阶段基础培养基；该MCDB-131培养基补充有另外的3.6g/L碳酸氢钠；100mL2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；10mL 1X浓度的GlutaMAXTM；1mL 2.5mM葡萄糖(45％水溶液)；以及ITS-X的1:50,000稀释液。将细胞在补充有100ng/ml GDF8和3μM MCX化合物的基础培养基中培养一天。24小时之后，如上所述完成培养基交换，并向烧瓶中加入补充有100ng/mL GDF8的新鲜基础培养基。在无进一步培养基交换的情况下保持细胞48小时。在第1阶段中，溶解氧含量保持在10％，并且pH保持在7.4。
第2阶段(3天)：
在第1阶段完成之后，如上所述完成培养基交换，由此移除废第1阶段培养基，并替换为仅补充有50ng/mL FGF7的第1阶段基础培养基。培养基交换48小时之后，再次移除废培养基并替换为补充有50ng/mL FGF7的新鲜基础培养基。在第2阶段中，DO保持在30％DO，并且pH保持在7.4。
第3阶段(3天)：
在第2阶段完成之后，如上所述完成培养基交换，由此移除废第2阶段培养基，并替换为以下基础培养基：包含1.18g/L碳酸氢钠的900mL MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的3.6g/L碳酸氢钠；100mL 2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；10mL 1X浓度的GlutaMAXTM；1mL 2.5mM葡萄糖(45％水溶液)；以及ITS-X的1:200稀释液。第3阶段基础培养基补充有50ng/mL FGF-7；100nM LDN-193189；2μM RA；0.25μM SANT-1；以及400nM TPB。培养基交换后24小时，再次用包含除LDN-193189以外的上述补充物的新鲜培养基替换废培养基。在培养基中培养细胞48小时。在第3阶段中，保持30％DO和7.0的pH。
第4阶段(3天)：
在第3阶段完成之后，如上所述完成培养基交换，由此移除废第3阶段培养基，并替换为与第3阶段所用相同但补充有0.25μM SANT-1和400nM TPB的基础培养基。在第4阶段开始48小时之后，向每个生物反应器中加入3.2mL/L的45％葡萄糖溶液(8mM葡萄糖推注)，并且在培养基中再培养细胞24小时。在第4阶段中，保持30％DO和7.4的pH。
第5阶段(7天)：
在第4阶段完成之后，如上所述完成培养基交换，由此移除第4阶段废培养基，并替换为以下第5阶段基础培养基：包含1.18g/L碳酸氢钠的900mL MCDB-131培养基基础，该培养基补充有另外的1.754g/L碳酸氢钠；100mL 2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；8mL/L的45％葡萄糖溶液；ITS-X的1:200稀释液；250μL/L的1M抗坏血酸；以及1mL 10mg/L肝素溶液。第5阶段基础培养基补充有1μM T3，10μM ALK5抑制剂II，1μMγ分泌酶抑制剂XXI；20ng/mL的β细胞素；0.25μM SANT-1；以及100nM RA。第5阶段开始48小时之后，移除废培养基并替换为新鲜的相同基础培养基和补充物。48小时之后，再次交换培养基并替换为新鲜的相同培养基和补充物。48小时之后，再次交换培养基并替换为新鲜的相同培养基和补充物，不同的是不含γ分泌酶抑制剂XXI和SANT。48小时之后，移除废培养基并替换为新鲜的相同培养基和补充物。将细胞再培养24小时至第5阶段结束。在第5阶段中，保持30％DO和pH 7.4。
第6阶段(7天)：
在第5阶段结束时(分化的第19天)，通过无菌管和蠕动泵从3升反应器中移除细胞。然后对细胞进行计数、重力沉淀，并且以50万个细胞/mL的归一化分布重新悬浮在第6阶段培养基(下文详述)中，并且加入到两个以55RPM搅拌的0.5升一次性转瓶(Corning)中，并且在5％CO2潮湿37℃培养箱中的包含高葡萄糖(25.5mM)或低葡萄糖(5.5mM)的培养基中以漂移条件保持7天。一个烧瓶容纳以下培养基和补充物：包含1.18g/L碳酸氢钠的300mLMCDB-131培养基基础，该培养基补充有另外的1.754g/L碳酸氢钠；100mL 2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；8mL/L的45％葡萄糖溶液(25.5mM最终葡萄糖浓度)；ITS-X的1:200稀释液；250μL/L的1M抗坏血酸；和1mL 10mg/L肝素；以及10μM ALK5抑制剂II。第二个烧瓶容纳以下培养基和补充物：包含1.18g/L碳酸氢钠并且基础葡萄糖浓度为5.5mM的300mL MCDB-131培养基基础，该培养基补充有另外的1.754g/L碳酸氢钠；100mL2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；ITS-X的1:200稀释液；250μL/L的1M抗坏血酸；和1mL 10mg/L肝素；以及10μM ALK5抑制剂II。第5阶段开始48小时、96小时和120小时之后，移除废培养基并替换为新鲜的相同基础培养基和补充物。第6阶段于开始之后144小时(分化第26天)结束。
在分化过程中，从反应器收集样品并分析总细胞数(如表X所示)和mRNA表达(qRT-PCR，如图27所示)。在第3阶段、第4阶段、第5阶段和第6阶段结束时，使用流式细胞术分析样品的蛋白质表达(表XII)。
在第3阶段完成时，据观察几乎所有细胞都表达内胚层转录因子(FOXA2)和胰腺特异性转录因子(PDX1)两者。通过流式细胞术检测到少数表达NKX6.1的细胞(约20％)，并且几乎没有NEUROD1表达细胞(表XII)。在第4阶段结束时，再次通过流式细胞术分析样品的NKX6.1、NEUROD1、PDX1、FOXA2、CDX2和Ki67表达(表XII)。有趣的是，从第3阶段结束到第4阶段结束，NKX6.1表达群增加至超过细胞的91％，并且这些细胞保持内胚层和胰腺特化(>99％的PDX1和FOXA2表达细胞)。然而，仅有限群体的细胞(<8％)表达内分泌激素细胞的特征性标记物(Islet1、CHGA、NEUROD1和NKX2.2)。在第5阶段完成时，对于内分泌激素细胞的特征性标记物呈阳性的细胞的百分比大幅增加，从第4阶段结束时的小于10％上升至76％的对于NEUROD1呈阳性的细胞和57％的对于胰岛素呈阳性的细胞。此外，总的细胞群保持显著的NKX6.1(81％)和PDX1(>97％)表达。如通过对于Ki67呈阳性的细胞百分比所测得，增殖水平为约18％，并且CDX2(内胚层肠道细胞的标记物)非常低，<3.0％。这些数据表明，类胰岛(具体地讲类β细胞)群正在反应器中形成。
在第5阶段完成时，从3升搅拌罐式反应器移除细胞并分到500mL转瓶中，转瓶保持在5％CO2的37℃潮湿培养箱中。在相似条件下处理转瓶，不同的是基础培养基葡萄糖浓度。测试的两个葡萄糖条件为：低葡萄糖为5.5mM起始基础葡萄糖浓度(“LG”)，或高葡萄糖为25.5mM起始基础葡萄糖浓度(“HG”)(表XIV)。在第6阶段以任一种条件处理7天的细胞表现出内分泌激素细胞(尤其是胰腺β胰岛细胞)的特征性标记物的显著增加。在第6阶段第7天结束时，几乎一半细胞对于PAX6呈阳性，而60％对于NEUROD1和NKX6.1或胰岛素和NKX6.1呈共阳性(表XIII)。另外，该系统中产生的细胞保持高水平的PDX1(>81％)并且显示出降低水平的增殖，如通过对于Ki67呈阳性的细胞百分比所测得(约12％，按照表XIV)。
这些结果得到qRT-PCR数据的支持，该数据显示随着细胞进入第5阶段，NGN3存在急剧而短暂的诱导(图27A)。随后持续诱导NEUROD1表达(图27B)以及与胰岛形成和内分泌激素细胞相关的其它基因诸如嗜铬粒蛋白A(CHGA)、嗜铬粒蛋白B(CHGB)、胰高血糖素(GCG)、胰岛相关多肽(IAPP)、Islet1(ISL1)、MAFB、PAX6和生长抑素(SST)，分别如图27C至图27J所示。除了胰岛特异性基因诱导之外，β细胞特异基因同样在第5阶段受到诱导并持续至第6阶段(分别为图27P至图27S)，正如针对胰岛素(INS；图27K)、葡萄糖6磷酸酶2(G6PC2；图27L)、PCSK1和PCSK2(图27M和图27N)、锌转运体(SLC30A8；图27O)以及β细胞形成和发挥功能所需的转录因子(诸如NKX6.1、NKX2.2、MNX1/HB9和UCN3)所观察到的那样。诸如CDX2和ZIC1的基因的表达(表明替代命运的形成)接近或低于qRT-PCR的检测下限(数据未示出)。
表XI：指定分化日的总细胞计数
分化天数 总细胞(×106/mL)
-3 0.23
0-调整前 0.75
0-0.5×106/mL调整值 0.50
4 1.49
6-调整前 1.61
6-2M/mL调整值 2.15
7 2.21
11 1.47
12 1.24
13 0.68
19 0.57
表XII：第3阶段结束(S3D3-24H)和第4阶段结束(S4D3-24H)时的流式细胞术结果 (对于标记物呈阳性的细胞％)
表XIII：第5阶段结束(S5D7-24H)时的流式细胞术结果(对于标记物呈阳性的细 胞％)
表XIV：第6阶段结束(S6D7-24H)时的流式细胞术结果(对于标记物呈阳性的细 胞％)(注：LG＝5.5mM葡萄糖；HG＝25.5mM葡萄糖)
实施例5
该实施例展示了在搅拌罐式无菌封闭的生物反应器中，从表达转录因子PDX1的细胞群形成胰岛素表达细胞。从该过程产生的胰岛素阳性细胞保持PDX1表达并且共表达NKX6.1。当该细胞群被移植到免疫受损小鼠的肾包膜中时，移植物在移植后四周产生了可检测血液水平的人C-肽。
将人胚胎干细胞系H1细胞(WA01细胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在补充有0.5％w/v FAF-BSA的E8TM培养基中作为圆形聚集群集动态悬浮培养≥4个传代。然后按照以下方法以单个细胞和2至10个细胞的群集的形式冷冻群集。将群集中的大约60000-100000万个聚集细胞转移至离心管，并使用100mL的1X DPS-/-洗涤。洗涤之后，然后通过向松散的细胞聚集体沉淀物加入30mL的50体积％酶和50体积％DPBS-/-的溶液，以酶促方法解聚细胞聚集体。将细胞群集抽吸1至3次，然后在室温下间歇旋动大约4分钟，接着在80至200rcf下离心5分钟。然后在不干扰细胞沉淀物的情况下尽可能完全地抽出上清液。接着轻敲离心管的硬表面大约4分钟，以使群集解聚成单个细胞和包含2至10个细胞的群集。4分钟之后，将细胞重新悬浮在100mL的E8TM培养基中，该培养基补充有10μM Y-27632(Enzo Life Sciences)和0.5％w/v FAF-BSA，并且在80至200rcf下离心5至12分钟。然后抽出上清液，并逐滴加入冷(≤4℃)细胞保存培养基CS10以实现10000至15000万个细胞/mL的最终浓度。将该细胞溶液保持在冰浴中，同时将其等分到2mL冷冻小瓶(Corning)中，之后使用可控速率CryoMedTM34L冷冻器如下所述冷冻细胞。将室冷却至4℃，并且保持该温度直至样品小瓶温度达到6℃，然后将室温度每分钟降低2℃直至样品达到-7℃，此时以20℃/min的速率冷却室，直至室达到-45℃。然后使室温度以10℃/min短暂上升，直至温度达到-25℃，再以0.8℃/min进一步冷却室，直至样品小瓶达到-40℃。然后以10℃/min冷却室温度，直至室达到-100℃，此时再以35℃/min冷却室，直至室达到-160℃。然后将室温度保持在-160℃至少10分钟，之后将小瓶转移至气相液氮储存器。然后将这些高密度的冷冻保存的单个细胞用作ISM。
从液氮储存器中取出ISM的小瓶，将其解冻，并用于以29.5万个活细胞/mL的接种浓度接种3升玻璃搅拌悬浮罐生物反应器(DASGIP)。从液氮储存器中取出小瓶，并迅速转移至37℃水浴，保持120秒以解冻。然后将小瓶移至BSC，并将解冻的内容物通过2mL玻璃移液管转移至50mL锥形管。接着将补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Rho激酶抑制剂Y-27632的10mL E8TM培养基以逐滴方式加入管中。在80-200rcf下离心细胞5min。从管中抽出上清液，加入补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632的10mL新鲜E8TM培养基，并将包含细胞的部分移取到培养基转样瓶(Sanisure,Inc)中，该转样瓶中包含450mL E8TM培养基，其补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632。然后通过使用蠕动泵焊接的无菌管将瓶内容物直接泵送到生物反应器中。生物反应器中准备有1000mL E8TM培养基，该培养基补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632并被预热至37℃，在70rpm下搅拌，其中溶解氧设定点为30％(调节空气、O2和N2)，并且可控CO2分压为5％。在反应器中接种以得到0.225×106个细胞/mL的目标浓度(浓度范围：0.2至0.5×106个细胞/mL)。
接种反应器之后，细胞在搅拌反应器中形成圆形聚集群集。培养24小时之后，培养基被部分交换，因为移除了超过80％的初始体积并且重新加入了补充有0.5％w/v FAF-BSA的1.5L E8TM培养基(新鲜培养基)。接种之后48小时重复该培养基交换过程。作为圆形聚集群集悬浮培养3天之后，通过移除废E8TM培养基并加入分化培养基，在3升反应器中开始进行分化。下文描述了分化方案。
第1阶段(3天)：
将反应器设定为37℃的温度，并以70rpm持续搅拌。将气体和pH对照设定为10％的溶解氧设定点(调节空气、O2和N2)，并且通过CO2调节将pH设定为7.4。使用包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基制备第1阶段基础培养基；该MCDB-131培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖(45％水溶液)；以及ITS-X的1:50,000稀释液。将细胞在补充有100ng/mL GDF8和3μMMCX化合物的1.5L基础培养基中培养一天。24小时之后，如上所述完成培养基交换，并向反应器中加入补充有100ng/mL GDF8的1.5L新鲜基础培养基。在无进一步培养基交换的情况下保持细胞48小时。
第2阶段(3天)：
将反应器设定为37℃的温度，并以70rpm持续搅拌。将气体和pH对照设定为30％的溶解氧设定点(调节空气、O2和N2)，并且通过CO2调节将pH设定为7.4。在第1阶段完成之后，如上所述完成培养基交换，由此移除废第1阶段培养基，并替换为仅补充有50ng/mL FGF7的1.5L相同培养基。培养基交换48小时之后，再次移除废培养基并替换为补充有50ng/mLFGF7的300mL新鲜第2阶段基础培养基。
第3阶段(3天)：
在第2阶段结束时，并且在马上要进行培养基交换之前，对细胞进行计数、重力沉淀，并且以200万个细胞/mL的归一化分布重新悬浮在1.5升的以下第3阶段基础培养基中：包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。第3阶段基础培养基补充有50ng/mL FGF-7；100nM LDN-193189；2μM RA；0.25μM SANT-1；以及400nM TPB。将反应器设定为37℃的温度，并以70rpm持续搅拌。将气体和pH对照设定为30％的溶解氧设定点(调节空气、O2和N2)，并且通过CO2调节将pH设定为7.0。培养基交换后24小时，再次用包含除LDN-193189以外的上述补充物的1.5L新鲜第3阶段培养基替换废培养基。然后在培养基中培养细胞48小时，直至第3阶段结束。
第4阶段(3天)：
第3阶段完成时，移除每个生物反应器中的废培养基并替换为1.5L由以下物质构成的第4阶段基础培养基：包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。第4阶段基础培养基补充有0.25μM SANT-1和400nM TPB。将反应器保持在37℃，并以70rpm搅拌。将气体和pH调节至30％的溶解氧设定点(调节空气、O2和N2)，并且通过CO2调节将pH设定点调节至7.4。在第4阶段开始48小时之后，向生物反应器中加入3.2mL/L的45％葡萄糖溶液(8mM葡萄糖推注)，并且在培养基中再培养细胞24小时。
第5阶段和第6阶段：
在第4阶段第3天结束时，将圆形聚集群集从生物反应器泵出并转移至两个独立的以55RPM搅拌的0.5升Corning一次性转瓶，并且保持在补充有5％CO2的37℃潮湿培养箱中。然后将每个容器中的细胞保持在300mL工作体积的由以下物质构成的第5阶段基础培养基中：包含1.18g/L碳酸氢钠的300mL MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的1.75g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X的1:200稀释液；250μL/L的1M抗坏血酸；10mg/L肝素；1μM T3(即3,3',5-三碘代-L-甲状腺原氨酸钠盐)以及10μM ALK5抑制剂II。
所用的第5阶段基础培养基根据如下两个不同条件A或B补充：
a.对于条件A，施加补充有100nM LDN、100nM SANT和10μM硫酸锌的第5+阶段基础培养基，以开始第5阶段。在开始阶段之后24和48小时，交换该培养基。在第5阶段开始之后72小时，移除废培养基，并用补充有100nM XXγ分泌酶抑制剂、100nM LDN和10μM硫酸锌的第5阶段基础培养基处理细胞，以开始第6阶段。然后每24小时替换一次该培养基，持续十一天，但第8天、第9天和第11天的开始时除外。
b.对于条件B，施加补充有100nMγ分泌酶抑制剂XX、20ng/mLβ细胞素、0.25μMSANT-1和100nM RA的第5阶段基础培养基，以开始第5阶段。第5阶段开始48小时之后，移除废培养基并替换为300mL相同培养基和补充物。48小时之后，移除培养基并替换为补充有20ng/mL的β细胞素和100nM RA的第5阶段基础培养基。48小时之后，再次交换培养基并替换为相同培养基。
在分化过程中，从悬浮培养物收集细胞样品以进行分析。分析样品的mRNA表达(qRT-PCR)和蛋白质表达(流式细胞术和荧光免疫组织化学)。
第4阶段结束6天后(条件A：第6阶段第3天；条件B：第5阶段第6天)，观察到来自两种处理的细胞表达可通过流式细胞术检测到的与内分泌胰腺和β细胞的形成一致的一组蛋白质(表XV)。两种处理产生了高百分比的PDX1(>91％)表达细胞，并且细胞开始共表达胰岛素和NKX6.1(未示出)。有趣的是，观察到根据条件A处理的细胞具有降低水平的增殖，表达Ki67的细胞在A中为15.5％，在B中为27.3％(表XV)。此外，用条件A处理过的细胞比条件B具有更多的NKX6.1表达、NEUROD1表达以及NKX6.1/NEUROD1共表达细胞(表XV)，这说明用条件A处理产生了表达内分泌胰腺基因特征并能够形成β细胞的更大细胞群。
这些流式细胞术数据受到OpenArray qRT-PCR数据的支持，OpenArray qRT-PCR数据表明，随着细胞进入第5阶段，两种条件下均存在与持续诱导NEUROD1表达(图28B)相关的NGN3诱导(图28A)。在条件A中，在第5阶段NGN3开始诱导之后，在第6阶段开始时存在与用γ分泌酶抑制剂XX处理对应的第二次NGN3诱导。条件A的这种NGN3表达双峰与NKX6.1的持续表达一起发生(图28C)并且与多个基因表达相关，这些基因与胰岛形成和内分泌激素细胞相关，诸如嗜铬粒蛋白A(CHGA)、嗜铬粒蛋白B(CHGB)、胰高血糖素(GCG)、胰岛相关多肽(IAPP)、MAFB、PAX6和生长抑素(SST)(分别为图28D至图28J)。此外，在第5阶段中同样诱导了β细胞功能所需的基因并持续至第6阶段，正如针对胰岛素(INS；图28K)、葡萄糖6磷酸酶2(G6PC2；图28L)、PCSK1(图28M)和锌转运体(SLC30A8；图28N)以及β细胞形成、成熟和发挥功能所需的MNX1/HB9和UCN3-转录因子(分别为图28O和图28P)所观察到的那样。
在第6阶段第11天结束时，将5×107个由条件A分化的细胞从培养基分离到50mL锥形管中，然后用包含1.18g/L碳酸氢钠和0.2％w/v FAF-BSA的MCDB-1313培养基洗涤2次。将细胞重新悬浮于洗涤培养基中，并在室温下保持大约5小时，再植入到NSG小鼠的肾包膜下。每个动物接受了5×106个细胞的剂量。在植入之前，这些细胞表达与内分泌胰腺和β细胞一致的蛋白质(表XVI)，并且在最早测量的时间点、植入后4周、以及18周的研究过程中，在禁食过夜并且在IP葡萄糖推注后60分钟进行眶后取血之后，检测到响应于腹膜内葡萄糖注射的人C-肽(N＝7只动物，图29)。
表XV：流式细胞术结果
第4阶段结束6天后(条件A：第6阶段第3天；条件B：第5阶段第6天)
表XVI：流式细胞术结果
条件A：第6阶段第11天
实施例6
该实施例展示了在搅拌罐式无菌封闭的生物反应器中，从表达PDX1的细胞群形成胰岛素表达细胞。从该过程产生的胰岛素阳性细胞保持PDX1表达并且共表达NKX6.1。当该细胞群被移植到免疫受损小鼠的肾包膜中时，移植物在移植后两周内产生了可检测血液水平的人C-肽。
将人胚胎干细胞系H1细胞(WA01细胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在补充有0.5％w/v FAF-BSA的E8TM培养基中作为圆形聚集群集动态悬浮培养≥4个传代。然后按照以下方法以单个细胞和2至10个细胞的群集的形式冷冻群集。将群集中的大约60000-100000万个聚集细胞转移至离心管，并使用100mL的1X DPS-/-洗涤。洗涤之后，然后通过向松散的细胞聚集体沉淀物加入30mL的50体积％酶和50体积％DPBS-/-的溶液，以酶促方法解聚细胞聚集体。将细胞群集抽吸1至3次，然后在室温下间歇旋动大约4分钟，接着在80至200rcf下离心5分钟。然后在不干扰细胞沉淀物的情况下尽可能完全地抽出上清液。接着轻敲离心管的硬表面大约4分钟，以使群集解聚成单个细胞和包含2至10个细胞的群集。4分钟之后，将细胞重新悬浮在100mL的E8TM培养基中，该培养基补充有10μM Y-27632(Enzo Life Sciences)和0.5％w/v FAF-BSA，并且在80至200rcf下离心5至12分钟。然后抽出上清液，并逐滴加入冷(≤4℃)细胞保存培养基CS10以实现10000至15000万个细胞/mL的最终浓度。将该细胞溶液保持在冰浴中，同时将其等分到2mL冷冻小瓶(Corning)中，之后使用可控速率CryoMedTM34L冷冻器如下所述冷冻细胞。将室冷却至4℃，并且保持该温度直至样品小瓶温度达到6℃，然后将室温度每分钟降低2℃直至样品达到-7℃，此时以20℃/min的速率冷却室，直至室达到-45℃。然后使室温度以10℃/min短暂上升，直至温度达到-25℃，再以0.8℃/min进一步冷却室，直至样品小瓶达到-40℃。然后以10℃/min冷却室温度，直至室达到-100℃，此时再以35℃/min冷却室，直至室达到-160℃。然后将室温度保持在-160℃至少10分钟，之后将小瓶转移至气相液氮储存器。然后将这些高密度的冷冻保存的单个细胞用作ISM。
从液氮储存器中取出ISM的小瓶，将其解冻，并用于以29.5万个活细胞/mL的接种浓度接种3升玻璃搅拌悬浮罐生物反应器(DASGIP)。从液氮储存器中取出小瓶，并迅速转移至37℃水浴，保持120秒以解冻。然后将小瓶移至BSC，并将解冻的内容物通过2mL玻璃移液管转移至50mL锥形管。接着将补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Rho激酶抑制剂Y-27632的10mL E8TM培养基以逐滴方式加入管中。在80-200rcf下离心细胞5min。从管中抽出上清液，加入补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632的10mL新鲜E8TM培养基，并将包含细胞的部分移取到培养基转样瓶(Sanisure,Inc)中，该转样瓶中包含450mL E8TM培养基，其补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632。然后通过使用蠕动泵焊接的无菌管将瓶内容物直接泵送到生物反应器中。生物反应器中准备有1000mL E8TM培养基，该培养基补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632并被预热至37℃，在70rpm下搅拌，其中溶解氧设定点为30％(调节空气、O2和N2)，并且可控CO2分压为5％。在反应器中接种以得到0.225×106个细胞/mL的目标浓度(浓度范围：0.2至0.5×106个细胞/mL)。
接种反应器之后，细胞在搅拌反应器中形成圆形聚集群集。培养24小时之后，培养基被部分交换，因为移除了超过80％的初始体积并且重新加入了补充有0.5％w/v FAF-BSA的1.5L E8TM培养基(新鲜培养基)。接种之后48小时重复该培养基交换过程。作为圆形聚集群集悬浮培养3天之后，通过移除废E8TM培养基并加入分化培养基，在3升反应器中开始进行分化。下文描述了分化方案。
第1阶段(3天)：
将反应器设定为37℃的温度，并以70rpm持续搅拌。将气体和pH对照设定为10％的溶解氧设定点(调节空气、O2和N2)，并且通过CO2调节将pH设定为7.4。使用包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基制备第1阶段基础培养基；该MCDB-131培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖(45％水溶液)；以及ITS-X的1:50,000稀释液。将细胞在补充有100ng/mL GDF8和3μMMCX化合物的1.5L基础培养基中培养一天。24小时之后，如上所述完成培养基交换，并向反应器中加入补充有100ng/mL GDF8的1.5L新鲜基础培养基。在无进一步培养基交换的情况下保持细胞48小时。
第2阶段(3天)：
将反应器设定为37℃的温度，并以70rpm持续搅拌。将气体和pH对照设定为30％的溶解氧设定点(调节空气、O2和N2)，并且通过CO2调节将pH设定为7.4。在第1阶段完成之后，如上所述完成培养基交换，由此移除废第1阶段培养基，并替换为与第1阶段基础培养基所用相同但补充有50ng/mL FGF7的1.5L培养基。培养基交换48小时之后，再次移除废培养基并替换为补充有50ng/mL FGF7的300mL新鲜基础培养基。
第3阶段(3天)：
在第2阶段结束时，并且在马上要进行培养基交换之前，对细胞进行计数、重力沉淀，并且以200万个细胞/mL的归一化浓度重新悬浮在1.5升的以下第3阶段基础培养基中：包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。第3阶段基础培养基补充有50ng/mL FGF-7；100nM LDN-193189；2μM RA；0.25μM SANT-1；以及400nM TPB。将反应器设定为37℃的温度，并以70rpm持续搅拌。将气体和pH对照设定为30％的溶解氧设定点(调节空气、O2和N2)，并且通过CO2调节将pH设定为7.0。培养基交换后24小时，再次用包含除LDN-193189以外的上述补充物的1.5L新鲜第3阶段基础培养基替换废培养基。然后在培养基中培养细胞48小时，直至第3阶段结束。
在阶段结束时，从3升的母反应器移除150mL细胞(1.05×106个活细胞/mL)，并在无菌条件下转移到0.2L反应器。根据下述第4阶段使剩余的1.35L反应器体积进一步分化，并且该流程和细胞在下文中被称为“标准流程”和“标准细胞”。将细胞转移至0.2L反应器，然而不根据下文第4阶段分化，而是根据下文所述的第5阶段进一步分化，并且该流程和细胞在下文中被称为“跳过4(Skip 4)流程”和“跳过4细胞”。对于跳过4流程，使用无菌管和蠕动泵在第3阶段之后将聚集的细胞群集移至0.2L生物反应器(标记为“跳过4”)，从而以1.05×106个细胞/mL开始第5阶段培养基暴露。
第4阶段(3天)：
第3阶段完成时，移除每个生物反应器中的废培养基并替换为1.5L由以下物质构成的第4阶段基础培养基：包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。第4阶段基础培养基补充有0.25μM SANT-1和400nM TPB。将反应器保持在37℃，并以70rpm搅拌。将气体和pH调节至30％的溶解氧设定点(调节空气、O2和N2)，并且通过CO2调节将pH设定点调节至7.4。在第4阶段开始48小时之后，向生物反应器中加入3.2mL/L的45％葡萄糖溶液(8mM葡萄糖推注)，并且在培养基中再培养细胞24小时。
使用无菌管和蠕动泵，在标准流程的第4阶段第3天结束时移除聚集的细胞群集(150mL，0.9×106个活细胞/mL)，并将其转移至0.2L生物反应器(标记为“标准”)以开始第5阶段培养基暴露。另外，将一些第4阶段第3天细胞(45×106个细胞/mL)从培养基分离到50mL锥形管中，然后用包含1.18g/L碳酸氢钠和0.2％w/v FAF-BSA的MCDB-1313培养基洗涤2次。将细胞重新悬浮在洗涤培养基中并在室温下保持大约5小时，然后以5×106个细胞/动物移植到NSG小鼠的肾包膜下，以使用响应于禁食过夜和IP葡萄糖推注后60分钟的眶后取血之后的腹膜内葡萄糖注射的人C-肽检测来进行体内功能分析(N＝7只动物)。
第5阶段(7天)：
在将细胞接种到标准和跳过4的0.2L生物反应器中后，移除废培养基并替换为包含MCDB-131培养基基础的150mL第5+阶段基础培养基，该MCDB-131培养基包含1.18g/L碳酸氢钠并且补充有另外的1.75g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X的1:200稀释液；250μL/L的1M抗坏血酸；10mg/L肝素(Sigma Aldrich；目录号H3149-100KU)。该第5阶段基础培养基补充有1μM T3，10μM的2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(“ALK5抑制剂II”)，1μMγ分泌酶抑制剂XXI；20ng/mL的β细胞素(R&D Systems，目录号261-CE-050)；0.25μM SANT-1；以及100nMRA。第5阶段开始48小时之后，移除废培养基并替换为150mL相同培养基和补充物。48小时之后，移除培养基并替换为补充有1μM T3、10μM ALK5抑制剂II、20ng/mL的β细胞素以及100nMRA的第5+阶段基础培养基。48小时之后，再次交换培养基并替换为补充有1μM T3、10μMALK5抑制剂II、20ng/mL的β细胞素以及100nM RA的第5+阶段基础培养基，并培养24小时至第5阶段结束。在第5阶段第7天结束时，将来自每个标准流程和跳过4流程的细胞移植到NSG小鼠的肾包膜中，以通过上述方法分析体内功能。
在分化过程中，从悬浮培养物收集细胞样品以进行分析。分析样品的mRNA表达(qRT-PCR)和蛋白质表达(通过流式细胞术)。据观察，从第3阶段培养基直接将分化移动到第5阶段培养基，跳过4流程导致与胰岛细胞、内分泌激素表达细胞和β细胞相关的基因的表达增加(与根据标准流程分化的细胞相比)。使用跳过4流程，与替代肠命运相关的基因显示出较低表达(ALB和CDX2；图30B和图30D)，而内分泌激素细胞形成和发挥功能所需的基因比在标准流程中发现的具有更多表达(ABCC8、ARX、CHGA、CHGB、G6PC2、GCG、IAPP、MAFB、NEUROD1、NKX2.2、PAX4、PAX6、PPY和SST，如图30A、图30C、图30E、图30F、图30G、图30H、图30J、图30M、图30O、图30Q、图30S、图30T、图30X和图30A’所示)。此外，对于跳过4流程和标准流程所得到的细胞两者，β细胞形成所需的基因(NKX6.1和PDX1；图30R和图30W)在第5阶段第6天均以类似水平表达。β细胞发挥功能和维持所需的基因(IAPP、INS、ISL1、HB9、PCSK1、PCSK2、SLC30A8和UNC3；图30J、图30K、图30L、图30M、图30U、图30V、图30Z和图30B’)或β细胞增殖所需的基因(WNT4A，图30C’)在用第5阶段培养基处理的跳过4细胞中以类似或更高水平表达。
这些数据与表明在跳过4细胞中的较早时间点处并持续较长时间的更高水平NGN3诱导(内分泌特化所需)的数据相关，而PTF1A表达(外分泌胰腺所需)在标准流程所产生水平的仅第1/20处达到峰值。这些结果表明，在即使短暂的PTF1A诱导也不存在的情况下，跳过4反应器中的细胞也稳健地特化至内分泌胰腺命运，表明PTF1A对于在体外形成β细胞不是必需的。该观察结果有重大意义，因为其不同于本领域所见的结果，其中PTF1A在进一步分化或美国专利公布No.2014/0271566A1中所述的假设发育模式(其中第4阶段细胞的特征为第4阶段的PDX1/NKX6.1/PTF1A标记，之后进一步体外发育成类β细胞)之前已在第4阶段中表达。
第4阶段第3天存在的PTF1A表达(图30Y)细胞群具有几乎同质的PDX1/NKX6.1共表达群体以及非常少的NEUROD1阳性细胞(通过流式细胞术测得，96.2％KX6.1、99.6％PDX1和2.4％NEUROD1)。将细胞插入到NSG小鼠的肾包膜中(500万个细胞/动物；N＝7)并经过16周周期，血液样本中未检测到人c-肽(数据未示出)。该结果出人意料，因为本领域之前已证明，由四阶段分化过程得到的富集NXK6.1/PDX1/PTF1A表达细胞群能够在移植后3个月内逆转糖尿病。
当第4阶段第3天(PTF1A表达)细胞根据标准流程进一步分化至第5阶段时，在类似于跳过4流程的细胞(低/无PTF1A)的移植后，移植物在2周时分泌可检测血液水平的人c-肽(图31)并且在12周时达到>0.5ng/mL的人c-肽。这些数据表明，PTF1A表达对确保进一步成熟为功能性β细胞既不是必要的也不是充分的。相反，PTF1A表达的上升同样指示了，可通过跳过标准第4阶段并且将细胞从包含≥0.5μM视黄酸、FGF7和PKC激动剂(TPPB)的培养基直接转移至包含γ分泌酶抑制剂、甲状腺激素(T3)且含有或不含ALK5抑制剂的培养基来避免的替代细胞群的出现。
这些结果表明，在第3阶段将pH调节至≤7.2可以抑制至少80％的NGN3表达(参见图26E：BxB和BxC与BxD)，并且促进PDX1/NKX6.1共阳性、PTF1A阴性细胞的生成，所述细胞可在不经过PTF1A阳性第4阶段细胞群的情况下，进一步直接分化成包含PDX1/NKX6.1/胰岛素阳性类β细胞的类胰岛细胞群。
实施例7
该实施例展示了使用低培养基pH(<7.2)、FGF7、视黄酸和PKC拮抗剂(TPPB)在搅拌罐式无菌封闭的生物反应器中通过五阶段分化流程形成胰岛素表达细胞。据发现，在第3阶段使用低pH消除了在第3阶段使用任何音猬因子抑制剂(诸如SANT01或环杷明)或TGF-β/BMP信号转导抑制剂或活化剂的需要，并且在第4阶段结束时会产生PDX1(94％)和NKX6.1(87％)表达细胞群。从这些细胞产生的第5阶段反应器群体具有高百分比的NEUROD1/NKX6.1共阳性细胞、以及具有PDX1和NKX6.1共表达的胰岛素阳性细胞，并且这三者(NEUROD1、PDX1、NKX6,1)必须与胰岛素共表达以获得正常的胰腺β细胞功能。因此，当该第5阶段细胞群被冷冻保存、解冻并移植到免疫受损小鼠的肾包膜中时，移植物在移植后两周内产生可检测血液水平的人C-肽，并且在移植后四周时C-肽达到平均>1ng/mL。
将人胚胎干细胞系H1细胞(WA01细胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在补充有0.5％w/v FAF-BSA的E8TM培养基中作为圆形聚集群集动态悬浮培养≥4个传代。然后按照以下方法以单个细胞和2至10个细胞的群集的形式冷冻群集。将群集中的大约60000-100000万个聚集细胞转移至离心管，并使用100mL的1X DPS-/-洗涤。洗涤之后，然后通过向松散的细胞聚集体沉淀物加入30mL的50体积％酶和50体积％DPBS-/-的溶液，以酶促方法解聚细胞聚集体。将细胞群集抽吸1至3次，然后在室温下间歇旋动大约4分钟，接着在80至200rcf下离心5分钟。然后在不干扰细胞沉淀物的情况下尽可能完全地抽出上清液。接着轻敲离心管的硬表面大约4分钟，以使群集解聚成单个细胞和包含2至10个细胞的群集。4分钟之后，将细胞重新悬浮在100mL的E8TM培养基中，该培养基补充有10μM Y-27632(Enzo Life Sciences)和0.5％w/v FAF-BSA，并且在80至200rcf下离心5至12分钟。然后抽出上清液，并逐滴加入冷(≤4℃)细胞保存培养基CS10以实现10000至15000万个细胞/mL的最终浓度。将该细胞溶液保持在冰浴中，同时将其等分到2mL冷冻小瓶(Corning)中，之后使用可控速率CryoMedTM34L冷冻器如下所述冷冻细胞。将室冷却至4℃，并且保持该温度直至样品小瓶温度达到6℃，然后将室温度每分钟降低2℃直至样品达到-7℃，此时以20℃/min的速率冷却室，直至室达到-45℃。然后使室温度以10℃/min短暂上升，直至温度达到-25℃，再以0.8℃/min进一步冷却室，直至样品小瓶达到-40℃。然后以10℃/min冷却室温度，直至室达到-100℃，此时再以35℃/min冷却室，直至室达到-160℃。然后将室温度保持在-160℃至少10分钟，之后将小瓶转移至气相液氮储存器。然后将这些高密度的冷冻保存的单个细胞用作ISM。
从液氮储存器中取出ISM的小瓶，将其解冻，并用于以29.5万个活细胞/mL的接种密度接种3升玻璃搅拌悬浮罐生物反应器(DASGIP)。从液氮储存器中取出小瓶，并迅速转移至37℃水浴，保持120秒以解冻。然后将小瓶移至BSC，并将解冻的内容物通过2mL玻璃移液管转移至50mL锥形管。接着将补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Rho激酶抑制剂Y-27632的10mL E8TM培养基以逐滴方式加入管中。在80-200rcf下离心细胞5min。从管中抽出上清液，加入补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632的10mL新鲜E8TM培养基，并将包含细胞的部分移取到培养基转样瓶(Sanisure,Inc)中，该转样瓶中包含450mL E8TM培养基，其补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632。然后通过使用蠕动泵焊接的无菌管将瓶内容物直接泵送到生物反应器中。生物反应器中准备有1000mL E8TM培养基，该培养基补充有0.5％w/v FAF-BSA和10μM Y-27632并被预热至37℃，在70rpm下搅拌，其中溶解氧设定点为30％(调节空气、O2和N2)，并且可控CO2分压为5％。在反应器中接种以得到0.225×106个细胞/mL的目标浓度(浓度范围：0.2至0.5×106个细胞/mL)。
接种反应器之后，细胞在搅拌反应器中形成圆形聚集群集。培养24小时之后，培养基被部分交换，因为移除了超过80％的初始体积并且重新加入了补充有0.5％w/v FAF-BSA的1.5L E8TM培养基(新鲜培养基)。接种之后48小时重复该培养基交换过程。作为圆形聚集群集悬浮培养3天之后，通过移除废E8TM培养基并加入分化培养基，在3升反应器中开始进行分化。下文描述了分化方案。
第1阶段(3天)：
将反应器设定为37℃的温度，并以70rpm持续搅拌。将气体和pH对照设定为10％的溶解氧设定点(调节空气、O2和N2)，并且通过CO2调节将pH设定为7.4。使用包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基制备第1阶段基础培养基；该MCDB-131培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖(45％水溶液)；以及ITS-X的1:50,000稀释液。将细胞在补充有100ng/mL GDF8和2μMMCX化合物的1.5L第1阶段基础培养基中培养一天。24小时之后，如上所述完成培养基交换，并向反应器中加入补充有100ng/mL GDF8的1.5L新鲜基础培养基。在无进一步培养基交换的情况下保持细胞48小时。
第2阶段(3天)：
将反应器设定为37℃的温度，并以70rpm持续搅拌。将气体和pH对照设定为30％的溶解氧设定点(调节空气、O2和N2)，并且通过CO2调节将pH设定为7.4。在第1阶段完成之后，如上所述完成培养基交换，由此移除废第1阶段培养基，并替换为与第1阶段基础培养基所用相同但补充有50ng/mL FGF7的1.5L培养基。培养基交换48小时之后，再次移除废培养基并替换为补充有50ng/mL FGF7的1.5L新鲜基础培养基。
第3阶段(3天)：
在第2阶段结束时，并且在马上要进行培养基交换之前，对细胞进行计数、重力沉淀，并且以200万个细胞/mL的归一化浓度重新悬浮在1.5升的以下第3阶段基础培养基中：包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。第3阶段基础培养基补充有50ng/mL FGF-7、1μM RA和400nM TPB。将反应器设定为37℃的温度，并以70rpm持续搅拌。将气体和pH对照设定为30％的溶解氧设定点(调节空气、O2和N2)，并且通过CO2调节将pH设定为7.0。培养基交换后24小时，再次用包含上述补充物的1.5L新鲜第3阶段基础培养基替换废培养基。然后在培养基中培养细胞48小时，直至第3阶段结束。
第4阶段(3天)：
第3阶段完成时，移除每个生物反应器中的废培养基并替换为1.5L由以下物质构成的第4阶段基础培养基：包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。第4阶段基础培养基补充有0.25μM SANT-1和400nM TPB。将反应器保持在37℃，并以70rpm搅拌。将气体和pH调节至30％的溶解氧设定点(调节空气、O2和N2)，并且通过CO2调节将pH设定点调节至7.4。在第4阶段开始48小时之后，向生物反应器中加入3.2mL/L的45％葡萄糖溶液(8mM葡萄糖推注)，并且在培养基中再培养细胞24小时。
第5阶段(8天)：
在第4阶段第3天结束时，移除废培养基并替换为由以下物质构成的1.5L第5阶段基础培养基：包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的1.75g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X的1:200稀释液；250μL/L的1M抗坏血酸；10mg/L肝素。对于首次给料，第5阶段基础培养基补充有1μM T3(即3,3',5-三碘代-L-甲状腺原氨酸钠盐)，10μM ALK5抑制剂II，1μMγ分泌酶抑制剂XXI；20ng/mL的β细胞素；0.25μM SANT-1；以及100nM RA。第5阶段开始48小时之后，移除废培养基并替换为1.5L新鲜的相同培养基和补充物。48小时之后，移除培养基并替换为补充有1μM T3、10μM ALK5抑制剂II、20ng/mL的β细胞素以及100nM RA的第5阶段基础培养基。48小时之后，再次交换培养基并替换为补充有1μM T3、10μM ALK5抑制剂II、20ng/mL的β细胞素以及100nM RA的第5阶段基础培养基，并培养48小时至第5阶段结束。
在第5阶段第8天结束时(最后给料之后48小时)，通过无菌管和蠕动泵从反应器移出聚集细胞群集并离心得到沉淀物。为了冻存细胞，将其转移到由具有2.43g/L碳酸氢钠的57.5％MCDB131、30％无异源的KSR、10％DMSO和2.5％HEPES构成的冻存培养基(最终浓度为25mM)。一旦细胞群集在环境温度下悬浮于冻存培养基中，则将冷冻小瓶在15分钟内移动到可控速率冷冻器(CRF)。室温度然后在45分钟内降低至4℃，并且进一步以2.00℃/分钟降低至-7.0℃(样品)。然后将样品快速冷却，将室温度以25.0℃/分钟的速率降低至-45.0℃。然后通过将室温度以10.0℃/分钟增加至-25.0℃来提供补偿增加(室)。然后以0.2℃/分钟冷却样品直到温度达到-40.0℃。然后以35.0℃/分钟的速率将室冷却至-160℃，并且在该温度下保持15分钟。在CRF运行终止时，将样品移动到气相液氮储存容器。
细胞已储存于气相液氮之后，通过从储存装置移除来解冻细胞，并将其转移到37℃水浴。将小瓶在水浴中轻轻旋动小于2分钟，直到小冰晶留在小瓶中。然后将小瓶内容物转移到50ml圆锥并且使用具有2.43g/L碳酸氢钠和2％BSA的MCDB131培养基在两分钟内逐滴稀释至最终体积总共为20ml。接着通过测定总细胞数。然后将细胞从培养基分离到50mL锥形管，移除上清液，并将细胞重新悬浮在具有2.43g/L碳酸氢钠和2％BSA的新鲜MCDB131培养基中，并将其转移至125mL转瓶并填充至75mL的体积，其中细胞浓度为100万个细胞/mL。将细胞在以55RPM搅拌的潮湿5％CO2培养箱中保持过夜，并且第二天通过流式细胞术分析细胞。解冻后，在三个平行测定中，细胞中超过50％为NKX6.1/NEUROD1共阳性(图32)，超过80％为NKX6.1/NEUROD1共阳性(图33)，并且至少35％为NKX6.1/胰岛素共阳性(图34)。此外，当这些细胞被移植到NSG小鼠的肾包膜下(500万个细胞/剂；N＝7)时，所有动物具有可检测水平的C-肽并且它们在植入后4周内分泌C-肽，平均>1ng/mL。在植入后6周时，7只移植动物中有5只表现出大于未刺激水平的葡萄糖响应性胰岛素(人C-肽)分泌(图35)，并且在12周时所有7只动物均表现出葡萄糖响应性胰岛素(人C-肽)分泌(图36)。
这些数据表明，NKX6.1/胰岛素共表达细胞可通过在第3阶段进行pH和溶解氧调节而产生，以消除对于能够阻断TGF-β/BMP或音猬因子信号转导同时还在第4阶段最大化NKX6.1/PDX1阳性细胞的产量的蛋白质或小分子的需要，所述阳性细胞可在搅拌罐式反应器中通过第5阶段进一步分化至NEUORD1/NKX6.1/PDX1/胰岛素共表达。细胞可被冷冻保存、解冻和植入，并且将在体内起作用，如在移植后4周内通过葡萄糖诱导的胰岛素分泌(>1ng/mL C-肽)所测得，并且在移植后12周时表现出葡萄糖响应性。
实施例8
该实施例展示了使用3L一次性转瓶在搅拌悬浮培养物中形成胰岛素表达细胞。培养基和气体通过可移除通气侧臂盖交换。胰岛素阳性细胞在分步过程中形成，在该过程中细胞首先表达PDX1，然后还表达NKX6.1。然后这些共表达细胞在悬浮培养时获得胰岛素和随后的MAFA、以及PDX1和NKX6.1的表达。
在使用MatrigelTM作为粘附基质的mTeSR1TM培养基中，在贴壁培养条件下将人胚胎干细胞系H1细胞(WA01细胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)培养4个传代，持续扩展到更大的容器中。在第4代将细胞接种到多个5层细胞叠堆(“CS5”)中。传代后72小时，每个CS5中的细胞汇合度达到70％-80％。移除废培养基，并用PBS洗涤细胞。然后向细胞中加入300mL预热至37℃的VerseneTM，并将细胞在37℃(5％CO2)下温育8.5分钟。温育时间之后，小心地从烧瓶中移除EDTA，在烧瓶中留下大约50mL的残余VerseneTM。然后在残余VerseneTM的情况下使细胞层连续温育3分钟，同时对容器进行间歇轻敲以使细胞群集分离。该残余温育3分钟之后，将包含10μM Y-27632(Enzo Life Sciences)的250mL mTeSR1TM加入烧瓶中，以淬灭细胞解离过程并收集分离的细胞群集。然后将洗涤培养基转移到圆瓶，用另外的150mL包含150μM Y-27632的mTeSR1TM洗涤CS5，并与首次洗涤物汇集。然后将20000万个细胞转移至未涂覆但经组织培养物处理过的CS1，补充额外的培养基以获得200mL的最终体积，其中细胞密度为100万个细胞/mL。
将包含分离的细胞的CS1在37℃下温育2小时。使用附接在2个CELI叠堆端口之间的泵配管与闭环C-flex配管，通过蠕动泵将细胞悬浮液在75rpm下研磨5分钟以使聚集体均匀化。然后用0.2μM通气盖替代泵配管组件，并放回37℃培养箱中过夜温育12至22小时。温育之后，细胞形成多能细胞的圆球形聚集群集。
然后将三个600mL包含新形成的群集的CS1容器各自转移至装有另外的1200mL新鲜预热mTeSR1TM的3L一次性转瓶，该mTeSR1TM包含10μM Y-27632并且所得细胞密度为大约30万个细胞/mL。然后在37℃和40rpm的搅拌速率下温育转瓶。温育24小时之后，使细胞脱离搅拌，并使群集沉降8分钟至烧瓶底部，之后从顶部抽走1.5L的废培养基，从而避免群集固定在容器底部。向细胞中加入1.5mL新鲜mTeSR1TM培养基，并将其放回培养箱中，以40rpm再培养24小时。在72小时结束时，将多能群集转移到分化培养基中。下文描述了分化方案。
第1阶段(3天)：
将4个转瓶中的每一个在无搅拌的情况下从动态悬浮培养转移至BSC中的培养箱。如下所述进行完整的培养基交换，以确保仅残余的废培养基被转为新培养基。为了进行完整的培养基交换，使群集沉降8分钟至烧瓶底部。然后使用真空抽吸法从液体的顶部开始移除废培养基，直至剩余仅300mL。将剩余的细胞体积转移至150mL锥形管，并在800rpm下离心3分钟。使用真空抽吸系统在不破坏细胞群集沉淀物的情况下移除剩余的废培养基。然后将沉淀物重新悬浮在包含1.5L MCDB-131培养基的1.8L基础培养基中，该MCDB-131培养基包含1.18g/L碳酸氢钠；补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠，2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖(45％水溶液)；以及ITS-X的1:50,000稀释液。将细胞在补充有1.8ml GDF8和540μL MCX化合物的1.8L第1阶段基础培养基中培养一天。进行细胞计数，以确认分化开始时具有50万个细胞/mL的起始密度。然后将瓶放回转板上的培养箱中，每个条件下2种速度，如下表XVII所示。将转瓶温育过夜。
表XVII：分化过程中使用的条件
大约24小时之后，完成培养基交换以移除大约90％的废培养基，并替换为补充有1.8mL GDF8的1.8L新鲜基础培养基。要进行培养基交换，使群集沉淀8分钟至烧瓶底部，并且使用真空抽吸法移除废培养基直至剩余仅300mL。将剩余的细胞转移到250mL圆形瓶中，并使群集沉淀6分钟，之后使用移液管移除培养基以确保仅剩余180mL包含细胞的培养基，从而确保不超过10％的残余废培养基转移至下次给料。然后将剩余的细胞和培养基装回到含有1.8L新鲜培养基的转瓶中并温育48小时。
第2阶段(3天)：
如上所述进行完整的培养基交换，以移除所有废第1阶段培养基，并且将细胞转移到用作第1阶段基础培养基但补充有1.8mL FGF7的1.8L相同培养基中。然后将瓶放回培养箱中，使其在无培养基交换的情况下在动态搅拌下保持48小时，之后再次移除废培养基以留下180mL的废培养基，并且加入补充有1.8mL FGF7的1.8L新鲜基础培养基。然后将细胞温育24小时。
第3阶段(3天)：
在第2阶段完成时，进行完整的培养基交换以移除所有第2阶段培养基并将细胞转移至1.5L培养基中：包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。第3阶段基础培养基补充有1.5mL FGF-7；75μL RA；以及120μL TPB。在“黑暗条件”下制备培养基。将瓶的总体积从1.8-2.0L减小至1.5-1.65L，以达到大约150-200万个细胞/mL的细胞密度。将瓶温育24小时，之后进行培养基交换以留下150mL废培养基，并加入包含以上补充物的1.5L新鲜第3阶段基础培养基。然后在培养基中培养细胞48小时，直至第3阶段结束。
第4阶段(3天)：
在第3阶段完成时，进行完整的培养基交换，并且将细胞转移至由以下物质构成的1.5L第4阶段基础培养基中：包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的2.4g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；以及ITS-X的1:200稀释液。第4阶段基础培养基补充有150μL SANT-1和120μLTPB。然后将瓶放回培养箱中，并使其在无培养基交换的条件下在动态搅拌下保持48小时。在48小时结束时，向转瓶中加入5.28mL 45％D-葡萄糖溶液，并将烧瓶放回，再温育24小时。
第5阶段(3天)：
在第4阶段第3天结束时，移除废培养基并替换为由以下物质构成的1.5L第5阶段基础培养基：包含1.18g/L碳酸氢钠的1.5L MCDB-131培养基，该培养基补充有另外的1.75g/L碳酸氢钠；2％w/v FAF-BSA，预先重构于MCDB-131中；1X浓度的GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X的1:200稀释液；250μL/L的1M抗坏血酸；10mg/L肝素。第5阶段基础培养基补充有1μM T3(即3,3',5-三碘代-L-甲状腺原氨酸钠盐)，10μM ALK5抑制剂II，1μMγ分泌酶抑制剂XXI；20ng/mL的β细胞素；0.25μM SANT-1；以及100nM RA。第5阶段开始48小时之后，移除废培养基并替换为1.5L新鲜的相同培养基和补充物。48小时之后，移除培养基并替换为补充有1μM T3、10μM ALK5抑制剂II、20ng/mL的β细胞素和100nM RA的第5阶段基础培养基，并继续培养48小时直至第5阶段结束。
在第5阶段结束时，使聚集的细胞群集沉降8分钟至烧瓶底部，并且使用真空抽吸法移除培养基直至剩余约300mL液体。将剩余的细胞体积转移至150mL锥形管，并在800rpm下离心3分钟，之后移除剩余的废培养基。将细胞沉淀物重新悬浮在基础洗涤培养基MCDB1313中。然后将细胞在800rpm下再次快速离心5分钟。为了冻存细胞，将其转移到由具有2.43g/L碳酸氢钠的57.5％MCDB131、20％无异源的KSR、10％DMSO和2.5％HEPES构成的冻存培养基(最终浓度为25mM)。一旦细胞群集在环境温度下悬浮于冻存培养基中，则将冷冻小瓶在15分钟内移动到可控速率冷冻器(CRF)。室温度然后在45分钟内降低至4℃，并且进一步以2.00℃/分钟降低至-7.0℃(样品)。然后将样品快速冷却，将室温度以25.0℃/分钟的速率降低至-45.0℃。然后通过将室温度以10.0℃/分钟增加至-25.0℃来提供补偿增加(室)。然后以0.2℃/分钟冷却样品直到温度达到-40.0℃。然后以35.0℃/分钟的速率将室冷却至-160℃，并且在该温度下保持15分钟。在CRF运行终止时，将样品移动到气相液氮储存容器。
将细胞储存于气相液氮之后，将其从储存装置中移出三个小瓶的细胞以解冻，并将其转移到37℃水浴中。将小瓶在水浴中轻轻旋动小于2分钟，直到小冰晶留在小瓶中。然后将小瓶内容物转移至转瓶，并以逐滴方式加入10mL解冻培养基，同时使用MCDB131培养基连续手动混合转瓶，该MCDB131培养基经过补充具有1.6g/L碳酸氢钠、8mM葡萄糖、1xITS-X和2％BSA的最终浓度。在所有三个小瓶都解冻之后，加入另外的解冻培养基以达到大约80mL的目标体积。然后在具有5％CO2的潮湿培养箱中并在38-40rpm的轻轻搅拌下，将转瓶温育过夜(16-24小时)。第二天，如下所述洗涤细胞。使转瓶在罩子中沉淀6分钟，并且抽走大约75mL的废培养基，同时使用10mL玻璃移液管将剩余的细胞悬浮液转移至50mL锥形管，并随后在600rpm下离心3分钟。抽走上清液并将细胞沉淀物重新悬浮在10mL洗涤培养基中，之后，在600rpm下重新离心细胞3分钟。在抽吸并将细胞沉淀物重新悬浮在10mL洗涤培养基中之后，将沉淀物转移回加入了60mL洗涤培养基的转瓶中。然后将瓶放到BSC的转板上，并从充分混合的均匀转瓶中收集样品，以获得细胞恢复能力并收集细胞进行分析和运输。
图37A和图37B示出了转瓶内培养基的pH曲线。培养基的pH受到培养箱中的CO2(设定点，5％)和代谢活动(具体地讲，图38所示的细胞的乳酸盐生成)调控。其表明，具有最低pH环境(具体地讲，条件A)的培养物同样具有最高乳酸盐浓度。如图37A和图37B所示，第2阶段期间所有转瓶的pH在第3阶段中介于约6.8和7.2之间以及约7.0和7.2之间。在第3阶段完成后，据观察几乎所有细胞都表达内胚层转录因子FOXA2和胰腺特异性转录因子PDX1两者。还检测到至少50％表达NKX6.1，并且小部分为NEUOD1阳性。在第3阶段的另外48小时之后，第4阶段第2天完成时，NKX6.1群体增加至群体的约65％，这是最初用Accutase提升的(条件C和D)并且是最初用EDTA提升的细胞群的大约70％-75％，如表XVIII所示。
表XVIII
在第5阶段第6天完成时，在冷冻保存细胞之前再次通过流式细胞术对细胞进行分析。
表XIX：第5阶段蛋白质表达
通过流式细胞术评估解冻的细胞以便与新鲜(冷冻保存前)分析进行比较。通过在解冻时(t＝0)将最终细胞群与初始群体比较来评估细胞恢复能力，如表XX所示。通过活/死荧光成像定性评估细胞活力，如图39所示，并与t＝0时比较。
表XX
*“24HAT”意指解冻后24小时，上标是指运行编号。
尽管已结合各种具体材料、程序和实例描述和示出了本发明，然而应当理解，本发明并不限于针对该目的所选材料和程序的特定组合。本领域的技术人员将理解，可对这些细节作出多种改变。说明书和实例应被认为仅为示例性的，本发明的真实范围和实质由随附权利要求书限定。本申请中所提到的所有参考文献、专利和专利申请均全文以引用方式并入本文中。

Claims (7)

1.一种用于分化人多能细胞的方法，包括以下步骤：通过在约7.2至约7.0的pH下在动态悬浮培养物中培养前肠内胚层细胞至少约24小时来使所述前肠内胚层细胞分化成胰腺内胚层细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括在具有等于或大于约150万个细胞/mL的细胞浓度的培养物中培养所述前肠内胚层细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括在具有大于或等于约200万个细胞/mL的细胞浓度的培养物中培养所述前肠内胚层细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述胰腺内胚层细胞对于PTF1A和NGN3的表达基本上呈阴性。
5.根据权利要求4所述的方法，还包括将对于PTF1A和NGN3的所述表达基本上呈阴性的所述胰腺内胚层细胞富集成胰腺内胚层细胞群，所述胰腺内胚层细胞群具有大于或等于约96％的对于PDX1和NKX6.1的共表达呈阳性并且对于PTF1A的表达呈阳性的细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，还包括在不存在其中产生对于PTF1A表达呈阳性的细胞的分化阶段的情况下，将对于PTF1A和NGN3的所述表达基本上呈阴性的所述胰腺内胚层细胞分化成胰腺内分泌。
7.一种用于分化人多能细胞的方法，包括以下步骤：通过在约7.2至约7.0的pH下在动态悬浮培养物中培养前肠内胚层细胞至少约24小时，细胞浓度等于或大于约150万个细胞/mL并且类视黄醇浓度为约0.5至约1.0μM，将所述前肠内胚层细胞分化成胰腺内胚层细胞，其中所述培养是在不存在能够进行TGF-β信号转导和BMP信号转导的抑制、阻断、激活或激动中的一者或多者的组分以及音猬因子信号转导途径抑制剂的情况下进行的。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112867787A (zh) * 2018-09-19 2021-05-28 武田药品工业株式会社 胰岛素产生细胞
CN119432595A (zh) * 2023-08-07 2025-02-14 浙江霍德生物工程有限公司 利用生物反应器进行诱导多能干细胞的悬浮培养

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3408375A4 (en) 2016-01-26 2019-07-17 Centre for Commercialization of Regenerative Medicine PROCESS FOR DISSOCIATION OF CELL AGGREGATES
US10391156B2 (en) 2017-07-12 2019-08-27 Viacyte, Inc. University donor cells and related methods
JP2020527956A (ja) * 2017-07-21 2020-09-17 センマ・セラピューティクス・インコーポレーテッド 幹細胞由来の膵臓ベータ細胞の再凝集
IL272734B2 (en) * 2017-09-11 2025-05-01 Novo Nordisk As Enrichment of nkx6.1 and c-peptide co-expressing cells derived in vitro from stem cells
KR102789149B1 (ko) 2017-11-15 2025-03-31 셈마 테라퓨틱스, 인크. 섬세포 제조 조성물 및 사용 방법
EP3833365A4 (en) 2018-08-10 2022-05-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
US20200080107A1 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
WO2020243663A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
JP2022535239A (ja) 2019-05-31 2022-08-05 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティド 生体適合性メンブレン複合体
CN114401752B (zh) 2019-05-31 2023-04-04 W.L.戈尔及同仁股份有限公司 具有受控氧扩散距离的细胞封装装置
US12310830B2 (en) 2019-05-31 2025-05-27 W. L. Gore & Associates, Inc. Biocompatible membrane composite
MX2022002663A (es) 2019-09-05 2022-04-07 Crispr Therapeutics Ag Celulas donantes universales.
JP2022547505A (ja) 2019-09-05 2022-11-14 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト ユニバーサルドナー細胞
US11566230B2 (en) 2020-12-31 2023-01-31 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
WO2025117331A1 (en) * 2023-12-01 2025-06-05 Eli Lilly And Company Methods of making stem cell-derived islet-like cells, as well as populations and compositions including the same

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050266554A1 (en) * 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
WO2007103282A2 (en) * 2006-03-02 2007-09-13 Cythera, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
WO2011139628A1 (en) * 2010-04-25 2011-11-10 Mount Sinai School Of Medicine Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells
US20110280842A1 (en) * 2008-08-22 2011-11-17 Presidents And Fellows Of Harvard College Methods of reprogramming cells
US20130189777A1 (en) * 2011-12-22 2013-07-25 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Single Hormonal Insulin Positive Cells

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
JP4666567B2 (ja) 2001-12-07 2011-04-06 ジェロン・コーポレーション ヒト胚幹細胞由来の膵島細胞
PL2322599T3 (pl) 2003-06-27 2015-10-30 Depuy Synthes Products Inc Komórki pozyskiwane poporodowo z tkanki sznura pępowinowego i sposoby pozyskiwania i zastosowania tych komórek do naprawy i regeneracji tkanek miękkich
SG149061A1 (en) 2003-12-23 2009-01-29 Cythera Inc Definitive endoderm
KR101178786B1 (ko) 2004-03-23 2012-09-07 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 다능성 줄기세포의 증식 방법
AU2006208944A1 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Imperial College Innovations Limited Methods for embryonic stem cell culture
AU2006202209B2 (en) 2005-05-27 2011-04-14 Lifescan, Inc. Amniotic fluid derived cells
WO2007026353A2 (en) 2005-08-29 2007-03-08 Technion Research & Development Foundation Ltd. Media for culturing stem cells
EP2674485B1 (en) * 2005-10-27 2019-06-12 Viacyte, Inc. Pdx-1 expressing dorsal and ventral foregut endoderm
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
AU2007277364B2 (en) 2006-07-26 2010-08-12 Viacyte, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
EP2059586B1 (en) 2006-08-02 2016-07-20 Technion Research & Development Foundation Ltd. Methods of expanding embryonic stem cells in a suspension culture
JP5991796B2 (ja) 2007-06-29 2016-09-14 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 胚性幹細胞培養のための自動化された方法および装置
MX2011000125A (es) * 2008-06-30 2011-02-25 Centocor Ortho Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre pluripotentes.
US20110104805A1 (en) 2009-10-29 2011-05-05 Centocor Ortho Biotech Inc. Pluripotent Stem Cells
EP4219683A1 (en) * 2012-12-31 2023-08-02 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using hb9 regulators
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050266554A1 (en) * 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
WO2007103282A2 (en) * 2006-03-02 2007-09-13 Cythera, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US20110280842A1 (en) * 2008-08-22 2011-11-17 Presidents And Fellows Of Harvard College Methods of reprogramming cells
WO2011139628A1 (en) * 2010-04-25 2011-11-10 Mount Sinai School Of Medicine Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells
US20130189777A1 (en) * 2011-12-22 2013-07-25 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Single Hormonal Insulin Positive Cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KEVIN A D"AMOUR ET AL.,: "Production of pancreatic hormone expressing endocrine cells from human embryonic stem cells", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *
RACHEL E. JENNINGS ET AL.,: "Development of the Human Pancreas From Foregut to Endocrine Commitment", 《DIABETES》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112867787A (zh) * 2018-09-19 2021-05-28 武田药品工业株式会社 胰岛素产生细胞
CN119432595A (zh) * 2023-08-07 2025-02-14 浙江霍德生物工程有限公司 利用生物反应器进行诱导多能干细胞的悬浮培养

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Publication number Publication date
KR102281752B1 (ko) 2021-07-23
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PH12017501153A1 (en) 2017-11-27

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