CN115838692A - 抗人突变型促红素鼠单克隆抗体、应用及人重组促红素兴奋剂检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗原‑抗体蛋白质的技术领域,具体而言,涉及抗人突变型促红素鼠单克隆抗体、应用及人重组促红素兴奋剂检测方法。上述杂交瘤细胞株保藏编号为CGMCC No.45302,其分泌表达的鼠单克隆抗体能够特异识别人突变型促红素p.Arg193AspfsTer28。采用上述鼠单克隆抗体建立的双向免疫纯化联合蛋白免疫印迹技术,可作为人体尿液样本中重组促红素的兴奋剂检测方法,有效区分人体尿液样本中的野生型促红素、突变型促红素和重组促红素,直接准确检测来源于各类人群尿液样本中的重组促红素,排除假阳性风险,同时使兴奋剂检测流程得到优化,弥补了目前世界反兴奋剂领域关于重组促红素检测的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及抗原-抗体蛋白质的技术领域,具体而言,涉及抗人突变型促红素鼠单克隆抗体、应用及人重组促红素兴奋剂检测方法。
背景技术
人重组促红素(rEPO)因其具有刺激红细胞生成从而提高人体的携氧能力,一直是耐力项目运动员滥用比例较高的一类兴奋剂。
近期研究发现,人类EPO基因多态性c.577del在东亚人群发生概率达0.5-1%,该多态性可产生突变型促红素p.Arg193AspfsTer28(VAR-EPO)。VAR-EPO含有野生型促红素(WT-EPO)全部氨基酸结构的同时,在C端延长了26个氨基酸,因此目前商业化生产的EPO单克隆抗体均既可以识别WT-EPO和rEPO,也可以识别VAR-EPO。
VAR-EPO分子量较WT-EPO增加3.1kDa,与rEPO接近,采用现有的蛋白免疫印迹兴奋剂检测方法无法区分rEPO和VAR-EPO,在兴奋剂检测中存在报告rEPO假阳性的风险。基于以上原因,世界反兴奋剂机构虽然已修订rEPO检测流程和判定标准,但是针对从EPO基因多态性c.577del携带人群的低剂量使用rEPO尚未建立有效的兴奋剂检测方法,从而影响兴奋剂检测的公平公正。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供抗人突变型促红素鼠单克隆抗体、应用及人重组促红素兴奋剂检测方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:本发明提供了一株用于分泌抗人突变型促红素鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所述杂交瘤细胞株的拉丁文学名为Mus muscu lus,分类命名为小鼠杂交瘤细胞,保藏编号为CGMCCNo.45302,保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2022年8月26日。
本发明还提供了一种抗人突变型促红素鼠单克隆抗体,该抗体由上述的杂交瘤细胞株产生。
进一步,所述人突变型促红素为人突变型促红素p.Arg193AspfsTer28,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种用于制备上述的鼠单克隆抗体的多肽抗原,所述多肽抗原的氨基选序列如SEQ I D NO:3所示。
本发明还提供了上述的鼠单克隆抗体在人重组促红素兴奋剂检测中的应用。
本发明还提供了一种人重组促红素兴奋剂检测方法,采用上述的鼠单克隆抗体对待测样品中的人重组促红素兴奋剂进行检测。
进一步,当待测样品中仅含有人突变型促红素和/或野生型促红素时,检测结果为阴性;当待测样品中含有人重组促红素兴奋剂时,检测结果为阳性。
进一步,所述检测方法为双向免疫纯化联合蛋白免疫印迹法,包括至少一轮反向免疫纯化、正向免疫纯化以及蛋白免疫印迹的步骤。
进一步,每一轮所述反向免疫纯化的步骤为:将待测样品或上一轮得到的上清溶液与所述鼠单克隆抗体混合,再依次进行孵育、加入免疫磁珠、孵育以及磁珠富集的步骤,得到本轮所述反向免疫纯化的上清溶液。
本发明还提供了上述鼠单克隆抗体在制备检测人EPO基因多态性c.577del的试剂中的应用。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明的抗VAR-EPO鼠单克隆抗体,能够特异识别VAR-EPO,可特异性高效结合尿液样本中的痕量VAR-EPO,同时不识别WT-EPO和rEPO;
(2)本发明的rEPO的兴奋剂检测方法,采用上述抗体建立的双向免疫纯化联合蛋白免疫印迹技术,可区分人体尿液样本中的WT-EPO、VAR-EPO和rEPO,直接准确检测来源于各类人群尿液样本中的rEPO,排除假阳性风险;
(3)本发明的rEPO检测方法,使兴奋剂检测流程得到优化,弥补了目前世界反兴奋剂领域关于rEPO检测的缺陷。
(4)本发明的抗VAR-EPO鼠单克隆抗体可用于制备人EPO基因多态性c.577del的检测试剂盒,从而用于该基因多态性的筛查。
附图说明
图1为本发明所述抗体非变性SDS-PAGE电泳图;
图2为本发明所述抗体变性SDS-PAGE电泳图;
图3为本发明中,分别采用双向免疫纯化联合蛋白免疫印迹和正向免疫纯化联合蛋白免疫印迹对各样品进行检测,得到的免疫印迹图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例和附图对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
本发明基于VAR-EPO与WT-EPO的C端差异氨基酸链设计并合成肽段作为抗原,采用杂交瘤细胞技术得到了一株杂交瘤细胞株,并表达纯化得到了抗VAR-EPO鼠单克隆抗体。该抗体是全球首个特异识别VAR-EPO的鼠单克隆抗体,可特异性高效结合尿液样本中的痕量VAR-EPO,同时不识别WT-EPO和rEPO。采用该抗体建立的双向免疫纯化联合蛋白免疫印迹法可区分人体尿液样本中的WT-EPO、VAR-EPO和rEPO,直接准确检测来源于各类人群尿液样本中的rEPO,排除假阳性风险,优化兴奋剂检测流程,弥补目前世界反兴奋剂领域关于rEPO检测的缺陷。
具体而言,本发明的rEPO兴奋剂检测方法采用的双向免疫纯化联合蛋白免疫印迹法,包括反向免疫纯化至少一轮、正向免疫纯化以及蛋白免疫印迹的步骤。每一轮反向免疫纯化的步骤为:将待测样品或上一轮得到的上清溶液与鼠单克隆抗体混合,再依次进行孵育、加入免疫磁珠、孵育以及磁珠富集的步骤,得到本轮反向免疫纯化的上清溶液。
检测结果的判定方式为,当待测样品中仅含有VAR-EPO和/或WT-EPO时,检测结果为阴性;当待测样品中含有rEPO时,检测结果为阳性。
其中,待测样品的ELISA板洗脱液用于检测rEPO。当WT-EPO条带上方rEPO位置出现拖尾或条带时,说明样品中含有rEPO,即检测结果为阳性,当WT-EPO条带上方rEPO位置未检出拖尾或条带时,说明样品中不含有rEPO,即检测结果为阴性。
对于阴性的检测结果,可以结合磁珠洗脱液的电泳条带进一步判断其携带的具体基因型。当磁珠洗脱液在VAR-EPO位置检出条带时,说明该样品中含有由EPO基因多态性c.577del编码的VAR-EPO;当未出现电泳条带时,说明不含有VAR-EPO。具体的检测步骤和检测结果的判断可参考具体的实施例。
本发明的人重组促红素兴奋剂检测方法,采用双向免疫纯化联合蛋白免疫印迹的方法检测尿样中的rEPO,可检测出尿液中的痕量VAR-EPO,经试验验证,该方法的最低检测限可达0.1pg/mL。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1抗原的制备
由于VAR-EPO在包含WT-EPO全部氨基酸和糖基结构的基础上仅在C端较WT-EPO增加了26个氨基酸,因此为了制备仅识别VAR-EPO而不识别WT-EPO和rEPO的单克隆抗体,在充分考虑了免疫特异性的基础上,本发明基于VAR-EPO与WT-EPO的C端差异氨基酸链设计并合成多肽抗原。
VAR-EPO氨基酸链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;其中,VAR-EPO与WT-EPO的C端差异氨基酸链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,SEQ ID NO:2:GDDDQVCPPGHIHHLPHQHCLCHTLPRHS。
该抗原多肽由北京义翘神州设计并合成,其设计过程充分考虑了免疫原性、特异性、亲疏水性、表面可及性和空间构象等因素。该抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,SEQ ID NO:3:CHTLPRHSGGGSHTLPRHS。
合成后得到的抗原多肽偶联病毒样颗粒(VLP),制备为可用于动物免疫的抗原。
实施例2抗VAR-EPO鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株及鼠单克隆抗体的制备
采用实施例1制备得到的抗原制备鼠单克隆抗体,具体的实验步骤如下:
(1)动物免疫
对Balb/c小鼠实施注射抗原进行免疫。免疫方式为,将免疫原与等量的佐剂混合,并在小鼠的腹部皮下多点注射,其中,每只小鼠的免疫抗原注射剂量为50ug。第一次免疫结束后,间隔2周进行第二次免疫,再间隔3周进行第三次免疫。
(2)采血及效价检测
三次免疫结束后,取血测定血清效价。分别采用rEPO和重组VAR-EPO测定血清效价,具体步骤为:
在第三次免疫后一周,经小鼠眶静脉丛取血50~60ul,4℃静置过夜后,离心分离上层血清用于效价检测;取适量待检测蛋白,用包被缓冲液稀释成5ug/mL,然后用单道移液器在96孔板每孔中加入100μL,轻拍板子使样品混匀,用保鲜膜封严,4℃下包被过夜;用洗涤液按200μL/孔洗板1次,扣干酶标板;再用封闭液按300μL/孔封闭酶标板,室温下封闭1小时;用洗涤液按300μL/孔洗板2次后加样(将经过梯度稀释的样品及样品稀释剂以100μL/孔加样),同时加入检测抗体,以100μL/孔加至96孔板内,室温下作用2小时;用洗涤液按200μL/孔洗板3次,以200μL/孔加入显色液室温放置12min;以50μL/孔加入终止液终止反应;用酶标仪进行检测:测定波长为450nm。
测定后,选取与重组VAR-EPO反应血清效价高且与rEPO无反应的小鼠,用免疫原加强免疫一次,3天后取脾进行融合。
(3)融合及筛选
取免疫后小鼠脾细胞,按1:1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞混合,利用电融合法进行融合,获得杂交瘤细胞。分别采用rEPO(1μg/mL)和重组VAR-EPO(1μg/mL&0.1μg/mL)为包被抗原,用ELISA法测定细胞上清液,选取VAR-EPO高低浓度均阳性且rEPO阴性孔通过有限稀释连续克隆2-3次,得到一株稳定分泌鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株,编号22TJY2-MM07。
(4)杂交瘤细胞培养及抗体纯化
用超纯水冲洗Protein A亲和层析柱,然后用平衡缓冲液平衡;将培养得到的杂交瘤细胞上清上样亲和层析柱,上样完毕后,用平衡缓冲液淋洗。洗脱缓冲液洗脱,收集洗脱峰,用Tris缓冲液中和,并脱盐至PBS7.4,得到纯化后的抗体。
纯化后对抗体进行验证,其非变性SDS-PAGE电泳图如图1所示,抗体变性SDS-PAGE电泳图如图2所示。
实施例3检测尿液样本中的rEPO
本实施例采用双向免疫纯化联合蛋白免疫印迹的方法进行检测,具体的检测步骤为:
(1)样本超滤浓缩
取15mL待检测尿样,加入1.5mL Tris-HCl缓冲液(3.75M,pH7.4),充分混匀调节样本pH值,离心20分钟,离心力4000g。离心后,将上清液倒入15mL 10kD超滤离心管(Millipore)超滤浓缩至200μL-500μL,并置换为PBS缓冲液体系,将浓缩后的样本转入1.5mL低吸附离心管。
(2)反向免疫纯化
向浓缩后的样本中加入1μg实施例2中制备得到的鼠单克隆抗体,充分混匀后,室温孵育1小时。孵育结束后,向样本中加入50μL清洗后的Anti-mouse IgG磁珠(DynabeadsM-280Sheep anti-Mouse IgG,Invitrogen),充分混匀后4℃孵育90分钟。孵育结束后,将样本置于磁力架上富集磁珠。
回收上清溶液,向上清溶液中再次加入1μg实施例2中制备得到的鼠单克隆抗体,充分混匀后,室温孵育1小时。孵育结束后,向样本中加入50μL清洗后的Anti-mouse IgG磁珠,充分混匀后4℃过夜孵育。
孵育结束后,将样本置于磁力架上富集磁珠,分别收集磁珠和上清液。
将富集的磁珠清洗3次后,加入25μL SDS上样缓冲液95℃孵育5分钟以洗脱EPO蛋白。孵育结束后,冷却EP管,短暂离心后置于磁力架待上样。
需要说明的是,在实际检测中,反向免疫纯化可以进行多轮,每轮反向免疫纯化对上一次反向免疫纯化得到的上清液继续重复上述实验步骤。
(3)正向免疫纯化
将步骤(2)回收的上清液转至0.5mL 30kD超滤离心管(Millipore)超滤浓缩至20μL左右,转入包被EPO抗体的ELISA板(Stemcell)37℃孵育2小时。孵育结束后,清洗ELISA板,加入20μL SDS上样缓冲液95℃孵育5分钟以洗脱EPO蛋白。孵育结束后,冷却ELISA板待上样。
(4)蛋白免疫印迹法
分别对步骤(2)中的磁珠洗脱液和步骤(3)中的ELISA板洗脱液进行双次蛋白免疫印迹。
选用10% Bis-Tris蛋白胶(Invitrogen)搭配SDS MOPS缓冲体系进行SDS-PAGE凝胶电泳,恒定电压200V,75分钟。采用Towbin转印缓冲液搭配半干转印的方法,将蛋白转印至0.45μm PVDF膜(Millipore),1.0mA/cm2转印60分钟。转印结束后,将PVDF膜置于5%LFM/PBS中封闭60分钟。封闭结束后,将PVDF膜用PBS涮洗后,加入20mL用1%LFM/PBS稀释的一抗溶液(1μg/mL,MAB2871,R&D)4℃过夜孵育。
一抗孵育结束后,将PVDF膜用PBS涮洗并清洗3遍后,采用半干转印方法进行第二次蛋白免疫印迹,将结合于第一张PVDF膜上的EPO抗体转印至第二张膜上,转印缓冲体系为0.7%醋酸溶液,转印条件为0.72mA/cm2,10分钟。转印结束后,将PVDF膜置于5% LFM/PBS中封闭60分钟。封闭结束后,将PVDF膜用PBS涮洗后,加入40mL用1%LFM/PBS稀释的生物素标记二抗溶液(0.65μg/mL,Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody Biotin,Invitrogen)室温孵育60分钟。孵育结束后,将PVDF膜用PBS涮洗并清洗3遍,加入40mL用1%LFM/PBS稀释的链霉亲和素标记HRP溶液(0.25μg/mL,Streptavidin Protein HRP,Thermo)室温孵育60分钟。孵育结束后,将PVDF膜用PBS涮洗并清洗5遍后,用HRP化学发光底物显色试剂(SuperSignal West Femto)显色。
(5)检测结果分析
通过磁珠洗脱液的条带可以检测该样品中是否含有由EPO基因多态性c.577del编码的VAR-EPO;再结合ELISA板洗脱液的条带可以进一步检测该样品中是否含有rEPO。综合分析同一样本ELISA板洗脱液和磁珠洗脱液结果,检测结果如表1所示:
表1
表1中,a~g分别表示以下结果:
a:不携带EPO基因多态性c.577del,rEPO阴性;
b:不携带EPO基因多态性c.577del,rEPO阳性;
c:不携带EPO基因多态性c.577del,rEPO阳性;
d:EPO基因多态性c.577del杂合子,rEPO阴性;
e:EPO基因多态性c.577del纯合子,rEPO阴性;
f:EPO基因多态性c.577del杂合子,rEPO阳性;
g:EPO基因多态性c.577del纯合子,rEPO阳性。
对比例1
采用正向免疫纯化联合蛋白免疫印迹对各样品进行检测,得到免疫印迹结果。
采用实施例3和对比例1的实验方法分别对各种样品进行检测,以验证本发明所述rEPO兴奋剂检测方法的检测效果。
其中,待检测的样品已知,各样品的电泳条带如图3所示,其中,电泳条带编号和检测方法如表2所示:
表2
通过图3可以看出,对于未添加rEPO的空白尿样1~4,在对非EPO基因多态性c.577del携带人群进行检测时(1和2),无论是采用正向免疫纯化还是本发明的双向免疫纯化对ELISA板洗脱液的检测结果都仅检出WT-EPO的条带,未检出rEPO的条带。而对EPO基因多态性c.577del杂合携带人群进行检测时(3和4),仅采用正向免疫纯化,ELISA板洗脱液中既检出了WT-EPO的条带,在其上方也显示有条带;而采用本发明的双向免疫纯化对ELISA板洗脱液的检测结果都仅检出WT-EPO的条带,未检出上方条带。可以看出,仅采用正向免疫纯化时,即便是该尿样中并未添加rEPO,但由于其为EPO基因多态性c.577del杂合携带人群,其尿样中含有的VAR-EPO也会导致检测为rEPO阳性,使检测结果不准确;而采用本发明的双向免疫纯化检测结果显示rEPO阴性,这说明本发明的方法能够有效区分因携带EPO基因多态性c.577del产生的VAR-EPO和rEPO,使检测结果准确。
对于添加rEPO的尿样5~8,无论是仅采用正向免疫纯化还是本发明的双向免疫纯化方法,无论是对非EPO基因多态性c.577del携带人群的尿样还是EPO基因多态性c.577del杂合携带人群的尿样,均能够在WT-EPO的条带上方检出条带,这说明本发明的检测方法能够有效检测出rEPO。
对于样品2’和4’,采用本发明的双向免疫纯化法检测磁珠洗脱液,可以看出,对于非EPO基因多态性c.577del携带人群,本发明的方法未检出条带,而对于EPO基因多态性c.577del杂合携带人群,本发明的方法可检出条带,这说明本发明的检测方法能够有效检测出VAR-EPO。
通过上述实验结果可以说明,本发明的抗VAR-EPO鼠单克隆抗体对于VAR-EPO具有高度的特异性和良好的亲和性,双向免疫纯化联合蛋白免疫印迹能够有效区分WT-EPO、VAR-EPO和rEPO,这样可以避免来自EPO基因多态性c.577del携带人群的样品被误判为含有rEPO。同时,对于EPO基因多态性c.577del携带人群,如果其尿样中含有rEPO,也可检出,有效防止漏检。
因此,对于完全未知基因型的人群,无论其携带的是何种基因型,本发明的鼠单克隆抗体及双向免疫纯化方法均能够一次性有效判定其尿样中是否含有rEPO,无需进行后续追踪调查,有效提高了检测效率和准确性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一株用于分泌抗人突变型促红素鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其特征在于,所述杂交瘤细胞株的拉丁文学名为Mus musculus,保藏编号为CGMCC No.45302,保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心。
2.一种抗人突变型促红素鼠单克隆抗体,其特征在于,由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生。
3.根据权利要求2所述的抗人突变型促红素鼠单克隆抗体,其特征在于,所述人突变型促红素为人突变型促红素p.Arg193AspfsTer28,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种用于制备权利要求2或3所述的鼠单克隆抗体的多肽抗原,其特征在于,所述多肽抗原的氨基选序列如SEQ ID NO:3所示。
5.权利要求2或3所述的鼠单克隆抗体在人重组促红素兴奋剂检测中的应用。
6.一种人重组促红素兴奋剂检测方法,其特征在于,采用如权利要求2或3所述的鼠单克隆抗体对待测样品中的人重组促红素兴奋剂进行检测。
7.根据权利要求6所述一种人重组促红素兴奋剂检测方法,其特征在于,当待测样品中仅含有人突变型促红素和/或野生型促红素时,检测结果为阴性;当待测样品中含有人重组促红素兴奋剂时,检测结果为阳性。
8.根据权利要求6所述一种人重组促红素兴奋剂检测方法,其特征在于,所述检测方法为双向免疫纯化联合蛋白免疫印迹法,包括反向免疫纯化至少一轮、正向免疫纯化以及蛋白免疫印迹的步骤。
9.根据权利要求8所述一种人重组促红素兴奋剂检测方法,其特征在于,每一轮所述反向免疫纯化的步骤为:将待测样品或上一轮得到的上清溶液与所述鼠单克隆抗体混合,再依次进行孵育、加入免疫磁珠、孵育以及磁珠富集的步骤,得到本轮所述反向免疫纯化的上清溶液。
10.权利要求2或3所述的鼠单克隆抗体在制备检测人EPO基因多态性c.577del的试剂中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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