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KR102595249B1 - 세포 치료를 위한 표적화된 리간드-페이로드 기반의 약물 전달 - Google Patents

세포 치료를 위한 표적화된 리간드-페이로드 기반의 약물 전달 Download PDF

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KR102595249B1
KR102595249B1 KR1020197026818A KR20197026818A KR102595249B1 KR 102595249 B1 KR102595249 B1 KR 102595249B1 KR 1020197026818 A KR1020197026818 A KR 1020197026818A KR 20197026818 A KR20197026818 A KR 20197026818A KR 102595249 B1 KR102595249 B1 KR 102595249B1
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KR
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ser
leu
thr
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KR1020197026818A
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필립 에스. 로우
맛두리 스리니바사라오
보닝 장
Original Assignee
퍼듀 리서치 파운데이션
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Abstract

세포 치료의 유연한 미세 조정을 제공하는 약물 전달 플랫폼이 본 명세서에 개시되어 있다. 특히, 조작된 융합 단백질은 이식된 세포 치료 효과를 관찰 또는 조절하기 위해, 이식된 세포에 의해 내재화될 약물의 적어도 하나의 페이로드를 운반하는 고친화도 리간드와 결합된다.

Description

세포 치료를 위한 표적화된 리간드-페이로드 기반의 약물 전달
상호 참조
본 출원은 2017년 2월 17일에 제출된, 35 U.S.C. §119(e)에 따른 미국 가출원 62/460,118의 이점을 주장한다. 이의 내용은 본 명세서에 전문 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 세포 치료를 위한 약물 전달 플랫폼을 제공한다. 특히, 조작된 단백질은 이식된 세포 치료 효과를 조절하기 위해, 조작된 단백질을 통해 이식된 세포에 의해 내재화될 적어도 하나의 약물의 페이로드를 운반하는 고친화도 리간드와 결합된다.
지난 수십년 동안, 세포 유형, 전달 방법 및 적합한 질병 모델에 관한 이 분야에서 큰 발전이 이루어졌다. 세포 유형 측면에서, 현재 세포 치료는 대략 키메라 항원 수용체(CAR), 종양 모델용 세포 및 줄기 세포 기반 재생 의학으로 분류될 수 있다. 관련 종래기술로는 세포 치료(cell therapy)를 위한 표적화된 리간드-페이로드 기반 약물 전달이라는 발명의 명칭으로 공개된 WO 2016/098078 (2016.06.23.)을 들 수 있다.
키메라 T 세포 수용체로도 알려진 CAR T, 키메라 면역수용체 또는 인공 T 세포 수용체는 면역 이펙터 세포(보통 T 세포 또는 NK 세포)가 상응하는 항원으로 표적 세포를 인식하고 그의 세포독성 활성을 발휘할 수 있게 한다. CAR-T 기술의 출현과 개발은 특정 유형의 암에 대한 약속을 제공하여, CAR-T를 생의학 연구 및 임상 연구 분야에서 슈퍼스타로 만든다.
재생 의학은 손상된 조직과 장기를 완전히 치유할 수 있는 능력을 갖는 업계판도를 바꿀 수 있는 의학 분야로, 오늘날 치료가 불가능한 상태에 있는 사람들에게 해결책과 희망을 제공한다. 발생 및 세포 생물학, 면역학 및 기타 분야의 발전으로 기존 재생 요법을 개선하고 새로운 요법을 개발할 수 있는 새로운 기회가 열렸다.
줄기 세포는 분화라고 불리는 과정을 통해 피부 세포, 뇌 세포, 폐 세포 등과 같은 여러 유형의 세포로 발전할 수 있는 능력을 갖고 있다. 줄기 세포는 새로운 임상 용도의 문을 열어주기 때문에 재생 의학의 핵심 구성요소이다.
성체 및 배아 줄기 세포를 포함한 다양한 줄기 세포가 재생 의학에 사용될 수 있다. 또한, 제대혈에서 발견되는 것과 같은 다양한 유형의 선조 세포, 및 유도 만능 줄기 세포라 불리는 생체공학적 세포가 재생 의학에 사용된다. 각 유형마다 고유한 특성이 있으며, 일부 유형은 다른 유형보다 더 다양하다.
개발중인 많은 재생 요법은 특정 환자 자신의 세포에서 시작된다. 예를 들어, 환자 자신의 피부 세포가 수집되어, 실험실에서 재프로그래밍되어 특정 특성을 제공하고 환자에게 다시 전달되어 그의 질병을 치료할 수 있다.
비록 항CD19 CAR T가 백혈병 치료를 위한 임상 적용에서 큰 성공을 거두었지만, 종양 세포의 빠른 용해로부터 생성된 사이토카인 스톰(storm)과 같은 치명적인 부작용뿐만 아니라 빠르게 증식하는 항-CD19 CAR T 세포에 의한 정상 CD19+ B 세포의 사멸이 CAR T 세포의 보다 미세한 제어를 필요로 한다. 줄기 세포 기반 재생 요법에서, 표적 조직에서 이식된 세포의 분화 과정 및 영양 역할을 보다 잘 이해하기 위한 노력이 이루어졌다. 한편, 이들 과정은 표적 조직의 재생에 추가로 기여하기 위해 줄기 세포에 특이적으로 전달되는 일부 소분자 약물에 의해 잠재적으로 변경될 수 있다.
CAR T 세포 뿐만 아니라 다른 줄기 세포 기반 재생 요법에 대한 또 다른 오래 지속되는 우려는 상기 이식된 세포의 종양형성 가능성이다. 요약하면, CAR T 세포 또는 줄기 세포가 이식된 후 이식된 세포의 활동을 제어하기 위한 전용 출입구를 갖는 것이 이상적일 것이다.
발명의 요약
본 발명은 미세 조정 세포 치료를 위한 약물 전달 플랫폼을 제공한다. 약물 전달 시스템은 하기를 포함한다:
a. 이식용 표적 세포 상의 조작된 단백질, 여기서 융합 단백질은 제1 성분 및 제2 성분을 포함하고, 상기 제1 성분 및 제2 성분은 펩타이드 링커에 의해 연결되고, 상기 제1 성분은 비-막 단백질이고, 상기 제2 성분은 막 고정된 펩타이드 또는 단백질이며;
b. 링커에 접합된 적어도 하나의 소형 리간드, 여기서 상기 적어도 하나의 소형 리간드는 조작된 단백질의 적어도 하나의 성분에 대해 고유의 높은 친화도를 가지며; 및
c. 링커에 접합된 약물의 적어도 하나의 페이로드(payload), 여기서 상기 약물의 페이로드는 상기 소형 리간드가 상기 조작된 단백질의 적어도 하나의 성분에 결합할 때 표적 세포와 관련된다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼은 영상화제의 약물의 페이로드를 갖는다. 상기 영상화제는 형광 염료 로다민, 플루오레세인 및 S0456으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 상기 영상화제는 방사성 동위원소 킬레이트 영상화 모이어티, EC 20 킬레이트 헤드, NOTA 및 DOTA로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼은 세포독성 약물의 약물의 페이로드를 갖는다. 상기 세포독성 약물은 투불리신, DM1, DM4 및 아우리스타틴으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼은 유전자 발현 조절제의 약물의 페이로드를 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼은 세포 활성의 조절제 약물의 페이로드를 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 조절제는 다사티닙(dasatinib), MEK1/2 억제제 및 PI3K 억제제의 군; HDAC 억제제, 키나제 억제제 및 대사 억제제의 군; GSK3 베타 억제제, MAO-B 억제제 및 Cdk5 억제제의 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 조절제는 포스파타제 억제제, RORγt 작용제 또는 siRNA mi181a1이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물의 페이로드는 SHP1/2, TC-PTP에 대한 억제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 포스파타제 억제제이다.
일부 구현예에서, 약물 전달 플랫폼에서 상기 언급된 약물의 페이로드는 소형 리간드가 상기 조작된 단백질의 적어도 하나의 성분에 결합할 때 표적 세포에 의해 추가로 내재화된다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼은 소형 리간드와 페이로드 약물을 연결하기 위한 방출가능한 링커를 갖는다. 상기 링커는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:
일부 구현예에서, 상기 언급된 조작된 단백질 성분은 엽산 수용체 알파(FRa), 엽산 수용체 베타(FRb), 우로키나제 수용체(uPAR), FK506 결합 단백질(FKBP), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 플루오레세인 이소티오시아네이트에 대한 단일 사슬 단편 변이체(FITC에 대한 scFv) 및 디니트로페놀에 대한 단일 사슬 단편 변이체(DNP에 대한 scFv)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 소형 리간드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
,
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼은 FKBP로서 제1 성분을 갖고, 제2 성분은 제1 성분 상에 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커(anchor)를 부여하는 펩타이드이고, 소형 리간드는 FK506 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, FK506 유도체는 칼시뉴린 결합 부위를 폐지한다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 제2 성분은 전장 또는 절단된 엽산 수용체(FR)이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼은 조작된 단백질의 제1 성분 및 제2 성분을 연결하기 위한 가요성 펩타이드 링커 SGGGS의 적어도 하나의 세그먼트를 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼은 서열번호 1~2(각각, 마우스 FKBP-FRa에 대한 아미노산 서열 및 인간 FKBP-FRa에 대한 아미노산 서열)로 구성된 군으로부터 선택된 조작된 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼은 서열번호 12~15로 구성된 군으로부터 선택된 조작된 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 이식을 위한 표적 세포는 면역 세포이다. 예를 들어, 면역 세포는 NK 세포 또는 키메라 항원 수용체 T(CAR T) 세포일 수 있다. 상기 CAR T 세포는 서열번호 3~4로부터 선택된 아미노산 서열을 발현할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼은 화학식 I의 소형 리간드 접합체를 갖는다.
[화학식 I]
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼은 서열번호 3(마우스 항CD19 CAR T 작제물에 대한 아미노산 서열) 또는 서열번호 4(인간 항CD19 CAR T 작제물에 대한 아미노산 서열)를 발현하는 CAR T 세포로서 이식을 위한 표적 세포를 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 소형 리간드는 약물 내재화를 추적하기 위해 형광 염료 또는 방사성 프로브에 추가로 접합된다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼은 형질도입된 트랜스진 발현의 조절인자의 내인성 유전자 발현의 조절인자에 추가로 접합된 소형 리간드를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 전달 플랫폼에서, 이식을 위한 표적 세포는 환자에게 결핍된 생화학물질을 합성하도록 설계된 줄기 세포, 전구 세포 또는 이식된 세포이다.
본 발명은 서열번호 12~15로부터 선택된 아미노산 서열을 발현하는 작제물을 포함하는 CAR T 세포를 추가로 제공한다.
본 발명은 서열번호 12~15로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 작제물을 추가로 제공한다.
본 발명은 발현 벡터에서 EF1a 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 1~2 중 어느 하나를 포함하는 FKBP-FRa 융합 수용체를 코딩하는 DNA 작제물을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 5를 갖는 pWPI이다.
본 발명은 서열번호 6~8 중 어느 하나를 포함하는 DNA 작제물을 추가로 제공한다.
본 발명은 삽입 유전자 hFKBP-FR(서열번호 7) 및 인간 항CD19 CAR(서열번호 9)을 포함하는 이식된 세포를 추가로 제공한다.
본 발명은 삽입 유전자 mFKBP-FR(서열번호 8) 및 마우스 항CD19 CAR(서열번호 10)을 포함하는 이식 세포를 추가로 제공한다.
본 발명은 세포 치료 효과를 조절하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 하기를 포함한다:
a. 이식을 위한 표적 세포를 확인하는 단계, 여기서 상기 이식된 표적 세포가 세포 치료 기능을 가지며;
b. 이식을 위한 표적 세포의 표면에 조작된 융합 단백질을 제공하는 단계, 상기 융합 단백질이 제1 성분 및 제2 성분을 포함하고, 상기 제1 성분 및 제2 성분이 가요성 펩타이드 링커에 의해 연결되고, 상기 제1 성분이 비-막 단백질이고, 상기 제2 성분이 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 고정 펩타이드 또는 단백질이며;
c. 표적 세포에 약물 접합체의 페이로드를 제공하는 단계, 여기서 상기 약물의 페이로드는 링커를 통해 소형 리간드에 접합되고, 선택적으로 형광 염료에 접합되며, 여기서 상기 소형 리간드는 높은 친화도를 갖는 조작된 융합 단백질의 적어도 하나의 성분에 결합하고, 약물의 페이로드와 함께 표적 세포에 의해 내재화되며; 및
d. 표적 세포 치료 기능을 조절하기 위해 표적 세포 내에서 약물을 방출하는 단계.
일부 구현예에서, 상기 언급된 세포 치료 기능은 대상체에게 광학적으로 유도된 수술을 제공하는 것이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 세포 치료 기능은 표적 세포 증식을 제어하는 것이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 세포 치료 기능은 표적 세포 관여 암 세포에 대한 세포독성을 실행하는 것이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 이식된 표적 세포는 면역 세포이다. 예를 들어, 표적 세포는 CAR T 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 이식된 표적 세포는 환자에 결핍된 생화학 물질을 합성하도록 설계된 줄기 세포, 전구 세포 또는 이식된 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물의 페이로드는 로다민 및 FITC의 형광 염료로부터 선택된 영상화제, 또는 EC20 킬레이트 헤드, NOTA 및 DOTA로부터 선택된 방사선 동위원소 영상화제이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물의 페이로드는 투불리신, DM1, DM4 및 아우리스타틴으로 구성된 군으로부터 선택된 세포독성 약물이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물의 페이로드는 다사티닙, MEK1/2 억제제 및 PI3 키나제 억제제로 이루어진 키나제 억제제, 또는 mi181a1의 siRNA로부터 선택된 유전자 발현의 조절제이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 이식된 표적 세포는 서열번호 12~15로 구성된 군으로부터 선택된 융합 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 조작된 단백질 성분은 FRa, FRb, uPAR, FKBP, DHFR, FITC에 대한 scFv 및 DNP에 대한 scFv로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 소형 리간드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
일부 구현예에서, 소형 리간드와 페이로드 약물을 연결하기 위한 상기 언급된 링커는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
일부 구현예에서, 상기 언급된 이식된 표적 세포는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 군으로부터 선택된 조작된 FKBP-LINKER-FRa 융합 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 이식된 표적 세포는 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 군으로부터 선택된 조작된 항CD19 CAR T 작제물을 포함하는 CAR T 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 약물 접합체는 화학식 I을 포함하는 FK506-방출성 링커이며, 여기서 상기 FK506의 결합 도메인은 약 4 pM 내지 약 100 pM의 FKBP에 대한 친화도를 갖는다.
(화학식 I)
일부 구현예에서, 상기 언급된 이식된 표적 세포는 CAR T 세포이고, 상기 약물 접합체는 이식된 CAR T 세포의 과도한 사이토카인 스톰을 제어하기 위한, GSK3b 억제제, MAPK 억제제로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 이식된 표적 세포는 CAR T 세포이고, 상기 약물 접합체는 원치 않는 T 세포 증식을 제어하도록 설계된 조절제이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 이식된 표적 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포이고, 상기 약물 접합체는 골절 복구를 촉진하기 위한 GSK3b 억제제이다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 이식된 표적 세포는 환자에 결핍된 생화학 물질을 합성하도록 설계된 줄기 세포, 전구 세포 또는 이식된 세포이고; 상기 약물 접합체는 파킨슨 병 또는 다른 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한, MAO-B 억제제 및 cdk5 억제제로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 이식된 표적 세포는 NK 세포이고, 상기 약물 접합체는 Th17 세포 매개 면역 반응을 제어하기 위한 RORγt 작용제이다.
본 발명의 이들 및 다른 특징, 양태 및 장점은 하기 도면, 관련 설명 및 청구범위를 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1: A. 세포 치료를 위한 FKBP-FRa 및 FK506-페이로드 기반 약물 전달 플랫폼의 개요; B. 페이로드의 CAR T 세포 전달을 위한 비밀 경로 플랫폼의 그래픽 예시.
도 2a. 왼쪽: FKBP 결합 부위(황색) 및 강조표시된 유도체화된 부위(적색)를 갖는 FK506의 화학 구조. 오른쪽: 칼시뉴린 A 단편(녹색), 칼시뉴린 B(청록색), FKBP12(보라색) 및 FK506(황색)의 삼원 복합체의 공-결정 구조, PDB: 1TCO
도 2b. 조작된 융합 단백질에서 2개의 모듈의 다양한 조합 옵션 및 각각의 리간드 선택, 잠재적 유도체화 부위가 강조되어 있음.
도 3: 왼쪽: CAR T 세포의 시공간 제어를 위한 탐구, Sun J. 등 2015에서 적용된, CAR T 세포 활성의 음성 및 양성 조절. 오른쪽: 적응 세포 치료를 위한 안전 스위치로서 유도성 세포자멸사, Malcolm K.B. 등 2011로부터 적용된, AP1903(FK506 이량체) 유도된 FKBP-카스파제9 매개된 세포자멸사의 메커니즘 및 AP1903의 구조
도 4: a. FKBP-FRa 삽입물을 갖는 pWPI 발현 벡터 맵(hFRa 1-24: 적색, FKBP: 황색, hFRa 25-258: 적색) b. FKBP-FRa 형질도입된 K562 세포는 FRa 양성 KB 세포 및 형질도입되지 않은 K562 세포와 비교하여 약 50 kDa(FRa의 경우 37kDa + FKBP의 경우 12 kDa)의 더 높은 밴드를 나타낸다. c. 페이로드 캐리어 작제물 및 CAR T 작제물 설계 d. FKBPFR3GS의 작제물 설계(FF3으로 표시). N 말단에서 C 말단까지, 신호 펩타이드로서 1-24 aa의 인간 FRa, 인간 FKBP 단백질, 3개의 Gly-Ser 링커 및 이어서 25-258 aa의 인간 FRa를 갖는다. FKBPFR1GS(FF1로 표시)에서 FF3의 3개의 Gly-Ser 라이너는 다른 부분을 변경하지 않고 하나의 Gly-Ser 링커로 치환된다. e. 4m5.3FR의 작제물 설계. N 말단에서 C 말단으로, 이는 hCD8 신호 펩타이드, FITC에 대한 4M5.3 항체의 scFv, GS 링커, 25-258 aa의 인간 FRa를 갖는다.
도 5. FKBPFR1GS 융합 수용체에서 FR과 FKBP 사이의 간섭. FKBPFR1GS 융합 단백질에서 엽산의 결합은 0.01 nM만큼 낮은 FK506-로다민의 결합을 차단하고, 50 nM에서 FK506-로다민 결합을 완전히 파기한다.
도 6. FKBPFR1GS jurkat 세포는 OTL38에 결합한 후 감소된 FK506-로다민 강도를 보여준다. 융합 수용체 내의 FK506-로다민(공여체)으로부터 OTL38(FA-S0456, 수용체, ex/em: 774/794 nm)까지의 FRET은 FR과 FKBP 사이의 상호작용을 나타낸다.
도 7. FKBP와 FR 사이의 링커 길이를 증가시키면, 두 부분 간의 간섭이 크게 낮아진다. FF1(FKBP와 FR 사이의 1GS)과 비교하여, FF3(FKBP와 FR 사이의 3GS)은 10 nM FA의 존재 하에 FK506-로다민의 결합을 유지하는데, 이는 인체내 FA의 생리학적 농도와 비슷하다.
도 8. PI-PLC 처리는 GPI 고정된 융합 수용체 FF3을 방출한다. FF3 융합 수용체를 갖는 jurkat T 세포는 20 nM FA-FITC(EC17)와의 포화 결합을 나타내는 반면, 5 mU PI-PLC 또는 50 mU PI-PLC 처리 후 FA-FITC는 세포에 대한 결합을 잃어, GPI 고정된 FF3 융합 수용체의 방출을 나타낸다.
도 9. FKBPFR3GS 융합 수용체에서의 FA-로다민 결합 곡선. 인간 T 세포상에서 안정적으로 발현된 FKBPFR3GS 융합 수용체는 FR+ KB 세포에서 FA-로다민의 친화도와 비슷한 높은 친화도(Kd = 0.95 nM)로 엽산 유도체(FA-로다민)에 결합할 수 있다(Kd 약 1 nM). 따라서, 융합 수용체내 FR의 결합 특성이 유지된다.
도 10. FKBPFR3GS 융합 수용체에서의 FK506-로다민 결합 곡선. 인간 T 세포 상에서 안정적으로 발현된 FKBPFR3GS 융합 수용체는 높은 친화도(Kd = 3.93 nM)로 FK506 유도체(FK506-로다민)에 결합할 수 있으며, 이는 융합 수용체내 FKBP의 결합 특성이 보존됨을 의미한다.
도 11. SLF-FITC는 비교적 높은 결합 친화도(Kd = 62 nM)를 갖는 FKBPFR3GS 융합 수용체에 결합하는 반면, 유리 SLF(100x, 사전배양)와의 경쟁은 이러한 결합을 차단한다. FK506의 모방인 SLF는 이전의 보고와 일치하는 모체 리간드 FK506과 비교하여 FKBPFR 융합 수용체에 대한 10배 낮은 결합 친화도를 나타낸다.
도 12. 4M5.3FR 융합 수용체에서의 FA-로다민 결합 곡선. FA-로다민은 FR+ KB 세포(Kd 약 1nM)에서 FA-로다민의 친화도와 비슷한 높은 친화도(Kd = 2.25nM)로 인간 T 세포에서 안정적으로 발현되는 4M5.3FR 융합 수용체에 결합할 수 있다. 따라서, FR 결합 특성은 4M5.3FR 융합 수용체에서 보존된다.
도 13. 4M5.3FR 융합 수용체에서의 FITC-AF647 결합 곡선. FITC-AF647은 높은 친화도(Kd = 8.03 nM)로 인간 T 세포에서 안정적으로 발현되는 4M5.3FR 융합 수용체에 결합할 수 있다. 100x comp는 유리 FITC 나트륨을 나타낸다. FITC와 scFv 4M5.3의 결합 특성은 4M5.3FR 융합 수용체에서 보존된다.
도 14. FA-투불리신은 FF3+ 인간 T 세포에 대한 수용체 특이적 사멸 효과를 매개할 수 있다. FA를 사용한 보상(FA를 사용한 100x 사전배양)은 그 효과를 차단한다. 이는 FF3 융합 수용체 시스템을 통한 유리 약물 투불리신의 성공적인 내재화 및 방출을 의미한다.
도 15. FA-투불리신은 혼합된 인간 T 세포 배양에서 hFF3+ 집단을 특이적으로 사멸시킨다. FA-Tub 농도가 증가함에 따라 hFF3+ 세포의 절대 수는 감소하는 반면, hFF3-세포는 방출된 약물 및 고농도에서의 방관자 효과를 통해 사멸된다.
도 16. SLF-Tub는 IC50 = 138 nM으로 hFF3+ Jurkat 세포를 특이적으로 사멸시킨다. 이는 FKBPFR3GS 융합 수용체에 의한 SLF-Tub의 성공적인 내재화 및 세포내 투불리신의 방출을 나타낸다.
도 17. FITC-DM4와 FITC-Tub는 모두 4M5.3FR+ 인간 T 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 반면, FITC-Tub는 더 높은 IC50을 갖는다. 유리 FITC 나트륨(100x 사전배양)의 보상은 수용체 매개된 사멸 효과를 차단한다. 이는 4M5.3FR 융합 수용체를 통해 FITC-세포독성 약물의 T 세포내로의 성공적인 내재화 및 방출을 의미한다.
도 18 FITC-투불리신은 혼합 인간 T 세포 배양에서 4M5.3FR+ 집단을 특이적으로 사멸시킨다. FITC-Tub 농도가 증가함에 따라 4M5.3FR+ 세포의 절대 수는 감소하는 반면, 4M5.3FR- 세포는 방출된 약물 및 고농도에서 방관자 효과를 통해 사멸된다.
도 19 FITC-DM4는 혼합된 인간 T 세포 배양에서 4M5.3FR+ 집단을 특이적으로 사멸시킨다. FITC-DM4 농도가 증가함에 따라 4M5.3FR+ 세포의 절대 수는 감소하는 반면, 4M5.3FR- 세포는 방출된 약물 및 고농도에서 방관자 효과를 통해 사멸된다.
도 20. 10 nM 농도에서 다사티닙(Lck 억제제) 및 이브루티닙(ITK 억제제)은 CD19+ Raji 종양 세포(표적)에 대한 항CD19 CAR T 세포(FMC63 CAR T, 이펙터)의 용해 효과를 감소시킨다. 2개의 이펙터:표적 비율(E:T)이 테스트되었다. 정상 T 세포 및, CD19- K562 세포를 갖는 항CD19 CAR T를 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 21. FITC-다사티닙은 Raji 세포에 대한 FMC63+4M5.3FR+hT 세포의 용해 효과를 감소시킬 수 있다. 이는 4M5.3FR 융합 수용체를 통해 FITC-다사티닙의 T 세포로의 성공적인 내재화 및 방출 및 T 세포로의 다사티닙의 방출을 의미한다.
도 22. 100 nM 농도에서의 TC-PTP 억제제는 소진된 항CD19 CAR T 세포에서 공-억제제 분자 집단을 감소시킨다(CD19+ Raji 세포로 7회 자극하여 생성됨, 하기 상세한 과정 참조). PD-1, LAG3 및 이중 양성 집단이 치료시 감소한다. 이는 TC-PTP 억제제와 같은 포스파타제 억제제가 소진된 CAR T 세포를 재생시키기 위한 비밀 게이트웨이 플랫폼에 대한 페이로드로서 사용될 수 있음을 의미한다.
[표 1]
FKBP-FRa 세포 치료 플랫폼 및 해당 페이로드의 잠재적 응용.
서열 목록
서열번호 1: 마우스 FKBP-FRa에 대한 아미노산 서열
서열번호 2: 인간 FKBP-FRa에 대한 아미노산 서열
서열번호 3: 마우스 항CD19 CAR T 작제물에 대한 아미노산 서열
서열번호 4: 인간 항CD19 CAR T 작제물에 대한 아미노산 서열
서열번호 5: 인간 T 세포 형질도입에 대한 벡터 pWPI
서열번호 6: 마우스 T 세포 형질도입을 위한 pMP71 gb NotIEcoRI 마우스
서열번호 7: pWPI-FRa 1-24 FKBP FRa
서열번호 8: pWPI mFKBP-mFRa SGGGS
서열번호 9: pHR EcorI hAnti cd19 1D3 myc 힌지 cd28 cd3zeta
서열번호 10: pWPI pmei mAnti cd19 1D3 myc 힌지 cd28 cd3zeta
서열번호 11: GPI 고정된 아미노산 서열을 갖는 FKBP-1SG-FR
서열번호 12: GPI 고정된 아미노산 서열을 갖는 FKBP-3SG-FR
서열번호 13: GPI 고정된 아미노산 서열을 갖는 4M5.3-FR
서열번호 14: FMC63-T2A-FKBP3SGFR
서열번호 15: FMC63-T2A-4M5.3SGFR
서열번호 16: 신호 펩타이드를 갖는 FRb
서열번호 17: 신호 펩타이드를 갖는 uPAR
서열번호 18: DHFR
서열번호 19: FITC에 대한 scFv: 4M5.3(Kd = 200 pM)
서열번호 20: FITC 4D5Flu에 대한 scFv(Kd = 10 nM)
서열번호 21: DNP SPE7에 대한 scFv
본 발명의 개념이 도면 및 본원의 상세한 설명에서 예시되고 상세하게 설명되지만, 도면 및 그 설명의 결과는 예시적인 것으로 간주되며, 특성상 제한적이지 않다; 단지 예시적인 구현예들만이 도시되고 설명되며, 본 발명의 사상 내에 있는 모든 변경 및 변형은 보호되는 것이 바람직하다는 것을 이해한다.
달리 정의되지 않는 한, 과학적 및 기술 명명법은 본 발명에 관한 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명은 이식된 세포 표면 상에 융합 수용체를 유전적으로 도입함으로써 이식된 세포 활성을 제어하기 위한 신규한 플랫폼을 제공한다. 이어서, 상기 이식된 세포는 소분자 리간드와 이식된 세포 표면상의 융합 수용체 사이의 고유한 높은 친화도를 사용하여 소분자 리간드 접합된 약물 페이로드에 의해 특이적으로 표적화될 것이다. 융합 수용체의 한 부분은 접합체를 내재화하는 역할을 하며, 상기 페이로드는 이식된 세포 내부에 놓이면 방출가능한 링커를 통해 방출될 것이다. 이식된 세포 유형 및 이식된 세포에 부과되는 원하는 조절에 따라, 약물 페이로드는 다양한 기능일 수 있다. 접합체에서 페이로드를, 예를 들어 세포독성 약물 또는 키나제 억제제로서 변경함으로써, 약물 페이로드는 이식된 세포의 다중 측면, 예컨대 증식, 분화 또는 사이토카인 방출 프로파일을 제어하는데 사용될 수 있다.
펩티딜-프롤린 이성질화 효소(PPIases) 패밀리는 FK506-결합 단백질(FKBP), 사이클로필린 및 파르불린으로 구성된다. 인간에는 18개의 FKBP, 24개의 사이클로 필린 및 3개의 파르불린이 있다. 이들 중에서, FKBP51 및 FKBP52는 FKBP12(KDFK506
Figure 112019093684947-pct00009
0.2 nM)와 비교하여, FK506, KDFK506 104 nM 및 KDFK506 23 nM 각각의 높은 내지 중간 정도의 결합 친화도를 공유한다. 또한, 이들 2개의 FKBP 중 어느 것도 세포막에서 발현되지 않아, 본 시스템에서 거의 교차 결합 활성이 발생하지 않는다. 야생형 단백질의 전체 구조를 보존하는 FKBP51F67V뿐만 아니라 FKBPWT보다 FKBP12F36V에 대한 더 높은 친화도를 갖는 합성 리간드를 설계하기 위한 노력이 또한 이루어졌다. 상기 언급된 리간드와 함께 모든 상동체 및 돌연변이된 단백질이 본 발명에 적합할 수 있다.
특히, 일 구현예에서, 예시된 소분자 리간드 및 융합 수용체의 쌍은 FK506-FKBP로 선택된다. 전체 과정은 도 1a에 일반화될 수 있으며, 여기서 FK-506-페이로드는 FKBP-FRa 조작된 세포에 먼저 결합하고; 이러한 결합에 따라, 막횡단 융합 단백질은 페이로드-링커-FK506을 내재화할 것이다. 다음으로, 내재화된 FK506-페이로드가 링커에서 쪼개지고, 페이로드가 세포내에 방출되었다. 세포 유형 및 페이로드 유형에 따라, 방출된 페이로드 약물은 그의 원하는 기능을 발휘할 수 있다.
도 1b에서, 특정 키메라 항원 수용체 T 세포 매개된 세포 치료가 도시되어있다. 이 모델에서, 적합한 신호 펩타이드를 포함하는 N 말단에서 C 말단까지의 구조를 갖는 융합 단백질을 발현하는 CAR T 세포, GPI 앵커의 단백질 모듈 1에 연결된 단백질 모듈 2가 암 세포에 제공된다. 일부 구현예에서, 암 세포는 표적 리간드가 융합 수용체의 적어도 하나의 모듈에 결합할 때 CAR T 세포에 의해 인식되고 CAR T 세포와 관련된 페이로드와 결합될 CD19 표면 단백질을 갖는다. 전형적으로, 이들 모듈 중 어느 하나에 대한 표적화 리간드의 높은 친화도로, 리간드와 관련된 페이로드는 표적 세포 내로 내재화되어, 키메라 항원 수용체를 통해 암 세포와 결합하도록 방출될 수 있다.
모듈 1 및 이의 리간드로 표시되는 GPI 고정된 단백질과 도 2b에 도시된 모듈 2 표적 세포 표면 단백질 및 그의 각 리간드의 많은 상이한 조합들이 있을 수 있다. 모듈 1 단백질 또는 모듈 2 단백질, 또는 둘다는 리간드 접합된 페이로드 전달을 용이하게 하기 위해 고친화도 표적 리간드와 결합될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, FRa-링커-FKBP 구조를 포함하는 융합 단백질을 갖는 것이 가능하며, 여기서 FA 유도체와 결합하는 FRa, 동시에 FK506 유도체, FA 유도체 또는 FK 506 유도체 중 어느 하나 또는 둘다와 결합된 FKBP가 세포독성 약물, 영상화제 또는 조절제와 같은 페이로드에 연결될 수 있다. 동일하거나 상이한 페이로드를 운반하는 것의 상기 가요성으로, 상이한 또는 동일한 페이로드의 예상치 못한 상승작용 또는 조절 효과를 달성하거나, 페이로드가 영상화제인 경우 표적 세포를 관찰할 수 있다. 이 시스템의 페이로드 전달의 가요성과 다양성의 장점은 더 많은 예를 통해 이해될 것이다.
유사하게, GPI 고정된 단백질과 쌍을 이룬 리간드의 또 다른 구현예는 uPAR과 쌍을 이룬 일 수 있다.
FITC 또는 이의 유도체는 FITC에 대한 항체의 단일 사슬 단편 변이체(scFv), 예를 들어, 의 리간드 구조, 또는 FKBP와 쌍을 이루는 의 구조, 또는 DHFR과 쌍을 이루는 , 또는 DNP에 대한 scFV와 쌍을 이루는 에 결합할 수 있는 것으로 고려된다.
이 전달 시스템에서 예시적인 리간드-단백질 쌍으로서 FK506-FKBP를 선택하는 것의 몇 가지 장점을 언급할 가치가 있다. 1. FKBP는 포유동물 세포막에 자연적으로 존재하는 막 단백질이 아니므로, FK506-페이로드 접합체가 표적 세포에 특이적으로 결합할 것이다; 2. FKBP 단백질은 분자량이 12 kDa인 비교적 작은 단백질로, 수용체의 구조 및 내재화 특성에 최소한의 변동을 가해 다른 수용체와 쉽게 융합될 수 있게 한다. 3. FK506은 인간 내부에 자연적으로 존재하지 않기 때문에 융합 수용체가 차단되지 않을 것이다; 4. 페이로드 약물이 높은 친화도로 전달될 수 있도록 FK506-FKBP 사이의 결합 친화도는 약 4 pM이다; 5. FK506-FKBP의 공-결정 구조가 이용가능하고, FK506의 잘 확립된 유도체 부위는 FK506-FKBP의 결합을 유지하면서 FK506과 칼시뉴린 사이의 원치않는 결합을 제거한다(도 2a 참조).
FKBP의 서열이 변형될 수 있고, 상응하는 FK506 리간드는 FKBP의 변형된 버전 및 FK506의 변형된 버전이 본원에 예시된 바와 같이 또는 본 개시내용보다 양호한 바람직한 친화도를 갖는 정도에 따라 변형될 수 있는 것으로 고려된다.
융합 단백질의 다른 부분에 대해, 단량체로서 잘 이해된 내재화 공정을 위해 엽산 수용체(FR)가 선택된다. 선행 연구에 따르면‘매직 카보네이트’연결된 엽산 접합체는 FR을 통해 내재화되고 세포 내부의 환원성 환경에 의해 분열될 수 있음을 알 수 있다. 이 메커니즘을 사용하여 FK506-FKBP 접합체 약물 페이로드는 FR에 의해 내재화되고, 세포질로 방출될 것이다.
CAR T 치료의 큰 잠재력 및 심각한 부작용으로 인해, 여러 개의 제어된 CAR T 세포 디자인이 보고되었다. 이들 중 대부분은 T 세포 활성화를 위해 불린 게이트(boolean gate) 또는 캐스케이드 경로를 통합하여 ON/OFF 스위치에 집중했다(도 3 참조, 왼쪽, CAR T 세포 활성의 음성 및 양성 조절을 나타냄, CAR T 세포의 시공간 제어에 대한 탐구, Sun J. 등. 2015로부터 적응됨). 말콤(Malcolm) K.B. 그룹은 FKBP-카스파제9 융합 단백질을 설계하고, FK506 이량체를 사용하여 표적 세포의 세포자멸사를 유도한다(도 3 참조, 오른쪽, AP1903(FK506 이량체) 유도된 FKBP-카스파제9 매개 세포자멸사 및 AP1903의 구조를 도시함, 채택한 세포 치료에 대한 안전 스위치로서 유도성 세포자멸사, Malcolm K.B. 등 2011로부터 적응됨).
본 발명은 상기 보고된 방법에 비해 여러개의 장점이 있다: 1. 바이너리 ON/OFF 스위치 대신, 본 플랫폼은 여러 종류의 조절 페이로드를 전달하여 표적 세포의 여러 측면을 변경하여 바이너리 ON/OFF 스위치에 비해 큰 가요성을 제공할 수 있다; 2. 제어 모이어티, FK506-페이로드는 소분자이므로, 사전-조작된 세포와 비교하여 선형 제어 및 용량 최적화가 가능하게 한다. 3. 플랫폼은 CAR T 세포뿐만 아니라 많은 다른 줄기 세포 기반 재생 요법에 이용될 수 있다.
이 플랫폼의 가장 참신하고 가장 중요한 부분은 다기능 페이로드이며, 이는 잠재적 부작용을 해결하거나 세포 치료의 효율성을 개선시키기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 세포독성 약물은 하기와 같은 경우에 이식된 세포로 전달될 수 있다: 1. 세포가 과다-증식하여 항CD19 CAR T 세포와 같은 정상 기관 또는 시스템에 영향을 미친다. 2. 세포는 렌티바이러스 기반 유전자 변형 및 줄기 세포의 고유 특성에 있는 종양원성이 된다.
반면에, 일부 세포 치료는 표적 조직의 억제성 미세환경으로 인해 성공률이 낮다. 예를 들어, 고형 종양에 대한 CAR T 세포 치료에서, 낮은 침투 속도 외에, CAR T의 증식 및 활성화는 MDSC 및 종양 세포에 의해 크게 억제된다. 이는 CAR T 세포에서 RORrt 작용제 또는 MAP 키나제 억제제 유도된 T 세포 활성화뿐만 아니라 TLR8 작용제 유도된 그랜자임 B의 발현에 의해 잠재적으로 완화될 수 있다. RORrt와 같은 세포내 표적이 본 발명의 페이로드에 더 적합할 수 있지만, TLR8과 같은 막 수용체는 또한 세포막에 근접하여 접근할 수 있다.
줄기 세포 재생 요법에서, 페이로드는 질병 모델에 따라 더 다양하다. 줄기 세포를 유전자 전달 플랫폼으로 사용하여 개발된 사전-고정된 유전자를 전달하는 대신에, 본 발명은 이식된 세포 및 이들의 미세환경에 미세한 조정을 제공하고, 다양한 소분자 페이로드를 통해 원하는 표현형을 얻는다. 소분자는 FKBP-FRa 과발현된 이식 세포를 특이적으로 표적화하는, FK506에 접합되기 때문에, 소분자의 정상 조직의 비-특이적 표적화 또한 회피된다.
많은 예 중 하나는 골격 재생 요법에서 골절 복구를 위해 중간엽 줄기 세포(MSC)에서 BMP2의 과발현을 유도하는 것이다. 한편, 이 약물 페이로드 전달 시스템을 통해, 이식된 세포에 GSK3 베타 억제제를 도입함으로써 BMP2 및/또는 VEGF의 발현 수준이 증가될 수 있다. GSK3 베타 억제제는 골절 복구에 바람직한 약물이다. 따라서, GSK3 베타 억제제는 이식된 MSC의 기능 및 골절 부위 내의 미세환경을 추가로 조절하기 위한 잠재적인 페이로드로서 이상적이다.
이 약물 페이로드 전달 시스템의 다른 예는 알츠하이머, 파킨슨 병 등을 포함하는 신경퇴행성 질환으로 적용되며, 여기서 MSC 기반 치료는 유망한 미래를 보유하고 있다. MSC는 신경 재생을 촉진하기 위해 GDNF, VEGF 및 많은 다른 사이토카인을 과발현하도록 변형되었다. 한편, MAO-B 억제제와 같은 소분자는 성상세포에서 GDNF, NGF 및 BDNF의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다. PI3K 억제제(BEZ235), Cdk5 억제제(로스코비틴) 및 GSK3b 억제제(NP-12)와 같은 알츠하이머 병의 치료를 위한 여러 키나제 억제제도 제안되어 있다. 신경퇴행성 모델에서 이들 소분자의 MSC로의 특이적 전달을 목표로 하는 FK506-FKBP 쌍을 사용하면, 다른 비-표적 조직에서 이들 강력한 억제제 및 작용제의 부작용을 피하면서 재생 효능을 향상시킬 것이다.
재료 및 방법:
화합물 및 합성 과정:
표적 리간드는 링커를 통해 페이로드와 연결된다. 링커 최적화 옵션이 하기에 열거되어 있다. 페이로드는 3가지 종류로 분류된다: I 이미징, II 세포독성 약물, III 조절 소분자 약물.
링커 최적화:
화합물 분류:
상세한 화합물 구조 및 합성 경로
FK506-로다민:
과정: 디메틸포름아미드 중의 로다민-NHS 에스테르(1.0 당량)를 실온에서 2시간 동안 Boc-NH-PEG3-NH2(1.2 당량) 및 디이소프로필에틸아민(3.0 당량)과 반응시켰다. 생성물을 UV 검출기를 사용하여 분취용 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 정제된 로다민-PEG3-NH-Boc 접합체(1.0 당량)를 1:10 TFA-디클로로메탄 시스템에서 2시간 동안 교반함으로써 Boc 탈보호를 실시하였다. 이어서, 미정제 유리 아민 생성물을 디메틸포름아미드에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(3.0 당량)의 존재하에 EDC(2.0 당량), HOBT(2.0 당량)로 활성화시켰다. 15분 후, FK506-CO2H(1.2 당량, 참고 문헌: Bioorg. Med. Chem., 17(2009) 5763-5768의 과정을 사용하여 합성됨)를 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 최종 FK506-로다민 접합체를 UV 검출기(파장 280 nm에서 모니터링함)를 사용하여 분취용 역상 HPLC 상에서 정제한 후 단리하였다. 미정제 생성물을 Xterra RP18 분취용 HPLC 컬럼(Waters)에 로딩하고, 95% 5 mM 인산 나트륨(이동상 A, pH7.4) 및 5% 아세토니트릴(이동상 B)로 시작하여 12mL/분의 유속으로 35분에 0% A 및 50% B에 도달하는 구배 조건으로 용리시켰다. 7분 분석용 HPLC-MS 분석에서 구배(0~50% B) 동안 생성물 피크의 체류시간 = 2.5분. ESI m/z = 1539.6. 약어: PEG = 폴리에틸렌 글리콜; EDC = 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드; HOBT = 하이드록시벤조트리아졸; HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피.
FK506-NIR 염료:
합성 과정:
SLF-FITC:
합성 과정:
SLF-EC20:
합성 과정:
SLF-투불리신:
합성 과정:
FITC-AF647:
합성 과정:
FITC-DM4:
합성 과정:
과정: 디메틸술폭사이드 중의 DM4(1.0 당량)를 실온에서 1시간 동안 2-(피리딘-2-일디설판일)에탄-1-아민(1.0 당량) 및 디이소프로필에틸아민(3.0 당량)과 반응시켰다. 이어서, 생성된 미정제 생성물을 FITC(1.0 당량)와 반응시키고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 최종 FITC-DM4 접합체를 UV 검출기(파장 280 nm에서 모니터링함)를 사용하여 분취용 역상 HPLC 상에서 정제한 후 단리하였다. 미정제 생성물을 Xterra RP18 분취용 HPLC 컬럼(Waters)에 로딩하고, 95% 5 mM 인산 나트륨(이동상 A, pH7.4) 및 5% 아세토니트릴(이동상 B)로 시작하여 12mL/분의 유속으로 10분에 0% A 및 100% B에 도달하는 구배 조건으로 용리시켰다. 7분 분석용 HPLC-MS 분석에서 구배(0~100% B) 동안 생성물 피크의 체류 시간 = 4.23분. ESI m/z = 1244.8. 약어: FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피.
FITC-Tub
합성 과정:
FITC-EC20
합성 과정:
FITC-다사티닙
합성 과정:
실험 과정:
세포 배양
293TN 세포를 렌티바이러스 패키징을 위한 항생제가 없는 10% FBS와 함께 DMEM에서 배양하였다. Raji 및 Jurkat 세포를 10% FBS, 10% 페니실린/스트렙토마이신과 함께 RPMI-1640에서 배양하였다. ficoll을 사용하여 1차 인간 T 세포를 hPBMC에서 분리하고, EasySep™ 인간 T 세포 강화 키트(19051, Stemcell Tech)에 의한 음성 선택으로 강화시키고, 1일 동안 Dynabeads CD3/CD28(11161D, Thermo Fisher)에 의해 활성화시키고, 30IU hIL2(130-097-745, Miltenyi Biotec Inc.)가 보충된 TexMACS 배지로 배양하였다. T 세포를 20% 인간 AB 혈청(HP1022, Valley Biomedical) 및 10% DMSO와 함께 RPMI-1640에서 동결보존하였다.
렌티바이러스 패키징
리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 사용하여 트랜스진 발현 벡터 및 패키징 플라스미드 믹스(CPCP-K2A, Cellecta)에 의한 293TN 세포의 형질감염을 통해 Pantropic VSV-G 유사형 렌티바이러스가 생산되었다. 24시간에, 바이러스 상청액을 수확하고, 농축한 다음, 특정 세포주, 또는 같은 날 해동된 1차 T 세포에 첨가하였다. T 세포 형질도입을 위해, 바이러스 상청액 및 8 ug/ml 폴리브렌을 첨가한 후 37도에서 2500 rpm에서 90분 동안 세포를 원심분리하였다.
결합 분석
결합 분석을 위해, 세포를 4도에서 30분 동안 리간드-염료 단독 또는 리간드-염료 및 유리 리간드(100x, 30분 동안 사전배양된)와 함께 배양하였다. 배양 후 세포를 3회 세척하고, 2% FBS PBS에 재-현탁시키고, 7-AAD를 첨가하여 죽은 세포를 게이트 아웃시켰다. FK506-로다민 및 FA-S0456의 FRET 영상화: 융합 수용체의 점유를 이해하기 위해, FKBP-FRa+ jurkat 세포는 지시된 서열 및 농도에서 FA/FA-S0456, FK506/FK506-로다민과 함께 배양한다. FRET는 BD Fortessa 유세포 분석기에 의해 검출되는, 동일하거나 근처의 수용체에서 FA-OTL38로 그의 에너지가 전달될 때 FA-로다민의 강도 손실에 의해 시각화된다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석했다.
GPI 고정된 단백질을 방출하기 위한 PI-PLC 처리
1x105 세포를 30분 동안 37도에서 소화 완충액(2% BSA)에서 5 mU 또는 50 mU PI-PLC(P5542-5UN, Sigma)와 함께 배양하고; 배양 후, 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 리간드-염료와 함께 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다.
세포 생존력 분석
세포를 96 웰 플레이트에 시딩하고, 유리 리간드 경쟁의 100x 사전배양과 함께 또는 없이, 2시간 동안 상이한 농도의 특정 리간드-세포독성 약물과 함께 배양하였다. 2시간 배양 후, 세포를 따뜻한 배지로 3회 세척하고, 새로운 배지로 보충하였다. 72시간 후, CellTiter-Glo® 분석(G7570, Promega)에 의해 세포 수를 시험하거나, 수용체 양성 세포의 리간드-염료 염색에 의해 정량화하였다.
CAR T 세포 용해 효과
1x105 CAR T 및 특정 수의 Raji 세포를 처리 약물의 존재 또는 부재하에 E:T 비에 따라 96 웰 플레이트에서 공동 배양하였다. 24시간 후, LDH 분석을 위해 100 ul 상청액을 꺼내었다. 용해 백분율은 (치료군 - CAR T 단독)/(최대 용해-CAR T 단독)%로 계산되었다.
CAR T 세포의 소진
1x106 Raji 세포를 배지 교체 없이 12시간마다 24 웰 플레이트에서 1x106 CAR T 세포에 반복적으로 첨가하였다. 소진 상태는 공-억제 분자: PD-1, LAG-3 및 Tim-3의 보다 낮은 용해 효과 및 보다 높은 발현을 특징으로 하였다.
리간드-세포독성 약물에 의한 융합 수용체 양성 CAR T의 생체내 절제
4x105 luc+ Raji 세포를 NSG 마우스에 정맥내 주사하였다. 6일 후, 1x107 융합 수용체 양성 CAR T 세포를 정맥내 주사하였다. 8일에, 리간드-세포독성 약물(0.5 umole/kg, 1 umole/kg)을 1회 정맥내 주사하였다. CAR T 주사 후 3일마다 채취한 혈청 샘플을 사용하여 ELISA에 의해 IL2, INFr을 측정하였다. 말초 혈액내 CAR T 세포를 유세포 분석에 의해 계수하였다.
리간드-약물에 의한 융합 수용체 양성 CAR T의 생체내 조절
4x105 luc+ Raji 세포를 NSG 마우스에 정맥내 주사하였다. 6일 후, 1x107 융합 수용체 양성 CAR T 세포를 정맥내 주사하였다. 7일에, 리간드-약물 약물(0.5 umole/kg, 1 umole/kg)을 1회 정맥내 주사하였다. CAR T 소진 모델의 경우, 6일에 1x105 CAR T를 정맥내 주사하고, CAR T 집단이 말초 혈액에 나타나고 종양 부담이 안정화되지 않고 계속 증가하면, 리간드-약물(0.5 umole/kg, 1 umole/kg)을 정맥내 주사하였다.
융합 수용체 양성 CAR T의 생체내 영상화 및 추적
2x106 Raji를 NSG 마우스의 오른쪽에 피하 주사하였다. 14일 후, 1x107 융합 수용체 양성 CAR T를 정맥내 주사하였다. 16일에, 동물에게 정맥내 주사에 의해 99mTc-결합 접합체(10 nmol, 150 μCi)를 투여하고, SPECT 영상화 기계에 의해 영상화하였다.
실시예
1. 융합 단백질 설계 및 그의 발현
1.1 FKBP-FR 융합 수용체(서열번호 2)의 설계
FK506 유도체의 합성: FK506-로다민 및 FK506-투불리신 합성은 재료 및 방법 섹션에 기재되어 있다.
hFRa는 신호 펩타이드로서 N 말단에 24개의 아미노산을 갖는 GPI 고정된 막 단백질이다. 막 제시 및 내재화 특성을 보존하기 위해, FRa의 전장을 사용하기 위해 선택하고, hFKBP 서열과, hFRa의 T24와 R25 사이의 가요성 펩타이드 링커(SGGGS)를 통합한다(도 4a). 가요성 링커는 인체에서 일반적인 효소 소화에 내성이 있도록 선택된다. 이어서, 전체 서열을 pWPI 렌티바이러스 발현 벡터에 삽입하고, 형질도입된 T 세포에서 단백질 발현을 위한 바람직한 프로모터로서 EF1a를 사용한다.
1.2 형질도입된 세포에서 FKBP-FR 융합 수용체의 발현
FKBP-FRa의 발현은 렌티바이러스 형질도입된 K562에서 웨스턴 블롯에 의해 확인된다. 형질도입된 K562 세포 용해는 hFRa 항체에 대한 형질도입되지 않은 세포와 비교하여 약 50 kDa의 특이적 밴드를 보여준다(도 4b).
1.3 FKBPFR3GS의 융합 단백질 작제(FF3으로 표시됨)
도 4d(서열번호 12)를 참조한다. N 말단에서 C 말단까지는 신호 펩타이드로서 1~24 aa의 인간 FRa, 인간 FKBP 단백질, 3개의 Gly-Ser 링커 및 이어서 2~258 aa의 인간 FRa를 갖는다. FKBPFR1GS(FF1로 표시됨)의 작제물 설계에서, FF3의 3개의 Gly-Ser 링커는 다른 부분이 변경되지 않은 하나의 Gly-Ser 링커로 치환된다. 결합 분석법에 나타난 바와 같이, 링커 길이를 증가시키면 융합 단백질에서 두 성분 사이의 간섭이 감소된다.
1.4 GS 링커를 이용한 FITC-svFv-FR의 융합 단백질의 작제.
도 4e를 참조한다. 작제물은 또한 4M5.3 FR(서열번호 13)로 명명된다. N-말단에서 C-말단으로, hCD8 신호 펩타이드, (FITC에 대한) 4M5.3의 svFv, GS 링커, 25~258 aa의 인간 FRa를 갖는다.
1.5. FK506-99mTc PET 영상화에 의한 FKBP-FRa/FKBPtFRa 양성 세포의 생체내 비침습적 추적
CAR T 세포 모델의 경우, 1x106 KB 세포를 NSG(잭슨(Jackson) 연구소)에 피하 이식한다. 종양이 100 mm3에 도달한 후, 1500만 항-FITC CAR+ FKBP-FRa+ 또는 항-FITC CAR+ FKBP-FRa-인간 T 세포를 마우스에 정맥내 주사하였다. FITC-FA는 CAR T의 증식을 유도하기 위해 지시된 날에 주사한다. 마우스를 CAR T 이식 후 2일마다 다음 과정에 의해 영상화한다. 영상화 당일, 이전 보고서에 따라 99mTc로 FK506-EC20 헤드를 제조하였다. 100 ul 용액 중 200uCi 99mTc를 각 마우스에 정맥내 주사하고, 전신 이미지를 MiLab PET/CT에 의해 촬영하여, 종양 영역, 비장 및 림프절에 초점을 맞춘다. PMOD 소프트웨어로 3D 이미지를 재구성한다. CAR T 이식 후 약 10일째에 마지막 영상화 후, 마우스를 안락사시키고, 각 장기내 99mTc 분포를 감마 카운터에 의해 계수한다.
조혈 줄기 세포 이식 모델의 경우, 인간화된 NSG 마우스가 이전에 보고된 바와 같이 생성된다. 1천만개의 CD34+ FKBP-FRa+ hHSC를 인간화된 NSG 마우스에 정맥내 주입한다. 4개월 후, 골수 및 척추에 초점을 맞추면서, 상기 언급된 바와 같이 FK506-99mTc를 사용하여 전신 이미지를 촬영한다.
2. FKBP-FRa 융합 수용체는 FK506-페이로드에 특이적으로 결합 및 내재화한다
2.1 FKBP-FRa 융합 수용체는 FK506-로다민에 특이적으로 결합한다
결합 분석을 위해, 세포를 4도에서 30분 동안 리간드-염료 단독 또는 리간드-염료 및 유리 리간드(100x, 30분 동안 사전배양된)와 함께 배양하였다. 배양 후 세포를 3회 세척하고, 2% FBS PBS에 재현탁시키고, 7-AAD를 첨가하여 죽은 세포를 게이트 아웃시켰다. BD Fortessa 유세포 분석기를 사용하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석했다.
2.2. FKBP-FRa 융합 수용체에 의한 FK506-로다민의 결합(FK506-로다민 및 FA-S0456의 FRET 영상화)
융합 수용체의 점유를 이해하기 위해, FKBP-FRa+ jurkat 세포를 지시된 서열 및 농도에서 FA/FA-S0456, FK506/FK506-로다민과 함께 배양한다. FRET는 BD Fortessa 유세포 분석기에 의해 검출되는, 동일하거나 근처의 수용체에서 FA-OTL38로 그의 에너지가 전달될 때 FA-로다민의 강도 손실에 의해 시각화된다.
도 5는 FKBPFR1GS 융합 단백질에서 엽산의 결합이 0.01 nM만큼 낮은 FK506-로다민의 결합을 차단하고, 50 nM에서 FK506 로다민 결합을 완전히 폐지함을 보여준다.
도 6은 FKBPFR1GS jurkat 세포가 엽산 수용체 표적 염료인 OTL38에 결합한 후 FK506-로다민 강도가 감소되었음을 보여준다. FK506-로다민(공여체)에서 OTL38(FA-S0456, 수용체(acceptor), ex/em:774/794nm)로의 FRET는 융합 수용체내에서 FR과 FKBP 사이의 상호작용을 나타낸다.
도 7은 FKBP와 FR 사이의 링커 길이를 증가시키는 것이 융합 단백질의 두 성분 사이의 간섭을 상당히 낮춘다는 것을 보여준다. FF1(FKBP와 FR 사이의 1GS)과 비교하면, FF3(FKBP와 FR 사이의 3GS)은 10 nM FA의 존재 하에 FK506-로다민의 결합을 유지하는데, 이는 인체내 FA의 생리학적 농도와 비슷하다.
2.3. GPI 고정된 FF3 융합 수용체의 방출
FF3 융합 단백질을 갖는 PI-PLC 처리 T 세포를 사용하여 GPI 고정된 수용체 FF3의 방출을 초래하였다. FF3 융합 수용체를 갖는 Jurkat T 세포는 20 nM FA-FITC(EC17)와의 포화된 결합을 나타내는 반면, 5 mU PI-PLC 또는 50 mU PI-PLC 처리 후 FA-FITC는 세포에 대한 결합을 잃어 GPI 고정된 FF3 융합 수용체의 방출을 나타낸다. 도 8을 참조한다.
2.4 인간 T 세포에서 융합 단백질 FKBPFR3GS는 FR 결합 특성을 유지한다
FA-로다민 결합 곡선은 FKBPFR3GS 융합 수용체에 제시되어 있다. 인간 T 세포상에서 안정적으로 발현된 FKBPFR3GS 융합 수용체는 FR+ KB 세포내 FA-로다민의 친화도(Kd 약 1 nM)와 비슷한, 높은 친화도(Kd = 0.95 nM)로 엽산 유도체(FA-로다민)에 결합할 수 있다. 따라서, 융합 수용체에서 FR의 결합 특성이 유지된다. 도 9를 참조한다.
2.5 인간 T 세포내 융합 단백질 FKBPFR3GS는 FKBP 결합 특성을 유지한다
FKBPFR3GS 융합 수용체에서의 FK506-로다민 결합 곡선. 인간 T 세포 상에서 안정적으로 발현된 FKBPFR3GS 융합 수용체는 높은 친화도(Kd = 3.93 nM)로 FK506 유도체(FK506-로다민)에 결합할 수 있으며, 이는 융합 수용체에서 FKBP의 결합 특성이 보존됨을 의미한다. 도 10을 참조한다.
2.6 SLF-FITC는 상대적으로 높은 결합 친화도(Kd = 62 nM)로 FKBPFR3GS 융합 수용체에 결합한다
유리 SLF(100, 사전배양)의 경쟁은 SLF-FITC 결합을 차단한다. FK506의 모방인 SLF는 모체 리간드 FK506과 비교하여, FKBPFR 융합 수용체에 대한 10배 더 낮은 결합 친화도를 나타낸다. 도 11을 참조하고, 도 10과 비교한다.
2.7 4M5.3FR 융합 수용체에서 FA-로다민의 결합 곡선.
FA-로다민은 FR+ KB 세포(Kd 약 1 nM)내 FA-로다민의 친화도와 비슷한, 높은 친화도(Kd = 2.25 nM)로 인간 T 세포에서 안정적으로 발현된 4M5.3FR 융합 수용체에 결합할 수 있다. 따라서, FR 결합 특성은 4M5.3FR 융합 수용체에서 보존된다. 도 12를 참조한다.
2.8 4M5.3FR 융합 수용체에서의 FITC-AF647 결합 곡선.
FITC-AF647은 높은 친화도(Kd = 8.03 nM)로 인간 T 세포에서 안정적으로 발현되는 4M5.3FR 융합 수용체에 결합할 수 있다. 100x comp는 유리 FITC 나트륨을 나타낸다. FITC와 scFv 4M5.3의 결합 특성은 4M5.3FR 융합 수용체에서 보존된다. 도 13을 참조한다.
3.1. FF3+ 인간 T 세포에 대한 FA-투불리신 사멸 효과
FA-투불리신은 FF3+ 인간 T 세포에 대한 수용체 특이적 사멸 효과를 매개할 수 있다. FA를 통한 보상(FA를 사용한 100x 사전배양)은 효과를 차단한다. 이는 FF3 융합 수용체 시스템을 통한 유리 약물 투불리신의 성공적인 내재화 및 방출을 의미한다. 도 14를 참조한다.
3.2 혼합된 인간 T 세포 배양액에서 hFF3+ 집단에 대한 FA-투불리신 사멸 효과.
FA-투불리신은 혼합된 인간 T 세포 배양액에서 hFF3+ 집단을 특이적으로 사멸시킨다. FA-Tub 농도가 증가함에 따라 hFF3+ 세포의 백분율이 감소한다. 도 15를 참조한다.
3.3 SLF-Tub는 IC 50 = 138 nM으로 hFF3+ Jurkat 세포를 특이적으로 사멸시킨다.
hFF3 Jurkat 세포와 SLF-Tub의 2시간 배양은 수용체 양성 세포를 사멸시킬 수 있다. 이는 FKBPFR3GS 융합 수용체에 의한 SLF-Tub의 성공적인 내재화와 세포 내부의 투불리신의 방출을 나타낸다. 도 16을 참조한다.
3.4. 4M5.3FR+ 인간 T 세포에 대한 FITC-DM4 및 FITC-Tub 사멸 효과
FITC-DM4 및 FITC-Tub는 모두 4M5.3FR+ 인간 T 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 반면, FITC-Tub는 IC50이 더 높다. 유리 FITC 나트륨(100x 사전배양)의 보상은 수용체 매개된 사멸 효과를 차단한다. 이는 4M5.3FR 융합 수용체를 통해 FITC-세포독성 약물의 T 세포 내로의 성공적인 내재화 및 방출을 의미한다. 도 17을 참조한다.
3.5. FITC-투불리신은 혼합된 인간 T 세포 배양액에서 4M5.3FR+ 집단을 특이적으로 사멸시킨다.
FITC-Tub 농도가 증가함에 따라 4M5.3FR+ 세포의 절대 수는 감소하는 반면, 4M5.3FR- 세포는 방출된 약물 및 고농도에서 방관자 효과를 통해 사멸된다. 도 18을 참조한다.
3.6. FITC-DM4는 혼합된 인간 T 세포 배양에서 4M5.3FR+ 집단을 특이적으로 사멸시킨다.
FITC-DM4 농도가 증가함에 따라 4M5.3FR+ 세포의 절대 수는 감소하는 반면, 4M5.3FR- 세포는 방출된 약물 및 고농도에서 방관자 효과를 통해 사멸된다. 도 19를 참조한다.
3.7 CD19+ Raji에 대한 항CD19 CAR T 세포에 미치는 키나제 억제제 조절 효과
10 nM 농도의 다사티닙(Lck 억제제) 및 이브루티닙(ITK 억제제)은 CD19+ Raji 종양 세포(표적)에 대한 항CD19 CAR T 세포(FMC63 CAR T, 이펙터)의 용해 효과를 감소시킨다. 2개의 이펙터:표적 비율(E:T)을 시험하였다. 정상 T 세포, 및 CD19-K562 세포를 갖는 항CD19 CAR T를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 20을 참조한다.
3.8. FITC-다사티닙은 FMC63+4MFR+hT 세포의 Raji 세포로의 용해 효과를 감소시킬 수 있다.
이는 4M5.3FR 융합 수용체를 통해 FITC-다사티닙의 T 세포로의 성공적인 내재화 및 방출 및 T 세포로의 다사티닙의 방출을 의미한다. 도 21을 참조한다.
3.9 100 nM 농도에서의 TC-PTP 억제제는 소진된 항CD19 CAR T 세포에서 공동-억제제 분자 집단을 감소시킨다
소진된 항CD19 CAR T 세포는 CD19+ Raji 세포로 7회 자극함으로써 생성된다(재료 및 방법 섹션의 상세한 과정 참조). 치료시 PD-1 양성, LAG3 양성 및 이중 양성 집단이 감소한다. 도 22를 참조한다.
4. 세포 치료의 활성을 제어하기 위한 기타 FK506-페이로드
이 약물 페이로드 전달 시스템의 기술적인 유리한 특징은 다-기능성을 갖는 것이다. 잠재적인 페이로드 및 해당 효과는 하기와 같다(표 1). 소분자 페이로드는 하기 파라미터에 기초하여 선택된다: 1. 시험관내 및 생체내 모두에서 유리 약물의 기능 분석은 공개된 문헌 또는 연구실에서 확인되었다. 2. 약물의 화학 구조는 유도체화를 위해 비교적 더 접근가능한 유리 아민을 갖는다. 3. 임의의 하기가 바람직할 것이다: FDA 인가된 약물; 합리적인 가격으로 시판. FK506-페이로드는 시험관내 실험을 위해 먼저 시험될 것이고, T 세포 활성화 및 줄기 세포 사이토카인 방출은 다중 면역분석에 의해 모니터링될 것이다. 생체내 질환 모델의 경우, 본 연구실에서 CAR T 치료 및 골절 마우스 모델을 잘 확립하고, 신경퇴행성 마우스 모델을 위한 여러 잠재적 협력자를 확립하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Purdue Research Foundation <120> FUSION PROTEIN AND LIGAND-PAYLOAD BASED DRUG DELIVERY FOR CELL THERAPY <130> 67762-02 <150> 62/460,118 <151> 2017-02-17 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 367 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence for mouse FKBP-FRa with linker peptide <400> 1 Met Ala His Leu Met Thr Val Gln Leu Leu Leu Leu Val Met Trp Met 1 5 10 15 Ala Glu Cys Ala Gln Ser Arg Ala Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser 20 25 30 Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val 35 40 45 His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg 50 55 60 Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Thr Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile 65 70 75 80 Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala 85 90 95 Lys Leu Ile Ile Ser Ser Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro 100 105 110 Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu 115 120 125 Lys Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Thr Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu 130 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Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu 945 950 955 960 Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg 965 970 975 Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn 980 985 990 Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala 995 1000 1005 Gly Pro Trp Ala Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met 1010 1015 1020 Leu Leu Trp Leu Leu Ser 1025 <210> 16 <211> 255 <212> PRT <213> artificial <220> <223> FRb with signal peptide <400> 16 Met Val Trp Lys Trp Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Val Cys Val Ala 1 5 10 15 Thr Met Cys Ser Ala Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met 20 25 30 Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His 35 40 45 Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr 50 55 60 Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp 65 70 75 80 Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln 85 90 95 Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln 100 105 110 Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu 115 120 125 Cys Lys Glu Asp Cys Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His 130 135 140 Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val 145 150 155 160 Asn Lys Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe 165 170 175 Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys 180 185 190 Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe 195 200 205 Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala 210 215 220 Ala Ala Met His Val Asn Ala Gly Glu Met Leu His Gly Thr Gly Gly 225 230 235 240 Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Gln Leu Trp Leu Leu Gly 245 250 255 <210> 17 <211> 335 <212> PRT <213> artificial <220> <223> uPAR with signal peptide <400> 17 Met Gly His Pro Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu His Thr Cys 1 5 10 15 Val Pro Ala Ser Trp Gly Leu Arg Cys Met Gln Cys Lys Thr Asn Gly 20 25 30 Asp Cys Arg Val Glu Glu Cys Ala Leu Gly Gln Asp Leu Cys Arg Thr 35 40 45 Thr Ile Val Arg Leu Trp Glu Glu Gly Glu Glu Leu Glu Leu Val Glu 50 55 60 Lys Ser Cys Thr His Ser Glu Lys Thr Asn Arg Thr Leu Ser Tyr Arg 65 70 75 80 Thr Gly Leu Lys Ile Thr Ser Leu Thr Glu Val Val Cys Gly Leu Asp 85 90 95 Leu Cys Asn Gln Gly Asn Ser Gly Arg Ala Val Thr Tyr Ser Arg Ser 100 105 110 Arg Tyr Leu Glu Cys Ile Ser Cys Gly Ser Ser Asp Met Ser Cys Glu 115 120 125 Arg Gly Arg His Gln Ser Leu Gln Cys Arg Ser Pro Glu Glu Gln Cys 130 135 140 Leu Asp Val Val Thr His Trp Ile Gln Glu Gly Glu Glu Gly Arg Pro 145 150 155 160 Lys Asp Asp Arg His Leu Arg Gly Cys Gly Tyr Leu Pro Gly Cys Pro 165 170 175 Gly Ser Asn Gly Phe His Asn Asn Asp Thr Phe His Phe Leu Lys Cys 180 185 190 Cys Asn Thr Thr Lys Cys Asn Glu Gly Pro Ile Leu Glu Leu Glu Asn 195 200 205 Leu Pro Gln Asn Gly Arg Gln Cys Tyr Ser Cys Lys Gly Asn Ser Thr 210 215 220 His Gly Cys Ser Ser Glu Glu Thr Phe Leu Ile Asp Cys Arg Gly Pro 225 230 235 240 Met Asn Gln Cys Leu Val Ala Thr Gly Thr His Glu Pro Lys Asn Gln 245 250 255 Ser Tyr Met Val Arg Gly Cys Ala Thr Ala Ser Met Cys Gln His Ala 260 265 270 His Leu Gly Asp Ala Phe Ser Met Asn His Ile Asp Val Ser Cys Cys 275 280 285 Thr Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Val Gln Tyr Arg Ser 290 295 300 Gly Ala Ala Pro Gln Pro Gly Pro Ala His Leu Ser Leu Thr Ile Thr 305 310 315 320 Leu Leu Met Thr Ala Arg Leu Trp Gly Gly Thr Leu Leu Trp Thr 325 330 335 <210> 18 <211> 187 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DHFR <400> 18 Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly 1 5 10 15 Ile Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe 20 25 30 Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln 35 40 45 Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys 50 55 60 Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu 65 70 75 80 Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp 85 90 95 Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met 100 105 110 Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His 115 120 125 Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu 130 135 140 Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu 145 150 155 160 Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile 165 170 175 Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp 180 185 <210> 19 <211> 255 <212> PRT <213> artificial <220> <223> scFv against FITC: 4M5.3(Kd = 200pM) <400> 19 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Val Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Ser Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala 115 120 125 Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Gly Val Lys Leu Asp Glu Thr 130 135 140 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ala Met Lys Leu Ser Cys Val 145 150 155 160 Thr Ser Gly Phe Thr Phe Gly His Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln 165 170 175 Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gln Phe Arg Asn Lys Pro 180 185 190 Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 195 200 205 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn 210 215 220 Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Ala Ser Tyr 225 230 235 240 Gly Met Glu Tyr Leu Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 245 250 255 <210> 20 <211> 244 <212> PRT <213> artificial <220> <223> scFv against FITC 4D5Flu (Kd=10nM) <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr 165 170 175 Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly 210 215 220 Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 21 <211> 244 <212> PRT <213> artificial <220> <223> scFv against DNP SPE7 <400> 21 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu 130 135 140 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp 145 150 155 160 Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp 165 170 175 Pro Asn Gly Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala 180 185 190 Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser 195 200 205 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Trp 210 215 220 Tyr Tyr Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser

Claims (60)

  1. a. 이식용 표적 세포상의 조작된 단백질로서, 상기 조작된 단백질은 제1 성분 및 제2 성분으로 이루어지고, 상기 제1 성분 및 제2 성분은 펩타이드 링커에 의해 연결되고, 상기 제1 성분은 비-막 단백질이고, 상기 제2 성분은 막 고정된 펩타이드 또는 단백질인, 조작된 단백질;
    b. 링커에 접합된 소형 리간드로서, 상기 소형 리간드는 조작된 단백질의 적어도 하나의 성분에 대해 고유의 결합 친화도를 가지는, 소형 리간드; 및
    c. 링커에 접합된 약물의 페이로드(payload)로서, 상기 약물의 페이로드는 상기 소형 리간드가 상기 조작된 단백질의 적어도 하나의 성분에 결합할 때 표적 세포와 관련되는, 약물의 페이로드
    를 포함하는, 세포 치료용(for cell therapy) 약물 전달 플랫폼으로서,
    상기 제1 성분은 FK506 결합 단백질(FKBP)이고,
    상기 제2 성분은 상기 제1 성분 상에 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커를 부여하고, 엽산 수용체 알파(FRa) 또는 엽산 수용체 베타(FRb)로 이루어지는 펩타이드이고,
    상기 소형 리간드는
    FK506 ,
    FK506 유도체 ,
    SLF (FKBP의 합성 리간드) ,
    SLF 유도체 ,
    FA (엽산) , 또는
    FA 유도체 (R은 알킬기임)
    이고,
    상기 펩타이드 링커는 SGGGS의 적어도 하나의 세그먼트이고,
    상기 링커는 알킬, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프롤린, 올리고-(4-피페리딘 카르복실산), 올리고피페리딘, 펩타이드, 사카로-펩타이드 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이고,
    상기 약물의 페이로드는 로다민, 플루오레세인 이소티오시아네이트, S0456, EC20 킬레이트 헤드, NOTA(1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산), DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), 투불리신, DM1, DM4, 아우리스타틴, 다사티닙, MEK1/2 억제제, PI3K 억제제, HDAC 억제제, 키나제 억제제, 대사 억제제, GSK3 베타 억제제, MAO-B 억제제, Cdk5 억제제, RORγt 작용제, SHP1/2 억제제, TC-PTP 억제제, 및 siRNA mi181a1으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것인, 세포 치료용 약물 전달 플랫폼.
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  10. 제1항에 있어서, 이식용 표적 세포는 면역 세포, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 또는 이들 모두인, 약물 전달 플랫폼.
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  13. 제1항 또는 제10항에 있어서, 세포 치료 효과를 조절하는 방법에 사용하기 위한 것으로, 세포 치료 기능을 보유하는 확인된 이식용 표적 세포는 약물 전달 플랫폼과 접촉되고, 페이로드는 표적 세포 내에서 방출되어 표적 세포 치료 기능을 조절하는, 약물 전달 플랫폼.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포 치료 기능은 광학적으로 유도된 수술을 제공하거나, 표적 세포 증식을 제어하거나, 또는 표적 세포에 세포 독성을 실행하는 것인, 약물 전달 플랫폼.
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