KR102650818B1 - 황색포도상구균 단백질 a에 대한 항체를 포함하는 피부 진단용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황색포도상구균의 단백질 A(Protein A)에 특이적인 항체 및 이를 포함하는 황색포도상구균 검출용 또는 피부 상태 진단용 조성물 또는 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단일클론항체는 항원에 대한 반응성이 매우 높으며 특히, 서로 다른 CDR을 갖는 두 개의 항체를 포획 항체와 검출 항체로 조합하여 사용함으로써 낮은 농도에서도 신속하고 정확하게 항원을 검출할 수 있어 래피드 자가 진단 키트 등에 적용될 수 있는바, 이를 이용하여 피부 표면에서 황색포도상구균의 증식 상태 등에 대해 직관적으로 확인할 수 있고, 피부 염증, 과민면역반응 등 피부의 이상 상태를 진단하고, 관련 질병의 발생가능성 및 지속성을 예측할 수 있으며, 이후 치료 방법을 결정하는데 활용될 수 있다.

Description

황색포도상구균 단백질 A에 대한 항체를 포함하는 피부 진단용 키트{Diagnostic kit for skin comprising antibody specific for protein A of Staphylococcus aureus}

본 발명은 황색포도상구균의 단백질 A(Protein A)에 특이적인 항체 및 이를 포함하는 황색포도상구균 검출용 또는 피부 상태 진단용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

최근에는 마이크로바이옴에 대한 연구가 활발히 이루어지면서 장내 마이크로바이옴 및 피부 마이크로바이옴에 대한 영역이 각광받고 있다. 이 중 피부 마이크로바이옴의 경우, NGS 및 유전자 검사 등을 이용하여 매우 세부적인 결과 및 데이터 확보가 가능하나 피부 상태에 대해 간편하게 확인할 수 있는 신속 진단 방법은 부재인 상황이다.

한편, 최근 연구에서 황색포도상구균의 Staphylococcal protein A(SPA)가 피부조직에 있는 상피세포에서 IL-18 사이토카인을 생성하고 이에 의해 CD4+T 세포를 활성화하여 IFN-γ, IL-3, IL-13 등을 분비하게 함으로써 히스타민과 비만세포의 침윤을 초래하여 아토피피부염과 같은 피부 염증 질환을 일으킨다는 보고가 있었다.

이에 따라 본 발명자들은 피부의 염증 및 과민면역반응으로 인한 아토피 증상과 관련이 높은 황색포도상구균을 검출하기 위한 키트를 개발하고자 연구를 진행하였다. 특히, COVID로 인한 신속 진단 키트에 대한 소비자 접근성이 매우 높아진 상태에서 황색포도상구균의 주요 단백질인 단백질 A의 피부 표면 농도를 측정하기 위한 신속 자가 진단 키트를 개발하고자 하였으며, 상기 단백질 A에 대한 신규한 단일클론항체를 개발하고, 이의 최적 조합을 선별하여 빠르고 정확하게 황색포도상구균을 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

KR 10-0943302 B1

본 발명은 황색포도상구균의 단백질 A(Protein A)에 특이적인 항체 및 이를 포함하는 황색포도상구균 검출용 조성물 또는 키트를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재들로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 실시예에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 황색포도상구균의 단백질 A(Protein A)에 특이적인 항체가 제공된다.

또한, 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 황색포도상구균의 단백질 A(Protein A)에 특이적인 항체가 제공된다.

본 발명의 다른 실시예에 따라, 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주세포가 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기 항체를 포함하는 황색포도상구균 검출용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기 항체를 포함하는 황색포도상구균 검출용 키트가 제공된다.

본 발명에 따른 단일클론항체는 황색포도상구균의 단백질 A(Protein A)에 대해 특이적인 신규한 항체로서, 항원에 대한 반응성이 매우 높다. 특히, 본 발명에 따른 단일클론항체는 서로 다른 CDR을 갖는 두 개의 항체를 포획 항체와 검출 항체로 조합하여 사용함으로써 낮은 농도에서도 신속하고 정확하게 항원을 검출할 수 있어 래피드 자가 진단 키트 등에 적용될 수 있다. 또한, 이를 이용하여 피부 표면에서 황색포도상구균의 증식 상태 등에 대해 직관적으로 확인할 수 있는바, 피부 염증, 과민면역반응 등 피부의 이상 상태를 진단하고, 관련 질병의 발생가능성 및 지속성을 예측할 수 있으며, 이후 치료 방법을 결정하는데 활용될 수 있다.

본 발명의 상세한 설명에서 인용되는 도면을 보다 충분히 이해하기 위하여 각 도면의 간단한 설명이 제공된다.
도 1은 정제된 단일클론항체를 확인한 SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 선별된 단일클론항체와 상용화된 항체의 Protein A 항원에 대한 친화도를 웨스턴 블랏을 통해 비교한 결과이다.
도 3은 래피드 키트 스트립 상에서 본 발명에 따른 단일클론항체 조합의 Protein A 항원에 대한 반응성을 관찰한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 단일클론항체인 7G1과 6B5를 이용하여 제조한 래피드 키트 상에서 Protein A 항원에 대한 반응성을 관찰한 결과이다.
도 5는 실제 피부 검체를 본 발명에 따른 단일클론항체인 7G1과 6B5를 이용하여 제조한 래피드 키트에 적용하였을 때, 황색포도상구균의 검출이 가능함을 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 또한, 본 발명의 실시예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 실시예에 대한 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 발명의 실시예들을 설명할 것이나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정되거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있다.

본 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 포함한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 항목들 중의 어느 하나의 항목을 포함한다.

본 발명의 실시예에 따라 황색포도상구균의 단백질 A(Protein A)에 특이적인 신규한 항체가 제공된다.

본 발명에 있어서, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다.

본 발명에 있어서, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

본 발명의 목적상 상기 항체는 황색포도상구균의 단백질 A(Protein A)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체일 수 있다.

본 발명에 있어서, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역 (complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 황색포도상구균의 단백질 A(Protein A)에 특이적인 항체가 제공되며, 이를 7G1으로 명명하였다.

상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하고, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따라, 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 황색포도상구균의 단백질 A(Protein A)에 특이적인 항체가 제공되며, 이를 6B5로 명명하였다.

상기 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하고, 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체는 황색포도상구균의 단백질 A를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 가진다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글자이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있으며, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.

또한, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

따라서 본 발명에 따른 항체는 상술한 아미노산 서열과 80 내지 99% 상동성, 90 내지 99% 상동성, 95 내지 99% 상동성을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따라 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기분위가 변형된 유사체(analogue)를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따라 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

본 발명에 있어서, “벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 본 발명의 벡터에서 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 작동 가능하게 결합된(operatively linked) 것일 수 있다. 상기 “작동 가능하게 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있고, 상기 항생제 내성 유전자는 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린 중 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 박테리아 또는 동물 세포일 수 있다. 상기 벡터로 형질전환된 세포는 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포로, 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다. 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵 세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따라 상기 항체를 포함하는 황색포도상구균 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다. 상기 조성물 또는 키트는 피부 상태 진단용일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트는 항원-항체 복합체의 검출에 의해 황색포도상구균을 검출할 수 있으며, 상기 항원은 황색포도상구균의 Protein A나 균주 자체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 검출 방식에 따라 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 예를 들어, 항체가 두개일 경우 하나의 항체는 포획(capture) 항체, 다른 하나의 항체는 검출(detection) 항체일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 7G1 항체를 포획 항체로 이용하고, 6B5 항체를 검출 항체로 이용하는 신속(래피드) 항원 진단 키트를 제조하였다.

본 발명에 있어서, 상기 "항원-항체 복합체"는 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있으며, 구체적으로 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있으며, 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소 등을 포함하며, 콜로이드성 금 입자 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드(bead)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 키트는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 샌드위치 ELISA 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트일 수 있고, 구체적으로는 2개의 항체를 이용하는 샌드위치 ELISA 키트 또는 래피드 키트일 수 있으나, 이에 한정되지 않고 하나 이상의 항체를 이용하는 모든 키트에 적용 가능하다.

본 발명에 있어서 "ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)"는 효소면역 측정방법이라고도 하며, 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 복합체를 형성함으로써 이의 효소와 기질의 반응을 통해 흡광도를 이용하여 정량하는 방법이다. 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지 체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등을 포함한다.

본 발명에 있어서, “래피드 키트”는 신속 진단 검사(Rapid diagnostic test, RDT) 또는 신속 항원 검사 또는 면역크로마토그래피 키트 분석이라고도 불린다. 래피드 키트 분석은, 제1 샘플 패드, 멤브레인, 흡수 패드를 포함하는 면역 크로마토그래피 스트립에 의한 분석방법으로서, 사용자가 생물학적 또는 화학적 샘플로부터 분석 물질을 특별한 기술이나 장비 없이 짧은 시간내에 간단하게 검출할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 상용화된 항체에 비해 항원과의 반응성이 우수하여 민감도 및 특이성이 우수한바, 짧은 시간 내에 항원 여부를 검출하는 래피드(신속) 키트에 적용 가능한 것을 특징으로 한다. 상기 래피드 키트는 예를 들어 60분 이내, 구체적으로는 30분 이내, 보다 더 구체적으로는 15분 이내에 검출이 가능할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 키트에 사용되는 검체(시료)는 조직, 전혈, 소변, 타액 등을 모두 포함할 수 있으나, 본 발명의 목적에 따라 구체적으로는 피부 조직일 수 있다. 예를 들어, 피부 조직의 표면을 스틱으로 긁어 버퍼 용액에 용해시키는 방식으로 검체를 제조할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 키트는 피부 표면, 즉 표피 조직을 직접적으로 이용함으로써 피부에 증식하고 있는 포도상구균의 여부 및 이의 농도를 신속하고 간편하게 자가 진단하는데 사용될 수 있다. 더 구체적으로는 아토피피부염과 같은 피부 염증 질환이나 과민면역반응 질환의 원인이 되는 황색포도상구균의 피부 표면 농도를 측정함으로써 피부 상태를 진단하고, 관련 질병의 발생가능성 및 지속성을 예측할 수 있으며, 이후 치료 방법을 결정하기 위한 신속 자가 진단 키트로 활용될 수 있다.

이하에서, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 실시예를 다음과 같이 나타내었으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 황색포도상구균 단백질 A(Protein A)에 대한 단일클론항체의 제조

1-1. 쥐의 면역화 (Immunization of mice)

150ug의 Protein A가 들어있는 PBS와 같은 부피의 Freund's adjuvant(Incomplete, Sigma)를 섞어 총 600μl가 되도록 만든 후, 6주령 암컷 BALB/c 마우스에 한 마리당 200μl씩 주입하여 1차 면역을 진행하였다. 2주 후에 150μg의 Protein A를 총 600μl가 되도록 PBS에 녹인 후 1차 면역이 진행된 마우스에 동일하게 한 마리당 200μl씩 주입하여 2차 면역을 진행하였다.

1-2. 세포 융합

2차 면역 4일 후 마우스의 lymph node를 무균적으로 적출하고 DMEM 배지로 2번 세척하였다. 세척된 lymph node를 cell strainer (Falcon)를 이용하여 단일 세포 (single cell)로 만들어 준 후, 다시 DMEM으로 세척하고 DMEM에 부유시켰다. Lymph node 세포와 SP2/O 세포의 비율을 5:1의 비율이 되게끔 혼합하고, PEG (Polyethylene Glycol 1500, Sigma) 1ml을 2분간 천천히 첨가하며 세포융합을 유도하였다. 여기에 DMEM 배지를 첨가하고 37℃에서 15분간 정치시킨 후 1200rpm에서 원심분리하여 상층액을 제거하였다. HAT (0.1mM hypoxanthine, 0.4M aminopterin, 16uM thymidine, Sigma)와 20% FBS가 첨가된 DMEM에 1x10⁶ cell/ml의 농도로 부유시킨 다음, 이 부유액 100μl를 96 웰 플레이트에 분주하고, 세포배양기에서 2주간 배양하여 융합된 세포를 선별하였다.

1-3. 융합된 세포의 항체 형성 확인

융합된 세포의 항체 생성 여부는 면역항원과 융합된 세포 배양액을 이용하여 Indirect ELISA 방법으로 관찰하였다. 면역항원을 0.5μg/ml 농도로 희석하여 모든 웰에 50μl씩 넣은 후, 냉장에서 밤새 정치시켜 항원을 코팅한 후, 각 웰을 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 1% BSA/PBS를 각 웰에 180μl씩 첨가하고 상온에서 1시간도안 반응하며 블로킹시켰다. 융합된 세포의 배양액을 각 웰에 50μl씩 첨가하고, 상온에서 1시간동안 반응한 후 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 1:10000 비율로 HRP-conjugated anti mouse IgG antibody (Sigma)를 각 웰에 50μl씩 분주하여 상온에서 30분 반응한 후 0.05% PBST로 3회 세척하였다. TMB substrate (Surmodics)를 각 웰에 50μl씩 첨가한 후 차광하여 상온에서 15분간 반응하였다. 1N sulfuric acid를 각 웰에 50μl씩 첨가하여 반응을 멈추고 ELISA 리더기에서 OD (optical density)를 측정하였다.

1-4. 항체의 정제

항체를 생성하는 융합세포를 25T 플라스크로 옮겨서 대량 배양한 후, 얻어진 세포 상층액으로부터 Protein G 친화 컬럼을 사용하여 항체를 정제하였다. 총 11개의 항체를 분리한 후, 이를 정제 후 겔에 로딩하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 11개의 단일클론항체(1F2, 4C1, 5B7, 5G2, 6D7, 2E3, 2G2, 5D8, 6C12, 6B5, 7G1)의 발현을 확인함으로써 잘 정제되었음을 확인하였다.

1-5. 단일클론항체의 후보군 선별

Sandwich ELISA 방법으로 항원과 항체 반응성을 조사함으로써 항체를 선별하였다. Sandwich ELISA는 다음과 같이 진행되었다. 먼저 실시예 1-4에서 정제된 총 11개의 단일클론항체를 각각 carbonate buffer에 1μg/ml 농도로 희석한 후 각 웰에 100μl씩 첨가하고 냉장에서 밤새 정치시켜 항체를 코팅하였다. 각 웰을 0.05% PBST로 3회 세척한 후, 1% BSA/PBS를 모든 웰에 300μl씩 첨가하여 상온에서 1시간 반응하며 블로킹 시켰다. 면역항원을 1μg/ml, 0.1μg/ml, 0.01μg/ml의 농도로 희석하여 100μl씩 첨가하여 상온에서 1시간동안 반응시킨 후, 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 각각의 biotinylated-항체를 1μg/ml농도로 희석하여 각 웰에 100μl씩 첨가한 후 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 0.05% PBST로 3회 세척한 후, SA-HRP (Sigma)를 1:8000비율로 희석하여 각 웰에 100μl씩 첨가하여 상온에서 30분간 반응하였다. 위와 같은 방법으로 세척한 후 TMB (Surmodics)를 각 웰에 100μl씩 첨가한 후 차광하여 상온에서 15분간 반응시킨 후, 1N sulfuric acid를 각 웰에 50μl씩 첨가하여 반응을 멈추고 ELISA 리더기에서 OD (optical density)를 측정하였다. 상기와 같은 방식으로 항원과 항체의 농도반응을 통하여 단일클론항체 후보군을 선별하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

OD	1F2	2E3	2G2	4C1	5B7	5D8	5G2	6B5	6C12	6D7	7G1
1000ng/ml		3.855	3.998	4.000	4.000	4.000	3.794	4.000	4.000	4.000	3.946
100ng/ml		3.921	3.858	3.866	3.898	3.927	3.904	3.951	4.000	3.855	3.935
10ng/ml		0.890	1.238	0.790	0.875	1.221	2.012	1.249	1.283	0.486	1.773
B		0.054	0.052	0.052	0.053	0.054	0.053	0.054	0.055	0.052	0.055
	1F2_1ug/ml
OD	1F2	2E3	2G2	4C1	5B7	5D8	5G2	6B5	6C12	6D7	7G1
1000ng/ml	4.000		4.000	3.985	4.000	4.000	4.000	4.000	4.000	3.940	4.000
100ng/ml	4.000		4.000	3.990	3.973	4.000	4.000	4.000	3.977	3.900	3.996
10ng/ml	2.484		3.065	2.154	2.253	3.090	3.689	3.159	3.106	1.336	3.612
B	0.058		0.069	0.055	0.056	0.056	0.056	0.056	0.056	0.056	0.065
	2E3_1ug/ml
OD	1F2	2E3	2G2	4C1	5B7	5D8	5G2	6B5	6C12	6D7	7G1
1000ng/ml	3.978	3.903		3.886	4.000	3.966	4.000	3.475	3.234	3.919	3.278
100ng/ml	3.924	3.898		3.938	3.918	3.948	3.970	3.654	3.865	3.879	3.843
10ng/ml	1.813	1.921		1.229	1.758	1.730	2.482	1.715	1.744	1.465	2.038
B	0.058	0.055		0.058	0.060	0.056	0.059	0.056	0.055	0.055	0.060
	2G2_1ug/ml
OD	1F2	2E3	2G2	4C1	5B7	5D8	5G2	6B5	6C12	6D7	7G1
1000ng/ml	3.929	3.825	3.505		3.948	4.000	3.934	3.391	3.869	3.768	3.726
100ng/ml	3.922	3.654	3.669		3.804	3.914	3.894	3.594	3.857	3.638	3.597
10ng/ml	2.716	2.780	2.640		2.642	3.184	2.848	3.030	3.131	2.650	2.955
B	0.054	0.055	0.053		0.059	0.056	0.054	0.056	0.053	0.054	0.055
	4C1_1ug/ml
OD	1F2	2E3	2G2	4C1	5B7	5D8	5G2	6B5	6C12	6D7	7G1
1000ng/ml	3.478	3.908	3.957	3.903		3.728	3.783	3.752	3.938	3.491	3.458
100ng/ml	3.842	3.842	3.590	3.672		3.872	3.828	3.883	3.854	3.628	3.480
10ng/ml	0.405	0.455	0.526	0.276		0.510	1.064	0.515	0.541	0.278	0.644
B	0.050	0.050	0.050	0.049		0.050	0.050	0.049	0.052	0.052	0.050
	5B7_1ug/ml
OD	1F2	2E3	2G2	4C1	5B7	5D8	5G2	6B5	6C12	6D7	7G1
1000ng/ml	3.770	3.843	3.287	3.974	3.814		3.495	3.756	3.922	3.145	3.558
100ng/ml	3.844	3.891	3.584	3.634	3.290		3.618	3.606	3.070	3.188	3.659
10ng/ml	3.923	3.850	3.753	3.813	3.781		3.603	3.877	3.945	3.550	3.846
B	0.075	0.091	0.071	0.070	0.081		0.073	0.071	0.077	0.072	0.070
	5D8_1ug/ml
OD	1F2	2E3	2G2	4C1	5B7	5D8	5G2	6B5	6C12	6D7	7G1
1000ng/ml	3.419	3.701	3.994	4.000	4.000	3.954		3.267	2.865	2.426	3.825
100ng/ml	3.373	3.817	3.897	3.851	3.991	3.848		3.285	3.451	3.242	3.832
10ng/ml	3.207	3.204	1.876	1.524	3.176	1.539		1.643	1.493	2.979	0.775
B	0.053	0.053	0.056	0.056	0.053	0.055		0.055	0.054	0.054	0.052
	5G2_1ug/ml
OD	1F2	2E3	2G2	4C1	5B7	5D8	5G2	6B5	6C12	6D7	7G1
1000ng/ml	3.383	3.093	3.472	3.390	3.946	3.778	3.137		3.308	3.025	3.519
100ng/ml	3.336	3.455	3.272	3.729	3.806	3.751	3.239		3.693	3.305	3.575
10ng/ml	3.849	3.677	3.819	3.771	3.936	3.848	3.680		3.843	3.668	3.805
B	0.075	0.074	0.068	0.068	0.078	0.074	0.075		0.072	0.068	0.069
	6B5_1ug/ml
OD	1F2	2E3	2G2	4C1	5B7	5D8	5G2	6B5	6C12	6D7	7G1
1000ng/ml	3.703	3.696	3.807	3.427	2.885	2.711	2.803	2.886		2.947	3.343
100ng/ml	3.866	3.775	3.732	3.533	3.349	3.081	2.551	2.786		3.159	3.483
10ng/ml	3.897	3.845	3.889	3.853	3.824	3.741	3.615	3.549		3.626	3.772
B	0.074	0.070	0.061	0.067	0.079	0.068	0.069	0.068		0.066	0.067
	6C12_1ug/ml
OD	1F2	2E3	2G2	4C1	5B7	5D8	5G2	6B5	6C12	6D7	7G1
1000ng/ml	3.847	3.888	3.773	3.928	3.868	3.927	3.804	3.913	3.918		3.820
100ng/ml	3.771	3.824	3.617	3.864	3.917	3.866	2.611	3.819	3.900		3.919
10ng/ml	0.625	0.718	1.091	0.756	0.726	1.250	1.875	1.206	1.208		1.533
B	0.053	0.053	0.052	0.056	0.058	0.053	0.053	0.052	0.053		0.052
	6D7_1ug/ml
OD	1F2	2E3	2G2	4C1	5B7	5D8	5G2	6B5	6C12	6D7	7G1
1000ng/ml	3.032	2.798	2.853	2.947	2.953	3.124	2.295	3.256	3.582	3.109
100ng/ml	3.303	3.186	3.483	3.188	2.889	3.327	2.594	3.563	2.950	3.415
10ng/ml	3.578	3.460	3.580	2.990	3.747	3.509	3.081	3.608	3.518	3.813
B	0.110	0.106	0.100	0.095	0.113	0.100	0.101	0.097	0.100	0.098
	7G1_1ug/ml

표 1에 나타낸 바와 같이, 11개의 단일클론항체 중 2가지를 쌍으로 선별하여 Sandwich ELISA를 수행한 결과, 항원에 대해 높은 반응성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 2. 선별된 단일클론항체와 상용화된 항체의 Protein A 항원에 대한 친화도 비교

2-1. Indirect ELISA 방법을 통한 비교

Protein A 항원을 carbonate buffer에 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 0.156ng/ml 농도로 단계 희석한 후 각 웰에 100μl씩 첨가하고 냉장에서 밤새 정치시켜 항원을 코팅하였다. 모든 웰을 0.05% PBST로 3회 세척한 후, 1% BSA/PBS를 각 웰에 300μl씩 첨가하여 상온에서 1시간동안 반응하며 블로킹 시켰다. 위와 같은 방법으로 0.05% PBST로 모든 웰을 3회 세척한 후, 상기 실시예 1-5에서 선별된 단일클론항체와 구입한 EastCoast Bio사(J144)와 Merk사(SAB4200745)의 항체를 1μg/ml의 농도가 되도록 1% BSA/PBS로 희석한 후, 각 웰에 100μl씩 첨가하여 상온에서 1시간동안 반응한 후 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 1:10000 비율로 HRP-conjugated anti mouse IgG antibody (Sigma)를 각 웰에 100μl씩 분주하여 상온에서 30분간 반응한 후 0.05% PBST로 3회 세척하였다. TMB substrate (Surmodics)를 각 웰에 50μl씩 첨가한 후 차광하여 상온에서 15분간 반응하였다. 1N sulfuric acid를 각 웰에 50μl씩 첨가하여 반응을 멈추고 ELISA 리더기에서 OD (optical density)를 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명을 통해 선별된 단일클론항체가 상용화된 항체에 비해 더욱 우수한 반응성을 나타냄을 확인하였다.

2-2. 웨스턴 블랏을 통한 비교

Protein A 항원 2μg을 SDS 샘플 버퍼에 첨가하여 95~100℃에서 10분간 가열시켜 준 후, 12% SDS-PAGE 겔에 샘플과 마커를 각 20μl씩 걸어주고 80~120V에서 2시간 전기영동 시켰다. 완료된 후, 겔을 떼어내서 흐르는 물에 씻어준 후 트랜스퍼용 플라스틱 패드 위에 3M paper-PVDF-gel-3M paper 순으로 올려주었다. Transfer chamber에 장착해 주고 185mA에서 2시간 정도 트랜스퍼하였다. 이후 5% skim milk로 블로킹 시킨 후, 1차 항체로 상기 실시예 1에서 선별된 단일클론항체와 구입한 Merck사 (SAB4200745)의 항체를 1:1000의 비율로 냉장에서 밤새 반응시켰다. 이를 1x TBST로 5분씩 세 번 세척한 후, 2차 항체와 함께 1:4000의 비율로 1시간동안 상온에서 반응시키고, 1x TBST로 5분씩 세 번 세척하였다. ECL 버퍼를 멤브레인에 골고루 뿌려준 후, 검출하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명을 통해 선별된 항체 중 단일클론항체 6B5, 7G1이 상용화된 항체에 비해 더욱 우수한 반응성을 나타냄을 확인하였다(Size : 42kDa).

실시예 3. 신규한 단일클론항체를 이용한 래피드 진단 키트의 제작

3-1. 래피드 키트 스트립을 이용한 항체 선별

실시예 2에서 선별된 단일클론항체를 포함하는 래피드 키트를 제작하여, Protein A에 대한 검출능을 확인하였다. 보다 구체적으로, 상기 ELISA 방법으로 선별된 단일클론항체 후보군들을 각 1mg/ml의 농도로 희석하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 (nitrocellulose membrane)에 1μl씩 점적하였다. 또한 항체-금(gold) 나노입자 축합체를 Protein A (1mg/ml) 또는 황색포도상구균 균주와 섞은 후 점적 부위의 색상 변화 정도를 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 단일클론항체를 2가지씩 세트로 반응시킨 결과, Blank에는 결합하지 않고, Protein A와 황색포도상구균 균주에 강하게 반응하는 것을 확인하였으며, 그 중 4번 세트인 6B5와 7G1의 세트가 가장 우수한 결과를 나타냄을 확인하였다.

3-2. 래피드 진단 키트 상에서 최종 선별 항체의 검출능 확인

래피드 키트를 이용해 상기 3-1에서 최종 선별된 단일클론항체인 7G1과 6B5의 Protein A 항원에 대한 검출능을 확인하였다. 구체적으로 7G1 항체를 포획 항체로 이용하고, 6B5 항체를 검출 항체로 이용하였다. 6B5 항체 (테스트 라인) 및 anti-Nus A 항체 (컨트롤 라인)를 니트로셀룰로오스 멤브레인 (nitrocellulose membrane)에 점적한 스트립을 27x300mm로 준비하였다. 그 다음 7G1 항체-금 나노입자 축합체와 Nus A Protein-금 나노입자를 컨주게이트 패드에 분주한 후 건조하여 준비하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인 하단에 컨주게이트 패드와 시료 패드를 부착하고 상단에는 흡수패드를 부착시켜 래피드 키트를 제조한 후, Protein A를 농도별로 준비한 시료를 검체 주입부에 넣고 테스트라인의 색상 변화 정도를 관찰하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 두 가지의 단일클론항체인 7G1과 6B5가 피부에서 황색포도상구균를 검출하기 위한 신속 진단 키트에 적용될 수 있으며, 특히 약 0.001μg/ml의 수준까지 신속하고 정확하게 검출 가능함을 확인하였다. 다음으로 황색포도상구균이 존재하는 실제 피부 표피를 긁어 제조한 검체를 대상으로 상기에서 개발된 래피드 진단 키트를 이용하여 황색포도상구균의 검출 가능 여부에 대한 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 단일클론항체인 7G1과 6B5를 이용하여 실제 피부에서 황색포도상구균의 신속 진단이 가능함을 확인하였다.

실시예 4. 신규한 단일클론항체인 7G1과 6B5의 서열분석

상기 실시예 3에서 효과를 확인한 단일클론항체 7G1과 6B5의 서열분석을 수행하였다.

그 결과 단일클론항체 7G1은 서열번호 1 내지 3의 CDR 1 내지 3을 포함하고 있는 서열번호 7의 중쇄와 서열번호 4 내지 6의 CDR 1 내지 3을 포함하고 있는 서열번호 8의 경쇄로 이루어져 있음을 확인하였다. 또한, 단일클론항체 6B5는 서열번호 9 내지 11의 CDR 1 내지 3을 포함하고 있는 서열번호 15의 중쇄와 서열번호 12 내지 14의 CDR 1 내지 3을 포함하고 있는 서열번호 16의 경쇄로 이루어져 있음을 확인하였다.

이상의 실험 결과를 통하여, 황색포도상구균의 단백질 A에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 7G1과 6B5를 이용하여, 피부에서 직접적으로 황색포도상구균의 존재 여부를 판단함으로써 피부 상태를 진단할 수 있는 래피드 진단 키트를 제조할 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역;
   서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 황색포도상구균의 단백질 A(Protein A)에 특이적인 항체.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체.
4. 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역;
   서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 황색포도상구균의 단백질 A(Protein A)에 특이적인 항체.
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체.
6. 제 4 항에 있어서,
   상기 항체는 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
8. 제 7 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
9. 제 8 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주세포.
10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 황색포도상구균 검출용 조성물.
11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 황색포도상구균 검출용 키트.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 키트는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 샌드위치 ELISA 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트인, 키트.
13. 제 11 항에 있어서, 상기 키트는 2종류의 항체를 포함하고,
    상기 2종류의 항체 중 어느 한 종류의 항체는, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하고, 다른 한 종류의 항체는, 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체이며,
    상기 어느 한 종류의 항체가 포획 항체이면 상기 다른 한 종류의 항체는 검출항체이고,
    상기 어느 한 종류의 항체가 검출 항체이면, 상기 다른 한 종류의 항체는 포획 항체인 것인, 키트.
14. 제 11 항에 있어서, 상기 키트는 피부에 존재하는 황색포도상구균의 검출이 가능한 것을 특징으로 하는, 키트.