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KR102587442B1 - 항-cd47 항체 또는 그 적용 - Google Patents

항-cd47 항체 또는 그 적용 Download PDF

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KR102587442B1
KR102587442B1 KR1020217008708A KR20217008708A KR102587442B1 KR 102587442 B1 KR102587442 B1 KR 102587442B1 KR 1020217008708 A KR1020217008708 A KR 1020217008708A KR 20217008708 A KR20217008708 A KR 20217008708A KR 102587442 B1 KR102587442 B1 KR 102587442B1
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용 왕
리웬 자오
치펑 송
용치앙 주
야난 장
루웨이 한
리앙 진
웬밍 우
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난징 산홈 팔마세우티칼 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 항체 약물(antibody drugs)의 기술 분야에 관한 것으로, 특히 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물과 이의 응용에 관한 것이다. 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상당한 항종양 활성 및 인간 CD47 단백질에 대한 높은 친화성을 가지며, 세포 표면에서 CD47에 결합하는 SIRPa의 능력(capability)을 제거할 수 있으며, 현저한 혈액 응집 활성을 갖지 않으므로 항종양 약물의 제조에 적용될 수 있다.

Description

항-CD47 항체 또는 그 적용
본 명세서는 항체 약물의 기술 분야에 관한 것으로, 특히 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment), 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물, 및 그 용도에 관한 것이다.
인테그린 관련 단백질(IAP)로 알려진 CD47 단백질은 IgG 슈퍼 패밀리에 속한 여러 조직과 세포에서 널리 발현되는 5-스팬(five-span) 막 관통 당단백질이다. CD47는 리간드 TSP-1 또는 SIRPα에 결합하여 세포의 이동, 부착 및 아포토시스(apoptosis), 축삭 확장(axon extension), 사이토카인 생산뿐만 아니라 T 세포 활성화 등을 포함하는 다양한 세포 기능을 조절 할 수 있다. SIRPα은 전형적인 면역 수용체 티로신-기반 저해 모티브(ITIM)를 포함하는 막 관통 단백질이며, 주로 대식세포, 수지상 세포 등의 골수 조혈 세포의 세포막 표면에 발현된다. CD47의 SIRPα에 대한 결합은 ITIM의 인산화와 그 결과로서의 SHP-1/SHP-2의 동원을 유도하고, 이는 식세포 시냅스(phagocytic synapses)에서 미오신 IIA의 축적을 더욱 저해하고, 결국 식세포의 식세포 기능을 저해한다.
종양 세포의 "면역 회피(immune escape)"는 종양 형성, 종양 발생 및 약물 내성의 주요 메커니즘으로 간주된다. 대식세포의 표면에서 SIRPα와 상호 작용하는 CD47 분자의 높은 발현을 통해 종양 세포는 대식세포의 식세포 활성을 현저하게 억제하고 대식세포에 의해 삼켜지는 것을 피할 수 있다. CD47의 SIRPα에 대한 결합이 차단되면, 종양으로 인한 면역 억제 또는 면역 관용이 제거되고, 종양 세포가 효과적으로 사멸될 수 있다. 이는 표적 종양 면역 요법의 표적으로써 CD47을 대상으로 하기 위한 매우 강력한 이론적 기초를 제공한다.
최근 항-CD47 항체, 항-SIRPα 항체, 재조합 SIRPα 단백질 및 이중특이적(bispecific) 항체 등과 같이 국내외에서 CD47/SIRPα 신호 전달 경로를 표적으로하는 다양한 치료에 대해 많은 연구가 이루어지고 있다. 이 중 CD47 차단 항체는 가장 유망한 종양 치료 요법으로 간주되고 있다. 인간 CD47 차단 단일클론 항체의 효과는 림프종, 방광암, 결장암, 교모세포종, 유방암, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 등과 같은 다양한 전임상 모델에서 확인되었다.
나아가, 적혈구 및 혈소판도 CD47 분자를 발현하기 때문에, 항체가 CD47와 SIRPα 사이의 상호 작용을 차단하면, 이러한 세포는 "날 먹지 마라(don't eat me)" 신호의 보호를 잃고 그로 인해 대식 세포에 의한 식균 작용에 노출될 가능성 이 높다. 따라서, 혈소판 분해, 적혈구 응집, 적혈구의 고갈, 빈혈 등과 같은 항-CD47 항체의 부작용은 피해야 한다. 이는 항-CD47 항체를 적용할 때 또한 중요한 고려 사항이다.
따라서 우수한 항종양 활성을 가지며, 현저한(significant) 혈구 응집 활성을 갖지 않는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공할 필요가 있다.
본 발명의 일 견지는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 중쇄가변 영역의 상보성 결정 영역 1(HCDR1), 중쇄 사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역 2(HCDR2)의 및/또는 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 3(HCDR3)을 포함하며; 그리고 경쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1(LCDR1), 경쇄 가변 영역 의 상보성 결정 영역 2(LCDR2) 및/또는 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 3(LCDR3)을 포함한다.
일부 구현에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서
(1) 중쇄 가변 영역은 다음 그룹에서 선택된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고:
(a1) 서열 번호: 1, 2 및 3에 개시된 아미노산 서열,
(a2) 서열 번호: 10, 2 및 11에 개시된 아미노산 서열,
(a3) 서열 번호: 4, 5 및 6에 개시된 아미노산 서열,
(a4) 서열 번호: 7, 8 및 9에 개시된 아미노산 서열, 및
(a5) (a1), (a2), (a3), 또는 (a4)에 개시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 CDR; 그리고
(2) 경쇄 가변 영역은 다음 그룹에서 선택된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다:
(a6) 서열 번호: 12, 13 및 14에 개시된 아미노산 서열,
(a7) 서열 번호: 15, 16 및 17에 개시된 아미노산 서열,
(a8) 서열 번호: 18, 19 및 20에 개시된아미노산 서열, 및
(a9) (a6), (a7,) 또는 (a8)에 개시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 CDR.
특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 각각 서열 번호: 1, 2 및 3에 개시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 또는 서열 번호: 1, 2 및 3에 개시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함하고; 그리고 경쇄 가변 영역은 각각 서열 번호: 12, 13 및 14에 개시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 또는 서열 번호 12, 13 및 14에 개시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함한다.
특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 각각 서열 번호: 10, 2 및 11에 개시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 또는 서열 번호: 10, 2 및 11에 개시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함하고; 그리고 경쇄 가변 영역은 각각 서열 번호: 12, 13 및 14에 개시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 또는 서열 번호: 12, 13 및 14에 개시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함한다.
특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 각각 서열 번호: 4, 5 및 6에 개시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 또는 서열 번호: 4, 5 및 6에 개시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함하고; 그리고 경쇄 가변 영역은 각각 서열 번호: 15, 16 및 17에 개시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 또는 서열 번호: 15, 16 및 17에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함한다.
특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 각각 서열 번호: 7, 8 및 9에 개시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 또는 서열 번호: 7, 8 및 9에 개시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함하고; 그리고 경쇄 가변 영역은 각각 서열 번호: 18, 19 및 20에 개시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 또는 서열 번호: 18, 19 및 20에 개시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함한다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 쥣과(murine) 유래 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서
(1) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 다음으로부터 선택되며:
(b1) 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23 및 서열 번호 27에 개시된 아미노산 서열,
(b2) 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 (b1)에 기재된 아미노산 서열로부터 유래되고 (b1)에 기재된 아미노산 서열과 기능적으로 동일하거나 유사한 아미노산 서열, 및
(b3) (b1)에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 그리고
(2) 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 다음으로부터 선택된다:
(b4) 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 28에 개시된 아미노산 서열,
(b5) 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 (b4)에 기재된 아미노산 서열로부터 유래되고 (b4)에 기재된 아미노산 서열과 기능적으로 동일하거나 유사한 아미노산 서열, 및
(b6) (b4)에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호: 21, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호: 21로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 21과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 24, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 24로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 24와 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호: 22, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호: 22로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 22과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 22에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 25, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 25로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 25와 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 25에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호: 23, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호: 23으로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 23과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 23에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 26, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 26로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 26과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 26에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호: 27, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호: 27로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 27과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 24, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 24로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 24와 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호: 23, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호: 23으로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 23과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 23에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 28, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 28로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 28과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 28에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호: 21, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호: 21로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 21과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 번호: 1, 2 및 3에 개시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 24, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 24로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 24와 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 번호 12, 13 및 14에 개시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호: 22, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호: 22로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 22와 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 22에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 번호: 4, 5 및 6에 개시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 25, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 25로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 25와 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 25에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 번호 15, 16 및 17에 개시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호: 23, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호: 23으로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 23과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 23에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 번호: 7, 8 및 9에 개시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 26, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 26으로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 26과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 26에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 번호 18, 19 및 20에 개시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호: 27, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호: 27로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 27과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 번호: 1, 2 및 11에 개시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 24, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 24로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 24와 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 번호 12, 13 및 14에 개시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호: 23, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호: 23로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 23과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 23에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 번호: 7, 8 및 9에 개시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 28, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 28로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 28과 동일한 아미노산 서열, 및 서열 번호: 28에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 번호 18, 19 및 20에 개시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서에 따른 항-CD47 항체는 쥣과 유래 항체이며, 이는 나아가 쥣과 유래 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 그의 변이체의 중쇄 불변 영역, 및 쥣과 유래 카파 사슬 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
일부 바람직한 구현에서, 본 명세서에 따른 항-CD47 항체는 쥣과 유래 IgG1, IgG2 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역, 및 쥣과 유래의 카파 사슬 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서
(1) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 다음으로부터 선택되며:
(c1) 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 및 서열 번호: 31에 개시된 아미노산 서열,
(c2) 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 (c1)에 개시된 아미노산 서열로부터 유래되고 (c1)에 개시된 아미노산 서열과 기능적으로 동일하거나 유사한 아미노산 서열, 및
(c3) (c1)에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 그리고
(2) 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 다음으로부터 선택된다:
(c4) 서열 번호: 32, 서열 번호: 33 및 서열 번호: 34에 개시된 아미노산 서열,
(c5) 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 (c4)에 개시된 아미노산 서열로부터 유래되고 (c4)에 개시된 아미노산 서열과 기능적으로 동일하거나 유사한 아미노산 서열, 및
(c6) (c4)에 개시된 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 29, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 29로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 29와 동일한 서열, 및 서열 번호: 29에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되고; 그리고 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 32, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호 32로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 32와 동일한 서열, 및 서열 번호: 32에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 30, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 30으로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 30과 동일한 서열, 및 서열 번호: 30에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되고; 그리고 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 33, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호 33으로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 33과 동일한 서열, 및 서열 번호: 33에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 31, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 31로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 31과 동일한 서열, 및 서열 번호: 31에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되고; 그리고 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 34, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호 34로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 34와 동일한 서열, 및 서열 번호: 34에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 29, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 29로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 29와 동일한 서열, 및 서열 번호: 29에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되고, 서열 번호: 10, 2 및 11에 개시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며; 그리고 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 32, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호 32로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 32와 동일한 서열, 및 서열 번호: 32에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되고, 서열 번호: 12, 13 및 14에 개시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 30, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 30으로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 30과 동일한 서열, 및 서열 번호: 30에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되고, 서열 번호: 4, 5 및 6에 개시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며; 그리고 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 33, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호 33으로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 33과 동일한 서열, 및 서열 번호: 33에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되고, 서열 번호: 15, 16 및 17에 개시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 31, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 서열 번호: 31로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 31과 동일한 서열, 및 서열 번호: 31에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되고, 서열 번호: 7, 8 및 9에 개시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며; 그리고 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 34, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 서열 번호 34로부터 유래되고 기능적으로 서열 번호: 34와 동일한 서열, 및 서열 번호: 34에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되고, 서열 번호: 18, 19 및 20에 개시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
일부 구현에서, 본 명세서는 항-CD47 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기에서 중쇄는 인간화 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 그 변이체의 중쇄 불변 영역(constant region)을 포함하고, 경쇄는 인간화 카파, 람다 사슬, 또는 그 변이체의 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현에서, 쥣과 유래의 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 추가로 쥣과 유래의 카파, 람다 사슬, 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역 및/또는 쥣과 유래 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현에서, 항-CD47 키메라 항체의 항체 경쇄 또는 이의 항원 결합 단편은 추가로 쥣과 유래의 카파, 람다 사슬, 또는 이의 돌연변이 서열의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 항-CD47 키메라 항체의 항체 중쇄 또는 이의 항원 결합 단편은 추가로 쥣과 유래 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 돌연변이 서열의 중쇄 불변 영역을 더 포함하고, 그리고 바람직하게는 아미노산 돌연변이 후 ADCC (항체 의존성 세포 매개 세포 독성)를 현저히 감소시키는 인간화 IgG1 또는 IgG2 또는 IgG4의 불변 영역의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서의 항-CD47 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 추가로 인간화 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 그 변이체의 중쇄 불변 영역, 및 인간화 카파 사슬, 람다 사슬 또는 그 변이체의 경쇄 불변 영역을 더 포함한다. 일부 바람직한 구현에서, 본 명세서의 항-CD47 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 추가로 인간화 IgG1, IgG2 또는 그 변이체의 중쇄 불변 영역, 및 인간화 카파 사슬 또는 그 변이체의 경쇄 불변 영역을 더 포함한다.
일부 구현에서, 본 명세서는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기에서 항원 결합 단편은 Fab, Fv, sFv 또는 F(ab)2이다.
본 명세서의 다른 구현은 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된(isolated) 핵산을 제공한다.
일부 특정 구현에서, 본 명세서에 따른 분리된 핵산은, 여기서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 서열 번호: 35, 서열 번호: 36 또는 서열 번호: 37에 개시되고; 그리고 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호: 38, 서열 번호: 39 또는 서열 번호: 40에 개시된다.
특정 구현에서, 본 명세서에 따른 분리된 핵산은, 여기서 중쇄 가변 영역 서열 번호: 29를 코딩하는 핵산 서열이 서열 번호: 35에 개시되고, 경쇄 가변 영역 서열 번호: 32를 코딩하는 핵산 서열이 서열 번호 38에 개시된다.
특정 구현에서, 본 명세서에 따른 분리된 핵산은, 여기서 중쇄 가변 영역 서열 번호: 30을 코딩하는 핵산 서열이 서열 번호: 36에 개시되고, 경쇄 가변 영역 서열 번호: 33을 코딩하는 핵산 서열이 서열 번호 39에 개시된다.
특정 구현에서, 본 명세서에 따른 분리된 핵산은, 여기서 중쇄 가변 영역 서열 번호: 31을 코딩하는 핵산 서열이 서열 번호: 37에 개시되고, 경쇄 가변 영역 서열 번호: 34를 코딩하는 핵산 서열이 서열 번호 40에 개시된다.
본 발명의 다른 견지는 본 발명의 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 견지는 상기 기재된 바와 같은 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
일부 구현에서, 본 명세서 따른 숙주 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포로부터 선택된다. 일부 구현에서, 숙주 세포는 박테리아, 바람직하게는 대장균이다. 또 다른 바람직한 구현에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다.
본 발명의 또 다른 견지는 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 단계 및 숙주 세포로부터 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 견지는 본 발명에 따른 항-CD47 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구현에서 본 명세서는 본 발명의 본 발명에 따른 항-CD47 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 또한 다른 항체, 표적화 약물 등과 같은 다른 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구현에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 항산화제, 폴리펩티드, 단백질, 친수성 중합체, 아미노산, 당류, 킬레이트제, 알디톨, 이온 및 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 완충 수용액(buffered aqueous solution)이다. 또 다른 특정 구현에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 리포솜 형태이다.
본 발명에 따른 항-CD47 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경구 또는 비경구 투여에 적합한 약제학적 제제를 제조하기 위해 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합될 수있다. 투여 경로는 경구, 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 뇌내, 안구 내, 기관 내(intratracheal), 피하 및 비강 내 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 제제는 임의의 수단, 예를 들어 인퓨젼(infusion) 또는 볼루스(bolus) 주입에 의해, 상피 또는 피부 점막(예를 들어, 구강 점막 또는 직장 등)을 통한 흡수 수단에 의해 투여 될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 제제(preparation)는 당업계에 공지된 방법으로 제조될 수 있으며, 약제학적 제제 분야에서 통상적으로 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유한다.
본 명세서의 또 다른 견지는 본 발명의 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 이를 필요로하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, CD47 활성을 억제하는 방법을 제공한다.
본 명세서의 또 다른 견지는 CD47 활성을 억제하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 구현에서, CD47 활성을 억제하기 위한 약제는 백혈병, 림프종, 유방암, 폐암, 위암, 장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 췌장암, 신경교종 및/또는 흑색종을 치료하는데 사용된다. 일부 구현에서, 본 명세서는 항-종양 약물의 제조에 있어서 상기 언급 된 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 바람직하게, 상기 종양은 백혈병, 림프종, 유방암, 폐암, 위암, 장암, 식도암, 난소 암, 신장 암, 방광암, 췌장암, 신경아 교종 및 흑색 종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 제공하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 현저한 항종양 효과를 가지며, 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있으며, 상당한 혈구 응집 활성은 갖지 않는다. 면역원성이 크게 감소된 인간화 항체는 인간 면역계에 의한 외인성 단일클론 항체의 거부를 효과적으로 제거하고 광범위한 시장전망(market prospects)을 가진 다양한 종양 질환 치료용 의약품 제조에 사용될 수 있다.
도 1은 원숭이 CD47에 대한 항-CD47 인간화 항체의 결합 활성 시험의 ELISA 결과를 보여준다.
도 2는 인간 CD47에 대한 항-CD47 인간화 항체의 결합 활성 시험의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 3은 세포 표면에서 CD47에 대한 항-CD47 인간화 항체의 결합 활성 시험의 ELISA 결과를 보여준다.
도 4는 적혈구 응집 결과, 양성 대조군으로써 RBC(적혈구), 및 블랭크 대조군으로써 PBS를 보여준다
도 5는 FACS 검출에 의한 항-CD47 인간화 항체의 차단 활성 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 인간 위암 NUGC-4 이식 종양 모델에서 항-CD47 인간화 항체 Hu34-39-PE의 항-종양 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 인간 위암 NUGC-4 이식 종양 모델에서 항 CD47 인간화 항체 Hu26T-31-PE의 항-종양 검사 결과를 나타낸 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 과학적 및 기술적 용어의 의미는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것이다. 본원에 기술 된 세포 및 조직 배양, 분자생물학뿐만 아니라 단백질 및 올리고/폴리 뉴클레오티드 화학 및 혼성화에 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에서 잘 알려져 있고 일반적으로 사용된다. 표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)에 사용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 일반적으로 사용되거나 본원에 기재된 제조자의 지침 또는 방법에 따라 수행된다. 전술한 기술 및 방법은 일반적으로 당업계에 잘 알려진 것과 본 명세서에서 인용되고 논의된 다수의 포괄적이고 보다 구체적인 문서에서 설명된 내용에 따라 사용된다. Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989))을 참조 할 수 있다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의료 및 제약 화학에 사용되는 명명법 및 실험실 방법 및 기술은 당업계에서 잘 알려져 있고 일반적으로 사용된다.
본 명세서에서 용어 "적어도 80% 서열 동일성"은 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "적어도 85% 서열 동일성"은 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 의미한다. 일부 바람직한 구현에서, 본 명세서에 기재된 서열 동일성은 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수있다. 두 서열 간의 서열 비교 및 동일성 백분율 결정은 National Center For Biotechnology Institute 웹 사이트의 BLASTN/BLASTP 알고리즘에 의해 수행 될 수 있다.
항체 분자에서 경쇄의 3 개의 초가변 영역(hypervariable regions)과 중쇄의 3 개의 초가변 영역이 3 차원 공간에서 서로에 대해 배열(arranged relative to each other)되어 항원 결합 표면을 형성한다. 항원 결합 표면은 결합된 항원의 3 차원 표면에 상보적이며, 중쇄 및 경쇄의 각각의 3 개의 초가변 영역을 "상보성 결정 영역"또는 "CDR"이라고 한다. 각 도메인에 대한 아미노산 할당은 Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest"(National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1987 및 1991)) 또는 Chothia and Lesk (J. Mol. Biol. 196 : 901-917(1987), Chothia et al., Nature 342 : 878-883 (1989)에 의해 결정된다.
본 명세서의 "항원 결합 단편"은 항원 결합 활성을 갖는 하기 단편을 지칭한다: 인간 CD47에 결합하는 Fab 단편, Fab'단편, F(ab')2 단편 및 Fv 단편 및 scFv 단편. Fv 단편은 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하지만 불변 영역은 포함하지 않으며, 이는 모든 항원 결합 부위를 갖는 가장 작은 항체 단편이다. 일반적으로, Fv 항체는 또한 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 포함하고, 항원 결합에 필요한 구조를 형성할 수 있다. 상이한 링커가 또한 항체의 2 개의 가변 영역을 연결하는 데 사용되어, 단일 사슬 항체 또는 단일 사슬 Fv(scFv)로 불리는 폴리펩티드 사슬을 형성할 수 있다.
본 명세서의 항체는 면역글로불린 분자 또는 이의 면역학적 활성부, 즉 항원에 (면역 반응을 통해) 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 의미한다. "특이적 결합"은 항체가 항원의 하나 이상의 항원 결정자(antigenic determinants)와 반응하지만 다른 폴리펩티드와 반응하지 않거나 매우 낮은 친화성(Kd> 10-6)으로 다른 폴리펩티드에 결합하는 것을 의미한다. 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, dAb(도메인 항체), 단일 사슬, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편, Fv, scFv 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 단일 클론 항체(mAb)는 단일클론 세포주로부터 얻은 항체이며, 상기 세포주는 진핵, 원핵 또는 파지 클론닝된(cloned) 세포주에 제한되지 않는다. 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술 및 CDR 그래프팅과 같은 합성 기술 또는 다른 기존 기술을 사용한 재조합에 의해 획득할 수 있다.
본 명세서의 "쥣과 유래 항체"는 당해 분야의 지식 및 기술에 따라 생산된 인간 CD47에 대한 단일클론 항체이다. 생산 과정에서 피험자에게 CD47 항원을 주입하고, 이후 원하는 서열이나 기능적 특성을 가진 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리한다.
본 명세서의 "키메라 항체"는 쥣과 유래 항체의 가변 영역과 인간 항체의 불변 영역을 융합하여 형성된 항체로서, 쥣과 유래 항체에 의해 유도되는 면역반응을 감소시킬 수 있는 것이다. 키메라 항체를 확립하기 위해서는 먼저 쥣과 유래의 특정 단일 클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 확립하고, 마우스 하이브리도마 세포에서 가변 영역 유전자를 클로닝한 다음, 필요에 따라 인간 항체의 불변 영역 유전자를 클로닝하고, 마우스 가변 영역과 인간 불변 영역 유전자를 연결하여 형성 한 키메라 유전자를 인간 벡터에 삽입한다. 마지막으로, 키메라 항체는 진핵 시스템 또는 원핵 시스템에서 발현된다.
본 명세서의 "인간화 항체"는 또한 인간 항체의 가변 영역 프레임 워크(FR)에 마우스 CDR 서열을 이식하여 생성된 항체인 CDR 이식(CDR grafted) 항체라고도 불린다. 이러한 가변 영역 프레임 워크 서열은 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개 레퍼런스, 예를 들어 ImMunoGeneTics(IMGT) 웹사이트 http://imgt.cines.fr 또는 Journal of Immunoglobulin, 2001ISBN012441351에서 획득할 수 있다.
상세 설명
다음의 대표적인 실시예는 본 명세서의 내용의 보호 범위를 제한하기 보다는 본 명세서의 내용을 더욱 잘 설명하기 위해 사용된다. 다음 실시예에 명시된 조건이 없는 실험 방법은 일반적으로 Cold Spring Harbor의 항체 기술 실험 매뉴얼 및 분자 클로닝 매뉴얼과 같은 기존 조건에 따라 또는 원료 또는 상품 제조업체에서 권장하는 조건에 따라 수행된다. 실시예에 사용된 물질과 시약은 달리 명시하지 않는 한 모두 상업적으로 이용가능하다.
실시예 1: 항원 단백질 및 양성 대조군 항체의 제조
1. 항원 단백질 및 양성 대조군 항체의 발현 벡터 구축
(1) 항원 단백질 발현 벡터 구축
CD47 단백질의 전체 길이를 코딩하는 유전자 단편을 합성하고, 상기 아미노산 서열을 서열 번호: 41에 나타내었다. 이 단편을 진핵 발현 플라스미드 pTargeT에 클로닝하여 CD47 발현 플라스미드 pTargeT-CD47을 생성하였다.
인간 CD47 단백질의 세포외 영역의 아미노산 서열은 hIgG1-Fc 또는 his-tag의 아미노산 서열과 융합되었으며, 설계된 아미노산 서열은 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43으로 각각 표시된다. 상술한 아미노산 서열의 코돈 최적화 후, 태그된 CD47 단백질 세포 외 영역 코딩 단편인 CD47-hFc 및 CD47-his를 각각 합성하고 진핵 발현 플라스미드 pHR에 클로닝하여 각각의 발현 플라스미드 pHR-CD47-hFc 및 pHR-CD47-his을 발생시켰다.
인간 CD47 단백질의 세포 외 영역의 아미노산 서열을 mIgG1-Fc의 아미노산 서열과 융합하고, 설계된 아미노산 서열을 서열 번호: 44에 나타내었다. 아미노산의 코돈 최적화 후 완전한 발현 플라스미드 pcDNA3.1 (+)-TPA-CD47-mIgG1-Fc가 구축되었다.
상기 SIRPα의 서열은 서열 번호: 45에 개시되어 있다. 아미노산 서열의 코돈 최적화 후 완전한 발현 플라스미드 pcDNA3.1 (+)-SIRPα-myc-His를 구축하였다.
(2) 양성 대조군 항체의 발현 벡터 구축
양성 대조군 항체로는 특허 출원 WO2013/119714에 개시된 항체 AB6.12-IgG4P (본원에서는 AB06.12-4P로 약칭)를 사용하였다. AB06.12-4P의 아미노산 서열은 다음과 같다:
AB06.12-4P의 중쇄 아미노산 서열은 서열 번호: 46에 개시되어 있으며; 및
AB06.12-4P의 경쇄 아미노산 서열은 서열 번호: 47에 개시되어 있다.
상술한 항체 서열에 해당하는 아미노산 서열을 인위적으로 최적화하여
양성 대조군 항체 AB06.12-4P의 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드 pcDNA3.1 (+)-SHC025-hG4 및 pcDNA3.1(+)-SHC025-hk를 획득하였다. 상기 중쇄 유전자 단편을 IgG4의 경쇄 불변 영역을 포함하는 진핵 발현 플라스미드 pHR에 클로닝하여 AB06.12-4P의 중쇄 진핵 발현 플라스미드 pHR-SHC025-hG4-4PE 및 경쇄 발현 플라스미드 pcDNA3.1 (+)-SHC025-hk를 획득하였다.
2. 항원 단백질 및 양성 대조군 항체의 발현 및 정제
(1) 항원 단백질의 안정된 형질전환 세포주 구축
CHO-K1 세포(Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences)를 160V의 전압에서 15msec의 사각 펄스 하에서 진핵 발현 플라스미드 pTargeT-CD47로 전기트랜스펙션(Electrotransfection)시킨 다음 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양했다. 24 시간 후, 500μg/ml G418을 포함하는 배양 배지로 세포를 선별하였다. 16 일 후 FACS에 의해 풀(pool)의 양성 비율이 검출되었다. 플라스미드로 트랜스펙션된 세포를 플레이팅(1x106 세포/ml의 세포 밀도, 100 μl/웰)하고, PE 마우스 항-인간 CD47 항체(BD, 556046)와 함께 배양하였다. 유세포분석기(BD, FACSJazz)를 사용하여 585nm 파장의 평균값을 읽었으며, GraphPad를 사용하여 데이터 분석을 수행했다. 양성 세포주를 서브클로닝하고, CD47을 높은 수준으로 발현하고 CHO-K1-E5로 명명된 CHO-K1 세포주를 선택했다.
(2) 태깅된(tagged) 항원 단백질 및 양성 대조군 항체의 발현
293F 세포를 0.5 x 106 세포/ml의 밀도로 1L 세포 배양 플라스크에 접종하였다. 신선하고 예열된(Fresh and pre-warmed) FreeStyle 293 발현 배지를 첨가하여 총 부피를 250mL로 만들었다. 세포는 가습된 CO2 인큐베이터에서 37 ℃ 및 8% CO2에서 밤새 배양되었다. 500μl의 1mg/ml PEI 용액을 8.5ml FreeStyle 293 발현 배지에 첨가하고 잘 혼합했다. 트랜스펙션 될 플라스미드 250μg을 8.5ml FreeStyle 293 발현 배지에 첨가하고 잘 혼합했으며, 태깅된(tagged) 항원 단백질 플라스미드 pHR-CD47-hFc, pHR-CD47-his, pcDNA3.1(+)-TPA-CD47-mIgG1-Fc 및 pcDNA3.1(+)-SIRPα-myc-His를 각각 트랜스펙션시키고, 양성 대조군 항체 AB06.12-4P의 중쇄 플라스미드 pHR-SHC025-hG4-4PE 및 경쇄 플라스미드 pcDNA3.1 (+)-SHC025-hk를 공동-트랜스펙션(co-transfected)시켰다. 플라스미드가 포함된 발현 배지에 PEI가 함유된 FreeStyle 293 발현 배지를 첨가하고 잘 혼합한 다음, 혼합물을 세포에 첨가하고, 가습된 CO2 인큐베이터에서 37 ℃ 및 8% CO2에서 배양되었다. 트랜스펙션 후 1 일 및 3 일에 플라스크 당 2.5ml의 200mM 글루타민 및 5ml의 180g/L 글루코스를 세포에 공급하였다. 세포 생존율이 65% ~ 75%로 떨어졌을 때 세포 배양 상층액을 수집했다. 상기 세포 배양액을 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 수집한 후, 8,000rpm에서 20 분 동안 원심분리하여 상층액을 수집했다.
(3) 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography) 정제
단백질의 특성에 따라 AKTA 기계(GE, AKTA pure-150)를 이용하여 서로 상이한 친화성 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제를 수행하였다(상이한 단백질에 적합한 친화성 크로마토그래피 컬럼은 표 1 참조). 구체적인 정제 단계는 다음과 같다.
상이한 단백질에 적합한 친화성 크로마토그래피 컬럼
단백질 컬럼 상표 모델
쥣과 단일클론 항체 (하이브리도마)/CD47-mFc 단백질 G 프리패킹 컬럼(prepacked column) Bestchrom Ezfast 단백질 G 4FF
CD47-his/ SIRPα-myc-His NI 프리패킹 컬럼(prepacked column) GE His Trap, HP 5ml
CD47-hFc/키메라 항체, 인간화 항체 단백질 A 프리패킹 컬럼(prepacked column) GE Hi Trap, Mabselect SuRe 5 ml
단백질 A 셀프-패킹 컬럼(self-packed column) GE Mabselect LX 18 ml
세정
장비와 파이프 라인을 10mL/min의 유속으로 2분 동안 초순수로 세척한 후 0.1M NaOH로 크로마토그래피 시스템을 세척 하였다.
컬럼 연결
크로마토그래피 컬럼을 크로마토그래피 장비에 연결하고 초순수로 5 분 동안 헹구고 나서, 크로마토그래피 시스템을 5 분의 체류 시간(retention time)으로 30분 동안 0.1M NaOH로 헹구었다.
평형(Equilibration)
20mM PB + 0.15M NaCl, pH 7.2의 5 개의 CV(컬럼 부피)를 사용하여 컬럼을 평형화했다.
샘플 로딩
세포 발현으로부터의 상층액을 5분의 체류 시간으로 컬럼에 로딩 하였다.
사후 평형(Re-equilibration)
평형을 위해 5 개의 CV 20mM PB + 0.15M NaCl, pH 7.2를 사용하였다.
용출
5분의 체류 시간 동안 50mM 아세트산(pH = 3.4)으로 용출을 수행하였다. 수집은 UV280이 약 50 mAu에 도달했을 때 시작되었고, UV280이 약 50 mAu로 떨어졌을 때 중단되었다. 샘플은 1M Tris-HCl(pH 9.0)을 사용하여 7.0의 pH로 조정되었다.
재평형(Re-equilibration)
20mM PB + 0.15M NaCl, pH 7.2의 3 개의 CV를 5 분의 체류 시간으로 평형을 위해 사용하였다.
온-컬럼 세정(On-column Cleaning)
0.1M NaOH로 30 분 동안 체류 시간 5 분으로 세정을 수행하였다.
세정 및 보존
정제수로 10 분간 세척 한 후 20% 에탄올 2CV로 세척하였다.
실시예 2 단일 클론 항체의 제조
1. 하이브리도마의 준비
(1) 동물 면역화(immunization)
실험용 SJL 마우스는 보조제(adjuvant)와 함께 다르게 태깅된 CD47 단백질로 면역화되었다. 50μg의 항원이 첫 번째 슈트(shoot)에 사용되었고, 이후에 25μg의 항원이 면역화에 사용되었다.
실험에 사용된 면역 보조제는 QuickAntibody-Mouse5W(Beijing Biodragon immunotech. Co., Ltd.), TiterMax(Sigma), CpG(GenScript Biotechnology Co., Ltd.) 또는 Alum(thermo) 보조제일 수있다. 상이한 태깅된 CD47 단백질 샘플을 와류(vortex)와 함께 보조제 용액에 적가하여 완전히 혼합했다. 보조제의 투여량은 설명서를 참조했다. 혼합물을 잘 혼합하고 유중수 에멀젼을 형성한 후 SJL 마우스를 면역화시켰다.
CCRF-CEM 및 CHO-K1-E5와 같은 높은 수준의 CD47을 발현하는 세포주도 마우스를 면역화하여 항체를 생산하는 데 사용되었다. 실시예 1에서 얻은 배양된 인간 급성 림프모구성 백혈병(lymphoblastic leukemia) 세포(CCRF-CEM) 및 CHO-K1-E5 양성 세포를 트립신으로 처리 한 후 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 PBS에 재현탁시켰다. 샘플의 일부를 꺼내 세포 계수를 수행하고 나머지 샘플을 1,000rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 PBS에 재현탁시켰다. 적절한 양의 PBS를 첨가하여 1x108 세포/ml의 세포 현탁액을 얻었다. 실험군의 각 마우스는 1x107 세포로 면역화되었다.
면역화 프로토콜은 표 2에 개시되어있다.
마우스 면역화 프로토콜
그룹 항원 보조제(Adjuvant) 면역 루트(Immunization Route)*
1 PBS 없음
2 CD47-his/CD47-mFc Quick Antibody-Mouse5W i.m.
3 CD47-his/CD47-mFc Titer Max/CpG/Alum s.c./i.m.
4 CD47-mFc Quick Antibody-Mouse5W i.m.
5 CD47-mFc Titer Max/CpG/Alum s.c./i.m.
6 CCRF-CEM/CHO-K1-E5 없음 i.p.
* i.m .: 근육 주사; s.c .: 피하 주사; i.p .: 복강 내 주사.
(2) 하이브리도마 융합
비장 세포의 획득 및 준비. 추가(booster) 면역화 후 마우스를 희생시키고 75% 알코올에 담갔다. 비장을 절개하고 그라인딩 로드(grinding rod)으로 으깨서, 세포 스트레이너(cell strainer)를 통해 여과하여 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 비장 세포 현탁액을 2,000rpm에서 5 분 동안 원심분리하고 상층액을 버렸다. 2mL 적혈구 용해물을 용해 적혈구에 첨가하고 실온에서 2분 동안 용해시키고 PBS를 첨가하여 20mL가 되도록 하였다. 1,500rpm에서 7 분간 원심 분리한 후 상층액을 버렸다. 재현탁 후 생존 세포를 계수 하였다. 배양 플라스크의 Sp2/0 세포를 수집하고, 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 한 후 상층액을 버렸다. 재현탁 후 생존 세포를 계수하였다. 비장 세포를 Sp2/0 세포와 1 : 1의 비율로 혼합하고 1,500rpm에서 7 분 동안 원심분리 한 후 상층액을 버렸다. 세포를 20 mL 전기천공 완충액에 재현 탁시켰다. 1,500rpm에서 7 분간 원심분리 한 후 상층을 버리고 상기 단계를 1 회 반복했다. 세포를 적절한 양의 전기천공 완충액으로 재현탁하여 약 2 x 107 세포/mL의 세포 농도를 보장했다. 융합을 위해 세포 현탁액을 9mL 전기천공 탱크에 첨가 하였다. 융합 후, 세포 현탁액을 20% FBS를 함유하는 15mL RPMI 1640 완전 배지(complete medium )로 옮기고 실온에서 20 분 동안 방치하였다. 융합된 세포를 1×HAT, 1×BIOMYC3 및 20% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지로 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 100μl/웰로 여러 96-웰 세포 배양 플레이트에 첨가하여 웰 당 세포 부피가 약 4×104 세포/웰이 되도록 하고, 플레이트를 37 ℃ 세포 인큐베이터에 넣었다. 5일 후, 20% FBS, 1×HAT 및 1×BIOMYC-3을 포함하는 추가의 RPMI 1640 완전 배지 100μL를 각 웰에 추가로 첨가했다.
(3) 하이브리도마(hybridoma) 스크리닝 및 서브클로닝(subcloning)
융합 1주 후, 배양 상층액을 수집하여 세포 표면상의 CD47-his 단백질 또는 CD47에 결합할 수있는 하이브리도마 상층액을 ELISA에 의해 스크리닝하는데 사용 하였다. CD47-his는 hFc 및 mFc 대신 CD47에 대한 항체를 스크리닝하는 데 사용되었다. CD47-SIRPα 상호작용을 차단하는 하이브리도마 상층액의 능력을 ELISA로 분석하였다. SIRPα-myc-his를 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 재조합 인간화 CD47-hFc 및 하이브리도마 상층액의 혼합물을 첨가하고 2시간 동안 배양하였다. HRP 표지된 항-인간 IgG Fc 특이적 항체(Jackson Immuno Research)를 첨가하고 1 시간 동안 배양했다. 450nm에서 흡광도를 감지하기 위해 Microplate 리더를 사용했다. 스크리닝 실험에서 결합 및 차단 활성을 나타내는 하이브리도마 부모 클론이 확장되었다. 결합 및 차단 활성을 재시험하고, 다시 스크리닝하여 결합 및 차단 활성을 갖는 하이브리도마 양성 클론을 얻었다.
제한 희석법(limiting dilution)에 의해 양성 세포주를 서브클로닝 하였다. 배양 1 주일 후, CD47에 대한 결합 활성 및 상층액의 CD47-SIRPα 상호작용 차단 활성을 ELISA에 의해 검출하였다. 위의 두 테스트에서 양성 결과를 보인 세 개의 세포주가 각각 SHC025-26, SHC025-34 및 SHC025-58로 명명되었다.
2. 항체 서브타입의 확인
항체 서브 타입을 마우스 항체 서브 타입 확인 키트 "SBA Clonotyping Systerm-C57BL/6-HRP"(SouthernBiotech, Cat. No. 5300-05B)의 지침에 따라 확인하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.
항체 서브타입의 동정 결과
항체 항체 서브타입
SHC025-26 IgG1/k
SHC025-34 IgG2c/k
SHC025-58 IgG2b/k
3. 단일 클론 항체의 준비
세포 배양 상층액의 활성 분석 결과, 단일 클론 항체 SHC025-26, SHC025-34, SHC025-58의 부모 클론을 동정하고 확장하였다. 배양 배지는 10% 우태아 혈청, 1×NAEE, 1×나트륨 피루베이트, 및 1 % 페니실린-스트렙토마이신 이중 항생제를 함유하는 1640 배지였다. 세포 밀집(confluence) > 80% 일 때, 세포를 계대 배양하고 확장(expanded)하였다. 50ml의 상층액을 수집하고 항체를 정제하였다. 수득된 항체를 SDS-PAGE 겔 전기영동하였고, 좋은(good) 순도를 나타냈다.
4. 단일 클론 항체의 시퀀싱
서브클로닝된 양성 하이브리도마를 확장하고, RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, 74134)의 지침에 따라 총 RNA 추출을 위해 적절한 양의 세포를 사용했다. cDNA의 첫 번째 가닥은 Prime Script 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara, 6110A)를 사용하여 합성되었다.
특정한 프라이머가 마우스 항체 서브타입의 가변 영역에 따라 설계되었으며, 프라이머의 5 '말단은 진핵 발현 벡터와의 상동 재조합을 위한 상동성 팔(arm) 서열을 포함하였다. cDNA를 주형으로 하여 항체의 가변 영역에 대한 PCR 증폭을 수행하여 마우스 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 유전자 단편을 각각 얻었다. 프라이머의 디자인은 다음을 참조한다. 1. Anke Krebber, Susanne Bornhauser, Jorg Burmester etal. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. Journal of Immunological Methods, 1997, 201: 35-55; 2. Simon KorenMiha KosmacAnja Colja Venturini etal. Antibody variable-region sequencing as a method for hybridoma cell-line authentication, 2008, 78: 1071-1078. DNA 시퀀싱이 수행되었으며 결과를 표 4에 나타내었다.
항-CD47 쥣과-유래 단일 클론 항체의 서열 표
항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
SHC025-26 서열 번호: 21 서열 번호: 24
SHC025-34 서열 번호: 22 서열 번호: 25
SHC025-58 서열 번호: 23 서열 번호: 26
실시예 4 키메라 항체의 구축
마우스 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 정제된 DNA 단편(정제 단계는 실시 예 1 참조)을 인간 항체의 경쇄 불변 영역 또는 중쇄 불변 영역을 포함하는 선형화 된 진핵 발현 플라스미드를 사용하여 각각 대장균 DH5α 컴피턴트 세포(competent cell)로 공동-형질전환(co-transformed)시켰다. 상기 혼합물을 상응하는 항생제가 들어있는 한천 플레이트의 표면에 고르게 스프레딩한다. 한천 플레이트를 37 ℃ 항온 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션 한 다음, DNA 시퀀싱을 위해 여러 개의 단일 콜로니를 선택했다. 정확한 서열을 갖는 키메라 항체는 SHC025-26CHI, SHC025-34CHI 및 SHC025-58CHI로 명명하였다.
정확한 서열을 갖는 양성 클론을 상응하는 항생제가 함유된 2 × YT 액체 배지에 접종하고 진탕하면서 37 ℃에서 12 시간 이상 배양하였다. 플라스미드 추출을 위해 박테리아 세포를 수집하여 키메라 항체의 경쇄 및 중쇄를 발현하는 플라스미드를 얻었다. 플라스미드의 농도와 순도는 핵산 정량 분석기로 검출되었다.
키메라 항체용 플라스미드를 HEK293E 세포에 프랜스펙션시키고, 상기 항체를 발현 및 정제하였다. 순도, 활성 및 친화도를 테스트하고 분석했다.
시퀀싱을 통해 SHC025-26의 중쇄 CDR 위치 118에 하나의 시스테인이 있고 SHC025-58의 경쇄 CDR 위치 56에 하나의 시스테인이 있음을 확인하였다. 항체 발현 동안 CDR 영역의 시스테인은 항체 분자의 다른 시스테인과 무작위로 쌍을 이루어 이황화 가교를 형성하여 항체의 순도에 큰 영향을 미친다. 이 문제를 해결하기 위해 SHC025-26CHI 및 SHC025-58CHI의 아미노산 서열을 다음과 같이 수정하였다: SHC025-26CHI 중쇄의 C118을 T로 돌연변이시키고 수득된 항체를 SHC025-26CHI-T로 명명하였고; SHC025-58CHI 경쇄의 C56을 A로 돌연변이시키고 수득된 항체를 SHC025-58CHI-A로 명명하였다. 상기 돌연변이 서열은 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)에 의해 구축되었다. 키메라 항체 시퀀싱 결과를 표 5에 나타내었다.
항-CD47 키메라 항체의 서열
키메라 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
SHC025-26CHI 서열 번호: 21 서열 번호: 24
SHC025-26CHI-T 서열 번호: 27 서열 번호: 24
SHC025-34CHI 서열 번호: 22 서열 번호: 25
SHC025-58CHI 서열 번호: 23 서열 번호: 26
SHC025-58CHI-A 서열 번호: 23 서열 번호: 28
실시예 5 인간화 항체의 구축 및 생산
키메라 항체의 활성도 및 친화도 KD 값의 분석에 기초하여 SHC025-34CHI, SHC025-58CHI-A, 및 SHC025-26CHI-T를 인간화 항체로 변형시켰다.
인간화 항체를 구축하기 위해, SHC025-34CHI, SHC025-58CHI-A 및 SHC025-26CHI-T 항체의 가변 영역을 ImMunoGeneTics(IMGT)의 마우스 항체 서열과 비교하여 이들의 쥣과 유래 생식세포계열(germlines)을 결정하였다. 상동성 비교 결과 SHC025-34CHI, SHC025-58CHI-A 및 SHC025-26CHI-T 항체의 중쇄 가변 영역의 FR 영역 서열이 각각 마우스 항체 IGHV1-8 * 01, IGHV3-21 * 04 및 IGHV1-2 * 02의 생식세포계열 유전자와 가장 유사한 것으로 확인되었으며; 항체의 경쇄 가변 영역의 FR 서열은 각각 마우스 항체 IGKV3-11 * 01, IGKV1-5 * 01 및 IGKV4-1 * 01과 가장 유사했다. 주형으로서 SHC025-34CHI/SHC025-58CHI-A 항체의 프레임 워크 영역 서열 FR1-FR3을 사용하여, SHC025-34CHI/SHC025-58CHI-A 의 FR1-FR3 서열을 대체하기 위해 3D 구조는 유사하지만 면역원성이 낮은 완전한 인간 프레임워크 영역을 인간 프레임워크 영역 라이브러리에서 스크리닝했다. 중쇄/경쇄의 전장 서열을 3D 모델링하고 원래 항체의 중쇄/경쇄 서열과 구조적으로 비교했다. 항원성 및 3D 구조적 유사성을 고려하여, SHC025-34CHI의 6 개의 인간화 중쇄 가변 영역(서열 번호: 48, 49, 50, 51, 52 및 53 참조) 및 4 개의 인간화 경쇄 가변 영역(서열 번호: 54, 55, 56 및 57), 및 SHC025-58CHI-A의 6 개의 인간화 중쇄 가변 영역(서열 번호: 58, 59, 60, 61, 62 및 63 참조) 및 5 개의 인간화 경쇄 가변 영역(서열 번호: 64 , 65, 66, 67 및 68 참조)가 최종적으로 추가의 최적화를 위해 선택되었다. SHC025-34CHI 또는 SHC025-58CHI-A 항체의 95% 보다 많은(more than) 비-CDR 영역이 인간화되었다. SHC025-26CHI-T의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 서열은 Protein Data Bank에서 구조적 정렬 분석을 수행하는 데 사용되었다. 가장 높은 유사성을 가진 FR1-FR3 서열이 쥣과 유래 서열을 대체하기 위해 선택되었고, 구조 시뮬레이션에서 항체의 구조 안정화에 중요한 역할을 하는 아미노산 부위는 쥣과 유래 아미노산 잔기로 다시 돌연변이시켰다. 마지막으로, SHC025-26CHI-T의 4 개의 인간화 중쇄 가변 영역(서열 번호: 69, 70, 71 및 72 참조) 및 2 개의 인간화 경쇄 가변 영역(서열 번호: 73 및 74 참조)을 얻었다.
상기에서 수득된 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 상응하는 뉴클레오티드 서열로 역전사하고, 인접 단편들 사이에 상보적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 단편을 생성하였다. 상기 올리고뉴클레오티드 단편을 어닐링하고 Overlap PCR에 의해 조립하였다. 그 후 전체 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 단편을 특정 프라이머를 사용하여 증폭했다(5 '말단은 진핵 발현 벡터와의 상동성 재조합을 위한 상동성 팔 서열을 포함). 경쇄 가변 영역의 정제된 뉴클레오티드 단편을 IgG4의 경쇄 불변 영역을 포함하는 선형화된 진핵 발현 플라스미드와 함께 대장균 DH5α 컴피턴트 세포로 공동-형질전환시켰다. 중쇄 가변 영역의 정제된 뉴클레오티드 단편을 S228P/L235E 돌연변이를 포함하는 IgG4의 중쇄 불변 영역을 포함하는 진핵 발현 플라스미드와 함께 대장균 DH5α 컴피턴트 세포로 공동-형질전환시켰다. 형질전환된 플라스미드가 있는 상기 컴피턴트 세포를 상응하는 항생제를 함유하는 한천 플레이트의 표면에 고르게 스프레딩 하였다. 한천 플레이트를 37 ℃ 항온 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션 한 다음, DNA 시퀀싱을 위해 여러 개의 단일 콜로니를 선택했다.
정확한 서열을 갖는 양성 클론을 상응하는 항생제가 함유된 2 × YT 액체 배지에 접종하고 진탕하면서 37℃에서 12 시간 이상 배양하였다. 플라스미드 추출을 위해 박테리아 세포를 수집하여 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄를 발현하는 플라스미드를 얻었다. 플라스미드의 농도와 순도는 핵산 정량 분석기로 검출되었다.
상기 플라스미드를 HEK293E 세포로 트랜스펙션시키고, 많은 수의 항체를 발현 및 정제하였다. 순도, 활성 및 친화도를 테스트하고 분석했다.
순도, 활성 및 친화성이 우수한 인간화 항체를 선별하여 Hu26T-31-PE, Hu34-39-PE, Hu58A-14-PE로 명명하였다. 서열은 표 6에 나타내었다. 인간화 항체의 공급원은 표 7에 나타내었다.
항-CD47 인간화 항체의 서열 표
인간화 항체 아미노산 서열 뉴클레오티드 서열
중쇄 가변 영역 경쇄 가변 영역 중쇄 가변 영역 경쇄 가변 영역
Hu26T-31-PE 서열 번호: 29 서열 번호: 32 서열 번호: 35 서열 번호: 38
Hu34-39-PE 서열 번호: 30 서열 번호: 33 서열 번호: 36 서열 번호: 39
Hu58A-14-PE 서열 번호: 31 서열 번호: 34 서열 번호: 37 서열 번호: 40
인간화 서열 정보
중쇄
인간화 서열의 공급원 재조합 인간화 서열
X62106 Homsap IGHV1-2*02 F 서열 번호: 29
X92343 Homsap IGHV1-46*01 F 서열 번호: 30
HM855688 Homsap IGHV3-21*04 F 서열 번호: 31
경쇄
인간화 서열의 공급원 재조합 인간화 서열
X97473 Homsap IGLV3-9*01 F 서열 번호: 32
X71966 Homsap IGLV3-21*01 F 서열 번호: 33
Z73648 Homsap IGLV4-69*01 F 서열 번호: 34
실시예 6 원숭이 CD47에 대한 항체 결합 활성(ELISA에 의한)
항체의 결합 활성을 단백질 기반 ELISA로 분석하였다. Cynomolgus CD47-His (0.1μg/웰, ACRO Biosystems, Cat. No. CD7-C52H1-50μg)를 96 웰 ELISA 플레이트에 코팅했다. 본 명세서의 항-CD47 항체를 1차 항체로 사용하고 총 8 가지 농도로 5 배 구배 희석으로 ELISA 플레이트에 첨가하였다: 각각 2000 ng/mL, 400 ng/mL, 80 ng/mL, 16 ng/mL, 3.2 ng/mL, 0.64 ng/mL, 0.128 ng/mL, 및 0 ng/mL. 상기 플레이트를 37 ℃에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 양성 대조군 항체로는 AB06.12-4P를, 2 차 항체로는 Anti-Human IgG HRP(Jackson, 109-035-003, 1 : 10000)를 사용했다. 발색 용액 TMB(3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine)를 플레이트에 첨가하고, 반응 종료 후 마이크로 플레이트 리더(Thermo, Multiskan FC)를 사용하여 OD450 값을 판독했다. EC50은 GraphPad에 의해 생성되었다. 그 결과를 도 1에 나타냈다.
실험 결과, 본 발명의 인간화 항-CD47 항체 Hu26T-31-PE, Hu34-39-PE 및 Hu58A-14-PE는 시노몰구스(cynomolgus) CD47에 결합할 수 있으며, 결합능은 양성 대조군 항체 AB06.12-4P와 동등했다.
실시예 7 인간 CD47에 대한 항체 결합 활성(ELISA에 의한)
항체의 결합 활성을 ELISA로 분석하였다. 인간 CD47-His 단백질(0.1μg/웰, 실시예 1 및 2에서 제조됨)을 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하고 ELISA 플레이트를 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 1×PBST로 3회 세척한 후, 상기 ELISA 플레이트를 4 ℃에서 밤새 5% 무지방 우유(non-fat milk)로 차단했다. 상기 플레이트를 1×PBST로 3 회 세척하였다. 본 명세서의 항-CD47 항체를 1 차 항체로 사용하고 총 8 개 농도로 5배 구배 희석으로 ELISA 플레이트에 첨가하였다: 각각 2000 ng/mL, 400 ng/mL, 80 ng/mL, 16 ng/mL, 3.2 ng/mL, 0.64 ng/mL, 0.128 ng/mL, 및 0 ng/mL. 상기 플레이트를 37 ℃에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 상기 플레이트를 1×PBST로 3회 세척하였다. 양성 대조군 항체로는 AB06.12-4P를, 2 차 항체로는 Anti-Human IgG HRP(Jackson, 109-035-003, 1 : 10000)를 사용했다. 그 후 상기 플레이트를 37 ℃에서 40분 동안 인큐베이션했다. 1×PBST로 플레이트를 5 회 세척 한 후 발색 용액 TMB를 첨가하고, 반응 종료 후 마이크로플레이트 리더(Thermo, Multiskan FC)를 사용하여 OD450 값을 판독하였다. EC50은 GraphPad에 의해 생성되었다. 그 결과를 도 2에 나타냈다.
실험 결과, 본 발명의 인간화 항-CD47 항체 Hu26T-31-PE, Hu34-39-PE 및 Hu58A-14-PE는 인간 CD47에 결합할 수 있으며, 결합능은 양성 대조군 항체 AB06.12-4P와 동등했다.
실시예 8 세포 표면 CD47에 결합하는 항체(ELISA에 의한)
항체의 결합 활성은 세포 기반 ELISA로 분석하였다. CHO-K1-E5 세포를 웰당 1×105 세포로 플레이팅하고 37 ℃ 및 5 % CO2에서 밤새 배양했다. 둘째 날, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정한 다음, 무지방 우유로 1 시간 동안 차단하고, 나중에 1×PBS로 부드럽게 세척했다. 본 발명의 항-CD47 항체를 1 차 항체로 사용하고 총 8 가지 농도로 5 배 구배 희석으로 플레이트에 첨가하였다: 각각 2000 ng/mL, 400 ng/mL, 80 ng/mL, 16 ng/mL, 3.2 ng/mL, 0.64 ng/mL, 0.128 ng/mL, 및 0 ng/mL. 상기 플레이트를 37 ℃ 에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 양성 대조군 항체로는 AB06.12-4P를, 2 차 항체로는 Anti-Human IgG HRP(Jackson, 109-035-003, 1 : 10,000)를 사용했다. 발색 용액 TMB를 추가하고, 종료 후 OD450 값을 읽기 위해 마이크로플레이트 리더(Thermo, Multiskan FC)를 사용했다. EC50은 GraphPad에 의해 생성되었다. 그 결과를 도 3에 나타냈다.
실험 결과, 본 발명의 인간화 항-CD47 항체 Hu26T-31-PE, Hu34-39-PE 및 Hu58A-14-PE는 세포 표면의 CD47에 결합할 수 있으며, 결합능은 양성 대조군 항체 AB06.12-4P와 동등했다.
실시예 9 인간 CD47 단백질에 대한 항체의 친화성 분석
실시예 1 및 2에서 제조된 인간화 항-CD47 항체의 항원 CD47(19-136)-hFC에 대한 친화도는 Fortebio Octet에 의해 결정되었다. 먼저, 항원 CD47 (19-136)-hFc를 비오틴으로 표지한 다음 PBS가 있는 10kD 컷오프 한외여과(cut-off ultrafiltration) 튜브에 넣어 원심분리에 의해 탈염하였다. 이 단계는 3-4 회 반복되었다. 바이오틴-표지 항원(CD47-hFc-Biotin)의 실제 농도는 Nanodrop 장치에 의해 결정되었다. CD47-hFc-비오틴을 SD 버퍼(0.02 % Tween20 + 0.1 % BSA 용액)로 5μg/ml의 농도로 희석했다. 인간화 항-CD47 항체는 10μg/ml, 2.5μg/ml, 0.625μg/ml 및 0μg/ml의 농도가 되도록 4 배 구배 희석으로 SD 버퍼로 희석되었다. SA 센서를 사용하여 항원을 고형화하고, fortebio Octet RED96의 매뉴얼에 따라 친화성 분석을 수행했다. 구체적인 매개 변수와 실험 결과는 표 8에 나타내었다.
인간 CD47 단백질에 대한 항체의 친화성 분석
항체 KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
Hu26T-31-PE 5.87E-11** 1.04E+06 6.13E-05
Hu34-39-PE 1.13E-10 6.69E+06 7.58E-04
Hu58A-14-PE 9.46E-11 1.78E+06 1.68E-04
AB06.12-4P 1.01E-10 4.80E+06 4.85E-04
실험 결과는 Hu26T-31-PE가 양성 대조군 항체보다 인간 CD47 단백질에 대한 결합에 대해 유의하게 더 높은 친화성을 가짐을 보여준다.
실시예 10 혈구 응집 분석
5 mL 혈액 샘플을 40 mL PBS에 첨가했다. 혼합물을 2000rpm에서 5 분 동안 원심분리하고 상층액을 버렸다. 세포 펠렛을 PBS로 3회 세척 한 다음 PBS에 재현 탁시켰다. 헤마토크릿에 따라 2% 적혈구 현탁액을 준비하였다. 분석될 항체의 초기 농도는 2 배 희석으로 1-20μM, 총 24 농도 구배였다. 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 상기 언급 된 상이한 농도의 항체 50μL를 첨가한 다음, 2% 적혈구 현탁액 50ul를 첨가하였다. 상기 혼합물을 잘 혼합하고, 실온에 두고 2 시간 후 응집에 대해 모니터링했다. 토끼 다클론 RBC 항체(Rockland, 109-4139)를 혈구 응집에 대한 양성 대조군으로 사용하였고, 그 결과를도 4에 나타내었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 96- 웰 플레이트에서 좌측에서 우측으로 항체(토끼 다클론 RBC 항체, AB06.12-4P 항체 및 본 발명의 시험 항체)의 농도를 20uM에서 시작하는 2 배 구배로 희석하였다. RBC는, 토끼 다클론 RBC 항체가 유의한 혈구응집을 일으킨, 양성 대조군을 나타내고, PBS는 빈 대조군을 나타냈다. 세포 응집이 없으면 적혈구는 스무스한 가장자리(smooth edge)를 갖는 작은 점으로 웰의 바닥으로 떨어진다. 가장자리가 약간 모호한(vague) 점은 소량의 적혈구가 응집되었음을 나타낸다. 적혈구가 조각 형태(flaky)를하고 웰 바닥 전체를 덮는다면 대부분의 적혈구가 응집되었음을 나타낸다.
특허 출원 WO2011/143624에 개시된 항-CD47 항체 Hu5F9-G4는 항-CD47 항체의 공통적인 바람직하지 않은 특성인 동일한 농도 범위 내에서 적혈구의 상당한 응집을 유발할 수 있는 것으로 보고되었다. 그러나, 동일한 조건 하에서 본 발명의 Hu26T-31-PE, Hu34-39-PE, 및 Hu58A-14-PE는 실험 결과와 같이 혈구 응집을 유발하지 않았으며, 이는 본 발명의 항체가 이 점에서 Hu5F9-G4 항체보다 현저하게 우수함을 나타낸다.
실시예 11 FACS에 의한 CD47 차단 활성 검출
SIRPa가 세포 표면에서 CD47에 결합하는 것을 차단하는 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체의 능력을 FACS에 의해 검출하였다.
CD47에 양성인 CHO-K1-E5 세포를 CD47 제공자로 사용했다. 연속 희석된 항-CD47 항체의 존재 하에, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 모니터링하였다. PE Streptavidin(Biolegend, 405203, 1 : 200)을 SIRPa-비오틴의 변화를 모니터링하기위한 2 차 항체로 사용되었으며, AB06.12-4P는 SIRPa가 세포 표면에서 CD47에 결합하는 것을 차단하는 양성 대조군으로 사용되었다. 유세포분석기(BD, FACSJazz)를 사용하여 585nm 파장에서 평균값을 판독하고 GraphPad에 의해 IC50을 생성했다. 그 결과를도 5에 나타냈다.
실험 결과를 차단 활성 등급이 높음에서 낮음이 하기 순서임을 나타낸다: Hu26T-31-PE≥Hu34-39-PE≥AB06.12-P> Hu58A-14-PE
실시예 12 인간 위암 NUGC-4 이식 종양 모델에서 항-종양 시험
1. 실험 재료
(1) 실험 세포 및 동물
NUGC-4 인간 위암 세포는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입했다.
NOD-Scid 마우스, 암컷, 5-8 주령, 무게 18-20g을 Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.에서 구입했다.
(2) 테스트 샘플 및 컨트롤
레퍼런스 항체 이소타입 IgG4(Cat. No. AB170091)은 Crown Bioscience Co., Ltd.에서 구입하여 음성 대조군으로 사용했다.
실험 전, 본 발명의 인간화 항-CD47 항체를 PBS 내 0.6mg/mL 및 0.3mg/mL의 두 가지 농도로 준비하고, 이소타입 IgG4 및 AB 06.12-4P는 0.6mg/mL로 준비했다.
(3) 실험 방법
NUGC-4 인간 위암 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 10% 우태아 혈청 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토 마이신을 함유하는 RMPI1640 배지와 함께 배양하였다. 세포를 소화(digest)시키고, 2 mL 1×EDTA 용액으로 처리하고 일주일에 한번 계대시켰다(passaged). 세포 밀집이 80%-90%에 도달하면 세포를 수집하고, 계수하고, 시딩(seeded)했다. 5×106 세포를 포함하는 PBS를 100 uL Matrigel(최종 부피 200 μL)과 혼합했다. 마우스는 오른쪽 뒷면에 5×106 세포/마우스 혼합물을 주입하였다. 종양이 150-200 mm3의 부피로 자라면 마우스를 그룹화하고 테스트 샘플을 주당 3 회 복강 내(intraperitoneally) 투여했다. 종양 직경은 주 3 회 버니어 캘리퍼스(vernier caliper)로 측정되었고, 종양 부피는 V = 0.5a × b2의 계산 방정식으로 계산되었으며, 여기서 a와 b는 각각 종양의 긴 직경과 짧은 직경을 나타낸다. 항체의 항-종양 효능은 상대적인 종양 성장률 T/C(%)로 평가되었다. 상대적 종양 성장률 T/C (%)의 계산식은 다음과 같다: T/C% = TRTV/CRTV × 100% (TRTV: 처리 군 RTV; CRTV: 음성 대조군 RTV). RTV = V21/V0, 여기서 V0은 그룹화 및 투여되는 시점(0 일)에 측정된 종양 부피이고, V21은 투여 21 일(21 일)에 측정된 종양 부피이다. 투여군 및 비히클 군의 마지막 날(21 일)에 종양 부피를 GraphPad Prism을 사용한 t-테스트로 분석했다. 결과를 표 9에 나타냈다.
인간 위암 NUGC-4 이식 종양 모델에서의 항-종양 테스트 결과
항체 용량(Dose, mg/kg) T/C (%) p (vs. Isotype IgG4)
Isotype IgG4 6 86.61 -
AB06.12-4P 6 18.82 **
Hu26T-31-PE 3 12.24 ***
Hu26T-31-PE 6 2.96 ***
Hu34-39-PE 3 15.29 ***
Hu34-39-PE 6 3.45 ***
Isotype IgG4와 비교하여 ***는 p <0.001을 나타내고; **는 p <0.005를 나타낸다.
실험 결과는 본 발명의 항체가 인간 위암 NUGC-4 세포를 접종한 NOD-SCID 마우스 이식 종양 모델에서 유의한 항-종양 효과를 나타냄을 보여준다. 3mg/kg 용량의 Hu26T-31-PE 및 Hu34-39-PE는 6mg/kg 용량에서 기준 항체 AB06.12-4P와 동등한 종양 억제 효과를 보인 반면 Hu26T-31-PE 및 6mg/kg 용량의 Hu34-39-PE는 6mg/kg 용량에서 기준 항체 AB06.12-4P보다 더 나은 종양 억제 효과를 나타낸다. 약물 중단 1 주일 후, 6mg/kg 용량의 레퍼런스 항체 그룹에서 종양 재발이 발생했으며, 반면 Hu26T-31-PE 또는 Hu34-39-PE 그룹에서는 재발이 발생하지 않았다 (도 6 및 도 7). 이는 본 발명의 항-CD47 항체가 종양 성장 억제에 대해 예기치 않게 더 나은 효과를 가짐을 나타낸다.
상기 실시예는 본 발명의 항-CD47 항체가 유의한 항 종양 효과를 가지며 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있음을 입증하여, 상기 항체가 항-종양 약물의 제조에 사용될 수 있고 좋은 시장 전망을 가지고 있음을 시사한다.
이상 본 발명을 상세히 설명 하였지만, 당업자라면 본 발명 내용의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 명세서 내용에 대해 다양한 수정 및 변경이 가능함을 이해해야 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명에 한정되지 않고 첨부된 청구범위에 기인한다(attributable to).
SEQUENCE LISTING <110> NANJING SANHOME PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> ANTI-CD47 ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF <130> OP0020-XX-0591 <150> CN 201811009176.8 <151> 2018-08-31 <150> PCT/CN2019/103673 <151> 2019-08-30 <160> 74 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 <400> 1 Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 <400> 2 Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR3 <400> 3 Ala Arg Cys Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 <400> 4 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 <400> 5 Ile Thr Pro Gly Arg Gly Glu Thr 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR3 <400> 6 Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Gly Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 <400> 7 Gly Phe Ile Phe 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107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized light chain variable region <400> 68 Asp Ile Lys Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Phe Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe 20 25 30 Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Tyr Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Val Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Val Glu Phe Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 69 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized heavy chain variable region <400> 69 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Ala Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized heavy chain variable region <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Ala Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized heavy chain variable region <400> 71 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Ala Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 72 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized heavy chain variable region <400> 72 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Ala Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized light chain variable region <400> 73 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Val 20 25 30 Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 74 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized light chain variable region <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Val 20 25 30 Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys

Claims (16)

  1. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    중쇄 가변 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 아미노산 서열은 서열 번호 4, 5 및 6에 개시된, 중쇄 가변 영역이고; 그리고
    경쇄 가변 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 상기 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 아미노산 서열은 서열 번호 15, 16 및 17에 개시된, 경쇄 가변 영역인,
    항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 뮤린 유래 모노클로날 항체, 인간-뮤린 키메라 항체 또는 인간화 항체인, 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 뮤린 유래 IgG1, IgG2 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역 및 뮤린 유래 카파 사슬 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 22이고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 25인, 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 30이고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 33인, 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된(isolated) 핵산.
  7. 제6항에 있어서,
    (1) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열은 서열 번호: 35 또는 서열 번호: 36에 개시되어 있고;
    (2) 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열은 서열 번호: 39에 개시되어 있는, 핵산.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD47 활성을 억제하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 백혈병, 림프종, 유방암, 폐암, 위암, 장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 췌장암, 신경교종 및 흑색종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, 암 치료용 약제학적 조성물.
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