KR102632025B1 - 센서 장치용 전극의 중합체-코팅 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전기화학 또는 전기장 효과 기반 검출 방법을 사용하여 샘플을 전기화학적으로 분석하기 위한 센서 장비의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유체 샘플에 노출될 수 있는 기능화된 표면을 포함하는 전극으로서, 상기 기능화된 표면은 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체 및 유체 샘플에 포함된 분석물에 결합하는 적어도 하나의 검출제를 포함하며, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체 및 상기 적어도 하나의 검출제는 전극의 표면에 분포되어, 검출제가 전극 표면 전체의 표면적 당 본질적으로 동일한 양으로 존재하도록 하고 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체가 하기와 같은 양으로 존재하는 검출제 주위에 배열된, 전극에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전극 상에 기능화된 표면을 제조하는 방법, 전극을 포함하는 적어도 하나의 분석물을 결정하기 위한 분석물 검출기, 및 유체 샘플에서 적어도 하나의 분석물을 결정하기 위한 상기 분석물 검출기의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 전기화학 또는 전기장 효과 기반 검출 방법을 사용하여 샘플을 분석하기 위한 센서 장비의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유체 샘플에 노출될 수 있는 기능화된 표면을 포함하는 전극으로서, 상기 기능화된 표면은 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체 및 유체 샘플에 포함된 분석물에 결합하는 적어도 하나의 검출제를 포함하며, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체 및 상기 적어도 하나의 검출제는 전극의 표면에 분포되어, 검출제가 전극 표면 전체의 표면적 당 본질적으로 동일한 양으로 존재하고 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체가 검출제에 근접한 유체의 이온 강도의 감소를 허용하는 양, 및 유체 샘플에 포함된 분석물을 결합시키는 것을 허용하는 양으로 존재하는 검출제 주위에 배열되도록 하는, 전극에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전극 상에 기능화된 표면을 제조하는 방법, 전극을 포함하는 적어도 하나의 분석물을 결정하기 위한 분석물 검출기, 및 유체 샘플에서 적어도 하나의 분석물을 결정하기 위한 상기 분석물 검출기의 용도에 관한 것이다.
최근 생물학적 검출을 위해 전계 효과 트랜지스터 (FET)-기반 센서를 적용하는데 큰 진전이 있었다. FET-기반 측정은 하전된 분자를 센서 표면에 결합하여, 표면 전위를 변경시키고, 결과적으로 트랜지스터 내부의 채널 전류를 변경시킨다. 상기 전하 기반 감지 메커니즘은 FET 측정을 라벨이 없고 광범위한 생물학적 표적에 대해 매우 민감하게 한다. 예를 들어, FET-바이오센서는 핵산 (DNA 및 RNA), 효소, 단백질 질환 마커 및 심지어 전체 바이러스, 박테리아 및 진핵 세포와 같은 다양한 생체분자를 검출하기 위해 적용되어 왔다. 이들의 다재다능성, 고감도 및 빠른 응답성으로 인해, FET-기반 바이오센서는 PoC (Point-of-Care) 장치에서의 적용을 찾도록 하는 위치에 있다.
상기 언급된 장점에도 불구하고, FET-기반 바이오-감지는 낮은 이온 강도 용액에서의 측정으로 현재까지 제한되어 왔다. 이것은 높은 이온 강도 환경에서 전하를 감지하는 것이 Debye 스크리닝에 의해 방해를 받는데, 여기서 이온 용액 중의 하전된 분자는 분자의 전하를 효과적으로 스크리닝하는 전기적 이중 층을 형성하는 반대-이온을 끌어들이는, 즉 DNA 와 같은 음으로 하전된 분자가 정전기적 상호작용을 통한 양이온에 의해 둘러싸일 것이기 때문이다. 따라서 Debye 스크리닝은 전해질 농도에 따라 다르다.
이온 강도가 >100 mM 인 생리학적 조건 하에서, Debye 스크리닝 효과는 센서 표면으로부터 약 1 nm 내로 검출을 제한한다. 이러한 이유로, 대부분의 FET-기반 바이오센서는 샘플을 사전-탈염 또는 희석함으로써, 비-생리학적 이온 강도 조건 하에서만 작동되었다. PoC 설정에 적용가능하게 하기 위해서는, 샘플 프로세싱 능력이 환자-근처 부위에서 매우 제한적이기 때문에 이온 스크리닝을 보다 직접적이고 효율적인 방식으로 줄여야만 한다.
최근 몇 가지 연구에서 상기 Debye 스크리닝 문제를 완화하기 위한 몇 가지 전략이 보고되었다. 표적 분자를 전극 표면에 더 가깝게 하기 위한 더 작은 수용체, 예를 들어 앱타머 또는 더 작은 항체 단편의 사용은 단백질의 트랜지스터-기반 검출을 향상시키는 것으로 보고되었다. 또한, 고주파 FET 측정을 실시함으로써, 이온 스크리닝 효과가 완화될 수 있음이 입증되었다.
보다 최근에, 센서 상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 의 동시-고정화는 높은 이온 강도 용액에서 생체분자의 트랜지스터-기반 검출을 가능하게 하는 것으로 나타났다 (Gao 2015, Nano Lett. 15: 2143; Gao 2016, PNAS 113(51): 14633-14638 및 WO2016/161246).
PEG 는 또한 상이한 목적을 위해 전극 재료에 기재되어 있다. 예를 들어, 이들은 프로브 고정화 및 비특이적 결합 감소를 위한 링커로서 기술되었다 (Shim 2002, Nano Lett. 2: 285). 또한, PEG 는 Fab 단편에 대한 안정화제로서 작용할 수 있다 (Yoshimoto 2010, J. Am. Chem. Soc. 132: 7982).
본 발명의 근본적인 기술적 문제는 전술한 요구를 충족시키기 위한 수단 및 방법의 제공으로 볼 수 있다. 상기 기술적 문제는 청구 범위 및 이하에서 특징 지어지는 구현예에 의해 해결된다.
따라서, 본 발명은 유체 샘플에 노출될 수 있는 기능화된 표면을 포함하는 전극으로서, 상기 기능화된 표면은 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체 및 유체 샘플에 포함된 분석물에 결합하는 적어도 하나의 검출제를 포함하며, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체 및 상기 적어도 하나의 검출제는 전극의 표면에 분포되어, 검출제가 전극 표면 전체의 표면적 당 본질적으로 동일한 양으로 존재하고 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체가 하기와 같은 양으로 존재하는 검출제 주위에 배열되도록 하는 전극에 관한 것이다:
i) 검출제에 근접한 유체의 이온 강도의 감소를 허용하는 양, 및
ii) 유체 샘플에 포함된 분석물을 결합시키는 것을 허용하는 양.
이하에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가지고 있다", "포함하다" 또는 "포함되다" 또는 그의 임의의 문법적 변형은 비-배타적 방식으로 사용된다. 따라서, 이들 용어는 이들 용어에 의해 도입된 특징 외에, 이 맥락에서 설명된 존재물에 추가 특징이 존재하지 않는 상황 및 하나 이상의 추가 특징이 존재하는 상황을 모두 지칭할 수 있다. 예를 들어, 표현 "A 는 B 를 가지고 있다", "A 는 B 를 포함한다" 및 "A 에는 B 가 포함된다" 는 모두 B 외에 다른 엘리먼트가 A 에 존재하지 않는 상황 (즉, A 가 단독으로 그리고 배타적으로 B 로 이루어지는 상황) 및 B 이외에, 하나 이상의 추가 엘리먼트, 예를 들어 엘리먼트 C, 엘리먼트 C 및 D 또는 심지어 추가 엘리먼트가 존재물 A 에 존재하는 상황을 말할 수 있다.
또한, "적어도 하나", "하나 이상" 이라는 용어 또는 유사한 표현은 특징 또는 엘리먼트가 1 회 또는 1 회 초과, 즉 2 회, 3 회, 4 회, 5 회 내지 제한되지 않은 횟수까지 존재할 수 있음을 나타내고, 전형적으로 각각의 특징 또는 엘리먼트를 도입할 때 오직 한 번만 사용될 것임을 명시할 것이다. 이하에서, 대부분의 경우, 각각의 특징 또는 엘리먼트를 언급할 때, 각각의 특징 또는 엘리먼트가 1 회 또는 1 회 초과로 존재할 수 있다는 사실에도 불구하고, "적어도 하나" 또는 "하나 이상" 이라는 표현은 반복되지 않을 것이다.
또한, 이하에서 사용되는 용어 "바람직하게", "더욱 바람직하게", "특히", "더욱 특히", "구체적으로", "더욱 구체적으로", "전형적으로", "더욱 전형적으로" 또는 유사한 용어가 대안적인 가능성을 제한하지 않고 선택적 특징과 함께 사용된다. 따라서, 이러한 용어들에 의해 도입된 특징들은 선택적 특징이며 어떠한 방식으로도 청구 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 당업자라면 알 수 있듯이, 대안적인 특징을 사용하여 본 발명을 수행할 수 있다. 유사하게, "본 발명의 구현예에서" 에 의해 도입된 특징들 또는 유사한 표현들은 본 발명의 대안적인 구현예에 관한 임의의 제한 없이, 본 발명의 범주에 관한 임의의 제한 없이, 및 이러한 방식으로 도입된 특징을 본 발명의 다른 선택적 또는 비-선택적 특징과 조합하는 가능성에 관한 임의의 제한 없이 선택적 특징인 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "전극" 은 전기 접촉을 가능하게 하는 구조를 지칭한다. 전극은 일반적으로 반도체 엘리먼트, 전해질, 진공 또는 공기와 같은 전기 회로의 비-금속 부분과 전기적으로 접촉하는데 사용된다. 전형적으로, 전극은 전기 전도성 물질을 포함한다. 특히, 본 발명에 따라 사용되는 전극은 고체 지지체이다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "전극" 은 일반적으로 전류 측정 및/또는 전압 측정을 수행하도록 구성되고/되거나 전류 및/또는 전위 및/또는 전압을 전극과 전기적으로 접촉하는 엘리먼트에 인가하도록 구성된 기능적 엘리먼트를 지칭할 수 있다. 특히, 전극은 전도성 및/또는 반전도성 물질을 포함할 수 있다. 예로서, 전극은 적어도 하나의 전도성 또는 반전도성 표면을 갖는, 적어도 하나의 금속 재료 및/또는 적어도 하나의 유기 또는 무기 반전도성 재료를 포함할 수 있다. 표면 그 자체는 전극 또는 전극의 일부를 형성할 수 있다. 예로서, 전극은 적어도 하나의 방향으로 등방성 또는 이방성으로 적어도 1000 S/m, 예를 들어 적어도 1000000 S/m 의 전기 전도성을 갖는 적어도 하나의 재료, 특히 적어도 하나의 표면 재료를 포함할 수 있다. 구체적으로, 전극은 그래핀, 탄소 나노튜브, 실리콘 나노와이어, 몰리브덴 산화물, 몰리브덴 이황화물, 티타늄 산화물, 아연 산화물, 금속 산화물, 갈륨 질화물, 금, 실리콘, 자성 비드, 나노입자 또는 이들 물질의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
전극은 일반적으로 반도체 엘리먼트, 전해질, 진공 또는 공기와 같은 전기 회로의 비-금속 부분과 전기적으로 접촉하는데 사용된다. 전형적으로, 전극은 전기 전도성 물질을 포함한다. 특히, 본 발명에 따라 사용되는 전극은 고체 지지 구조이다.
본원에 사용된 용어 "전기 접촉" 은 일반적으로 적어도 2 개의 구성요소의 배열 또는 구성을 지칭할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 구성요소는 적어도 하나의 다른 구성요소에 전기적으로 영향을 줄 수 있고/있거나 예를 들어 정전기 유도를 통한 전도성 및 전류 흐름과 같은 다른 구성요소의 전기적 품질을 적어도 부분적으로 제어할 수 있다. 특히, 전극은 상기 엘리먼트와 직접적인 물리적 접촉 없이 엘리먼트와 전기적으로 접촉될 수 있다. 따라서, 전극은 상기 엘리먼트로부터 절연되어 있음에도 불구하고 전압을 인가함으로써 엘리먼트 내의 전류 흐름을 제어할 수 있다. 절연은 예를 들어, 전형적으로 절연 게이트 전계 효과 트랜지스터 (IGFET) 의 서브그룹인 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터 (MOSFET) 의 게이트 전극의 경우와 같이 산화물 층으로 구성될 수 있으며, 이것은 하기에 더 자세히 설명되어 있다. 따라서, 일반적으로, 서로 전기적으로 접촉하기 위해, 적어도 2 개의 구성요소는 서로 직접적으로 물리적으로 접촉하지 않고 근접하여 위치될 수 있지만, 구성요소는 서로 전기적으로 영향을 줄 수 있다. 그러나, 부가적으로 또는 대안적으로, 적어도 2 개의 구성요소는 또한 적어도 하나의 전기 전도체와 같은 적어도 반전도성 특성 또는 전기 전도성 특성을 갖는 적어도 하나의 연결 엘리먼트를 통해 물리적으로 연결될 수 있다. 다시, 부가적으로 또는 대안적으로, 적어도 2 개의 구성요소는 별도의 구성요소일 수 있거나 서로 완전히 또는 부분적으로 통합될 수 있다. 예로서, 적어도 하나의 전극은 적어도 하나의 연결 엘리먼트를 통해, 예컨대 적어도 하나의 전기 전도성 리드를 통해 전계 효과 트랜지스터에 연결되거나, 전계 효과 트랜지스터에 심지어 완전히 또는 부분적으로 통합될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "기능화된 표면" 은 특정한 요구되는 물리적 및/또는 화학적 특성을 갖는 본 발명에 따른 전극의 표면을 지칭한다. 본 발명에 따른 전극의 표면은 이것이 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체 및 유체 샘플에 포함된 분석물에 결합하는 적어도 하나의 검출제를 포함하도록 기능화되어야 한다. 또한, 상기 중합체 및 검출제는 전극 표면 전체에 걸쳐 검출제가 표면적 당 실질적으로 동일한 면적으로 존재하도록 전극의 표면에 분포되어야 한다. 또한, 상기 배열에서, 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체는 검출제 주위에 존재해야 하고 검출제에 근접한 유체의 이온 강도의 감소를 허용하고 동시에, 유체 샘플에 포함된 분석물을 결합시킬 수 있는 양으로 존재해야 한다. 배열은 전형적으로, 연속 층일 수 있거나, 또는 각각의 검출제 주위의 스폿 형 배열과 같은 클러스터 배열일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유체 샘플" 은 그러한 분석물을 포함하는 것으로 검출되거나 의심되는 분석물을 포함하는 임의의 용액을 지칭한다. 유체 샘플은 수용액일 수 있거나 유기 용매를 포함하는 다른 용매를 포함할 수 있다. 유체 샘플은 임의의 기원일 수 있으며, 예를 들어, 이는 환경에 존재하는 유체 또는 유기체에 존재하는 유체 (즉, 체액) 를 포함하거나 추출물과 같은 유기체로부터 유래된 자연 발생 유체의 유체 샘플일 수 있다. 또한, 유체는 인공 유체, 예를 들어 분석될 화합물을 적절한 용매에 용해시켜 얻은 유체 또는 화학 반응의 생성물로서 얻어진 유체일 수 있다. 전형적으로, 상기 유체 샘플은 체액, 액체 또는 용해된 환경 샘플 또는 적어도 하나의 화학적 화합물의 용액이다. 더욱 전형적으로, 상기 유체는 이온 강도가 높은 유체이다. 따라서, 유체 샘플은 예를 들어, 용해된 염 또는 완충액에서 발생하는 다량의 양이온 및 음이온을 포함해야 한다. 높은 이온 강도 하에서, 전형적으로 이온은 밀리몰 양으로, 전형적으로 10 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 150 mM 또는 200 mM 이상의 양으로 존재하는 것으로 이해되어야 한다. 체액은 전형적으로 혈액, 혈장, 혈청 또는 이의 임의의 분획, 타액, 눈물, 점액, 림프, 뇌척수액, 소변, 대변, 땀, 정액, 활액으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "분석물" 은 유체 샘플에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 분자 및/또는 그 양이 검출될 분자를 지칭한다. 사용되는 검출제의 종류에 따라, 분석물은 다양한 종류의 분자로부터 선택될 수 있다. 특히, 분석물은 소분자, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 RNA 또는 DNA, 중합체 또는 다른 거대분자, 바이러스 또는 박테리아, 고세균, 조류 원생 동물 또는 곰팡이와 같은 단세포 유기체를 포함하는 미생물과 같은 유기체일 수 있다. 그러나, 전형적으로, 분석물은 대사 경로의 효소에 대한 기질, 이러한 경로의 중간체 또는 대사 경로에 의해 얻어진 생성물과 같은 소분자 화합물이다. 따라서, 보다 전형적으로, 본 발명에 따른 분석물은 대사산물일 수 있다. 대사 경로는 당업계에 공지되어 있으며 종마다 다양할 수 있다. 바람직하게는, 상기 경로는 적어도 시트르산 사이클, 호흡 사슬, 광합성, 광호흡, 당분해, 글루코네오제네시스, 헥소오스 모노포스페이트 경로, 산화 펜토오스 포스페이트 경로, 지방산의 생성 및 β-산화, 엘리먼트 사이클, 아미노산 생합성 경로, 프로테아좀 분해와 같은 단백질 분해 경로, 아미노산 분해 경로, 하기의 생합성 또는 분해: 지질, 폴리케타이드 (예를 들어, 플라보노이드 및 이소플라보노이드 포함), 이소프레노이드 (예를 들어, 테르펜, 스테롤, 스테로이드, 카로테노이드, 크산토필 포함), 탄수화물, 페닐프로파노이드 및 유도체, 알칼로이드, 벤제노이드, 인돌, 인돌-황 화합물, 포르피린, 안토시안, 호르몬, 비타민, 조인자, 예컨대 보결 분자단 또는 전자 운반체, 리그닌, 글루코시놀레이트, 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오사이드, 뉴클레오티드 및 관련 분자, 예컨대 tRNA, 마이크로RNA (miRNA) 또는 mRNA 를 포함한다. 따라서, 소분자 화합물 대사산물은 일반적으로 하기 부류의 화합물: 알콜, 알칸, 알켄, 알킨, 방향족 화합물, 케톤, 알데히드, 카르복실산, 에스테르, 아민, 이민, 아미드, 시아나이드, 아미노산, 펩티드, 티올, 티오에스테르, 포스페이트 에스테르, 설페이트 에스테르, 티오에테르, 설폭사이드, 에테르 또는 상기 언급된 화합물의 조합 또는 유도체로 구성된다. 대사산물 중 소분자는 정상적인 세포 기능, 기관 기능 또는 동물 성장, 발달 또는 건강에 필요한 1 차 대사산물일 수 있다. 또한, 소분자 대사산물은 필수 생태 기능을 갖는 2 차 대사산물, 예를 들어 유기체가 환경에 적응할 수있는 대사산물을 추가로 포함한다. 또한, 대사산물은 상기 1 차 및 2 차 대사산물로 제한되지 않으며 인공 소분자 화합물을 추가로 포함한다. 상기 인공 소분자 화합물은 유기체에 의해 투여되거나 섭취되지만 상기 정의된 바와 같은 1 차 또는 2 차 대사산물이 아닌 외인성으로 제공되는 소분자로부터 유래된다. 예를 들어, 인공 소분자 화합물은 동물의 대사 경로에 의해 약물로부터 얻은 대사 생성물일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "염석 효과를 매개할 수 있는 중합체" 는 하나 초과의 단량체 서브유닛을 포함하는 거대분자를 의미한다. 일반적으로, 중합체의 단량체 서브유닛은 서로 화학적으로 연결되어 이에 의해 거대분자가 형성된다. 중합체는 화학적으로 동일한 단량체로 이루어질 수 있다, 즉 단독-중합체일 수 있거나 또는 화학적으로 상이한 단량체로 이루어질 수 있다, 즉 이종-중합체일 수 있다. 이의 화학적 구조로 인해, 중합체는 단량체 서브유닛 및 그 성질뿐만 아니라 상기 단량체 서브유닛의 거대분자 배열에 기인한 다양한 특성을 갖는다. 본 발명에 따라 구상되는 중합체는 염석 효과를 매개할 수 있어야 한다, 즉, 적절하게 배열될 때, 예를 들어 층으로서 상기 중합체 층 내의 주변 이온성 유체의 이온 강도를 감소시켜야 한다. 통상적으로, 중합체는 용매, 특히 물 분자를 이들 가까이에서 풍부하게 하는 동안 이온을 중합체 주변에서 배제함으로써 이를 달성해야 한다. 중합체 주변 영역에서 용매의 이온 강도의 감소의 결과로서, 용해된 이온에 의해 유발되는 정전기 효과는 중합체 분자에 근접하여 감소될 것이다. 따라서, 예를 들어 전극 상에 층으로서 적절하게 배열된다면, 유체에서 분석물과 전극 사이의 Debye 길이가 증가될 수 있다. 이온 용액에 대한 Debye 길이는 다음 공식에 의해 결정될 수 있다:
식 중:
는 Debye 길이이고;
는 유전 상수이고;
는 자유 공간의 유전율이고;
는 볼츠만 상수이고;
T 는 온도이고;
는 아보가드로 수이고;
e 는 기본 전하이고;
I 는 이온 강도이다.
유체의 이온 강도 및 Debye 길이는 추가로 어려움 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 또한, Debye 길이에 대한 중합체의 효과는 당업자에게 공지되어 있고 하기 첨부된 실시예에 기재된 기술에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있다.
전형적으로, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체의 크기는 Debye 길이가 증가되고 적어도 하나의 검출 분자 주위의 이온 강도가 감소되는 정도이다. 더욱 전형적으로, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체의 분자량 (MW) 은 1 내지 100 kDa, 10 내지 100 kDa, 10 내지 50 kDa, 10 내지 25 kDa, 10 내지 20 kDa 또는 10 내지 15 kDa 이다.
또한 전형적으로, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 상기 언급된 중합체의 공중합체, 다당류, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 폴리실록산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
염석 효과를 매개할 수 있는 상기 언급된 중합체는 전극의 표면에 고정되어야 한다. 따라서, 중합체는 직접적으로 또는 간접적으로, 즉 링커를 통해 전극의 표면에 연결될 수 있다. 사용되는 연결의 종류는 전극 재료 및 중합체에 따라 다르다. 따라서, 적절하게 선택된다면, 중합체와 전극 표면 사이의 직접적인 연결이 달성될 수 있다. 그러나, 연결은 전형적으로 링커를 통한 간접 연결일 것이다. 본 발명에 따라 언급된 링커는 분자, 및 더욱 전형적으로 이작용성 분자이며, 이는 전극 표면 및 중합체 둘 다에 직접 결합할 수 있게 한다. 본원에 언급된 바와 같은 결합은 공유 또는 비-공유 결합일 수 있고, 따라서 적용되는 환경 및 조건에 따라 영구적이거나 가역적일 수 있다. 당업자는 어떤 조건 하에서 직접적 또는 간접적 결합이 달성될 수 있고 어떤 유형의 링커가 적합한지를 잘 알고 있다.
전형적으로, 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체는 링커를 통해 전극의 표면에 고정되거나 추가의 링커없이 작용기를 통해 직접 부착된다. 더욱 전형적으로, 상기 링커는 다음 구조를 갖는 링커이다:
여기서 A 는 하기 부류: 티올, 실란, 포스폰산, 방향족 분자 (예를 들어, 피렌), 카르복실, 아민, NHS 에스테르, 말레이미드로부터의 제 1 작용기이고,
B 는 하기 부류: 상기 기재된 부류로부터의 저분자량 중합체, 탄화수소 (예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 페닐), 산소 함유 기 (예를 들어, 에테르), 할로알칸 (예를 들어, 클로로), 질소 함유 기 (예를 들어, 아미드), 황 함유 기 (예를 들어, 설폭사이드), 인 함유 기, 붕소 함유 기, 또는 짧은 무기 중합체 사슬 (예를 들어, Si-계 (실록산), P-계, B-계, S-계) 로부터의 짧은 유기 사슬이고, C 는 하기 부류: 카르복실, 아민, NHS 에스테르, 말레이미드로부터의 제 2 작용기임.
본 발명에 따라 사용되는 용어 "검출제"는 유체 샘플에 존재할 때 검출될 분석물에 결합하는 분자를 지칭한다. 전형적으로, 검출제는 상기 분석물에 특이적이고 선택적으로 결합한다, 즉, 샘플에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 다른 분석물과 교차 반응하지 않는다. 특이적 결합은 다양한 잘 알려진 기술에 의해 시험될 수 있다. 검출될 분석물의 유형에 따라, 검출제는 상이한 부류의 분자로부터 선택될 수 있다. 당업자는 어떤 분자가 검출제로 사용되는 지에 의해 어떤 유형의 분석물이 검출될 수 있는 지를 잘 알고 있다. 전형적으로, 검출제는 항체 및 이의 단편, 핵산, 앱타머, 펩티드 핵산 (PNA), 수용체 또는 리간드 단백질 또는 펩티드 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 언급된 항체 및 이의 단편은 검출될 분석물에 전형적으로, 특이적으로 결합하는 모든 유형의 항체를 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 항체는 여전히 분석물에 결합할 수 있는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일 사슬 항체, 키메라 항체 또는 이러한 항체의 임의의 단편 또는 유도체이다. 본원에 사용된 용어 항체에 포함되는 이러한 단편 및 유도체는 이중특이적 항체, 합성 항체, Fab, F(ab)2, Fv 또는 scFv 단편, 또는 이들 항체 중 임의의 것의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다. 항체 또는 이의 단편은 일반적으로 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 모노클로날 항체는, 예를 들어, 마우스 골수종 세포를 면역화된 포유류 및 바람직하게는 Koehler & Millstein 기술에 따라 면역화된 마우스로부터 유래된 비장 세포에 융합시키는 것을 포함하는 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에 언급된 핵산은 모든 종류의 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA) 뿐만 아니라 그의 화학적으로 변형된 유도체를 지칭한다. 이들 분자는 당업계에 잘 알려져 있다. 전형적으로, 검출제로서의 핵산은 다른 핵산을 분석물로서 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 검출제 핵산은 검출될 분석물 핵산 또는 그의 일부와 부분적으로 또는 전체적으로 상보적이다. 전형적으로, 이러한 핵산은 올리고뉴클레오티드의 크기를 가질 수 있으며, 즉 5 내지 35 개의 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 10 내지 25 개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나, 100 내지 1,000 개의 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 300 내지 600 개의 뉴클레오티드 길이의 범위의, 더 큰 핵산 프로브일 수 있다.
본 발명에 따라 언급된 앱타머는 핵산 및 펩티드 앱타머를 포함한다. 염기 쌍을 형성하는 능력에 더하여, 핵산은 소분자, 단백질, 핵산, 심지어 세포, 조직 및 유기체와 같은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 3 차원 구조를 형성하는 능력으로 인해 다른 분석물을 검출하기 위해 앱타머로도 사용될 수 있다. 핵산 앱타머는 시험관 내 선별의 반복된 라운드를 통해 또는 지수 풍부화에 의한 리간드의 체계적인 진화 (SELEX) 기술을 통해 다양한 분자 표적에 결합하도록 조작될 수 있다. 펩티드 앱타머는 특정 표적 분자에 결합하도록 선별되거나 조작된 인공 펩티드이다. 이들 펩티드는 보통 단백질 스캐폴드에 의해 전시되는 가변 서열의 하나 이상의 펩티드 루프로 구성된다. 이들은 전형적으로 조합 라이브러리로부터 단리되고, 통상 가변 영역 돌연변이 유발의 지정 돌연변이 또는 라운드 및 선별에 의해 후속적으로 개선된다.
펩티드 핵산 (PNA) 은 펩티드 결합에 의해 연결된 반복 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성된 핵산-유사 백본을 갖는 인공적으로 합성된 중합체이다. 다양한 퓨린 및 피리미딘 염기는 메틸렌 브릿지 및 카르보닐 기에 의해 백본에 연결된다. PNA 및 핵산은 유사한 생물학적 특성을 가지므로, PNA 는 핵산 또는 앱타머와 같은 검출제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 수용체 또는 리간드 단백질 또는 펩티드는 다른 단백질 또는 펩티드를 특이적으로 인지할 수 있는 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 수용체 및 리간드 펩티드 또는 단백질은 다른 단백질 또는 펩티드와 같은 다른 분자와 특이적으로 상호작용할 수 있다. 따라서, 수용체 또는 리간드는 이러한 상호작용 단백질 또는 펩티드 또는 심지어 상호작용하는 다른 분자에 대한 검출제로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 수용체 또는 리간드 단백질 또는 펩티드는 또한 전체 생물학적 활성 수용체 또는 리간드의 일부 및 전형적으로 그의 결합 도메인을 포함하는 부분을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 수용체 또는 리간드 단백질 및 펩티드는 자연 발생적 수용체 또는 인공적으로 생성된 수용체일 수 있다. 검출제로서 전형적인 인공 펩티드는 또한 시클릭 펩티드를 포함한다.
검출제로서 또한 전형적으로 효소가 적합하다. 효소는 분자 (기질) 에 특이적으로 결합하고 상기 분자를 다른 분자 (생성물) 로 효소적으로 전환시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드이다. 따라서, 효소는 전형적으로 기질에 특이적으로 결합할 수 있고, 따라서 유체 샘플에 존재하는 분석물과 같은 기질을 검출하는데 사용될 수 있다. 효소에 의해 인지되는 분석물은 일반적으로 소분자, 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 그러나, 일부 효소는 또한 중합체와 같은 거대분자를 인지할 수도 있다. 적합한 효소 및 이들의 기질은 당업계에 잘 알려져 있다.
전형적으로, 상기 적어도 하나의 검출제는 링커를 통해 전극의 표면에 고정된다. 더욱 전형적으로, 상기 링커는 0.01 내지 5, 0.01 내지 1.0, 0.01 내지 0.5 또는 0.1 내지 0.5 kDa 의 MW 를 갖는 저분자량 (MW) 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 중합체는 전형적으로 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 및 상기 언급된 중합체의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 저분자량 중합체를 사용하면 검출제를 분석물에 결합시키는 입체형태 안정성, 유연성 및 능력을 강화해야 한다. 이것은 또한 분석물 이외의 종의 비-특이적 흡착을 감소시켜야 한다. 대안적으로, 검출제에 사용되는 링커는 또한 중합체에 대해 상기 기재된 링커일 수 있다.
특히, 본 발명에 따르면, 검출제에 대한 링커는 상기 언급된 바와 같은 중합체인 것으로 구상된다. 또한, 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체는 링커 중합체와 동일한 부류의 중합체이다, 즉 둘 다 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알콜) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 또는 상기 언급된 중합체의 공중합체이다. 더욱 전형적으로, 링커 중합체는 0.01 내지 5, 0.01 내지 1.0, 0.01 내지 0.5 또는 0.1 내지 0.5 kDa 의 MW 를 갖는 저분자량 (MW) 중합체인 반면, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체의 분자량 (MW) 은 1 내지 100 kDa, 10 내지 100 kDa, 10 내지 50 kDa, 10 내지 25 kDa, 10 내지 20 kDa 또는 10 내지 15 kDa 이다.
중합체 및 검출제는 전극 표면 전체에 걸쳐 검출제가 표면적 당 실질적으로 동일한 면적으로 존재하도록 전극의 표면에 분포되어야 한다. 본 발명의 전극을 사용하여 분석물 검출 측정을 수행할 목적으로, 검출제는 전극 표면 전체에 균질하게 존재하는 것이 바람직하다는 것을 이해할 것이다. 이러한 균질한 존재는 검출제 또는 검출제용 링커 및 중합체를 균질 용액으로서 전극의 표면에 적용함으로써 달성될 수 있다. 이에 의해, 전극의 모든 영역은 본질적으로 동일한 양의 검출제 또는 링커 및 중합체를 통계적으로 수용할 것이다. 이러한 균질한 코팅이 달성될 수 있는 방법은 또한 본 기술 분야에서 잘 확립되어 있고 다른 곳에서 더 상세히 설명된다.
또한, 중합체는 검출제 주위에 존재해야 하고 검출제에 근접한 유체의 이온 강도의 감소를 허용하는 양으로 존재해야 하고, 그러나, 유체 샘플에 포함된 분석물을 결합시킬 수 있어야 한다. 전형적으로, 검출제는 검출제가 유체 샘플과 자유롭게 접촉하지 않도록 중합체 분자에 의해 둘러싸여 있다. 이것은 중합체가 검출제에 근접한 이온 강도를 감소시켜 Debye 길이가 증가될 수 있게 한다. 검출제의 크기 및 중합체의 크기는 검출제가 표면 상의 중합체-층 또는 클러스터 내에 있고 자유 유체 샘플에 대한 접근이 제한되거나 또는 제한되지 않도록 주의해야 한다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 중합체의 크기는 검출제의 크기보다 크거나 같아야 하고, 또는 다른 말로는, 검출제는 바람직하게는 중합체-층 또는 클러스터에 포매되어야 한다. 하기 표에, 코팅에 대한 검출제 및 유용한 중합체가 열거되어 있다:
표 1: 개별 검출제에 유용한 중합체
중합체 층 및 검출제 층의 두께는 당업계에 공지된 기술에 의해 측정, 계산 및/또는 예측될 수 있다. 따라서, 중합체 및 검출제의 배열을 별개의 층으로서 고려할 때, 예측 및/또는 계산에 기초하여, 크기가 적합한 중합체가 추가로 어려움 없이 주어진 검출제에 대해 선별될 수 있다.
또한, 검출제 분자는 전형적으로 표면 상의 중합체 분자에 의해 완전히 둘러싸여야 한다. 분석물 검출을 위한 적절한 배열을 달성하기 위해, 상기 검출제 및/또는 이를 위한 링커는 상기 적어도 하나의 중합체와 동시에 적용된다. 전형적으로, 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체 및 기능화된 표면 상에 존재하는 적어도 하나의 검출제의 몰비는 1:100 내지 100:1, 1:50 내지 50:1, 1:20 내지 20:1, 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 5:1, 2:10 내지 8:1, 3:10 내지 7:1, 4:10 내지 6:1 또는 5:10 내지 5:1 이다. 이러한 몰비는 전극 표면 상에 검출제 및 중합체의 상기 언급된 호의적인 배열을 가능하게 한다. 특히, 중합체 및 검출제의 적합한 층 또는 클러스터 배열은 중합체 및 링커, 전형적으로 중합체 링커를 적합한 용매 중의 용액으로서 전극에 적용함으로써 수득될 수 있다. 상기 용액은 전형적으로, 중합체 및 링커를 1:10 내지 1:50, 더욱 전형적으로 1:20 의 분자량 비율로 포함한다. 항체, 수용체 또는 효소와 같은 더 큰 검출제에 대해서는 더 큰 분자 비율이 사용되어야 하며, 즉 링커의 양이 증가되어야 한다는 것을 이해해야 한다.
유리하게는, 본 발명에 기초한 연구에서, Debye 길이 증가의 정도는 PEG 의 존재 및 부재하에 상이한 염 농도 하에서 이중 가닥 DNA (dsDNA) 검출을 체계적으로 비교함으로써 정량화되었다. dsDNA 는 균일한 표면 전하와 쉽게 조정할 수 있는 길이로 인해 FET-기반 측정에 대해 Debye 스크리닝 효과를 연구하기에 이상적인 생체분자이다. 특히, dsDNA 와 함께 고정된 PEG 는 센서 표면 바로 옆의 영역을 국부적으로 탈염시켜 국부 이온 강도를 적어도 10 배 낮추는 것으로 나타났다. 이는 dsDNA 분자 주변 부근에서 Debye 스크리닝 효과가 낮아지고 생리학적 이온 강도 용액 하에서 개선된 FET-기반 검출을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 따르면, 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체에 의해 전극 표면 상의 주변 검출제가 전극 측정을 위한 Debye 길이를 증가시킬 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 높은 이온 강도를 갖는 용액에서 측정이 또한 효율적으로 수행될 수 있으며, 이는 일반적으로 이러한 용액에서 분석물의 전계 효과 기반 검출을 방지한다. 특히, 용액의 이온 강도는 염석으로 인해 중합체 층에서 감소되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 전극 상에 고정된 검출제는 분석물을 검출 분자에 결합시킬 수 있게 하고 층에서 이온 강도의 상기 감소를 위해 중합체 분자의 공간적 배열로 둘러싸여야만 한다. 검출제의 미리 정의된 혼합물 또는 검출제를 위한 링커 및 중합체 분자 또는 상기 중합체를 위한 링커를 사용함으로써 중합체 및 검출제의 적합한 배열을 달성할 수 있다. 기능화된 전극 표면의 제조 방법은 또한 본 발명의 기초가 되는 발견에 의해 제공되며 본원의 다른 곳에서 더 상세하게 설명된다. 항체, 펩티드, 수용체 또는 효소와 같은 검출제에 대한 링커로서 저분자량 중합체를 사용하는 것이 검출제에 대한 분석물에 대한 결합의 입체형태 안정성, 유연성 및 능력이 증가되고, 분석물 이외의 다른 종의 비-특이적 흡착이 감소되어 특히 유리할 것이다.
상기 용어에 대해 주어진 모든 정의 및 설명은 다음의 모든 구현예에 대해 준용된다.
본 발명은 전극 상에 기능화된 표면을 제조하는 방법으로서:
a) 링커 및 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체를, 상기 전극의 상기 표면 상에 상기 링커 및 상기 중합체의 공유 또는 비-공유 고정화를 허용하는 조건 하에서, 전극에 적용하는 단계; 및
b) 상기 링커 및 상기 중합체의 고정화 시 적어도 하나의 검출제를, 고정된 상기 링커를 통해 적어도 하나의 검출 분자의 상기 전극에 대한 공유 또는 비-공유적 부착을 허용하는 조건 하에서, 상기 전극에 적용하는 단계를 포함하고,
상기 조건은 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체 및 상기 적어도 하나의 검출제를 상기 전극의 상기 표면 상에 분포시켜서 상기 검출제가 전극 표면 전체의 표면적 당 동일한 양으로 존재하고 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 중합체가 하기와 같은 양으로 존재하는 상기 검출제의 주위에 배열되도록 하는, 전극 상에 기능화된 표면을 제조하는 방법에 관한 것이다:
i) 검출제에 근접한 유체의 이온 강도의 감소를 허용하는 양, 및
ii) 유체 샘플에 포함된 분석물을 결합시키는 것을 허용하는 양.
전극 표면에 상기 링커 및 상기 중합체의 공유 또는 비-공유 고정화를 허용하는 조건 하에서, 링커 및 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체를 전극에 적용한다. 따라서, 상기 분자의 고정화의 종류에 따라, 분자는 전극 표면에 공유 연결되거나 비-공유 메커니즘에 의해 부착될 수 있다. 전형적으로, 링커 또는 중합체의 공유 결합은 링커 또는 중합체 분자에 존재하는 작용기에 의해 달성될 수 있다. 상기 작용기는 전극 표면에 공유 결합을 형성할 수 있다. 상기 작용기는 또한 이들의 전극에 공유 결합을 허용하기 위해 중합체에 존재할 수 있다. 전형적으로, 링커 또는 중합체의 비-공유 결합은 또한 링커 또는 중합체 분자에 존재하는 작용기에 의해 달성될 수 있다. 상기 작용기는 예를 들어, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용, 파이-상호작용, 수소 결합 또는 반-데르-발스 힘을 통해 전극 표면에 비-공유 결합을 형성할 수 있다. 전형적인 작용기는 티올, 실란, 포스폰산, 방향족 분자 (예를 들어, 피렌), 카르복실, 아민, NHS 에스테르, 말레이미드일 수 있다.
또한 전형적으로, 본 발명의 방법에서 사용되는 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 및 상기 언급된 중합체의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
전형적으로, 본 발명의 방법에서 사용되는 상기 링커는 0.01 내지 5, 0.01 내지 1.0, 0.01 내지 0.5 또는 0.1 내지 0.5 kDa 의 MW 를 갖는 저분자량 (MW) 중합체이며, 상기 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 또는 상기 언급된 중합체의 공중합체이다.
링커 및 중합체의 적용은 검출 분자 및 중합체의 구상 배열을 반영하는 링커 및 중합체의 공간 배열을 형성할 수 있는 조건 하에서 수행된다. 이것은 상기 분자의 미리 정의된 혼합물을 전극 표면에 적용함으로써 달성될 수 있다. 전형적으로, 링커 및 중합체 분자는 적용 용액에서 미리 정의된 몰비로 혼합된다. 중합체 및 검출제에 대한 링커의 몰비는 적합한 용매 중에서 전형적으로, 1:100 내지 100:1, 1:50 내지 50:1, 1:20 내지 20:1, 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 5:1, 2:10 내지 8:1, 3:10 내지 7:1, 4:10 내지 6:1 또는 5:10 내지 5:1 이다. 상기 용매를 전극 표면과 접촉시키고 상기 표면 상에 링커 및 중합체를 고정시킬 수 있는 조건이 적용된다. 게다가, 링커 및 중합체는 일반적으로, 이들이 전극 표면 전체에 걸쳐 표면적 당 동일한 양으로 존재하도록 적용된다.
특히, 검출제에 대한 링커는 상기 언급된 바와 같은 저분자량 중합체, 더욱 전형적으로는 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체와 동일한 부류의 중합체이다, 즉 둘 다 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알콜) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 또는 상기 언급된 중합체의 공중합체이다. 본 발명의 방법에서, 중합체 및 검출제의 적합한 층 배열은 전형적으로, 중합체 및 상기 언급된 중합체 링커를 적합한 용매 중의 용액으로서 1:10 내지 1:50, 더욱 전형적으로 1:20 의 분자량 비율로 중합체 및 링커를 포함하는 전극에 적용함으로써 수득될 수 있다. 동일한 고정화 반응을 사용하여 상기 중합체 및 중합체 링커를 전극의 표면에 고정화시킬 수 있기 때문에, 염석 효과를 매개할 수 있는 링커 및 중합체와 동일한 중합체 부류의 분자를 사용하는 것이 유리하다.
다음 단계에서, 검출 분자는 고정된 링커를 통해 전극에 상기 적어도 하나의 검출 분자의 공유 또는 비-공유 부착을 허용하는 조건 하에서 적용된다. 링커는 전형적으로, 검출 분자와 공유 또는 비-공유 결합을 형성할 수 있는 추가 작용기를 포함한다. 전형적인 작용기는 본원의 다른 곳에 명시된 것들을 포함한다. 표면에 링커 및 중합체 분자를 포함하는 전극에 검출제를 도포하면, 구상되는 공간 배열이 생성된다. 특히, 탈염 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체 및 상기 적어도 하나의 검출제는 전극 표면 전체에 걸쳐 표면적 당 동일한 양으로 존재한다. 또한, 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체는 검출제 주위에 유체의 이온 강도의 감소를 허용하고 유체 샘플에 포함된 분석물을 결합시킬 수 있는 양으로 존재하는 검출제 주위에 배열된다.
본 발명은 또한 본 발명의 전극 또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 전극을 포함하는 적어도 하나의 분석물을 결정하기 위한 분석물 검출기를 제공하며, 여기서 상기 전극은 변환기와 전기적으로 접촉하거나 변환기의 일부이다.
본원에 사용된 용어 "분석물 검출기" 는 유체 샘플에서 적어도 하나의 분석물의 검출에 적합한 장치를 지칭한다. 분석물 검출기는 분석 성분으로서 본 발명의 전극을 포함해야 한다. 또한, 상기 장치는 전형적으로 유체 샘플을 장치 내로 도입하기 위한 로딩 엘리먼트 및 전극을 유체 샘플에 접촉시킬 수 있는 접촉 엘리먼트를 포함해야 한다. 또한, 전극은 변환기와 전기적으로 접촉하거나 그러한 변환기의 일부여야 한다. 전형적으로, 본 발명에 따른 분석 장치는 전계 효과 트랜지스터 (FET) 를 포함하고, 본 발명의 전극은 상기 트랜지스터에서 게이트 전극 또는 채널로서 사용된다. 게이트 전극 또는 채널로서 사용될 때, 본 발명의 전극은 예를 들어 본 발명에 따른 분석물 검출기를 적용하는 유체 샘플에서 분석물의 특이적이고 효율적인 검출을 허용한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명에 따른 분석 장치는 전기화학적 측정 장치를 포함할 수 있고 본 발명의 전극은 전기화학적 측정에 참여할 수 있다. "전기화학적 측정 장치" 라는 용어는 일반적으로 적어도 하나의 전기화학적 측정을 수행하도록 구성된 임의의 장치를 지칭할 수 있다. 이를 위해, 적어도 하나의 전기화학적 측정 장치는 하나 이상의 전기화학적 측정을 수행하도록 구성된 하나 이상의 전기 장치를 포함할 수 있다. 예로서, 전기화학적 측정 장치는 적어도 하나의 전극, 적어도 하나의 전원, 예컨대 일정한 전압원, 가변 전압원, 일정한 전류원, 가변 전류원, 주기적 전류 신호를 생성하기 위한 주파수 발생기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 전원을 포함할 수 있다. 또한, 전기화학적 측정 장치는 전압 측정 장치, 전류 측정 장치, 전위차계로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 전기 측정 장치와 같은 적어도 하나의 전기 신호 또는 전기 측정 변수를 측정하도록 구성된 적어도 하나의 전기 측정 장치를 포함할 수 있다. 다른 측정 장치도 또한 실현가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "전기화학적 측정" 은 일반적으로 산화 환원 반응의 적어도 하나의 측정가능한 특징의 측정을 지칭할 수 있다. 산화 환원 반응의 전기화학적 측정 및/또는 측정가능한 특징은 예로서 전류, 전압, 전위, 질량, 예를 들어 전극 상에 증착된 질량, 임피던스, 특히 실제 부분 및/또는 임피던스의 허수 부분을 함축할 수 있다.
구체적으로, 전기화학적 측정은 전기활성 종의 존재 하에 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "전기활성 종" 은 일반적으로, 예를 들어 전자 이동을 용이하게 함으로써 산화 환원 반응을 촉진시키거나 향상시키거나 촉매화시키는 화합물을 지칭할 수 있다. 전기활성 종은 유체 샘플에 용해될 수 있고/있거나 분석물 검출기의 표면에 고정될 수 있으며, 표면은 유체 샘플에 노출될 수 있다. 특히, 표면은 상기 언급된 감지 표면 및/또는 다목적 전극의 상기 언급된 표면일 수 있다. 전기활성 종의 바람직한 예는 산화 환원 매개체, 구체적으로 산화 환원 커플, 예컨대 제한 없이 칼륨 페리시아나이드/칼륨 페로시아나이드; 헥사아민루테늄 (II) 클로라이드/헥사아민루테늄 (III) 클로라이드; 페로센 메탄올이다. 전기활성 종의 추가의 바람직한 예는 아스코르브산, 글루타티온, 리포산, 요산, 옥살산, 탄닌 및 피트산과 같은 환원제이지만 이에 제한되지는 않는다. 전기활성 종은 산화 환원 반응의 적어도 하나의 측정가능한 특징의 측정을 촉진하거나 향상킬 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 전기화학적 측정은 엘리먼트, 예를 들어 전극의 전기적 특성의 직접적 또는 간접적 검출을 지칭할 수 있으며, 여기서 전기적 특성은 화학 반응 및/또는 전자의 전달에 의해 및/또는 원자 또는 분자의 결합에 의해 영향을 받거나 좌우된다. 구체적으로, 전기적 특성은 참여자 중 적어도 하나의 산화 상태의 변화를 포함하는 화학 반응에 의해 영향을 받거나 좌우될 수 있다. 전기적 특성은 예를 들어 엘리먼트의 전기화학적 전위 및/또는 전기화학적 전위의 변화, 엘리먼트의 전위 및/또는 전위의 변화, 엘리먼트에 인가된 전압 및/또는 전압의 변화 및/또는 엘리먼트에 축적된 전하량일 수 있다. 엘리먼트의 전기적 특성의 직접 또는 간접 측정은 엘리먼트의 전기적 특성에 의해 야기되는 및/또는 영향을 받는 전기장 효과에 기초할 수 있다. 따라서, 구체적인 예로서, 화학 반응은 엘리먼트의 산화 상태를 변화시킬 수 있다. 엘리먼트의 산화 상태의 변화는 전기장 효과를 통한 전기화학적 측정에서 측정될 수 있으며, 이는 엘리먼트의 산화 상태가 기여할 수 있다. 따라서, 엘리먼트의 산화 상태 변화의 검출은 예를 들어 전계 효과 트랜지스터를 사용하여 검출될 수 있다. 특히, 엘리먼트의 전기적 특성은 전계 효과 트랜지스터의 게이트 전압에 영향을 미침으로써 전계 효과 트랜지스터의 소스 전극과 드레인 전극 사이의 전류에 영향을 줄 수 있다.
본원에 사용된 용어 "변환기" 는 에너지를 하나의 형태에서 다른 형태로 전환하도록 구성되고/되거나 입력 신호, 특히 적용된 전류, 전압 또는 전위와 같은 전기 신호를, 상응하는 출력 신호로 전환하도록 구성되고, 여기서 출력 신호의 형태는 입력 신호의 형태와 상이한, 임의의 종류의 기능적 구성요소 또는 기능적 구성요소의 배열을 지칭한다. 따라서, 변환기는 입력 신호로서 다른 전기 신호, 예를 들어 인가된 전압 또는 전위를 받은 후 출력 신호로서 하나의 형태, 예를 들어 전류의 전기 신호를 생성하도록 구성될 수 있다. 구체적으로, 변환기는 전계 효과 트랜지스터 및/또는 전기화학적 측정 장치일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 변환기가 전계 효과 트랜지스터로서 구현되는 경우, 입력 신호는 게이트 전극에 의해 전계 효과 트랜지스터의 채널에 인가되는 전압 또는 전위일 수 있으며, 이는 센서 표면 상에서 하전된 종의 결합에 의해 변형될 수 있는 반면, 출력 신호는 전계 효과 트랜지스터의 소스 전극과 드레인 전극 사이의 드레인 전류 Id 일 수 있다. 변환기가 전기화학적 측정 장치로서 구현되는 경우, 입력 신호는 산화 환원 반응의 적어도 하나의 측정가능한 특성일 수 있다.
본 발명은 일반적으로 유체 샘플에서 적어도 하나의 분석물을 결정하기 위한 본 발명의 분석물 검출기의 사용을 고려한다. 전형적으로, 유체 중 적어도 하나의 분석물의 상기 결정은 진단 목적, 환경 모니터링 및 관리, 식품 안전, 품질 관리 또는 제조 공정에 관여된다.
분석물의 검출은 전형적으로 다양한 상이한 프로세스에서 중요한 역할을 한다. 이것은 질병 또는 다른 의학적 상태의 진단을 도울 수 있는 대상체의 분석물 변화의 진단에 사용될 수 있다. 게다가, 분석물의 분석은 환경 모니터링, 예를 들어 오염도의 변화를 검출하는데 유용할 수 있다. 그러나, 생산, 식품 안전 및 일반적인 품질 관리 프로세스는 전형적으로 분석물의 검출을 필요로 한다. 따라서, 본 발명에 따른 분석물 검출기는 임의의 이러한 프로세스에 사용될 수 있으며, 전형적으로 추가 자동화를 가능하게 한다.
게다가, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 적어도 하나의 분석물을 측정하는 방법을 포함한다:
(a) 적어도 하나의 분석물을 포함하는 것으로 의심되는 유체 샘플을 본 발명의 전극 또는 본 발명의 분석물 검출기와 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 전극 또는 검출기로 전기화학적 측정을 수행함으로써, 적어도 하나의 분석물이 결정될 것인 단계.
이러한 맥락에서 사용되는 용어 "결정하기" 는 정량적 결정, 즉 양의 결정 뿐만 아니라 정성적 결정, 즉 분석물의 존재 또는 부재의 결정을 지칭한다. 이러한 결정은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 전기화학적 측정을 수행함으로써, 예를 들어 본 발명의 분석물 검출기를 사용하여 수행될 수 있다. 전기화학적 측정의 결과에 기초하여, 적어도 하나의 분석물은 상기 언급된 바와 같이 결정될 수 있다.
전기화학적 측정은 원칙적으로 분석물을 전극 상의 검출제에 결합시키는 것을 허용하는 표준 조건 하에서 수행될 수 있다. 이러한 표준 조건은 전형적으로 유체 샘플의 어는점보다 높은 온도 및 비점보다 낮은 온도를 포함할 수 있다. 일부 적용에서, 온도는 실온 범위 내의 온도일 것이다. 그러나, 더욱 전형적으로, 전기화학적 측정은 30℃ 내지 40℃ 의 온도, 바람직하게는 적어도 30℃, 적어도 32℃, 적어도 35℃ 또는 적어도 37℃ 의 온도에서 수행된다. 본 발명에 기초한 연구에서 측정이 약 37℃ 에서 수행될 경우 강한 신호 향상이 달성될 수 있으며, 이는 21℃ 에 비해 3 배 더 낮은 검출 한계를 초래한다는 것이 밝혀졌다.
전기활성 종의 존재하에 전기화학적 측정을 수행하는 것은 예를 들어 신호 향상을 위해 수행될 수 있다. 전기활성 종은 분석물 용액에 용해되거나 표면에 고정될 수 있다. 전형적인 전기활성 종은 다음과 같다: 산화 환원 커플, 예컨대 포타슘 페리/페로시아나이드, 헥사암민류테늄 (II) 및 (III) 클로라이드, 페로센 메탄올; 아스코르브산, 글루타티온, 리포산, 요산, 옥살산, 탄닌, 피트산과 같은 환원제. 전기화학적 또는 트랜지스터-기반 측정을 수행하는 것은 전형적으로, 신호 향상을 위해 표면-결합 분석물에 부착된 2 차 수용체의 존재 하에 수행될 수 있다. 2 차 수용체는 그 자체로 신호 및/또는 선택성을 향상시킬 수 있거나 효소와 같은 추가 분자로 표지될 수 있다. 신호 향상 분자는 예를 들어, 기판과의 상호작용을 통해 양성자 또는 전자와 같은 센서에 의해 직접 측정가능한 종의 농도 변화를 생성할 수 있다.
본 발명은 프로그램이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행될 때 본 명세서에 포함된 하나 이상의 구현예에서 본 발명에 따른 전술한 방법을 수행하기 위한 컴퓨터-실행가능 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램을 추가로 개시하고 제안한다. 구체적으로, 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터-판독가능 데이터 캐리어 상에 저장될 수 있다. 따라서, 구체적으로, 전술한 바와 같은 방법 단계 c) 및 d) 중 하나, 하나 이상, 또는 심지어 모든 단계는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크를 사용하여, 바람직하게는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행 및/또는 제어 및/또는 평가될 수 있다.
본 발명은 프로그램이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행될 때 본 명세서에 포함된 하나 이상의 구현예에서 본 발명에 따른 전술한 방법을 수행하기 위한 프로그램 코드 수단을 갖는 컴퓨터 프로그램 제품을 추가로 개시하고 제안한다. 구체적으로, 프로그램 코드는 컴퓨터-판독가능 데이터 캐리어 상에 저장될 수 있다.
또한, 본 발명은, 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크의 작업 메모리 또는 메인 메모리와 같은 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크에 로딩한 후, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 구현예에 따른 전술한 방법을 실행할 수 있는 데이터 구조가 저장된 데이터 캐리어를 개시하고 제안한다.
본 발명은 프로그램이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행될 때 본 명세서에 포함된 하나 이상의 구현예에 따른 전술한 방법을 수행하기 위한 기계-판독가능 캐리어에 저장된 프로그램 코드 수단을 갖는 컴퓨터 프로그램 제품을 추가로 개시하고 제안한다. 본원에 사용된 컴퓨터 프로그램 제품은 프로그램을 거래가능한 제품으로 지칭한다. 제품은 일반적으로 종이 형식과 같은 임의의 형식으로 또는 컴퓨터-판독가능 데이터 캐리어 상에 존재할 수 있다. 구체적으로, 컴퓨터 프로그램 제품은 데이터 네트워크를 통해 분배될 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 구현예에 따른 전술한 방법을 수행하기 위해 컴퓨터 시스템 또는 컴퓨터 네트워크에 의해 판독가능한 명령을 포함하는 변조된 데이터 신호를 제안하고 개시한다.
바람직하게는, 본 발명의 컴퓨터로 구현된 양태를 참조하면, 여기에 개시된 하나 이상의 구현예에 따른 전술한 방법의 하나 이상의 방법 단계 또는 심지어 모든 방법 단계는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크를 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 일반적으로, 데이터의 제공 및/또는 조작을 포함하는 임의의 방법 단계는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크를 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 이들 방법 단계는 실제 측정 수행의 특정 양태 및/또는 샘플 제공과 같은 수동 작업을 필요로 하는 방법 단계를 제외하고는 임의의 방법 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 다음을 추가로 개시한다:
- 적어도 하나의 프로세서를 포함하는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크, 프로세서는 전술한 구현예 중 하나에 따른 방법을 수행하도록 적응됨,
- 데이터 구조가 컴퓨터에서 실행되는 동안 전술한 구현예 중 하나에 따른 방법을 수행하도록 적응된 컴퓨터 적재가능 데이터 구조,
- 컴퓨터 프로그램, 프로그램이 컴퓨터에서 실행되는 동안 본원에서 전술한 구현예 중 하나에 따른 상술된 방법을 수행하도록 적응된 컴퓨터 프로그램,
- 컴퓨터 프로그램이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크에서 실행되는 동안 본원에서 전술한 구현예 중 하나에 따른 상술된 방법을 수행하기 위한 프로그램 수단을 포함하는 컴퓨터 프로그램,
- 상기 구현예에 따른 프로그램 수단을 포함하는 컴퓨터 프로그램, 프로그램 수단은 컴퓨터에 판독가능한 저장 매체에 저장됨,
- 저장 매체, 데이터 구조는 저장 매체 상에 저장되고, 데이터 구조는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크의 주 및/또는 작업 저장소에 로딩된 후에 전술된 구현예 중 하나에 따른 상술된 방법을 수행하도록 적응됨, 및
- 프로그램 코드 수단을 갖는 컴퓨터 프로그램 제품, 프로그램 코드 수단이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크에서 실행되는 경우, 프로그램 코드 수단은 전술한 구현예 중 하나에 따른 상술된 방법을 수행하기 위해 저장 매체에 저장되거나 저장될 수 있음.
다음의 전형적인 구현예는 본 발명을 추가로 설명할 것이지만, 제한으로서 해석되지 않아야 한다:
1. 유체 샘플에 노출될 수 있는 기능화된 표면을 포함하는 전극으로서, 상기 기능화된 표면은 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체 및 유체 샘플에 포함된 분석물에 결합하는 적어도 하나의 검출제를 포함하며, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체 및 상기 적어도 하나의 검출제는 전극의 표면에 분포되어, 검출제가 전극 표면 전체의 표면적 당 본질적으로 동일한 양으로 존재하고 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체가 하기와 같은 양으로 존재하는 검출제 주위에 배열되도록 하는 전극:
i) 검출제에 근접한 유체의 이온 강도의 감소를 허용하는 양, 및
ii) 유체 샘플에 포함된 분석물을 결합시키는 것을 허용하는 양.
2. 제 1 구현예에 있어서, 상기 전극이 그래핀, 탄소 나노튜브, 탄소, 실리콘 나노와이어, 몰리브덴 산화물, 몰리브덴 이황화물, 티타늄 산화물, 아연 산화물, 금속 산화물, 갈륨 질화물, 금, 은, 백금, 실리콘, 자성 비드, 나노입자 또는 이들 물질의 임의의 조합을 포함하는 전극.
3. 제 1 또는 제 2 구현예에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체의 크기는 Debye 길이가 증가되고 적어도 하나의 검출 분자 주위의 이온 강도가 감소되도록 하는 것인 전극.
4. 제 3 구현예에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체의 분자량 (MW) 이 1 내지 100 kDa, 10 내지 100 kDa, 10 내지 50 kDa, 10 내지 25 kDa, 10 내지 20 kDa 또는 10 내지 15 kDa 인 전극.
5. 제 1 내지 제 4 구현예 중 어느 하나에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 상기 언급된 중합체의 공중합체, 다당류, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 폴리실록산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 전극.
6. 제 1 내지 제 5 구현예 중 어느 하나에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체가 링커를 통해 전극의 표면에 고정되거나 추가의 링커없이 작용기를 통해 직접 부착되는 전극.
7. 제 6 구현예에 있어서, 상기 링커가 하기 구조를 갖는 링커인 전극:
여기서 A 는 하기 부류: 티올, 실란, 포스폰산, 방향족 분자 (예를 들어, 피렌), 카르복실, 아민, NHS 에스테르, 말레이미드로부터의 제 1 작용기이고,
B 는 하기 부류: 상기 기재된 부류로부터의 저분자량 중합체, 탄화수소 (예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 페닐), 산소 함유 기 (예를 들어, 에테르), 할로알칸 (예를 들어, 클로로), 질소 함유 기 (예를 들어, 아미드), 황 함유 기 (예를 들어, 설폭사이드), 인 함유 기, 붕소 함유 기, 또는 짧은 무기 중합체 사슬 (예를 들어, Si-계 (실록산), P-계, B-계, S-계) 로부터의 짧은 유기 사슬이고,
C 는 하기 부류: 카르복실, 아민, NHS 에스테르, 말레이미드로부터의 제 2 작용기임.
8. 제 1 내지 제 7 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 검출제가 유체 샘플에 포함되는 분석물에 특이적으로 결합되는 전극.
9. 제 6 구현예에 있어서, 상기 적어도 하나의 검출제가 항체 및 이의 단편, 핵산, 앱타머, 펩티드 핵산 (PNA), 수용체 또는 리간드 단백질 또는 펩티드 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 전극.
10. 제 1 내지 제 9 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 검출제의 크기는 검출제가 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체에 의해 둘러싸이는 정도의 것인 전극.
11. 제 1 내지 제 10 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 검출제가 링커를 통해 전극의 표면에 고정되는 전극.
12. 제 11 구현예에 있어서, 상기 링커가 제 7 항에 정의된 바와 같은 링커인 전극.
13. 제 11 구현예에 있어서, 상기 링커가 0.01 내지 5, 0.01 내지 1.0, 0.01 내지 0.5 또는 0.1 내지 0.5 kDa 의 MW 를 갖는 저분자량 (MW) 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 및 상기 언급된 중합체의 공중합체인 전극.
14. 제 13 구현예에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체가 링커 중합체와 동일한 부류의 중합체인 전극.
15. 제 1 내지 제 14 구현예 중 어느 하나에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체 및 기능화된 표면 상에 존재하는 적어도 하나의 검출제의 몰비가 1:100 내지 100:1, 1:50 내지 50:1, 1:20 내지 20:1, 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 5:1, 2:10 내지 8:1, 3:10 내지 7:1, 4:10 내지 6:1 또는 5:10 내지 5:1 인 전극.
16. 하기 단계를 포함하는 전극 상에 기능화된 표면을 제조하는 방법:
a) 링커 및 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체를, 전극 표면 상의 상기 링커 및 상기 중합체의 공유 또는 비-공유 고정화를 허용하는 조건 하에서, 전극에 적용하는 단계; 및
b) 상기 링커 및 상기 중합체의 고정화 시 적어도 하나의 검출제를 고정된 링커를 통해 상기 적어도 하나의 검출 분자의 전극에 대한 공유 또는 비-공유적 부착을 허용하는 조건 하에서, 전극에 적용하는 단계;
이때, 조건은 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체 및 상기 적어도 하나의 검출제를 전극 표면 상에 분포시켜서 검출제가 전극 표면 전체의 표면적 당 동일한 양으로 존재하고 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체가 하기와 같은 양으로 존재하는 검출제 주위에 배열되도록 함:
i) 검출제에 근접한 유체의 이온 강도의 감소를 허용하는 양, 및
ii) 유체 샘플에 포함된 분석물을 결합시키는 것을 허용하는 양.
17. 제 16 구현예에 있어서, 상기 링커가 0.01 내지 5, 0.01 내지 1.0, 0.01 내지 0.5 또는 0.1 내지 0.5 kDa 의 MW 를 갖는 저분자량 (MW) 중합체이고, 상기 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 또는 상기 언급된 중합체의 공중합체인 방법.
18. 제 16 또는 제 17 구현예에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 및 상기 언급된 중합체의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
19. 제 17 또는 제 18 구현예에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체가 링커 중합체와 동일한 부류의 중합체인 방법.
20. 제 16 내지 제 19 구현예 중 어느 하나에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체 및 기능화된 표면 상에 존재하는 적어도 하나의 검출제의 몰비는 1:100 내지 100:1, 1:50 내지 50:1, 1:20 내지 20:1, 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 5:1, 2:10 내지 8:1, 3:10 내지 7:1, 4:10 내지 6:1 또는 5:10 내지 5:1 인 방법.
21. 제 1 내지 제 15 구현예 중 어느 하나의 전극 또는 제 16 내지 제 20 구현예 중 어느 하나의 방법에 의해 수득가능한 전극을 포함하는 적어도 하나의 분석물을 측정하기 위한 분석물 검출기로서, 상기 전극이 변환기와 전기적으로 접촉하거나 또는 변환기의 일부인 분석물 검출기.
22. 유체 샘플에서 적어도 하나의 분석물을 측정하기 위한, 제 21 구현예의 분석물 검출기의 용도.
23. 하기 단계를 포함하는, 적어도 하나의 분석물을 측정하는 방법:
(a) 적어도 하나의 분석물을 포함하는 것으로 의심되는 유체 샘플을 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 전극 또는 제 21 항의 분석물 검출기와 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 전극 또는 검출기로 전기화학적 측정을 수행함으로써, 적어도 하나의 분석물이 결정될 것인 단계.
24. 제 23 구현예에 있어서, 상기 전기화학적 측정이 30℃ 내지 40℃ 의 온도, 바람직하게는 적어도 30℃, 적어도 32℃, 적어도 35℃ 또는 적어도 37℃ 의 온도에서 수행되는 방법.
25. 유체 중 적어도 하나의 분석물의 결정은 진단 목적, 환경 모니터링 및 관리, 식품 안전, 품질 관리 또는 제조 공정에 관여되는, 제 22 구현예의 용도 또는 제 23 또는 제 24 구현예의 방법.
26. 유체 샘플이 액체 또는 용해된 환경 샘플 또는 적어도 하나의 화학적 화합물의 용액인, 제 1 내지 제 15 구현예 중 어느 하나의 전극, 제 16 내지 제 20 구현예 중 어느 하나의 방법 또는 제 22 구현예의 용도 또는 제 23 또는 제 24 구현예의 방법 또는 제 25 구현예의 용도 또는 방법.
27. 유체가 높은 이온 강도 유체인, 제 1 내지 제 15 구현예 중 어느 하나의 전극, 제 16 내지 제 20 구현예 중 어느 하나의 방법 또는 제 22 구현예의 용도 또는 제 23 또는 제 24 구현예의 방법 또는 제 25 구현예의 용도 또는 방법.
28. 제 27 구현예에 있어서, 상기 유체가 체액인 전극, 방법 또는 용도.
28. 제 28 구현예에 있어서, 상기 체액이 혈액, 혈장, 혈청 또는 이의 임의의 분획, 타액, 눈물, 점액, 림프, 뇌척수액, 소변, 대변, 땀, 정액, 활액으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 전극, 방법 또는 용도.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 본 명세서에 구체적으로 언급된 본 명세서 전체 내용 및 본 명세서 내용과 관련하여 본원에 참고로 포함된다.
도 1: 수정 진동자 저울 (Quartz Crystal Microbalance) 에 의한 표면 특성분석. (a) QCM 칩의 도식. (b-c) 전형적인 주파수 및 소실 변화 대 상이한 배음 (n = 5, 7, 9) 에 대한 시간 및 표면 개질: dsDNA (b), PEG (c) 및 두 가지의 믹스 (d) 를 나타내는 대표적인 데이터 세트. 일반적으로, 분자의 흡착에 따라 주파수가 감소하는 반면 소실은 증가한다. (e-f) 적어도 3 개의 칩에서 얻은 소실 및 주파수 변화에 대한 요약. 소실 증가는 PEG 에 대해 3 배를 초과하여 강한데, 이것이 DNA 보다 부드럽기 때문이다 (e). 이것은 또한 PEG-변형된 표면에 대한 배음의 "확산" 으로 보여진다 (f).
도 2: FET 측정. (a) QCM 칩의 금 표면이 공간적으로 분리된 상용 MOSFET 에 연결된, 확장-게이트 FET 구성의 도식. (b-d) 상이한 표면: 극소량의 금 (b), dsDNA (c) 및 DNA + PEG 믹스 (e) 를 사용하여 상이한 농도의 PBS 완충액으로 기록된 전형적인 전달 곡선. (d) 3 가지 상이한 표면에 대한 잠재적 변화 대 PBS 농도. 델타 V 는 비-특이적 이온 흡착 (배경) 으로 인해 금에 더 양성이 된다. 표면에 DNA 가 있으면, DNA 스크리닝의 효과가 중첩되어 양의 값으로의 뚜렷한 이동이 줄어든다. 믹스 층에 대해 반대 경향이 관찰된다.
도 3: (a) 금 배경을 뺀 후 도 2 로부터의 FET 데이터. 전해질 이온에 의한 DNA 스크리닝이 더 강력하기 때문에, PBS 농도가 증가함에 따라 전위는 더 많은 음의 값으로 이동한다. PEG + DNA 믹스 대 극소량의 DNA 에 대해 명확한 신호 향상이 관찰된다. (b) 제안된 모델: PEG 의 첨가는 유효한 Debye 길이를 증가시킨다. 결과적으로, 주어진 이온 강도에서 대부분의 DNA 를 볼 수 있어 더 큰 신호로 이어진다.
도 4: (A) 측정 설정의 도식. 반전도성 CNT (탄소 나노튜브) 네트워크는 서로 맞물린 Au 전극 (채널 길이 = 20 μm, 채널 너비 = 2 mm) 사이에 정렬된다. 부가적으로는, 누설 전류를 피하기 위해 SU-8 포토레지스트로 접점을 패시베이션한다. SU-8 은 IBM 이 처음 개발하여, 특허를 획득한 (미국 특허 번호 4882245) EPON SU-8 에폭시 수지 (Shell Chemical) 를 기반으로 하는 네거티브, 에폭시형, 근자외선 포토레지스트이다. 감지 표면에 상이한 액체를 제공하기 위해, PTFE 튜브가 있는 미세유체 PDMS 챔버가 사용되었다. Ag/AgCl 참고 전극은 미세유체 채널의 중간에 위치한다. (B) 측정 설정의 사진. (C) 두 편광 방향의 전형적인 전송 곡선. 이력현상은 매우 작다. (D) 전기장 정렬 CNT 네트워크의 AFM 이미지. 상단과 하단의 가로 줄무늬는 CNT 를 정렬하는 데 사용되는 금 전극이다. 동일한 전극이 나중에 전기 측정을 위한 소스 및 드레인 접점으로 사용되었다.
도 5: PEG화된 (A-C) 및 비-PEG화된 CNT FET (D-F) 를 사용한 GFP 검출의 비교. CNT 의 표면은 피렌 부티르산 (PBA) 과 피렌 폴리(에틸렌 글리콜) (A) 의 혼합물 또는 PBA 만 (D) 으로 변형되었다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 에 특이적인, 낙타과 나노바디 (VHH) 를 양쪽 표면에 고정시키고 GFP 용액에 노출시켜 VHH-GFP 결합을 평가하였다. B 및 E 는 100 mM Tris 완충액에서 상이한 농도의 GFP 로 측정된 전달 곡선을 보여준다. PEG화된 경우에서 강한 반응을 보이는 두 경우 모두 오른쪽으로의 이동이 보인다 (B). C 및 F 는 1 mM 및 100 mM 이온 강도 용액에서 GFP 농도 CGFP 의 함수로 얻은 전위 이동 ΔV 를 요약한다. 도 B, E 에서의 수평선에 의해 표시되는 바와 같이, 일정한 ISD 값에서 ΔV 를 판독하였다. C 의 신호는 F 의 신호보다 최대 3 배 더 크며, 이는 PEG 에 의한 로컬 완충액 희석으로 인한 것이다.
도 6: 금에 대한 2 개의 상이한 표면 변형을 (A) 와 10 kDa PEG 없이 (D) 비교하였다. 두 표면 모두 짧은 0.5 kDa PEG 링커를 사용하여 항-TSH 항체 단편으로 기능화되었다. 10 mM 완충액에서 상이한 BSA 및 TSH 농도에 대한 트랜지스터 전달 곡선은 각각 PEG 를 포함하거나 포함하지 않는 표면에 대해 (B) 및 (E) 에 도시되어 있다. 측정된 전압 이동은 PEG 가 있는 표면의 경우 (C) 와 PEG 가 없는 표면의 경우 (F) 로 표시된다. 10 mM (삼각형) 및 150 mM 완충액 (사각형) 에서 TSH (채워진 기호) 또는 BSA (열린 기호) 의 농도에 대한 이동을 도시한다. 심지어 150 mM 완충액에서도 상당한 반응으로 PEG 에서 명확한 신호 향상이 관찰된다. BSA 의 비-특이적 흡착의 기여는 모든 경우에 적다.
도 7: 21℃ 및 37℃ 에서 말 혈청에서 TSH 교정 곡선을 측정하였다. 오차 막대는 4 가지 상이한 칩으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
도 2: FET 측정. (a) QCM 칩의 금 표면이 공간적으로 분리된 상용 MOSFET 에 연결된, 확장-게이트 FET 구성의 도식. (b-d) 상이한 표면: 극소량의 금 (b), dsDNA (c) 및 DNA + PEG 믹스 (e) 를 사용하여 상이한 농도의 PBS 완충액으로 기록된 전형적인 전달 곡선. (d) 3 가지 상이한 표면에 대한 잠재적 변화 대 PBS 농도. 델타 V 는 비-특이적 이온 흡착 (배경) 으로 인해 금에 더 양성이 된다. 표면에 DNA 가 있으면, DNA 스크리닝의 효과가 중첩되어 양의 값으로의 뚜렷한 이동이 줄어든다. 믹스 층에 대해 반대 경향이 관찰된다.
도 3: (a) 금 배경을 뺀 후 도 2 로부터의 FET 데이터. 전해질 이온에 의한 DNA 스크리닝이 더 강력하기 때문에, PBS 농도가 증가함에 따라 전위는 더 많은 음의 값으로 이동한다. PEG + DNA 믹스 대 극소량의 DNA 에 대해 명확한 신호 향상이 관찰된다. (b) 제안된 모델: PEG 의 첨가는 유효한 Debye 길이를 증가시킨다. 결과적으로, 주어진 이온 강도에서 대부분의 DNA 를 볼 수 있어 더 큰 신호로 이어진다.
도 4: (A) 측정 설정의 도식. 반전도성 CNT (탄소 나노튜브) 네트워크는 서로 맞물린 Au 전극 (채널 길이 = 20 μm, 채널 너비 = 2 mm) 사이에 정렬된다. 부가적으로는, 누설 전류를 피하기 위해 SU-8 포토레지스트로 접점을 패시베이션한다. SU-8 은 IBM 이 처음 개발하여, 특허를 획득한 (미국 특허 번호 4882245) EPON SU-8 에폭시 수지 (Shell Chemical) 를 기반으로 하는 네거티브, 에폭시형, 근자외선 포토레지스트이다. 감지 표면에 상이한 액체를 제공하기 위해, PTFE 튜브가 있는 미세유체 PDMS 챔버가 사용되었다. Ag/AgCl 참고 전극은 미세유체 채널의 중간에 위치한다. (B) 측정 설정의 사진. (C) 두 편광 방향의 전형적인 전송 곡선. 이력현상은 매우 작다. (D) 전기장 정렬 CNT 네트워크의 AFM 이미지. 상단과 하단의 가로 줄무늬는 CNT 를 정렬하는 데 사용되는 금 전극이다. 동일한 전극이 나중에 전기 측정을 위한 소스 및 드레인 접점으로 사용되었다.
도 5: PEG화된 (A-C) 및 비-PEG화된 CNT FET (D-F) 를 사용한 GFP 검출의 비교. CNT 의 표면은 피렌 부티르산 (PBA) 과 피렌 폴리(에틸렌 글리콜) (A) 의 혼합물 또는 PBA 만 (D) 으로 변형되었다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 에 특이적인, 낙타과 나노바디 (VHH) 를 양쪽 표면에 고정시키고 GFP 용액에 노출시켜 VHH-GFP 결합을 평가하였다. B 및 E 는 100 mM Tris 완충액에서 상이한 농도의 GFP 로 측정된 전달 곡선을 보여준다. PEG화된 경우에서 강한 반응을 보이는 두 경우 모두 오른쪽으로의 이동이 보인다 (B). C 및 F 는 1 mM 및 100 mM 이온 강도 용액에서 GFP 농도 CGFP 의 함수로 얻은 전위 이동 ΔV 를 요약한다. 도 B, E 에서의 수평선에 의해 표시되는 바와 같이, 일정한 ISD 값에서 ΔV 를 판독하였다. C 의 신호는 F 의 신호보다 최대 3 배 더 크며, 이는 PEG 에 의한 로컬 완충액 희석으로 인한 것이다.
도 6: 금에 대한 2 개의 상이한 표면 변형을 (A) 와 10 kDa PEG 없이 (D) 비교하였다. 두 표면 모두 짧은 0.5 kDa PEG 링커를 사용하여 항-TSH 항체 단편으로 기능화되었다. 10 mM 완충액에서 상이한 BSA 및 TSH 농도에 대한 트랜지스터 전달 곡선은 각각 PEG 를 포함하거나 포함하지 않는 표면에 대해 (B) 및 (E) 에 도시되어 있다. 측정된 전압 이동은 PEG 가 있는 표면의 경우 (C) 와 PEG 가 없는 표면의 경우 (F) 로 표시된다. 10 mM (삼각형) 및 150 mM 완충액 (사각형) 에서 TSH (채워진 기호) 또는 BSA (열린 기호) 의 농도에 대한 이동을 도시한다. 심지어 150 mM 완충액에서도 상당한 반응으로 PEG 에서 명확한 신호 향상이 관찰된다. BSA 의 비-특이적 흡착의 기여는 모든 경우에 적다.
도 7: 21℃ 및 37℃ 에서 말 혈청에서 TSH 교정 곡선을 측정하였다. 오차 막대는 4 가지 상이한 칩으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
실시예
본 발명은 실시예에 의해 설명될 것이다. 그러나, 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것이지, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 폴리에틸렌 글리콜은 트랜지스터-기반 DNA 검출에서 Debye 스크리닝의 영향을 감소시킨다
QCM-D 측정: 이들을 전기화학 모듈을 사용하여 Biolin Scientific AB (Stockholm, Sweden) 의 Q-sense E4 로 수행하였다. QCM-D 는 상이한 배음에서, 4.95 MHz, 금으로 코팅된 QCM-D 센서 상의, 발진기 주파수의 이동 (Δf) 및 에너지 소실 (ΔD) 을 동시에 모니터링한다. 또한, Q-sense 의 전기화학 모듈을 통해 동시 FET 측정이 가능하다. 사용하기 전에, 금으로 코팅된 센서를 10 분 동안 UV/오존 처리로 세척한 다음, 80℃ 에서 10 분 동안 1 부 H2O2 (30%) + 1 부 NH4OH + 5 부 탈이온수 (DI) 를 함유하는 용액에 담그었다. 이어서 센서를 탈이온수로 광범위하게 세척하고 N2 가스로 건조시켰다. 모든 실험은 새로 세정한 센서를 사용하여 수행되었다.
확장-게이트 FET 측정: QCMD 실험에 사용된 전기화학 모듈은 금으로 코팅된 센서를 상업용 MOSFET 의 게이트 단자에 전기적으로 연결할 수 있었다. Ag/AgCl 기준 전극 (WPI, Dri-REF™, 맞춤형 길이) 이 출구 흐름 채널의 센서 표면 근처에 배치된다. 전기 측정은 듀얼-채널 소스미터 (Keithley 2636B) 를 사용하여 수행되었다.
dsDNA 준비 및 고정화: 상보적 단일-가닥 DNA (i): 5'-CAATGCAGATACACTTTTTT-C3H6-SH-3' (ii): 5'-AGTGTATCTGCATTG-3' 를 STAB vida, Portugal 에서 구입하였다. 가닥 (i) 은 금 표면에 고정화를 촉진하기 위해 티올화된다. 평균 분자량이 10 kDa 인 티올화된 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG-SH) 을 Nanocs, Inc. (Boston, MA) 에서 구입하였다. 달리 명시되지 않는 한, 다른 모든 시약은 Sigma-Aldrich 에서 구입하였다.
(A) dsDNA, (B) PEG 및 (C) 믹스 dsDNA-PEG 층의 형성: QCM-D 및 FET 측정 모두에 의해 모든 3 개의 상이한 표면의 형성을 모니터링하였다. 티올화된 이중 가닥 DNA (dsDNA) 는 매 실험 전에, 실온에서 100 mM PBS 에서 30 분 동안 가닥 (i) 및 (ii) 의 등몰 용액 (-20℃ 에 저장된 100 μM 저장 용액 각각 10 ㎕) 을 혼합함으로써 형성되었다. 그리고 매 실험 전에, PEG 분말을 물에 용해시킴으로써 티올화된 mPEG 용액 (5 mM) 을 제조하였다. (A) dsDNA SAM: 완충액 A (1 M NaCl, 10 mM Tris pH 7 중 1 mM EDTA) 에 1 μM 티올화된 dsDNA 를 10 분 동안 100 ㎕/분으로 주입하여 금 코팅된 QCM-D 센서에 dsDNA 의 단층을 형성한 다음, 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 표면을 완충액 A 로 10 분 동안 100 ㎕/분으로 세척하였다. 과량의 dsDNA 를 세척해낸 후, 상이한 농도의 PBS 용액 (200 mM, 100 mM, 50 mM, 10 mM 및 1 mM) 을 챔버 (10 분 동안 100 ㎕/분) 에 주입하고 안정적인 신호가 달성될 때까지 FET 반응을 기록하였다. (B) PEG SAM: 1 μM 티올화된 mPEG (평균 MW = 10 kDa) 를 주입하여 PEG 단층을 형성한 것을 제외하고는 A 와 유사하다. (C) 믹스 dsDNA-PEG 층: 센서 표면을 1 μM 티올화된 dsDNA 로 인큐베이션함으로써 dsDNA 의 단층이 먼저 형성되었다. 그 후, 과량의 dsDNA 를 100 ㎕/분의 완충액 A 를 10 분 동안 흘려 세척하였다. 완충액 A 중의 1 uM mPEG-SH 를 챔버에 주입하고 20 분 동안 인큐베이션한 후 100 uL/분 완충액 A 를 10 분 동안 흘림으로써 비결합된 PEG 분자를 세척하여 PEG 를 dsDNA 의 단층에 첨가하였다. A 및 B 와 유사하게, 상이한 농도의 PBS 용액을 챔버에 주입하여 상이한 이온 강도 조건 하에서 믹스 층의 FET 반응을 모니터링하였다.
표면 특징분석: 금-코팅된 수정 상에 dsDNA, PEG, 및 믹스 dsDNA + PEG 층의 단층의 형성은 수정 진동자 저울 소실 (QCMD) 을 이용하여 특징분석하였다. QCMD 에서, 진동하는 압전 수정의 공명 주파수와 소실 에너지의 변화는 결정 표면의 질량 흡착에 따라 측정된다 (도 1a). 이들은 이후 흡착된 층의 점탄성 특성 뿐만 아니라 밀도, 질량 및 두께를 얻기 위해 사용된다. 도 1b-d 는 금 코팅 수정에 대해 (b) dsDNA, (c) PEG 및 (d) 믹스 dsDNA + PEG 층 고정화 시 상이한 배음 (n = 3 (도 1b ~ d 에 도시되지 않음), 5, 7, 9) 으로부터의 공진 주파수의 변화, Δf, 및 소실 계수의 변화 ΔD 를 보여준다. 각각의 층에 대한 3 개의 개별 시험으로부터 계산된 평균 ΔD 와 Δf 는 각각, 막대 그래프로 도 1e 및 f 에 도시되어 있다. PEG 의 경우 감지된 Δf (─Δf = 35-45 Hz) 가 dsDNA 의 것보다 두 배 미만임 (─Δf = 약 25 Hz) 에도 불구하고, 소실 변화는 약 6 배 더 크다는 것은 주목할 가치가 있다. 이는 dsDNA 가 표면에서 보다 단단한 층처럼 행동하는 반면 PEG 는 고정될 때 고도로 수화된 브러시와 같은 구조를 형성하는 것으로 알려져 있는 사실과 일치한다. 이것은 또한 모든 배음이 동일한 규모로 변경되는 dsDNA 와 비교하여 PEG 고정화시 Δf 와 ΔD 의 확산이 명백하다.
Voigt 점탄성 모델링은 모든 3 가지 상이한 층에 대한 QCMD 데이터를 피팅하고 형성된 층의 물리적 특성을 설명하는 파라미터를 얻는 데 사용된다. 피팅된 파라미터는 표 1 에 나열된다.
표 1: QCMD 결과의 Voigt 점탄성 모델링에서 파생된 파라미터
dsDNA 의 측정된 두께는 1 M NaCl 에서 약 5 nm 이며, 이는 15 개의 염기쌍 dsDNA (5 nm) + 링커 (1 nm) 의 예상 길이에 가깝다. 이는 dsDNA 분자가 수직으로 고정되어 표면에 평평하게 놓여 있지 않음을 나타낸다. PEG (10 kDa) 층은 1 μM PEG 가 고정화에 사용될 때 약 9 nm 에서 더 두껍다. 점탄성 모델링 결과는 또한 dsDNA 의 전단 점도 및 전단 모듈러스 (4.7 +/- 0.7 mPa·s 및 1.3 +/- 0.6 MPa, 각각) 가 PEG 의 것 (1.8 +/- 0.3 mPa·s 및 0.26 +/- 0.05 MPa, 각각) 보다 높다는 것을 보여준다. 이러한 점탄성 파라미터는 금 상의 dsDNA 가 PEG 와 비교하여 더 단단한 층을 형성함을 시사한다. 우리의 결과는 dsDNA 가 상당히 단단한 필름을 형성하는 반면 PEG 가 표면에 부드러운, 브러시 같은 구조를 형성하는 것으로 알려진 이전의 연구와 일치한다.
두 성분이 연속적으로 첨가된 믹스 층에서는 각 단계를 독립적으로 모델링할 수 있다. 표 1 에 도시된 바와 같이, dsDNA 가 먼저 고정되었기 때문에, 피팅 파라미터는 오직-dsDNA 층과 일치한다. 이러한 결과에 기초하여, 표면은 커버리지가 60% 인 것으로 추정된다. 이어서, 전기적으로 중성이며 dsDNA 분자 사이의 빈 공간에 잠재적으로 결합할 수 있는 PEG 를 첨가하였다. PEG 의 첨가시 소실 및 주파수 둘 다의 변화는 PEG 가 dsDNA 층에 성공적으로 첨가되어 혼합된 필름을 생성함을 입증하였다.
FET 측정: 모든 3 개의 상이한 표면을 특징화하는 데 사용된 QCMD 소자는 전기화학 모듈과 함께 제공되고, 이것은 확장 게이트 FET (EGFET) 구성을 사용하여 동일한 칩에서 FET 측정을 동시에 수행할 수 있게 한다. 상기 특정 EGFET 설정에서, QCM 칩의 금 표면은 상용 MOSFET의 게이트 단자에 전기적으로 연결된다 (도 2a). 생물학적 용액이 있는 감지 표면은 MOSFET 판독 트랜지스터에서 분리된다. 이는 감지 칩의 복잡성을 줄이고 통상의 이온-감지 FET 의 전하 감도를 유지하면서 판독 트랜지스터를 접점에서 솔루션까지 보호한다 (Tarasov 2016, 2D Mater. 2: 044008; Tarasov 2016, Biosens. Bioelectron. 79: 669). EGFET 측정을 통한 dsDNA 의 Debye 스크리닝에 대한 PEG 의 영향을 연구하기 위해, 금-고정화 dsDNA 에서 얻은 전달 곡선을 다른 이온 강도 용액 (1-200 mM PBS) 하에서, 믹스 dsDNA + PEG 층과 비교하였다 (도 2). 음성 대조군으로서, 이온 강도의 변화에 따라 오직-금 표면 반응도 측정되었다 (도 2b). MOSFET 의 전달 곡선은 PBS 농도가 증가함에 따라 더 양의 값으로 이동한다 (도 2b 및 2d). 이러한 양의 전위 이동은 Cl- 이온 및 금의 경우에 이전에 관찰된 바와 같이 금 표면에 흡착되는 음이온의 검출을 의미한다 (Tarasov 2012, ACS Nano 6: 9291).
dsDNA 의 존재 하에, 전달 곡선은 PBS 농도가 증가함에 따라 여전히 오른쪽으로 이동하지만 오직-Au 표면과 비교하여 더 낮은 정도로 이동한다 (도 2c 및 도 2d). 금에 대한 음이온 흡착이 없는 경우, dsDNA 검출에 대한 이온 강도 증가의 예상 효과는 보다 음의 값으로 전위를 이동시켜야 한다. 그러나, 이러한 배경 음이온 흡착으로 인해, 이온 강도가 증가함에 따라 양의 전위 이동이 여전히 관찰된다. 상이한 PBS 농도 하의 차등 신호 (V = VdsDNA - V오직-Au ) 는 따라서, dsDNA 측정에 대한 이온 스크리닝의 효과를 보기 위해 수득되었다. 한편, 믹스 층에서, PEG 의 존재는 dsDNA 상의 음전하의 검출을 더욱 뚜렷하게 만들었다. 이번에는 PBS 농도를 높이면 전위가 왼쪽으로 이동한다 (도 2e 및 도 2d). 배경 차감시, 신호의 이동은 PEG 의 존재 하에서 없는 것보다 더 높다.
이러한 트랜지스터-기반 측정은 일단 PEG 가 센서 표면에 존재하면 심지어 200 mM PBS 에서도, dsDNA 로부터 검출된 신호 향상이 있음을 보여준다. 이는 실험에 사용된 농도에서 PEG 가 심지어 생리학적 염 농도에서도 Debye 길이를 증가시킨다는 것을 나타낸다. 이는 PEG 가 특정 수성 염 용액에서 나타나는 염석 효과 때문일 수 있으며, 삼원 물 + PEG + 염 시스템의 조성 공간의 일부에 대한 PEG-풍부상 및 염-풍부상의 분리를 특징으로 한다. 이러한 PEG 의 "염석" 이온에 대한 경향은 PEG 분자를 바로 둘러싸는 영역에서 유효 이온 농도의 감소의 원인인 것으로 여겨진다. 따라서, 상기 "국부적으로-탈염된" 영역은 겉보기 이온 강도와 관련하여 비교적 높은 Debye 길이를 나타낼 것이다.
도 3a 는 PEG 가 센서 표면에서 dsDNA 와 혼합될 때 달성되는 신호 향상을 보여준다. 아래쪽 및 위쪽을 가리키는 삼각형은 각각 PEG 의 존재 및 부재에서 dsDNA 의 FET 신호의 이온 강도 의존성이다. 이것은 극소량의 금으로 측정된 배경 신호를 빼서 정규화한 도 2d 에서 제시되는 바와 동일한 데이터이다. 이 데이터는 PEG 가 존재하는 경우 (믹스) 신호가 적어도 3-4 배 향상되었음을 나타낸다. 도 3b 에 개략적으로 도시된 염 희석 모델을 이용하여, PEG 의 존재 및 부재 하에서 dsDNA 검출에 대한 정규화된 데이터를 비교하였다. 도 3a 의 상단 파선은 총 이온 강도에 대한 Debye 길이 의존성을 나타낸다. PEG 가 dsDNA 부근에서 이온의 농도를 감소시킨다는 것을 고려하여, 일련의 이온 강도 희석 후 예상 신호를 계산하였다. 적어도 10 배 희석에 도달하면, 예상 신호 (도 3a, 하단 파선) 는 이제 PEG 존재 하에서 얻은 신호 (도 3a, 상향 삼각형) 와 중첩된다. 이것은 우리의 실험 조건으로 PEG 와 믹스 층에서 이온 농도의 적어도 10 배 희석을 달성할 수 있으며, 따라서 dsDNA 신호를 적어도 3 배 향상시킨다.
센서 표면에 PEG 를 첨가함으로써, dsDNA 의 트랜지스터-기반 검출에 대한 이온 스크리닝의 효과가 완화될 수 있음이 입증되었다. EGFET 를 사용하여 금 전극에서 수행한 측정은 PEG 가 심지어 높은 이온 강도 용액 (최대 200 mM PBS) 에서도 dsDNA 의 신호를 적어도 3 배 향상시키는 것을 보여준다. 이러한 이온 스크리닝의 감소는 PEG 가 그 가까운 주변 영역에서 이온 종을 배제하는 경향 (염석 효과) 에 기인할 수 있다. 이는 센서 표면에 충분한 PEG 분자가 존재하면 PEG 층 내에 국부적으로 탈염된 영역이 생성됨을 의미한다. 따라서, 높은 이온 강도 용액의 존재 하에서도, 센서 표면 상의 PEG 층 내의 영역은 PEG 층 위의 영역과 비교하여 효과적으로 낮은 이온 강도 환경을 갖는다. 이것은 센서 표면 옆의 영역 내에서 Debye 길이를 증가시키므로 감지 범위를 표면으로부터 훨씬 더 멀리 증가시킨다.
PEG 의 적용은 다른 유형의 바이오센서로 확장될 수 있다. 중요한 부분은 동시에 수용체 밀도와 탈염 효과를 극대화하기 위해 표면 상의 PEG 와 수용체의 양을 조정해야 한다는 것이다. 이온 스크리닝을 완화시키는 것 외에도, PEG 는 또한 비-특이적 상호작용을 방지하고 센서 표면에서 생체분자를 보다 안정적으로 만드는 데 효과적인 것으로 나타났다. 이러한 모든 장점을 갖추고, 트랜지스터-기반 바이오센서 표면에 PEG 를 통합하면 FET 바이오센서를 PoC 응용 분야로 추진하는 데 엄청난 영향을 줄 수 있다.
실시예 2: 나노바디 수용체가 있는 PEG화 탄소 나노튜브 트랜지스터를 사용하는 고 이온 강도 용액에서의 생체검출
FET-기반 바이오센서는 확장가능한 제작 공정으로 민감하고 안정적인 변환기를 제공하는 고품질의, 분류된 반전도성 탄소 나노튜브 네트워크로 만들어진다. Debye 스크리닝을 극복하기 위해 결합된 표면 기능화 계획이 제안된다: 1) 짧은 나노바디 (VHH) 는 표면에 더 근접한 분석물 결합을 가능하게하는 수용체로서 사용되며, 2) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 층이 첨가되어 유효 Debye 길이를 증가시킨다. 모델 시스템으로 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 사용하여, 높은 이온 강도 용액에서 PEG화 표면으로 3 배 신호 향상이 입증된다. 메커니즘은 염석 효과에 의해 매개되는, PEG 에 의한 국부 완충액 희석에 의해 설명된다. 센서는 4 차 규모를 초과하는 동적 범위로 pM 미만 감지 한계에 도달한다. 또한, 추가적인 표면 패시베이션이 수행되는 경우 센서는 비-특이적 흡착으로 인한 기여는 무시할만하여 매우 특이적이다.
나노바디의 고정화 (혼합 자가 조립 단층 (SAM) 형성): 전술한 바와 같이 CNT FET 를 제작한 후 (Rother 2016, ACS Appl. Mater. Interf. 8: 5571), CNT 를 에탄올로 1 시간 동안 세정하여 CNT 선별 공정으로부터 남은 중합체/오염물을 제거하였다. 이어서, CNT 전극을 에탄올 중 1 mM 피렌 부티르산 (PBA, 링커) + 0.25 mM 피렌-PEG (10 kDa) 로 1 시간 동안 처리하였다. 그 후, 이것을 에탄올, H2O 로 간단히 플러시한 다음 100 mM Tris pH 7.4 에서 밤새 유지하였다. 이어서, 증류수로 간단히 플러시한 후, 100 mM N-히드록시숙신이미드 (NHS) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 (EDC) 수용액을 20 분 동안 채널 내로 펌핑하여 표면을 활성화시켰다. 그 후, 0.2 M 포스페이트 완충액 (pH 7) 중의 10 μM GFP-특이적 VHH 나노바디 또는 10 μM 소 혈청 알부민 (BSA) 을 각각 1 시간 동안 도입하여 특이적 및 비-특이적 흡착 실험을 각각 수행하였다. 이어서, 가능한 남은 활성 부위를 비활성화시키기 위해 표면을 15 분 동안 100 mM Tris 로 플러시하였다. 마지막으로, 최적화된 CNT FET 기반 GFP 감지 어세이의 경우, 비-특이적 결합을 감소시키기 위해 표면을 100 mM Tris 중의 100 nM BSA 용액에 30 분 동안 노출시켰다.
GFP 결합 측정: 15 분 동안 1 mM Tris pH 7.4 에서 특정 농도의 녹색 형광 단백질 (GFP) 로 전극을 플러시하고 3 회 연속 측정을 수행하였다. 그 후, 15 분 동안 100 mM Tris pH 7.4 에서 동일한 농도의 녹색 형광 단백질 (GFP) 로 전극을 플러시하고, 다시 3 회 연속 측정을 수행하였다. 이러한 측정 및 처리는 0 내지 100 nM GFP 의 전체 농도 범위에 대해 반복되었다.
CNT FET 는 도 4A 에 도시된 바와 같이 액체-게이트 구성으로 작동되었다. 측정 설정의 사진이 도 4B 에 제공된다. CNT 를 중합체 분류하고, 이전에 공개된 프로토콜에 따라 전기장에서 정렬시켰다 (Rother 2016, ACS Appl. Mater. Interf. 8: 5571). 전형적인 트랜지스터 전송 곡선은 도 4C 에 제시되어 있다. 모든 소자는 작은 이력현상, 104 를 초과하는 전류 온-오프 비율, 및 110 mV/dec 미만의 가파른 하위임계 스윙을 갖는 앰비폴라 거동을 나타내었다. 전형적인 소자의 AFM 이미지가 도 4 D 에 제시된다.
GFP-특이적 VHH 는 피렌 부티르산 (PBA) 을 링커 분자로서 사용하여 탄소 나노튜브에 아미노 결합되었다. 신호에 대한 PEG 의 영향을 연구하기 위해, VHH 를 PBA + PEG 코팅된 표면 (도 5A) 및 PBA 로만 변형된 대조군 CNT 샘플 (도 5D) 둘 다에 고정시켰다. 두 센서 표면을 모두 1 mM 또는 100 mM Tris 완충액에 용해된 다양한 GFP 농도에 노출시켰다. PEG화 표면에 대한 측정 결과는 도 5B, C 에, 비-PEG화 표면에 대한 측정 결과는 도 5E, F 에 도시되어 있다. 두 경우 모두, PEG화 표면이 더 강하게 반응하면서 GFP 농도가 증가함에 따라 전달 곡선이보다 양의 값으로 이동한다 (도 5B, E). 도 C 및 F 는 GFP 농도의 함수로서 두 센서의 반응을 비교한다. 중요하게도, PEG화된 센서의 신호는 비-PEG화된 표면과 비교하여 100 mM 완충액에서 3 배 향상을 나타낸다 (100 nM GFP 의 경우 25 mV 대 8 mV). 1 mM 완충액에서 관찰된 신호 향상은 덜 급격하고 대략 2 배 증가에 달한다 (100 nM GFP 의 경우 47 mV 대 25 mV). 이러한 결과는 PEG 가 최대 달성가능한 센서 반응에 강한 긍정적 영향을 미친다는 것을 분명히 나타낸다.
실시예 3: 혈청 중의 갑상선-자극 호르몬의 트랜지스터-기반 검출
여기서, 표면 화학 접근법은 짧은 생물학적 수용체로서 항체 단편을 탈염 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자와 조합하여 혈청에서 표지가 없는 선택적 면역검출을 가능하게 한다. 갑상선-자극 호르몬 (TSH) 은 여기에서 대표적인 분석물로서 선택되는데, 요구되는 민감도 요건을 갖춘 관련성 있고 잘 특성화된 면역감지 파라미터이다. 상기 접근법은 상업용 MOSFET 변환기에 전기적으로 연결된 금 감지 표면으로 이루어진 확장-게이트 구성으로 입증된다. 상기 설정은 간단한 칩 제작의 장점과 링커 분자의 부착을 위한 티올-금 화학을 확립하였다. Debye 길이에 대한 탈염 PEG 의 효과를 평가하기 위해, 10 kDa PEG 를 첨가하거나 첨가하지 않은, 2 개의 상이한 표면 변형을 비교한다. SH-PEG-COOH (0.5 kDa) 의 자가-조립 단층 (SAM) 이 없는 감지 표면은 다음에서 “Mono SAM” 구성이라고 한다. PEG 의 존재 하에 시스템을 연구하기 위해 SH-PEG-COOH (0.5 kDa) 및 SH-PEG (10 kDa) 를 조합하여 “Mix SAM” 구성이라고 한다 (도 6).
항-TSH 항체 단편 (F(ab')2) 을 센서 표면에 고정시키고, 완충액 및 혈청에서의 TSH 검출을 입증하였다. Debye 길이를 증가시키기 위해 PEG 를 표면에 공동-고정시켰다. PEG 대 링커 비는 단편을 포함시키기 위해 1:20 으로 선택되었다. 이 비율을 사용하면 PEG 가 없는 제어 표면과 비교하여 높은 이온 강도 완충액에서 3 배 신호 향상이 달성되었다 (도 6). 더욱이, 비-특이적 흡착은 칩을 BSA 에 노출시켜 시험하였으며 매우 낮은 것으로 제시되었다 (특정 신호의 <10%, 도 6). 이어서, 적어도 3 개의 소자로 혈청에서 측정을 반복하였다. 보정 곡선은 도 7 에 제시한다. 37℃ 에서 측정을 수행하면 강력한 신호 향상을 달성하여, 21℃ 에 비해 3 배 더 낮은 검출 한계를 이끌어 냈다. 이러한 개선은 주로 고온에서의 결합 속도가 빠르기 때문이다.
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agtgtatctg cattg 15
Claims (17)
- 전극 상에 기능화된 표면을 제조하는 방법으로서:
a) 링커 및 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체를, 상기 전극의 상기 표면 상에 상기 링커 및 상기 중합체의 공유 또는 비-공유 고정화를 허용하는 조건 하에서, 상기 전극에 적용하는 단계; 및
b) 상기 링커 및 상기 중합체의 고정화 시 적어도 하나의 검출제를, 고정된 상기 링커를 통해 적어도 하나의 검출제의 상기 전극에 대한 공유 또는 비-공유적 부착을 허용하는 조건 하에서, 상기 전극에 적용하는 단계를 포함하고,
상기 조건은 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체 및 상기 적어도 하나의 검출제를 상기 전극의 상기 표면 상에 분포시켜서, 상기 검출제가 전극 표면 전체의 표면적 당 동일한 양으로 존재하고, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 중합체가 상기 검출제의 주위에 배열되고 하기와 같은 양으로 존재하도록 하고:
i) 검출제에 근접한 유체의 이온 강도의 감소를 허용하는 양, 및
ii) 유체 샘플에 포함된 분석물을 상기 검출제에 결합시키는 것을 허용하는 양,
염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 다당류, 폴리실록산 및 상기 언급된 중합체의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전극 상에 기능화된 표면을 제조하는 방법. - 제 1 항에 있어서, 상기 링커가 0.01 내지 5, 0.01 내지 1.0, 0.01 내지 0.5 또는 0.1 내지 0.5 kDa 의 MW 를 갖는 저분자량 (MW) 중합체이고, 상기 링커 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 다당류, 폴리실록산 및 언급된 중합체의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전극 상에 기능화된 표면을 제조하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 및 언급된 중합체의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전극 상에 기능화된 표면을 제조하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체가 링커 중합체와 동일한 부류의 중합체인, 전극 상에 기능화된 표면을 제조하는 방법.
- 제 4 항의 방법에 의해 얻어지는 전극으로서, 유체 샘플에 노출될 수 있는 기능화된 표면을 포함하고, 상기 기능화된 표면은 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체 및 유체 샘플에 포함된 분석물에 결합하는 적어도 하나의 검출제를 포함하며, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체 및 상기 적어도 하나의 검출제는 상기 전극의 표면에 분포되어, 상기 검출제가 전극 표면 전체의 표면적 당 동일한 양으로 존재하고, 상기 염석 효과를 매개할 수 있는 중합체가 상기 검출제 주위에 배열되고 하기와 같은 양으로 존재하도록 하고:
i) 검출제에 근접한 유체의 이온 강도의 감소를 허용하는 양, 및
ii) 유체 샘플에 포함된 분석물을 상기 검출제에 결합시키는 것을 허용하는 양,
염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 다당류, 폴리실록산 및 상기 언급된 중합체의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 적어도 하나의 검출제가 링커를 통해 전극의 표면에 고정되며, 상기 링커가 0.01 내지 5, 0.01 내지 1.0, 0.01 내지 0.5 또는 0.1 내지 0.5 kDa 의 MW 를 갖는 저분자량 (MW) 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 링커 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 다당류, 폴리실록산 및 언급된 중합체의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되고,
염석 효과를 매개할 수 있는 중합체가 링커 중합체와 동일한 부류의 중합체인, 전극. - 제 5 항에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체의 크기는 Debye 길이가 증가되고 적어도 하나의 검출제 주위의 이온 강도가 감소되도록 하는 것인, 전극.
- 제 6 항에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체의 분자량 (MW) 이 1 내지 100 kDa, 10 내지 100 kDa, 10 내지 50 kDa, 10 내지 25 kDa, 10 내지 20 kDa 또는 10 내지 15 kDa 인, 전극.
- 제 5 항에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리글리세롤, 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리메타크릴레이트 또는 또다른 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 및 언급된 중합체의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전극.
- 제 5 항에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 상기 적어도 하나의 중합체가 링커를 통해 전극의 표면에 고정되거나 추가의 링커없이 작용기를 통해 직접 부착되는, 전극.
- 제 9 항에 있어서, 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체를 고정하는 상기 링커가 하기 구조를 갖는 링커인, 전극:
여기서 A 는 하기 부류: 티올, 실란, 포스폰산, 방향족 분자, 카르복실, 아민, NHS 에스테르, 말레이미드로부터의 제 1 작용기이고,
B 는 하기 부류: 상기 기재된 부류로부터의 저분자량 중합체, 탄화수소, 산소 함유 기, 할로알칸, 질소 함유 기, 황 함유 기, 인 함유 기, 붕소 함유 기, 또는 짧은 무기 중합체 사슬로부터의 짧은 유기 사슬이고,
C 는 하기 부류: 카르복실, 아민, NHS 에스테르, 말레이미드로부터의 제 2 작용기임. - 제 5 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 검출제가 유체 샘플에 포함된 분석물에 특이적으로 결합하는, 전극.
- 제 5 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 검출제가, 항체 및 그의 단편, 핵산, 앱타머, 펩티드 핵산 (PNA) 수용체 또는 리간드 단백질 또는 펩티드, 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전극.
- 제 5 항에 있어서, 적어도 하나의 검출제의 크기는 검출제가 염석 효과를 매개할 수 있는 적어도 하나의 중합체에 의해 둘러싸이는 정도의 것인, 전극.
- 제 5 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 전극을 포함하는 적어도 하나의 분석물을 측정하기 위한 분석물 검출기로서, 상기 전극이 변환기와 전기적으로 접촉하거나 또는 변환기의 일부인 분석물 검출기.
- 제 14 항에 있어서, 유체 샘플에서 적어도 하나의 분석물을 측정하기 위해 사용되는, 분석물 검출기.
- 하기 단계를 포함하는, 적어도 하나의 분석물을 측정하는 방법:
(a) 적어도 하나의 분석물을 포함하는 것으로 의심되는 유체 샘플을, 제 5 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 전극, 또는 제 5 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 전극을 포함하는 적어도 하나의 분석물을 측정하기 위한 분석물 검출기로서, 상기 전극이 변환기와 전기적으로 접촉하거나 또는 변환기의 일부인 상기 분석물 검출기와 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 전극 또는 검출기로 전기화학적 측정을 수행함으로써, 적어도 하나의 분석물이 결정될 것인 단계. - 제 16 항에 있어서, 상기 전기화학적 측정이 30℃ 내지 40℃ 의 온도에서 수행되는, 적어도 하나의 분석물을 측정하는 방법.
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