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KR102618424B1 - 지속성 응고 인자 vii 및 그 제조 방법 - Google Patents

지속성 응고 인자 vii 및 그 제조 방법 Download PDF

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KR102618424B1
KR102618424B1 KR1020197003758A KR20197003758A KR102618424B1 KR 102618424 B1 KR102618424 B1 KR 102618424B1 KR 1020197003758 A KR1020197003758 A KR 1020197003758A KR 20197003758 A KR20197003758 A KR 20197003758A KR 102618424 B1 KR102618424 B1 KR 102618424B1
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ctp
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polypeptide
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라우라 모슈코비치
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옵코 바이오로직스 리미티드
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Abstract

응고 인자의 카르복시 말단에 부착되지만 이의 아미노 말단에는 부착되지 않는 융모성 성선 자극 호르몬의 적어도 하나의 카르복시-말단 펩티드(CTP)를 포함하는 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 개시된다. 본 개시의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물과 약제학적 제제 및 그 사용 방법 및 생산 방법이 또한 개시된다.

Description

지속성 응고 인자 VII 및 그 제조 방법
응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 융모성 성선 자극 호르몬의 적어도 하나의 카르복시-말단 펩티드(CTP)를 포함하는 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 개시된다. 본 개시의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물과 약제학적 제제 및 그 사용 방법 및 생산 방법이 또한 개시된다.
응고 인자 대체 요법의 개발은 많은 혈우병 환자의 삶을 바꿔 놓았다. 혈우병(hemophilia)은 신체의 혈액 응고(clotting 또는 coagulation) 조절 능력을 손상시키는 일단의 유전질환이다. 혈우병 환자는 효과적인 혈액응고에 필요한 인자 VIII 또는 인자 IX 단백질을 적절한 양으로 생산하지 못한다. 중증 혈우병 환자의 경우, 경미한 부상으로도 수 일 또는 수 주일 동안 혈액 손실이 일어날 수 있고, 완치될 수 없으므로, 관절 및 기타 기관에 대한 영구적인 손상을 줄 수 있고, 조기 사망으로 이어질 수 있다.
혈우병은 응고 연쇄반응(coagulation cascade)에서 중요한 인자의 손상 또는 부재에 의해 발생하는 유전성, X-염색체 관련 출혈 질환이다. 혈우병 환자의 경우, 트롬빈 생성(thrombin generation) 및 혈전 형성(fibrin clot formation)이 심하게 손상되어, 가장 흔하게는 관절 및 장기에서의 자연 출혈이 발생하고, 외상 또는 수술 도중 및 이후에 과도한 출혈이 발생한다. 빈번한 출혈 또한 혈우병 환자에서 관절 종창(joint swelling), 관절 손상, 중증 변형(severe deformity), 빈번한 감염, 및 거동 불편(reduced mobility)을 초래한다(Mayo Clinic). A형 혈우병은 인자 VIII 발현의 결핍이나 결여로 발생하는 반면, B형 혈우병은 인자 IX 발현의 결핍이나 결여로 발생한다.
B형 혈우병은 FIX의 응혈 촉진 활성도(procoagulant activity)를 결핍시킨다. B형 혈우병 환자에게는 종종 중증 관절염으로 이어지는 자연적인 연조직 출혈 및 재발성 관절혈증이 나타난다. 이들 환자에 대한 현재의 치료법에는 재조합 FIX의 정맥내 투여가 포함된다. 그러나, 비용 문제 및 혈액 순환으로부터 FIX가 비교적 신속하게 제거되는 문제는 지속형 FIX의 개발을 어렵게 만든다. FVIII 및 FIX가 상업적으로 이용 가능하게 되면서 생명을 위협하는 출혈 사례의 조절이 개선되었다. 많은 환자에게 예방 요법이 처치되는데, 이는 출혈 및 이와 연관된 합병증의 위험을 감소시킨다. 그러나, 유의한 비율의 환자(10~30%)에서는 외부로부터 투여되는 FVIII 및 FIX에 대한 억제성 항체(inhibitory antibody)가 발생한다. 우회 제품인 FVIIa를 투여하면 억제성 Abs를 가진 환자에 대해 항상성(homeostatis)을 유도할 수 있고, 효과적인 치료를 제공할 수 있다.
재조합 FVIIa(NovoSeven®)는 상업적으로 이용할 수 있으며, 이는 억제체를 가진 혈우병 환자에서의 출혈 사례 치료용으로 1996년에 승인되었다. 그러나, rFVIIa는 2.5시간의 말단 반감기로 신속하게 제거된다. 그 결과, 경미 내지는 중간 정도의 출혈에 이어서 적절한 항상성을 달성하기 위해서는 환자에게 여러 번의 빈번한 (2~3시간 간격으로 2~3회의 투약) 주입이 일반적으로 필요하다. 결과적으로, 1회의 투약 후 지혈 활성도의 지속 시간을 연장시키고 투약의 빈도를 훨씬 줄일 수 있는 지속성 형태의 FVIIa의 개발에 대한 많은 관심이 있다. 지속성 FVIIa는 또한 장기적인 예방 요법의 실행 가능성을 증가시킨다.
FVIIa의 반감기를 연장하기 위한 다양한 기술이 개발 중이다. 그러나, 이러한 단백질의 생물학적 활성도를 보존하고 변형으로 인한 유의한 면역 원성이 유도되지 않게 하면서 단백질의 연장된 반감기를 달성할 필요가 있다. 본 발명은 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 FVIIa에 부착하여 이의 반감기 및 생물학적 활성도가 연장되도록 이를 변형시킴으로써 이러한 필요를 해결한다.
일 양태에서, FVII의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3개의 CTP 분자를 포함하는, 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin) 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형 인간 인자 VII(FVII) 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 상기 방법은: 상기 CTP-변형 FVII를 암호화하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터로, 소정 수의 세포를 안정적으로 형질 감염시키는 단계 (여기서, 상기 형질 감염된 세포는 상기 CTP-변형 FVII를 발현하고 분비함); 상기 CTP-변형 FVII를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계; 상기 클론을 소정의 비율로 용액 내에서 증식시키는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 수확하는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 여과하여 정화된 수확 용액을 수득하는 단계; 및 상기 정화된 수확 용액으로부터 상기 폴리펩티드를 정제하여, 원하는 농도의 CTP-변형 FVII를 갖는 정제된 단백질 용액을 수득함으로써, CTP-변형 FVII를 제조하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다 (여기서, 제조된 CTP-변형 FVII의 아미노산 서열은 서열 번호 7에 제시됨).
또 다른 양태에서, FVII의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3개의 CTP 분자를 포함하는, 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin) 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형 인간 활성 인자 VII(FVIIa) 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 상기 방법은: CTP-변형 FVII를 암호화하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터로, 소정 수의 세포를 안정적으로 형질 감염시키는 단계 (여기서, 상기 형질 감염된 세포는 상기 CTP-변형 FVII를 발현하고 분비함); 상기 CTP-변형 FVII를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계; 상기 클론을 소정의 비율로 용액 내에서 증식시키는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 수확하는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 여과하여 정화된 수확 용액을 수득하는 단계; 및 상기 정화된 수확 용액으로부터 상기 폴리펩티드를 정제하고 활성화시켜, 원하는 농도의 CTP-변형 FVIaI를 갖는 정제된 단백질 용액을 수득함으로써, CTP-변형 FVIIa를 제조하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다 (여기서, 제조된 CTP-변형 FVIIa의 아미노산 서열은 서열 번호 7에 제시됨).
또 다른 양태에서, FVII의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3개의 CTP 분자를 포함하는, 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin) 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형된 인간 인자 VII(FVII) 폴리펩티드로서, 상기 CTP-변형 FVII는: CTP-변형 FVII를 암호화하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터로, 소정 수의 세포를 안정적으로 형질 감염시키는 단계 (여기서, 상기 형질 감염된 세포는 상기 CTP-변형 FVII를 발현하고 분비함); 상기 CTP-변형 FVII를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계; 상기 클론을 소정의 비율로 용액 내에서 증식시키는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 수확하는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 여과하여 정화된 수확 용액을 수득하는 단계; 및 상기 정화된 수확 용액으로부터 상기 폴리펩티드를 정제하여, 원하는 농도의 CTP-변형 FVII를 갖는 정제된 단백질 용액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 상기 제조된 CTP-변형 FVII는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, FVII의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3개의 CTP 분자를 포함하는, 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin) 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형된 인간 활성화된 인자 VII(FVIIa) 폴리펩티드로서, 상기 CTP-변형 FVIIa는: CTP-변형 FVII를 암호화하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터로, 소정 수의 세포를 안정적으로 형질 감염시키는 단계 (여기서, 상기 형질 감염된 세포는 상기 CTP-변형 FVII를 발현하고 분비함); 상기 CTP-변형 FVII를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계; 상기 클론을 소정의 비율로 용액 내에서 증식시키는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 수확하는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 여과하여 정화된 수확 용액을 수득하는 단계; 및 상기 정화된 수확 용액으로부터 상기 폴리펩티드를 정제하고 활성화시켜, 원하는 농도의 CTP-변형 FVIIa를 갖는 정제된 단백질 용액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 상기 제조된 CTP-변형 FVIIa는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
관련 양태에서, 제조된 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형된 인간 인자 VII (FVII) 폴리펩티드는 고도로 글리코실화되어 있다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 제조된 CTP-변형 FVII의 글리코실화 패턴은 CTP당 적어도 4개의 O-결합 글리코실화 부위의 글리코실화를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 CTP-변형 FVII는 고 백분율의 하전된 N-글리칸을 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 제조된 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형된 인간 인자 VII (FVII) 폴리펩티드는 고도로 시알산화되어 있다.
관련 양태에서, 제조된 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형된 인간 인자 VII (FVII) 폴리펩티드는 고 백분율의 카르복시화 글루탐산 잔기를 포함한다.
관련 양태에서, 클론을 증식시키는 것은 제조용 세포 은행(WCB) 또는 마스터 세포 은행(MCB)로부터 수득된 클론을 증식시키는 것을 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 클론은 적어도 600 mg/L의 수준으로 CTP-변형 FVII를 발현하고 분비한다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 클론은 일련의 서브 배양단계를 통해 생물 반응기 수준까지 용액 내에서 증식된다. 또 다른 관련 양태에서, 생물 반응기는 일회용 생물 반응기 또는 스테인리스강 생물 반응기를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 생물 반응기는 유가배양(fed-batch) 모드 생물 반응기로서 작동된다.
관련 양태에서, 상기 정화된 수확물로부터 정제된 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형된 인간 인자 VII (FVII) 폴리펩티드의 적어도 60%는 CTP-변형 FVII의 고 글리코실화 형태를 포함한다. 관련 양태에서, 상기 정화된 수확물로부터 정제된 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형된 인간 인자 VII (FVII) 폴리펩티드의 적어도 60%는 고 백분율의 카르복시화 글루탐산 잔기를 포함한다.
관련 양태에서, 정제는 상기 정화된 수확물을 친화도 컬럼, 다중 모델 컬럼 또는 혼합 모드 컬럼, 소수성 상호 작용 컬럼, 및 음이온 교환 컬럼을 통과시키는 것을 포함하는 단계를 순차적으로 수행하는 것; 정화된 수확물 또는 컬럼 크로마토그래피 이후에 수집된 용출물 또는 이들의 조합 내에 존재하는 바이러스를 불활성화시키는 것을 포함하며, 상기 바이러스를 불활성화시키는 것은 상기 바이러스에 대해 독성인 용액에서 배양하거나, 나노 여과하거나, 이들의 임의의 조합을 포함하고, 음이온 교환 용출액은 한외 여과/투석 여과 단계를 거친다.
관련 양태에서, 제조된 CTP-변형 인간 인자 VII (FVII) 폴리펩티드는 활성 CTP-변형 FVII 폴리펩티드(CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드)를 포함한다.
관련 양태에서, 제조 방법은 고도로 글리코실화된 CTP-변형 FVII의 적어도 20%의 회수율을 달성한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 제조된 CTP-변형 FVII, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
또 다른 양태에서, FVIIa의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3개의 CTP 분자를 포함하는, 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형된 인간 활성 인자 VII(FVIIa) 폴리펩티드가 개시되는데, 상기 CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드는 실질적으로 순수하고 활성인 형태이며, 상기 CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드는: (a) 고 시알산 함량; (b) 저 산화 형태; (c) 고 글리코실화 형태; (d) 카르복실화 글루탐산 잔기의 고 백분율; (e) 하전된 N-글리칸의 고 백분율; 및 (f) 높은 포텐시(potency); 또는 이들의 조합을 포함하고, 상기 CTP-변형 FVIIa는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
관련 양태에서, 고 시알산 함량은 적어도 15 mol/mol로 이루어진다. 또 다른 관련 양태에서, 고 글리코실화 형태는 적어도 10 mol/mol의 O-글리칸 함량을 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 실질적으로 순수하고 활성인 형태는 상기 활성 CTP-변형 FVIIa의 고 글리코실화 형태의 적어도 60%를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 적어도 60%의 실질적으로 순수하고 CTP-변형 FVIIa 형태는 고 백분율의 카르복실화된 글루탐산(Gla) 잔기를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 고 백분율의 카르복시화 글루탐산(Gla) 잔기는 적어도 90% Gla 잔기로 구성된다. 또 다른 관련 양태에서, 저 백분율의 산화 형태는 5% 미만으로 구성된다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 90%이다. 추가 관련 양태에서, 순도 백분율은 97.3%, 97.6%, 97.4% 및 97.0%로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 포텐시는 적어도 10,500 U/mg이다. 추가 관련 양태에서, 포텐시는 15,563 U/mg 16,720 U/mg, 22,478 U/mg 및 23,608 U/mg으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, (a) 고 시알산 함량; (b) 저 산화 형태; (c) 고 글리코실화 형태; (d) 카르복실화 글루탐산 잔기의 고 백분율; (e) 하전된 N-글리칸의 고 백분율; 및 (f) 고 포텐시; 또는 이들의 조합을 포함하는 CTP-변형된 FVIIa를 포함하는 조성물(여기서, 상기 CTP-변형 FVIIa는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함함), 및 약제학적으로 허용 가능한 담체가 본원에 개시된다.
다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명, 실시예 및 도면으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 개시의 사상 및 범주에 속하는 다양한 변경과 변형이 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 당업자에게 명백하게 될 것이므로, 본 개시의 바람직한 구현예를 나타내는 특정 실시예 및 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 단지 예시로서 주어진 것임을 이해해야 한다.
특허 또는 출원 파일에는 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면이 포함되어 있다. 컬러 도면(들)이 구비된 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청에 따라 필요한 수수료의 납부 후에 제공될 것이다.
도 1. pCI-dhfr-MOD-5014 플라스미드의 맵을 도시한다.
도 2a. FVII-CTP3 정제 단계의 개략도를 보여준다. 배치(batch) 31은 PK/PD 연구를 위해 생성하였다.
도 2b. FVII-CTP3 정제 단계의 개략도를 보여준다. 배치(batch) 38은 생존 연구를 위해 생성하였다.
도 3a. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 쿠마시(Coomassie) 염색된 SDS-PAGE의 각 레인에 10 μg(배치 31) 또는 5 μg(배치 38)을 로딩하였다. 1. FVII-CTP3 폴리펩티드; 2. 3x CTP를 포함하는 중쇄; 3. 경쇄 3개의 항체 모두가 FVII를 검출한다.
도 3b. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS- PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE의 각 레인에 10 μg(배치 31) 또는 5 μg(배치 38)을 로딩하였다. 1. FVII-CTP3 폴리펩티드; 2. 3x CTP를 포함하는 중쇄; 3. 경쇄
도 3c. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS- PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE의 각 레인에 10 μg(배치 31) 또는 5 μg(배치 38)을 로딩하였다. 1. FVII-CTP3 폴리펩티드; 2. 3x CTP를 포함하는 중쇄; 3. 경쇄
도 3d. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS- PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE의 각 레인에 10 μg(배치 31) 또는 5 μg(배치 38)을 로딩하였다. 1. FVII-CTP3 폴리펩티드; 2. 3x CTP를 포함하는 중쇄; 3. 경쇄
도 3e. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS- PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE의 각 레인에 10 μg(배치 31) 또는 5 μg(배치 38)을 로딩하였다. 1. FVII-CTP3 폴리펩티드; 2. 3x CTP를 포함하는 중쇄; 3. 경쇄
도 3f. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS- PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 웨스턴 블롯의 각 레인에 1 μg의 단백질을 로딩하였다. 1. FVII-CTP3 폴리펩티드; 2. 3x CTP를 포함하는 중쇄; 3. 경쇄 3개의 항체 모두가 FVII를 검출한다. FVIIa 경쇄는 α-FVII 모두로 검출된다.
도 3g. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS- PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 웨스턴 블롯의 각 레인에 1 μg의 단백질을 로딩하였다. 1. FVII-CTP3 폴리펩티드; 2. 3x CTP를 포함하는 중쇄; 3. 경쇄 3개의 항체 모두가 FVII를 검출한다. FVIIa 중쇄는 α-CTP에 의해 검출되었다.
도 3h. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS- PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 웨스턴 블롯의 각 레인에 1 μg의 단백질을 로딩하였다. 1. FVII-CTP3 폴리펩티드; 2. 3x CTP를 포함하는 중쇄; 3. 경쇄 3개의 항체 모두가 FVII를 검출한다. FVIIa 중쇄는 α-Gla에 의해 검출되었다.
도 4. 세라믹 히드록시아파타이트(HA) 컬럼 상에서의 정제 결과 FVII-CTP3 색소형성 활성(chromogenic activity)이 강화됨을 보여준다. 상업적으로 이용 가능한 색소 형성 활성 시험 키트인 BIOPHEN(Hyphen BioMed 221304)을 사용해 FVII-CTP3 수확물의 시험관내(in vitro) 포텐시, 프로세스 중 분획, 및 정제된 FVII-CTP3 대 인간 집합의 정상 혈장에 대한 비교 분석을 수행하였다. FVII-CTP3 수확물과 단백질을 연속 희석하고, 투여-반응 곡선을 정상 인간 혈장의 기준 제제와 비교하여 그 포텐시를 평가하였다.
도 5. FVIII-결핍 마우스에서 FVIIa-CTP3 대 NovoSeven®의 PK 프로파일을 보여준다. FVIIa-CTP3은 FVII 선택, HA 정제 단계 및 활성화에 이어서 생산되었다. FVIII-/- 혈우병 마우스에게 FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®을 1회의 정맥 주사로 투여하였다. 투여 후 0.083, 0.5, 2, 8, 24, 48, 및 72시간차에 안구 뒤에서 혈액 샘플을 채취하였다. 샘플링 직후 구연산 첨가 혈장(0.38%)을 제조하여 분석 전까지 -20℃에서 보관하였고, STACLOT 상용 키트를 사용해 FVIIa 응고 활성에 기초한 PK 프로파일을 작성하였다.
도 6a. FVIIa-CTP3이 FVII 선택, HA 정제 단계 및 활성화에 이어서 생산되었음을 보여준다. FVIII-/- 혈우병 마우스에게 FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®을 1회의 정맥 주사로 투여하였다. 투여 후 0.083, 0.5, 2, 8, 24, 48, 및 72시간차에 안구 뒤에서 혈액 샘플을 채취하였다. 샘플링 직후 구연산이 첨가된 혈장(0.38%)을 제조하여 분석 전까지 -20℃에서 보관하였다. PK 실험 중에 트롬빈 생성 파라미터를 평가하고, 피크에 대한 최대량을 포함하는 파라미터를 평가하였다.
도 6b. FVIIa-CTP3이 FVII 선택, HA 정제 단계 및 활성화에 이어서 생산되었음을 보여준다. FVIII-/- 혈우병 마우스에게 FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®을 1회의 정맥 주사로 투여하였다. 투여 후 0.083, 0.5, 2, 8, 24, 48, 및 72시간차에 안구 뒤에서 혈액 샘플을 채취하였다. 샘플링 직후 구연산이 첨가된 혈장(0.38%)을 제조하여 분석 전까지 -20℃에서 보관하였다. PK 실험 중에 트롬빈 생성 파라미터를 평가하고, 시점에 대한 트롬빈의 양을 포함하는 파라미터를 평가하였다.
도 6c. FVIIa-CTP3이 FVII 선택, HA 정제 단계 및 활성화에 이어서 생산되었음을 보여준다. FVIII-/- 혈우병 마우스에게 FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®을 1회의 정맥 주사로 투여하였다. 투여 후 0.083, 0.5, 2, 8, 24, 48, 및 72시간차에 안구 뒤에서 혈액 샘플을 채취하였다. 샘플링 직후 구연산이 첨가된 혈장(0.38%)을 제조하여 분석 전까지 -20℃에서 보관하였다. PK 실험 중에 트롬빈 생성 파라미터를 평가하고, 트롬빈 생성 속도를 포함하는 파라미터를 평가하였다.
도 7a. 미 정맥(tail vein) 가로 절단(TVT) 이후 혈우병 마우스의 생존 곡선을 보여준다. TVT는 투여 후 15분차에 수행하였다. TVT 후 24시간 동안 마우스의 생존을 관찰하여, 첫 12시간 동안과 24시간 이후에 매시간마다 기록하였다. 대조군 데이터(비히클)는 실험당 5마리의 마우스로 수행한 3회 실험의 합이다.
도 7b. 미 정맥(tail vein) 가로 절단(TVT) 이후 혈우병 마우스의 생존 곡선을 보여준다. TVT는 투여 후 24시간차에 수행하였다. TVT 후 24시간 동안 마우스의 생존을 관찰하여, 첫 12시간 동안과 24시간 이후에 매시간마다 기록하였다. 대조군 데이터(비히클)는 실험당 5마리의 마우스로 수행한 3회 실험의 합이다.
도 7c. 미 정맥(tail vein) 가로 절단(TVT) 이후 혈우병 마우스의 생존 곡선을 보여준다. TVT는 투여 후 48시간차에 수행하였다. TVT 후 24시간 동안 마우스의 생존을 관찰하여, 첫 12시간 동안과 24시간 이후에 매시간마다 기록하였다. 대조군 데이터(비히클)는 실험당 5마리의 마우스로 수행한 3회 실험의 합이다.
도 7d. TVT 후 24시간차에 기록된 마우스 생존에 대한 요약을 보여준다.
도 8. 기질(페파크롬(Pefachrome) FVIIa) 절단 활성에 대한 FVIIa(NovoSeven)와 CTP-변형 인자 VIIa(MOD-5014) 간의 비교를 보여준다.
도 9. 조직 인자에 결합되었을 때, 기질(페파크롬(Pefachrome) FVIIa) 절단 활성에 대한 FVIIa(NovoSeven)와 CTP-변형 인자 VIIa(MOD-5014) 간의 비교를 보여준다.
도 10. 인자 VIIa 농도에 따른, FVIIa(NovoSeven)에 의한 활성화된 인자 X의 생성 또는 CTP-변형 FVIIa(MOD-5014)에 의한 활성화된 인자 X의 생성에 대한 비교를 보여준다.
도 11. 인자 X 농도에 따른, FVIIa(NovoSeven)에 의한 활성화된 인자 X의 생성 또는 CTP-변형 FVIIa(MOD-5014)에 의한 활성화된 인자 X의 생성에 대한 비교를 보여준다.
도 12a 및 12b. 조직 인자의 부재 하에서 지질 농도에 따른, FVIIa(NovoSeven)에 의한 활성화된 인자 X의 생성 속도 또는 CTP-변형 FVIIa(MOD-5014)에 의한 활성화된 인자 X의 생성 속도에 대한 비교를 보여준다(도 12a). 조직 인자의 부재 하에서 지질 농도에 따른, FVIIa(NovoSeven)에 의한 활성화된 인자 X의 생성 또는 CTP-변형 FVIIa(MOD-5014)에 의한 활성화된 인자 X의 생성에 대한 비교를 보여준다(도 12b).
도 13. 조직 인자의 부재 하에서 인자 X 농도에 따른, 활성화된 인자 X의 생성에 대한 FVIIa(NovoSeven)와 MOD-5014간의 비교를 보여준다.
도 14. 폴리브렌에 따른, FVIIa(NovoSeven)에 의한 기질(페파크롬 FVIIa) 절단의 억제 및 CTP-변형 FVIIa(MOD-5014)에 의한 기질(페파크롬 FVIIa) 절단의 억제에 대한 비교를 보여준다.
도 15a 내지 15c. FVIIa(NovoSeven)에 의한 기질(페파크롬 FXa) 절단의 억제 및 CTP-변형 FVIIa(MOD-5014)에 의한 기질(페파크롬 FXa) 절단의 억제에 대한 비교를 TFPI 농도(도 15a), FVIIa에 대한 TFPI 노출 기간(도 15b), 및 MOD-5014에 대한 TFPI 노출 기간(도 15c)에 따라 보여준다.
도 16. CTP-변형 FVII-CTP3의 상류 공정 생산 흐름도를 보여준다.
도 17. CTP-변형 FVII-CTP3의 정제 공정 흐름도를 나타낸다.
도 18. 정제된 CTP-변형 FVII-CTP3으로 인한 SDS-PAGE 감소를 나타낸다.
도 19. 총 N-글리칸 중 하전된 N-글리칸의 백분율이 정제 단계 동안 일정하였으며, 초기의 하전된 N-글리칸 백분율은 상류 세포 배양 단계로부터 영향을 받는다는 것을 보여준다.
도 20. 산화 형태 및 기타 관련 형태의 함량은 정제 단계 전반에 걸쳐 감소한다는 것을 나타낸다. 다중 모델 컬럼 및 HIC 컬럼은 산화 형태 및 관련 형태를 감소시키는 데 가장 유의한 영향을 미치는 정제 단계이다.
도 21. 다중 모델 컬럼에 의한 비-감마 카르복실화 단백질의 제거를 나타낸다. CHT 컬럼은 비-감마 카르복실화 단백질을 제거하여 감마 카르복실화 분획을 풍부하게 한다.
도 22. 정제 단계 전반에 걸친 시알산의 함량을 나타낸다. 시알산 함량은 정제 단계 동안 일정했으며, 초기의 시알산 함량은 상류 세포 배양 단계로부터 영향을 받는다.
일 구현예에서, 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형 인간 인자 VII(FVII) 폴리펩티드의 제조 방법이 개시되는데, 상기 FVII는 이의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3개의 CTP 분자를 포함하고, 상기 방법은: 상기 CTP-변형 FVII를 암호화하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터로, 소정 수의 세포를 안정적으로 형질 감염시키는 단계 (여기서, 상기 형질 감염된 세포는 상기 CTP-변형 FVII를 발현하고 분비함); 상기 CTP-변형 FVII를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계; 상기 클론을 소정의 비율로 용액 내에서 증식시키는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 수확하는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 여과하여 정화된 수확 용액을 수득하는 단계; 및 상기 정화된 수확 용액으로부터 상기 폴리펩티드를 정제하여, 원하는 농도의 CTP-변형 FVII를 갖는 정제된 단백질 용액을 수득함으로써, CTP-변형 FVII를 제조하는 단계를 포함하며, 제조된 CTP-변형 FVII의 아미노산 서열은 서열 번호 7에 제시된다. 　
일 구현예에서, FVII의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3 개의 CTP 분자를 포함하는, 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형 인간 인자 VII(FVII)가 개시되는데, 상기 CTP-변형 FVII는, 상기 CTP-변형 FVII를 암호화하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터로 소정 수의 세포를 안정적으로 형질 감염시키는 단계 (여기서, 상기 형질 감염된 세포는 상기 CTP-변형 FVII를 발현하고 분비함); 상기 CTP-변형 FVII를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계; 상기 클론을 소정의 비율로 용액 내에서 증식시키는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 수확하는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 여과하여 정화된 수확 용액을 수득하는 단계; 및 상기 정화된 수확 용액을 정제하여 원하는 농도의 CTP-변형 FVII를 갖는 정제된 단백질 용액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 상기 제조된 CTP-변형 FVII는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 　
일 구현예에서, C-말단 단부에 연속으로 부착된 3 개의 CTP 분자를 포함하는 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형 인간 인자 VII(FVII)를 포함하는 조성물이 개시된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII는 활성화된 CTP-변형 FVII(CTP-변형 FVIIa)를 포함한다.
인간 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형 인자 VII 폴리펩티드
응고 인자 VII(FVII)는 간세포에 의해 불활성 전구효소(치모겐)로서 혈류 내로 분비되는 444 개의 아미노산 당단백질(50KDa)이다. 조직이 손상되어 순환 혈액에 노출될 때, FVII는 FVII에 대해 순 수용체 단백질(true receptor protein)인 조직 인자(TF)와 복합체를 형성하고 혈관벽의 더 깊은 층에 국지화된 다양한 세포에 의해 발현된다. 이러한 FVII-TF 복합체가 형성되면 FVII가 활성화된다. 활성화된 FVII(FVIIa)는 인자 IX 및 인자 X를 활성화시켜 외인성 응고 경로를 개시한다.
FVII는 응고 시스템과 연관된 비타민 K-의존적 당단백질 군에 속한다. FVII는 성숙 아미노산 서열이 이어지는 N-말단 폴리펩티드와 전구체로서 합성된다. 폴리펩티드는 글루탐산 잔기(Glu)를 감마 카르복시 글루탐산 잔기(Gla)로 전환시키는 감마 카르복실라아제에 대한 도킹 부위를 함유한다. 카르복시 글루탐산(Gla)은 글루탐산 잔기의 번역-후 카르복실화에 의해 단백질에 도입되는 드문 아미노산이다. 이러한 변형은, 인자 FVII를 포함하는 응고 인자의 감마-카르복실화를 도입하는 데 비타민 K가 요구되는 칼슘 이온에 대한 친화도를 도입한다. Gla 도메인은 응고에 있어서 중요한 역할을 하는, 칼슘 이온의 고친화도 결합을 담당한다. 이러한 도메인에는 2개의 표피 성장 인자-유사(EGF) 도메인, 연결 영역(CR) 및 C-말단 세린 프로테아제 도메인이 이어진다. 분비 전에, FVII 프로펩티드는 절단되어 (신호 펩티드가 제거됨) 406 개 아미노산의 단쇄 치모겐 FVII 당단백질을 형성한다. 분비 후에, 단백질은 CR에서의 절단에 의해 활성화되어 이황화-결합 2 사슬 이종이량체인 FVIIa가 될 수 있다. FVIIa의 혈장 농도는 10 nM이며, 대략 1%가 건강한 개체에서 활성 형태로 순환한다.
일 구현예에서, FVII 또는 FVIIa의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법 또는 FVII 또는 FVIIa의 곡선 아래 영역(AUC)을 개선하는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 FVII 또는 FVIIa의 카르복시 말단에 3개의 CTP를 부착시켜 FVII 또는 FVIIa의 생물학적 반감기를 연장시키거나 FVII 또는 FVIIa의 AUC를 개선하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인자 VIIa(FVIIa) 폴리펩티드의 투여 빈도를 줄이는 방법이 본원에 개시되는데, 상기 방법은 상기 FVIIa 폴리펩티드의 카르복시 말단에 3 개의 융모성 인간 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 부착시켜 상기 FVIIa 폴리펩티드의 투여 빈도를 줄이는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인자 VIIa(FVIIa) 폴리펩티드의 제거 속도를 감소시키는 방법이 본원에 개시되는데, 상기 방법은 상기 FVIIa 폴리펩티드의 카르복시 말단에 3 개의 융모성 인간 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 부착시켜 상기 FVIIa 폴리펩티드의 제거 속도를 감소시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 활성화된 CTP-변형 FVII(FVIIa) 폴리펩티드의 생산 방법이 본원에 개시되는데, 상기 방법은 상기 FVIIa의 카르복시 말단에 3 개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 부착시켜 CTP-변형 FVIIa를 생산하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 응고 인자는 단백질이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 응고 인자는 펩티드이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 응고 인자는 폴리펩티드이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 효소이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 세린 프로테아제이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 당단백질이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 비타민 K-의존적인 당단백질이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 비타민 K-독립적인 당단백질이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 트랜스글루타미나아제(transglutaminase)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 불활성 치모겐(zymogen)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 당업자에게 알려진 임의의 응고 인자이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 VIIa(FVIIa)이다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 단백질이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 당단백질이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FVII이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FVIIa이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 신호 펩티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 재조합 응고 인자는 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 활성 응고 인자는 신호 펩티드를 포함하지 않는다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자는 C-말단에 부착된 3 CTP 반복체를 포함하고 N-말단에 부착된 CTP는 포함하지 않는다.
또 다른 구현예에서, FVIIa 폴리펩티드 및 상기 FVIIa의 카르복시 말단에 부착된 3개의 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)로 이루어진 CTP-변형 인자 VIIa(FVIIa)가 본원에 개시된다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자는 FVII의 도메인 구조와 유사하거나 동일한 도메인 구조를 포함하는 응고 인자이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 N-말단 프로펩티드(신호 서열)를 갖는 전구체로서 합성된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 응고 인자는 불활성 전효소(pro-enzyme) 형태이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자는 세포로부터 분비되고 N-말단 신호 서열이 결여된 불활성 치모겐이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 응고 인자는 활성 응고 인자이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 CTP-변형 FVII는 활성화될 때까지 불활성 전효소 형태이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 CTP-변형 FVII는 세포로부터 분비되고 N-말단 신호 서열이 결여된 불활성 치모겐이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 CTP-변형 FVII는 활성 응고 인자이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 간세포에서 생산된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 글루탐산(Glu)을 감마 카르복시 글루탐산(Gla)으로 전환시키는 감마카르복실라아제에 대한 도킹 부위(docking site)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 사용된 바와 같이 응고 인자는 상업적으로 이용 가능한 응고 인자이다.
일 구현예에서, FVIIa의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3개의 CTP 분자를 포함하는, 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형 인간 활성 인자 VII(FVIIa) 폴리펩티드가 개시되는데, 상기 CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드는 실질적으로 순수하고 활성인 형태이며, 상기 CTP-변형된 FVIIa 폴리펩티드는: (a) 고 시알산 함량; (b) 저 산화 형태; (c) 고 글리코실화 형태; (d) 고 백분율의 카르복실화 글루탐산 잔기; (e) 고 백분율의 하전된 N-글리칸; 및 (f) 높은 포텐시; 또는 이들의 조합을 포함하고, 상기 CTP-변형 FVIIa는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 　
일 구현예에서, FVIIa의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3개의 CTP 분자를 포함하는, 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형 인간 활성 인자 VII(FVIIa) 폴리펩티드가 개시되는데, 상기 CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드는 실질적으로 순수하고 활성인 형태이며, 상기 CTP-변형된 FVIIa 폴리펩티드는: (a) 고 시알산 함량; (b) 저 산화 형태; (c) 고 글리코실화 형태; (d) 고 백분율의 카르복실화 글루탐산 잔기; (e) 고 백분율의 하전된 N-글리칸; 및 (f) 적어도 10 U/mg의 포텐시; 또는 이들의 조합을 포함하는 CTP-변형된 FVIIa를 포함하는 조성물(여기서, 상기 CTP-변형 FVIIa는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함함), 및 　
관련 구현예에서, 고 시알산 함량은 적어도 15 mol/mol로 이루어진다. 또 다른 관련 양태에서, 고 글리코실화 형태는 적어도 10 mol/mol의 O-글리칸 함량을 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 실질적으로 순수하고 활성인 형태는 상기 활성 CTP-변형 FVIIa의 고 글리코실화 형태의 적어도 60%를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 적어도 60%의 실질적으로 순수하고 CTP-변형 FVIIa 형태는 고 백분율의 카르복실화된 글루탐산(Gla) 잔기를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 고 백분율의 카르복시화 글루탐산(Gla) 잔기는 적어도 90% Gla 잔기로 구성된다. 또 다른 관련 양태에서, 저 백분율의 산화 형태는 5% 미만으로 구성된다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 90%이다. 추가 관련 양태에서, 순도 백분율은 97.3%, 97.6%, 97.4% 및 97.0%로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 포텐시는 적어도 10,500 U/mg이다. 추가 관련 양태에서, 포텐시는 15,563 U/mg 16,720 U/mg, 22,478 U/mg 및 23,608 U/mg으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, (a) 고 시알산 함량; (b) 저 산화 형태; (c) 고 글리코실화 형태; (d) 고 백분율의 카르복실화 글루탐산 잔기; (e) 고 백분율의 하전된 N-글리칸; 및 (f) 고 포텐시; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 CTP-변형된 FVIIa를 포함하는 조성물(여기서, 상기 CTP-변형 FVIIa는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함함), 및 약제학적으로 허용 가능한 담체가 본원에 개시된다.
또 다른 구현예에서, (a) 고 시알산 함량; (b) 저 산화 형태; (c) 고 글리코실화 형태; (d) 고 백분율의 카르복실화 글루탐산 잔기; (e) 고 백분율의 하전된 N-글리칸; 및 (f) 적어도 10,500 U/mg의 포텐시; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 CTP-변형된 FVIIa를 포함하는 조성물(여기서, 상기 CTP-변형 FVIIa는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함함), 및 약제학적으로 허용 가능한 담체가 본원에 개시된다.
또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVIIa를 포함하는 조성물이 본원에 개시되는데, 상기 CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드는 실질적으로 순수하고 활성 형태이고, 상기 CTP-변형 FVIIa는:
a. 고 시알산 함량;
b.고 글리코실화 형태를 포함하되, 상기 CTP-변형 FVIIa는:
c. 저 산화 형태;
d. 고 백분율의 카르복실화 글루탐산 잔기;
e. 적어도 60% 하전된 N-글리칸; 또는
f. 적어도 10,500 U/mg의 포텐시;
또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 더 포함하며,
상기 CTP-변형 FVIIa는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVIIa를 포함하는 조성물이 본원에 개시되는데, 상기 CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드는 실질적으로 순수하고 활성 형태이고, 상기 CTP-변형 FVIIa는:
a. 고 시알산 함량;
b. 고 글리코실화 형태를 포함하되, 상기 CTP-변형 FVIIa는:
c. 저 산화 형태;
d. 고 백분율의 카르복실화 글루탐산 잔기;
e. 적어도 60% 하전된 N-글리칸; 또는
f. 적어도 10,500 U/mg의 포텐시 중 적어도 하나를 포함하고,
또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 더 포함하며,
상기 CTP-변형 FVIIa는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 CTP-변형 FVIIa의 상기 아미노산 서열은 서열 번호 7의 시스테인 잔기 135 및 잔기 262 사이에서 이황화(S-S) 브리지를 포함하는 이황화-결합 이중 사슬 이종이량체로서 구조적으로 존재하며, 상기 이중 사슬은 서열 번호 7의 아미노산 1~152를 포함하는 경쇄 및 아미노산 153~490을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 인자 VII를 암호화하는 핵산 서열은 다음의 핵산 서열을 포함한다: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgacgggcatcgtcagctggggccagggctgcgcaaccgtgggccactttggggtgtacaccagggtctcccagtacatcgagtggctgcaaaagctcatgcgctcagagccacgcccaggagtcctcctgcgagccccatttccctgaggatgcggccgc (서열 번호 1).
또 다른 구현예에서, 인자 VII의 아미노산 서열은 다음의 아미노산 서열을 포함한다: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP (서열 번호 2).
또 다른 구현예에서, 인자 VII의 아미노산 서열은 다음의 아미노산 서열을 포함한다: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPGCGR (서열 번호 3).
또 다른 구현예에서, (카르복시 말단에 부착된) 인자 VII-CTP-CTP-CTP를 암호화하는 핵산 서열은 다음의 핵산 서열을 포함한다: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctccagcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgcggccgcttaattaa (서열 번호 4).
또 다른 구현예에서, (카르복시 말단에 부착된) 인자 VII-CTP-CTP-CTP의 아미노산 서열은 다음의 아미노산 서열을 포함한다: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열 번호 5). 또 다른 구현예에서, 서열 번호 5의 아미노산 1~38은 신호 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 신호 서열의 아미노산 서열은 MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRR (서열 번호 6)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 신호 서열이 결여된 (카르복시 말단에 부착된) 인자 VII-CTP-CTP-CTP의 아미노산 서열은 다음의 아미노산 서열을 포함한다: ANAFLEELRP GSLERECKEE QCSFEEAREI FKDAERTKLF WISYSDGDQC ASSPCQNGGS CKDQLQSYIC FCLPAFEGRN CETHKDDQLI CVNENGGCEQ YCSDHTGTKR SCRCHEGYSL LADGVSCTPT VEYPCGKIPI LEKRNASKPQ GRIVGGKVCP KGECPWQVLL LVNGAQLCGG TLINTIWVVS AAHCFDKIKN WRNLIAVLGE HDLSEHDGDE QSRRVAQVII PSTYVPGTTN HDIALLRLHQ PVVLTDHVVP LCLPERTFSE RTLAFVRFSL VSGWGQLLDR GATALELMVL NVPRLMTQDC LQQSRKVGDS PNITEYMFCA GYSDGSKDSC KGDSGGPHAT HYRGTWYLTG IVSWGQGCAT VGHFGVYTRV SQYIEWLQKL MRSEPRPGVL LRAPFPSSSS KAPPPSLPSP SRLPGPSDTP ILPQSSSSKA PPPSLPSPSR LPGPSDTPIL PQSSSSKAPP PSLPSPSRLP GPSDTPILPQ (서열 번호 7).
또 다른 구현예에서, (카르복시 말단에 부착된) 활성 인자 VII-CTP-CTP-CTP(FVIIa-CTP3)의 아미노산 서열은 신호 서열이 없으며, 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 　 또 다른 구현예에서, FVIIa-CTP3은 신호 서열이 없으며, 서열 번호 7의 동족체를 포함한다. 　 또 다른 구현예에서, FVIIa-CTP3은 신호 서열이 없으며, 서열 번호 7의 변이체를 포함한다. 　 또 다른 구현예에서, FVIIa-CTP3의 아미노산 서열은 잔기 152에서의 아르기닌(R)과 잔기 153에서의 이소류신(I) 사이에서 절단된다. 또 다른 구현예에서, FVIIa-CTP3의 아미노산 서열은 각각의 사슬 상에 존재하는 시스테인 잔기 사이에서 이황화 S-S 브리지를 포함하는 이황화-결합 2 사슬 이종이량체로서 구조적으로 존재한다. 또 다른 구현예에서, FVIIa-CTP3의 아미노산 서열은 경쇄 내에 존재하는 시스테인 잔기와 중쇄 내에 존재하는 시스테인 잔기 사이의 이황화-S-S-결합에 의해 결합된 경쇄 및 중쇄를 포함하는 이종이량체로서 구조적으로 존재한다. 또 다른 구현예에서, 경쇄는 FVIIa-CTP3 아미노산 서열의 N-말단 단편을 포함하고, 중쇄는 FVIIa-CTP3 아미노산 서열의 C-말단 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 시스테인 잔기는 경쇄 또는 중쇄 내의 임의의 시스테인 잔기일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 FVIIa-CTP3의 아미노산 서열은 서열 번호 7의 시스테인 잔기 135 및 잔기 262 사이에서 S-S 브리지를 포함하는 이황화-결합 2 사슬 이종이량체로서 구조적으로 존재하며, 상기 2 사슬은 서열 번호 7의 아미노산 1~152를 포함하는 경쇄 및 아미노산 153~490을 포함하는 중쇄를 포함한다. 　
또 다른 구현예에서, 경쇄는 변성 조건 하의 SDS-PAGE 내에서 약 25 kDA에서 이동한다. 또 다른 구현예에서, 중쇄는 변성 조건 하의 SDS-PAGE 내에서 약 50 kDA에서 이동한다. 또 다른 구현예에서, 중쇄는 변성 조건 하의 SDS-PAGE 내에서 약 60 kDA에서 이동한다.
또 다른 구현예에서, 3개의 CTP가 C-말단에 부착되어 변형된 활성 FVII(FVIIa-CTP-CTP-CTP)의 경쇄는 서열 번호 8
ANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGR (서열 번호 8)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 3개의 CTP가 C-말단에 부착되어 변형된 활성 FVII(FVIIa-CTP-CTP-CTP)의 중쇄는 서열 번호 9
IVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열 번호 9)를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 응고 인자-CTP를 발현하는 세포에 퓨린(furin)이 첨가된다. 또 다른 구현예에서, 퓨린은 세포 내에서 본 개시의 응고 인자-CTP의 생산 효율을 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 퓨린은 본 개시의 응고 인자-CTP의 코딩 서열을 포함하는 벡터와 함께 형질 감염된다. 또 다른 구현예에서, 퓨린은 별도의 벡터에 의해 암호화된다. 또 다른 구현예에서, 퓨린과 응고 인자-CTP는 하나의 벡터에 의해 암호화된다. 또 다른 구현예에서, 퓨린의 코딩 서열은 pCI-DHFR 내에 삽입된다. 또 다른 구현예에서, 퓨린의 코딩 서열은 pCI-dhfr/smaI+NotI, Furin/AsisI F.I.+NotI에서 조작된다.
또 다른 구현예에서, 퓨린을 암호화하는 핵산 서열은 다음의 핵산 서열을 포함한다: tctagagtcgaccccgccatggagctgaggccctggttgctatgggtggtagcagcaacaggaaccttggtcctgctagcagctgatgctcagggccagaaggtcttcaccaacacgtgggctgtgcgcatccctggaggcccagcggtggccaacagtgtggcacggaagcatgggttcctcaacctgggccagatcttcggggactattaccacttctggcatcgaggagtgacgaagcggtccctgtcgcctcaccgcccgcggcacagccggctgcagagggagcctcaagtacagtggctggaacagcaggtggcaaagcgacggactaaacgggacgtgtaccaggagcccacagaccccaagtttcctcagcagtggtacctgtctggtgtcactcagcgggacctgaatgtgaaggcggcctgggcgcagggctacacagggcacggcattgtggtctccattctggacgatggcatcgagaagaaccacccggacttggcaggcaattatgatcctggggccagttttgatgtcaatgaccaggaccctgacccccagcctcggtacacacagatgaatgacaacaggcacggcacacggtgtgcgggggaagtggctgcggtggccaacaacggtgtctgtggtgtaggtgtggcctacaacgcccgcattggaggggtgcgcatgctggatggcgaggtgacagatgcagtggaggcacgctcgctgggcctgaaccccaaccacatccacatctacagtgccagctggggccccgaggatgacggcaagacagtggatgggccagcccgcctcgccgaggaggccttcttccgtggggttagccagggccgaggggggctgggctccatctttgtctgggcctcggggaacgggggccgggaacatgacagctgcaactgcgacggctacaccaacagtatctacacgctgtccatcagcagcgccacgcagtttggcaacgtgccgtggtacagcgaggcctgctcgtccacactggccacgacctacagcagtggcaaccagaatgagaagcagatcgtgacgactgacttgcggcagaagtgcacggagtctcacacgggcacctcagcctctgcccccttagcagccggcatcattgctctcaccctggaggccaataagaacctcacatggcgggacatgcaacacctggtggtacagacctcgaagccagcccacctcaatgccaacgactgggccaccaatggtgtgggccggaaagtgagccactcatatggctacgggcttttggacgcaggcgccatggtggccctggcccagaattggaccacagtggccccccagcggaagtgcatcatcgacatcctcaccgagcccaaagacatcgggaaacggctcgaggtgcggaagaccgtgaccgcgtgcctgggcgagcccaaccacatcactcggctggagcacgctcaggcgcggctcaccctgtcctataatcgccgtggcgacctggccatccacctggtcagccccatgggcacccgctccaccctgctggcagccaggccacatgactactccgcagatgggtttaatgactgggccttcatgacaactcattcctgggatgaggatccctctggcgagtgggtcctagagattgaaaacaccagcgaagccaacaactatgggacgctgaccaagttcaccctcgtactctatggcaccgcccctgaggggctgcccgtacctccagaaagcagtggctgcaagaccctcacgtccagtcaggcctgtgtggtgtgcgaggaaggcttctccctgcaccagaagagctgtgtccagcactgccctccaggcttcgccccccaagtcctcgatacgcactatagcaccgagaatgacgtggagaccatccgggccagcgtctgcgccccctgccacgcctcatgtgccacatgccaggggccggccctgacagactgcctcagctgccccagccacgcctccttggaccctgtggagcagacttgctcccggcaaagccagagcagccgagagtccccgccacagcagcagccacctcggctgcccccggaggtggaggcggggcaacggctgcgggcagggctgctgccctcacacctgcctgaggtggtggccggcctcagctgcgccttcatcgtgctggtcttcgtcactgtcttcctggtcctgcagctgcgctctggctttagttttcggggggtgaaggtgtacaccatggaccgtggcctcatctcctacaaggggctgccccctgaagcctggcaggaggagtgcccgtctgactcagaagaggacgagggccggggcgagaggaccgcctttatcaaagaccagagcgccctctgaacgcggccgc (서열 번호 10).
또 다른 구현예에서, 퓨린의 아미노산 서열은 다음의 아미노산 서열을 포함한다: MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHLNANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACVVCEEGFSLHQKSCVQHCPPGFAPQVLDTHYSTENDVETIRASVCAPCHASCATCQGPALTDCLSCPSHASLDPVEQTCSRQSQSSRESPPQQQPPRLPPEVEAGQRLRAGLLPSHLPEVVAGLSCAFIVLVFVTVFLVLQLRSGFSFRGVKVYTMDRGLISYKGLPPEAWQEECPSDSEEDEGRGERTAFIKDQSAL (서열 번호 11).
일 구현예에서, 용어 "응고 인자"는 알려진 응고 인자의 동족체를 포함한다. 일 구현예에서, 동족체는 응고 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 상동성은 응고 인자의 결실 변이체, 삽입 변이체, 또는 (아미노산 치환을 포함하는) 치환 변이체, 및 응고 인자의 생물학적 활성 폴리펩티드 단편을 또한 포함한다. 일 구현예에서, 변이체는 보존적 치환, 결실, 삽입, 또는 응고 인자의 3 차원 구조를 유의하게 변경시키지 않는 치환을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 결실, 삽입, 또는 치환은, 일 구현예에서 특정 결합 파트너에 대한 결합인, 응고 인자의 관심 기능을 변경시키지 않는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 응고 인자의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 응고 활성을 갖는 응고 인자의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 기능성 결합을 갖는 응고 인자의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 응고 활성을 갖는 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 기능성 결합을 갖는 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 기본 파라미터를 사용해 국립 생물정보센터(National Center of Biotechnology Information; NCBI)의 BlastP 소프트웨어를 사용해 결정된 바와 같이, 동족체(예: 폴리펩티드)는 응고 인자에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 89%, 적어도 91%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 [(CTP)n>1-응고 인자]는 아미노 말단 상에 CTP를 갖지 않는 적어도 하나의 CTP 단위에 그의 카르복시 말단 상에서 펩티드 결합을 통해 연결된 전장 응고 인자 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 [(CTP)n>1-응고 인자]는 아미노 말단 상에 CTP를 갖지 않는 추가 CTP 단위에 펩티드 결합을 통해 연결되는 적어도 하나의 CTP 단위에 펩티드 결합을 통해 연결된 응고 인자 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나의 핵산 분자는, C-말단에 부착된 적어도 하나의 CTP를 포함하고 아미노 말단 상에 CTP를 포함하지 않는 조작된 응고 인자를 암호화한다.
또 다른 구현예에서, CTP는 링커를 통해 응고 인자에 부착된다. 또 다른 구현예에서, CTP 서열을 응고 인자에 연결하는 링커는 공유 결합이다. 또 다른 구현예에서, CTP 서열을 응고 인자에 연결하는 링커는 펩티드 결합이다. 또 다른 구현예에서, CTP 서열을 응고 인자에 연결하는 링커는 치환된 펩티드 결합이다. 또 다른 구현예에서, CTP 서열은: DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (서열 번호 12)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP 서열은: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열 번호 13)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP 서열은 서열 번호 12 및 서열 번호 13에 제시된 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 　 　
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 카르복시 말단 펩티드(CTP)는 서열 번호 12에 제시된 바와 같은, 인간 융모성 성선 자극 호르몬의 아미노산 위치 112 내지 145의 아미노산 서열을 포함한다. 　 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 서열은 서열 번호 13에 제시된 바와 같은, 인간 융모성 성선 자극 호르몬의 아미노산 위치 118 내지 145의 아미노산 서열을 포함한다. 　 또 다른 구현예에서, CTP 서열은 또한 인간 융모성 성선 자극 호르몬의 위치 112와 118 사이의 임의 위치에서 시작하여 위치 145에서 종결된다. 일부 구현예에서, CTP 서열 펩티드는 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34개 아미노산 길이이고, CTP 아미노산 서열의 위치 112, 113, 114, 115, 116, 117 또는 118에서 시작한다.
또 다른 구현예에서, CTP 펩티드는, 참조로서 본원에 통합된 미국 특허 제5,712,122호에 기술된 바와 같이, 천연(native) CTP와는 1~5개의 보존적 아미노산 치환만큼 상이한 융모성 성선 자극 호르몬 CTP의 변이체이다. 　 또 다른 구현예에서, CTP 펩티드는 천연 CTP와는 1개의 보존적 아미노산 치환만큼 상이한 융모성 성선 자극 호르몬 CTP의 변이체이다. 또 다른 구현예에서, CTP 펩티드는 천연 CTP와는 2개의 보존적 아미노산 치환만큼 상이한 융모성 성선 자극 호르몬 CTP의 변이체이다. 또 다른 구현예에서, CTP 펩티드는 천연 CTP와는 3개의 보존적 아미노산 치환만큼 상이한 융모성 성선 자극 호르몬 CTP의 변이체이다. 또 다른 구현예에서, CTP 펩티드는 천연 CTP와는 4개의 보존적 아미노산 치환만큼 상이한 융모성 성선 자극 호르몬 CTP의 변이체이다. 또 다른 구현예에서, CTP 펩티드는 천연 CTP와는 5개의 보존적 아미노산 치환만큼 상이한 융모성 성선 자극 호르몬 CTP의 변이체이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 펩티드 아미노산 서열은 천연 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩티드에 대해 적어도 70% 상동성이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 펩티드 아미노산 서열은 천연 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩티드에 대해 적어도 80% 상동성이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 펩티드 아미노산 서열은 천연 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩티드에 대해 적어도 90% 상동성이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 펩티드 아미노산 서열은 천연 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩티드에 대해 적어도 95% 상동성이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 펩티드 아미노산 서열은 천연 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩티드에 대해 적어도 98% 상동성이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 천연 인간 CTP DNA 서열 또는 이의 펩티드에 대해 적어도 70% 상동성이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 천연 인간 CTP DNA 서열 또는 이의 펩티드에 대해 적어도 80% 상동성이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 천연 인간 CTP DNA 서열 또는 이의 펩티드에 대해 적어도 90% 상동성이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 천연 인간 CTP DNA 서열 또는 이의 펩티드에 대해 적어도 95% 상동성이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 천연 인간 CTP DNA 서열 또는 이의 펩티드에 대해 적어도 98% 상동성이다.
일 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 적어도 하나가 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 양쪽 모두가 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 2개가 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 3개가 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 4개가 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 5개가 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 2개 이상이 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 모두가 절단된다. 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열 번호 14의 첫 10개의 아미노산을 포함한다. 　 또 다른 구현예에서, 서열 번호 14는 다음의 아미노산(AA) 서열을 포함한다: SSSSKAPPPSLP. 또 다른 구현예에서, 서열 번호 14의 첫 10개의 아미노산은 서열 번호 15 SSSSKAPPPS에 제시되어 있다.
일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열 번호 13의 첫 10개의 아미노산을 포함한다. 　
일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열 번호 13의 첫 11개의 아미노산을 포함한다. 　 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열 번호 13의 첫 12개의 아미노산을 포함한다. 　 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 첫 8개의 아미노산을 포함한다. 　 　 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열 번호 13의 첫 13개의 아미노산을 포함한다. 　 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열 번호 13의 첫 14개의 아미노산을 포함한다. 　 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 첫 6개의 아미노산을 포함한다. 　 　 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 첫 5개의 아미노산을 포함한다. 　 　
일 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 적어도 하나가 글리코실화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 2개가 글리코실화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 3개가 글리코실화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 4개가 글리코실화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 5개가 글리코실화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 2개 이상이 글리코실화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 모두가 글리코실화된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 서열은 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 서열은 적어도 2개의 글리코실화 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 서열은 적어도 3개의 글리코실화 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 CTP 서열은 적어도 4개의 글리코실화 부위를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 하나 이상이 완전히 글리코실화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선 자극 호르몬 CTP 아미노산 서열 중 하나 이상이 부분적으로 글리코실화된다. 일 구현예에서, "부분적 글리코실화"는 CTP 글리코실화 부위 중 하나가 글리코실화되는 것을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, CTP 글리코실화 부위 중 2개가 글리코실화된다. 또 다른 구현예에서, CTP 글리코실화 부위 중 3개가 글리코실화된다.
일부 구현예에서, CTP 서열 변경은 적은 투여량을 사용할 수 있게 하는 데 유리하다. 일부 구현예에서, CTP 서열 변경은 경미한 투여량을 허용하는 데 유리하다. 일부 구현예에서, CTP 서열 변경은 안전하고 지속적인 효과가 나타나게 하는 데 유리하다.
일부 구현예에서, 본원에서 사용된 바와 같이 "폴리펩티드(polypeptide)", "조작된 응고 인자(engineered coagulation factor)", 또는 "단백질(protein)"은 천연 폴리펩티드(분해 생성물, 합성된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드) 및 펩티드 모방체(일반적으로, 합성된 폴리펩티드)뿐만 아니라, 응고 인자를 포함하는 폴리펩티드를 체내에서 보다 안정하게 또는 세포 내에 더 침투할 수 있게 하는 변경을 갖는 폴리펩티드 유사체인 펩토이드 및 세미펩토이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형은 CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH 또는 CF=CH를 포함하되 이들로 한정되지 않는 폴리펩티드 결합 변형, C 말단 변형, 백본 변형, 및 잔기 변형을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 펩티드 모방체 화합물의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 본원에 완전히 제시된 것처럼 참조로서 통합된 Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)에 명시되어 있다. 이와 관련된 더 세부적인 내용은 아래에 제공된다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 내의 폴리펩티드 결합(-CO-NH-)이 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합은 N-메틸화 결합(-N(CH3)으로 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합은 에스테르 결합(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-))으로 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합은 케토메틸렌 결합(-CO-CH2-)으로 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합은 α-aza 결합(-NH-N(R)-CO-)으로 치환된다(여기서, R은 임의의 알킬(예: 메틸) 카르바 결합(-CH2-NH-)임). 일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합은 히드록시에틸렌 결합(-CH(OH)-CH2-)으로 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합은 티오아미드 결합(-CS-NH-)으로 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합은 올레핀 이중 결합(-CH=CH-)으로 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합은 레트로 아미드 결합(-NH-CO-)으로 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합은 폴리펩티드 변이체(-N(R)-CH2-CO-)로 치환된다(여기서, R은 탄소 원자 상에서 자연적으로 제시되는 "곧은(normal)" 측쇄임). 일부 구현예에서, 이들 변형은 폴리펩티드 사슬을 따라 결합 중 임의의 하나에서 발생하며, 일 구현예에서는, 여러 결합(2~3 결합)에서 동시에 발생한다.
일부 구현예에서, Trp, Tyr 및 Phe와 같은 폴리펩티드의 천연 방향족 아미노산은 페닐글리신, TIC, 나프틸엘라닌(Nol), Phe의 고리-메틸화 유도체, Phe의 할로겐화 유도체 또는 o-메틸-Tyr과 같은 합성 비-천연 산으로 치환된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 하나 이상의 변형 아미노산 또는 하나 이상의 비-아미노산 모노머(예: 지방산, 복합 탄수화물 등)를 포함한다.
일부 구현예에서, 천연 아미노산인 글루탐산(Glu)은 번역 후 카르복실화되어 카르복시글루탐산(Gla)의 존재 하에 본원에 기술된 CTP-변형 FVII 또는 CTP-변형 FVIIa를 생성한다.
일 구현예에서, "아미노산(amino acid)" 또는 "아미노산 서열(amino acid sequence)"은 20개의 자연 발생 아미노산, 즉 종종 체내에서 번역 후 변형되는 히드록시프롤린(hydroxyproline), 포스포세린(phosphoserine) 및 포스포트레오닌(phosphothreonine)과 같은 아미노산; 및 2-아미노아디프산(aminoadipic acid), 히드록시라이신(hydroxylysine), 이소데스모신(isodesmosine), 노르발린(nor-valine), 노르류신(nor-leucine) 및 오르니틴(ornithine)을 포함하되 이들로 한정되지 않는 이상 아미노산을 포함하는 것으로 이해된다. 일 구현예에서, "아미노산"은 D- 및 L-아미노산 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 응고 인자를 용해 가능한 형태로 포함하는 폴리펩티드를 필요로 하는 치료제에 활용된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는, 히드록실-함유 측쇄로 인해 폴리펩티드의 가용성을 증가시킬 수 있는, 세린 및 트레오닌을 포함하되 이들로 한정되지 않는 이상의 비-천연 또는 천연 극성 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 응고 인자는 선형으로 활용되지만, 고리화가 조작된 응고 인자의 특성을 심각하게 방해하지 않는 경우, 조작된 응고 인자의 고리 형태도 활용될 수 있음을 당업자가 인식할 것이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 조작된 응고 인자는 생화학적으로, 예컨대 표준 고체상 기술(standard solid phase techniques)을 사용해 합성된다. 일부 구현예에서, 이들 생화학적 방법에는 완전 고체상 합성(exclusive solid phase synthesis), 부분 고체상 합성(partial solid phase synthesis), 단편 축합(fragment condensation), 또는 전통적 용액 합성(classical solution synthesis)이 포함된다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 기술을 사용하여 본원에 개시된 조작된 응고 인자를 생성한다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질 기술은 비교적 긴 (예: 18~25개의 아미노산보다 긴) 폴리펩티드를 생성하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질 기술은 본원에 개시된 조작된 응고 인자를 대량으로 생성하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 재조합 기술은 Bitter 등에 의한, (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier 등에 의한 (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson 등에 의한 (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu 등에 의한 (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi 등에 의한 (1984) EMBO J. 3:1671-1680 및 Brogli 등에 의한, (1984) Science 224:838-843, Gurley 등에 의한 (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 및 Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463에 기술되어 있으며, 본 문헌들은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 전술한 바와 같은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 코딩 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 전술한 바와 같은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 코딩 부분으로 이루어진 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 전술한 바와 같은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 코딩 부분으로 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 전술한 바와 같은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3개의 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 전술한 바와 같은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3개의 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 전술한 바와 같은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3개의 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 분자이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또 다른 구현예에서, FVII 폴리펩티드 및 상기 FVII 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착된 3개의 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)로 이루어진 CTP-변형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 개시된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 발현 벡터로부터 발현된 CTP-변형 FVII는 발현 후 일정 시점에 활성화되어 CTP-변형 FVIIa를 생성할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 기술된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 인자 VII(FVII) 폴리펩티드 및 상기 FVIIa 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착된 3개의 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)로 이루어진 CTP-변형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포가 개시된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 발현 벡터로부터 발현되어 세포 내에 있는 CTP-FVII는 세포로부터 분비된 후에 활성화될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 기술된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 인자 VII(FVII) 폴리펩티드 및 상기 FVIIa 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착된 3개의 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)로 이루어진 CTP-변형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물이 개시된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 기술된 바와 같은 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 또 다른 구현예에서, 세포는 원핵 세포이다.
일 구현예에서, CTP-변형 FVII의 생산 방법으로서, 상기 FVII의 카르복시 말단에 3개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 부착하여 CTP-변형 FVII를 생산하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 응고 인자는 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용해 합성된다. 일부 구현예에서, 조작된 응고 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자는 시스-조절 서열(예: 프로모터 서열)의 전사 조절을 포함하는 발현 벡터 내에 결합된다. 일부 구현예에서, 시스-조절 서열은 본원에 기술된 조작된 응고 인자의 구성적 발현(constituent expression)을 유도하는 데 적합하다. 일부 구현예에서, 시스-조절 서열은 본원에 기술된 조작된 응고 인자의 조직-특이적 발현(tissue-specific expression)을 유도하는 데 적합하다. 일부 구현예에서, 시스-조절 서열은 본원에 기술된 조작된 응고 인자의 유도성 발현(inducible expression)을 유도하는 데 적합하다.
일부 구현예에서, 본 개시와 함께 사용하기에 적합한 조직-특이적 프로모터는 하나 이상의 특이 세포 개체군에서 기능성인 서열을 포함한다. 예에는 간-특이적인 알부민과 같은 프로모터[Pinkert 등, (1987) Genes Dev. 1:268-277], 림프구-특이적인 프로모터[Calame 등, (1988) Adv. Immunol. 43:235-275], 특히 T-세포 수용체의 프로모터[Winoto 등, (1989) EMBO J. 8:729-733] 몇 면역 글로불린의 프로모터 [Banerji 등 (1983) Cell 33729-740], 신경세사 프로모터(neurofilament promoter)와 같은 뉴런-특이적 프로모터[Byrne 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477], 췌장-특이적 프로모터[Edlunch 등 (1985) Science 230:912-916] 또는 우유 유장 프로모터(milk whey promoter)와 같은 유선-특이적 프로모터(미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 출원 공개 제264,166호)가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 본 발명과 사용하기에 적합한 유도성 프로모터는, 예를 들어, 테트라시클린-유도성 프로모터(Srour, M.A., 등, 2003. Thromb. Haemost. 90: 398-405)를 포함한다.
일 구현예에서, "폴리뉴클레오티드 분자(polynucleotide molecule)"라는 문구는 RNA 서열, 상보성 폴리뉴클레오티드 서열(cDNA), 게놈 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 복합 폴리뉴클레오티드 서열(예: 상기한 것들의 조합)의 형태로 단리되고 제공되는 단일 또는 이중 가닥 핵산 서열을 지칭한다.
일 구현예에서, "상보성 폴리뉴클레오티드 서열(complementary polynucleotide sequence)"은 역전사 효소 또는 임의의 다른 RNA-의존적 DNA 중합 효소를 사용해 메신저 RNA를 역전사하여 생성되는 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 서열은 DNA 중합 효소를 사용해 체내에서 또는 시험관에서 후속적으로 증폭될 수 있다.
일 구현예에서, "게놈 폴리뉴클레오티드 서열(genomic polynucleotide sequence)"은 염색체로부터 유래된(단리된) 서열을 지칭하므로, 이는 염색체의 연속적인 부분을 나타낸다.
일 구현예에서, "복합 폴리뉴클레오티드 서열(composite polynucleotide sequence)"은 적어도 부분적으로 상보성이고 적어도 부분적으로 게놈인 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 복합 서열은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 암호화에 필요한 일부 엑손 서열뿐만 아니라 그 사이에 개재되는 일부 인트론 서열도 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 인트론 서열은 다른 유전자의 것을 포함하여 임의의 공급원의 것일 수 있고, 보존된 스플라이싱 신호 서열을 일반적으로 포함하게 된다. 일 구현예에서, 인트론 서열은 시스-작용 발현 조절 요소를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 이후 및 분비 이전에, 신호 펩티드는 전구체 조작된 응고 인자로부터 절단됨으로써, 신호 서열이 결여된 성숙한 조작된 응고 인자가 생성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 성숙한 조작된 응고 인자는 분비된 후에 활성화된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 PCR 기술, 또는 당업자에게 알려진 방법이나 단계를 사용해 제조된다. 일부 구현예에서, 상기 단계는 2개의 상이한 DNA 서열를 결합시키는 것을 포함한다(예: "Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel 등, John Wiley & Sons, 1992 참조).
일 구현예에서, 본원에 개시된, 조작된 응고 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터(핵산 작제물) 내에 삽입되어 재조합 폴리펩티드가 발현될 수 있게 한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 발현 벡터는 이러한 벡터를 원핵 생물에서의 복제와 통합에 적합하게 하는 추가 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 발현 벡터는 이러한 벡터를 진핵 생물에서의 복제와 통합에 적합하게 하는 추가 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 발현 벡터는 이러한 벡터를 원핵 생물과 진핵 생물 모두에서의 복제와 통합에 적합하게 하는 셔틀 벡터(shuttle vector)를 포함한다. 일부 구현예에서, 클론 벡터(cloning vector)는 전사 및 번역 개시 서열(예: 프로모터, 인핸서) 및 전사 및 번역 종결자(예: 폴리아데닐화 신호)를 포함한다.
일 구현예에서, 다양한 원핵 또는 진핵 세포가 숙주 발현 시스템으로 사용되어 본원에 개시된 응고 인자를 발현시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질 변환된 박테리아와 같은 미생물; 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질 변환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 꽃양배추 모자이크 바이러스인 CaMV; 담배 모자이크 바이러스인 TMV)로 감염되거나 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 Ti 플라스미드와 같은 재조합 플라스미드 발현 벡터로 형질 변환된 식물 세포 시스템을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 비-박테리아 발현 시스템(예: CHO 세포와 같은 포유류 발현 시스템)이 사용되어 본원에 개시된 응고 인자를 발현시킨다. 일 구현예에서, 포유류 세포에서 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 발현시키도록 사용된 발현 벡터는 CMV 프로모터 및 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 pCI-DHFR 벡터이다. pCI-dhfr 벡터의 작제는 일 구현예에 따라 국제 출원 제PCT/IL2016/050645호에 기술되어 있으며, 상기 출원은 그 전체가 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 박테리아 시스템에서는, 발현된 폴리펩티드에 대한 사용하고자 하는 의도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 대량의 폴리펩티드가 바람직하다. 일 구현예에서, 가능하게는 단백질 산물이 쉽게 정제되는 배양 배지 또는 박테리아의 주변 세포질 내로 발현 산물을 유도하는 소수성 신호 서열을 갖는 융합물로서, 단백질 산물이 높은 수준으로 발현되도록 하는 벡터가 바람직하다. 일 구현예에서, 특정 융합 단백질이 특정 절단 부위와 함께 조작되어 폴리펩티드의 회수에 도움을 준다. 일 구현예에서, 이러한 조작에 적합한 벡터는 대장균 발현 벡터의 pET 계열을 포함하되, 이에 한정되지 않는다[Studier 등, Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)].
일 구현예에서, 효모 발현 시스템이 사용된다. 일 구현예에서, 미국 특허 출원 제5,932,447호(그 전체가 본원에 참조로서 통합됨)에 개시된 바와 같이, 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 함유하는 다수의 벡터가 효모에서 사용될 수 있다. 　 　 　 또 다른 구현예에서, 효모 염색체 내로 외래 DNA 서열이 통합되도록 촉진하는 벡터가 사용된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 발현 벡터는, 예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)와 같은 단일 mRNA 유래의 몇 가지 단백질 및 프로모터-키메라 폴리펩티드의 게놈 통합을 위한 서열에 대한 번역을 가능하게 하는 추가 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 횡적 감염(lateral infection) 및 표적화 특이성과 같은 장점을 제공하므로, 이들은 본원에 개시된 응고 인자를 체내 발현시키는 데 유용하다. 일 구현예에서, 횡적 감염은, 예를 들어, 레트로바이러스의 생애 주기 중에 내재되어 있으며, 하나의 감염된 세포가, 이로부터 분리되어 이웃 세포를 감염시키는 많은 후손 비리온(virion)을 생산하는 과정이다. 일 구현예에서, 결과적으로 대부분이 애초에 원 바이러스 입자에 의해 감염되지 않았던 넓은 영역이 급속히 감염되는 것이다. 일 구현예에서, 횡적으로 퍼질 수 없는 바이러스 벡터가 생산된다. 일 구현예에서, 원하는 목적이 특정 유전자를 다수의 국소화 표적 세포에만 도입하고자 하는 것일 때 이러한 특징이 유용할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 발현 벡터를 세포 내에 도입하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 Sambrook 등의, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), Ausubel 등의, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang 등의, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega 등의, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) 및 Gilboa 등의, [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]에 일반적으로 기술되어 있으며, 예를 들어, 안정하거나 일시적인 형질 감염, 리포펙션, 전기 천공법 및 재조합 바이러스 벡터를 사용한 감염을 포함한다. 또한, 양성-음성 선택법의 경우, 본원에 참조로서 통합된 미국 특허 제5,464,764호 및 제5,487,992호를 참조한다.
일부 구현예에서, 바이러스 감염에 의해 핵산을 도입하는 경우, 바이러스의 감염성으로 인해 높은 형질 감염 효율을 얻을 수 있으므로, 리포펙션 및 전기 천공법과 같은 다른 방법에 비해 여러 가지 장점이 제공된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 응고 인자는 본원에서 전술한 임의의 적합한 투여 방식(즉, 체내 유전자 요법)을 사용해 개체에게 투여된 핵산 작제물로부터 발현될 수도 있음을 이해할 것이다. 일 구현예에서, 핵산 작제물을 필요에 따라 적절한 유전자 전달 비히클/방법(형질 감염, 형질 도입, 상동성 재조합 등) 및 발현 시스템을 통해 적합한 세포 내에 도입한 뒤, 변형 세포를 배양 중에 증식시켜 개체에게 다시 투여한다(예: 체외 유전자 요법).
일 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용된다. 일 구현예에서, 폴리펩티드 코딩 서열의 발현은 다수의 프로모터에 의해 진행된다. 일부 구현예에서, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터[Brisson 등의, Nature 310:511-514 (1984)]와 같은 바이러스 프로모터 또는 TMV에 대한 외피 단백질 프로모터[Takamatsu 등의, EMBO J. 6:307-311 (1987)]가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 예를 들어 RUBISCO의 작은 서브유닛[Coruzzi 등의, EMBO J. 3:1671-1680 (1984); 및 Brogli 등의, Science 224:838-843 (1984)]과 같은 식물 프로모터, 또는 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B[Gurley 등의, Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)] 와 같은 열충격 프로모터가 사용된다. 일 구현예에서, Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질 변환, 미세주입, 전기 천공법 및 당업자에게 잘 알려진 다른 기술을 사용해 작제물을 식물 세포 내에 도입한다. 예를 들어, Weissbach & Weissbach [Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463 (1988)]을 참조한다. 당업계에 잘 알려진, 곤충 및 포유류 숙주 세포 시스템과 같은 다른 발현 시스템도 본 발명에 사용될 수 있다.
(폴리펩티드를 암호화하는) 삽입 코딩 서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 함유하는 외에, 본원에 개시된 발현 작제물은 발현 폴리펩티드의 안정성, 생산, 정제, 수율 또는 활성을 최적화하도록 조작된 서열도 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 형질 변환 세포는 다량의 재조합 조작된 응고 인자를 발현시킬 수 있는 효과적인 조건 하에 배양된다. 일부 구현예에서, 효과적인 배양 조건은 단백질 생산을 가능하게 하는 효과적인 배지, 생물 반응기, 온도, pH 및 산소 조건을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 효과적인 배지는 본원에 기술된 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위해 세포를 배양되는 임의의 배지를 지칭한다. 일부 구현예에서, 배지는 일반적으로 동화성 탄소(assimilable carbon), 질소 및 인산염 공급원, 및 적절한 염, 미네랄, 금속 및 비타민과 같은 다른 영양소를 갖는 수용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포는 종래의 발효 생물 반응기, 쉐이크 플라스크, 시험관, 미량정량 접시(microtiter dishes) 및 페트리판(petri plates)에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양은 재조합 세포에 적절한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양 조건은 당업자의 전문 지식에 따라 결정된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 생성된 조작 응고 인자는 생산에 사용된 벡터 및 숙주 시스템에 따라 재조합 세포 내에 남거나, 발효 배지 내로 분비되거나, 대장균의 주변 세포질 공간과 같은 2개의 세포막 사이의 공간 내로 분비되거나, 세포 또는 바이러스 막의 외부 표면 상에 잔류한다.
일 구현예에서, 소정의 배양 시간에 이어서 재조합 조작 응고 인자의 회수가 이루어진다.
일 구현예에서, 본원에 사용된 "재조합 조작 응고 인자의 회수(recovering the recombinant engineered coagulation factor)"라는 문구는 폴리펩티드를 함유하는 전체 발효 배지를 수집하는 것을 지칭하며, 추가적인 분리와 정제 단계를 의미하지는 아니다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 응고 인자는 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과, 전기 영동, 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC), 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 콘카나바라린 A 크로마토그래피, 크로마토포커싱 및 용해도 차이와 같은(이들로 한정되지 않음) 다양한 표준 단백질 정제 기술을 사용해 정제된다.
일 구현예에서, 소수성 상호 작용 컬럼의 유형은 Capto Phenil Impress(CIP) 컬럼이다.
일 구현예에서, 회수를 용이하게 하기 위해, 발현된 코딩 서열은 본원에 개시된 조작된 응고 인자를 암호화하도록 조작되고, 절단성 모이어티에 융합될 수 있다. 일 구현예에서, 폴리펩티드가 친화도 크로마토그래피에 의해 (예를 들어, 절단성 모이어티에 대해 특이적인 컬럼 상에 고정함으로써) 쉽게 단리될 수 있도록 융합 단백질을 설계할 수 있다. 일 구현예에서, 절단 부위는 조작된 응고 인자와 절단성 모이어티 사이에서 조작되며, 이 부위에서 융합 단백질을 특이적으로 절단하는 적절한 효소 또는 제제를 사용해 처리함으로써 폴리펩티드가 크로마토그래피 컬럼으로부터 방출될 수 있다[예를 들어, Booth 등의, Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); 및 Gardella 등의, J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990) 참조].
일 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 응고 인자는 "실질적으로 순수한" 형태로 회수된다. 또 다른 구현예에서, 실질적으로 순수한 조작된 응고 인자는 응고 인자의 활성 형태를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 실질적으로 순수한 형태는 적어도 90% 순수한 것이다. 또 다른 구현예에서, 실질적으로 순수한 형태는 적어도 95~99% 순수한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 응고 인자는 시험관내 발현 시스템을 이용해 합성될 수도 있다. 일 구현예에서, 시험관내 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 상기 시스템의 구성 요소는 상업적으로 이용할 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 조작된 응고 인자는 합성되고 정제되며; 치료 효능은 채내에서 또는 시험관내에서 검정될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 조작된 응고 인자의 결합 활성은 당업자에게 알려진 다양한 검정법을 사용해 확인할 수 있다.
본원에 기술된 요소 또는 단계를 포함하는 본원에 개시된 폴리펩티드, 조성물, 제제 및 방법은, 또 다른 구현예에서는 이들 요소 또는 단계로 이루어지거나, 또 다른 구현예에서는 이들 요소 또는 단계로 본질적으로 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 용어 "포함하다(comprise)"는, 제약 업계에 알려진 바와 같은 CTP-변형 응고 인자와 같은 표시된 활성제를 포함하는 것 뿐만 아니라 다른 활성제, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 첨가제, 진정제, 안정화제 등을 포함하는 것도 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 표시된 활성 성분이 유일한 활성 성분인 조성물을 지칭하지만, 제제의 안정화, 보존 등을 위한 것으로서 표시된 활성 성분의 치료 효과에 직접적으로 관여하지 않는 다른 화합물이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "본질적으로 이루어지는"은 활성 성분의 방출을 용이하게 하는 구성 요소를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "이루어지는(consisting)"은 활성 성분 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 함유하는 조성물을 지칭한다.
또 다른 구현예에서, 인자 VII(FVII) 폴리펩티드 및 상기 FVII 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착된 3개의 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)로 이루어진 CTP-변형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 개시된다. 또 다른 구현예에서, 인자 VII(FVII) 폴리펩티드 및 상기 FVIIa 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착된 3개의 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물이 개시된다. 일 구현예에서, CTP-변형 FVII는 신호 펩티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII는 신호 펩티드를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 본원에서 전술한 바와 같은 재조합 응고 인자가 본원에 개시된다. 일 구현예에서, 본원에서 전술한 바와 같은 조작된 응고 인자가 본원에 개시된다. 일 구현예에서, 본원에서 전술한 바와 같은 조작된 응고 인자는 CTP-변형 응고 인자로서 지칭된다.
일 구현예에서, 응고 인자의 카르복시 말단에 부착되는 CTP는 카르복시 말단에 연속으로 부착된다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 조작된 응고 인자는 비-CTP-변형 응고 인자와 비교해 동등하거나 개선된 생물학적 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 조작된 응고 인자는 비-CTP-변형 응고 인자와 비교해 동등하거나 개선된 약물학적(pharmacological) 측정치를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 조작된 응고 인자는 비-CTP-변형 응고 인자와 비교해 동등하거나 개선된 약물동태학(pharmacokinetics)을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 조작된 응고 인자는 비-CTP-변형 응고 인자와 비교해 동등하거나 개선된 약물동력학(pharmacodynamics)을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 용어 "CTP 펩티드", "카르복시 말단 펩티드" 및 "CTP 서열"은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 또 다른 구현예에서, 카르복시 말단 펩티드는 전장 CTP이다.
다른 구현예에서, 용어 "조작된 응고 인자"는 성숙한 응고 인자의 아미노산 서열을 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 "조작된 응고 인자"는 신호 서열 또는 신호 펩티드를 포함하는 응고 인자의 아미노산 서열을 지칭한다.
또 다른 구현예에서, "신호 서열" 및 "신호 펩티드"는 동일한 특성 및 의미를 가지며, 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 또 다른 구현예에서, "서열(sequence)"이 폴리뉴클레오티드 분자와 관련될 때, 이는 코딩 부분을 지칭할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 CTP를 포함하는 조작된 응고 인자는 적어도 하나의 CTP가 없는 동일한 응고 인자와 비교해 강화된 체내 생물학적 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 강화된 생물학적 활성은 적어도 일부 생물학적 활성을 유지하면서 조작된 응고 인자의 반감기가 길어진 것에 기인한다. 또 다른 구현예에서, 강화된 생물학적 활성은 CTP 변형에 의해 강화된 생물학적 활성에 기인한다. 또 다른 구현예에서, 강화된 생물학적 활성은 길어진 반감기 및 CTP-변형 응고 인자의 강화된 기능성 모두에 기인한다.
일부 구현예에서, 응고 인자의 카르복시 말단 단부에 있는 적어도 하나의 CTP 서열은 응고 인자의 분해에 대한 보호를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 응고 인자의 카르복시 말단 단부에 있는 적어도 하나의 CTP 서열은 제거에 대한 보호를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 응고 인자의 카르복시 말단 단부에 있는 적어도 하나의 CTP 서열은 제거 시점을 연장시킨다. 일부 구현예에서, 응고 인자의 카르복시 말단 단부에 있는 적어도 하나의 CTP 서열은 Cmax를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 응고 인자의 카르복시 말단 단부에 있는 적어도 하나의 CTP 서열은 Tmax를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 응고 인자의 카르복시 말단 단부에 있는 적어도 하나의 CTP 서열은 T½를 연장시킨다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 공액 응고 인자(conjugated coagulation factor)는 변형되지 않은 공액 응고 인자와 동일한 방식으로 사용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 공액 응고 인자는 증가된 순환성 반감기 및 혈장 체류 시간, 감소된 제거, 및 증가된 임상적 체내 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자의 개선된 성질로 인해, 이러한 접합체(conjugate)는 동일한 응고 인자의 변형되지 않는 형태보다 덜 빈번하게 투여된다.
또 다른 구현예에서, 투여 빈도의 감소는 치료 전략을 개선하게 되는데, 일 구현예에서, 이는 치료 결과의 개선으로 이어지는 환자의 수용 상태(patient compliance)를 개선할 뿐 아니라 환자의 삶의 질도 개선하게 된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 분자량과 링커 구조를 갖는 접합체는 종래의 응고 인자 접합체와 비교해 개선된 포텐시, 개선된 안정성, 상승한 AUC 수준, 및 강화된 순환 반감기를 갖는 것으로 밝혀졌다.
조성물 및 사용 방법
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 응고 인자는 그 자체로 개체에게 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 응고 인자는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합되는 약제학적 조성물의 일부로서 개체에게 제공될 수 있다.
일 구현예에서, "약제학적 조성물(pharmaceutical composition)" 또는 "약제학적 제제(pharmaceutical formulation)"는 생리학적으로 적합한 담체 및 첨가제와 같은 다른 화학 성분을 갖는, 본원에 기술에 활성 성분 중 하나 이상으로 이루어진 제제(preparation)를 지칭한다. 약제학적 조성물 또는 "약제학적 제제"의 목적은 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다. 특정 구현예에서, "약제학적 조성물" 또는 "약제학적 제제"는 약물의 약제학적 투약 형태를 제공한다. 특정 구현예에서의 "약제학적 조성물" 또는 "약제학적 제제"는 서방성 기술(slow release technologies), 경피 패치, 또는 당업계에 알려진 임의의 투약 형태를 포함한다.
또 다른 구현예에서, "활성 성분(active ingredient)"은 생물학적 효과를 설명할 수 있는 관심 폴리펩티드 서열을 지칭한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 조성물은 관심 조작된 응고 인자의 카르복시 말단에만 임의의 형태로 결합된 적어도 하나의 CTP 서열을 포함할 것이다. 일 구현예에서, 조합된 제제가 본원에 개시된다. 일 구현예에서, "조합 제제(combined preparation)"는 상기 정의된 바와 같은 조합 파트너가 독립적으로, 또는 구별되는 양의 조합 파트너를 갖는 상이한 고정 조합을 사용하여 (동시에, 함께, 별도로, 또는 순차적으로) 투여될 수 있다는 의미에서 특히 "성분 키트(kit of parts)"를 정의한다. 그러면, 일부 구현예에서, 성분 키트의 성분은, 예를 들어, 동시에 투여되거나, 시간순으로 시차를 둔 상태로, 즉 성분 키트 중 임의의 성분에 대해 상이한 시점에 동일하거나 상이한 시간 간격으로 투여될 수 있다. 조합 파트너의 총량의 비율은, 일부 구현예에서는 조합 제제로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 조합 제제는 당업자에 의해 쉽게 만들어질 수 있으므로, 예를 들어, 치료 대상 환자 하위 개체군의 요구 또는 단일 환자의 요구에 대처하기 위해 다양해질 수 있는데, 이는 특정 질환, 질환의 중증도, 나이, 성별, 또는 체중으로 인해 상이한 요구가 존재할 수 있기 때문이다.
또 다른 구현예에서, FVIIa 폴리펩티드 및 상기 FVIIa의 카르복시 말단에 부착된 3개의 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)로 이루어진 CTP-변형 인자 VIIa(FVIIa)를 포함하는 약제학적 조성물 또는 약제학적 제제가 본원에 개시된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자의 치료 유효량을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 공액 응고 인자의 치료 유효량은 치료 중인 특정 병태, 치료 중인 환자의 병태뿐만 아니라 조성물 중의 다른 성분과 같은 인자에 따라 결정된다.
일 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 조성물, 제제, 및 방법에 사용하기 위한 약제학적 제제를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3개의 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 완충액 및 등장화제(tonicity agent)를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 완충액은 20 mM 시트르산 및 13.3 mM 글리세린이고, 등장화제는 150 mM NaCl이다. 또 다른 구현예에서, 제제는 약 6.4의 pH이다. 또 다른 구현예에서, 완충액은 20 mM 시트르산과 13.3 mM 글리세린이고, 등장화제는 150 mM NaCl이며, pH는 6.4이다. 또 다른 구현예에서, 완충액은 20 mM 시트르산, 100 mM 아르기닌, 2% 트레할로오스이며, pH는 6.2이다. 또 다른 구현예에서, 제제는 액체 제제이다. 또 다른 구현예에서, 제제는 동결건조 제제이다. 또 다른 구현예에서, 액체 제제는 동결 건조된 CTP-변형 응고 인자를 사용해 형성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 응고 인자는 FVII-CTP3이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 응고 인자는 FVIIa-CTP3이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 제제를 포함하는 주 1회의 투여 형태가 본원에 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 제제를 포함하는 1일 1회의 투여 형태가 본원에 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 제제를 포함하는 2일 1회의 투여 형태가 본원에 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 제제를 포함하는 3일 단위의 투여 형태가 본원에 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 제제를 포함하는 주 2회의 투여 형태가 본원에 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 제제를 포함하는 주 2회의 투여 형태가 본원에 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 제제를 포함하는 매주 단위의 투여 형태가 본원에 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 제제를 포함하는 2주 단위(매 2주 단위)의 투여 형태가 본원에 제공된다.
일 구현예에서, 응고 인자 및 상기 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선 자극 호르몬 CTP로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 제제가 본원에 개시되는데, 상기 폴리펩티드는 신호 펩티드로 이루어지고, 상기 제제는 증가된 안정성을 갖는다. 일 구현예에서, 제제는 적어도 1년간 안정적이다. 일 구현예에서, 제제는 적어도 2년간 안정적이다.
일 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 액체 제제로 제형된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 인자 VII는 액체 제제로 제형된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 인자 VIIa는 액체 제제로 제형된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 비강내 투여 형태로 제형된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 주사식 투여 형태로 제형된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 방법들에는 응고 인자 요법의 사용에 있어서 순응성(compliance)을 증가시키는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 CTP에 의해 변형된 응고 인자를 이를 필요로 하는 대상물에 제공하여 응고 인자 요법의 사용에 있어서 순응성을 증가시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 1일 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자를 포함하는 폴리펩티드는 매 2일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 매 3일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 매 4일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 매 5일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 매 6일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 매주 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 매 7~14일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 매 10~20일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 매 5~15일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 매 15~30일마다 1회 대상물에게 투여된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 제제는 주사기 또는 펜(Pen) 장치를 통해 주입하기 위한 액체 제제로 제형될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 제제는: 염화 벤즈알코늄(benzalkonium chloride) 및 티메로살(thimerosal) 등과 같은 보존제; 에데트산나트륨(edate sodium) 등과 같은 킬레이트제; 인산염, 시트르산염, 및 아세트산염과 같은 완충액; 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 만니톨 등과 같은 등장화제; 아스코르브산, 아세틸시스틴, 메타중아황산나트륨(sodium metabisulfote) 등과 같은 항산화제; 방향제; 셀룰로오스 및 이의 유도체를 포함하는, 중합체와 같은 점도 조절제(viscosity adjustors); 및 필요에 따라 이들 수성 조성물의 pH를 조절하기 위한 폴리비닐 알코올 및 산과 염기도 포함한다. 조성물은 국부 마취제 또는 기타 활성 물질을 또한 포함한다. 조성물은 분무제(sprays), 미스트제(mists), 드로프스제(drops) 등으로서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자는 인간 응고 인자이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자는 응고 장애(coagulation 또는 clotting disorder)를 앓고 있는 대상물의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 응고 장애는 혈우병(Hemophilia)이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자는 혈우병의 예방 치료를 통해 출혈 및 관련 합병증의 위험을 감소시키는 데 유용하다. 또 다른 구현예에서, 출혈 및 관련 합병증의 위험을 감소시키면 자연 출혈의 위험이 감소된다. 또 다른 구현예에서, 출혈 및 관련 합병증의 위험을 감소시키면 과다 출혈의 위험이 감소된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자는 외부로부터 투여된 응고 인자에 대한 억제성 항체의 발생 위험을 감소시키면서, 혈우병을 앓고 있는 대상물을 치료하는 데 유용하다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자는 혈우병을 앓고 있는 대상물을 치료하여 항상성을 유도하는 데 유용하다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 CTP-변형 응고 인자는 치료적 용도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP-변형 응고 인자는 예방적 용도를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자는 과다 출혈이나 타박상을 앓고 있거나, 프로트롬빈 시간(Prothrombin Time; PT)이나 부분 트롬보플라스틴 시간(Partial Thromboplastin Time; PTT)이 지연되는 대상물의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자는 출혈을 일으키는 후천성 병태, 예컨대 비타민 K 결핍증이나 간질환 등을 가진 대상물의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자는 (다른 질환으로 인한) 후천성이거나 선천성인, 경증이거나 중증인, 영구적이거나 일시적인 응고 인자의 결핍을 가진 대상물의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자는 A형 혈우병을 앓고 있는 대상물의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자는 B형 혈우병을 앓고 있는 대상물의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자는 간질환과 같은 만성 질환으로 인한; 응고 인자를 빠른 속도로 소진하는 파종성 혈관내 응고(disseminated intravascular coagulation; DIC)와 같은 급성 병태로 인한; 또는 비타민 K 결핍이나 와파린(wafarin)과 같은 비타민 K 길항제의 사용으로 인한 후천성 결핍증을 가진 대상물의 치료에 유용하다 (인자 II, VII, 및 X의 생성에는 비타민 K가 필요함). 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공액 응고 인자는 응고 불균형을 야기하는 간질환, 요독증(uremia), 암, 골수 장애(bone marrow disorder), 뱀독에 대한 노출, 비타민 K 결핍, 항응고 요법, 항응고성 와파린의 우발적인 섭취, 다중 수혈(저장된 혈액 단위가 일부 응고 인자를 상실함), 또는 이들의 조합과 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는 질환을 앓고 있는 대상물의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 대상물에서 심부 정맥 혈전증(deep vein thrombosis)을 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 CTP-변형 응고 인자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 또 다른 구현예에서, 혈우병에 걸린 대상물에서 조절되지 않는 출혈(uncontrolled bleeding)을 예방하는 방법으로서, 본원에 개시된 CTP-변형 응고 인자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 또 다른 구현예에서, 혈우병에 걸린 대상물에서 출혈 사례를 예방하는 방법으로서, 본원에 개시된 CTP-변형 응고 인자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 또 다른 구현예에서, B형 혈우병(선천성 인자 IX 결핍증)에 걸린 대상에게서 출혈 사례를 조절하는 방법이 본원에 개시된다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 제제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 본원에 기술된 바와 같은 제제를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 본원에 기술된 바와 같은 제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 응고(clotting 또는 coagulation) 장애를 예방하거나 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 CTP-변형 응고 인자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 예방 및 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 CTP-변형 응고 인자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 CTP-변형 인자 VIIa를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다.
일 구현예에서, 혈우병은 A형 혈우병이다. 또 다른 구현예에서, 혈우병은 B형 혈우병이다. 또 다른 구현예에서, 응고(clotting 또는 coagulation) 장애를 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 방법은 각각 FVIII 또는 FIX에 대한 억제자를 가진 A형 또는 B형 혈우병 환자에서 혈우병을 예방하거나 치료한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 후천성 혈우병(억제자가 없는 혈우병) 환자를 예방 또는 치료하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 응고(clotting 또는 coagulation) 장애를 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 방법은 억제자가 없는 A형 또는 B형 혈우병을 예방하거나 치료한다. 또 다른 구현예에서, 혈우병은 중증 혈우병이다. 또 다른 구현예에서, 혈우병은 중등도의 혈우병이다. 또 다른 구현예에서, 혈우병은 억제자가 있거나 없는 중등도 내지 중증 혈우병이다. 용어 "중등도 내지 중증 혈우병(moderate to severe hemophilia)"은 FVIII 또는 FIX를 3% 이하로 가진 대상물을 지칭한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 또 다른 구현예에서, 중증 혈우병(severe hemophilia)은 약 0~1%와 동등한 응고 인자 수준을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 혈우병은 중등도 혈우병인데, 이는 또 다른 구현예에서는 응고 인자 수준이 1~5%인 혈우병을 기술하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 혈우병은 중등도 혈우병인데, 이는 또 다른 구현예에서는 응고 인자 수준이 5~50%인 혈우병을 기술하는 것이다.
또 다른 구현예에서, 대상물에서 응고(clotting 또는 coagulation) 장애를 예방 또는 치료하는 방법이 본원에 개시되는데, 상기 방법은 FVIIa 폴리펩티드 및 상기 FVIIa 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 포함하는 CTP-변형 인자 VII(FVII) 폴리펩티드를 상기 대상물에게 투여하여, 상기 대상물에서 응고(clotting 또는 coagulation) 장애를 예방하거나 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법이 본원에 개시되는데, 상기 방법은 FVIIa 폴리펩티드 및 상기 FVIIa 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 포함하는 CTP-변형 인자 VIIa(FVIIa) 폴리펩티드를 상기 대상물에게 투여하여, 상기 대상물에서 혈우병을 예방하거나 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 CTP-변형 응고 인자를 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 따라서, 일 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 치료하는 방법이 본원에 개시되는데, 상기 방법은 FVIIa 폴리펩티드 및 상기 FVIIa 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 포함하는 CTP-변형 인자 VIIa(FVIIa) 폴리펩티드를 상기 대상물에게 투여하여, 상기 대상물에서 혈우병을 치료하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, CTP-변형 FVIIa는 동일한 조성물로 동시에 투여된다. 일 구현예에서, CTP-변형 FVIIa는 별개의 조성물로 동시에 투여된다. 일 구현예에서, CTP-변형 FVIIa는 별개의 조성물로 별도의 시간에 투여된다.
또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법이 본원에 개시되는데, 상기 방법은 FVIIa 폴리펩티드 및 상기 FVIIa 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 상기 대상물에게 투여하여, 상기 대상물에서 혈우병을 예방하거나 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법이 본원에 개시되는데, 상기 방법은 FVIIa 폴리펩티드 및 상기 FVIIa 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 포함하는 CTP-변형 인자 VIIa 폴리펩티드를 상기 대상물에게 피하 투여하거나 정맥내 투여하여, 상기 대상물에서 혈우병을 예방하거나 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3~5개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 포함하는 CTP-변형 응고 인자를 대상에게 투여하여, 상기 대상물에서 혈우병을 예방하는 단계를 포함하며, 상기 CTP-변형 응고 인자의 서열은 서열 번호 5 또는 7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 상기 CTP-변형 응고 인자는 서열 번호 5 또는 7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 　 또 다른 구현예에서, 상기 CTP-변형 응고 인자는 서열 번호 7로 이루어진다. 　 또 다른 구현예에서, 서열 번호 7로 이루어진 상기 CTP-변형 응고 인자는 활성화된 FVII(FVIIa)를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 치료하는 방법이 본원에 개시되는데, 상기 방법은 FVIIa 폴리펩티드 및 상기 FVIIa 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 포함하는 활성화된 CTP-변형 인자 VIIa(FVIIa) 폴리펩티드를 상기 대상물에게 투여하여, 상기 대상물에서 혈우병을 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 피하(SC) 투여는 재조합 FVII와 비교해 CTP-변형 FVII의 생체이용률(bioavailability)을 높인다. 또 다른 구현예에서, NovoSeven®의 SC 투여와 비교해, FVIIa-CTP3의 SC 투여 후에 반감기는 더 길고 생체이용률(AUC SC/AUC IV)은 더 높다. 또 다른 구현예에서, 경피 주입된 MOD-5014는 재조합 FVII(NovoSeven®)과 비교해 개선된 마우스 생존율을 나타낸다.
일 구현예에서, MOD-5014는 (C-말단 단부에 부착된 3개의 CTP 펩티드를 가지는) FVIIa-CTP3이다. 일 구현예에서, MOD-5014는 지속성 응고 인자를 제공한다. 일 구현예에서, MOD-5014는 재조합 인간 FVIIa와 비교해 더 지속적이고 연장된 혈액 응고 반응을 제공한다. 당업자는, 용어 MOD-5014 또는 FVIIa-CTP3이 동일한 특징과 의미를 가지면서 서로 교환 가능하게 사용될 수 있고, 일 구현예에서는 아미노산 서열 7을 포함하는 이황화-결합 2 사슬 이종이량체 구조를 지칭한다는 것을 이해할 것이다. 　 또한, 당업자는, 본원에서 응고 인자 또는 FVII-CTP3과 같은 CTP-변형 응고 인자를 기술함에 있어서, 용어 FVII-CTP3이 특정 사례에서는 FVII-CTP3의 불활성 형태를 지칭한다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 활성과 같은 연관된 세부 사항에 기초하여 어떤 형태가 언급되는지를 확실히 인식할 것이다. 유사하게, 용어 MOD-5014가 용어 FVIIa-CTP3와 상호 교환 가능하지만(즉, CTP-변형 응고 인자의 활성 형태를 나타내지만), 특정 사례에서 용어 MOD-5014는 FVII의 활성 형태를 지칭하거나 FVII-CTP3을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 지칭하는 데 사용될 수 있고, 이들은 이후 발현되고 세포로부터 분비되고, 시험관에서 정제 및 활성화되어 MOD-5014 분자에 존재하는 활성 형태인 FVIIa가 될 것이다.
일 구현예에서, 조직 인자 경로 억제제(TFPI)에 의한 MOD-5014의 비활성화는 투여량-의존적이다. 일 구현예에서, TFPI에 의한 MOD-5014의 비활성화는 TFPI에 의한 재조합 FVIIa(NovoSeven®)의 경우와 유사한 용량-의존적 비활성화 패턴을 나타낸다. 일 구현예에서, MOD-5014는 항-트롬빈 III에 의해 억제된다. 일 구현예에서, 항-트롬빈 III에 의한 MOD-5014의 억제는 헤파린(heparin) 존재 하에 확대된다. 일 구현예에서, 항-트롬빈 III에 의한 MOD-5014의 억제는 헤파린의 유무와 상관없이 재조합 FVIIa(NovoSeven®)의 경우와 유사한 억제 패턴을 나타낸다.
일 구현예에서, MOD-5014는 투여량-의존적 방식으로 트롬빈을 생성한다. 일 구현예에서, MOD-5014는 트롬빈 생성의 유도기(lag phase)를 감소시킨다. 일 구현예에서, MOD-5014는 혈액 응고 시간을 감소시킨다. 일 구현예에서, MOD-5014는 혈전(blood clot) 형성 효율을 증가시킨다. 일 구현예에서, MOD-5014의 투여는 대상물에서 혈액 응고 시간을 감소시킨다. 일 구현예에서, MOD-5014의 투여는 대상물에서 혈전 형성 효율을 증가시킨다. 일 구현예에서, MOD-5014에 의한 트롬빈 생성물은 재조합 FVIIa(NovoSeven®)에 의해 생성된 것과 유사하다. 일 구현예에서, MOD-5014에 의한 트롬빈 생성 유도기의 감소는 재조합 FVIIa(NovoSeven®)에 의해 생성된 것과 유사하다. 일 구현예에서, MOD-5014에 의한 혈액 응고 시간의 감소는 재조합 FVIIa(NovoSeven®)에 의해 생성된 것과 유사하다. 일 구현예에서, MOD-5014에 의한 혈전 생성 효율의 증가는 재조합 FVIIa(NovoSeven®)에 의해 생성된 것과 유사하다.
본원에 제공된 바와 같이, 인자 FVII와 같은 혈액 응고 인자에 대한 CTP의 부착은 혈액 응고 인자의 반감기를 증가시킨다. 실시예는 CTP의 부착이, 예를 들어 FVIIA에 부착된 3개의 CTP가 혈액 응고 활동에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 일 구현예에서, FVII에 대한 CTP 부착이 혈전 형성을 방해하지 않는다. 일 구현예에서, FVII에 대한 CTP 부착이 혈전 형성의 효율 증가를 방해하지 않는다. 일 구현예에서, FVII에 대한 CTP 부착이 혈액 응고 시간 감소를 방해하지 않는다. 일 구현예에서, 혈액 응고 인자에 대한 CTP의 부착에 이어서 FVII에 대한 인지질(phospholipid)의 결합이 유지된다. 일 구현예에서, FVIIA에 대한 CTP 부착이 혈전 형성을 방해하지 않는다. 일 구현예에서, FVIIA에 대한 CTP 부착이 혈전 형성의 효율 증가를 방해하지 않는다. 일 구현예에서, FVIIA에 대한 CTP 부착이 혈전 형성 감소를 방해하지 않는다. 일 구현예에서, 혈액 응고 인자에 대한 CTP의 부착에 이어서 FVIIA에 대한 인지질의 결합이 유지된다.
또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 CTP-변형 응고 인자를 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다.
또 다른 구현예에서, 조작된 응고 인자는 B형 혈우병 환자의 치료를 위한 것이다. 대형 포유류(개)에 대한 MOD-5014의 투여 결과 MOD-5014의 투여는 혈액 응고를 위한 효과적이고 안전한 지속성 FVIIa를 제공하였다(참조: 전체가 본원에 통합된 국제 출원 제PCT/IL2016/050645호). MOD-5014를 사용하는 치료는 예방을 위한 것이거나 요청에 따른 것일 수 있다. 일 구현예에서, 대상물에서 혈우병의 치료 방법으로서, 상기 대상물에게 MOD-5014를 투여하여 상기 대상물에서 혈우병을 치료하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일 구현예에서, 대상물에서 과다 출혈을 예방하는 방법으로서, 상기 대상물에게 MOD-5014를 투여하여 상기 대상에서 과다 출혈을 예방하는 방법이 본원에 개시된다. 일 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 예방 치료하는 방법으로서, 상기 대상물에게 MOD-5014를 투여하여 상기 대상물에서 혈우병을 예방 치료하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다.
일 구현예에서, MOD-5014로 대상물에서 혈우병을 치료하는 것은 재조합 FVIIa(NovoSeven®)와 비교해 MOD-5014의 투여 빈도를 감소시키는 것을 포함한다. 일 구현예에서, MOD-5014로 대상물에서 혈우병을 예방 치료하는 것은 재조합 FVIIa(NovoSeven®)와 비교해 MOD-5014의 투여 빈도를 감소시키는 것을 포함한다. 일 구현예에서, MOD-5014로 대상물에서 과다 출혈을 예방하는 것은 재조합 FVIIa(NovoSeven®)와 비교해 MOD-5014의 투여 빈도를 감소시키는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 3 개의 연속하는 CTP를 그의 카르복시 말단에 포함하는 응고 인자 VII는 NovoSeven®과 비교해 응고 활성을 유지하면서 개선된 PK 프로파일을 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제 및 방법은 FVIII 또는 FIX에 대한 억제제를 가진 A형 또는 B형 혈우병 환자 및 후천성 혈우병 환자에서 출혈 사례의 치료를 위한 것이고; FVIII 또는 FIX에 대한 억제제를 가진 A형 또는 B형 혈우병 환자 및 후천성 혈우병 환자에서 수술적 개입이나 침습 시술(invasive procedures)에서 출혈을 예방하기 위한 것이고; 선천성 FVII 결핍 환자에서 출혈 사례를 치료하기 위한 것이며; 선천성 FVII 결핍 환자에서 수술적 개입이나 침습 시술에서 출혈을 예방하기 위한 것이다. 후천성 혈우병은 이전에 지혈능(hemostatis)이 정상이던 환자가 응고 인자, 가장 흔하게는 FVIII에 대항하는 자기 항체를 발생시키는 자발적 자가 면역 장애이다. FVIII에 대항하는 자기 항체의 발생은 FVIII 결핍으로 이어지는데, 이는 응고 단계반응의 내인성 경로를 통한 인자 IXa 및 인자 VIIIa 복합체에 의한 트롬빈의 생성을 부족하게 한다. 다음의 병태는 후천성 A형 혈우병과 연관될 수 있다: 특발성 임신성 자가 면역 장애, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 피부병(예: 건선, 천포창), 호흡기 질환(예: 천식, 만성 폐색성 폐질환), 알레르기성 약물 반응, 당뇨, 급성 B형 간염 감염, 급성 C형 간염 감염, 악성 고형 종양(전립선, 폐, 결장, 췌장, 위, 담관, 두경부, 자궁 경부, 유방, 흑색종, 신장), 혈액암. 당업자는, 자가 면역 장애가 류머티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 측두 동맥염, 쇼그렌 증후군, 자가 면역 용혈성 빈혈, 굿파스쳐 증후군, 중증 근무력증, 그레이브스병, 자가 면역 갑상선 기능 저하증을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 당업자는, 페니실린 및 그 유도체, 술파미드(sulfamides), 페니토인(phenytoin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 메틸도파(methyldopa), 데포 티오크산텐(depot thioxanthene), 인터페론 알파(interferon alfa), 플루다라빈(fludarabine), 바실러스 칼멧-게링(bacille calmette-guιrin; BCG) 백신 접종, 데스벤라팍신(desvenlafaxine)를 투여 중인 환자에게서 알레르기 반응이 발생할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자는, 혈액암(hematologic malignancies)에는 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 발덴스트롬 마크로글루불린 혈증(waldenstrom macroglobulinemia, myelodysplastic syndrome), 골수 섬유증(myelofibrosis), 및 적백혈병(erythroleukemia)이 포함될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 그리고 일 구현예에서, 대상물에서 후천성 혈우병의 치료 방법으로서, 본원에 제공된 임의의 조성물을 대상물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은 근육 출혈(muscle bleeds)의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은 관절 출혈(joint bleeds)의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은 코피(epistaxis) 및 잇몸 출혈, 점막 출혈, 중추 신경계로의 출혈에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은 위장 출혈이나 대뇌 출혈에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은 저 빈도의 경증 출혈에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은 저 빈도의 중등도 출혈에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은 고 빈도의 경증 출혈에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은 고 빈도의 중등도 출혈에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은 무증후성 혈우병(asymptomatic hemophilia)에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은 경미 내지 중등도 혈우병에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은 중증 혈우병에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은, 일 구현예에서는 비조절성 출혈(uncontrollable hemorrhage)이고 또 다른 구현예에서는 뇌내 출혈(intracerebral hemorrhage)인, 출혈(hemorrhage)에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물, 제제, 및 방법은 신생아 응고 장애(neonatal coagulopathies); 중증 간질환(severe hepatic disease); 고위험 시술; 외상성 혈액 소실(traumatic blood loss); 골수 이식; 혈소판 감소증 및 혈소판 기능 장애; 경구 항응고의 긴급 반전(urgent reversal of oral anticoagulation); 인자 V, VII, X, 및 XI의 선천성 결핍; 또는 폰 빌데브란드병(von Willebrand disease), 일 구현예에서는 폰 빌데브란드 인자에 대한 억제제를 갖는 폰 빌데브란드병에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 CTP-변형 응고 인자는 대상물에서 본원에 기술된 바와 같은 혈우병 또는 관련 질환의 치료를 위한 것이다. 일 구현예에서, 대상물은 인간이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 인간 아이이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 반려 동물(domesticated animal)이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 포유류이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 가축(farm animal)이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 원숭이이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 말이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 젖소이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 마우스이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 랫트이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 개(canine)이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 고양이(feline)이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 소과(bovine), 양과(ovine), 돼지과(porcine), 말과(equine), 쥣과(murine) 또는 사슴과(cervine)이다. 일 구현예에서, 대상물은 수컷이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 암컷이다. 일 구현예에서, 대상물은 아이이거나, 또 다른 구현예에서는 청소년이거나, 또 다른 구현예에서는 성인이거나, 또 다른 구현예에서는 노인이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 소아과 대상물이고, 또 다른 구현예에서는 노인과 대상물이다.
또 다른 구현예에서, "생물학적으로 허용 가능한 담체(physiologically acceptable carrier)" 및 "약제학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"라는 문구는 유기체에게 유의한 자극을 유발하지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 성질을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 지칭하도록 상호 교환 가능하게 사용된다. 애쥬번트(adjuvant)는 이들 문구 하에 포함된다. 일 구현예에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체에 포함된 성분 중 하나는, 예를 들어, 유기 용매와 수성 용매 모두에서 넓은 범위의 가용성을 갖는 생체 적합 중합체인, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다.
또 다른 구현예에서, "첨가제(excipient)"는 약제학적 조성물에 첨가되어 활성 성분의 투여를 더 용이하게 하는 불활성 물질을 지칭한다. 일 구현예에서, 첨가제에는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당류 및 전분류, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물유 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
약물의 제형 및 투여를 위한 기술은, 참조로서 본원에 통합된 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에서는 투여량 범위에 대한 다양한 구현예가 고려된다. 본원에 개시된 조작된 응고 인자의 투여량은, 일 구현예에서는 0.005~100 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.005~5 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.01~50 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.1~20 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.1~10 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.01~5 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.001~0.01 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.001~0.1 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.1~5 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.5~50 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.2~15 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.8~65 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1~50 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 5~10 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 8~15 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 10~20 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 20~40 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 60~120 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 12~40 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 40~60 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 50~100 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1~60 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 15~25 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 5~10 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 55~65 mg/일의 범위이다.
또 다른 구현예에서, 투여량은 50~500 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 50~150 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 100~200 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 150~250 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 200~300 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 250~400 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 300~500 mg/일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 350~500 mg/일의 범위이다.
일 구현예에서, 투여량은 20 mg/일이다. 일 구현예에서, 투여량은 30 mg/일이다. 일 구현예에서, 투여량은 40 mg/일이다. 일 구현예에서, 투여량은 50 mg/일이다. 일 구현예에서, 투여량은 0.01 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.1 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.530 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 0.05 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 50 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 10 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 20~70 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 5 mg/일이다.
일 구현예에서, CTP-변형 응고 인자의 투여량은 1~5 mg/일이다. 일 구현예에서, CTP-변형 응고 인자의 투여량은 1~3 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 응고 인자의 투여량은 2 mg/일이다.
또 다른 구현예에서, 투여량은 1~90 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1~90 mg/2일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1~90 mg/3일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1~90 mg/4일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1~90 mg/5일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1~90 mg/6일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1~90 mg/일주일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1~90 mg/9일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1~90 mg/11일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1~90 mg/14일이다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여량은 10~50 mg/일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 10~50 mg/2일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 10~50 mg/3일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 10~50 mg/4일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 10~50 mg/5일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 10~50 mg/6일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 10~50 mg/일주일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 10~50 mg/9일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 10~50 mg/11일이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 10~50 mg/14일이다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 비강내 투여 형태로 제형된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 주사식 투여 형태로 제형된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 0.0001 mg 내지 0.6 mg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 0.001 mg 내지 0.005 mg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 0.005 mg 내지 0.01 mg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 0.01 mg 내지 0.3 mg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 0.2 mg 내지 0.6 mg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 그의 아미노 말단에 CTP를 갖지 않는다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 1~100 μg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 10~80 μg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 20~60 μg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 10~50 μg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 40~80 μg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 10~30 μg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 30~60 μg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 0.2 mg 내지 2 mg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 2 mg 내지 6 mg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 4 mg 내지 10 mg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 5 mg 내지 15 mg 범위의 투여량으로 대상물에게 투여된다.
일 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 10 μg/kg~1000 μg/kg 범위의 투여량으로 대상에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 25 μg/kg~600 μg/kg 범위의 투여량으로 대상에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 50 μg/kg~400 μg/kg 범위의 투여량으로 대상에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 25 μg/kg의 투여량으로 대상에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 50 μg/kg의 투여량으로 대상에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 100 μg/kg의 투여량으로 대상에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 200 μg/kg의 투여량으로 대상에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 300 μg/kg의 투여량으로 대상에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 400 μg/kg의 투여량으로 대상에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 500 μg/kg의 투여량으로 대상에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 600 μg/kg의 투여량으로 대상에게 투여된다.
일 구현예에서, CTP-변형 FVIIa의 투여량은 동일한 기간에 걸쳐 재조합 FVIIa(예: NovoSeven®)의 권장 투여량으로 환자에게 투여된 FVIIa의 양의 50%를 포함한다. 일 구현예에서, CTP-변형 FVII의 투여량은 동일한 기간에 걸쳐 재조합 FVII의 권장 투여량으로 환자에게 투여된 FVII의 양의 50%를 포함한다. 예를 들어, 수술 전 또는 수술 후 매 2시간마다 NovoSeven®이 90 mcg/kg의 투여량으로 주어지는 경우 (즉, 체중이 85 kg인 환자에게 매 2시간마다 7.65 mg을 투여하거나, 12시간 동안 45.9 mg을 6회로 나누어 투여하는 경우), 본원에 개시된 CTP-변형 응고 인자는 환자에게 투여되는 재조합 FVIIa의 12시간 투여량의 50%인 투여량으로 주어질 수 있다 (즉, 12시간에 한 번씩 23 mg의 투여량으로 주어짐).
또 다른 구현예에서, CTP-변형 응고 인자의 투여량은, 비-CTP-변형 응고 인자를 사용해 투여한 응고 인자의 양의 45%가 상기 투여량에 포함되도록 정해진다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 응고 인자의 투여량은, 비-CTP-변형 응고 인자를 사용해 투여한 응고 인자의 양의 10%가 상기 투여량에 포함되도록 정해진다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 응고 인자의 투여량은, 비-CTP-변형 응고 인자를 사용해 투여한 응고 인자의 양의 25%가 상기 투여량에 포함되도록 정해진다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 응고 인자의 투여량은, 비-CTP-변형 응고 인자를 사용해 투여한 응고 인자의 양의 35%가 상기 투여량에 포함되도록 정해진다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 응고 인자의 투여량은, 비-CTP-변형 응고 인자를 사용해 투여한 응고 인자의 양의 75%가 상기 투여량에 포함되도록 정해진다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 응고 인자의 투여량은, 비-CTP-변형 응고 인자를 사용해 투여한 응고 인자의 양의 100%가 상기 투여량에 포함되도록 정해진다. 그러나, 투여량에 비-CTP-변형 응고 인자와 동일한 양의 응고 인자(예: FIX)가 함유되더라도, 재조합 응고 인자와 비교해 반감기가 증가하기 때문에, 이는 투여 빈도가 줄어든다는 점에서 여전히 대상물에게 유리하다.
또 다른 구현예에서, 공액 응고 인자의 치료 유효량은 FVIIa의 경우 10μg/Kg~500μg/Kg이다. 또 다른 구현예에서, 공액 응고 인자의 치료 유효량은 체중 1 kg 당 150~250 IU로 1 일 1회 투여된다. 또 다른 구현예에서, 공액 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 인간 환자에게 다양한 수단으로 투여하기에 효과적인 강도로 제형된다.
일 구현예에서, CTP-변형 응고 인자는 주 단위로 대상물에게 투여된다. 일 구현예에서, CTP-변형 응고 인자는 주 2회 대상물에게 투여된다. 일 구현예에서, CTP-변형 응고 인자는 격주로(2주에 1회) 대상물에게 투여된다. 일 구현예에서, CTP-변형 응고 인자는 월 2회 대상물에게 투여된다. 일 구현예에서, CTP-변형 응고 인자는 월 1회 대상물에게 투여된다. 일 구현예에서, CTP-변형 응고 인자는 매일 대상물에게 투여된다. 일 구현예에서, CTP-변형 응고 인자는 매 2 일마다 대상물에게 투여된다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 매 3 일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 매 4 일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 매 5 일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 매 6 일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 매 7~14 일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 매 10~20 일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 매 5~15 일마다 1회 대상물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 매 15~30 일마다 1회 대상물에게 투여된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 방법들에는 응고 인자 요법의 사용에 있어서 순응성을 증가시키는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 적어도 하나의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)를 포함하는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하여 응고 인자 요법의 사용에 있어서 순응성을 증가시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 방법들에는 응고 인자 요법이 필요한 만성 질환을 앓고 있는 환자의 순응성을 증가시키는 방법이 포함된다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 방법은 본원에서 전술한 바와 같은 CTP로 응고 인자를 변형함으로써 응고 인자의 투여 빈도를 감소시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, 용어 순응성(compliance)은 유착성(adherence)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 방법들에는 응고 인자의 투여 빈도를 감소시킴으로써 응고 인자 요법을 필요로 하는 환자의 순응성을 증가시키는 방법이 포함된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도 감소는 CTP-변형 응고 인자를 더 안정하게 만드는 CTP 변형으로 인해 달성된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도 감소는 응고 인자의 T½을 증가시킨 결과로서 달성된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도 감소는 응고 인자의 제거 시간을 증가시키거나 제거 속도를 감소시킨 결과로서 달성된다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도 감소는 응고 인자의 AUC 측정치를 증가시킨 결과로서 달성된다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자의 카르복시 말단에 하나 내지 10개의 CTP를 부착하여, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자의 카르복시 말단에 하나 내지 5개의 CTP를 부착하여 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자의 카르복시 말단에 3개의 CTP를 부착하여 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자의 카르복시 말단에 3개 내지 5개의 CTP를 부착하여 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 요법의 사용에 있어서 순응성을 증가시키는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 하나 내지 10개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하여 응고 인자 요법의 사용에 있어서 순응성을 증가시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 요법의 사용에 있어서 순응성을 증가시키는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 하나 내지 5개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하여 응고 인자 요법의 사용에 있어서 순응성을 증가시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 요법의 사용에 있어서 순응성을 증가시키는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하여 응고 인자 요법의 사용에 있어서 순응성을 증가시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 요법의 사용에 있어서 순응성을 증가시키는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3개 내지 5개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하여 응고 인자 요법의 사용에 있어서 순응성을 증가시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈전 또는 응고 장애를 예방하거나 치료하는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 하나 내지 10개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 상기 대상물에게 제공하여 상기 대상에서 혈전 또는 응고 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈전 또는 응고 장애를 예방하거나 치료하는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 하나 내지 5개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상물에게 제공하여 상기 대상에서 혈전 또는 응고 장애를 예방하거나 치료하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈전 또는 응고 장애를 예방하거나 치료하는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상물에게 제공하여 상기 대상에서 혈전 또는 응고 장애를 예방하거나 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 예방하는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상물에게 제공하여 상기 대상에서 혈우병을 예방하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 예방하는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3개 내지 5개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상물에게 제공하여 상기 대상에서 혈우병을 예방하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 놀랍게도 SC 투여 후에 혈류내로 더 효과적으로 흡수된다 (그 전체가 참조로서 본원에 통합된 PCT/IL2016/050645를 참조한다). FVIIa는 예방적 용도로 사용될 수 있으므로, 이를 피하 투여할 수 있다는 것이 장점으로 작용한다. 피하 주입은 또한 환자가 자가 주입하기에 매우 용이하며, 환자가 매우 어리고 혈관이 작아서 찾기 어려울 때 유리하다.
또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 치료하는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 하나 내지 10개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 상기 대상물에게 제공하여 상기 대상에서 혈우병을 치료하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 치료하는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 하나 내지 5개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상물에게 제공하여 상기 대상에서 혈우병을 치료하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 치료하는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상물에게 제공하여 상기 대상에서 혈우병을 치료하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상물에서 혈우병을 치료하는 방법이 본원에 제공되는데, 상기 방법은 응고 인자 및 응고 인자의 카르복시 말단에 부착된 3개 내지 5개의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상물에게 제공하여 상기 대상에서 혈우병을 치료하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 경구 투여는 정제, 캡슐, 캔디(lozenges), 씹는 정제, 현탁액, 유상액 등을 포함하는 단위 투여 형태를 포함한다. 이러한 단위 투여 형태는 본 개시의 바람직한 응고 인자의 안전한 유효량을 포함하는데, 일 구현예에서, 이들 단위 투여 형태의 각각은 약 0.7 또는 3.5 mg 내지 약 280 mg/70 kg이거나, 또 다른 구현예에서, 약 0.5 또는 10 mg 내지 210 mg/70 kg이다. 경구 투여용 단위 투여 형태의 제조에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, 정제는, 불활성 희석제로서 염화칼슘, 염화나트륨, 만니톨, 젖산 및 셀룰로오스와 같은 종래의 약제학적으로 호환 가능한 애쥬번트를 포함하고; 전분, 젤라틴 및 자당과 같은 결합제를 포함하고; 전분, 알긴산 및 교차 카르복시메틸셀룰로오스(croscarmelose)와 같은 붕해제(disintegrants)를 일반적으로 포함한다. 일 구현예에서, 이산화규소와 같은 활택제(glidant)가 사용되어 분말 혼합물의 유동 특성을 개선할 수 있다. 일 구현예에서, FD&C 염료와 같은 착색제가 외관을 위해 첨가될 수 있다. 아스파탐, 사카린, 멘톨, 페퍼민트, 및 과일향과 같은 감미제 및 향미제는 씹는 정제용으로 유용한 애쥬번트이다. 캡슐은 일반적으로 상기 개시된 하나 이상의 고체 희석제를 포함한다. 일부 구현예에서, 담체 성분의 선택은 맛, 원가, 및 저장 안정성과 같은 부차적 고려 사항에 따라 달라지는데, 이는 본 발명의 목적에 그다지 중요하지 않으며 당업자가 용이하게 만들 수 있다.
일 구현예에서, 경구 투여 형태는 사전 정의된 방출 프로파일을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 경구 투여 형태는 지방성(extended release)의 정제, 캡슐, 캔디 또는 씹는 정제를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 경구 투여 형태는 서방성(slow release)의 정제, 캡슐, 캔디 또는 씹는 정제를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 경구 투여 형태는 즉시 방출형(immediate release)의 정제, 캡슐, 캔디 또는 씹는 정제를 포함한다. 일 구현예에서, 경구 투여 형태는 당업자에게 알려진 바와 같이 약제학적 활성 성분의 바람직한 방출 프로파일에 따라 제형된다.
일부 구현예에서의 경구용 조성물은 용액, 유상액(emulsion), 현탁액 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물의 제조에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, 액체 경구 조성물은 바람직한 화합물 또는 화합물들의 약 0.001% 내지 약 0.933%를 포함하거나, 다른 구현예에서는 약 0.01% 내지 약 10%를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물은 용액 또는 유상액을 포함하는데, 일부 구현예에서 이는 본원에 개시된 화합물의 안전한 유효량 및, 선택적으로 국소 비강내 투여용 다른 화합물을 포함하는 수용액 또는 유상액이다. 일부 구현예에서, 조성물은 대상 화합물(subject compound)의 약 0.001% 내지 약 10.0% w/v, 더 바람직하게는 약 00.1% 내지 약 2.0% 포함하는데, 이는 비강내 경로에 의해 전신으로 화합물을 전달하는 데 사용된다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 근육내에 주입된다(근육주사). 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 피부 아래에 주입된다(피하주사). 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 근육내에 주입된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 하나의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩티드는 피부내에 주입된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자는 전신 투여를 통해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자는 정맥 주사에 의해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 투여는 척수강내(intrathecal) 또는 직접 심실내 투여(direct intraventricular administration)를 비롯하여 골수내 주사(intramedullary injections)를 포함하는, 비 경구(parenteral), 폐(pulmonary), 경구(oral), 국소(topical), 피내(intradermal), 근육내(intramuscular), 복강내(intraperitoneal), 정맥내(intravenous), 피하(subcutaneous), 비강내(intranasal), 경비(transnasal), 안구내(intraocular), 점안(ophthalmic), 경막외(epidural), 구강내(buccal), 직장내(rectal), 경점막(transmucosal), 장(intestinal) 또는 비경구(parenteral) 전달일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제제는 전신 투여 방식보다는 국소 투여 방식으로, 예를 들어, 환자 신체의 특정 영역 내로 제제의 직접 주입을 통해 투여된다.
일 구현예에서, 투여 경로는 장관(enteral) 경로일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 경로는 결막(conjunctival), 경피(transdermal), 피내(intradermal), 동맥내(intra-arterial), 질(vaginal), 직장(rectal), 종양내(intratumoral), 비 암소(parcanceral), 경점막(transmucosal), 근육내(intramuscular), 혈관내(intravascular), 심실내(intraventricular), 두개내(intracranial), 비강내(intra-nasal), 설하(sublingual) 경로, 또는 이들의 조합일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물 및 약제학적 제제는 액체 제제의 정맥내, 동맥내, 또는 근육내 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 액체 제제는 용액, 현탁액, 분산액, 유상액, 기름 등을 포함한다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물 약제학적 제제는 정맥내 투여되므로, 정맥내 투여에 적합한 형태로 제형된다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물 약제학적 제제는 동맥내 투여되므로, 동맥내 투여에 적합한 형태로 제형된다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물 약제학적 제제는 근육내 투여되므로, 근육내 투여에 적합한 형태로 제형된다.
또한, 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물 약제학적 제제는 신체 표면에 국소 투여되므로, 국소 투여에 적합한 형태로 제형된다. 적합한 국소 제제는 젤, 연고, 크림, 로션, 드로프스 등을 포함한다. 국소 투여를 위해, 본원에 개시된 화합물은 약제학적 담체가 있거나 없는 생리학적으로 허용 가능한 희석제 중에서 용액, 현탁액, 또는 유상액으로서 제조되고 적용되는 추가의 적절한 치료제(들)과 조합된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물 및 약제학적 제제는 당업계에 잘 알려진 단계, 예를 들어, 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당제화(dragee-making), 분말화(levigating), 현탁화, 캡슐화, 인트랩핑(entrapping) 또는 동결건조 단계에 의해 제조된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물 및 약제학적 제제는 활성 성분을 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 첨가제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체를 사용해 종래 방식으로 제형된다. 일 구현예에서, 제제는 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
일 구현예에서, 본 개시의 주사식 제제(injectables)는 수용액으로 제형된다. 일 구현예에서, 본 개시의 주사식 제제는 생리학적으로 호환 가능한 완충액, 예컨대, 행크액(Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 또는 생리 식염 완충액 등으로 제형된다. 일부 구현예에서, 경점막 투여의 경우, 침투할 배리어에 적합한 침투제(penetrants)가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 알려져 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 침투제는, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비 경구 투여용으로 제형된다. 일부 구현예에서, 주사용 제제는 단위 투여 형태로, 예를 들어, 앰플(ampoules)이나 다중 투여용 용기에 선택적으로 보존제를 첨가하여 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유상액이며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 특정 제형화제를 함유한다.
일부 구현예에서, 조성물은: 염화 벤즈알코늄(benzalkonium chloride) 및 티메로살(thimerosal) 등과 같은 보존제; 에데트산나트륨(edate sodium) 등과 같은 킬레이트제; 인산염, 시트르산염, 및 아세트산염과 같은 완충액; 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 만니톨 등과 같은 등장화제; 아스코르브산, 아세틸시스틴, 메타중아황산나트륨(sodium metabisulfote) 등과 같은 항산화제; 방향제; 셀룰로오스 및 이의 유도체를 포함하는, 중합체와 같은 점도 조절제(viscosity adjustors); 및 필요에 따라 이들 수성 조성물의 pH를 조절하기 위한 폴리비닐 알코올 및 산과 염기도 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 국부 마취제 또는 기타 활성 물질을 또한 포함한다. 조성물은 분무제(sprays), 미스트제(mists), 드로프스제(drops) 등으로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 비 경구 투여용 약제학적 조성물 약제학적 제제는 수용성 형태인 활성 제제 수용액을 포함한다. 또한, 일부 구현예에서, 활성 성분의 현탁액은 적절한 오일 또는 물 기반의 주사 현탁액으로서 제조된다. 일부 구현예에서, 적합한 친지방성(lipophilic) 용매 또는 비히클은 참기름과 같은 지방성 오일, 또는 올레산 에틸(ethyl oleate), 트리글리세라이드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨(sodium carboxymethyl cellulose), 소르비톨 또는 덱스트란 등을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 현탁액은 활성 성분의 가용성(solubility)을 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 적절한 물질 또는 안정화제를 또한 함유한다.
또 다른 구현예에서, 활성 화합물은 소포, 특히 리포좀으로 전달될 수 있다(참조: Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat 등의, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein 및 Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; J. E. Diederichs and al., Pharm./nd. 56 (1994) 267- 275).
또 다른 구현예에서, 조절식 방출 시스템으로 전달된 약제학적 조성물은 정맥내 주입, 이식 가능한 삼투 펌프, 경피 패치, 또는 다른 투여 방식을 위해 제형된다. 일 구현예에서, 펌프가 사용된다(참조: 전술한 Langer의 문헌; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald 등의, Surgery 88:507 (1980); Saudek 등의, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). 또 다른 구현예에서, 중합체 재료가 사용될 수 있다. 여전히 또 다른 구현예에서, 조절식 방출 시스템은 치료 표적(뇌)에 가깝게 위치될 수 있으므로, 전신 투여량의 분획만으로 충분하다(예를 들어, 전술한 Goodson의 Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). Langer의 검토(Science 249:1527-1533 (1990))에서는 다른 조절식 방출 시스템이 논의된다.
일부 구현예에서, 사용 전의 활성 성분은 멸균 주사용 증류수 기반의 용액과 같은 적절한 비히클을 사용해 구성하기 위한 분말 형태이다. 일부 구현예에서의 조성물은 분무화와 흡입 투여를 위해 제형된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 분무화 수단이 부착된 용기에 담긴다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 제제는, 예를 들어, 코코아 버터나 기타 글리세리드(glycerides)와 같은 종래의 좌제 기제(suppository bases)를 사용하는 좌약이나 정체 관장(retention enemas)와 같은 직장용 조성물로 제형된다.
일부 구현예에서, 본원 개시의 맥락에서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물 및 약제학적 제제는 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양의 활성 성분이 함유된 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효량(therapeutically effective amount)은 질환의 증상을 예방하거나, 완화시키거나 개선하거나, 치료 중인 대상물의 생존을 연장시키기에 효과적인 활성 성분의 양을 의미한다.
일 구현예에서, 치료 유효량은 당업자의 능력 범위 내에서 충분히 결정될 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 그 성분으로서의 역할을 할 수 있는 일부 예시적인 물질은: 젖당, 포도당 및 자당과 같은 당류; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분류; 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 에틸 셀룰로오스, 및 메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 분말 트래거캔스(tragacanth); 맥아(malt); 젤라틴; 탈크(talc); 스테아르산(stearic acid) 및 스테아린 마그네슘(magnesium stearate)과 같은 고체 윤활제; 황산칼슘(calcium sulfate); vegetable oils, such as 땅콩유, 면실유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 오브로마유(oil of the obroma)와 같은 식물유; 프로필렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 알긴산; Tween™ 브랜드의 유화제와 같은 유화제; 라우릴 황산나트륨(sodium lauryl sulfate)과 같은 습윤제; 착색제; 향미제; 정제화제(tableting agents), 안정화제; 항산화제; 보존제; 파이로젠이 없는 물(pyrogen-free water); 등장성 염수(isotonic saline); 및 인산 완충 용액(phosphate buffer solutions)이다. 조성물과 함께 사용할 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 담체의 선택은 기본적으로 조성물이 투여될 방식에 의해 결정된다. 일 구현예에서, 대상 조성물이 주사용인 경우, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 혈액 적합성(blood-compatible) 현탁제를 갖는 살균 생리 식염수로서, 그 pH가 약 7.4로 조절된 것이다.
또한, 조성물은 추가로 결합제(예: 아카시아, 옥수수 전분, 젤라틴, 카보머, 에틸 셀룰로오스, 구아 검, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 포비돈), 붕해제(예: 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 이산화규소, 크로스카르멜로오스 나트륨(croscarmelose sodium), 크로스포비돈(crospovidone), 구아 검, 전분 글리콜산 나트륨(sodium starch glycolate)), 다양한 pH 및 이온 강도의 완충액(예: Tris-HCI., 아세트산염, 인산염), 표면에 대한 흡착을 방지하는 알부민이나 젤라틴과 같은 첨가제, 세제(예: Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, 담즙산염(bile acid salts)), 프로테아제 억제제, 계면활성제(예: 라우릴 황산나트륨), 침투 강화제, 가용화제(예: 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜), 항산화제(예: 아스코르브산, 메타중아황산나트륨, 부틸화 히드록시아니솔), 안정화제(예: 하이드록시프로필 셀롤로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스), 점도 증가제(예: 카보머, 콜로이드성 이산화규소, 에틸 셀룰로오스, 구아 검), 감미제(예: 아스파탐, 구연산), 보존제(예: 티메로살(Thimerosal), 벤질 알코올, 파라벤(parabens)), 윤활제(예: 스테아르산, 스테라인 마그네슘, 폴리에틸렌 글리콜, 라우릴 황산나트륨), 유동 보조제(예: 콜로이드성 이산화규소), 가소제(예: 디에틸 프탈레이트, 트리에틸 구연산염), 유화제(예: 카보머, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 라우릴 황산나트륨), 중합체 코팅(예: 폴록사머(poloxamers) 또는 폴록사민(poloxamines)), 코팅 및 막 형성제(예: 에틸 셀룰로오스, 아크릴산염, 폴리메틸아크릴산염) 및/또는 애쥬번트를 포함한다.
시럽제, 일릭서제, 유상액 및 현탁액용 담체의 일반적인 성분은 에탄올, 글리세롤, 프로필린 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 액상 자당, 소르비톨 및 물을 포함한다. 현탁액의 경우, 일반적인 현탁 제제는 메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 셀로로오스(예: Avicel™, RC-591), 트래거캔스 및 알긴산나트륨을 포함하고; 일반적인 습윤제는 레시틴 및 폴리에틸렌 산화 소르비탄(예: polysorbate 80)을 포함한다. 일반적인 보존제는 메틸 파라벤 및 벤조산나트륨을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 경구용 액체 조성물은 위에 개시된 감미제, 향미제 및 착색제와 같은 하나 이상의 성분을 또한 함유한다.
조성물은 또한 폴리락트산, 폴리글리콜산, 히드로겔 등과 같은 중합체 화합물의 미립자 제제, 또는 조성물의 미립자 제제 내에 또는 그 위에 혼입된 활성 재료, 또는 마이크로 에멀젼(microemulsions), 미셀(micelles), 단층박막 소포(unilamellar vesicles) 또는 다층박막 소포(multilamellar vesicles), 파열적혈구(erythrocyte ghosts) 또는 스페로플라스트(spheroplasts) 위에 혼입된 활성 재료를 포함한다. 이러한 조성물은 물리적 상태, 가용성, 안정상, 체내 방출 속도, 및 체내 제거 속도에 영향을 미치게 된다.
중합체(예: 폴록사머 또는 폴록사민)로 코팅된 미립자 조성물, 및 조직 특이적 수용체, 리간드 또는 항원에 대항해 유도된 항체에 결합되거나 조직 특이적 수용체의 리간드에 결합된 화합물도 본 발명에 포함된다.
일부 구현예에서, 화합물은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린과 같은 수용성 중합체의 공유 결합에 의해 변형된다. 또 다른 구현예에서, 변형된 화합물은 상응하는 비변형 화합물보다 정맥 주사후 혈액 중에서 실질적으로 더 긴 반감기를 나타낸다. 일 구현예에서, 변형된 화합물은 또한 수용액에서 화합물의 가용성을 증가시키고, 뭉침을 제거하고, 화합물의 물리적 및 화학적 안정성을 강화시키며, 화합물의 면역원성 및 반응성을 크게 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 바람직한 체내 생물학적 활성은 이러한 중합체 화합물의 투여 빈도를 줄이거나, 비변형 화합물의 투여량보다 적은 투여량을 투여함으로써 달성된다.
일부 구현예에서, 유효량 또는 유효 투여량의 제조는 우선적으로 시험관 검정에서 추정할 수 있다. 일 구현예에서, 투여량은 동물 모델에서 제형될 수 있고, 이러한 정보는 인간에서의 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 활성 성분의 독성 및 치료 효능은 표준 약제학적 절차에 의해 시험관내에서, 세포 배양 중에, 또는 실험 동물에서 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 이들 시험관내, 세포 배양 검정, 및 동물 연구에서 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 다양한 투여량을 제형하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 투여량은 사용되는 투여 형태, 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라진다. 일 구현예에서, 최종적인 제제 형태, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려해 의사가 개별적으로 선택할 수 있다. [예를 들어, Fingl 등의, (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1을 참조한다].
일 구현예에서, 치료 대상 병태의 중증도 및 반응성에 따라, 투여 방식은 1회 투여이거나 다중 투여일 수 있고, 치료 과정은 수일에서 수주간 이어지거나, 치료의 효과가 나타날 때까지 또는 질환 상태의 감소가 달성될 때까지 이어질 수 있다.
일 구현예에서, 투여할 조성물의 양은 치료 중인 대상물, 통증의 정도, 투여 방식, 처방의의 판단 등에 따라 당연히 달라질 것이다.
일 구현예에서, 호환 가능한 약제학적 담체 중에 제형된, 본원에 개시된 제제를 포함하는 조성물이 제조되어 적절한 용기에 담기고, 표시된 병태에 대한 치료를 위해 표지된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자는 비이온성 표면 활성제(계면 활성제), 다양한 당류, 유기 폴리올 및/또는 인간 혈청 알부민과 같은 복합 유기 첨가제 및 안정화제와 조합으로 냉동 건조된(동결 건조된) 제제이다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 기술된 바와 같이 주사용 살균수에서 동결 건조된 응고 인자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 기술된 바와 같이 주사용 살균 PBS에서 동결 건조된 응고 인자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 기술된 바와 같이 주사용 살균 0.9% NaCl에서 동결 건조된 응고 인자를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자, 및 인간 혈청 알부민, 폴리올, 당류, 및 음이온성 표면 활성 안정화제와 같은 복합 담체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자, 및 락토바이오닉산(lactobionic acid) 및 아세테이트/글리신 완충액을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자, 및 물에서 인터페론 성분의 가용성을 증가시키는, 아르기닌이나 글루탐산염과 같은 아미노산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 동결 건조된 응고 인자, 글리신이나 인간 혈청 알부민(HSA), 완충액(예: 아세트산염) 및 등장성 제제(예: NaCl)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자, 인산 완충액, 글리신, 및 HSA를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 약 4 내지 7.2의 pH를 갖는 완충 용액에 놓일 때 안정화된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 약 4 내지 8.5의 pH를 갖는 완충 용액 중에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 약 6 내지 7의 pH를 갖는 완충 용액 중에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 약 6.5의 pH를 갖는 완충 용액 중에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 약 6.4의 pH를 갖는 완충 용액 중에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 안정화제로서 아미노산을 사용해 안정화되고, 일부 경우에 (아미노산이 하전된 측쇄를 함유하지 않는 경우) 염(salt)를 사용해 안정화된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 아미노산인 안정화제를 약 0.3 중량% 내지 5 중량%로 포함하는 액체 조성물이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 투여 정확도(dosing accuracy) 및 제품 안전성을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 주사 가능한 용도에 사용하기 위한 생물학적으로 활성인 안정한 액체 제제를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 비-동결 건조 응고 인자를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 액체 상태로 장기간 보관할 수 있는 액체 제제를 제공하여, 투여 전 보관 및 운송을 용이하게 한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 기질 재료(matrix material)로서 고체 지질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 주사용 약제학적 조성물은 기질 재료로서 고체 지질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 스프레이 응고(spray congealing)에 의한 지질 미립자의 생산이 Speiser에 의해 기술된 후(Speiser 등의, Pharm. Res. 8 (1991) 47-54), 이에 의한 경구 투여용 지질 나노펠릿의 생산이 기술되었다(Speiser EP 0167825 (1990)). 또 다른 구현예에서, 사용되는 지질은 신체에서 잘 견딘다(예를 들어, 지방산으로 구성된 글리세리드는 비 경구 영양을 위한 유상액 중에 존재한다).
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 중합체 미립자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 나노입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 리포좀을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 지질 유상액을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 마이크로스피어(microspheres)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 지질 나노입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 양친매성 지질(amphiphilic lipids)을 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 약물, 지질 기질(lipid matrix) 및 계면 활성제를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 지질 기질은 적어도 50% w/w인 모노글리세리드 함량을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 담는 FDA 승인 키트와 같은 팩이나 디스펜서 장치에 제공된다. 일 구현예에서, 팩은 예를 들어 블리스터 팩과 같은 금속이나 플라스틱 포일을 포함한다. 일 구현예에서, 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여 지침이 수반된다. 일 구현예에서, 팩 또는 디스펜서에는 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 용기와 관련된 고지가 수반되며, 상기 고지에는 조성물의 형태 또는 인간 또는 동물 투여에 대한 상기 기관의 승인이 반영된다. 일 구현예에서의 이러한 통지에는 처방 약물이나 승인된 제품 첨가물에 대해 미국 식품의약국(FDA)가 승인한 내용이 표지된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 응고 인자는, 각각의 제제만으로 치료했을 때와 비교해 개선된 치료 효과를 달성하도록 추가 활성 제제와 함께 개인에게 제공될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또 다른 구현예에서, 병행요법과 관련된 심각한 부작용을 피하기 위한 조치(예: 상보성 제제의 투여 및 선택)가 취해진다.
제조
일 구현예에서, 인간 융모성 성선 자극 호르몬 펩티드(CTP)-변형 인자 VIIa 폴리펩티드의 제조 방법이 개시되며, 상기 방법은: (a) 상기 CTP-변형 인자 VII를 암호화하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터로 소정의 수의 세포를 안정적으로 형질 감염시키는 단계(여기서, 상기 형질 감염된 세포는 상기 CTP-변형 인자 VII를 발현하고 선택적으로 분비함); (b) 상기 CTP-변형 인자 VII를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계; (c) 상기 클론을 소정의 비율까지 용액 내에서 증식시키는 단계; (d) 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 수확하는 단계; (e) 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 여과하여 정화된 수확 용액을 수득하는 단계; (f) 상기 정화된 수확 용액을 정제하고 활성화시켜 원하는 농도의 CTP-변형 인자 VIIa를 갖는 정제된 단백질 용액을 수득함으로써, 인간 융모성 성선 자극 호르몬 펩티드(CTP)-변형 인자 VIIa 폴리펩티드를 제조하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII가 분비된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII가 분비되지 않는다. CTP-변형 인자 VII의 제조에 있어서, 형질 감염이 초기 단계이다. 일단 최종 고 발현 클론이 선택되면, 각각의 생산 단계에는 마스터 세포 은행(MCB)의 해동, 증식, 수확 및 정제가 포함된다. (실시예 3에서, 클론의 증식에서 수확까지를 기술한 단계 1~5; 및 정제 및 활성화를 기술한 단계 6~14를 참조한다). 일 구현예에서, 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형 인간 활성 인자 VII(FVIIa) 폴리펩티드의 제조 방법이 개시되는데, 상기 폴리펩티드는 상기 FVII의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3개의 CTP 분자를 포함하고, 상기 방법은: 상기 CTP-변형 FVII를 암호화하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터로, 소정 수의 세포를 안정적으로 형질 감염시키는 단계 (여기서, 상기 형질 감염된 세포는 상기 CTP-변형 FVII를 발현하고 분비함); 상기 CTP-변형 FVII를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계; 상기 클론을 소정의 비율로 용액 내에서 증식시키는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 수확하는 단계; 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 여과하여 상기 CTP-변형 FVII를 함유하는 정화된 수확 용액을 수득하는 단계; 및 상기 정화된 수확 용액으로부터 상기 CTP-변형 FVII를 정제하고 활성화시켜, 원하는 농도의 CTP-변형 FVIIa를 갖는 정제된 단백질 용액을 수득하여(여기서, 상기 제조된 CTP-변형 FVIIa는:
a. 저 산화 형태;
b. 고 백분율의 카르복실화 글루탐산 잔기;
c. 적어도 60% 하전된 N-글리칸; 또는
d. 적어도 10,500 U/mg의 포텐시 중 적어도 하나를 포함함),
CTP-변형 FVIIa를 제조하는 단계를 포함한다(여기서, 상기 제조된 CTP-변형 FVIIa의 아미노산 서열은 서열 번호 7에 제시됨).
일 구현예에서, 본원에 개시된, 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터(핵산 작제물) 내에 삽입되어 재조합 폴리펩티드가 발현될 수 있게 한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 발현 벡터는 이러한 벡터를 원핵 생물에서의 복제와 통합에 적합하게 하는 추가 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 발현 벡터는 이러한 벡터를 진핵 생물에서의 복제와 통합에 적합하게 하는 추가 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 발현 벡터는 이러한 벡터를 원핵 생물과 진핵 생물 모두에서의 복제와 통합에 적합하게 하는 셔틀 벡터(shuttle vector)를 포함한다. 일부 구현예에서, 클론 벡터(cloning vector)는 전사 및 번역 개시 서열(예: 프로모터, 인핸서) 및 전사 및 번역 종결자(예: 폴리아데닐화 신호)를 포함한다.
일 구현예에서, CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드의 제조 방법은, 프로모터, CTP-변형 FVII 폴리펩티드에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 시미안 바이러스(simian virus; SV) 40 폴리아데닐화 서열이다.
일 구현예에서, 다양한 원핵 또는 진핵 세포가 숙주 발현 시스템으로 사용되어 본원에 개시된 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질 변환된 박테리아와 같은 미생물; 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질 변환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 꽃양배추 모자이크 바이러스인 CaMV; 담배 모자이크 바이러스인 TMV)로 감염되거나 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 Ti 플라스미드와 같은 재조합 플라스미드 발현 벡터로 형질 변환된 식물 세포 시스템을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 비-박테리아 발현 시스템(예: CHO 세포 또는 CHO 세포 유래의 세포와 같은 포유류 발현 시스템)이 사용되어 본원에 개시된 폴리펩티드를 발현시킨다. 일 구현예에서, 포유류 세포에서 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 발현시키도록 사용된 발현 벡터는 CMV 프로모터 및 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 pCI-DHFR 벡터이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 발현 벡터는, 예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)와 같은 단일 mRNA 유래의 몇 가지 단백질 및 프로모터-키메라 폴리펩티드의 게놈 통합을 위한 서열에 대한 번역을 가능하게 하는 추가 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 포유류 발현 벡터는 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 이용할 수 있는 pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, 프로메가(Promega)로부터 이용할 수 있는 pCI, 스트레이트진(Strategene)으로부터 이용할 수 있는 pMbac, pPbac, pBK-RSV 및 pBK-CMV, 클론테크(Clontech)로부터 이용할 수 있는 pTRES, 및 이들의 유도체를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스와 같은 진핵생물 바이러스 유래의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터가 본원에 개시된 방법에 사용된다. SV40 벡터는 pSVT7 및 pMT2를 포함한다. 일부 구현예에서, 소 유두종 바이러스 유래의 벡터는 pBV-1MTHA를 포함하고, 엡스타인 바 바이러스(Epstein Bar virus) 유래의 벡터는 pHEBO, 및 p2O5를 포함한다. 다른 예시적인 바이러스는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 배큘로바이러스(baculovirus) pDSVE, 및 SV-40 초기 프로모터, SV-40 후기 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터, 쥣과 유선 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 프로모터, 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터, 또는 진핵세포에서의 발현에 효과적인 다른 프로모터의 유도하에 단백질의 발현을 가능하게 하는 임의의 다른 벡터를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 CTP-변형 인자 VII를 암호화하는 발현 벡터를 세포 내에 도입하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 유전자 변형 세포 또는 유전자 전이 세포를 생성하는, 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 사용한 진핵 숙주 세포의 "형질 감염(transfection)"은 당업계에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, Sambrook 등의, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), Ausubel 등의, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang 등의, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega 등의, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) 및 Gilboa 등의, [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]에 기술되어 있고, 이에는, 예를 들어, 안정한 형질 감염 또는 일시적 형질 감염, 및 전기 천공법이 포함된다. 또한, 양성-음성 선택법에 대해서는 미국 특허 제5,464,764호 및 제5,487,992호를 참조한다. 형질 감염 방법은 리모좀-매개 형질 감염, 인산칼슘 공침(co-precipitation), 전기 천공법, (DEAE-덱스트란과 같은) 다가 양이온-매개 형질 감염, 원형질 융합, 바이러스 감염(재조합 바이러스 감염을 포함함) 및 미세주입을 더 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 형질 감염은 안정한 형질 감염이다. 특정 숙주 세포주 및 세포 유형에서 본원에 개시된 관심 폴리펩티드를 암호화하는 이종 유전자를 최적의 빈도로 형질 감염시키고 발현시키는 형질 감염 방법이 바람직하다. 적절한 방법은 일상적인 절차에 의해 결정될 수 있다. 안정한 형질 감염체의 경우, 작제물이 숙주 세포의 게놈 또는 인공 염색체/미니 염색체에 통합되거나, 세포 내에서 안정하게 유지되도록 에피솜처럼(episomally) 위치된다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 개시된 실시예는 당업자의 기술 범위에 있는 세포 생물학, 분자 생물학, 세포 배양, 면역학 등의 종래 기술을 사용할 것이다. 이들 기술은 현재 문헌에 충분히 기술되어 있다. 예를 들어, Sambrook 등의, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel 등의, Current Protocols in Molecular Biology (1987, 증보판); Brown ed., Essential Molecular Biology, IRL Press (1991); Goeddel ed., Gene Expression Technology, Academic Press (1991); Bothwell 등 eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ. (1990); Wu 등, eds., Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990); McPherson et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Miller & Calos eds., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987); Butler ed., Mammalian Cell Biotechnology (1991); Pollard 등, eds., Animal Cell Culture, Humana Press (1990); Freshney 등, eds., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987); Studzinski, ed., Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1995); Melamed 등, eds., Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990); Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (증보판); Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animals Cells, in: Biotechnology Vol. 2, P
Figure 112019024050421-pct00001
hler ed., VCH, Weinheim 663-744; the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.), 및 Harlow 등, eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1987)을 참조한다.
CTP-변형 인자 VII를 암호화하는 관심 이종 유전자는 바이러스 형질 변환, 형질 감염 또는 미세 주입과 같은 다양한 방법에 의해 본원에 개시된 세포 내로 도입될 수 있다. 관심 이종 유전자는 선형 DNA로서 또는 발현 벡터의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 하나 이상의 이종 유전자의 삽입 및 이들의 발현을 위한 다중 클로닝 부위를 허용하는 다수의 진핵 생물 발현 벡터가 알려져 있다. 상업적 공급자로는, 무엇보다도 Stratagene (미국 캘리포니아주 라 졸라); Invitrogen (미국 캘리포니아주 칼즈배드); Promega (미국 위스콘신, 매디슨) 또는 BD Biosciences Clontech (미국 캘리포니아주 팔로 알토)와 같은 회사들이 있다. 하나 이상의 관심 유전자를 코딩하는 DNA 또는 발현 벡터로 세포를 형질 감염시키는 것은 Sambrook 등의 문헌(1989) 또는 Ausubel 등의 문헌(1994)에서 기술된 바와 같은 종래 방법에 의해 수행된다. 적합한 형질 감염 방법은, 예를 들어, 리포좀-매개 형질 감염, 인산칼슘 공침, 전기 천공법, (DEAE 덱스트란과 같은) 다가 양이온-매개 형질 감염, 원형질 융합, 미세주입 및 바이러스 감염을 포함한다. 바람직하게는, DNA 분자가 숙주 세포의 게놈 또는 인공 염색체/미니 염색체에 통합되거나, 안정한 방식으로 숙주 세포에 에피솜적으로 함유되는 안정한 형질 감염이 수행된다. 문제의 숙주 세포에서 하나 이상의 관심 이종 유전자에 대한 최적의 형질 감염 빈도 및 발현을 제공하는 형질 감염 방법이 바람직하다.
일부 구현예에서, 바이러스 감염에 의해 핵산을 도입하는 경우, 바이러스의 감염성으로 인해 높은 형질 감염 효율을 얻을 수 있으므로, 리포펙션 및 전기 천공법과 같은 다른 방법에 비해 여러 가지 장점이 제공된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 본원에서 전술한 임의의 적합한 투여 방식(즉, 체내 유전자 요법)을 사용해 개체에게 투여된 핵산 작제물로부터 발현될 수도 있음을 이해할 것이다. 일 구현예에서, 핵산 작제물을 필요에 따라 적절한 유전자 전달 비히클/방법(형질 감염, 형질 도입, 상동성 재조합 등) 및 발현 시스템을 통해 적합한 세포 내에 도입한 뒤, 변형 세포를 배양 중에 증식시켜 개체에게 다시 투여한다(예: 체외 유전자 요법).
관심 이종 유전자는 일반적으로 관심 유전자의 전사를 가능하게 하는 프로모터 및 관심 유전자의 전사 및 번역(발현)을 가능하게 하는 다른 조절 요소에 기능적으로 결합되거나, 그의 효율을 증가시킨다.
당업자는, 용어 "프로모터"가 그에 기능적으로 결합된 유전자 또는 서열의 전사를 가능하게 하고 조절하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 프로모터는 RNA 중합효소에 결합하기 위한 인식 서열 및 전사를 위한 개시 부위(전사 개시 부위)를 함유한다. 특정 세포 유형 또는 숙주 세포에서 원하는 서열을 발현시키기 위해서는 적절한 기능적 프로모터를 선택해야 한다. 당업자는 구성적, 유도성 및 억제성 프로모터를 포함하여, 다양한 공급원으로부터의 다양한 프로모터에 대해 잘 알고 있을 것이다. 이들은 예를 들어 GenBank와 같은 데이터뱅크에 보관되며, 상업적 또는 개별 공급원 유래의 폴리뉴클레오타드 서열 내에서 클로닝된 별도의 요소 또는 요소들로서 수득될 수 있다. 유도성 프로모터에서, 프로모터의 활성은 신호에 반응해 감소되거나 증가될 수 있다. 하나의 예시적인 유도성 프로모터는 테트라시클린(tet) 프로모터이다. 이는 테트라시클린-조절 전사촉진 단백질(tTA)에 의해 유도될 수 있는 테트라시클린 작동자 서열(tetO)을 함유한다. 테트라시클린의 존재 중에, tetO에 대한 tTA의 결합이 억제된다. 예시적인 다른 유도성 프로모터는 jun 프로모터, fos 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터 및 열충격 프로모터이다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Gossen, M. 등의,　Curr Opi Biotech　1994, 5, 516-520를 또한 참조한다). 진핵 생물에서 고 발현에 특히 적합한 프로모터 중에는, 예를 들어, 햄스터의 유비퀴틴/S27a 프로모터 (WO 97/15664), SV 40 초기 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter), 마우스 메탈로티오테인-1 프로모터, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복 영역, 및 인간 사이토메갈로바이러스의 초기 프로모터가 있다. 예시적인 다른 이종 포유류 프로모터는 액틴(actin) 프로모터, 면역 글로불린 프로모터, 또는 열충격 프로모터(들)이다.
예를 들어, 프로모터는 전사 활성을 증가시키기 위해 인핸서 서열에 기능적으로 결합될 수 있다. 이를 위해, CMV 또는 SV40 인핸서와 같은 하나 이상의 인핸서 및/또는 인핸서 서열의 여러 카피가 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 전사 활성을 증가시키기 위해 인핸서 서열에 기능적으로 결합될 수 있다. 이를 위해, CMV 또는 SV40 인핸서와 같은 하나 이상의 인핸서 및/또는 인핸서 서열의 여러 카피가 사용될 수 있다.
당업자는, 용어 "인핸서"가, 시스 위치에서 프로모터의 활성에 영향을 미쳐 이러한 프로모터에 기능적으로 연결된 유전자의 전사를 자극하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 프로모터와 달리, 인핸서의 효과는 위치와 배향과 독립적이므로, 인핸서는 전사 유니트의 전방이나 후방에 위치할 수 있고, 인트론 내 또는 심지어 코딩 영역 내에 위치할 수 있다. 인핸서는 전사 유니트의 바로 근방 및 프로모터로부터 상당한 거리 모두에 위치할 수 있다. 프로모터와 물리적으로 및 기능적으로 중첩하는 것도 가능하다. 당업자는, (예를 들어, ATCC에 보관되어 있거나, 상업적 공급원 및 개별 공급원 유래의) 폴리뉴클레오티드 서열 내에서 클로닝된 독립 요소 또는 요소들로서 이용 가능한 다양한 공급원 유래의 다수의 인핸서 (및 GenBank와 같은 데이터뱅크에 보관된, 예를 들어, SV40 인핸서, 폴리오마 인핸서, 아데노바이러스 인핸서)를 알 것이다. 다수의 프로모터 서열은 빈번하게 사용되는 CMV 프로모터와 같은 인핸서 서열도 함유한다. 인간 CMV 인핸서는 지금까지 확인된 가장 강력한 인핸서 중 하나이다. 하나의 예시적인 유도성 인핸서는 글루코코티코이드 또는 중금속에 의해 자극될 수 있는 메탈로티오네인 인핸서이다.
기본적으로, 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 종결 신호와 폴리아데닐화 신호, 및 기타 발현 조절 요소를 포함한다. 유도성 및 구조적 조절 서열 모두는 다양한 세포 유형에 대해 알려져 있다. "전사 조절 요소(transcription-regulatory elements)"는 발현될 유전자 서열의 상류에 있는 프로모터, 전사 개시 부위 및 종결 부위, 및 폴리아데닐화 신호를 일반적으로 포함한다.
당업자는, 용어 "전사 개시 부위(transcription initiation site)"가 일차 전사체, 즉 mRNA 전구체에 혼입된 제1 핵산에 상응하는 작제물의 핵산을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 전사 개시 부위는 프로모터 서열과 중첩될 수 있다.
당업자는, 용어 "전사 종결 부위(transcription termination site)"는 일반적으로 관심 유전자 또는 전사될 유전자 부분의 3' 말단에 존재하고 RNA 중합 효소에 의한 전사의 대략 종결을 가져오는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
당업자는, 용어 "폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal)"는, 진핵 생물 mRNA의 3' 말단 특정 부위에서 절단을 유발하고, 절단된 3' 말단에서 약 100~200개의 아데닌 뉴클레오티드(폴리A 꼬리)로 이루어진 서열의 전사 후 통합을 유발하는 신호 서열을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 폴리아데닐화 신호는 절단 부위의 약 10~30개 뉴클레오티드 상류의 서열 AATAAA 및 하류에 위치한 서열을 포함한다. tk 폴리A, SV40 후기 및 초기 폴리A 또는 BGH 폴리A와 같은 다양한 폴리아데닐화 요소가 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,122,458호에 기재됨).
"번역 조절 요소(translation regulatory elements)"는 발현될 각 폴리펩티드에 대한 번역 개시 부위(AUG), 정지 코돈 및 폴리A 신호를 포함한다. 최적의 발현을 위해서는, 임의의 잠재적으로 부적절한 추가 번역 개시 코돈이나, 전사 또는 발현 수준에서 발현에 영향을 줄 수 있는 다른 서열을 제거하기 위해, 발현될 핵산 서열의 5'-미번역 영역 및/또는 3'-미번역 영역을 제거, 추가 또는 변경하는 것이 바람직할 수 있다. 발현을 촉진하기 위해, 리보솜 공통 결합 부위(consensus binding sites)가 대안적으로 시작 코돈의 바로 상류에 삽입될 수 있다. 분비된 폴리펩티드를 생산하기 위해, 일반적으로 관심 유전자는 합성된 폴리펩티드를 ER 막에 및 이를 통해 운반하는 신호 전구체 펩티드를 코딩하는 신호 서열을 함유한다. 신호 서열은, 항상 그렇지는 않지만 종종 분비된 단백질의 아미노 말단에 위치하며, 단백질이 ER 막을 통해 여과된 후에 신호 펩티다아제에 의해 절단된다. 유전자 서열은 대개 자신의 신호 서열을 함유하게 되지만, 꼭 그런 것은 아니다. 천연 신호 서열이 존재하지 않는 경우, 이종 신호 서열이 알려진 방식으로 도입될 수 있다. 이러한 종류의 수많은 신호 서열은 당업자에게 알려져 있으며, GenBank 및 EMBL과 같은 서열 데이터뱅크에 보관되어 있다.
당업자는, 용어 "폴리펩티드(polypeptides/polypeptide)" 또는 이의 문법적 등가물이 아미노산 서열이나 단백질을 포함하도록 상호 교환 가능하게 사용될 수 있고, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 본 용어는 글리코실화, 인산화, 아세틸화 또는 단백질 처리와 같은 반응에 의해 번역 후에 변형된 단백질도 포함한다. 폴리펩티드의 구조는 그의 생물학적 활성을 유지하면서, 예를 들어, 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입, 및 다른 단백질과 융합에 의해 변형될 수 있다.
세포에서 하나 이상의 관심 유전자 산물을 생산하기 위해, 세포는 관심 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 무혈청 배양액 및 현탁 배양액 중에서 성장될 수 있다. 예를 들어, 관심 유전자가 구성적 프로모터의 조절하에 있는 경우, 특별한 유도제를 첨가할 필요는 없다. 관심 유전자의 발현이 유도성 프로모터의 조절하에 있는 경우, 예를 들어, 상응하는 유도제를 충분하되 비 독성인 농도로 세포 배양 배지에 첨가해야 한다. 세포는 다수의 계대 배양에 의해 원하는대로 증식되어 적절한 세포 배양 용기에 옮겨질 수 있다. 유전자 산물(들)은 세포 산물, 막 결합 산물 또는 분비물로서 생산된다.
일 구현예에서, CTP-변형 인자 VIIa를 제조하는 단계는, CTP-변형 인자 VII를 암호화하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터로 소정의 수의 세포를 안정하게 형질 감염시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VIIa를 제조하는 단계는, 상기 CTP-변형 인자 VII를 암호화하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터로 세포를 안정하게 형질 감염시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 CHO 세포이다. 또 다른 구현예에서, 세포는 DG44 세포이다. 또 다른 구현예에서, 세포는 CTP-변형 인자 VII의 분비 및 발현에 적합한, 당업계에 알려진 임의의 세포이다. 일 구현예에서, 발현된 CTP-변형 FVII는 신호 서열이 결여된 FVII-CTP3 치모겐이다. 또 다른 구현예에서, 발현된 CTP-변형 FVII의 아미노산 서열은 서열 번호 7에 제시되어 있다.
당업자는, CTP-변형 FVII가 불활 상태의 치모겐으로서 발현될 수 있고, 치모겐은 정제 단계 동안 또는 그 후에 활성화될 수 있음을 이해할 것이다. 용어 "CTP-변형 FVII"는 "CTP-변형 FVII/FVIIa"와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있고, CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 불활성 형태 및 활성 형태 모두를 포함할 수 있다. 유사하게, FVII/FVIIa-CTP3과 같은 개별 CTP-변형 인자 VII 폴리펩티드도 불활성 형태, 활성 형태, 또는 둘 다를 나타내도록 FVII/FVIIa의 명명법을 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 활성화된 FVIIa-CTP3을 포함하는 CTP-변형 폴리펩티드는 이황화결합에 의해 결합된 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 형질 감염된 세포는 CTP-변형 인자 VII를 발현한다. 또 다른 구현예에서, 발현되고 제조된 FVII/FVIIa-CTP3은 상기 인자 VII/VIIa의 카르복시 말단에 부착된 2개의 CTP, 및 상기 인자 VII/VIIa의 아미노 말단에 부착된 하나의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 발현되고 제조된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드는 상기 인자 VII/FVIIa의 카르복시 말단에 부착된 하나의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드로 이루어진다. 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII의 발현은 고 발현 수준이다. 또 다른 구현예에서, 상기 CTP-변형 인자 VII/VIIa는 고도로 글리코실화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 CTP-변형 인자 VII/VIIa는 고도로 시알산화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 CTP-변형 인자 VII/VIIa는 높은 O-글리칸 함량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 상기 CTP-변형 인자 VII/VIIa는 높은 N-글리칸 함량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 상기 CTP-변형 인자 VII/VIIa는 하전된 N-글리칸 높은 함량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 상기 CTP-변형 인자 VII/VIIa는 고백분율의 카르복시-글루탐산을 갖는다. 본원에 상세하게 기술된 바와 같이, CTP-변형 인자 VIIa는 상이한 글리코실화 함량 및 패턴을 가질 수 있다. 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 CTP-변형 인자 VIIa는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 글리코실화 패턴 및 함량을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본원에 제시된 제조 방법은 높은 글리코실화 함량 및 고백분율의 글리코실화된 글리코실화 부위를 갖는 CTP-변형 인자 VIIa를 제공한다.
또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 O-글리칸 함량은 적어도 2 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 O-글리칸 함량은 적어도 4 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 O-글리칸 함량은 적어도 5 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 O-글리칸 함량은 적어도 6 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 O-글리칸 함량은 적어도 8 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 O-글리칸 함량은 적어도 10 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 O-글리칸 함량은 적어도 12 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 O-글리칸 함량은 적어도 14 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 O-글리칸 함량은 적어도 16 mol/mol이다.
일 구현예에서, O-글리칸의 높은 수준 또는 함량은 본원에 개시된 제조 단계 중 상류 단계에 의해 유도된다. 또 다른 구현예에서, O-글리칸의 높은 수준 또는 함량은 본원에 개시된 제조 단계에서의 클론에 의해 유도된다. 또 다른 구현예에서, O-글리칸의 높은 함량 또는 수준은 최종 약물이 수득될 때까지 유지된다.
또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa는 높은 시알산 함량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 4 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 6 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 8 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 10 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 12 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 14 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 15 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 17 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 18 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 20 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 22 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 25 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 27 mol/mol이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 높은 시알산 함량은 적어도 30 mol/mol이다.
또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 40%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 50%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 60%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 70%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 80%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 85%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 90%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 91%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 92%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 93%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 94%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 95%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 96%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 97%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 98%이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 상기 고백분율 카르복시-글루탐산은 적어도 99%이다. 당업자는 카르복시 글루탐산 잔기의 백분율이 도메인이 없는 카르복시 글루탐산 잔기(도메인 없는 Gla) 백분율과 반대로 발현될 수 있다는 것을 이해할 것이다 (예를 들어, 고 백분율 Gla가 40%이면 도메인 없는 Gla는 60%임).
일 구현예에서, CTP-변형 인자 VIIa를 제조하는 단계는 CTP-변형 인자 VII을 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 최적으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 30~1500 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 30 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 40 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 50 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 60 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 70 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 50~70 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 200 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 300 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 400 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 500 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 600 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 700 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 800 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 900 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 1000 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 1100 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 1200 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 1300 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 1400 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 발현 수준은 적어도 1500 mg/L이다. 또 다른 구현예에서, 클론이 배지에서 증식되어 마스터 세포 은행(MCB) 및 제조용 세포 은행(WCB)을 형성한다. 일 구현예에서, 단계 (c)에서의 클론은 MCB로부터 수득된다. 또 다른 구현예에서, 클론은 WCB로부터 수득된다.
CTP-변형 FVII는 분비된 유전자 산물로서 세포 배양 배지로부터 수득된다. 그러나, 단백질 또는 폴리펩티드가 분비 신호없이 발현되는 경우, 유전자 산물은 세포 용해물로부터 단리될 수도 있다. 다른 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질이 실질적으로 없는 순수한 균질 산물을 수득하기 위해, 통상적인 정제 과정이 수행된다. 먼저, 배양 배지 또는 용해물로부터 세포 및 세포 잔해가 빈번하게 제거된다. 그러면, 원하는 유전자 산물은, 예를 들어, 면역친화도 컬럼 및 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 친화도 컬럼, 에탄올 침강, Sephadex에 대한 역상 HPLC 또는 크로마토그래피, 히드록시아파타이트, DEAE와 같은 실리카 또는 양이온 교환 수지에 의한 가용성 단백질, 폴리펩티드 및 핵산의 오염으로부터 자유로울 수 있다(본원의 실시예 참조). 당업계에 알려져 있고, 재조합 숙주 세포에 의해 발현된 이종 단백질을 정제하는 일반적인 방법론은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, Harris 등에 의한 문헌 (Harris 등의, Protein Purification: A Practical Approach, Pickwood and Hames, eds., IRL Press, Oxford, 1995) 및 Scopes에 의한 문헌에 기재되어 있다(Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, 1988). 이들 방법은 본원에 개시된 방법에 그 전체 또는 일부가 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 무혈청 조건 하에 포유류 세포에서 CTP-변형 FVII를 제조하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 (i) 포유류 세포가 CTP-변형 FVII를 코딩하는 유전자를 함유하고; (ii) 포유류 세포는 포유류 세포의 복제를 허용하는 무혈청 조건 하에 성장되고; (ⅲ) 각각의 경우에, 이들 포유류 세포(들) 중 적어도 하나는 무혈청 조건 하에 세포 배양 용기에 보관되어 있고; (iv) 적절히 보관된 포유류 세포가 무혈청 조건 하에서 복제되고; (v) 복제된 세포는 CTP-변형 FVII가 발현되는 무혈청 조건 하에 배양되며; (vi) 그런 다음, CTP-변형 FVII 산물은 세포 또는 배양 상등액으로부터 단리되어, 정제되고 활성화되는 것을 특징으로 한다. 본 방법의 또 다른 구현예에서, 포유류 세포는 CTP-변형 FVII를 위한 유전자가 도입된, 형질 감염된 포유류 세포이다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 또한 재조합 유전자 산물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 전술한 방법의 단계 (i) 전에, CTP-변형 FVII를 적어도 코딩하는 핵산으로 포유류 세포를 형질 감염시키는 것을 특징으로 한다. 상응하는 포유류 세포를 안정하게 형질 감염시키는 것이 바람직하다.
예시적인 무혈청, 무단백질 또는 화학적으로 정의된 배지는, 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 배지 Ham's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI 1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential medium (MEM; Sigma), Iscove's Modified Dulbecco's medium (IMDM; Sigma), CDCHO (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA), CHO-S-SFMII (Invitrogen), 무혈청 CHO 배지(Sigma), CD-PowerCHO2 medium (Lonza) 및 무단백질 CHO 배지(Sigma)를 포함한다. 필요에 따라, 이들 각각의 배지는 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예: 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자), 염(예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 인산), 완충액(예: HEPES), 뉴클레오시드(예: 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코스 또는 다른 균등한 영양제, 항생제 및/또는 미량 원소와 같은 다양한 화합물, 또는 Power Feed A(Lonza)와 같은, 상업적으로 이용 가능한 영양분 공급원(Feed)으로 보충될 수 있다. 복제 가능한 세포가 하나 이상의 선별 마커를 발현하는 재조합 세포인 경우, 항생제와 같은 하나 이상의 적합한 선택 제제가 배지에 첨가될 수도 있다.
(폴리펩티드를 암호화하는) 삽입 코딩 서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 함유하는 외에, 본원에 개시된 발현 작제물은 발현 폴리펩티드의 안정성, 생산, 정제, 수율 또는 활성을 최적화하도록 조작된 서열도 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일 구현예에서, CTP-변형 FVII를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 4에 제시되어 있다. 　
일부 구현예에서, 형질 변환 세포는 다량의 재조합 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 효과적인 조건 하에 배양된다. 일부 구현예에서, 효과적인 배양 조건은 단백질 생산을 가능하게 하는 효과적인 배지, 생물 반응기, 온도, pH 및 산소 조건을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. 당업자는, 용어 "효과적인 배지(effective medium)"가, 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위해 세포가 배양되는 임의의 배지를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 배지는 일반적으로 동화성 탄소(assimilable carbon), 질소 및 인산염 공급원, 및 적절한 염, 미네랄, 금속 및 비타민과 같은 다른 영양소를 갖는 수용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포는 종래의 발효 생물 반응기, 쉐이크 플라스크, 시험관, 미량정량 접시(microtiter dishes) 및 페트리판(petri plates)에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양은 재조합 세포에 적절한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양 조건은 당업자의 전문 지식에 속한다.
일 구현예에서, 배양 조건에는 약 20~80%의 용존 산소(DO) 함량이 포함된다. 또 다른 구현예에서, DO 함량은 약 20~30%이다. 또 다른 구현예에서, DO 함량은 약 30~40%이다. 또 다른 구현예에서, DO 함량은 약 40~50%이다. 또 다른 구현예에서, DO 함량은 약 50~60%이다. 또 다른 구현예에서, DO 함량은 약 60~70%이다. 또 다른 구현예에서, DO 함량은 약 70~80%이다.
일 구현예에서, 배양 조건은 일 온도에서 시작하여 제조 도중에 또 다른 pH로 바뀌는 pH를 포함한다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 7.3에서 시작하여 생물 반응기 인큐베이션 중에 약 6.7로 바뀐다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 7.3, 약 7.2 또는 약 7.1에서 시작하여 생물 반응기 인큐베이션 중에 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9 또는 약 7.0으로 바뀐다.
일부 구현예에서, 생산에 사용된 벡터 및 숙주 시스템에 따라 본원에 기술된 생성 폴리펩티드는 재조합 세포 내에 남거나, 배지 내로 분비된다.
일 구현예에서, 소정의 배양 시간에 이어서 재조합 폴리펩티드의 회수가 이루어진다.
당업자는, 본원에 사용된 "재조합 폴리펩티드의 회수"라는 문구가 폴리펩티드를 함유하는 전체 배지를 수집하는 것을 포함할 수 있고, 이에 추가적인 분리 및 정제 단계가 수반될 수 있음을 이해할 것이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과, 전기 영동, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 콘카나바라린 A 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피, 크로마토포커싱 및 용해도 차이와 같은 (이들로 한정되지 않음) 다양한 표준 단백질 정제 기술을 사용해 정제된다.
일 구현예에서, 각각의 컬럼은 조절되거나 조절되지 않은 온도 하에서 가동될 수 있다.
일 구현예에서, 모든 크로마토그래피 단계는 하향 흐름 방식(down flow mode)으로 수행된다. 또 다른 구현예에서, 모든 크로마토그래피 단계는 상향 흐름 방식(upflow mode)으로 가동된다.
일 구현예에서, 회수를 용이하게 하기 위해, 발현된 코딩 서열은 본원에 개시된 폴리펩티드를 암호화하도록 조작되고, 절단성 모이어티에 융합될 수 있다. 일 구현예에서, 폴리펩티드가 친화도 크로마토그래피에 의해 (예를 들어, 절단성 모이어티에 대해 특이적인 컬럼 상에 고정함으로써) 쉽게 단리될 수 있도록 융합 단백질을 설계할 수 있다. 일 구현예에서, 절단 부위는 폴리펩티드와 절단성 모이어티 사이에서 조작되며, 이 부위에서 융합 단백질을 특이적으로 절단하는 적절한 효소 또는 제제를 사용해 처리함으로써 폴리펩티드가 크로마토그래피 컬럼으로부터 방출될 수 있다[예를 들어, Booth 등의, Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); 및 Gardella 등의, J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990) 참조].
일 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 "실질적으로 순수한" 형태로 회수된다. 당업자는, "실질적으로 순수한"이라는 문구가 본원에 기술된 응용예에서 단백질이 효과적으로 사용되게 하는 순도를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 형태는 본원에서도 개시된 바와 같은 고도로 글리코실화된 형태(O-글리칸 및/또는 N-글리칸) 및 고도로 시알산화된 형태를 포함할 수도 있다. 또 다른 구현예에서, 이러한 형태는 고 백분율 카르복실화 글루탐산 잔기, 및/또는 저 백분율의 산화 형태를 갖는 형태를 포함할 수 있다. 여전히 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CTP-변형 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 활성 형태의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 CTP-변형 FVII/FVIIa의 산화 백분율은 20% 산화 미만이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 CTP-변형 FVII/FVIIa의 산화 백분율은 15% 산화 미만이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 CTP-변형 FVII/FVIIa의 산화 백분율은 10% 산화 미만이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 CTP-변형 FVII/FVIIa의 산화 백분율은 8% 산화 미만이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 CTP-변형 FVII/FVIIa의 산화 백분율은 5% 산화 미만이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 CTP-변형 FVII/FVIIa의 산화 백분율은 4% 산화 미만이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 CTP-변형 FVII/FVIIa의 산화 백분율은 3% 산화 미만이다.
일 구현예에서, 산화된 형태의 환원 및 산화된 형태의 수준에 대한 조절은 상류에서 최종 약물까지의 전체 제조 단계 전반에 걸쳐 수행된다.
또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 40%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 50%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 60%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 70%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 75%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 80%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 85%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 90%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 91%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 92%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 93%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 94%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 95%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 96%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 97%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 98%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII 폴리펩티드의 순도는 적어도 99%이다. 추가 구현예에서, 순도 백분율은 97.3%, 97.6%, 97.4% 및 97.0%로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 대상물은 인간 대상물이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 반려 동물(domesticated animal)이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 애완동물(pet)이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 포유류이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 가축(farm animal)이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 원숭이이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 말이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 젖소이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 마우스이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 랫트이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 개(canine)이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 고양이(feline)이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 소과(bovine), 양과(ovine), 돼지과(porcine), 말과(equine), 쥣과(murine) 또는 사슴과(cervine)이다. 일 구현예에서, 대상물은 수컷이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 암컷이다. 일 구현예에서, 대상물은 아이이거나, 또 다른 구현예에서는 청소년이거나, 또 다른 구현예에서는 성인이거나, 또 다른 구현예에서는 노인이다. 또 다른 구현예에서, 대상물은 소아과 대상물이고, 또 다른 구현예에서는 노인과 대상물이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 CTP-변형 FVII 폴리펩티드는 시험관내 발현 시스템을 사용해 합성된다. 일 구현예에서, 시험관내 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 상기 시스템의 구성 요소는 상업적으로 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 재조합 DNA 기술을 사용해 CTP에 의해 변형된 인자 VIIa의 생산이 수행된다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리펩티드가 합성되고 정제되며; 치료 효능은 채내에서 또는 시험관내에서 검정될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 CTP에 의해 변형된 재조합 인자 VII/VIIa의 결합 활성은 다양한 검정법을 사용해 확인할 수 있다.
일 구현예에서, CTP-변형 인자 VIIa의 제조 방법은 상기 CTP-변형 인자 VII를 최적으로 발현시키는 클론을 상기 WCB로부터 수득하여, 상기 클론을 증식시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VIIa의 제조 방법은 상기 CTP-변형 인자 VII를 최적으로 발현시키는 클론을 상기 MCB로부터 수득하여, 상기 클론을 증식시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 세포 클론은 일련의 계대배양 단계를 통해 생산 생물 반응기 수준까지 용액 중에서 증식된다. 또 다른 구현예에서, 상기 계대배양된 클론을 함유하는 용액을 생물 반응기에 파종한다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기는 일회용 생물 반응기이다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기는 스테인리스강 생물 반응기, GE의 Wave system과 같은 요동 생물 반응기(rocking motion bioreactor), 관류 생물 반응기(perfusion bioreactor), 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 생물 반응기를 포함한다. 일 구현예에서, 생물 반응기로부터 세포를 꺼내는 것은 일회용 필터 시스템을 사용해 수행된다. 대규모 제조가 수행되는 경우, 여과 시스템을 사용하기 전에 연속 원심분리가 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 세포 클론은, 상기 세포가 원하는 크기에 도달할 때까지 이를 생물 반응기에서 (생물 반응기의 크기를 키워가며) 연속 배양함으로써 더 증식되거나 그 증식 비율이 커진다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기는 유가 배양(fed-batch) 모드로 작동한다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기는 배치(batch) 모드로 작동한다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기는 반복-배치(repeated-batch) 모드로 작동한다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기는 관류(perfusion) 모드로 작동한다.
피크 생존 세포 밀도는 사용된 생물 반응기의 유형에 따라 다르다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 제조 방법에서 사용된 생물 반응기의 피크 생존 세포 밀도는 약 0.2 x 106~1.4 x 106 세포/ml이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 제조 방법에서 사용된 생물 반응기의 피크 생존 세포 밀도는 약 0.05 x 106~100 x 106이다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기의 피크 생존 세포 밀도는 약 0.05 x 106~0.5 x 106이다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기의 피크 생존 세포 밀도는 약 0.5 x 106~5 x 106이다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기의 피크 생존 세포 밀도는 약 5.0 x 106~50 x 106이다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기의 피크 생존 세포 밀도는 약 50 x 106~100 x 106이다.
생물 반응기 사용을 위한 영양분 공급 계획은 다를 수 있는데, 예를 들어, 특정일로부터 기산하여 반복적으로 매일 공급하거나, 며칠간 고정적으로 공급할 수 있고, 첨가된 영양분의 추가 %는 수%에서 심지어 50% 이상까지 상이할 수 있다.
당업계에 알려진 바와 같이, DMSO가 상이한 농도로 생물 반응기에 첨가될 수 있다. 일 구현예에서, 0.1~3% DMSO가 생물 반응기의 사용 중에 생물 반응기에 첨가된다. 또 다른 구현예에서, 0.1~0.5% DMSO가 첨가된다. 또 다른 구현예에서, 0.5~1.0% DMSO가 첨가된다. 또 다른 구현예에서, 1.0~1.5% DMSO가 첨가된다. 또 다른 구현예에서, 1.5~2.0% DMSO가 첨가된다. 또 다른 구현예에서, 2.0~2.5% DMSO가 첨가된다. 또 다른 구현예에서, 2.5~3.0% DMSO가 첨가된다.
일 구현예에서, CTP-변형 인자 VIIa의 제조 방법은, 정제된 활성 CTP-변형 인자 FVII 용액을 수득하기 위해, 정화된 수확 용액을 정제하고 활성화시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제시된 방법을 사용해 제조된 정제된 단백질 용액은 CTP-변형 VII/VIIa를 적어도 5~95% 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제시된 방법을 사용해 제조된 정제된 단백질 용액은 CTP-변형 VII/VIIa를 적어도 5% 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제시된 방법을 사용해 제조된 정제된 단백질 용액은 CTP-변형 VII/VIIa를 적어도 10% 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제시된 방법을 사용해 제조된 정제된 단백질 용액은 CTP-변형 VII/VIIa를 적어도 20% 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제시된 방법을 사용해 제조된 정제된 단백질 용액은 CTP-변형 VII/VIIa를 적어도 30% 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제시된 방법을 사용해 제조된 정제된 단백질 용액은 CTP-변형 VII/VIIa를 적어도 40% 포함한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 적어도 50% 포함한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 적어도 60% 포함한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 적어도 70% 포함한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 적어도 80% 포함한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 적어도 90% 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제시된 방법을 사용해 제조된 정제된 단백질 용액은 CTP-변형 VII/VIIa를 적어도 95% 포함한다.
일 구현예에서, 정화된 수확물은 2~25℃에서 24시간까지 보유된다. 또 다른 구현예에서, 정화된 수확물은 최대 1개월 동안 적어도 5℃에서 보관된다.
일 구현예에서, 단계에서 수득된 정화된 수확물은 미생물 오염도(bioburden), 세균내 독소, 특정 단백질 함량, 잔류 DNA, 바이러스, 바이러스-유사 입자 및/또는 마이코플라스마(Mycoplasma) 또는 이들의 임의의 조합에 대해 시험된다.
일 구현예에서, 정화된 수확물의 정제는 다음을 포함하는 단계들을 순차적으로 수행함으로써 달성된다: (g) 상기 정화된 수확 용액을 농축하고, 투석 여과하고, 정제시키는 단계(여기서, 상기 농축, 투석 여과 및 정제는 정화된 수확 용액을 음이온 교환 컬럼 및 소수성 상호 작용 컬럼을 통해 순차적으로 통과시키는 중공 섬유 카세트 또는 접선 유동 카세트에 의해 수행됨); (h) 상기 단계 이후에 수득된 상기 정화된 수확물을 수득하는 단계; (i) 상기 정화된 수확물에 존재하는 바이러스를, 상기 바이러스에 독성인 용액 중에서 배양하여 불활성화시키는 단계; (j) 단계 (h)로부터 상기 정화된 수확 용액을 수득하고, 상기 정화된 수확 용액을 농축하고, 투석 여과하고 정제시키는 단계(여기서, 상기 농축, 투석 여과 및 정제 이후에 친화도 컬럼, 다중 모델 컬럼 또는 혼합-모드 컬럼, 소수성 상호 작용 컬럼(HIC) 및 음이온 교환 컬럼을 통해 상기 정화된 수확용액을 순차적으로 통과시키는 것이 이어짐); (j) 단계 (i) 이후에 상기 정화된 수확 용액을 수득하고, 나노 여과에 의해 바이러스로부터 상기 정화된 수확 용액을 물리적으로 제거하는 단계; 및 (k) 단계 (j) 이후에 상기 정화된 수확 용액을 수득하고, 상기 정화된 수확 용액을 농축하고, 투석 여과하고 정제시켜 상기 CTP-변형 FVII/FVIIa를 고도로 글리코실화된 형태로 함유하는 최대로 정제된, 정화된 수확물에 도달시키는 단계.
일 구현예에서, CTP-변형 FVII는 정제 중에 활성화된다. 대안적인 구현예에서, CTP-변형 FVII는 정제 이후에 활성화된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII는 임의의 정제 단계와 동시에 활성화된다.
일 구현예에서, 정화된 수확물을 농축하고 여과하기 위한 한외 여과 및 투석 여과는 중공 섬유 카트리지, 또는 동등한 TFF 기반의 UFDF 단계를 사용해 수행될 수 있다. 카트리지 명목 분자량 컷오프 크기는 10,000 kDa이다. 또 다른 구현예에서, 막 카트리지는 3 kDa 내지 30 kDa의 컷오프 크기를 갖는 PES/PS/RC 막을 준수하는 것일 수 있다. 또 다른 구현예에서, UFDF 단계는 크로마토그래피 단계들 사이에 수행될 수 있다. 또 다른 구현예에서, UFDF 단계는 음이온 교환 컬럼을 사용하기 전에 수행될 수 있다. 또 다른 구현예에서, UFDF 단계는 소수성 상호 교환 크로마토그래피(HIC)를 사용하기 전에 수행될 수 있다. 또 다른 구현예에서, UFDF 단계는 소수성 상호 교환 크로마토그래피(HIC)를 사용한 후에 수행될 수 있다. 여전히 또 다른 구현예에서, UFDF는 여러 단계에서 수행될 수 있는데, 예를 들어, UFDF는 수확에 이어서, 크로마토그래피 단계들 사이에, 또는 나노 여과에 의한 바이러스 제거에 이어지는 단계로서 수행되거나, 이들의 임의의 조합일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 음이온 교환 컬럼은 DEAE-세파로스 패스트 플로우 컬럼(DEAE-Sepharose Fast Flow column)이다. 또 다른 구현예에서, DEAE 컬럼은 상기 CTP-변형 인자 VII/VIIa는 고도로 글리코실화된 형태를 정제한다. 일 구현예에서, 글리코실화 정도가 높을수록 CTP-변형 인자 VII/VIIa의 약물동력학이 더 좋아진다. 또 다른 구현예에서, 음이온 교환 컬럼은 당업계에 알려진 다른 음이온 교환 컬럼들, 예를 들어, Capto DEAE 음이온 교환 컬럼 또는 Eshmuno Q와 같은 다른 수지를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 소수성 컬럼은 페닐 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 컬럼이다. 페닐 HIC에 대한 사용 사이클의 수는 약 1~10회 범위일 수 있다. 일 구현예에서, 1~3사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 1~5사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 1~6사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 1~7사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 1~8사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 1~9사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 1~10사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 당업계에 알려진 완충액이 세척 및 용리에 사용된다. 일 구현예에서, 용리 완충액은 황산암모늄과 프로필렌 글리콜을 포함한다. 일 구현예에서, 용리 완충액은 황산암모늄과 에틸렌 글리콜을 포함한다.
일 구현예에서, 수산화인회석 혼합 모드 컬럼(Hydroxyapatite Mixed-Mode column)은 세라믹 수산화인회석 혼합 모드 컬럼(CHT)을 포함한다. CHT에 대한 사용 사이클의 수는 약 1~10회 범위일 수 있다. 일 구현예에서, 1~3사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 1~5사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 1~6사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 1~7사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 1~8사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 1~9사이클이 수행된다. 또 다른 구현예에서, 1~10사이클이 수행된다. CHT 컬럼으로부터의 용리는 약 3~10 컬럼 부피(CV)로 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 용리는 약 3 CV로 수행된다. 또 다른 구현예에서, 용리는 약 4 CV로 수행된다. 또 다른 구현예에서, 용리는 약 5 CV로 수행된다. 또 다른 구현예에서, 용리는 약 6 CV로 수행된다. 또 다른 구현예에서, 용리는 약 7 CV로 수행된다. 또 다른 구현예에서, 용리는 약 8 CV로 수행된다. 또 다른 구현예에서, 용리는 약 9 CV로 수행된다. 또 다른 구현예에서, 용리는 약 10 CV로 수행된다.
일 구현예에서, 오염으로 인해 정화된 수확물 중에 존재할 수 있는 바이러스가 정화된 수확물 중에서 불활성화된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스는 1% Triton-X 100 용액을 사용해 불활성화된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스는 0.2 내지 2% Triton-X 100 용액을 사용해 불활성화된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스는 0.5% Triton-X 100 용액을 사용해 불활성화된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스는 1~4% Triton-X 100 용액을 사용해 불활성화된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스는 0.2~0.5% Triton-X 100 용액을 사용해 불활성화된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스는 0.5~1.0% Triton-X 100 용액을 사용해 불활성화된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스는 2% Triton-X 100 용액을 사용해 불활성화된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스는 3% Triton-X 100 용액을 사용해 불활성화된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스는 4% Triton-X 100 용액을 사용해 불활성화된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스는 5~10% Triton-X 100 용액을 사용해 불활성화된다. 또 다른 구현예에서, Triton-X 100 용액 중에서 바이러스의 불활성화는 약 0.5 내지 24시간 동안이다. 또 다른 구현예에서, Triton-X 용액 중에서 바이러스의 불활성화는 약 0.5 내지 1시간 동안이다. 또 다른 구현예에서, Triton-X 용액 중에서 바이러스의 불활성화는 약 1 내지 2시간 동안이다. 또 다른 구현예에서, Triton-X 용액 중에서 바이러스의 불활성화는 약 2 내지 3시간 동안이다. 또 다른 구현예에서, Triton-X 용액 중에서 바이러스의 불활성화는 약 3 내지 4시간 동안이다. 또 다른 구현예에서, Triton-X 용액 중에서 바이러스의 불활성화는 약 4 내지 6시간 동안이다. 또 다른 구현예에서, Triton-X 용액 중에서 바이러스의 불활성화는 약 6 내지 8시간 동안이다. 또 다른 구현예에서, Triton-X 용액 중에서 바이러스의 불활성화는 약 8 내지 10시간 동안이다. 또 다른 구현예에서, Triton-X 용액 중에서 바이러스의 불활성화는 약 10 내지 12시간 동안이다. 또 다른 구현예에서, Triton-X 용액 중에서 바이러스의 불활성화는 약 12 내지 24시간 동안이다.
당업자는, 당업계에서 이용 가능하고 이들 바이러스에 독성인, 염화나트륨 및 Tween 80을 포함하되 이들로 한정되지 않는 다른 용액 또는 다른 농도가 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 또 다른 구현예에서, 트리-n-부틸 인산염(TNBP) 및 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80; Tween 80)의 혼합물이 단계 (h)에서 바이러스를 불활성화시키는 데 사용된다.
일 구현예에서, 바이러스는 나노 여과를 사용함으로써 물리적으로 제거된다. 당업자는, 당업계에 알려진 임의의 바이러스 제거용 필터가 본원에 개시된 방법에 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 또 다른 구현예에서, 나노 여과는 플라노바(Planova) 또는 플라노바형 필터 카트리지(1~60 mm2)를 사용해 수행될 수 있다. 당업계에 알려진 방법을 사용해, 정화된 수확물로부터 바이러스의 제거를 확인하는 단계가 이러한 방법에 이어진다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 고도로 글리코실화된 CTP-변형 인자 VII/VIIa의 적어도 20% 회수율을 달성한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 고도로 글리코실화된 CTP-변형 인자 VII/VIIa의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.9%의 회수율을 달성한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 고도로 글리코실화된 CTP-변형 인자 VII/VIIa의 정제에 이어서, 상기 CTP-변형 폴리펩티드를 특성화하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa의 순도가 결정된다. 또 다른 구현예에서, 글리코실화 함량이 결정된다. 또 다른 구현예에서, 글리코실화 부위 점유율이 결정된다. 일 구현예에서, 순도, 글리코실화 함량 및 글리코실화 부위 점유율은 제조된 CTP-변형 인자 VII/VIIa에서 결정된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에서 사용된 세포 클론은 냉동 세포은행에 보관된다. 또 다른 구현예에서, 세포 클론은 동결 건조된 세포은행에 보관된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 세포은행은 마스터 세포은행이다. 또 다른 구현예에서, 세포은행은 제조용 세포은행이다. 또 다른 구현예에서, 세포은행은 굿 매뉴팩처링 프랙티스(Good Manufacturing Practice; GMP) 세포은행이다. 또 다른 구현예에서, 세포은행은 임상등급 재료의 생산용으로 의도된다. 또 다른 구현예에서, 세포은행은 인간에 사용하기 위한 규제 관행을 따른다. 또 다른 구현예에서, 세포은행은 당업계에 알려진 임의의 다른 유형의 세포은행이다.
또 다른 구현예에서의 "굿 매뉴팩처링 프랙티스"는 미국 연방 법규 코드 (21 CFR 210~211)에 의해 정의된다. 또 다른 구현예에서, "굿 매뉴팩처링 프랙티스"는 임상-등급 재료의 생산 또는 인간 소비를 위한 다른 표준; 예를 들어 미국 이외의 국가의 표준에 의해서 정의된다. 각각의 가능성은 본원에 개시된 별도의 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 세포 증식에 사용된 배지는 메토트렉사트(methotrexate; MXT)를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 배지는 메토트렉사트가 없는 배지이다. 또 다른 구현예에서, 배지 내에 존재하는 MXT의 농도는 약 0.1~2 uM이다. 또 다른 구현예에서, 배지 내에 존재하는 MXT의 농도는 약 0.1~0.5 uM이다. 또 다른 구현예에서, 배지 내에 존재하는 MXT의 농도는 약 0.5~1.0 uM이다. 또 다른 구현예에서, 배지 내에 존재하는 MXT의 농도는 약 1.0~1.5 uM이다. 또 다른 구현예에서, 배지 내에 존재하는 MXT의 농도는 약 1.5~2.0 uM이다. 당업자는, 용어 "배지(medium)"가 본원에 개시된 CTP-변형 인자 VII를 포함하는 세포의 성장 또는 배양에 적합한 액체 또는 겔 또는 분말을 포함할 수 있음을 잘 이해할 것이다. 이러한 배지는 "성장 배지(growth medium)"또는 "배양 배지(culture medium)"로서 대안적으로 지칭될 수 있으며, 영양 배지, 농축 배지, 최소 배지, 감별 배지(differential medium), 수송 배지 또는 선택 배지를 포함하되 이들로 한정되지 않을 수 있다. 추가 양태에서, 선택성 배지는 제조 단계 동안에 세포의 특정 그룹을 선택하는 데 적합할 수 있다.
일 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 5~95%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 5%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 10%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 15%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 20%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 30%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 40%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 50%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 60%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 70%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 80%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 90~95%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 95.1~99.9%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질 용액은 100%의 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 함유한다.
일 구현예에서, 제조된 CTP-변형 응고 인자는 높은 %의 감마카르복실화를 포함한다. 당업자는, 응고 인자의 백분율(%) 감마 카르복실화가 CTP-변형 응고 인자의 포텐시와 직접적인 관계를 가질 수 있음을 이해할 것이다. 일 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 50%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 60%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 70%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 80%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 90%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 92%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 93%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 94%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 95%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 96%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 97%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 98%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 적어도 99%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 100%의 감마 카르복실화를 포함한다.
또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 40~50%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 50~60%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 60~70%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 70~80%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 80~85%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 85~90%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 90~92%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 90~95%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 95~97%의 감마 카르복실화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVII-CTP3 또는 FVIIa-CTP3의 % 감마 카르복실화는 95~100%의 감마 카르복실화를 포함한다.
일 구현예에서, 저 감마 카로복실화의 제거는 본원에 개시된 제조 단계 중 다중 모델 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피에서 수행된다(도 17의 단계 9 참조).
일 구현예에서, 제조된 CTP-변형 인자 VII/VIIa는 고도로 글리코실화된다. 당업자는, CTP-변형 인자 VII/VIIa와 관련하여, 용어 "고도로 글리코실화(highly glycosylated)"는 총 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드의 약 70~80%의 글리코실화 수준을 포함할 수 있음을 잘 이해할 것이다. 또 다른 구현예에서, 고도로 글리코실화된 CTP-변형 인자 VII/VIIa는 적어도 70%의 글리코실화 수준을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 고도로 글리코실화된 CTP-변형 인자 VII/VIIa는 적어도 80%의 글리코실화 수준을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 총 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드의 약 81~90%의 글리코실화 수준을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 고도로 글리코실화된 CTP-변형 인자 VII/VIIa는 적어도 90%의 글리코실화 수준을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 총 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드의 약 91~95%의 글리코실화 수준을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 총 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드의 약 95.1~99%의 글리코실화 수준을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 총 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드의 100%의 글리코실화 수준을 포함할 수 있다. 고도로 글리코실화된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드는 지속성 인자 VII/VIIa를 사용하는 방법에 있어서 투여 빈도를 감소시키는 유익한 특성을 가질 수 있다. 높은 클리코실화 수준은 재조합 인자 VII/VIIa와 비교해 CTP-변형 인자 VII/VIIa, 예를 들어 CTP-변형 인자 VIIa의 유체역학적 부피를 유의하게 증가시키는 데 기여한다. 이는 CTP-변형 인자 VIIa의 순환 시간을 연장시킬 수 있다.
일 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 수는 적어도 4~6이다. 또 다른 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 수는 4~6이다. 또 다른 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 수는 적어도 4~8이다. 또 다른 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 수는 4~8이다. 일 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 수는 적어도 6~8이다. 일 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 수는 6~8이다. 또 다른 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 수는 적어도 4이다. 또 다른 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 수는 적어도 5이다. 또 다른 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 수는 적어도 6이다. 또 다른 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 수는 적어도 7이다. 또 다른 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 수는 적어도 8이다.
일 구현예에서, 하나의 CTP가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 4~6이다. 또 다른 구현예에서, 하나의 CTP가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 6~8이다. 또 다른 구현예에서, 하나의 CTP가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 4~8이다. 또 다른 구현예에서, 2개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 8~12이다. 또 다른 구현예에서, 2개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 12~16이다. 또 다른 구현예에서, 2개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 8~16이다. 또 다른 구현예에서, 3개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 12~18이다. 또 다른 구현예에서, 3개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 18~24이다. 또 다른 구현예에서, 3개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 12~24이다. 또 다른 구현예에서, 4개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 16~24이다. 또 다른 구현예에서, 4개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 24~32이다. 또 다른 구현예에서, 4개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 16~32이다. 또 다른 구현예에서, 5개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 20~32이다. 또 다른 구현예에서, 5개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 30~40이다. 또 다른 구현예에서, 5개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 20~40이다. 또 다른 구현예에서, 6개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 24~36이다. 또 다른 구현예에서, 6개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 36~48이다. 또 다른 구현예에서, 6개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 24~48이다. 또 다른 구현예에서, 7개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 28~35이다. 또 다른 구현예에서, 7개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 42~56이다. 또 다른 구현예에서, 7개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 28~56이다. 또 다른 구현예에서, 8개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 32~48이다. 또 다른 구현예에서, 8개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 48~64이다. 또 다른 구현예에서, 8개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 32~64이다. 또 다른 구현예에서, 9개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 36~54이다. 또 다른 구현예에서, 9개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 54~72이다. 또 다른 구현예에서, 9개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 36~72이다. 또 다른 구현예에서, 10개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 40~60이다. 또 다른 구현예에서, 10개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 60~80이다. 또 다른 구현예에서, 5개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드당 O-글리칸의 수는 적어도 40~80이다.
일 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 점유율은 적어도 70%이다. 또 다른 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 점유율은 적어도 80%이다. 또 다른 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 점유율은 적어도 90%이다. 또 다른 구현예에서, CTP당 O-글리칸의 점유율은 100%이다.
일 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 고 백분율의 N-글리칸이 하전된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 적어도 40%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 적어도 50%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 적어도 60%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 적어도 70%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 적어도 80%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 적어도 85%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 적어도 90%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 적어도 95%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 100%를 포함한다.
또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 40%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 50%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 60%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 70%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 80%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 85%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 90%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 95%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 100%를 포함한다.
또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 10% 내지 30%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 20% 내지 40%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 30% 내지 40%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 20% 내지 50%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 40% 내지 50%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 30% 내지 60%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 50% 내지 60%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 40% 내지 70%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 60% 내지 70%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 50% 내지 80%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 70% 내지 80%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 55% 내지 85%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 80% 내지 85%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 60% 내지 90%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 85% 내지 90%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 65% 내지 95%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 90% 내지 95%를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa당 하전된 N-글리칸의 백분율은 약 95% 내지 100%를 포함한다.
일 구현예에서, 하전된 N-글리칸의 높은 수준은 본원에 개시된 제조 단계 중 상류 단계에 의해 유도된다. 또 다른 구현예에서, 하전된 N-글리칸 중 60% 초과가 초기 DSP 단계에서 도달하고, 이 수준은 최종 약물이 수득될 때까지 유지된다.
일 구현예에서, 하전된 N-글리칸의 높은 수준은 본원에 개시된 제조 단계 중 상류 단계에 의해 유도된다. 또 다른 구현예에서, 하전된 N-글리칸 중 60% 초과가 초기 DSP 단계에서 도달하고, 이 수준은 최종 약물이 수득될 때까지 유지된다.
일 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa는 고도로 시알산화된다. 당업자는, CTP-변형 인자 VII/VIIa와 관련하여, 용어 "고도로 시알산화(highly glycosylated)"는 총 CTP-변형 인자 VIIa 폴리펩티드의 약 70~80%의 시알산화 수준을 포함할 수 있음을 잘 이해할 것이다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 총 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드의 약 80~90%의 시알산화 수준을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 총 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드의 약 90~95%의 시알산화 수준을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 총 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드의 약 95.1~99%의 시알산화 수준을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 총 CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드의 100%의 시알산화 수준을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VIIa 내의 O-글리칸 구조는 모노-시알산화 코어 1을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 CTP-변형 FVII/FVIIa의 시알산화 및 O-결합 글리칸 함량의 높은 백분율은 CTP-변형 FVII/FVIIa의 포텐시를 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 CTP-변형 FVII/FVIIa의 시알산화 및 O-결합 글리칸 함량의 높은 백분율은 CTP-변형 FVII/FVIIa의 유체역학적 부피를 증가시킨다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 CTP-변형 FVII/FVIIa는 포텐시를 갖는다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa는 실질적으로 순수하고 활성인 CTP-변형 FVII/FVIIa 폴리펩티드이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 FVII/FVIIa는 본원 기술된 방법을 사용해 제조된다. 또 다른 구현예에서, 상기 포텐시는 적어도 5,000 U/mg이다. 또 다른 구현예에서, 상기 포텐시는 적어도 7,500 U/mg이다. 또 다른 구현예에서, 상기 포텐시는 적어도 10,000 U/mg이다. 또 다른 구현예에서, 상기 포텐시는 적어도 10,500 U/mg이다. 또 다른 구현예에서, 상기 포텐시는 적어도 15,000 U/mg이다. 또 다른 구현예에서, 상기 포텐시는 적어도 20,000 U/mg이다. 또 다른 구현예에서, 상기 포텐시는 적어도 25,000 U/mg이다. 또 다른 구현예에서, 상기 포텐시는 적어도 27,500 U/mg이다. 또 다른 구현예에서, 상기 포텐시는 적어도 30,000 U/mg이다. 또 다른 구현예에서, 상기 포텐시는 적어도 35,000 U/mg이다. 또 다른 구현예에서, 상기 포텐시는 적어도 40,000 U/mg이다. 추가 구현예에서, 포텐시(potency)는 15,563 U/mg 16,720 U/mg, 22,478 U/mg 및 23,608 U/mg으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드는 상기 인자 VII/VIIa의 카르복시 말단에 부착된 2개의 CTP, 및 상기 인자 VII/VIIa의 아미노 말단에 부착된 하나의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII/VIIa 폴리펩티드는 상기 인자 VII/VIIa의 카르복시 말단에 부착된 하나의 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드로 이루어진다.
일 구현예에서, 상기 CTP-변형 인자 VII/VIIa를 암호화하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터는 프로모터, 상기 CTP-변형 폴리펩티드에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 서열을 또한 포함한다. 일 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 시미안 바이러스(SV) 40 폴리아데닐화 서열이다.
일 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 30~1500 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 30 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 40 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 50 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 60 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 70 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 50~70 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 80 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 90 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 70~100 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 100 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 200 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 100~200 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 300 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 200~300 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 400 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 300~400 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 500 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 500~600 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 600 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 600~700 mg/L의 수준으로 발현된다. 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 700 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 701~800 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 800 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 801~900 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 900 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 901~1000 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 1000 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 1001~1100 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 1100 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 1101~1200 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 1200 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 1201~1300 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 1300 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 1301~1400 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 1400 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 1401~1500 mg/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VII는 적어도 1500 mg/L의 수준으로 발현된다.
당업자는, 용어 "발현(expression)"이 숙주 세포 내의 이종 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 숙주 세포에서 원하는 관심 생성물/단백질의 발현 수준은 세포 내에 존재하는 상응 mRNA 또는 cDNA의 양, 또는 본 실시예에와 같이 선택된 서열에 의해 암호화된 원하는 관심 폴리펩티드/단백질의 양에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 선택된 서열로부터 전사된 mRNA는 노던 블랏 하이브리드화(Northern blot hybridization), 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포 RNA에 대한 인시튜 하이브리드화, 또는 PCR에 의해 정량화될 수 있다(Sambrook 등의, 1989 문헌; Ausubel 등의 개정된 1987 문헌을 참조한다). 선택된 서열에 의해 암호화된 단백질은 다양한 방법에 의해, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블랏팅, 방사면역검정(radioimmunoassays), 면역 침강(immunoprecipitation), 단백질의 생물학적 활성에 대한 검정, 단백질의 면역 염색에 이어지는 FACS 분석(참조: Sambrook 등의 1989 문헌; Ausubel 등의 개정된 1987 문헌), 또는 균질 시간 분해 형광(homogeneous time-resolved fluorescence; HTRF) 검정에 의해 정량화될 수 있다. 일 구현예에서, CTP-변형 인자 VIIa의 정량화는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, RP-HPLC는 C-18 컬럼을 포함한다. 또 다른 구현예에서, RP-HPLC는 C-8 컬럼을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 수확물 중에서 CTP-변형 인자 VII를 정량화하기 위해 RP-HPLC를 사용한다(실시예 3의 단계 2 내지 5 참조). 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 정제 중에 CTP-변형 인자 VII를 정량화하기 위해 RP-HPLC를 사용한다.
또 다른 구현예에서, 세포은행, 또는 본원에 개시된 냉동된 스탁(frozen stock)은 90%를 초과하여 해동될 때 생존력을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 보관은 무기한의 시간 동안이다.
또 다른 구현예에서, 보관은 2주 동안이다. 또 다른 구현예에서, 보관은 3주 동안이다. 또 다른 구현예에서, 보관은 1개월 동안이다. 또 다른 구현예에서, 보관은 2개월 동안이다. 또 다른 구현예에서, 보관은 3개월 동안이다. 또 다른 구현예에서, 보관은 5개월 동안이다. 또 다른 구현예에서, 보관은 6개월 동안이다. 또 다른 구현예에서, 보관은 9개월 동안이다. 또 다른 구현예에서, 보관은 1년 동안이다.
또 다른 구현예에서, 세포은행, 또는 본원에 개시된 냉동된 스탁은, 본원에 개시된 정의된 배지에서 세포 배양물을 성장시키는 단계, 글리세롤을 포함하는 용액 중에서 배양물을 냉동시키는 단계, 및 세포 클론을 -20℃ 미만에서 세포 클론을 저장하는 단계를 포함하는 방법에 의해 저온 보존된다. 또 다른 구현예에서, 온도는 약 -70℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 약 -70~-80℃이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 정의된 배지가 이러한 방법에 사용될 수 있다. 각각의 정의된 배지는 본원에 개시된 별도의 구현예를 나타낸다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에 대한 또 다른 구현예에서, 배양물은 세포은행으로부터 접종된다. 또 다른 구현예에서, 배양물은 냉동 스탁으로부터 접종된다. 또 다른 구현예에서, 배양물은 시작 배양물로부터 접종된다. 또 다른 구현예에서, 배양물은 콜로니로부터 접종된다. 또 다른 구현예에서, 배양물은 중간-로그 성장상(mid-log growth phase)에서 접종된다. 또 다른 구현예에서, 배양물은 대략 중간-로그 성장상에서 접종된다. 또 다른 구현예에서, 배양물은 또 다른 성장상에서 접종된다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에 대한 또 다른 구현예에서, 냉동에 사용된 용액은 DMSO를 2~20%의 양으로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 양은 2%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 20%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 1%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 1.5%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 3%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 4%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 5%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 2%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 2%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 7%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 7.5%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 9%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 10%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 12%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 14%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 16%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 18%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 22%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 25%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 30%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 35%이다. 또 다른 구현예에서, 양은 40%이다.
또 다른 구현예에서, 첨가물은 자당(sucrose)이다. 또 다른 구현예에서, 첨가물은 임의의 다른 총괄적(colligative) 첨가물이거나, 결빙 방지 특성(anti-freeze properties)을 갖는 당업계에 알려진 첨가물이다. 각각의 가능성은 본원에 개시된 별도의 구현예를 나타낸다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용된 냉동 용액(freezing solution)은 컨디셔닝된 배지 및 DMSO를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용된 냉동 용액은 46.255%의 컨디셔닝된 배지 및 7.5%의 DMSO를 포함한다.
일 구현예에서, 세포 배양물은 당업계의 통상적인 기술에 의해 성장된다. 또 다른 구현예에서, 세포 배양물이 성장하는 동안 일정한 pH가 유지된다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 7.0로 유지된다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 6이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 6.5이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 7.5이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 8이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 6.5~7.5이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 6~8이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 6~7이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 7~8이다.
또 다른 구현예에서, 배양물이 성장하는 동안 일정한 온도가 유지된다. 또 다른 구현예에서, 온도는 약 37℃로 유지된다. 또 다른 구현예에서, 온도는 37℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 25℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 27℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 28℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 30℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 32℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 34℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 35℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 36℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 38℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 39℃이다.
또 다른 구현예에서, 배양물이 성장하는 동안 일정한 용존 산소 농도가 유지된다. 또 다른 구현예에서, 용존 산소 농도는 포화 농도의 20%로 유지된다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 15%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 16%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 18%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 22%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 25%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 30%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 35%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 40%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 45%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 50%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 55%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 60%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 65%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 70%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 75%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 80%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 85%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 90%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 95%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 100%이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 포화 농도의 약 100%이다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에 대한 또 다른 구현예에서, 배양물은 용기당 2 리터(L)의 최대 부피를 갖는 배지에서 성장된다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 200 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 300 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 500 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 750 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 1 L의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 1.5 L의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 2.5 L의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 3 L의 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 5 L의 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 적어도 5 L의 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 적어도 10 L의 부피를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 2 L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 500 ml의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 750 ml의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 1 L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 1.5 L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 2.5 L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 3 L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 4 L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 5 L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 6 L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 8 L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 배지는 용기당 10 L의 최소 부피를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 상기 냉동시키는 단계는 배양물의 밀도가 1 x 106 생존 세포(VC)/ml일 때 수행된다. 또 다른 구현예에서, 생존량(biomass)은 1.5 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 1.5 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 2 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 3 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 4 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 5 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 7 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 9 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 10 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 12 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 15 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 20 x 107 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 25 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 30 x 107 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 33 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 40 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 50 x 106 VC/ml이다. 또 다른 구현예에서, 생존량은 50 x 106 VC/ml보다 더 많다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에 대한 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 액체 질소 중에서 급속 냉동된 다음, 최종 냉동 온도에서 보관된다. 또 다른 구현예에서, 배양물은 보다 점진적인 방식으로, 예를 들어, 최종 저장 온도에서 배양액 바이알에 넣음으로써 냉동된다. 또 다른 구현예에서, 배양물은 세포 배양물을 냉동시키기 위한, 당업계에 알려진 임의의 다른 방법에 의해 냉동된다.
당업자는, 용어 "세포 배양(cell culture)" 및 "조직 배양(tissue culture)"이 상호 교환 가능하게 사용될 수 있으며, 액체 배지 또는 액체 배지가 구비된 표면(예: 유리, 플라스틱 또는 한천) 상의 현탁 배양액 중에서, 또는 시험관내에서 세포를 유지시키는 것을 지칭함을 이해할 것이다. 일반적으로, "세포 배양"은 일정한 적정 pH를 유지하기 위해 완충된 배지를 필요로 한다. 세포 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 필요한 영양소의 적절한 공급을 포함하도록 제형화되고, 유지되는 특정 세포에 맞게 삼투압 조절될 수 있으며, 온도 및 기상 또한 절절한 한계 내에서 조절된다. 세포 배양 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Morgan 등의, 1993 Animal Cell Culture, BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK; 및 Adams, R. L. P. 1990 Cell Culture for Biochemists, Second Edition, Elsevier를 참조한다.
당업자는, 용어 "계대(passage)"가 세포 개체군을 계대 배양(subculturing)하는 활동을 행위를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는, 용어 "계대 배양(subculture)"이, 일 구현예에서는 새로운 멸균 배지인, 멸균 배지를 이전 배양물로부터의 샘플로 접종함으로써 이뤄지는 세포 배양을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
당업자는 또한, 용어 "세포 균주(cell strain)"가 계대 배양 기술을 사용해 1차 배양물로부터 유래된 세포의 개체군을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 1차 배양물은 2개 이상의 새로운 배양물로 계대 배양될 수 있고, 세포 균주를 유지하기 위해 계대 배양은 수 개월 동안 주기적인 간격으로 반복된다. 계대 배양은 기존의 세포 배양 기술을 사용해 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 계대 배양된 세포 균주 및 불멸화된 세포주는 케라틴, 호르몬 수용체 및 성장 인자 수용체 등과 같은 특정 기능적 마커의 발현을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 배양은 성장 인자가 첨가된 정의된 무혈청 배지에서 수행될 수 있다. 다른 양태에서, 배지는 첨가된 성장 인자가 있거나 없는 혈청을 함유한다. 이러한 변형은 세포 증식을 최적화하기 위해 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
당업자는, 용어 "세포주(cell line)"가 시험관내에서 무한 증식의 가능성을 갖는 것을 특징으로 하는 단일 외식편으로부터 유래된 세포 개체군을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 세포주는 배양물 내에서 생존하고 지속적으로 성장할 수 있는 그의 능력에 기초하여 1차 배양물로부터 단리될 수 있다. 모든 신생 세포 개체군이 시험관내에서 무기한 성장할 능력을 가진 것은 아니지만, 원래 종양 조직으로부터 유래된 세포주는 생체내에서 형질 전환되었을 수 있다. 또한, 세포주는 일반적으로 여러 차례의 분열을 통해 그들의 차별화된 특성을 유지한다.
일반적으로, 적합한 세포 배양 기질은 멸균시킬 수 있지만, 독성 인자를 침출시키지 않고, 현미경 영상을 왜곡시키지 않는 용기이다. 따라서, 유리 및 플라스틱으로 형성된 플레이트가 본원에서의 적합한 기질이다. 플라스틱 용기는 당업계에 세포의 부착을 촉진시키도록 알려진 기술을 사용해 더 처리될 수 있다(Ramsey 등의 1984 In vitro 20:802). 적합한 조직 배양 배지는 무기염, 아미노산, 비타민 및 다양한 보충제와 결합된 에너지 공급원을 제공하는 등장성의 완충된 기저 영양 배지로 일반적으로 구성된다. 보충제는 오염을 막거나 선택적 조건, 부착 인자 및 성장 인자 등을 제공하기 위한 혈청(예: 우태혈청 등), 다양한 항생물질을 포함할 수 있다. 최소 필수 배지(minimal essential medium; MEM), 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Rosewell Park Memorial Institute; RPMI) 1640 또는 둘베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)와 같은 다수의 배지 제제가 당업계에 알려져 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 적합한 조직 배양 조건도 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Morgan 등의, 1993 Animal Cell Culture, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford, UK, 및 Adams, R. L. P. 1990 Cell Culture for Biochemists, Second Edition, Elsevier를 참조한다. 본원에 개시된 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VIIa의 제조 방법은 무혈청 방법이다. 본원에 개시된 또 다른 구현예에서, CTP-변형 인자 VIIa의 제조 방법은 동물 유래가 없는 방법이다.
본원에 기술된 방법 및 조성물의 또 다른 구현예에서, 배양물의 보관 온도는 -20 내지 -80℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -20℃보다 상당히 낮다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -70℃보다 높지 않다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -70℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 약 -70℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -20℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 약 -20℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -30℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -40℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -50℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -60℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -80℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -30 내지 -70℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -40 내지 -70℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -50 내지 -70℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -60 내지 -70℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -30 내지 -80℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -40 내지 -80℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -50 내지 -80℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -60 내지 -80℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -70 내지 -80℃이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -70℃보다 낮다. 또 다른 구현예에서, 온도는 -80℃보다 낮다.
또 다른 구현예에서, 동결 보존을 위해, 세포는 동결보호제가 포함된 배지에서 -70℃보다 낮은 온도에 도달할 때까지 천천히 동결되고, 그런 다음, -130℃보다 낮은 온도에서 이들을 유지하기 위해 바이알이 액체 질소 냉동고로 옮겨진다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 또 다른 구현예에서, 동결 보존 또는 동결 보관은 최대 24시간 동안이다. 또 다른 구현예에서, 동결 보존 또는 동결 보관은 최대 2일 동안, 최대 3일 동안, 최대 4일 동안, 최대 1주일 동안, 최대 2주일 동안, 최대 3주일 동안, 최대 1개월 동안, 최대 2개월 동안, 최대 3개월 동안, 최대 5개월 동안, 최대 6개월 동안, 최대 9개월 동안, 또는 최대 1년 동안이다. 상기 나열된 각각의 가능성이 본원에 개시된 구현예이다.
또 다른 구현예에서, 동결 보존 또는 동결 보관은 최소 1주일 동안, 최소 2주일 동안, 최소 3주일 동안, 최소 1개월 동안, 최소 2개월 동안, 최소 3개월 동안, 최소 5개월 동안, 최소 6개월 동안, 최소 9개월 동안, 최소 1년 동안, 최소 1.5년 동안, 최소 2년 동안, 최소 3년 동안, 최소 3년 동안, 최소 5년 동안, 최소 7년 동안, 최소 10년 동안, 또는 10년을 초과하는 동안이다. 상기 나열된 각각의 가능성이 본원에 개시된 구현예이다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 또 다른 구현예에서, 세포는 연장된 동결 보존 또는 동결 보관 기간에 이어서 해동된 후에 성장을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 세포는 세포은행 또는 시작 배양물 유래의 세포를 새로운 배지에 접종한 지 약 15~22시간 후에 성장을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 세포는 세포은행 또는 시작 배양물 유래의 세포를 새로운 배지에 접종한 지 약 12~20시간 후에 성장을 나타낸다. 일 구현예에서, 생존력, 유전적 안정성, 및 표현형 안정성을 보장하기 위해서는, 세포주를 (정상적인 계대 배양을 통해) 기하급수적인 성장상에 유지시켜야 한다.
동결 보존 또는 동결 보관의 "연장된 기간(extended period)"은, 또 다른 구현예에서는 1개월이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 2개월이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 3개월이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 5개월이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 6개월이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 9개월이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 1년이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 1.5년이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 2년이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 2~7년이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 적어도 7년이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 적어도 10년이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 세포는 동결 보존에 이어지는 해동 후에 90%가 넘는 생존력을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 동결 보존의 기간에 이어지는 해동시의 생존력은 100%에 가깝다. 또 다른 구현예에서, 해동시의 생존력은 90%에 가깝다. 또 다른 구현예에서, 해동시의 생존력은 적어도 90%이다. 또 다른 구현예에서, 해동시의 생존력은 80%보다 높다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 백신 투여량의 세포은행, 냉동 스탁, 또는 배치(batch)는 정의된 세포 배양 배지에서 성장된다. 이러한 배지는 당업계에 알려져 있으며, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (ATCC® 번호 30-2002), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (ATCC® 번호 30-2005), Hybri-Care Medium (ATCC® 번호 46-X), McCoy's 5A 및 RPMI-1640 (ATCC® 번호 30-2007), Ham's Nutrient Mixtures (ATCC® CCL-61™), PowerCHO™ Chemically Defined, Serum-free CHO Medium (Lonza 카달로그 번호 12-771Q); 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 배지를 포함할 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 당업자에 의해 경험적으로 결정되는 바와 같이, 이들 배지는 항생제 또는 동물 혈청에서 보충될 수 있다.
일 구현예에서, 대규모 부피로 포유류 세포의 배양을 가능하게 하는 생물 반응기 및 방법이 본원에 개시된다. 또한, 또 다른 구현예에서, 상기 생물 반응기 및 방법은 마치 대규로 부피로 성장된 것처럼 최적의 조건 하에 포유류 세포의 배양을 가능하게 함으로써, 방법의 성능 및 산물의 품질을 생물 반응기의 크기와 무관하게 할 수 있다. 생물 반응기 내에서의 인큐베이션 기간은 규모와 생물 반응기 시스템을 변경하는 것만으로 달라질 수 있는데, 예를 들어 기간은 8 내지 9일이거나, 15 내지 16일일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기에서 인큐베이션의 지속 기간은 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 또는 약 20일 이상이다. 또 다른 구현예에서, 관류 생물 반응기가 사용되는 경우, 인큐베이션의 지속 기간은 최대 7 내지 120일일 수 있다.
또 다른 구현예에서, pH, 용존 산소 농도(DOT), 및 온도와 같은 공정 파라미터와 관련하여 균질한 환경에서 포유류 세포의 배양을 가능하게 하여, 잘 혼합된 세포 현탁액을 유지하고, 생물 반응기 내에서 영양 공급물을 블렌딩할 수 있는 대규모 생물 반응기가 본원에 개시된다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기는 일회용 생물 반응기이다.
본원에 개시된 방법은 청구범위에 따른 진핵생물 세포, 특히 포유류 세포의 배양을 위한 생물 반응기, 생물 반응기 시스템 및 방법을 제공함으로써 본원에 개시된 방법의 근본적인 기술 문제를 해결한다.
일 구현예에서, 생물 반응기는 적어도 250 리터(L)의 체적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기는 적어도 500 L의 체적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기는 적어도 1000 L, 적어도 2000 L, 적어도 5,000 L, 적어도 10,000 L, 적어도 12,000 L, 또는 적어도 15,000 L의 체적을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 세포는 생물 반응기의 체적을 증가시켜가면서 계대배양된다 (실시예 참조).
당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이, 본 개시의 변형된 펩티드 및 단백질은 원하는 용도에 따라 표지, 약물, 표적 제제, 담체, 고형 지지체 등에 결합될 수 있다. 변형된 생물학적 제제의 표지된 형태는 이들의 대사 경로(metabolic fate)를 추적하는 데 사용될 수 있고; 이러한 목적에 적합한 표지는, 특히, 요오드 131, 테크네튬 99, 인듐 111 등과 같은 방사성 동위원소 표지를 포함한다. 표지는 검정 시스템에서 변형된 단백질 또는 펩티드의 검출을 매개하는 데 사용될 수도 있는데; 이 경우에는, 방사성 동위원소뿐만아니라 효소 표지, 형광 표지, 발색 표지 등도 사용될 수 있다. 펩티드 또는 단백질 자체가 항체나 수용체 리간드와 같은 표적화 제제인 경우 이러한 표지를 사용하는 것이 특히 도움이 된다.
본 개시의 변형된 펩티드 및 단백질을 고형 지지체에 결합시키기 위해 유사한 결합 기술을 다른 기술과 함께 사용할 수 있다. 결합된 경우, 이들 변형된 펩티드 및 단백질은 특이적 반응이 나타나는 원하는 성분의 분리를 위한 친화도 시약으로서 사용될 수 있다.
최종적으로, 본 개시의 변형된 펩티드 및 단백질은 이들 새로운 화합물과 특이적으로 면역 반응을 보이는 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이들 항체는, 변형되지 않은 펩티드 또는 단백질의 근본적인 생물학적 활성에 따라 다양한 진단 및 치료적 용도에 유용하다. 본 개시가 본원에 기술된 바와 같은 FVII 또는 FVIIa와 면역 반응성인 항체를 제공한다는 것을 이해할 것이다. 일 구현예에서, 이러한 항체는 투여된 CTP-변형 응고 인자를 내인성 응고 인자와 구별하거나 동정하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체는 투여된 CTP-변형 응고 인자를 국소화시키도록 사용될 수 있다.
본원에 개시된 추가의 목적, 이점, 및 신규한 특징은 다음의 실시예를 검토함으로써 당업자에게 명백해질 것이며, 이들 실시예는 제한하고자 하는 의도는 아니다. 또한, 전술한 바와 같이 및 아래의 청구범위에서 청구된 바와 같은, 본원에 개시된 다양한 구현예 및 양태 각각은 다음의 실시예에 의해 실험적으로 뒷받침된다.
실시예
일반적으로, 본원에서 사용된 명명법 및 본 발명에서 이용되는 실험 과정에는 분자 기술, 생화학 기술, 미생물학 기술 및 재조합 DNA 기술이 포함한다. 이러한 기술은 참고 문헌에 상술되어 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 등 (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson 등, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren 등 (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 제시된 방법론; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites 등 (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8판), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell 및 Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)를 참조하고; 이용 가능한 면역 검정법은 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 기술되어 있는데, 이는 예를 들어, 미국 특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 제4,098,876호; 제4,879,219호; 제5,011,771호 및 제5,281,521호; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., 및 Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., 및 Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) 및 "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak 등의, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)를 참조하며, 이들 모두는 참조로서 통합된다. 기타 일반적인 참조는 본 문서 전반에 걸쳐 제공된다.
실시예 1
FVIII -결핍 혈우병 마우스에서 FVII - CTP 3 의 타당성 조사
상업적인 FVII에 대한 FVII-CTP, FVII-CTP2 및 FVII-CTP3의 수확물 PK 프로파일 및 응고 활성을 시험하는 연구를 수행하였다. FVII-CTP 및 FVII-CTP2 수확물 또는 rhFVII에 대해, FVII-CTP3은 그의 응고 활성을 유지하면서 개선된 PK 프로파일을 나타냈다. FVII-CTP3의 시험관내 및 체내 특성을 더 특징화하기 위해, 단백질을 발현하여 분비하는 작고 안정한 풀을 생성하고, 정제 및 활성화 단계를 진행하였다.
현 연구에서, FVIIa-CTP3의 약물동력학 및 약물동태학적 특성을 FVIII-결핍 마우스에서 시험하였다. 단백질의 PK 프로파일을 평가하였다. FVIIa의 고유 활성도-기반의 PK 프로파일을 수립하고 시판 제품 NovoSeven®과 비교하였다. 또한, 미 정맥 가로 절단(생존 연구) 후, FVIII-결핍 마우스에서 응고를 유도하는 FVIIa-CTP3의 지속성 체내 지혈 능력을 시험하였다.
연구 목적:
FVIII-결핍 마우스에서, IV를 유사한 활성의 투여량으로 1회 투여한 후, 상업적인 rhFVIIa (NovoSeven®)에 대한 FVIIa-CTP3의 약물동태학 및 약물동력학적 파라미터를 평가하기 위함.
FVIIa-CTP3 및 NovoSeven®의 IV를 유사한 활성의 투여량으로 1회 투여하고, 이어서 미 정맥 가로 절단(생존 연구)를 시행하여 FVIII-결핍 마우스에서 항상성을 유지하는 FVIIa-CTP3의 체내 능력을 판단하기 위함.
FVII-CTP 3 수확물의 생산:
pCI-DHFR 벡터를 사용해 Dg44 세포에서 FVII-CTP3을 실내에서 발현시켰다(도 1). 25 ng/L의 비타민 K3(Sigma)의 존재 하에 쉐이크 플라스크에서 안정한 형질 감염된 풀 #71을 성장시켰다. 세포 현탁액을 배양하고, 생존율이 60~80%로 감소한 뒤 수확하였다. 수확물을 여과하고 -70℃에서 동결시켰다.
수확물 FVII 항원 수준의 결정:
FVII 항원 수준은 인간 FVII ELISA 키트(Zymotest HyPhen)를 사용해 결정하였다 (표 1). 항원 수준은 각각의 수집된 수확물 배치마다 계산하였다.
[ 표 1 : FVII - CTP 3 항원 수준]
FVII-CTP 3 정제 단계 (도 2a~2b)
단계 개요
짧은 정제 연구에 이어서, 2개의 컬럼을 사용하는 다음의 정제 단계를 수행하였다. VII-선택 친화도 컬럼(GE) 및 세라믹 히드록시아파타이트 1형(HA), 40 μm (Bio Rad), FVII-CTP3 γ-카르복실화 농축 단백질을 정제하였다. 정제된 FVII-CTP3을 CaCl2의 존재 하에 2~8℃에서 밤새 인큐베이션하여 자가-활성화를 유도하였다. 정제 단계는 그의 최종 발달기에 있고 최적화되고 있으므로, 비록 정제 단계의 대부분이 유사하더라도, 정제 단계의 일부는 2개의 배치(batch)에서 동일하지 않다.
10kDa 중공 섬유 또는 펠리콘 카세트를 사용하는 한외 여과/투석 여과(UFDF)
정화된 수확물을 주말 동안(2~3일) 4℃에서 해동시켰다.
배치 31에서, 정화된 수확물(12 리터)을 10 KDa 분자량 컷오프가 구비된 중공 섬유 카트리지(GE Healthcare 카달로그 # UFP-10-C-4X2MA)를 사용해 (연속 2회 작동시켜) 4배로 농축시켰다. 농축된 수확물을 1~2부피의 TBS(50mM 트리스, 150mM NaCl, pH 7.4)에 대해 투석 여과시켰다.
배치 38에서, 정화된 수확물(8.5 리터)를 10 KDa 분자량 컷오프가 구비된 펠리콘 2(Millipore) 카세트를 사용해 4배로 농축시켰다. 농축된 수확물을 VII-선택 컬럼에 직접 로딩하였다.
2 가지 한외 여과 모두를 얼음 상에서 얼음처럼 차가운 완충액을 사용해 수행하였다. 로딩하기 전에, UFDF 샘플을 0.22 μm로 여과시켰다.
FVII-선택 컬럼 상에서의 포획
UFDF 또는 농축된 수확물을 VII-선택 컬럼(XK16/20, CV 18 ml)에 로딩하고, pH 7.4의 TBS로 사전 평형화시켰다. pH 7.5의 50 mM 트리스-HCl, 0.5 M NaCl을 사용해 컬럼을 세척하고, pH 7.5의 50 mM 트리스-HCl, 1 M NaCl 50% (v/v), 프로필렌 글리콜을 사용해 FVII-CTP3을 용리시켰다. 동일한 컬럼을 사용해 연속 2 사이클로 상기 단계를 수행하였다.
세라믹 히드록시아파타이트 컬럼에서의 감마 카르복실화-기반 분리
용리된 산물을 pH 6.8의 10 mM 인산나트륨을 사용해 1:10으로 희석하고, 세라믹 히드록시아파타이트 컬럼(XK16/20, CV 24 ml)에 로딩하였다. pH 6.8의 59 mM 인산나트륨으로 컬럼을 세척하고, 인자 VII의 γ-카르복실화된 풍부한 분획을 pH 6.8의 500 mM 인산나트륨으로 용리시켰다. 본 단계는 동일한 컬럼 상에서 연속 2 사이클로 수행하였다. 각각의 배치에서, 2 사이클의 용출물을 수집하고 1.7~2 mg/ml로 농축하고, pH 8.2의 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl로 투석 여과하여 부피를 줄이고, 활성화 단계를 위한 재료를 준비하였다.
FVII 활성화
정제된 FVII-CTP3을 1 mg/ml까지 희석시키고, 2~8℃의 pH 8.2의 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl 및 1 mM CaCl2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 완충액(UFDF)을 예비 제형 완충액(20 mM 시트르산 완충액, 240 mM NaCl, 13.3 mM 글리신, pH 6.9)로 교환함으로써 활성화를 종료하였다.
FVII-CTP 3 및 FVIIa-CTP 3 의 분석 특성:
SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏
정제된 FVII-CTP3, 및 FVIIa-CTP3을 Precision Plus Dual Color Protein Marker (Bio-Rad)를 사용해 12% 트리스-글리신 젤에 로딩하였다. 쿠마시 브릴리안트 블루 시약으로 젤을 염색하여 SDS-PAGE 쿠마시 분석을 수행하였다(레인당 5 또는 10 μg의 단백질). 항-인간 FVII 다클론 Ab (R&D systems; AF2338), 항-인간 감마 카르복실화 단클론 항체(American Diagnostics 카달로그 #499, 3570), 및 항-CTP 단클론 Ab를 사용해 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다(레인당 1 μg의 단백질). 환원 조건 하에, 75 KDa에서 이동한 FVII-CTP3, 2 개의 주 대역에서 이동한 FVIIa-CTP3; 50 kDa에서의 중쇄, 및 25 kDa에서의 경쇄는 도 3a~3h에서 대역 2 및 3으로 각각 제시되어 있다.
정제 단계는 불순물을 제거하면서 FVII-CTP3 부분을 유의하게 농축시켰다. 정제 단계 수율은 (ELISA에 따르면) 25~30% FVII였다. 정제 도중에 상실된 단백질의 대부분은 FVII 발색 활성이 낮았거나, 없었다. 쿠마시 염색 SDS-PAGE에 따르면, 환원된 FVIIa-CTP3은 예상보다 더 많은 대역을 함유한다. ~75 kDa 근처로 이동하는 대역은 비활성화 FVII를 나타낸다(도 3a~3h, 대역 1). 이러한 대역은 경미한 MW 차이를 갖는 2개의 대역으로 구성되는데, 이는 상이한 γ-카르복실화 함량을 반영하는 것일 수 있다. MW가 20 kDa 미만인 추가 대역을 관찰하였다. 이는 중쇄의 분해 산물인 것으로 이전에 보고되었다.
FVII-CTP 3 발색 활성도:
상업적으로 이용 가능한 발색 활성도 시험 키트인 BIOPHEN(Hyphen BioMed 221304)을 사용해 인간 풀 정상 혈장에 대한 FVII-CTP3 수확물의 시험관내 포텐시, 프로세스 중 분획, 및 정제된 FVII-CTP3의 비교 평가를 수행하였다. FVII-CTP3 수확물과 단백질을 연속 희석하고, 투여-반응 곡선을 정상 인간 혈장의 기준 제제와 비교하여 그 포텐시를 평가하였다. FVII-CTP3 정제에 이어서, 발색 활성도는 유의하게 개선되었으며, 비활성 분획은 주로 HA 컬럼으로 분리시켰다(도 4). FVII 발색 활성도와 웨스턴 블랏에서 단클론 항-Gla 항체를 사용한 FVII의 검출 간에 강한 상관관계가 관찰되었다. 수확물에서 EC50 값에 의해 반영된 바와 같이 FVII 발색 활성도의 포텐시는 카르복실화된 FVII 분획과 카르복실화되지 않은 FVII 분획 모두로부터 영향을 받는다. FVII-CTP3 γ-카르복실화 분회의 정제 및 농축 후에 활성도가 개선됨으로써, FVII 활성도에 γ-카르복실화가 중요한 기여를 한다는 것을 입증하였다(도 4). 이러한 파라미터는 적절한 FVII 채내 활성도에 있어 중요하며, 이는 클론 개발 프로그램에서 추가로 다루게 될 것이다.
A280에 의한 단백질 결정
FVIIa-CTP3 및 NovoSeven®의 이론적인 흡광 계수를 ProtParam 알고리즘(http://web.expasy.org/protparam)을 사용해 계산하였다. 계산은 아미노산 서열에 기초한다. FVII-CTP3 및 NovoSeven®에 대한 계산된 흡광 계수는 각각 1.186 및 1.406이다. 이들 값은 280 nm에서 1 g/L의 흡수에 대한 것이다.
두 단백질 간의 흡광 계수 차이는, NovoSeven®에 비해 FVIIa-CTP3의 분자량이 증가한 것에 기인하는데, 이는 CTP가 방향족 잔기와 시스테인 잔기를 가지지 않으므로 흡광도에 기여하지 않기 때문이다.
A280에 의한 단백질 결정은 최종 FVII에 사용되고, VII-선택 컬럼의 용리로부터 시작하는, 정제된 단계 중 샘플에 사용된다.
FVIIa 항원 수준의 결정
인간 FVIIa ELISA 키트(IMUBIND, American Diagnostica)를 사용해 FVIIa 항원 수준을 결정하였다. 항원 수준은 각각의 배치마다 계산하였다. 그러나, 본 도구는 주사용 투여량을 결정하는 데 유용하지 않았는데, 이는 본 도구가 활성 산물의 양을 나타내지 않았기 때문이다.
FVIIa- Staclot® VIIa-rTF의 응고 검정
FVIIa는 단쇄 FVII의 사슬내 절단으로부터 유래된다. 천연 조직 인자(TF)는 FVIIa의 보조 인자(cofactor)이다. TF에 결합 시, FVII는 인자 X가 Xa로 활성화되는 것을 매개하며, 그 자신은 FVIIa로 형질 전화된다. 가용성 조직 인자는 천연 조직 인자의 세포외 부분이다. 이는 더 이상 자기-활성화에 의해 FVII를 활성화시킬 수 없지만, 조직 인자에 결합된 FVIIa는 FX를 FXa로 활성화시킬 수 있다.
본 검정에 사용된 재조합 가용성 조직 인자(rsTF)는 FVIIa 응고 시험물을 작제하도록 FVIIa 특이성을 이용한다. FVIIa, 칼슘 및 인지질의 존재 하에, rsTF는 FVII를 FVIIa로 활성화시키지 않고 혈장 응고를 유도한다.
본 시스템에서 관찰된 응고 시간은 시험된 샘플 중의 FVIIa 함량에 반비례하며, 샘플 중에 FVII이 존재하는 것을 방해하지 않는다.
검정은 Omri Laboratories (Nes-Ziona, Israel)가 수행하였다. 재구성 후의 NovoSeven® 및 각 연구 이전의 FVIIa-CTP3 모두에 대해 FVIIa 활성도를 평가하였다. NovoSeven® 활성도는 바이알 상에 보고된 예상 활성도와 상관되지 않았지만, 그 차이는 활성도 평가에 대한 상이한 접근 방식으로 인한 것일 수 있다. 표 39는 단백질 농도를 고려하지 않고 부피당 FVIIa 응고 활성을 요약한 것이다.
[표 2] 배치 산물의 FVIIa 응고 활성도
FVIIa-CTP 3 의 고유 활성도
FVIIa의 고유 활성도(단백질 농도로 나눈 활성도/ml로서 계산됨)를 A280에 기초하여 계산하였으며, 이는 표 3에 제시되어 있다. MW가 다른 두 분자의 고유 활성도를 비교할 때, 활성도를 정상화하기 위해서는 보상을 해야 한다(분자량 차이 때문에 NovoSeven® 1 mg 내의 활성 부위의 수는 FVIIa-CTP3에서보다 1.185 배 더 높음). 변환 계수의 계산은 다음 방정식에 제시되어 있다:
[표 3] NovoSeven ®과 비교한 FVIIa - CTP 3 고유 활성도
FVIIa - CTP 3 PK-PD 연구:
연구 개요
C57B FVIII-결핍 마우스에게 체중 1 kg당 6.4E6 U(160,000 U/동물)의 투여량으로 FVIIa-CTP3 및 rhFVIIa (NovoSeven®, NS)를 1회 정맥 주사로 투여하였다. 투여 후 4마리의 마우스로부터 0.166, 0.5, 2, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58, 및 72 시간차에 안구 뒤에서 혈액 샘플을 교대로 채취하였다 (표 4). 샘플링 직후 구연산이 첨가된 혈장(0.32%)을 제조하여 분석 전까지 -20℃에서 보관하였다. FVIIa 응고 활성도 수준을 평가하고, 세부적인 PK 분석을 수행하였다. 연구는 Omri Laboratories (Nes-Ziona, Israel)가 수행하였다.
[표 4 ] 연구 개요
FVIII-결핍 마우스에서의 FVIIa-CTP 3 PK 프로파일
Staclot® VIIa-rTF 키트(Stago, Parsippany, NJ)를 사용해 혈액 샘플 중 FVIIa 활성도를 정량화하였다. 약물동태학적 프로파일을 각각의 단백질에 대해 계산하여, 각각의 시점에서 4마리의 동물의 평균을 나타냈다. 도 5는 실험 전반에 걸친 FVIIa의 PK 프로파일을 나타낸다. FVIIa 회수는 표 6에 제시되어 있다. PK 파라미터의 요약은 표 7에 제시되어 있다.
표 5는 NovoSeven® 또는 FVIIa-CTP3의 투여 후 응고 활성도 값을 요약한 것이다. FVIIa-CTP3 및 NovoSeven®은 투여 후 30분만에 최대 활성도에 도달했다. NovoSeven®의 가장 높은 활성도 값은 FVIIa-CTP3의 최대 활성도 값의 43%에 불과했다. FVIIa-CTP3 응고 활성도는 더 긴 기간동안 유지되어, 활성도의 연장을 입증하였다. NovoSeven®-처리 마우스에 대한 응고 활성도는 12시간 후의 시점들에서는 검출되지 않은 반면, FVII-CTP3 처리된 마우스는 투여 후 48시간이 지난 후에도 측정 가능한 활성도를 지속적으로 보유하였다(표 5 및 도 5).
3개의 연속하는 CTP 카피를 FVIIa에 추가한 결과, 투여 후 최고 활성도로 측정했을 때 및 시험관내 분석에 기초한 예상 활성도와 비교했을 때의 회수율은 100% 증가하였고(표 6), 반감기 및 평균 체류 시간(MRT)은 5배 증가하였다. 노출 시간(AUC)은 3배 증가시켰다(표 7).
[표 5 ] IV의 1회 주사 후 FVIIa의 응고 활성도
[표 6 ] FVIIa - CTP 3 회수
표 7: FVIIa - CTP 3 대 NovoSeven ®의 PK 파라미터
트롬빈 생성 검정 (TGA)
트롬빈의 생성은 응고 단계반응의 근본적인 부분이며, 특정 개체가 트롬빈을 얼마나 잘 생성할 수 있는지에 대한 이러한 추정은 출혈 또는 혈전증(thrombosis)의 위험과 상관될 수 있다. 트롬빈 생성을 분석할 때 흔하게 측정되는 변수에는 지연 시간, 피크 트롬빈 생성까지의 시간, 피크, 내인성 트롬빈 전위[ETP](곡선 및 꼬리 아래 영역), 트롬보그램의 시간 경과("TG")가 포함된다. 지연 시간 이후, 트롬빈의 파열이 관찰된다. 그러나, 모든 트롬빈의 95%보다 더 많은 부분이 아직 형성되지 않은 때인, 지연 시간의 말미에 응고가 발생한다. 트롬빈 생성 검정은, 인간 혈우병 혈장이 보충된 Thrombinoscope 시약을 사용해 Omri Laboratories에서 수행하였다. TGA는 NovoSeven® 및 FVIIa-CTP3의 주입으로 유래된 마우스 혈장에서의 응고 능력을 반영합니다. 도 6a~6c는 FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®의 투여 후 마우스 혈장에 대한 TGA 파라미터 값을 나타낸다. FVIIa-CTP3 투여 후, 모든 3가지 파라미터(트롬빈 생성 속도, 생성된 트롬빈 및 KIIa의 최대량)는 NovoSeven® 치료에 비해 FVII-CTP3가 유리함을 나타낸다. 이는, NovoSeven®과 비교해, FVII-CTP3의 잠재적인 지속적인 우월성에 대한 생각을 더 강하게 만든다.
FVIIa-CTP 3 미 정맥 가로 절단(TVT) 연구:
연구 개요
FVIIa-CTP3에 대한 PK/PD 시험에서 얻은 데이터는 FVIIa-CTP3의 기능성에 대한 깨달음을 제공하였으며, NovoSeven®과 비교해 FVIIa-CTP3이 약물동태학적 장점을 가지고 있음을 입증하였다. 그러나, 외상 사례 후에 생체내에서 응고를 유도하는 단백질의 능력은 아직 입증되지 않았다. FVIIa-CTP3의 지혈 능력을 평가하기 위해, 동일한 FVIII-결핍 마우스 모델을 출혈 실험에 사용하였다.
FVIII-결핍 마우스에게 FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®을 정맥 주사로 1회 투여하였다. FVIIa 응고 활성도 검정에서 평가된 각 약물의 포텐시에 따라 계산된, 동등한 FVIIa 활성도(1.6E05 단위, 200 μl)를 제공하는 양으로 마우스에게 약물을 투여하였다 (표 8). 투여된 투여량은 9 mg/kg의 NovoSeven®, 및 40 mg/kg의 FVII-CTP3이었는데, 이는 FVIIa-CTP3의 활성도 감소 때문이다. 대조군에는 200 μl 비히클을 주사하였다.
투여한지 15분 (주사 1), 24시간 (주사 2) 또는 48시간 (주사 3) 후에 꼬리 선단으로부터 2.7 cm의 미 정맥(tail vein)을 가로 절단하고, 마우스 생존을 24시간 동안 기록하였다.
[표 8 ] 주입된 샘플의 평가
단백질 농도는 A280으로 결정하였다.
결과
3가지 주사(5마리의 동물 x 3회 주사)에 대한 비히클 주입 대조군의 데이터를 요약하여 도 7a~7d에 제시하였다. 미 정맥 가로 절단한지 24시간 후에 생존은 30%로 관찰되었다.
NovoSeven® 및 FVIIa-CTP3-처치 마우스는 FVIIa 투여 후 15분에 수행한 미 정맥 가로 절단 후에 적절한 지혈 활성도를 나타냈다. FVIIa-CTP3 및 NovoSeven® 처리 동물에서는 100%의 생존률이 관찰되었다(도 7a~7d).
PK/PD 연구에서 입증된 FVII-CTP3의 제거 속도의 감소는 투여 후 24시간차에 수행한 미 정맥 가로 절단 이후에 가장 명확하게 평가된다. NovoSeven®의 생존률 감소가 관찰된다. 대조군과 비슷하게, 10시간 이내에 50%의 사망률이 관찰된다. 한편, FVIIa-CTP3 처치 마우스 중 90%는 생존했다(도 7a~7d). 이러한 결과는 FVIIa-CTP3 치료의 지속성 효능을 강조하는 것이다.
투여 48시간 후에, FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®으로 처치한 그룹에서 생존률의 감소가 나타난다 (도 7C). FVIIa-CTP 마우스에서 약간의 개선이 관찰되었지만, 차이는 통계적 유의성에 미치지 못했다.
논의:
재조합 단백질에 대한 CTP 융합은, 비슷한 활성도를 유지하면서 단백질의 순환 반감기를 연장시킨다. 70 KDa의 임계 크기를 초과하는 단백질 제거가 감소된 후의 메커니즘은 신장 제거와 관련하여 잘 이해되며, CTP 융합 이후에는 추가적인 보호가 이루어진다. CTP 융합은 단백질 방패 주위를 스위핑하여 단백질 분해 절단으로부터 단백질을 보호하고, 고도의 음전하로 인해 단백질의 방사상 분자량을 증가시키며, 간청소 수용체에 대한 간의 친화도를 감소시키는 것으로 여겨진다.
본 연구는 FVII에 대한 CTP융합이 단백질 반감기 및 제거에 미치는 영향에 대한 구체적인 통찰력을 제공하고, 이러한 변형에 이어지는 고유 활성도의 패러다임을 다루고자 하는 것이다. FVIII-결핍 마우스에게 FVIIa-CTP3의 IV를 1회 주사로 투여하거나, 상업적인 재조합 FVIIa(NovoSeven®)를 유사한 투여량(단위 기준)으로 투여하고, PK 활성도-기반의 분석을 수행하였다. FVIIa-CTP3은 각각 5배 및 3.5배 증가한 반감기 및 AUC에 의해 반영된 바와 같이 우월한 장기 지속성을 입증하였다. Staclot® 활성도 키트에 의해 계산된 바와 같이, A280에 의해 측정된 단백질 농도로 나눈 FVIIa-CTP의 고유 활성도(U/mg)는 NovoSeven®의 고유 활성도보다 4~5배 더 낮은 것으로 나타났다.
CTP가 FVIIa의 체내 지혈 효과에 미치는 영향을 이해하기 위해, 출혈을 감소시키는 FVIIa-CTP3의 능력을 조사하였다. 혈우병 마우스 모델의 미 정맥 가로 절단 출혈 모델에서, rFVIIa 투여는 실험 동물의 생존률을 높일 수 있고, 출혈로 인한 이들의 사망을 막을 수 있다. 본원에 기술된 연구에서는, FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®을 동물들에게 투여하였다. 투여 후 0.25시간만에 가로 절단이 수행될 때, 두 가지 분자 모두는 항상성을 유지시킬 수 있었다. 투여 후 24시간차에 미 정맥 가로 절단을 수행할 때, FVIIa-CTP3-처리 그룹에서 활성도의 지속시간이 유의하게 연장된 것이 입증되었다. 비히클-처리 그룹의 생존률은 예상보다 높았고, 이전 연구에서 얻은 것보다 높았다(50% 대 이전 연구 20%, 데이터 미도시). 처리된 동물의 생존 백분율은, 투여 후 36시간을 포함하는 조기 시점에서 더 평가된다.
결론적으로, FVIIa-CTP3은 혈우병 생쥐에서 활성도 지속 기간을 증가시키는 것이 입증되었는데, 이는 NovoSeven®과 비교해 지혈 효과가 더 오래 지속되는 것으로 해석된다. 수집한 데이터는, CTP를 FVII에 융합시키는 것이 혈우병 환자에서 예방 치료를 유의하게 개선하는 효능을 갖는 기술임을 시사한다.
실시예 2
상업적 재조합 hFVIIa에 대한 MOD -5014의 생화학적 특성 -
인자 VIIa 활성도에 대한 카르복시 -말단 펩티드( CTP )의 효과
프로젝트의 이론 근거 및 요약
이들 연구는 본원에서 MOD-5000으로 지칭된 상업적인 재조합 hFVIIa에 대해 MOD-5014의 생화학적 특성을 평가하도록 설계되었다.
본 연구는:
· MOD-5014의 합성 기질 절단
· 합성 기질 절단에 의해 측정된 MOD-5014의 조직 인자(TF) 결합
· 인자 X(FX) 활성화에 의해 측정된 MOD-5014의 TF 결합
· TF-결합 MOD-5014에 의한 FX 활성화의 동태학
· FX 활성화에 의해 측정된 MOD-5014의 지질 결합
· 지질-결합 MOD-5014에 의한 인자 활성화의 동태학
· 항-트롬빈(AT)에 의한 MOD-5014의 불활성화
· TFPI에 의한 MOD-5014의 불활성화를 조사하였다.
전반적으로, 데이터는, MOD-5000에 비해 MOD-5014가 유사한 활동 메커니즘을 가지되, 촉매 활성도는 다소 감소함을 시사한다. 이들 결과는, TF-결합 MOD-5014의 활성도가 약간 감소하였고, TF와 독립적으로는 활성도가 약간 더 감소하였음을 입증하였다.
이러한 효과는 주로 반응의 정도보다는 반응 속도에 의해 반영되었으며, 전체 시간 경과를 측정할 수 있는 반응은 완료된다.
AT 억제의 속도가 약간 감소된 것은, 적절한 억제 반응으로 MOD-5014의 신체내 반감기가 연장되었음을 시사한다.
실험 재료
· MOD-5014 GMP-1: 2.5 mg/ml (A280 기준)
· NovoSeven Lot# CU60430: 0.943 mg/ml (A280 기준), MOD-5000로 지칭됨.
MOD-5014의 합성 기질 절단
이론적 근거: 합성 기질의 절단은 전적으로 기능적 활성 부위의 이용 가능성에 달려있다.
방법: MOD-5000 및 MOD-5014를 몰 기준의 동일한 농도로 희석시켰다. 그런 다음, 동일한 농도를 기질 Pefachrome FVIIa (메틸술포닐-D-시클로헥실알라닐-2-아미노부티릴-아르기닌-p-니트로아닐라이드)의 고정 농도에 첨가하고, 황색의 출현으로 기질의 절단을 모니터링하였다.
결과
농도: FVIIa 360 nM; 기질 500 μM
분석: 405 nm에서의 흡수를 알려진 흡광 계수를 사용해 p-니트로아닐린의 농도로 전환시켰다. p-니트로아닐린의 농도를 시간에 대해 플롯팅하여 기질 절단의 속도를 결정하였다.
데이터는 다음에 맞았다:
속도 = k 1 [ VIIa ]
k1= 27.5 mol pNA/분/mol VIIa
결론: 몰 기준으로, MOD-5000 및 MOD-5014는 동일한 기질 절단 속도를 갖는다(도 8). 후속 연구를 위해, 기질 절단 측정치는 희석 및 피펫팅을 위한 대조군으로서 사용된다.
합성 기질 절단에 의해 측정된 MOD-5014의 TF 결합
이론적 근거: 인자 VIIa가 TF에 결합할 때, VIIa에서 구조 변화가 발생하여, 기질 절단의 속도를 증가시킨다. 이는, 증가된 기질 절단이 TF에 대한 인자 VIIa의 결합을 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 의미한다.
방법: 다양한 농도의 MOD-5000 및 MOD-5014를 고정 농도의
TF에 첨가하고, 5분 동안 인큐베이션하였다. 기질(Pefachrome FVIIa)을 첨가하였다. 황색의 출현에 의해 405 nm에서 기질 절단이 모니터링되었다.
결과
농도: FVIIa 0-25 nM; TF 8.7 nM; 기질 500 μM
분석: TF의 농도가 예상 Kd보다 훨씬 높으므로, 저농도에서는 모든 FVIIa가 TF에 결합될 것이다. 기질 절단의 속도는 VIIa/TF 복합체의 속도일 것이다. 일단, FVIIa의 농도가 TF의 농도를 초과하면, 기질 절단의 속도는 유리 FVIIa의 속도까지 떨어질 것이다. FVIIa 및 TF가 1:1 몰 복합체를 형성하므로, 기질 절단 속도의 변화가 일어나는 FVIIa의 농도는 FVIIa의 추정 농도를 확인하는 것이다.
데이터는 다음에 맞았다:
결론: MOD-5000 (Novoseven) 및 MOD-5014는 TF의 예상 농도(8.7 nM)에서 동일한 변곡점을 보여준다(도 9). 이는, 기질 절단에 의해 예측된 바와 같이, MOD-5000 및 MOD-5014의 몰 농도가 정확함을 확인하는 것이다. MOD-5014는 TF에 결합될 때 MOD-5000에 비해 기질 절단 속도가 아주 조금 줄었다(98%) (도 9).
인자 X 활성화에 의해 측정된 MOD-5014의 TF 결합
이론적 근거: FVIIa에 의한 FX의 절단은 FVIIa/TF 복합체에 의한 절단에 비해 그 속도가 느리다. 따라서, TF에 대한 FVIIa의 결합은 FX 활성화 속도를 측정함으로써 평가될 수 있다.
방법: 다양한 농도의 MOD-5000 및 MOD-5014를 고정 농도의 TF에 첨가하고, FX 활성화 속도를 측정하였다. 인자 X 활성화를 합성 기질 Pefachrome FXa(메톡시카르보닐-D-시클로헥실알라닐-글리실-아르기닌 파라니트로아닐라이드)의 절단에 의해 평가하였다. 합성 기질의 절단은 표준 곡선에 의해 FXa 농도로 전환된다. FVIIa 또는 FVIIa/TF 중 어느 것도 인지할 수 있는 속도로 FX 기질을 절단하지 않는다.
결과
농도: FVIIa 0-2 nM; TF 10 pM; FX 135 nM; 기질 500 μM
혈장 중 인자 X의 농도는 8 μg/mL (~ 135 nM)임.
분석: FX 활성화의 속도는 FVIIa가 TF에 결합할 때 증가한다. 일단, 모든 TF가 FVIIa로 포화되면, FX 활성화의 속도는 최대 값에 도달해 있을 것이다(도 10).
데이터는 다음에 맞았다:
결론: TF에 대한 FVIIa의 결합에는, 아주 조금의 부정적인 협력(Hill value<1)이 존재한다. 이는 MOD-5000 및 MOD-5014에 대해 동일하다. TF에 결합할 때, MOD-5014는 MOD-5000에 비해 FX 활성화의 속도가 약간 감소한다 (93%). TF에 대한 MOD-5014의 친화도는 MOD-5000의 친화도와 동등하다(도 10).
FX 농도의 함수로서 FX 활성의 속도
이론적 근거: TF에 결합할 때 MOD-5014 활성화의 속도가 약간 감소한 것은 FXa에 대한 친화도가 감소하였거나, FX가 복합체에 결합할 때 그 회전율이 감소한 결과일 수 있다. FX 농도의 함수로서 FX 활성화의 속도를 측정함으로써 복합체의 동태학적 파라미터를 확립하였다.
방법: 고정 농도의 FVIIa/TF 복합체를 사용해 다양한 농도의 FX를 인큐베이션하였다.
인자 X 활성화는 합성 기질(Pefachrome FXa)의 절단에 의해 평가하였다. 합성 기질의 절단은 표준 곡선에 의해 FXa 농도로 전환된다.
결과
농도: FVIIa 1 nM; TF 5 pM; FX 0-1500 nM; 기질 500 μM
분석: 더 많은 FX가 첨가함으로써, 모든 FVIIa/TF 복합체가 FX에 결합되는 시점까지, FVIIa/TF 복합체 중 더 많은 것들을 FX 결합 상태로 유지시켰다. 그 시점에, 반응은 FX가 활성화된 속도에 의해 제한되었다. 따라서, FX 활성화의 속도는 FX의 농도가 증가하면서 증가했을 것이고, 곡선의 형상은 점근적으로 최대 속도에 접근했을 것이다(도 123).
데이터는 다음에 맞았다:
결론: TF에 결합할 때, MOD-5014는 MOD-5000에 비해 FX 회전율이 약간 감소했다 (92%). MOD-5014/TF 복합체에 대한 FX의 결합은 MOD-5000/TF 복합체에 대한 결합과 동일했다(도 11).
FX 활성화에 의해 측정된 MOD-5014의 지질 결합
이론적 근거: 혈소판 상에서 인자 X의 활성화는 FVIIa의 지혈 효과에 기여하는 것으로 여겨진다. 혈소판 활성도는 저-TF 환경에서, 또는 TF가 없을 때 발생하는 것으로 여겨진다. TF가 없는 인자 X의 활성화는 지질 소포에서 연구될 수 있다.
방법: 지질에 대한 FVIIa에 의한 인자 X 활성화는 효소(FVIIa) 및 단백질 기질(FX) 모두의 결합의 함수이다. 지질 비율은, 고도로 활성화된 혈소판의 조성을 모방하도록 PC:PE:PS = 41:44:14로 설계하였다. 지질을 큰 단일층 소포(200 nm)로서 준비하였다. 소모의 농도를 증가시키면서 FVIIa와 FX에 첨가하였다. 인자 X 활성화는 합성 기질(Pefachrome FXa)의 절단에 의해 평가하였다. 합성 기질의 절단을 표준 곡선에 의해 FXa 농도로 전환시켰다.
결과
농도: FVIIa 20 nM; FX 500 nM; Lipids 0-1000 μM; 기질 500 μM.
분석: FXa 생성 속도를 지질 소포 농도에 대해 플롯팅하였다(도 12a). 예상한대로, FXa 생성은 지질 농도가 증가하면서 증가하였는데, 이는 더 많은 표면적이 반응에 사용될 수 있었기 때문이다. 충분히 높은 지질 농도에서는, FVIIa 및 FX가 상이한 지질 소포로 분리됨에 따라 반응 속도가 감소하였다. 본 시스템에서는 이러한 템플릿 반응이 예상된다. 데이터는 방정식에 맞지 않았으며, 도시된 라인은 단지 시각적인 참조를 위한 것이다. MOD-5000과 MOD-5014 간의 FXa 생성 속도의 차이는 지질에 대한 친화도 차이로 인한 것이 아니었다. 이는, 각각의 최대치에 대해, FXa 생성 속도를 지질 농도에 대해 플롯팅한 도 12b에 도시된다.
결론: TF의 부재 중에 FX 활성화의 속도는 MOD-5014의 경우 MOD-5000 보다 낮다(~60%). 지질에 대한 MOD-5014의 친화도는 MOD-5000의 경우와 동일하다.
지질-결합 MOD-5014에 의한 FX 활성화의 동태학
이론적 근거: MOD-5014의 경우, TF의 부재 중에 FX 활성화의 속도가 MOD-5000에 비해 감소한 것은, FXa에 대한 친화도 감소, 또는 FX가 지질 표면의 효소에 결합될 때 FX의 회전율 감소의 결과일 수 있다.
방법: 고정 농도의 FVIIa 및 지질 소포를 사용해 다양한 농도의 FX를 인큐베이션하였다. 인자 X 활성화는 합성 기질(Pefachrome FXa)의 절단에 의해 평가하였다. 합성 기질의 절단을 표준 곡선에 의해 FXa 농도로 전환시켰다.
결과
농도: FVIIa 20 nM; FX 0-2500 nM; Lipids 100 μM; 기질 500 μM.
분석: 더 많은 FX가 첨가됨에 따라, 지질 표면에 있는 FVIIa의 더 많은 부분이 모든 FVIIa가 FX에 결합되는 지점까지 FX 결합될 것이다. 그 시점에, 반응은 FX가 활성화되는 속도에 의해 제한된다. 따라서, FX 활성화의 속도는 FX의 농도가 증가하면서 증가하게 되고, 곡선의 형상은 점근적으로 최대 속도에 접근하게 된다. 예상한대로, FX에 대한 FVIIa의 친화도는 TF의 부재 중에 감소하고(더 높은 Km), FXa 생성의 속도는 TF의 부재 중에 감소한다(도 13).
데이터는 다음에 맞았다:
결론: TF의 부재 중에 지질 표면에서 FX 활성화의 속도는 MOD-5014의 경우 MOD-5000 보다 낮다(45%). 지질 표면에서 MOD-5014에 대한 FX의 결합은 MOD-5000에 대한 결합과 동일하였다(도 13).
AT에 의한 MOD-5014의 불활성화
이론적 근거: 체내에서 FVIIa 제거의 유의한 부분은 AT로 FVIIa 복합체를 형성하는 것을 통해 일어나는 것으로 여겨진다. 이러한 반응의 속도는 FVIIa가 TF에 결합될 때에만 시험관내에서 측정될 수 있다. 측정 가능한 속도로 진행시키기 위해, 시험관내 반응은, 자연 발생 글리코사미노글리칸의 효과를 모방하는 것으로 여겨지는 고농도의 헤파린을 또한 필요로 한다.
방법: TF로 인자 VIIa를 인큐베이션하여 복합체를 형성시켰다. AT 및 헤파린으로 복합체를 인큐베이션하였다. 헤파린을 중화하기 위해 폴리브렌(헥사디메트린 브로마이드)을 첨가함으로써 일정한 간격으로 반응을 중단시켰다. 합성 기질(Pefachrome FVIIa)을 절단하여 잔여 FVIIa/TF 활성도를 측정하였다. 검정에 사용된 농도에서는, 폴리브렌이 기질 절단을 변경시키지 않았다.
결과
농도: FVIIa 10 nM; TF 11 nM; AT 1 μM; 헤파린 5 U/mL; FVIIa/TF 8.2 nM; 폴리브렌 100 μg/mL; 기질 500 μM.
분석: 기질 절단의 속도로 측정한 FVIIa/TF의 농도를 분단위 시간에 대해 플롯팅하였다(도 14). 예상한대로, AT/헤파린은 FVIIa을 억제하여, FVIIa/TF 활성도를 상실시켰다.
데이터는 다음에 맞았다:
결론: T=0에서의 활성도에 대한 유사값들은, 반응물 중에 동등한 양의 MOD-5000 및 MOD-5014가 존재하였음을 나타낸다. MOD-5014는 MOD-5000보다 약간 더 천천히(62%) 억제되었다 (도 14). 억제가 완료되도록 두 가지 반응 모두를 진행하였다.
TFPI에 의한 MOD-5014의 불활성화
이론적 근거: TFPI는 FVIIa/TF 복합체의 생리적 억제제이다. TFPI의 K2 도메인은 FXa와 초기 복합체를 형성한다. 복합체는 TFPI의 K1 도메인이 FVIIa와 상호 작용하는 FVIIa/TPI에 결합한다. 따라서, FVIIa/TF에 의한 FX 활성화는 복합체의 억제 및 FVIIa-TFPI의 폐쇄를 초래하게 된다.
방법: 인자 VIIa 및 TF를 함께 인큐베이션하여 복합체를 형성하였다. 복합체를 TFPI/FX/FXa 기질에 첨가하였다. 인자 X 활성화는 합성 기질(Pefachrome FXa)의 절단에 의해 평가하였다. 합성 기질의 절단을 표준 곡선에 의해 FXa 농도로 전환시켰다.
결과
농도- 억제: FVIIa 1 nM; TF 20 pM; FX 135 nM; TFPI 0-5 nM; 기질 500 μM.
분석: 예상한대로, 초기 FXa 생성은 모든 반응물에서 동시에 발생하였다(도 15a~c). TFPI의 존재 중에, FXa 생성의 속도는 TFPI/FXa에 의해 FVIIa/TFPI 복합체가 억제됨에 따라 느려졌다 (아래 2개 패널). TFPI 복합체의 폐쇄는 더 높은 TFPI 농도에서 더 신속하게 일어났다(아래 2개 패널). FVIIa/TFPI가 폐쇄되기 전에 형성된 FXa의 양은 FVIIa/TF와 TFPI의 상호 작용의 척도이다. MOD-5014의 FXa 형성 속도가 약간 감소되었으므로, FXa/TFPI 복합체의 형성은 늦어졌고, MOD-5014를 사용한 반응은 MOD-5000을 사용했을 때보다 평탄부에 도달하는데 더 오래 걸렸다.
결론: 위 패널에 도시된 바와 같이, TFPI에 의한 MOD-5014/TF의 억제, FXa의 생성을 위한 농도 의존성은 MOD-5000의 농도 의존성과 매우 유사하다. MOD-5014가 TFPI 억제에 대해 약간 더 민감한 것일 수 있고(124%); 대안적으로, 이는 FXa 생성의 속도를 약간 더 느려진 결과일 수 있다.
실시예 3
CTP-변형 활성화된 인자 VII의 생산
목적
생산 방법의 목적은, 화학적으로 정의된 배지에서 CHO 세포를 사용하는 재조합 DNA 기술에 의한 유가 배양의 상류 단계를 개발하고, 고도의 글리코실화되고 고도로 감마 카르복실화된 MOD-5014를 정제하는 견고하고 확장 가능한 하류 단계를 개발하는 것이었다. 즉, 최고 함량의 감마 카르복실화를 사용해 MOD-5014를 생산 및 정제하고, 공정 및 생산 관련 불순물을 효과적으로 제거하기 위한 것이다. 중요한 것은, O-글리칸, N-글리 칸, 시알산 백분율, 산화 관련 형태, (STA-CLOT 분석에 의해 시험된) 포텐시, Gla 도메인의 백분율 (또는 대안적으로, 카르복실화되지 않은 글루탐산 잔기의 백분율), 및 비활성화된 FVII의 백분율을 분석하는 것이었다.
생산 절차
형질 감염 시 안정한 클론 선별
MOD-5014를 암호화하는 cDNA를 CHO 세포(무단백질 배지에서의 성장 및 현탁액 성장에 적합한 dhfr-음성 CD DG44 세포)에 형질 감염시키고, 희석 단계를 제한함으로써 안정한 클론을 생성시켰다. 최고의 생산 클론을 증폭시키고, 추가 개발을 위해 최종 클론을 선별하였다.
마스터 세포은행 및 제조용 세포은행(MCB; WCB)을 유도하는 과정 전반에 걸쳐 동물 성분이 없는 배지를 사용하였다. 세포 배양 중 희석 단계를 제한함으로써 안정한 클론을 단리시켰다. 선별 제제의 농도를 증가시키면서 최고 생산 클론을 증폭시켰다. 선택된 배지에서의 클론 집단 배가수(PDL), CTP-변형 인자 VII의 생산성 (1일 세포당 피코그램, PCD), 및 최대 배양된 세포 밀도에 기초하여, 최고 생산 클론을 단리하고 이를 사용해 R&D 은행을 제조하고, 이어서 인증된 마스터 세포은행(MCB)과 제조용 세포은행(WCB)을 제조하였다.
상류 단계:
MOD-5014를 발현하는 CHO 세포의 안정한 클론을 마스터 세포은행(MCB)의 단일 바이알로부터 접종하고(도 16의 단계 1), 비타민 K가 보충된, 화학적으로 한정된 무혈청 배지에서 유가 배양(fed-batch) 접근법을 사용해 단계적으로 1000 L 또는 2000 L 생물 반응기로 증식시켰다 (도 16의 단계 2~4).
생산 세포 배양 상청액을 미생물 오염도, 세균내 독소, 생산성 및 외래성 바이러스(adventitious virus)에 대해 검사하였다. 상기 단계는 파종을 위한 50 L 및 200 L 생물 반응기(도 16의 단계 3)와 증량(scaling-up)을 위한 1000 또는 2000 리터 생물 반응기(도 16의 단계 4)를 사용해 수행하였다. 모든 산물의 접촉 표면을 일회용이었으며, 일회용이 아닌 산물 접촉 장비는 산물 전용이었다. 이러한 장비들은 배치 간에 세척하고 살균처리하였다. 배양물을 1000 L 또는 2000 L 생물 반응기에서 접종하기 전에 50 L 및 200 L 생물 반응기에서 증식시켰다. 최종 증량 및 유가 배양 생물 반응기 생산은 2000 L의 일회용 생물 반응기에서 수행하였다. 세포의 제거는 일회용 필터 시스템(Millipore 심도 필터)을 사용해 수행하였다.
세포 증식은 생산용 1000 또는 2000 L의 생물 반응기에서 수행하였다(도 16의 단계 4).
배양물을 생물 반응기에서 약 11일 동안(세포의 생존력에 따라 다름) 37℃, 50% 용존 산소(DO) 및 pH 7.1에서 인큐베이션하였다. 실험 도중, pH를 6.9로 변경하여 수확까지 유지하고, 공급물(Cell Boost 6)을 첨가하고, 비타민 K3을 첨가하였다. 또한, DMSO를 생물 반응기에 첨가하였다. 원하는 농도를 유지하기 위해 포도당 공급 용액을 배양물에 첨가하고, 원하는 배양 농도를 유지하기 위해 1 M 탄산나트륨의 볼루스를 첨가하였다. 미리 정의된 기준을 사용해 수확을 수행하였다. 첫 4일 동안, 세포 수, 생존력, 및 대사 분석을 위해 세포 배양물을 매일 샘플링하였다. 5일차부터, 세포 수, 생존력 및 대사 분석을 위해 1일 2회씩 배양물을 샘플링하고, 9일차부터는 Elisa 또는 HPLC 친화도 방법에 의한 고유 생산성을 위해 동일하게 샘플링하였다.
본원에 제시된 실시예는 유가 배양 모드를 사용하였지만, 당업자는 일반적으로 유사한 성장 및 정제 방법을 사용하여 관류 모드를 개발할 수 있을 것이다. 대안적으로, 당업자는 인큐베이션 기간이 7~120일까지 될 수 있는 관류 방법을 개발할 수 있을 것이다.
세포 수확 및 보관 (도 16의 단계 5)
수확은 일회용 여과 공정 트레인을 사용해 수행하였다. 수확물을 정화하기 위해 심도 여과 및 0.2 μm 여과를 수행하였다. 정화에 이어 0.45/0.2 μm 여과를 수행하였다. 심도 필터를 세척하고, 잔류액은 공기로 시스템 밖으로 불어냈다. 여과 단계는 15 L/분 이하의 펌프 속도 및 최대 규정 압력으로 실행하였다. 그 후, 필터를 트리스-HCl 완충액으로 세척하고 가압 공기로 불어내어 산물 회수율을 증가시켰다.
정화된 수확물을, ELISA 또는 HPLC 친화도 방법, SDS-PAGE, 웨스턴 블랏, HCP ELISA 검정, 잔류 DNA, 체내 바이러스 검정, 바이러스-유사 입자, S+L- 및 마이코플라스마에 의해 미생물 오염도, 세균내 독소, 특정 단백질 함량에 대해 검사하였다.
정제 및 활성화 단계
정제 방식은 도 17에 기술되어 있다. 정제 단계는 4개의 크로마토그래피 컬럼에 기초하였다. 친화도 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 및 음이온-교환 크로마토그래피를 사용해 단백질을 정제하였다. 단백질은 음이온-교환 크로마토그래피 단계에서 활성화시켰다. 정제 단계에는 바이러스-불활성화 및 나노-여과 단계도 포함시켰다.
한외 여과 및 투석 여과 1 - UFDF1 (단계 6)
정화된 수확물을 농축시키고 접선 유동 여과(TFF) 기반의 한외 여과 및 투석 여과(UF/DF) 단계를 사용해 투석 여과시켰다. 카트리지 명목 분자량 컷오프 크기는 30 kDa였다 농축되고 투석 여과된 수확물을 ELISA, HPLC 친화도 방법에 의해 특정 단백질 함량에 대해 검사하였고, 세포내 독성 및 미생물 오염은 SDS-PAGE, 웨스턴 블랏 및/또는 HCP ELISA를 사용해 평가하였다.
접종에 의한 바이러스 불활성화 (단계 7)
0.22 μm 필터를 통해 재료를 멸균 혼합 백 내로 여과시켰다. 그 다음에, 바이러스 성분을 불활성화시키기 위해 용액을 첨가하였는데, 예를 들어, 트리스/10% 트리톤 용액을 최종 여과액에 첨가하여 트리톤 농도를 1%(w/w)로 만들었다. 인큐베이션 후, 친화도 컬럼에 로딩하기 전에, 0.2 μm 필터 단위를 사용해 생성 용액을 다시 여과시켰다. 여과된 바이러스 불활성화 산물을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석을 사용해 세포내 독성 및 미생물 오염에 대해 검사하였다.
친화도 크로마토그래피 (단계 8)
본 단계에 대해서는 친화도 컬럼을 사용하였다. 상기 컬럼을 사전 정의된 상 높이(bed height)까지 채웠다. 본 단계는 생성물의 품질에 따라 2~4 사이클로 수행하였다. 로딩된 산물 중의 특정 단백질은, 검정에서의 트리톤에 의해 야기되는 간섭 때문에 트리톤의 첨가 이전에 결정하였다. 친화도 컬럼을 평형화시키고 바이러스 불활성화된 풀(pool)을 로딩한 후, 세척하였다. 2차 세척을 수행하고, 재료를 용리한 다음, 차일의 처리를 위해 2~8℃에서 보관하였다. 모든 크로마토그래피 단계들은 하향 흐름 방식으로 수행하였다.
용출물을, 280 nm에서의 흡광도, RP-HPLC, AIEX HPLC, SEC-HPLC, HCP ELISA, SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 포함하는 당업계에 알려진 기술을 사용하여 특정 단백질 산물, 세포내 독소, 잔류 DNA, 시알산 함량, 감마카르복실화 백분율, 하전된 N-글리칸, 잔류 침출 친화도 리간드 및 미생물 오염에 대해 검사하였다.
다중 모델 또는 혼합 모드 크로마토그래피 (단계 9)
본 단계에 대해서는, 다중 모델 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 채워진 컬럼을 사용하였다. 상기 컬럼을 사전 정의된 상 높이까지 채웠다. 본 단계는 생성물의 품질에 따라 1~4 사이클로 수행하였다. 컬럼을 평형화시키고, 희석된 친화도 용출물로 로딩하고, 세척하고, 용출물을 수집하여 추가 처리 전까지 2~8℃에서 보관하였다. 용출물을, 280 nm에서의 흡광도, RP-HPLC, AIEX HPLC, SEC-HPLC, HCP ELISA, SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 포함하는 기술을 사용하여 특정 단백질 산물, 세포내 독소, 잔류 DNA, 시알산 함량, 감마카르복실화 백분율, 하전된 N-글리칸, 잔류 침출 친화도 리간드 및 미생물 오염에 대해 검사하였다.
소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) (단계 10)
본 단계에 대해서는 HIC 수지를 사용하였다. 상기 컬럼을 사전 정의된 상 높이까지 채웠다. HIC 크로마토그래피는 생성물의 품질에 따라 1~4 사이클로 수행하였다. HIC 로딩은 다중 모델 또는 혼합 모드 단백질 컬럼 용출물을 황산 암모늄으로 조정하여 준비하였다. 컬럼을 평형화시키고, 조정되고 0.2 μm 필터로 여과된 다중 모델 또는 혼합 모드 컬럼 용출물로 로딩한 다음, 세척하였다. 생성물을 용리한 다음, 추가 처리 전까지 2~8℃에서 보관하였다. 용출물은, 280 nm에서의 흡광도 및 SEC-HPLC에 의해, 특정 단백질 농도에 대해 검사하였다. 또한, 용출물을 세포내 독성 및 미생물 오염에 대해 검사하였다.
HIC 용출물의 한외 여과 및 투석 여과 (단계 11)
HIC 용출물을 농축하고 투석 여과시켜 부피를 줄이고, 음이온 교환 컬럼 단계를 위한 재료를 준비하였다. 일단, pH 및 전도도(conductivity)가 범위 내에 있는 것으로 결정되었으면, 시스템을 배수시키고 0.5/0.2 μm 여과 단계를 사용해 살균 백 내로 여과시켰다. 농축되고 투석 여과된 HIC 용출액의 최종 부피를 추가 처리 전까지 2~8℃에서 보관하였다. 용출물을, 280 nm에서의 흡광도, RP-HPLC, AIEX HPLC, SEC-HPLC, HCP ELISA, SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 포함하는 기술을 사용하여 특정 단백질 산물, 세포내 독소, 잔류 DNA, 시알산 함량, 감마카르복실화 백분율, 하전된 N-글리칸, 잔류 침출 친화도 리간드 및 미생물 오염에 대해 검사하였다.
음이온 교환 크로마토그래피 (단계 12)
본 단계에 대해서는 음이온 교환 수지로 채워진 컬럼을 사용하였다. 상기 컬럼을 사전 정의된 상 높이까지 채웠다. 로딩할 생성물은 농축되고 투석 여과된 HIC 용출물 분획이었다. FVII를 FVIIa로 활성화시키는 것은 음이온 교환 컬럼에서 이루어졌다. 활성화 및 세척 단계에 이어, 추가 처리를 위해 생성물을 용리하고 수집하였다. 필요에 따라 용출물은 pH 조정하였다. 그런 다음, 용출물을 0.45/0.2 μm 필터를 통해 여과시켰다. 재료를 추가 처리 전까지 2~8℃에서 보관하였다. 모든 크로마토그래피 단계들은 하향 흐름 방식으로 수행된다. 용출물을, 280 nm에서의 흡광도, RP-HPLC, AIEX HPLC, SEC-HPLC, HCP ELISA, SDS-PAGE, 및 웨스턴 블랏에 의해 특정 단백질 농도, 잔류 DNA, 및 미생물 오염에 대해 검사하였다.
나노 여과에 의한 바이러스의 제거 (단계 13)
아사히 플라노바 20N 바이러스 필터(Asahi Planova 20N Virus filter)를 사용해 바이러스 제거를 수행하였다. 0.45/0.2 μm 또는 0.1 μm 막의 필터를 나노 필터(Planova 20N filter)의 전단 필터(prefilter)로서 사용하였다. 아사히 플라노바 20N 필터를 사전 평형화시키고, 음이온 교환 용리 완충액 또는 제형 완충액을 사용해 만든 최종 제제로 프라이밍하였다. 음이온 교환 용출물을 필터 트레인을 통해 연속적으로 가압하여 통과시키고, 멸균 생물 처리 백(bioprocess bag)에 수집하였다. 필터 트레인(플라노바 필터)를 음이온 교환 용리 완충액 또는 제형 완충액으로 세척하여 생성물 회수율을 최대화시켰다. 제조자의 권장 절차에 따라 필터의 무결성을 사용 전 및 사용 후에 검사하였다. 사용 전 검사에는, 마찬가지로 제조자의 절차에 따른 금입자 시험이 포함된다. 바이러스 여과물을, 280 nm에서의 흡광도, RP-HPLC, AIEX HPLC, SEC-HPLC, SDS-PAGE에 의해 특정 단백질에 대해 검사하였다. 또한, 바이러스 여과물을 세포내 독성 및 미생물 오염에 대해 검사하였다.
UFDF-3 및 약물(DS)의 여과 및 보관 (단계 14)
벌크 여과 및 충진(Fill)에 대한 준비로, 바이러스 여과물을 표적 DS 농도(2~100 mg/ml로 다양할 수 있음)까지 농축시켰다. 마지막 단계에는 0.2 μm 필터를 통과시키는 멸균 여과에 의한 여과를 포함시켰다. 본 단계에 대해서는 일회용 또는 재사용 카세트를 사용하였고, 컷오프는 3~30KDa였다. 생성물을 1단계에서 5~25 mg/ml 단백질로 농축하고, pH 6.4에서 20 mM 시트르산, 150 mM NaCl, 13.3 mM 글리신, 또는 pH 6.2에서 20 mM 시트르산, 100 mM 아르기닌, 2 % 트레할로오스에서 투석 여과(DF)시켰다 (≥7 DF 부피). UFDF-3 풀을 280 nm에서의 흡광도에 의해 특정 단백질에 대해 검사하였다. 또한, UFDF-3 풀을 세포내 독성 및 미생물 오염에 대해 검사하였다.
최종 생성물 농도를 조정하고, 0.04%의 최종 농도까지 폴리소르베이트-80(PS-80)을 첨가하였다. 대안적으로는, 아무것도 첨가하지 않았다. 조정된 UFDF-3 생성물을 Millipak 100 또는 Millipak 200 필터로 여과시켰다. 여과된 산물 용액을 소 표본화하여 70 ± 5℃의 온도에서 동결시켰다. 제형된 풀을 A280에 의해 생성물 농도에 대해 검사하였다. 제제 완충액은 pH 6.2의 20 mM 시트르산염, 100 mM 아르기닌, 2% 트레할로오스, 0.04% PS80이었다.
결과
사용된 정제 단계에서는, 고도로 글리코실화된 MOD-5014 생성물인, 다중 모델 단계(도 21) 동안에 고도로 감마 카르복실화된 MOD-5014를 포획하고 정제하였다. 또한, 고도로 글리코실화된 MOD-5014의 초기 백분율은 상류 세포 배양 단계로부터 영향을 받으며, 정제 단계 전반에 걸쳐 일정하게 유지된다(도 19). 상기 단계는, 다중 모델 및 HIC 정제 단계(그림 20) 동안에 산화 형태 및 기타 관련 형태와 같은 공정 관련 불순물을 제거할 수 있는 높은 용량을 나타냈고, 그 결과 고품질의 생성물이 생성되었다.
정제된 MOD-5014 생성물의 환원 SDS-PAGE 분석은 도 18에 도시된다. 다음의 단리된 생성물을 동정하였다(우측 넘버링 참조): 75kDa - 비활성화 형태의 MOD-5014 (1); 55kDa - MOD-5014 중쇄-CTP-CTP-CTP (2); 25kDa - MOD-5014 경쇄 (4); 저분자량(LMW) 형태 (3, 5, 및 6).
표 9는 2개의 상이한 생산 대행 기업(CMO)에서의 조작 실험(ER), 및 상이한 GMP 실험(Good Manufacturing Process)에 대한 생산 단계의 결과를 나타낸 것이다. 세부 내역에는 포텐시, 백분율(%) 비활성화된 MOD-5014, 백분율(%) 산화 형태; 카르복실화되지 않은 글루탐산 잔기(도메인 없는 Gla)의 백분율(%), 시알산 함량(mol/mol), 및 O-글리칸 함량(mol/mol)이 포함된다.
[표 9] 정제된 MOD-5014의 품질 특성
또한, CMO-1 결과는 하전된 N-글리칸의 백분율이 85.3(ER) 및 84.2(GMP1)이었음을 보여준다.
결론
결론적으로, MOD-5014의 임상적 개발 및 상업적 제조를 지원하기에 적합한 대규모 유가배양 제조 단계가 개발되었다. 상기 결과는 고도로 글리코실화된 지속성 FVIIa-CTP (MOD-5014)의 생산을 위한 재현 가능한 유가배양 생산 단계로서 본 단계를 지지한다. 정제된 MOD-5014 생성물에는 높은 함량의 O-글리칸 및 시알산이 함유되어 있다. 정제된 생성물에는 최소 수준의 비활성화된 FVII 및 도메인 없는 Gla(카르복실화되지 않은 Glu 잔기)가 함유되어 있다.
실시예 4
약품(Drug Product; DP) 제조
약품(DP)의 제형 단계는 약물(DS)의 해동과 함께 시작된다. 약품은, 제형 완충액을 사용해 약물(DS)을 필요한 농도까지 희석시키거나, 희석없이 충진시키고, 무균 여과시키고, 표준 2R 바이알 또는 기타 1차 포장 용기, 예컨대 카트리지 또는 충진된 주사기 등에 충진시킴으로써 생산된다. 당업자는, 용어 "약물(drug substance; DS)"이 활성 약제학적 성분(API)를 포함하거나 이와 균등할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일 구현예에서, 본원에 제시된 바와 같은 CTP-변형 인자 VII는 벌크 정제된 약물을 포함하는 약물(DS)이다. 당업자는 또한, 용어 "약품(drug product; DP)"이 무균 조건 하에 바이알과 같은 최종 용기에 일단 분배된 최종적으로 제형된 약물을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 일 구현예에서, 본원에 제시된 바와 같은 CTP-변형 인자 VII는 최종적으로 제형된 CTP-변형 인자 VII를 포함하는 약품(DP)이다.
CTP-변형 인자 VII의 특징
수확물 중의 CTP-변형 폴리펩티드 함량 및 고 글리코실화 형태의 백분율은 특정 RP-HPLC 방법에 의해 결정된다. 수확물 중의 총 단백질은 브랫포드 분석(Bradford analysis)에 의해 결정된다. 선별된 클론에 의해 생산된 수확물 중 특정 단백질 백분율은 수확물 중 총 단백질에 대해 70% 초과이다. 또한, 제조 상류 단계는 저 글리코실화 형태와 비교해 고도로 글리코실화된 CTP-변형 단백질의 높은 백분율을 가능하게 하도록 개발된 것이다. 고도로 글리코실화된 형태가 목표 형태인데, 이는 상기 형태가 CTP-변형 폴리펩티드 반감기를 더 길게 연장시키기 때문이다.
O-글리칸 함량
글리코프로파일링(Glycoprofiling)은 글리칸을 방출시키고, 이어서 글리칸을 2-아미노벤자미드(2AB)로 표지하고, 세척한 뒤 NP-HPLC에 의해 분석하여 수행된다. 요약하자면, O-글리칸 함량 검정을 수행하여, CTP-변형 인자 VII의 몰당 O-글리칸 몰의 수를 계산하는 것이다. O-글리칸의 말단 갈락토오스 단위는 β-갈락토시다아제에 의해 단백질로부터 효소적으로 절단된다. 이들 유리 갈락토오스 단위는 CarboPac PA20-컬럼 상에서 분리되고, 펄스 전류계로 검출된다. 갈락토오스(Gal)는 갈락토오스 참조 표준에 대한 외부 교정을 사용해 정량화된다. 갈락토오스의 함량은 O-글리칸 구조물인 Gal-GalNAc의 함량과 직접 연관된다. 약물 및 약품 배치의 분석은 배치들 간의 강력한 일관성을 입증한다. 이러한 예상치 못한 강력한 글리코실화 함량은 유의하며, CTP당 O-글리칸의 수가 당업계에 알려진 것보다 개선됨을 나타낸다.
온전한 분자량 분석 샘플
상이한 DS 배치의 분자량 분석은 O-결합 글리코실화 부위의 수에 대한 정보를 얻는 것을 목표로 수행된다. 온전한 샘플뿐만 아니라 뉴라미니다아제를 사용해 탈시알산화된 샘플, 및 O-글리코시다아제를 사용해 탈-O-글리코실화된 샘플이 온라인 LC/ES-MS에 의해 분석된다. 높은 %의 세린 점유도를 나타내는 이 결과는 당업계에 알려진 수준과 비교해 기대 밖이다(본원에서 제조된 CTP-변형 인자 VII에서는 세린이 6개까지 글리코실화되는데 비해, 4개의 세린만 글리코실화됨)
CTP-변형 단백질 샘플의 O-결합 글리코실화 부위 점유율
4개의 상이한 DS 배치의 O-글리코실화 부위 점유율은 분자당 O-결합 글리코실화 부위의 수에 대한 정보를 얻는 것을 목표로 M-scan에서 분석된다. 뉴라미니다아제를 사용해 샘플을 탈-시알산화한 뒤, 환원된/카르복시메틸화 샘플의 트립신 소화가 이어진다. 최종적으로, 처리된 샘플에 대한 온라인 LC/ES-MS를 수행하고, 지정된 소프트웨어를 사용해 MS 데이터를 해석한다. 트립신 소화 혼합물의 분석으로부터 얻은 데이터의 평가는 단백질 서열의 100%가 맵핑되도록 하는 신호로 이어진다. O-글리코실화는 N-말단 및 C-말단 CTP 영역 모두에서 일어날 수 있다. 점유 부위는 프롤린에 이어서 세린 잔기뿐만 아니라 세린 반복 영역에 있는 4개 중 2개의 세린으로서 식별된다. 18개 까지의 총 세린 잔기는 O-글리칸에 대한 부착 부위의 역할을 한다. 배치들 간의 유의한 차이가 검출되지 않는다.
순도
RP-HPLC는 분자를 이들의 극성에 따라 분리한다. 극성이 더 낮은 용매로부터 극성이 더 높은 용매로의 이동상 구배는 극성이 더 낮은 분자보다 극성이 강한 분자를 먼저 용리시키는 데 사용된다. 관련 형태들은 220 nm에서의 UV 검출을 사용해 천연 단백질로부터 분리된다. 관련 형태와 메인 피크의 상대 피크 면적(면적 %)은 상응하는 피크 면적을 통합함으로써 계산될 수 있다. 약물 및 약품의 메인 피크는 97%를 초과하는 피크 면적으로 구성되는데, 이는 제품이 고도로 정제되었으며 정제 단계가 효과적임을 나타낸다.
크기 배제 HPLC는 크기에 따라 분자를 분리하는 크로마토그래피 기술이다. 선택된 분류 범위 내에서는, 더 큰 분자가 더 작은 분자보다 먼저 용리된다. 분리 메커니즘은 비흡착성이며, 분자들은 등용매 조건 하에 용리된다. SEC는 단량체가 표적 분자의 고 분자량 형태(예: 이량체 및 중합체)로부터 분리되도록 한다. SEC 방법은 약물 및 약물 중 이량체 및 중합체의 함량을 분석하기 위해 개발된 것이다.
RP-HPLC 함량법
본 방법은 중간 샘플의 함량 결정 및 역상 크로마토그래피에 의한 중간 샘플 중 CTP-변형 폴리펩티드의 비글리코실화 백분율(%) 결정에 사용되고 있다. 역상-HPLC는 분자를 이들의 극성에 의해 분리한다. 비교적 비극성인 분자는 하전되는 동안에 컬럼 재료에 결합되며(ligate), 극성 분자는 컬럼과 상호 작용을 하지 않고 용리된다.
결합된 분자는 극성에서 덜 극성인 용액으로의 구배를 이용해 용리된다. 최강 극성의 분자가 가장 먼저 용리되고, 덜 극성인 분자들의 용리가 이어진다. 검출은 214 nm에서의 흡광도를 통해 수행된다.
바이러스 제거
내인성 및 우발적 바이러스로 인한 최종 약품의 오염을 처리하고 경감시키는 제조 단계의 능력은 예비 평가의 대상이었다. GLP-준수 연구는, 제조 단계의 축소된 세그먼트에 스파이크된 3가지 바이러스 모델을 사용하는 조사 제품에 대한 적용 가능한 지침에 따라 수행되어, 스파이크된 바이러스 개체군을 비활성화시키거나 제거하는 이러한 단계의 능력을 정량화하였다. 바이러스의 양이 log10 조정 역가로 표현된 경우, log10 제거 계수는 입력 값에서 출력 값을 단순히 공제하여 결정된다. 제거 계수는 log10 수치로서 추가되어, 평가된 모든 단계에 대한 전체 제거 계수를 도출한다. A-MuLV는 CHO 레트로 바이러스의 존재 가능성을 나타내는 대표적인 바이러스로 간주되는데, 오염성인 A-MuLV 바이러스를 불활성화시키고 제거하기 위해 취한 조치가 적어도 역대수10(antilog10)의 제거 계수(예: 약 22의 log 바이러스 감소계수(LRF))를 달성함으로써, 전체 단계가 바이러스 제거에 탁월한 능력을 가지고 있음을 입증하였다. 외피가 없는 작은 내성 바이러스인 PPV의 경우, 나노 여과 단계에 의해 강력하게 제거된다.
본 개시의 특정 특징이 본원에서 예시되고 기술되었지만, 많은 수정, 치환, 변경, 및 등가물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 개시의 진정한 사상 내에 있는 모든 이러한 수정 및 변경을 포함하도록 의도된 것임을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> OPKO BIOLOGICS LTD. HERSHKOVITZ, Oren MOSCHCOVICH, Laura <120> LONG-ACTING COAGULATION FACTORS AND METHODS OF PRODUCING SAME <130> P-9520-PC9 <150> 62/360,767 <151> 2016-07-11 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1356 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60 tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg 120 cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag 180 gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240 ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300 tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg 360 aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420 cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct 480 ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540 attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600 cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660 gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720 aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780 gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840 aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900 cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca 960 ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020 ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080 tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140 tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacg 1200 ggcatcgtca gctggggcca gggctgcgca accgtgggcc actttggggt gtacaccagg 1260 gtctcccagt acatcgagtg gctgcaaaag ctcatgcgct cagagccacg cccaggagtc 1320 ctcctgcgag ccccatttcc ctgaggatgc ggccgc 1356 <210> 2 <211> 444 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln 1 5 10 15 Gly Cys Leu Ala Ala Val 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cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660 gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720 aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780 gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840 aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900 cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca 960 ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020 ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080 tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140 tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacc 1200 ggcatcgtga gctggggcca gggctgcgcc accgtgggcc acttcggcgt gtacaccagg 1260 gtgtcccagt acatcgagtg gctgcagaaa ctgatgagaa gcgagcccag acccggcgtg 1320 ctgctgagag cccccttccc cagcagcagc tccaaggccc ctccccctag cctgcccagc 1380 cctagcagac tgcctgggcc cagtgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctccagcaag 1440 gccccacccc ctagcctgcc ttctccttct cggctgcctg gccccagcga tactccaatt 1500 ctgccccagt cctccagcag taaggctccc cctccatctc tgccatcccc cagcagactg 1560 ccaggccctt ctgatacacc catcctccca cagtgatgag gatccgcggc cgcttaatta 1620 a 1621 <210> 5 <211> 528 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CTP-Modified Factor VII <400> 5 Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln 1 5 10 15 Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val 20 25 30 Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 35 40 45 Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu 50 55 60 Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly 85 90 95 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 110 Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile 115 120 125 Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr 130 135 140 Gly Thr Lys Arg Ser Cys 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acatctacag tgccagctgg 780 ggccccgagg atgacggcaa gacagtggat gggccagccc gcctcgccga ggaggccttc 840 ttccgtgggg ttagccaggg ccgagggggg ctgggctcca tctttgtctg ggcctcgggg 900 aacgggggcc gggaacatga cagctgcaac tgcgacggct acaccaacag tatctacacg 960 ctgtccatca gcagcgccac gcagtttggc aacgtgccgt ggtacagcga ggcctgctcg 1020 tccacactgg ccacgaccta cagcagtggc aaccagaatg agaagcagat cgtgacgact 1080 gacttgcggc agaagtgcac ggagtctcac acgggcacct cagcctctgc ccccttagca 1140 gccggcatca ttgctctcac cctggaggcc aataagaacc tcacatggcg ggacatgcaa 1200 cacctggtgg tacagacctc gaagccagcc cacctcaatg ccaacgactg ggccaccaat 1260 ggtgtgggcc ggaaagtgag ccactcatat ggctacgggc ttttggacgc aggcgccatg 1320 gtggccctgg cccagaattg gaccacagtg gccccccagc ggaagtgcat catcgacatc 1380 ctcaccgagc ccaaagacat cgggaaacgg ctcgaggtgc ggaagaccgt gaccgcgtgc 1440 ctgggcgagc ccaaccacat cactcggctg gagcacgctc aggcgcggct caccctgtcc 1500 tataatcgcc gtggcgacct ggccatccac ctggtcagcc ccatgggcac ccgctccacc 1560 ctgctggcag ccaggccaca tgactactcc gcagatgggt ttaatgactg ggccttcatg 1620 acaactcatt cctgggatga ggatccctct ggcgagtggg tcctagagat tgaaaacacc 1680 agcgaagcca acaactatgg gacgctgacc aagttcaccc tcgtactcta tggcaccgcc 1740 cctgaggggc tgcccgtacc tccagaaagc agtggctgca agaccctcac gtccagtcag 1800 gcctgtgtgg tgtgcgagga aggcttctcc ctgcaccaga agagctgtgt ccagcactgc 1860 cctccaggct tcgcccccca agtcctcgat acgcactata gcaccgagaa tgacgtggag 1920 accatccggg ccagcgtctg cgccccctgc cacgcctcat gtgccacatg ccaggggccg 1980 gccctgacag actgcctcag ctgccccagc cacgcctcct tggaccctgt ggagcagact 2040 tgctcccggc aaagccagag cagccgagag tccccgccac agcagcagcc acctcggctg 2100 cccccggagg tggaggcggg gcaacggctg cgggcagggc tgctgccctc acacctgcct 2160 gaggtggtgg ccggcctcag ctgcgccttc atcgtgctgg tcttcgtcac tgtcttcctg 2220 gtcctgcagc tgcgctctgg ctttagtttt cggggggtga aggtgtacac catggaccgt 2280 ggcctcatct cctacaaggg gctgccccct gaagcctggc aggaggagtg cccgtctgac 2340 tcagaagagg acgagggccg gggcgagagg accgccttta tcaaagacca gagcgccctc 2400 tgaacgcggc cgc 2413 <210> 11 <211> 793 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Glu Leu Arg Pro Trp Leu Leu Trp Val Val Ala Ala Thr Gly Thr 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Ala Ala Asp Ala Gln Gly Gln Lys Val Phe Thr Asn 20 25 30 Thr Trp Ala Val Arg Ile Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala Asn Ser Val 35 40 45 Ala Arg Lys His Gly Phe Leu Asn Leu Gly Gln Ile Phe Gly Asp Tyr 50 55 60 Tyr His Phe Trp His Arg Gly Val Thr Lys Arg Ser Leu Ser Pro His 65 70 75 80 Arg Pro Arg His Ser Arg Leu Gln Arg Glu Pro Gln Val Gln Trp Leu 85 90 95 Glu Gln Gln Val Ala Lys Arg Arg Thr Lys Arg Asp Val Tyr Gln Glu 100 105 110 Pro Thr Asp Pro Lys Phe Pro Gln Gln Trp Tyr Leu Ser Gly Val Thr 115 120 125 Gln Arg Asp Leu Asn Val Lys Ala Ala Trp Ala Gln Gly Tyr Thr Gly 130 135 140 His Gly Ile Val Val Ser Ile Leu Asp Asp Gly Ile Glu Lys Asn His 145 150 155 160 Pro Asp Leu Ala Gly Asn Tyr Asp Pro Gly Ala Ser Phe Asp Val Asn 165 170 175 Asp Gln Asp Pro Asp Pro Gln Pro Arg Tyr Thr Gln Met Asn Asp Asn 180 185 190 Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Val Ala Ala Val Ala Asn Asn 195 200 205 Gly Val Cys Gly Val Gly Val Ala Tyr Asn Ala Arg Ile Gly Gly Val 210 215 220 Arg Met Leu Asp Gly Glu Val Thr Asp Ala Val Glu Ala Arg Ser Leu 225 230 235 240 Gly Leu Asn Pro Asn His Ile His Ile Tyr Ser Ala Ser Trp Gly Pro 245 250 255 Glu Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Gly Pro Ala Arg Leu Ala Glu Glu 260 265 270 Ala Phe Phe Arg Gly Val Ser Gln Gly Arg Gly Gly Leu Gly Ser Ile 275 280 285 Phe Val Trp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Arg Glu His Asp Ser Cys Asn 290 295 300 Cys Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile Tyr Thr Leu Ser Ile Ser Ser Ala 305 310 315 320 Thr Gln Phe Gly Asn Val Pro Trp Tyr Ser Glu Ala Cys Ser Ser Thr 325 330 335 Leu Ala Thr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Gln Asn Glu Lys Gln Ile Val 340 345 350 Thr Thr Asp Leu Arg Gln Lys Cys Thr Glu Ser His Thr Gly Thr Ser 355 360 365 Ala Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Ile Ile Ala Leu Thr Leu Glu Ala 370 375 380 Asn Lys Asn Leu Thr Trp Arg Asp Met Gln His Leu Val Val Gln Thr 385 390 395 400 Ser Lys Pro Ala His Leu Asn Ala Asn Asp Trp Ala Thr Asn Gly Val 405 410 415 Gly Arg Lys Val Ser His Ser Tyr Gly Tyr Gly Leu Leu Asp Ala Gly 420 425 430 Ala Met Val Ala Leu Ala Gln Asn Trp Thr Thr Val Ala Pro Gln Arg 435 440 445 Lys Cys Ile Ile Asp Ile Leu Thr Glu Pro Lys Asp Ile Gly Lys Arg 450 455 460 Leu Glu Val Arg Lys Thr Val Thr Ala Cys Leu Gly Glu Pro Asn His 465 470 475 480 Ile Thr Arg Leu Glu His Ala Gln Ala Arg Leu Thr Leu Ser Tyr Asn 485 490 495 Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ile His Leu Val Ser Pro Met Gly Thr Arg 500 505 510 Ser Thr Leu Leu Ala Ala Arg Pro His Asp Tyr Ser Ala Asp Gly Phe 515 520 525 Asn Asp Trp Ala Phe Met Thr Thr His Ser Trp Asp Glu Asp Pro Ser 530 535 540 Gly Glu Trp Val Leu Glu Ile Glu Asn Thr Ser Glu Ala Asn Asn Tyr 545 550 555 560 Gly Thr Leu Thr Lys Phe Thr Leu Val Leu Tyr Gly Thr Ala Pro Glu 565 570 575 Gly Leu Pro Val Pro Pro Glu Ser Ser Gly Cys Lys Thr Leu Thr Ser 580 585 590 Ser Gln Ala Cys Val Val Cys Glu Glu Gly Phe Ser Leu His Gln Lys 595 600 605 Ser Cys Val Gln His Cys Pro Pro Gly Phe Ala Pro Gln Val Leu Asp 610 615 620 Thr His Tyr Ser Thr Glu Asn Asp Val Glu Thr Ile Arg Ala Ser Val 625 630 635 640 Cys Ala Pro Cys His Ala Ser Cys Ala Thr Cys Gln Gly Pro Ala Leu 645 650 655 Thr Asp Cys Leu Ser Cys Pro Ser His Ala Ser Leu Asp Pro Val Glu 660 665 670 Gln Thr Cys Ser Arg Gln Ser Gln Ser Ser Arg Glu Ser Pro Pro Gln 675 680 685 Gln Gln Pro Pro Arg Leu Pro Pro Glu Val Glu Ala Gly Gln Arg Leu 690 695 700 Arg Ala Gly Leu Leu Pro Ser His Leu Pro Glu Val Val Ala Gly Leu 705 710 715 720 Ser Cys Ala Phe Ile Val Leu Val Phe Val Thr Val Phe Leu Val Leu 725 730 735 Gln Leu Arg Ser Gly Phe Ser Phe Arg Gly Val Lys Val Tyr Thr Met 740 745 750 Asp Arg Gly Leu Ile Ser Tyr Lys Gly Leu Pro Pro Glu Ala Trp Gln 755 760 765 Glu Glu Cys Pro Ser Asp Ser Glu Glu Asp Glu Gly Arg Gly Glu Arg 770 775 780 Thr Ala Phe Ile Lys Asp Gln Ser Ala 785 790 <210> 12 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu 20 25 30 <210> 13 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 1 5 10 15 Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 20 25 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10

Claims (37)

  1. 인간의 활성화된 인자 VII(FVIIa)의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3개의 카르복시 말단 펩티드(CTP) 분자를 포함하는, 순수하고 활성 형태인 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin) CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드로서, 상기 CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드는:
    a. 적어도 15 mol/mol로 이루어진, 고 시알산 함량;
    b. 적어도 10 mol/mol의 O-글리칸 함량을 포함하는, 고 글리코실화 형태:
    c. 5% 미만의 산화 형태로 이루어진, 상기 CTP-변형 FVIIa의 저 산화 형태;
    d. 적어도 90% Gla 잔기로 이루어진, 고 백분율의 카르복실화 글루탐산(Gla) 잔기;
    e. 적어도 60% 하전된 N-글리칸; 및
    f. 적어도 10,500 U/mg의 포텐시를 포함하며,
    상기 CTP-변형 FVIIa는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열로 이루어진, CTP-변형 FVIIa.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CTP-변형 FVIIa의 아미노산 서열은 서열 번호 7의 시스테인 잔기 135 및 시스테인 잔기 262 사이에서 이황화(S-S) 브리지를 포함하는 이황화-결합 이중 사슬 이종이량체로서 구조적으로 존재하며, 상기 이중 사슬은 서열 번호 7의 아미노산 1~152를 포함하는 경쇄 및 아미노산 153~490을 포함하는 중쇄를 포함하는, CTP-변형 FVIIa.
  3. 제1항에 있어서,
    a. 하전된 N-글리칸의 상기 백분율은 85.3% 및 84.2%로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    b. 상기 포텐시는 15,563 U/mg 16,720 U/mg, 22,478 U/mg 및 23,608 U/mg으로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    c. 상기 CTP-변형 FVIIa는 CTP당 적어도 4개의 O-결합 글리코실화 부위를 가지거나;
    또는 이들의 조합인, CTP-변형 FVIIa.
  4. 제1항에 있어서,
    a. 상기 순수하고 활성인 형태는 상기 활성 CTP-변형 FVIIa의 카르복실화 글루탐산(Gla) 잔기의 고 글리코실화 형태의 적어도 60%를 포함하거나;
    b. 상기 순수하고 활성인 CTP-변형 FVIIa 폴리펩타이드의 순도는 적어도 90%이거나, 또는 97.3%, 97.6%, 97.4% 및 97.0%로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    또는 이들의 조합인, CTP-변형 FVIIa.
  5. 인간의 활성화된 인자 VII(FVIIa)의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3개의 카르복시 말단 펩티드(CTP) 분자를 포함하는, 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin) CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
    I. 상기 CTP-변형 FVII를 암호화하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터로 소정의 수의 세포를 안정적으로 형질 감염시키는 단계로서,
    II. 상기 형질 감염된 세포는 상기 CTP-변형 FVII를 발현하고 분비하는, 단계;
    III. 상기 CTP-변형 FVII를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계;
    IV. 상기 클론을 용액 중에서 미리 결정된 배율로 증식시키는 단계;
    V. 상기 클론이 함유된 상기 용액을 수확하는 단계;
    VI. 상기 클론이 함유된 상기 용액을 여과하여 상기 CTP-변형 FVII를 함유하는 정화된 수확 용액을 수득하는 단계; 및
    VII. 상기 정화된 수확 용액으로부터 CTP-변형 FVII를 정제하고 활성화시켜 원하는 농도의 CTP-변형 FVIIa를 갖는 정제된 단백질 용액을 수득하여 CTP-변형 FVIIa를 제조하는 단계를 포함하되, 상기 제조된 CTP-변형 FVIIa는:
    a. 5% 미만의 산화 형태로 이루어진, 상기 CTP-변형된 FVIIa의 저 산화 형태;
    b. 적어도 90% Gla 잔기로 이루어진, 고 백분율의 카르복실화 글루탐산(Gla) 잔기;
    c. 적어도 60% 하전된 N-글리칸; 및
    d. 적어도 10,500 U/mg의 포텐시를 포함하고,
    상기 제조된 CTP-변형 FVIIa의 아미노산 서열이 서열 번호 7로 이루어진, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드의 순도는 적어도 90%이거나, 또는 97.3%, 97.6%, 97.4% 및 97.0%로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    a. 상기 증식시키는 단계는 상기 CTP-변형 FVII를 최적으로 발현하고 분비하는, 제조용 세포 은행(working cell bank; WCB)으로부터 수득된 클론을 증식시키는 단계를 포함하거나, 상기 증식시키는 단계는 상기 CTP-변형 FVII를 최적으로 발현하고 분비하는, 마스터 세포 은행(master cell bank; MCB)으로부터 수득된 클론을 증식시키는 단계를 포함하거나;
    b. 상기 제조 방법은 동물이 없는 프로세스이거나;
    c. 상기 클론은 적어도 40 mg/L의 수준으로 CTP-변형 FVII를 발현하고 분비하거나;
    d. 상기 클론은 일련의 서브-배양 단계들을 통해 생산 생물 반응기(bioreactor) 수준까지 용액 내에서 증식되거나;
    e. 바이러스 제거는 22의 바이러스 로그 감소 인수(log reduction factor; LRF)를 나타내거나;
    또는 이들의 조합인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 생물 반응기는 일회용 생물 반응기 또는 스테인리스강 생물 반응기를 포함하되, 상기 생물 반응기는 유가배양(fed-batch) 모드 생물 반응기로서 동작하는, 방법.
  9. 제5항에 있어서, 정화된 수확물의 정제는:
    상기 정화된 수확 용액을 친화도 컬럼, 다중 모델 컬럼 또는 혼합 모드 컬럼, 소수성 상호 작용 컬럼, 및 음이온 교환 컬럼을 순차적으로 통과시키는 단계로서, 상기 음이온 교환 용출액은 한외 여과/투석 여과 단계를 거치는, 단계;
    정화된 수확물 또는 임의의 상기 크로마토그래피 컬럼 이후에 수집된 용출물, 또는 이들의 임의의 조합 중에 존재하는 바이러스를 불활성화시키는 단계로서, 바이러스를 불활성화시키는 단계는 상기 바이러스에 독성인 용액 중에서 배양하거나, 나노 여과하거나, 이들의 임의의 조합을 포함하는, 단계를 수행함으로써
    정제된 CTP-변형 FVII에 도달하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 바이러스 제거는 22의 바이러스 로그 감소 인수(log reduction factor; LRF)를 나타내는, 방법.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 제조된 CTP-변형 FVIIa의 글리코실화 패턴은 CTP당 적어도 4개의 O-결합 글리코실화 부위의 글리코실화를 포함하는, 방법.
  12. 제5항에 있어서,
    a. 상기 CTP-변형 FVIIa는 적어도 15 mol/mol로 이루어진 고 시알산 함량을 포함하거나;
    b. 상기 CTP-변형 FVIIa는 적어도 10 mol/mol로 이루어진 O-글리칸 함량을 포함하거나;
    c. 하전된 N-글리칸의 상기 백분율은 85.3% 및 84.2%로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    d. 상기 포텐시는 15,563 U/mg 16,720 U/mg, 22,478 U/mg 및 23,608 U/mg으로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    e. 상기 방법은 글리코실화된 CTP-변형 FVIIa의 적어도 20%의 회수율을 달성하거나;
    f. 상기 CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드의 회수율은 적어도 90% 이거나, 또는 97.3%, 97.6%, 97.4% 및 97.0%로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    또는 이들의 조합인, 방법.
  13. 제5항에 있어서, 상기 CTP-변형 FVIIa의 적어도 60%는 카르복실화 글루탐산(Gla) 잔기의 고 글리코실화 형태를 포함하는, 방법.
  14. 제5항에 있어서, 상기 제조된 CTP-변형 FVIIa의 상기 아미노산 서열은 서열 번호 7의 시스테인 잔기 135 및 시스테인 잔기 262 사이에서 이황화(S-S) 브리지를 포함하는 이황화-결합 이중 사슬 이종이량체로서 구조적으로 존재하며, 상기 이중 사슬은 서열 번호 7의 아미노산 1~152를 포함하는 경쇄 및 아미노산 153~490을 포함하는 중쇄를 포함하는, 방법.
  15. 인간 융모성 성선 자극 호르몬 카르복시 말단 펩티드(CTP)-변형된 인간 활성 인자 VII(FVIIa) 폴리펩티드로서 FVII의 C-말단 단부에 연속으로 부착된 3개의 CTP 분자를 포함하되, 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 CTP-변형 FVIIa 폴리펩티드.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 CTP-변형 FVIIa 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 응고 (coagulation 또는 clotting) 장애 치료용 조성물.
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