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KR102673828B1 - off-the-shelf 줄기세포 및 면역세포, 이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

off-the-shelf 줄기세포 및 면역세포, 이를 포함하는 약학적 조성물 Download PDF

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KR102673828B1
KR102673828B1 KR1020210009773A KR20210009773A KR102673828B1 KR 102673828 B1 KR102673828 B1 KR 102673828B1 KR 1020210009773 A KR1020210009773 A KR 1020210009773A KR 20210009773 A KR20210009773 A KR 20210009773A KR 102673828 B1 KR102673828 B1 KR 102673828B1
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cancer
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cell
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권대기
한미정
이승희
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주식회사 강스템바이오텍
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Abstract

본 발명은 B2M(Beta-2 microglobulin) 유전자의 발현이 억제되고, CD24(cluster of differentiation 24) 유전자를 발현함으로써, 면역 거부 반응이 억제된 분화전능성 줄기세포, 면역세포 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

off-the-shelf 줄기세포 및 면역세포, 이를 포함하는 약학적 조성물 {Off-the-shelf stem cell and immune cell, and a pharmaceutical composition}
본 발명은 off-the-shelf 줄기세포 및 면역세포, 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
암(악성 종양)은 현대사회에서 사망률 1위를 차지하는 주요 질병으로 현재까지 많은 연구에도 불구하고 획기적인 치료법이 없는 실정이다. 암의 치료에 있어 항암제와 같은 화학요법제를 이용한 치료는 어느 정도 효과를 거두고는 있으나 암의 다양한 발병기작과 항암제 내성 발현으로 인하여 많은 연구가 요구되고 있다.
최근 수십 년간 진단과 치료기술의 발달로 암치료에 대해 제한적으로나마 치료율의 향상과 기능적 보존이라는 긍정적인 결과를 얻기도 했지만 많은 진행성 암에 있어서 5년 생존율은 5 내지 50%에 맴돌고 있다. 이러한 암은 공격적인 침습, 림프절전이, 원격전이와 이차 암의 발생을 특징이라 할 수 있는데 일부암에 있어서는 다양한 연구와 치료에도 불구하고 지난 20년간 생존율이 크게 변하지 못한 상태이다. 최근에는 이러한 암에 대해 분자생물학적인 접근을 통해 치료효과를 높이려는 시도가 많아지고, 암의 증식, 전이와 세포사멸과 관련된 표적치료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
인간 T 세포 요법은 환자에서 암 세포를 표적화하고 사멸시키기 위해, 풍부화되거나 변형된 인간 T 세포에 의존한다. T 세포가 특정한 암 세포를 표적화하고 사멸시키는 능력을 증가시키기 위해, T 세포를 특정한 표적 암 세포로 지시하는 구축물을 발현하도록 T 세포를 조작하는 방법이 개발되어 왔다. 특정한 종양 항원과 상호작용할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 조작된 T 세포 수용체 (TCR)는 T 세포가 특정한 종양 항원을 발현하는 암 세포를 표적화하고 사멸시키는 것을 가능하게 한다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 면역거부반응 없이 안정적으로 암치료에 사용할 수 있는 세포독성을 나타내는 T 세포를 개발하기 위하여, 예의 연구노력한 결과, B2M, CIITA, TCR, PD1 및 CTLA4 유전자의 발현이 억제되고, CD24 및 CD19CAR 유전자의 발현수준이 증진된 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)이 효과적인 암 치료활성을 나타냄을 확인하였으며, 또한 B2M, CIITA 유전자의 발현이 억제되고, CD24 유전자의 발현수준이 증진된 줄기세포로부터 유도한 면역세포가 효과적인 암 치료 활성을 나타내며 NK세포에 의한 공격을 회피하여 면역거부반응이 적게 일어나는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2019-0130024호
본 발명은 면역거부반응이 억제된 분화전능성 줄기세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 면역거부반응이 억제된 면역세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 면역세포를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 B2M(Beta-2 microglobulin) 유전자의 발현이 억제되고, CD24(cluster of differentiation 24) 유전자를 발현하는 분화전능성 줄기세포에 관한 것이다.
본 발명은 상기 줄기세포로부터 유도된 면역세포에 관한 것이다.
본 발명은 상기 면역세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 줄기세포 및 면역세포를 사용하면, 면역거부반응을 나타내지 않아, 범용적으로 사용할 수 있는 바 기존의 환자맞춤형 CAR-T 치료보다 경제적으로, 보다 안전하게 사용할 수 있으므로, 보다 효과적인 질병의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 B2M-/- CIITA-/- PDCD1-/- CTLA4-/- iPSC 형태를 나타낸 것이다.
도 2는 B2M-/- CIITA-/- PDCD1-/- CTLA4-/- iPSC genotype을 나타낸 것이다. 각 도면에서 위의 가닥이 WT allele, 아래의 가닥이 KO allele이다.
도 3은 B2M-/- CIITA-/- iPSC genotype (B2M = HLA class I, CIITA = HLA class II)을 나타낸 것이다.
도 4는 Novel “Don’t eat me 유전자 CD24” 선별을 위한 평가 결과이다.
도 5는 B2M-/- CIITA-/- PDCD1-/- CTLA4-/- CD24+ CD19 CAR+ iPSC 제작을 확인한 것이다.
도 6은 TRA 유전자의 CDS에서 1개 이상의 base deletion이 일어난 것을 증명하는 sequencing 데이터이다. 즉, B2M-/- CIITA-/- PDCD1-/- CTLA4-/- TRA-/- CD24+ CD19 CAR+ iPSC 제작을 확인한 것이다.
도 7은 PBMC와 NK 세포의 inhibitory receptor heterogenicity를 확인한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 B2M(Beta-2 microglobulin) 유전자의 발현이 억제되고, CD24(cluster of differentiation 24) 유전자를 발현하는 분화전능성 줄기세포에 관한 것이다.
B2M 유전자는 HLA class I의 역할을 수행하는 유전자로서, B2M 유전자의 발현이 억제/결실되면, HLA class I의 활성이 저해/결핍된다.
CD24 유전자는 신규한 Don't eat me gene으로서, HLA class I의 활성이 결핍된 세포는 이식 후 natural killer cell의 공격을 받지만, 상기 Don't eat me 유전자는 natural killer cell의 공격을 방어한다.
본 발명의 분화전능성 줄기세포는 B2M 유전자의 발현이 억제되고, CD24 유전자를 발현함으로써 면역 거부 반응을 나타내지 않을 수 있다.
유전자의 발현 억제는 발현 억제 또는 결실을 의미하는 것으로서, 이는 당 분야에 공지된 방법에 의한 것일 수 있고, 예를 들면 CRISPR 등을 사용할 수 있다.
CRISPR에 의하는 경우, B2M 유전자의 발현 억제를 위해 예를 들면 서열번호 1의 sgRNA를 사용할 수 있다.
CD24 유전자는 내재적 또는 외인적으로 발현하는 것일 수 있고, 그 발현이 증가된 것일 수 있다. 외래 유전자가 도입된 경우, 예를 들면 인간 유래의 유전자일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 6(NM_013230)의 서열로 이루어진 유전자일 수 있다.
유전자의 도입은 당 분야에 공지된 방법에 의할 수 있고, 예를 들면 전기 천공법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유전자 도입시에는 다양한 벡터를 사용할 수 있고, 이는 공지된 플라스미드, 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터 등을 포함한다.
본 발명의 분화전능성 줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포(iPSC)일 수 있다.
본 발명의 분화전능성 줄기세포는 CIITA(class II, major histocompatibility complex, transactivator), PDCD1(Programmed cell death protein 1), CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) 및 TCR(T-cell receptor)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1개의 유전자의 발현이 더 억제된 것일 수 있다.
CIITA는 HLA class II의 역할을 수행하는 유전자로서, CIITA 유전자가 억제/결실되면, HLA class II의 활성이 저해/결핍된다. 상기 유전자가 억제됨으로써 면역 거부 반응이 보다 억제된다.
PDCD1은 T cell inhibitory receptor의 일종으로서, 암세포가 T cell의 PD1에 결합하면 T 세포의 기능이 억제된다. 상기 유전자가 억제됨으로써 상기 줄기세포로부터 분화된 면역세포의 활성이 암세포에 의해 억제되는 것을 방지할 수 있다.
CTLA4는 T cell inhibitory receptor의 일종으로서, 암세포가 T cell의 CTLA4에 결합하면 T 세포의 기능이 억제된다. 상기 유전자가 억제됨으로써 상기 줄기세포로부터 분화된 면역세포의 활성이 암세포에 의해 억제되는 것을 방지할 수 있다.
TCR은 T cell antigen recognition receptor의 역할을 수행하는 유전자이다. 상기 유전자가 억제됨으로써 상기 줄기세포로부터 분화된 면역세포가 이식편대숙주병(Graft-versus-host disease, GVHD)을 유발하는 것을 방지할 수 있다. TCR은 예를 들면 TRA(T cell receptor Alpha)일 수 있다.
유전자의 발현 억제는 발현 억제 또는 결실을 의미하는 것으로서, 이는 당 분야에 공지된 방법에 의한 것일 수 있고, 예를 들면 CRISPR 등을 사용할 수 있다.
CRISPR에 의하는 경우, CIITA의 발현 억제를 위해 서열번호 2의 sgRNA, PDCD1의 발현 억제를 위해 서열번호 3의 sgRNA, CTLA4의 발현 억제를 위해 서열번호 4의 sgRNA, TCR의 발현 억제를 위해 서열번호 5의 sgRNA를 사용할 수 있다.
본 발명의 분화 전능성 줄기세포는 암세포 표면 항원 특이적 CAR(Chimeric Antigen Receptor, 키메라 항원 수용체)를 발현하는 것일 수 있다. 그러한 경우 이로부터 분화된 면역 세포가 항암 활성을 나타낼 수 있다.
CAR는 암세포 표면 항원에 특이적인 것으로서, 암세포 표면 항원의 종류는 제한되지 않으며, 적용하고자 하는 암종, 그 특정의 암세포 표면의 항원일 수 있다. 예를 들면 CD19일 수 있다.
CAR는 적용하고자 하는 암세포 표면 항원에 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 것이라면, 그 세대, 각 도메인의 종류, 배치, 서열 등은 제한되지 않고 사용될 수 있다.
CD19 CAR의 경우의 구체적인 예를 들면, 항원 결합 도메인의 서열은 FMC63 클론 서열로 이루어진 것일 수 있고, 예를 들면 전체 서열은 서열번호 7의 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 분화 전능성 줄기세포는 앞서 예시한 다양한 조합의 유전자의 발현이 억제된 것일 수 있고, CD24 및/또는 암세포 표면 항원 특이적 CAR를 발현하는 것일 수 있다.
구체적인 예를 들자면 B2M, CIITA, PDCD1 및 CTLA4 유전자의 발현이 억제되고, CD24 유전자 및 암세포 표면 항원 특이적 CAR를 발현하는 것일 수 있고, 여기에 TCR 유전자의 발현이 더 억제된 것일 수 있다. TCR은 예를 들면 TRA일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분화 전능성 줄기세포로부터 분화된 면역세포에 관한 것이다.
상기 줄기세포로부터 분화된 면역세포는 상기 줄기세포가 발현하는 유전자를 발현하고, 발현이 억제된 유전자의 발현이 억제된 것일 수 있다. 이에 의해 면역 거부 반응을 나타내지 않을 수 있다.
또한, 암세포 표면 항원 특이적 CAR를 발현하는 경우 항암 활성을 나타낼 수 있다.
면역세포는 예를 들면 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), NK(Natural kill) 세포 또는 대식세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 면역 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 면역 세포는 암세포 표면 항원 특이적 CAR를 발현하는 것일 수 있다.
CAR에 사용될 수 있는 항원 결합 도메인의 종류가 제한되지 않고, 적용하고자 하는 암종에 맞는 항원 결합 도메인을 사용할 수 있는 것이므로, 본 발명의 약학 조성물은 다양한 암종에 대한 항암 활성을 나타낼 수 있다. 일 예로서, 고형암 또는 혈액암이 될 수 있고, 다른 예로서, 췌장암, 유방암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 간암, 위암, 결장암, 골암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양 등의 고형암이 될 수 있고, 또 다른 예로서, 백혈병 등의 혈액암이 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 경피흡수제, 겔제, 로션제, 연고제, 크림제, 첩부제, 카타플라스마제, 페이스트제, 스프레이, 피부 유화액, 피부 현탁액, 경피 전달성 패치, 약물 함유 붕대 또는 좌제의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 약학 조성물은 1일 0.01 내지 500 mg/kg으로, 구체적으로 10 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.
상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1. Wild type iPSC의 제작
피부세포에 reprogramming gene을 도입하여 iPSC를 제작하였다.
구체적으로, 야생형 iPSC를 제조하기 위해, 인간 섬유아세포 (Human dermal fibroblasts; hDF)에 reprogramming gene (Oct-4, Sox-2, c-Myc, Klf-4)을 발현하는 레트로바이러스 혹은 플라스미드를 도입하였다. MOI 5-20의 레트로바이러스를 spinfection 방법으로 hDF에 도입하였다. 플라스미드는 전기천공법으로 hDF에 도입하였다. Reprogramming gene이 도입된 hDF를 3주간 일반적인 iPSC 배양 조건에서 배양하여 최종적으로 미분화 iPSC 군집을 형성하였다. 미분화 iPSC 군집을 피펫을 이용하여 메커니컬하게 픽킹하였고, 계대배양을 통해 증식시켜서 이후 유전자 편집 실험에 사용하였다. 본 발명에서는 주로 레트로바이러스를 이용하여 제작한 iPSC를 사용하여 유전자 편집 실험을 진행하였다. 사용된 서열은 하기와 같다.
서열번호 타깃유전자 코딩 서열 (CDS)
8 Oct-4 NM_203289
9 Sox-2 NM_003106
10 c-Myc NM_002467
11 Klf-4 NM_001314052
2. B2M -/- CIITA -/- PDCD1 -/- CTLA4 -/- iPSC의 제작
상기 Wild type iPSC에 non-viral plasmid로 4종의 sgRNA/Cas9을 전기천공법으로 도입하였다.
B2M의 넉아웃을 위해 서열번호 1의 sgRNA, CIITA의 넉아웃을 위해 서열번호 2의 sgRNA, PDCD1의 넉아웃을 위해 서열번호 3의 sgRNA, CTLA4의 넉아웃을 위해 서열번호 4의 sgRNA를 사용하였다.
15개의 single cell 유래 콜로니를 독립적으로 배양하여, 넉아웃 여부를 sequencing으로 검증하였다.
Genotype Colony number Ratio (%)
B2M-/- CIITA-/-
PDCD1-/- CTLA4-/- 		1 6.7
B2M-/- CIITA-/- 2 13.3
B2M-/- 5 33.3
Wild type 7 46.7
15개의 콜로니 중 1개가 B2M-/- CIITA-/- PDCD1-/- CTLA4-/-임을 확인하였고, 이는 유전자 편집 이후에도 전형적인 미분화 콜로니 형태를 유지하였고(도 1), 그 genotype은 도 2와 같다.
B2M-/- CIITA-/- iPSC genotype은 도 3과 같다.
3. Novel Don't eat me 유전자의 스크리닝
Novel Don't eat me 유전자를 스크리닝하기 위해 CD24, HLA-G (B2M linked), PSG9 (Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 9) 유전자를 레트로바이러스 벡터 (pMX)에 클로닝 하였다. HLA class I null (B2M-/-) iPSC 유래 분화세포에 각각의 레트로바이러스를 spinfection으로 도입하였다 (MOI=10). qRT-PCR 기법으로 대조군 대비 50배이상 각각의 유전자가 과발현 되었음을 확인하였다. 이 세포를 NK 세포(Natural killer cell)와 반응시켜 세포 독성 정도를 비교하였다. 사용된 서열은 하기와 같다.
서열번호 후보 인간 유전자 코딩 서열 (CDS)
12 HLA-G NM_002127
13 PSG9 NM_001301707
이를 통해 기존에 잘 알려진 Don't eat me 유전자인 HLA-G와 비슷한 수준의 기능을 보이는 CD24 유전자를 선별하였다(도 4).
B2M-/- 세포 (HLA class I 넉아웃 세포)는 NK 세포의 공격을 받아 죽게 된다 (Death rate = 약 50%). 하지만 B2M-/- 세포에 전통적인 Don’t eat me 유전자인 HLA-G를 과발현시키면 NK 세포가 HLA-G와 상호 작용하여 해당 세포를 공격하지 않게 된다. 그래서 cell death rate가 약 60% 떨어지게 된다 (Death rate = 약 20%). 본 발명자들은 CD24를 B2M-/- 세포에 과발현시켜서 HLA-G와 거의 동일한 cell death 감소 효과를 확인하였다. 이는 NK 세포에 CD24와 결합하는 inhibitory receptor가 존재하기 때문인 것으로 판단된다.
4. B2M -/- CIITA -/- PDCD1 -/- CTLA4 -/- CD24 + CD19 CAR + iPSC 제작
B2M-/- CIITA-/- PDCD1-/- CTLA4-/- iPSC에 retroviral 인간 CD24 (pMX CD24; 서열번호 6, NM_013230), 2세대 lentiviral CD19 (FMC63 clone) CAR (pHR CD19 CAR; 서열번호 12)를 도입하고, 24개의 single cell 유래 콜로니를 독립적으로 배양한 뒤, CD24, CD19 CAR의 세포 내 도입여부를 PCR로 검증하였다.
24개의 콜로니 중 18개가 CD24+ CD19 CAR+ iPSC임을 확인하였다(도 5).
5. B2M -/- CIITA -/- PDCD1 -/- CTLA4 -/- TRA -/- CD24 + CD19 CAR + iPSC 제작
T cell receptor (TCR)는 TRA, TRB 유전자로 구성된다. B2M-/- CIITA-/- PDCD1-/- CTLA4-/- CD24+ CD19 CAR+ iPSC에 TRA knockout을 위한 CRISPR/Cas9을 전기천공법으로 도입하여 TRA-/-를 추가하였다. 이를 위해 서열번호 5의 sgRNA를 사용하였다. 결과적으로, B2M-/- CIITA-/- PDCD1-/- CTLA4-/- TRA-/- CD24+ CD19 CAR+ iPSC가 제작되었다.
6. NK 세포의 heterogenicity 확인
Novel Don't eat me 유전자인 CD24의 기능에 대한 메커니즘을 분석하기 위해 PBMC와 NK 세포에서 발현하는 inhibitory receptor를 FACS로 분석하였다. 결과적으로, PBMC와 NK 세포는 HLA-G와 결합하는 receptor인 CD85j를 발현하였다. 또한, 이와는 별개로 CD24 와 결합하는 receptor인 Siglec-10을 발현하였다. 종합하면, HLA class I null 세포에 과별현 된 CD24는 NK세포의 Siglec-10 receptor와 결합하여 don't eat me 유전자로 기능하는 것으로 설명될 수 있다.
<110> KANGSTEM BIOTECH CO., LTD. <120> Off-the-shelf stem cell and immune cell, and a pharmaceutical composition <130> 210122 <150> KR 10-2020-0009273 <151> 2020-01-23 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M sgRNA <400> 1 actcacgctg gatagcctcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CIITA sgRNA <400> 2 gatattggca taagcctccc 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 sgRNA <400> 3 atgtggaagt cacgcccgtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 sgRNA <400> 4 gtgcggcaac ctacatgatg 20 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRA sgRNA <400> 5 ctctcagctg gtacacggca 20 <210> 6 <211> 243 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 atgggcagag caatggtggc caggctcggg ctggggctgc tgctgctggc actgctccta 60 cccacgcaga tttattccag tgaaacaaca actggaactt caagtaactc ctcccagagt 120 acttccaact ctgggttggc cccaaatcca actaatgcca ccaccaaggc 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ggtagaagag gccaataaag 5760 gagagaacac cagcttgtta caccctgtga gcctgcatgg gatggatgac ccggagagag 5820 aagtgttaga gtggaggttt gacagccgcc tagcatttca tcacgtggcc cgagagctgc 5880 atccggagta cttcaagaac tgctgatatc gagcttgcta caagggactt tccgctgggg 5940 actttccagg gaggcgtggc ctgggcggga ctggggagtg gcgagccctc agatcctgca 6000 tataagcagc tgctttttgc ctgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg 6060 gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg 6120 cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc 6180 ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa cagggacttg aaagcgaaag 6240 ggaaaccaga ggagctctct cgacgcagga ctcggcttgc tgaagcgcgc acggcaagag 6300 gcgaggggcg gcgactggtg agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga 6360 gagatgggtg cgagagcgtc agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa 6420 ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa acatatagta tgggcaagca 6480 gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac 6540 aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat 6600 ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat agagataaaa gacaccaagg 6660 aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa gaccaccgca cagcaagcgg 6720 ccggtgatct tcagacctgg acgatatata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 6780 aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 6840 tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 6900 cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 6960 tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 7020 tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 7080 gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 7140 ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 7200 acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 7260 taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 7320 aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 7380 tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 7440 tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 7500 ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 7560 ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgccaaat ggcagtattc atccacaatt 7620 ttaaaagaaa aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta gacataatag 7680 caacagacat acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg 7740 tttattacag ggacagcaga gatccagttt ggatcgataa gcttgatatc gaattcctgc 7800 agccccgata aaataaaaga ttttatttag tctccagaaa aaggggggaa tgaaagaccc 7860 cacctgtagg tttggcaagc tagctgcagt aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac 7920 caaaccaaga atagagaagt tcagatcaag ggcgggtaca tgaaaatagc taacgttggg 7980 ccaaacagga tatctgcggt gagcagtttc ggccccggcc cggggccaag aacagatggt 8040 caccgcagtt tcggccccgg cccgaggcca agaacagatg gtccccagat atggcccaac 8100 cctcagcagt ttcttaagac ccatcagatg tttccaggct cccccaagga cctgaaatga 8160 ccctgcgcct tatttgaatt aaccaatcag cctgcttctc gcttctgttc gcgcgcttct 8220 gcttcccgag ctctataaaa gagctcacaa cccctcactc ggcgcgccag tcctccgaca 8280 gactgagtcg cccggggggg atctggagct ctcgagaatt ctcacgcgtg ccaccatggc 8340 cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg ctccacgccg ccaggccgga 8400 catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct ctgggagaca gagtcaccat 8460 cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat tggtatcagc agaaaccaga 8520 tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta cactcaggag tcccatcaag 8580 gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc attagcaacc tggagcaaga 8640 agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt ccgtacacgt tcggaggggg 8700 gaccaagctg gagatcacag gtggcggtgg ctcgggcggt ggtgggtcgg gtggcggcgg 8760 atctgaggtg aaactgcagg agtcaggacc tggcctggtg gcgccctcac agagcctgtc 8820 cgtcacatgc actgtctcag gggtctcatt acccgactat ggtgtaagct ggattcgcca 8880 gcctccacga aagggtctgg agtggctggg agtaatatgg ggtagtgaaa ccacatacta 8940 taattcagct ctcaaatcca gactgaccat catcaaggac aactccaaga gccaagtttt 9000 cttaaaaatg aacagtctgc aaactgatga cacagccatt tactactgtg ccaaacatta 9060 ttactacggt ggtagctatg ctatggacta ctggggccaa ggaacctcag tcaccgtctc 9120 ctcaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg cccaccatcg cgtcgcagcc 9180 cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg ggcgcagtgc acacgagggg 9240 gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg gccgggactt gtggggtcct 9300 tctcctgtca ctggttatca ccctttactg cagacgactc aagatccagg tccgaaaggc 9360 agctatagcc agccgtgaga aagcagatgc tgtctacacg ggcctgaaca cccggagcca 9420 ggagacatat gagactctga agcatgagaa accaccccag ggatccggaa gtatggtgag 9480 caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 9540 aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 9600 gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 9660 caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 9720 cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 9780 cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 9840 catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 9900 gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa 9960 ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 10020 ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 10080 cacccagtcc aagctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 10140 gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaagcggccg 10200 cgactctaga gtcgacctgc aggcatgcaa gcttgatatc aagcttatcg ataatcaacc 10260 tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 10320 gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 10380 cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt 10440 tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg 10500 cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac 10560 ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac 10620 tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt 10680 tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc 10740 ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg 10800 ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cat 10843 <210> 8 <211> 573 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 ctgggggttc tatttgggaa ggtattcagc caaacgacca tctgccgctt tgaggctctg 60 cagcttagct tcaagaacat gtgtaagctg cggcccttgc tgcagaagtg ggtggaggaa 120 gctgacaaca atgaaaatct tcaggagata tgcaaagcag aaaccctcgt gcaggcccga 180 aagagaaagc gaaccagtat cgagaaccga gtgagaggca acctggagaa tttgttcctg 240 cagtgcccga aacccacact gcagcagatc agccacatcg cccagcagct tgggctcgag 300 aaggatgtgg tccgagtgtg gttctgtaac cggcgccaga agggcaagcg atcaagcagc 360 gactatgcac aacgagagga ttttgaggct gctgggtctc ctttctcagg gggaccagtg 420 tcctttcctc tggccccagg gccccatttt ggtaccccag gctatgggag ccctcacttc 480 actgcactgt actcctcggt ccctttccct gagggggaag cctttccccc tgtctccgtc 540 accactctgg gctctcccat gcattcaaac tga 573 <210> 9 <211> 954 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 atgtacaaca tgatggagac ggagctgaag ccgccgggcc cgcagcaaac ttcggggggc 60 ggcggcggca actccaccgc ggcggcggcc ggcggcaacc agaaaaacag cccggaccgc 120 gtcaagcggc ccatgaatgc cttcatggtg tggtcccgcg ggcagcggcg caagatggcc 180 caggagaacc ccaagatgca caactcggag atcagcaagc gcctgggcgc cgagtggaaa 240 cttttgtcgg agacggagaa gcggccgttc atcgacgagg ctaagcggct gcgagcgctg 300 cacatgaagg agcacccgga ttataaatac cggccccggc ggaaaaccaa gacgctcatg 360 aagaaggata agtacacgct gcccggcggg ctgctggccc ccggcggcaa tagcatggcg 420 agcggggtcg gggtgggcgc cggcctgggc gcgggcgtga accagcgcat ggacagttac 480 gcgcacatga acggctggag caacggcagc tacagcatga tgcaggacca gctgggctac 540 ccgcagcacc cgggcctcaa tgcgcacggc gcagcgcaga tgcagcccat gcaccgctac 600 gacgtgagcg ccctgcagta caactccatg accagctcgc agacctacat gaacggctcg 660 cccacctaca gcatgtccta ctcgcagcag ggcacccctg gcatggctct tggctccatg 720 ggttcggtgg tcaagtccga ggccagctcc agcccccctg tggttacctc ttcctcccac 780 tccagggcgc cctgccaggc cggggacctc cgggacatga tcagcatgta tctccccggc 840 gccgaggtgc cggaacccgc cgcccccagc agacttcaca tgtcccagca ctaccagagc 900 ggcccggtgc ccggcacggc cattaacggc acactgcccc tctcacacat gtga 954 <210> 10 <211> 1365 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 ctggattttt ttcgggtagt ggaaaaccag cagcctcccg cgacgatgcc cctcaacgtt 60 agcttcacca acaggaacta tgacctcgac tacgactcgg tgcagccgta tttctactgc 120 gacgaggagg agaacttcta ccagcagcag cagcagagcg agctgcagcc cccggcgccc 180 agcgaggata tctggaagaa attcgagctg ctgcccaccc cgcccctgtc ccctagccgc 240 cgctccgggc tctgctcgcc ctcctacgtt gcggtcacac ccttctccct tcggggagac 300 aacgacggcg gtggcgggag cttctccacg gccgaccagc tggagatggt gaccgagctg 360 ctgggaggag acatggtgaa ccagagtttc atctgcgacc cggacgacga gaccttcatc 420 aaaaacatca tcatccagga ctgtatgtgg agcggcttct cggccgccgc caagctcgtc 480 tcagagaagc tggcctccta ccaggctgcg cgcaaagaca gcggcagccc gaaccccgcc 540 cgcggccaca gcgtctgctc cacctccagc ttgtacctgc aggatctgag cgccgccgcc 600 tcagagtgca tcgacccctc ggtggtcttc ccctaccctc tcaacgacag cagctcgccc 660 aagtcctgcg cctcgcaaga ctccagcgcc ttctctccgt cctcggattc tctgctctcc 720 tcgacggagt cctccccgca gggcagcccc gagcccctgg tgctccatga ggagacaccg 780 cccaccacca gcagcgactc tgaggaggaa caagaagatg aggaagaaat cgatgttgtt 840 tctgtggaaa agaggcaggc tcctggcaaa aggtcagagt ctggatcacc ttctgctgga 900 ggccacagca aacctcctca cagcccactg gtcctcaaga ggtgccacgt ctccacacat 960 cagcacaact acgcagcgcc tccctccact cggaaggact atcctgctgc caagagggtc 1020 aagttggaca gtgtcagagt cctgagacag atcagcaaca accgaaaatg caccagcccc 1080 aggtcctcgg acaccgagga gaatgtcaag aggcgaacac acaacgtctt ggagcgccag 1140 aggaggaacg agctaaaacg gagctttttt gccctgcgtg accagatccc ggagttggaa 1200 aacaatgaaa aggcccccaa ggtagttatc cttaaaaaag ccacagcata catcctgtcc 1260 gtccaagcag aggagcaaaa gctcatttct gaagaggact tgttgcggaa acgacgagaa 1320 cagttgaaac acaaacttga acagctacgg aactcttgtg cgtaa 1365 <210> 11 <211> 1542 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 atgaggcagc cacctggcga gtctgacatg gctgtcagcg acgcgctgct cccatctttc 60 tccacgttcg cgtctggccc ggcgggaagg gagaagacac tgcgtcaagc aggtgccccg 120 aataaccgct ggcgggagga gctctcccac atgaagcgac ttcccccagt gcttcccggc 180 cgcccctatg acctggcggc ggcgaccgtg gccacagacc tggagagcgg cggagccggt 240 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attaccaagg tcagtcccgg ggatttgtag ctcgggctgg ggagccctgt 1140 gtgtgctggc cccacttcgg gacacacggg atgatgctca ccccaccttc ttcaccccta 1200 gagctcatgc cacccggttc ctgcatgcca gaggagccca agccaaagag gggaagacga 1260 tcgtggcccc ggaaaaggac cgccacccac acttgtgatt acgcgggctg cggcaaaacc 1320 tacacaaaga gttcccatct caaggcacac ctgcgaaccc acacaggtga gaaaccttac 1380 cactgtgact gggacggctg tggatggaaa ttcgcccgct cagatgaact gaccaggcac 1440 taccgtaaac acacggggca ccgcccgttc cagtgccaaa aatgcgaccg agcattttcc 1500 aggtcggacc acctcgcctt acacatgaag aggcattttt aa 1542 <210> 12 <211> 1017 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctgctct cgggggccct gaccctgacc 60 gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180 gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300 aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccagttctca caccctccag 360 tggatgattg gctgcgacct ggggtccgac ggacgcctcc tccgcgggta tgaacagtat 420 gcctacgatg gcaaggatta cctcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgcagcg 480 gacactgcgg ctcagatctc caagcgcaag tgtgaggcgg ccaatgtggc tgaacaaagg 540 agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccaca gatacctgga gaacgggaag 600 gagatgctgc agcgcgcgga cccccccaag acacacgtga cccaccaccc tgtctttgac 660 tatgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat catactgacc 720 tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacgtggagc tcgtggagac caggcctgca 780 ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840 tacacgtgcc atgtgcagca tgaggggctg ccggagcccc tcatgctgag atggaagcag 900 tcttccctgc ccaccatccc catcatgggt atcgttgctg gcctggttgt ccttgcagct 960 gtagtcactg gagctgcggt cgctgctgtg ctgtggagaa agaagagctc agattga 1017 <210> 13 <211> 1002 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 atggggcccc tcccagcccc ttcctgcaca cagcgcatca cctggaaggg gctcctgctc 60 acagcatcac ttttaaactt ctggaacccg cccaccactg ccgaagtcac gattgaagcc 120 cagccaccca aagtttctga ggggaaggat gttcttctac ttgtccacaa tttgccccag 180 aatcttcctg gctacttctg gtacaaaggg gaaatgacgg acctctacca ttacattata 240 tcgtatatag ttgatggtaa aataattata tatgggcctg catacagtgg aagagaaaca 300 gtatattcca acgcatccct gctgatccag aatgtcaccc ggaaggatgc aggaacctac 360 accttacaca tcataaagcg aggtgatgag actagagaag aaattcgaca tttcaccttc 420 accttatact cgaagctgcc catcccctac atcaccatca acaacttaaa ccccagggag 480 aataaggatg tcttagcctt cacctgtgaa cctaagagtg agaactacac ctacatttgg 540 tggctaaacg gtcagagcct ccccgtcagt cccggggtaa agcgacccat tgaaaacagg 600 atactcattc tacccagtgt cacgagaaat gaaacaggac cctatcaatg tgaaatacgg 660 gaccgatatg gtggcctccg cagtaaccca gtcatcctaa atgtcctcta tggtccagac 720 ctccccagaa tttacccttc attcacctat taccgttcag gagaaaacct cgacttgtcc 780 tgcttcacgg aatctaaccc accggcagag tatttttgga caattaatgg gaagtttcag 840 caatcaggac aaaagctctt tatcccccaa attactagaa atcatagcgg gctctatgct 900 tgctctgttc ataactcagc cactggcaag gaaatctcca aatccatgac agtcaaagtc 960 tctggtccct gccatggaga cctgacagag tctcagtcat ga 1002

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 줄기세포에 있어서,
    상기 줄기 세포는, 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포이고,
    B2M(Beta-2 microglobulin), CIITA(class II, major histocompatibility complex, transactivator), PDCD1(Programmed cell death protein 1) 및 CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) 유전자의 발현이 억제되고, CD24(cluster of differentiation 24) 유전자 및 암세포 표면 항원 특이적 CAR(Chimeric Antigen Receptor)이 과발현된 줄기세포이고,
    상기 B2M은, 서열번호 1의 sgRNA에 의해 발현이 억제되고,
    상기 CIITA는 서열번호 2의 sgRNA에 의해 발현이 억제되고,
    상기 PDCD1는, 서열번호 3의 sgRNA에 의해 발현이 억제되고
    상기 CTLA4는, 서열번호 4의 sgRNA에 의해 발현이 억제된, 줄기세포.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 줄기세포는,
    TCR의 발현이 억제된 줄기세포이고
    상기 TCR은, 서열번호 5의 sgRNA에 의해 발현이 억제된, 줄기세포.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 TCR은 TRA(T cell receptor Alpha)인, 줄기세포.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 암세포 표면 항원은 CD19(Cluster of Differentiation 19)인 줄기세포.
  8. 청구항 4 내지 7 중 어느 한 항의 줄기세포로부터 유도된 면역세포.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 면역세포는, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), NK(Natural kill) 세포 또는 대식세포인, 면역세포.
  10. 청구항 8의 면역세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 암은 고형암 또는 혈액암인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 고형암은 췌장암, 유방암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 간암, 위암, 결장암, 골암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 결장암, 나팔관암, 질암, 음문암, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암, 신장골반암, 중추신경계 종양 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 암종인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 혈액암은 백혈병인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4251741A1 (en) 2020-11-30 2023-10-04 CRISPR Therapeutics AG Gene-edited natural killer cells
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2022120334A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Century Therapeutics, Inc. Genetically engineered cells and uses thereof
CN116635064A (zh) 2020-12-18 2023-08-22 世纪治疗股份有限公司 具有适应性受体特异性的嵌合抗原受体系统
US11473060B2 (en) 2020-12-30 2022-10-18 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into NK cells
WO2025106865A1 (en) * 2023-11-16 2025-05-22 University Of Utah Research Foundation Anti-cspg4 chimeric antigen receptor-expressing phagocytes

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019161271A1 (en) * 2018-02-16 2019-08-22 Kite Pharma, Inc. Modified pluripotent stem cells and methods of making and use

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2015228844B2 (en) * 2014-03-11 2019-08-15 Cellectis Method for generating T-cells compatible for allogenic transplantation
SG10201912171PA (en) * 2014-04-18 2020-02-27 Editas Medicine Inc Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
EA201790953A1 (ru) * 2014-10-31 2017-10-31 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Изменение экспрессии гена в cart-клетках и их применения
US12180263B2 (en) * 2014-11-06 2024-12-31 President And Fellows Of Harvard College Cells lacking B2M surface expression and methods for allogeneic administration of such cells
WO2016100975A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Massachsetts Institute Ot Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
PT3371314T (pt) * 2015-11-04 2023-08-31 Fate Therapeutics Inc Modificação genómica de células pluripotentes
EA201891338A1 (ru) * 2015-12-04 2018-12-28 Новартис Аг Композиции и способы для иммуноонкологии
EP3655022A1 (en) 2017-04-03 2020-05-27 Kite Pharma, Inc. Treatment using chimeric receptor t cells incorporating optimized polyfunctional t cells
IL272302B2 (en) * 2017-08-08 2025-01-01 Sangamo Therapeutics Inc Targeting T cells with genetic modifications mediated by a chimeric antigen receptor
US12171783B2 (en) * 2017-11-13 2024-12-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for targeting developmental and oncogenic programs in H3K27M gliomas
KR102791660B1 (ko) * 2017-12-22 2025-04-08 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 향상된 면역 효과기 세포 및 이의 용도
CA3148370A1 (en) * 2019-08-23 2021-03-04 Sana Biotechnology, Inc. Cd24 expressing cells and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019161271A1 (en) * 2018-02-16 2019-08-22 Kite Pharma, Inc. Modified pluripotent stem cells and methods of making and use

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