KR102606504B1

KR102606504B1 - 니클로사마이드를 포함하는 폐고혈압의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102606504B1
Application number: KR1020210046190A
Authority: KR
Inventors: 이민석; 강복기; 박상한; 김동환
Original assignee: 주식회사 대웅테라퓨틱스
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2023-11-29
Anticipated expiration: 2041-04-09
Also published as: KR20210126515A

Abstract

본 발명은 니클로사마이드(niclosamide) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 지연방출 조성물을 포함하는, 폐고혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

니클로사마이드를 포함하는 폐고혈압의 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING PULMONARY HYPERTENSION COMPRISING NICLOSAMIDE}

폐고혈압은 심장에서 폐로 가는 혈관의 혈압이 상승하는 질환으로서, 국내 폐고혈압 환자가 25만 명에 이르며, 이 중 2∼3%인 4500∼6000명이 폐동맥고혈압 환자로 추산된다.

폐동맥고혈압 환자는 숨가쁨(호흡곤란), 졸도, 현기증, 말초부종(예컨대, 하지부종), 무력감, 식욕감퇴, 심박수 증가, 두통, 전흉부통, 청색증 등의 증상을 보일 수 있다. 아울러 손, 발가락이 추위에 쉽게 차가워지고 파랗게 변색되는 레이노드현상을 수반할 수 있다. 폐동맥고혈압 환자의 경우 처음에는 천식이라든지 과도한 스트레스에 의한 영향이라든지 하는 오진을 받게 되는 경우가 많아 호흡곤란이 발생하고 평균 2.5년 후에야 올바른 진단을 받게 되기도 한다.

폐동맥고혈압은 비교적 발병빈도가 드물고 특별한 치료방법이 없다는 이유로 인하여 오랫동안 임상적 관심의 대상이 되지 못했지만 지난 십여 년간 폐동맥고혈압 분야에 주목할 만한 의학적 발전을 통해 폐동맥 고혈압의 병태생리에 대해 많은 이해를 하게 되었으며, 2019년 국내 폐동맥고혈압 치료제 시장은 307억원 규모로 전년 대비 20% 성장을 하였다.

폐동맥고혈압 약제는 경구제, 흡입제, 주사제 세가지로 나뉜다. 이중 경구용 치료제는 다시 기전에 따라 세가지로 나뉜다. 엔도텔린 수용체(ERA) 길항제 계열로는 트라클리어(보센탄), 옵서미트(마시텐탄), 볼리브리스(암브리센탄)가 있다. 포스포디에스터라제-5 억제제(PDE5i) 계열은 파텐션(실데나필), 시알리스(타다라필) 등이 있다. 마지막으로 프로스타사이클린(prostacyclin) 계열이 있으며 대표적인 약제로 업트라비(셀렉시팍)가 있다.

이러한 치료제가 존재함에도 2008년부터 2016년도의 심평원 폐동맥고혈압 치료 현황에 대한 분석 결과를 보면 국내 3년 생존율이 54%로 미국(2006-2007) 68%에 비해 낮은 것으로 나타나고 있으며, 이에 따라 폐고혈압, 폐동맥고혈압의 치료를 위한 약제의 개발 및 도입이 지속적으로 요구되고 있다.

한국공개특허 제10-2018-0081936호

본 발명의 목적은 니클로사마이드(niclosamide) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 지연방출 조성물을 포함하는, 폐고혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 폐고혈압의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 니클로사마이드(niclosamide) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 지연방출 조성물을 포함하는, 폐고혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, “니클로사마이드(niclosamide)”는 1960년 FDA 승인을 받아 50년 가까이 다양한 기생충 감염 치료에 사용되는 경구형 살리실 아닐리드 유도체이다. 이러한 기존 니클로사마이드 제제는 수용해도 및 장관투과도가 매우 낮아 생체이용율이 극도로 낮음에 따라 체내에서 유효 약리 효과를 나타내기 위한 혈중 약물농도의 달성 및 유지가 불가능하였다. 이러한 물리화학적 특성을 가진 약물의 경우 보통 다양한 가용화 기술을 이용한 생체이용율 증가를 시도하게 되지만, 니클로사마이드는 장내에서 미생물에 의한 환원이 나타나고, 위장관으로 대량의 약물이 분포하므로 경구투여경로로는 약물의 전신노출에 의한 약효를 기대하기 힘들다. 또한, 최근에는 다양한 종류의 암에 대한 항암 요법에 사용될 수 있다는 내용이 보고된 바 있으나, 제형에 따라 폐고혈압에 대해 치료, 개선 효과를 나타낼 수 있음에 대해서는 보고된 바 없으며, 특히 경구 투여시 약물의 청소율(Clearance)이 극도로 빠른 것으로 나타나, 기존 제형으로는 니클로사마이드를 폐고혈압 등 고혈압 치료 용도로의 체내 적용이 불가능한 문제가 있었다.

본 발명의 지연방출 조성물은 상기와 같은 니클로사마이드 기존 제형의 문제점을 해결하고 폐고혈압 치료 또는 개선 효과를 나타낼 수 있는 PK 프로파일 특성을 나타내는 것으로서, 유효 혈중농도가 장시간 유지될 수 있도록 하여 유효한 폐고혈압 치료 또는 개선 효과가 나타날 수 있도록 하였다.

본 발명에서, “폐고혈압(Pulmonary hypertension)”은 호흡곤란의 임상증상과 함께 폐동맥압의 상승 및 우심실 기능부전을 공통적 임상특징으로 가진 여러 질환들을 총칭한다.

상기 폐고혈압은 폐동맥고혈압(pulmonary arterial hypertension), 폐정맥폐쇄병 및 폐모세혈관혈관종(Pulmonary veno-occlusive disease (PVOD) and /or Pulmonary capillary hemangiomatosis (PCH)), 좌심질환에 기인한 폐고혈압(pulmonary hypertension owing to left heart disease), 폐질환이나 저산소증에 기인한 폐고혈압(pulmonary hypertension owing to lung disease and/or hypoxia), 만성적인 폐혈전색전증에 의한 폐고혈압(chronic thromboembolic pulmonary hypertension, CTEPH), 불명확한 여러 기전에 의한 폐고혈압(pulmonary hypertension with unclear multifactorial mechanisms)으로 분류된다.

구체적으로, 본 발명의 폐고혈압은 폐동맥고혈압(pulmonary arterial hypertension, PAH)일 수 있다.

상기 '폐동맥고혈압'은 특발성으로 발생하거나 혹은 만성 폐쇄성 폐질환, 선천성 심장병, 호흡곤란 증후군, 만성 저산소증 등 여러 원인에 의해 이차적으로 발생할 수 있다. 폐동맥 고혈압은 증가된 폐혈관 긴장도(tone), 혈관 반응, 폐 평활근 세포의 증식이 특징적인 병태생리이며,이차적으로 폐혈관 저항을 증가시켜 우심실 비대를 초래한다. 폐동맥 고혈압의 병리학적 소견으로는 혈관 내피세포와 섬유모세포 및 평활근 세포의 비대와 증식으로 인한 혈관 벽의 비후, 세포외 기질의 축적을 들 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 폐동맥고혈압은 특발성 폐동맥고혈압(idiopathic PAH), 유전성 폐동맥고혈압(hereditable PAH), 선천성 심질환과 동반된 폐동맥고혈압(PAH associated with congenital heart diseases), 결체조직질환과 동반된 폐동맥고혈압(PAH associated with connective tissue diseases), 인체면역결핍바이러스에 동반된 폐동맥고혈압(PAH associated with HIV infection), 문맥 고혈압에 동반된 폐동맥고혈압(PAH associated with portal hypertension), 약과 독소에 동반된 폐동맥고혈압(PAH associated with drugs and toxins), 헤모글로빈병과 관련된 폐동맥고혈압(PAH associated with hemoglobinopathies), 폐정맥 혹은 모세혈관이상과 관련된 폐동맥고혈압(PAH associated with pulmonary venous or capillary abnormalities)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 구체적으로, 상기 지연방출 조성물은 니클로사마이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체를 포함하는 것일 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 음이온계 다당류는 카복시 다당류인 것일 수 있으며, 상기 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체는 카복시메틸 셀룰로오스, 카복시에틸 셀룰로스, 카복시메틸 키토산 또는 카복시메틸 덱스트란일 수 있으나, 상기에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로 상기 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체는 카복시메틸 셀룰로오스일 수 있으나, 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체로서 약학 제제의 부형제로 적용되어 본 발명의 효과를 나타낼 수 있는 고분자면 제한없이 적용될 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 조성물은 인산염 및 나트륨염을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 인산염 및 나트륨염은 인산 나트륨 일염기 일수화물로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 구체적으로, 상기 지연방출 조성물은 만니톨을 추가로 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당알코올로서 주사 제형에 적용될 수 있는 부형제이면 필요에 따라 변경하여 적용할 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체를 포함하여 니클로사마이드 지연방출 조성물을 제조하였으며, 상기 제조된 조성물에서 유효한 폐고혈압 증상 중 하나인 폐동맥압의 상승에 대한 치료 효과가 나타남을 확인하였다.

구체적으로, 폐고혈압에서는 폐동맥압이 상승하면서 수축기압 상승, 우심실 비대화, 폐동맥에서의 혈관 폐색, 혈관 근육화가 나타나며, 본 발명 조성물은 이러한 증상들에 대해 유의한 감소 및 개선 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

특히, 양성대조군인 마시텐탄(Macitentan)과 유사하거나 개선된 우심실 수축기압(RSVP) 감소, 우심실 무게 감소, 우심실 비대 억제, 혈관 폐색 감소 및 혈관 근육화 감소 효과를 나타내었으며, 특히 니클로사마이드 비교 제형 대비 현저히 우수한 치료효과를 나타냄을 확인하였는 바, 종래 니클로사마이드 제형 및 경구투여 경로에서는 달성할 수 없었던 혈중 약물농도를 달성 및 유지함으로써 폐고혈압에 대한 예방 및/또는 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

상기 양성대조군으로서 투여된 약물인 마시텐탄(Macitentan)의 경우 폐동맥고혈압 치료 승인을 받은 약제로서, 엔도텔린(endothelin) 수용체 길항제 중 하나이다. 폐고혈압 질환에 있어, 혈관 내피 세포로부터 생성, 분비되는 엔도텔린-1(endothelin-1, ET-1)은 강력하고, 오래 지속되는 혈관 수축을 일으키는 펩타이드로서 폐혈관의 변화와 관련이 있다. 혈청 ET-1은 대식세포, 비만세포, 다형핵 백혈구에서도 생성 및 분비되며, 특히 안지오텐신 II(angiotensin II)에 의해 세포에서의 분비가 자극되어 이는 다시 심실의 비대 및 섬유화를 초래하는 것으로 알려져 있다. 이러한 ET-1의 세포 작용 기전을 조절하는 약물로서 개발된 것이 엔도텔린 수용체에 대해 경쟁적으로 작용하여 ET-1의 결합을 차단하는 엔도텔린 수용체 길항제이다.

본 발명 일 실시예에서는 폐동맥고혈압 치료제로서 승인된 엔도텔린 수용체 길항제 중 하나인 마시텐탄과 본 발명 조성물을 병용하는 경우에도 유의한 우심실 수축기압(RSVP) 감소, 우심실 무게 감소, 우심실 비대 억제, 혈관 폐색 감소 및 혈관 근육화 감소 효과가 나타났으며, 특히 우심실 비대 억제에 있어 병용투여에 의해 시너지 효과가 나타남에 따라 우심실 비대 억제 효과가 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명의 약학적 조성물은 엔도텔린 수용체 길항제(Endothelin receptor antagonist)를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 엔도텔린 수용체 길항제는 마시텐탄(Macitentan), 보센탄(Bosentan) 또는 암브리센탄(Ambrisentan)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 엔도텔린 수용체 길항제로서의 기전에 의한 약제이면 필요에 따라 적용 가능하다.

또한 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여 제제인 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 근육 또는 피하로 투여되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 적용될 수 있으며, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성별, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 폐고혈압의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 폐고혈압은 폐동맥고혈압일 수 있으며, 또한 구체적으로, 상기 약학적 조성물은 엔도텔린 수용체 길항제와 병용 투여될 수 있다.

'폐고혈압', '페동맥고혈압', '엔도텔린 수용체 길항제'는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 폐고혈압을 가진 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 폐고혈압을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 폐고혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 니클로사마이드 기존 제형의 문제점을 해결하고 유효 혈중농도 및 표적장기에서의 약물농도가 장시간 유지될 수 있도록 하여 폐고혈압의 예방 또는 치료 효과가 유효하게 나타날 수 있도록 한 것이다.

본 발명의 제형은 난용성 약물의 유효 혈중농도가 장시간 유지될 수 있도록 한 것으로서, 폐동맥고혈압 등의 폐고혈압과 같이 니클로사마이드가 치료 효과를 나타낼 수 있는 모든 질환을 대상으로 적용하여 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에서 약리효과를 확인한 동물실험 흐름을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 시험물질 투여에 따른 우심실 수축기압 분석 결과를 나타낸 것이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 3은 시험물질 투여에 따른 우심실 무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 시험물질 투여에 따른 우심실 비대 지표를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 시험물질 투여에 따른 혈관 폐색 비율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 시험물질 투여에 따른 혈관 폐색 정도를 관찰한 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 시험물질 투여에 따른 근육화 된 혈관의 비율 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 시험물질 투여에 따른 완전 근육화 된 혈관의 비율 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 시험물질 투여에 따른 혈관 근육화 정도를 관찰한 현미경 사진을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 니클로사마이드 지연방출 조성물의 제조

하기 표 1의 조성에 따른 니클로사마이드 제형을 제조하였다. 구체적으로, 주사용수에 카복시메틸셀룰로오스 나트륨, 인산 나트륨 일염기 일수화물 및 만니톨을 투입, 교반하여 완전히 용해시킨 후 니클로사마이드를 투입하여 교반시켰다. 이후 호모믹서(homomixer)를 이용하여 균질하게 혼화한 후, 121 ℃에서 15분 동안 고압증기멸균하여 무균화 공정을 진행하였다. 이후 습식 밀링법을 통해 목표하는 입자도로 약물입자도를 조절하고, 필요에 따라 사후멸균하여 제조를 완료하였다. 제조된 니클로사마이드 지연방출 조성물의 니클로사마이드 평균 입자도는 1 내지 3 um이 되도록 하였다.

성분	기능	함량(%,w/w)
니클로사마이드	유효성분	21.87
카복시메틸셀룰로오스 나트륨 (Sodium carboxymethylcellulose)	현탁화제	0.80
인산 나트륨 일염기 일수화물(Sodium phosphate monobasic monohydrate)	완충액	0.07
만니톨(mannitol)	현탁화제	4.37
물	주사용수	72.89
합계		100

비교예 1. 니클로사마이드의 비교 제형경구투여 용액은 적당량의 니클로사마이드를 칭량하여 비히클(Vehicle) 용액(0.2 v/v% Tween 80, 0.5 w/v% Methylcellulose)에 분산시켜 15mg/mL이 되도록 준비하여 경구투여 용액을 제조하였다.

실험예 1. 폐동맥고혈압(Pulmonary Arterial Hypertension, PAH) 동물모델 제작

6주령 웅성 SD 흰 쥐(주식회사 코아텍)를 입수하여 7일 간 건강상태를 확인하는 순화기간을 가졌다. 사육장은 온도 23±3 ℃, 상대습도 55±15 %, 환기횟수 10∼20 회/hr, 조명시간 12 시간 (오전 8 시 점등∼오후 8 시 소등) 및 조도 150∼300 Lux로 설정하였다. 이후, 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물들의 체중을 측정하고 평균체중 (g) ± 20 % 이내의 흰 쥐를 선별하였다. 10 마리는 G1으로 사용하고, SUGEN(SU5416, DC chemicals)을 20mg/kg 농도로 피하 주사하고 3주간 저산소 챔버에서 사육하여 폐동맥고혈압을 유도하였다.

SU5416는 DMSO에 녹인 후 희석 버퍼(dilution buffer, 0.5% Sodium carboxymethylcellulose, 0.9% sodium chloride, 0.4% polysorbate 80 및 0.9% benzyl alcohol in deionized water)로 희석하여 사용하였다. ProOx P360 Oxygen SingleChamber Controller로 지속적으로 산소 농도를 모니터링 하며 질소 주입을 통해 3주간 챔버 내부의 산소 농도를 약 10%로 유지시켰다. 제습기와 암모니아 제거제를 통하여 챔버 내 습도와 암모니아 농도를 적정 수준으로 유지하여 폐동맥고혈압을 유발시켰다.

SU5416을 투여하고 3주간 저산소 챔버에서 폐동맥고혈압 유도를 마친 동물들을 2주간 정상산소(normoxia)에서 2주간 사육하며 시험물질을 투여하는 실험을 진행하였다.

실험예 2. 시험군의 구성 및 투여량 설정

주성분인 니클로사마이드가 240 mg/mL로 함유되도록 하였으며, 시험군의 구성 및 투여물질의 투여량 설정 내용은 각각 하기 표 2에 나타난 바와 같다.

G1은 질병이 유발되지 않은 정상대조군이고, 마시텐탄(Macitentan)은 양성대조군으로서 투여하였다. 상기 마시텐탄은 종래 폐동맥고혈압 치료제로 승인된 것으로서, 0.5%(w/v) 카복시메틸셀룰로스나트륨(Sodium carboxymethylcellulose)을 이용하여 마시텐탄 10 mg/mL의 농도로 조제하였으며, 30mg/kg 농도로 경구투여(PO; per os)하였다.

경구투여의 경우, 동물을 경배부 피부 고정법으로 고정하고, 경구투여용 존데를 이용하여 위 내에 직접 투여하였다. 비교예 1의 조성물은 체표면적 기반 변환 시 인체에서의 실제 경구제 사용량 및 약물의 짧은 반감기를 고려하여 150 mg/10mL/kg/day의 용량을 1일 2회로 분할하여 매일 경구투여하였다.

본 발명의 실시예 1 조성물은 근육 투여(IM; intramuscular) 하였으며, 근육투여의 경우, 투여 전 투여부위를 70 % 알코올을 이용하여 소독하였다. 동물을 조심스럽게 보정하고, 22 gauge 주사 바늘이 장착된 주사기를 이용하여 동물의 우측 대퇴부에 투여하였다. 1주 1회 근육투여하는 경우, 1회차는 우측 대퇴부, 2회차는 좌측 대퇴부를 이용하여 근육주사 하였다.

군	PAH 유발여부	동물수 (마리)	투여물질	투여량	투여주기	투여경로
G1	N	10	-	-	-	-
G2	Y	13	비교예 1	150 mg/10mL/kg/day 용량을 1일2회로 분할하여 매일 투여		경구(PO)
G3	Y	7	실시예 1	0.42ml/kg (니클로사마이드로서 100mg/kg)	1주1회	근육(IM)
G4	Y	12	실시예 1	0.63ml/kg (니클로사마이드로서 150mg/kg)	1주1회	근육(IM)
G5	Y	10	마시텐탄	30mg/kg	1일1회	경구(PO)
G6	Y	10	실시예 1 +마시텐탄	실시예 1: 0.42ml/kg 마시텐탄: 30mg/kg	실시예 1: 1주1회 마시텐탄: 1일1회	실시예 1: 근육(IM) 마시텐탄: 경구(PO)

실험예 3. 약리효과 확인

3-1. 우심실 수축기압(right ventricular systolic pressure, RVSP) 분석

SU5416의 피하 투여일을 D₀로 하여 3주간 저산소 저산소 챔버에서 폐동맥고혈압 유도를 마치고(D₂₁), 표 2에 따른 시험물질을 2주 간 투여하고 D₃₅에 약리효과를 확인하기 위한 분석을 시행하였다(도 1의 흐름도 참조).

RVSP는 D₃₅에 실험동물의 무게를 측정한 뒤 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 마취한 후 우측 경정맥(Jugular vein)을 통해 Rat pressure catheter(Millar Instruments)를 삽입하여 측정하였다. RVSP 값은 LabChart 8 software(ADInstruments)를 이용하여 측정, 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 실시예 1 투여시 양성대조군인 마시텐탄과 유사한 수준의 약리효과가 나타났으며, 비교예 1(G2) 대비 눈에 띄게 RVSP가 감소된 것을 확인하였다. 아울러, 실시예 1 및 엔도텔린 수용체 길항제인 마시텐탄과의 병용(G6)에 있어서도 RVSP가 더욱 감소될 수 있음을 확인하였다. 기존 니클로사마이드는 경구투여 시 위장관에서 미생물에 의한 환원이 나타나고 위장관으로 대량의 약물이 분포하며, 전신흡수 후 약물의 장관순환 및 글루쿠론산 포합반응에 의해 매우 빠른 혈중 반감기를 나타내므로, 유효한 약리 효과를 나타낼 수 있는 혈중 농도의 유지가 어렵다. 비교예 1의 경우 위에 언급한 약물의 흡수 분포 대사적인 단점으로 인하여 매우 빠른 소실(Clearance)이 나타났으며, 이에 따라, 폐고혈압 치료에 필요한 체내 노출 달성이 어려운 것으로 보이나, 실시예 1의 조성물의 경우 유효한 폐고혈압, 특히 폐동맥고혈압의 치료 효과가 나타남을 확인하였다.

3-2. 우심실 무게(RV weight) 측정

상기 3-1에서 RVSP 측정을 마친 실험동물을 CO₂를 이용하여 신속하게 희생시킨 뒤 개복 후 PBS로 관류하여 혈액을 제거하고, 폐의 일부 엽을 적출하여 액체 질소에 바로 냉동 보존하였다. 이후 실험동물의 기도를 통하여 10% 중화 포르말린(Neutral buffered formalin, NBF)을 넣은 후 폐의 나머지 엽과 심장 조직을 적출하여 10% NBF에 담가 고정하였다. 이후 우심실 무게를 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 실시예 1 투여시 G3에서는 우심실의 무게가 유의하게 감소됨을 확인하였다. 반면, 상대적으로 실시예 1이 고용량으로 투여된 G4 및 양성대조군인 마시텐탄이 투여된 G5의 경우 우심실 무게의 유의한 감소는 확인되지 않았다.

아울러, 실시예 1 및 마시텐탄의 병용(G6)의 경우, 우심실 무게의 증가를 거의 완전히 억제하였으며, 특히 실시예 1 투여시 마시텐탄 대비하여 유의하게 우심실 무게 증가를 억제하였다는 점에서 폐고혈압, 폐동맥고혈압에 대한 유효한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

3-3. 우심실 비대 지표 확인

10% NBF에 고정된 심장은 우심실 벽을 따라 심장을 절개하여 우심실과 좌심실+격막 정량 후 무게비를 계산하였다. 상기 계산에 의해 우심실/(좌심실+심실벽) 무게 비(Heart (RV/LV+S) mass ratio)로 나타낸 우심실 비대 지표를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 실시예 1 투여시 양성대조군인 마시텐탄과 유사한 수준으로 우심실 비대 지표의 증가가 억제되는 것을 확인하였으며, 비교예 1(G2) 대비 눈에 띄게 우심실 비대 지표 증가가 현저히 억제된 것을 확인하였다. 아울러, 실시예 1 및 마시텐탄의 병용(G6)의 경우 시너지 효과에 의해 마시텐탄 단독군(G5) 대비 우심실 비대 지표의 증가가 더욱 크게 억제되는 것을 확인하였다.

3-4. 조직병리학적 검사

10% NBF에 고정된 폐를 파라핀 블록으로 만들어 section한 뒤 혈관 리모델링(vascular remodeling)을 분석하기 위해 두 가지 조직염색을 진행하였다.

Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색으로 혈관의 폐색 정도를 분석하였으며, 혈관내피세포마커(vWF)와 평활근세포 마커(SMAα)의 동시 염색(co-staining)으로 혈관의 근육화(muscularization) 정도를 분석하였다.

3-4-1. 혈관 폐색(occlusion) 정도 분석

Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색 후 각 섹션(section) 당 직경 50 μm 이하의 소폐동맥 (small pulmonary arteries) 34~140개를 현미경(Olympus BX53, Japan)으로 관찰 및 촬영하였다. 각 혈관의 폐색 정도는 폐색 없음(open; no occlusion), 부분 폐색(partial), 폐색(closed; occluded)로 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 정상군인 G1에서는 혈관 폐색이 없는 것에 비해, G2에서는 부분 혹은 완전 폐색이 일어난 혈관이 약 70% 이상인 것으로 나타났다. 이에 대하여 실시예 1 투여시 양성대조군인 마시텐탄과 유사한 수준으로 혈관 폐색이 유의하게 감소된 것을 확인하였으며, 실시예 1 및 마시텐탄의 병용의 경우에도 혈관 폐색이 유의하게 감소된 것을 확인하였다.

도 6에 따른 H&E 염색 후 직경 50 μm 이하의 혈관을 관찰한 현미경 사진에 있어서도 G2에서는 완전히 폐색된 혈관이 나타나는 반면, 실시예 1, 마시텐탄, 실시예 1 및 마시텐탄의 병용 모두에서 폐색된 혈관의 수가 유의미하게 감소하고 폐색없이 열린(open) 형태의 혈관이 증가함을 확인하였다.

3-4-2. 혈관 근육화(muscularization) 정도 분석

폐 조직 혈관의 근육화 정도를 확인하기 위하여 혈관내피세포 마커인 vWF-FITC(abcam)와 평활근세포 마커인 SMAα-Cy3(abcam)를 형광조직염색하였다. 파라핀 제거 및 수화(hydration) 후 항원 복구(antigen retrieval) 및 블록킹(blocking) 과정을 거친 조직을 1차 항체로 인큐베이션 하고 DAPI 염색 및 mounting하였다. 직경 50 μm 이하의 혈관을 섹션 당 최소 100개 이상씩 현미경으로 관찰 및 촬영하였다. 비-근육화(Non-muscularized), 부분 근육화(partially muscularized), 완전 근육화(fully muscularized)로 나누어 분석하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 질환 유발 후 비교예 1이 처리된 G2 군에서 완전 근육화 된 혈관의 비율이 급격히 증가하였으며, 실시예 1 투여시 양성대조군인 마시텐탄과 유사한 수준으로 혈관 근육화가 억제되는 것을 확인하였다.

아울러, 도 8에서도 실시예 1 투여시 양성대조군인 마시텐탄과 유사한 수준으로 완전 근육화 된 혈관 비율이 감소한 것을 확인하였다.

또한, 폐동맥 근육화 정도를 확인하기 위해 혈관내피세포의 마커인 vWF와 평활근세포의 마커인 SMAα를 염색하여 동시에 염색된 혈관을 관찰한 도 9의 현미경 사진에 있어서도 질환 유발 후 비교예 1이 처리된 G2 군에서는 근육화 된 혈관이 유의미하게 증가하였으며, 실시예 1, 마시텐탄, 실시예 1 및 마시텐탄의 병용 모두에서 완전 근육화 된 혈관 비율이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.

상기 약리효과를 확인함에 있어서 통계분석은 GraphPad Prism 8 Software를 이용하였으며 unpaired Student t-test를 사용하였다.

상기와 같은 결과는 본 발명의 니클로사마이드 지연방출 조성물을 비경구 경로로 투여 시 종래 제형인 경구투여에서는 달성할 수 없었던 혈중 약물농도를 달성 및 유지할 수 있도록 함으로써 폐고혈압, 특히 폐동맥고혈압에 대한 예방 및/또는 치료 효과를 나타낼 수 있음을 보여준다. 이러한 향상된 치료 효과는 실시예 1의 두 가지 용량 모두에서 나타나며, 나아가 본 발명의 니클로사마이드 지연방출 조성물은 마시텐탄과 같은 엔도텔린 수용체 길항제와 시너지 효과를 나타낼 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

니클로사마이드(niclosamide) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 지연방출 조성물을 포함하는, 폐고혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서,
상기 지연방출 조성물은 니클로사마이드(niclosamide) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 카복시메틸 셀룰로오스; 인산염; 나트륨염; 및 만니톨을 포함하고,
상기 지연방출 조성물은 비경구 투여되는 것인, 폐고혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폐고혈압은 폐동맥고혈압인, 폐고혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 엔도텔린 수용체 길항제(Endothelin receptor antagonist)를 추가로 포함하고,
상기 엔도텔린 수용체 길항제는 마시텐탄(Macitentan)인, 폐고혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
삭제
제1항의 조성물을 인간이 아닌 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 폐고혈압의 치료방법.
제12항에 있어서,
상기 폐고혈압은 폐동맥고혈압인, 폐고혈압의 치료방법.
제12항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 엔도텔린 수용체 길항제와 병용 투여되고,
상기 엔도텔린 수용체 길항제는 마시텐탄(Macitentan)인, 치료방법.