CN110872350A

CN110872350A - 抗cd47抗体及其应用

Info

Publication number: CN110872350A
Application number: CN201910817746.4A
Authority: CN
Inventors: 王勇; 赵立文; 宋其峰; 朱永强; 张亚楠; 韩璐薇; 金亮; 吴文明
Original assignee: Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2039-08-30
Also published as: EP3845561A4; TWI830774B; WO2020043188A1; KR102587442B1; CA3110620A1; CN110872350B; JP2021535743A; KR20210050538A; US20220119520A1; CN112601762B; CN112601762A; EP3845561A1; CA3110620C; JP2023075294A; JP7583707B2; US11987627B2; TW202024130A

Abstract

本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，包含抗CD47抗体或其抗原结合片段的药物组合物以及它们的应用。本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段具有显著的抗肿瘤活性，与人CD47蛋白的亲和力较高，可阻断SIRPa结合到细胞表面CD47的能力，且不具有显著的红细胞凝集活性，可在制备抗肿瘤的药物中应用。

Description

抗CD47抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，包含抗CD47抗体或其抗原结合片段的药物组合物以及它们的应用

背景技术

CD47蛋白又称整合素相关蛋白(IAP)，属于IgG超家族的一个五次跨膜糖蛋白，广泛表达于不同组织细胞。CD47可与配体TSP-1或SIRPα结合，调控不同的细胞功能，包括细胞迁移、粘附、凋亡，轴突延伸，细胞因子产生及T细胞激活。SIRPα是一个含有典型免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)跨膜蛋白，主要表达于髓系造血细胞膜表面，如巨噬细胞，树突状细胞等。CD47与SIRPα结合后，导致ITIMs的磷酸化，从而招募SHP-1/SHP-2，进而抑制肌球蛋白IIA在吞噬突触的积累，最终抑制吞噬细胞的吞噬功能。

肿瘤细胞的“免疫逃逸”被认为是肿瘤发生、发展和抗药的主要机制。肿瘤细胞通过高表达CD47分子，与巨噬细胞表面的SIRPα相互作用，可显著抑制巨噬细胞的吞噬活性，避免被巨噬细胞吞噬掉。当阻断CD47与SIRPα的结合时，可消除因肿瘤导致的免疫抑制或免疫耐受，有效杀伤肿瘤细胞。这为CD47的肿瘤免疫靶向治疗提供了极为有力的理论依据。

近年来，国内外针对CD47/SIRPα信号通路的各种治疗方式进行了大量研究，例如抗CD47抗体、抗SIRPα抗体、重组SIRPα蛋白、双特异性抗体。其中，CD47阻断性抗体被认为是其中最有希望的肿瘤治疗方案。人CD47阻断型单抗的有效性已经在多种临床前模型中证实，比如淋巴瘤、膀胱癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌、急性淋巴细胞性白血病和急性骨髓性白血病等。

此外，由于红细胞、血小板也表达CD47分子，当抗体阻断CD47与SIRPα的相互作用时，可能导致这些细胞失去“别吃我”信号的保护，进而被巨噬细胞吞噬。因此要避免抗CD47抗体的副作用，比如血小板降解，红细胞凝集，红细胞耗竭，贫血等也是应用抗CD47抗体需要考虑的一个重点。

因此，需要提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其具有优异的抗肿瘤活性且不具有显著的红细胞凝集活性。

发明内容

本发明一方面提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中所述重链可变区包含重链可变区的互补决定区1(HCDR1)、重链可变区的互补决定区2(HCDR2)和/或重链可变区的互补决定区3(HCDR3)，所述轻链可变区包含轻链可变区的互补决定区1(LCDR1)、轻链可变区的互补决定区2(LCDR2)和/或轻链可变区的互补决定区3(LCDR3)。

在一些实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：

(1)所述重链可变区包含选自如下组的HCDR1、HCDR2和HCDR3：

(a1)如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列；

(a2)如SEQ ID NO:10、2和11所示的氨基酸序列；

(a3)如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列；和

(a4)如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列；

(a5)与(a1)、(a2)、(a3)或(a4)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR；和

(2)所述轻链可变区包含选自如下组的LCDR1、LCDR2和LCDR3：

(a6)如SEQ ID NO:12、13和14所示的氨基酸序列；

(a7)如SEQ ID NO:15、16和17所示的氨基酸序列；和

(a8)如SEQ ID NO:18、19和20所示的氨基酸序列；

(a9)与(a6)、(a7)或(a8)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR。

在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:1、2和3或与SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:12、13和14或与SEQ ID NO:12、13和14所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区。

在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:10、2和11或与SEQ ID NO:10、2和11所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:12、13和14或与SEQ ID NO:12、13和14所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区。

在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:4、5和6或与SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:15、16和17或与SEQ ID NO:15、16和17所示的氨基酸序列具有至少85％，序列同一性的CDR的轻链可变区。

在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:7、8和9或与SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列具有至少85％，序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:18、19和20或与SEQ ID NO:18、19和20所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区。

在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。

在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段是鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段或人源化抗体或其抗原结合片段。

在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中

(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：

(b1)如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；

(b2)(b1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和

(b3)与(b1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和

(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：

(b4)如SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；

(b5)(b4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和

(b6)与(b4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:21经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:21功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24，SEQ IDNO:24经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:24功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:22经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:22功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:25，SEQ IDNO:25经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:25功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:23功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:26，SEQ IDNO:26经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:26功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:27经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:27功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24，SEQ IDNO:24经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:24功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:23功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:28，SEQ IDNO:28经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:28功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:21经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:21功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:24经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:24功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:12、13和14所示的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:22经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:22功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:25经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:25功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:15、16和17所示的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:23功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:26经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:26功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:18、19和20所示的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:27经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:27功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:1、2和11所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:24经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:24功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:12、13和14所示的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:23功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:28经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:28功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:18、19和20所示的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗CD47抗体为鼠源抗体，其还含有鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4或其变体的重链恒定区，和鼠源的κ链或其变体的轻链恒定区。

在一些优选的实施方案中，根据本发明的抗CD47鼠源抗体还含有鼠源的IgG1或IgG2或其变体的重链恒定区，和鼠源κ链或其变体的轻链恒定区。

在一些具体的实施方案中，本发明提供抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其中：

(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：

(c1)如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；

(c2)(c1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和

(c3)与(c1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和

(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：

(c4)如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列；

(c5)(c4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和

(c6)与(c4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:29经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:29功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:32，SEQID NO:32经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:32功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:30经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:30功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:33，SEQID NO:33经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:33功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:31经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:31功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:34，SEQID NO:34经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:34功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:29经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:29功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:10、2和11所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:32经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:32功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:12、13和14所示的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:30经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:30功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:33经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:33功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:15、16和17所示的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，本发明提供抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:31经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:31功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:34经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:34功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:18、19和20所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供一种抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包含人源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，所述轻链包含人源的κ、λ链或其变体的轻链恒定区。

在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源抗CD47抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，和/或进一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。

在本发明一个优选的实施方案中，所述的抗CD47嵌合抗体或其抗原结合片段的抗体轻链进一步包含鼠源κ、λ链或其突变序列的轻链恒定区。所述的抗CD47嵌合抗体或其抗原结合片段的抗体重链进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、gG4或其突变序列的重链恒定区，优选包含人源IgG1或IgG2重链恒定区，或者使用氨基酸突变后显著降低ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG4恒定区。

在一些具体的实施方案中，本发明的抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段还包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，和人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。在一些优选的实施方案中，本发明的抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段还包含人源IgG1或IgG2或其变体的重链恒定区，和人源κ链或其变体的轻链恒定区。

在一些实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段为Fab、Fv、sFv或F(ab)2。

本发明的另一方面提供一种分离的核酸，其编码根据本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段。

在一些具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其中编码重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37所示；编码轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40所示。

在一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其中编码重链可变区SEQID NO:29的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示；编码轻链可变区SEQ ID NO:32的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。

在一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其中编码重链可变区SEQID NO:30的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示；编码轻链可变区SEQ ID NO:33的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示。

在一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其中编码重链可变区SEQID NO:31的核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示；编码轻链可变区SEQ ID NO:34的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示。

本发明的另一方面提供一种表达载体，其表达本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段。根据本发明的表达载体其包含本发明的分离的核酸分子。

本发明的另一方面提供一种如上所述的表达载体转化的宿主细胞。

在一些实施方案中，根据本发明的宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。在一些实施方案中，所述的宿主细胞为细菌，优选为大肠杆菌。在另一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。

本发明的另一方面提供制备本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段的方法，包括在所述宿主细胞中表达抗体以及从宿主细胞中分离所述抗体的步骤。

本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含本发明的抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体。在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段，还包含其他活性组分，如其他抗体、靶向药物等。在一些实施方案中，所述药学可接受的载体选自抗氧化剂、多肽、蛋白质、亲水性聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、糖醇、离子和表面活性剂。在一个具体的实施方案中，所述药学可接受的载体为缓冲水溶液。在另一个具体的实施方案中，所述药学可接受的载体为脂质体的形式。

可以将本发明的抗CD47人源化抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括，但不限于经口、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、脑内、眼内、气管内、皮下、鼻内途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的另一方面提供抑制CD47活性的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物。

本发明的另一方面提供本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物在制备抑制CD47活性的药物中的应用。在一些实施方案中，所述抑制CD47活性的药物用于治疗白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤和/或黑素瘤。在一些实施方案中，本发明提供上述抗CD47抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用，优选地，所述肿瘤选自白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤和黑素瘤。

本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段具有显著的抗肿瘤作用，可明显抑制肿瘤增长，且不具有显著的红细胞凝集活性，人源化后的抗体免疫原性大大降低，有效消除人体免疫系统对外源性单抗的排异反应，可在制备用于治疗各类肿瘤疾病的药物中应用，具有广阔的市场前景。

定义

除非另有定义，本文中使用的科学和技术术语的含义是本领域技术人员所通常理解的含义。本文中所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡或多核苷酸化学及杂交中使用的命名和技术是本领域公知且普遍使用的。对于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养与转化(如电穿孔、脂质转染)，使用了标准技术。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明书或本领域普遍使用或本文所述的方法进行。前述技术和方法通常根据本领域公知且本说明书中引用和讨论的多部综合和较具体的文献中描述的那样使用。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，纽约冷泉港(1989))。本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药学化学中使用的命名以及实验室方法和技术是本领域公知且普遍使用的。

在本发明中，术语“至少80％序列同一性”是指至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的序列同一性。在本发明中，术语“至少85％序列同一性”是指至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的序列同一性。在一些优选的实施方案中，本发明所述的序列同一性可以至少为90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可以通过National Center For Biotechnology Instutute网站上的BLASTN/BLASTP算法来进行。

在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中以相对彼此的位置排列以形成抗原结合表面。抗原结合表面与所结合抗原的三维表面互补，且每条重链和轻链的三个高变区均被称作“互补决定区”或“CDR”。氨基酸向每个结构域的分配是根据Kabat《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，Chothia等，Nature 342:878-883(1989)定义。

本发明所述的“抗原结合片段”是指具有抗原结合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段及与人CD47结合的Fv片段、scFv片段。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体或单链Fv(scFv)。

本发明所述的抗体指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即包含特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”指抗体与抗原的一种或多种抗原决定簇反应而不与其他多肽反应或以很低的亲和性(Kd>10^-6)结合其他多肽。抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、dAb(结构域抗体)、单链、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv、scFv及Fab表达文库。单克隆抗体(mAb)是由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术及合成技术如CDR grafting或其它现有技术进行重组得到。

本发明所述的“鼠源抗体”为根据本领域知识和技能制备的对人CD47的单克隆抗体。制备时用CD47抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。

本发明所述的“嵌合抗体”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。

本发明所述的“人源化抗体”也称为CDR移植抗体，是将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架(FR)中产生的抗体。此类可变区框架序列可以从公共的DNA数据库或公开的参考文献获得，例如从ImMunoGeneTics(IMGT)网站http://imgt.cines.fr得到或从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。

附图说明

图1是抗CD47人源化抗体与猴CD47结合活性测定(ELISA)结果。

图2是抗CD47人源化抗体与人CD47结合活性测定(ELISA)结果。

图3是抗CD47人源化抗体与细胞表面CD47结合活性测定(ELISA)结果。

图4是红细胞凝集实验结果，其中RBC：阳性对照；PBS：空白对照。

图5是FACS检测抗CD47人源化抗体阻断活性实验结果。

图6是抗CD47人源化抗体Hu34-39-PE人胃癌NUGC-4移植瘤模型抗肿瘤试验结果。

图7是抗CD47人源化抗体Hu26T-31-PE人胃癌NUGC-4移植瘤模型抗肿瘤试验结果。

具体实施方式

下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。以下实施例中未注明条件的实验方法通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册、分子克隆手册等，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件进行。实施例中使用的材料、试剂如无特殊说明均为商购获得。

实施例1抗原蛋白及阳性对照抗体的制备

1、抗原蛋白及阳性对照抗体的表达载体构建

(1)抗原蛋白的表达载体构建

合成编码CD47蛋白全长的基因片段，氨基酸序列设计如SEQ ID NO:41所示，然后克隆到真核表达质粒pTargeT上，获得其表达质粒pTargeT-CD47。

融合人源CD47蛋白胞外区氨基酸序列与hIgG1-Fc或his标签氨基酸序列，氨基酸序列设计分别如SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示。对上述氨基酸序列进行密码子优化后合成带有标签的CD47蛋白胞外区基因片段CD47-hFc、CD47-his，并将其分别克隆至真核表达质粒pHR中，获得其表达质粒pHR-CD47-hFc、pHR-CD47-his。

融合人源CD47蛋白胞外区氨基酸序列与mIgG1-Fc氨基酸序列，氨基酸序列设计如SEQ ID NO:44所示。对该氨基酸序列进行密码子优化后合成完整的表达质粒pcDNA3.1(+)-TPA-CD47-mIgG1-Fc。

SIRPα的序列如SEQ ID NO:45所示，对所述序列进行密码子优化后合成完整的表达质粒pcDNA3.1(+)-SIRPα-myc-His。

(2)阳性对照抗体的表达载体构建

使用专利申请WO2013/119714中公开的抗体AB6.12-IgG4P(本文简称AB06.12-4P)作为阳性对照抗体，AB06.12-4P的氨基酸序列如下所示：

AB06.12-4P重链氨基酸序列：SEQ ID NO:46；

AB06.12-4P轻链氨基酸序列：SEQ ID NO:47。

对上述抗体序列所对应的氨基酸序列进行密码子人工优化，获得阳性对照抗体AB06.12-4P的重链及轻链表达质粒pcDNA3.1(+)-SHC025-hG4、pcDNA3.1(+)-SHC025-hk。并将其重链基因片段克隆到含有IgG4轻链恒定区的真核表达质粒pHR上，获得AB06.12-4P的重链真核表达质粒pHR-SHC025-hG4-4PE，其轻链表达质粒为pcDNA3.1(+)-SHC025-hk。

2、抗原蛋白及阳性对照抗体的表达与纯化

(1)抗原蛋白的稳转细胞株的构建

将真核表达质粒pTargeT-CD47在160V电压，15msec的方形脉冲下以电转的方式转染到CHO-K1细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所)，置37℃，5％CO₂的培养箱中培养。24h后采用含500ug/ml G418的培养基加压培养。16天后采用FACS检测pool阳性率，将电转质粒后的细胞铺板(1x10⁶个/ml的细胞密度，100ul/孔)，采用PE mouse anti-human CD47抗体(BD，556046)与细胞孵育，以流式细胞仪(BD，FACSJazz)读取585nm波长下mean值，使用GraphPad进行数据分析。将阳性细胞株进行亚克隆，挑选出克隆化的CHO-K1细胞株，该细胞株高水平表达CD47分子，命名为CHO-K1-E5。

(2)标签抗原蛋白及阳性对照抗体的表达

在1L细胞培养瓶中接种密度为0.5x 10⁶个细胞/ml的293F细胞，加入新鲜的预热的FreeStyle293表达培养基，使接种后总体积达到250mL，置37℃，8％CO₂，加湿的CO₂培养箱中培养过夜。取8.5mL FreeStyle 293表达培养基，加入1mg/ml的PEI溶液500ul，混合均匀，取250ug待转染质粒加入8.5ml FreeStyle 293表达培养基中，混合均匀，其中标签抗原蛋白质粒pHR-CD47-hFc、pHR-CD47-his、pcDNA3.1(+)-TPA-CD47-mIgG1-Fc、pcDNA3.1(+)-SIRPα-myc-His分别转染；阳性对照抗体AB06.12-4P重链质粒pHR-SHC025-hG4-4PE和轻链质粒pcDNA3.1(+)-SHC025-hk共同转染。将PEI与FreeStyle 293表达培养基的混合溶液加入到质粒中，混合均匀，然后加入细胞培养物中，置37℃，8％CO₂，加湿的CO₂培养箱中培养。在细胞转染后第1天和第3天对细胞进行补料，每瓶加入2.5ml的谷氨酰胺(母液浓度为200mM)和5ml的葡萄糖(母液浓度为180g/L)。当细胞细胞活力降至65％～75％时，收集细胞上清。将细胞培养物1500rpm离心5min，收集上清，再8000rpm离心20min，收集上清。

(3)亲和层析柱纯化

利用AKTA(GE，AKTA pure-150)根据蛋白性质采用不同的亲和层析柱进行纯化(不同蛋白适配的亲和层析柱见表1)，具体纯化步骤如下：

表1不同蛋白适配的亲和层析柱

清洗：超纯水清洗设备及管路2min，流速10mL/min，后用0.1M NaOH清洗层析系统；

接柱：将层析柱接入层析设备，并用超纯水冲洗5min；后0.1M NaOH冲洗30min，保留时间5min；

平衡：20mM PB+0.15M NaCl，pH 7.2平衡5个CV(柱体积)；

上样：将细胞表达上清上样，保留时间5min；

后平衡：20mM PB+0.15M NaCl，pH 7.2平衡5个CV；

洗脱：50mM醋酸，pH＝3.4洗脱，保留时间5min。UV280至50mAu左右时开始收集，降至50mAu左右时停止收集。用1M Tris-HCl，pH 9.0将样品pH调节至7.0；

再平衡：20mM PB+0.15M NaCl，pH 7.2平衡3个CV，保留时间5min；

在线清洗：0.1M NaOH清洗30min，保留时间5min；

清洗保存：纯化水清洗10min，后20％乙醇2个CV。

实施例2单克隆抗体的制备

1、杂交瘤单克隆的制备

(1)动物免疫

采用不同标签的抗CD47抗原蛋白与佐剂共同免疫的方法免疫SJL品系的实验小鼠，首次抗原使用50ug抗原，后期使用25ug抗原免疫。

免疫佐剂可以是Quick Antibody-Mouse5W(北京博奥龙免疫技术有限公司)或Titer Max(Sigma)与CpG(金斯瑞生物科技有限合成)/Alum(thermo)佐剂间隔。将不同标签的CD47抗原蛋白样品逐滴加入到佐剂溶液中，边滴加边涡旋以充分混合，佐剂使用剂量参考说明书进行。混合均匀形成油包水的乳状后免疫SJL小鼠。

高水平表达CD47分析的细胞系如CCRF-CEM和CHO-K1-E5也用来免疫小鼠，使之产生抗体。用胰蛋白酶消化处理正在培养的人急性淋巴白血病细胞(CCRF-CEM)和实施例1中获得的CHO-K1-E5阳性单细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞沉淀，取样用细胞计数仪计数，剩余样品1000rpm离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞沉淀，计入适量的PBS以获得1x10⁸个细胞/ml的细胞悬液。实验组小鼠每只免疫1x10⁷个细胞。

免疫方案如表2所示：

表2小鼠免疫方案

组别	抗原	佐剂	免疫途径*
				1	PBS	无
2	CD47-his/CD47-mFc	Quick Antibody-Mouse5W	i.m.
				3	CD47-his/CD47-mFc	Titer Max/CpG/Alum	s.c./i.m.
4	CD47-mFc	Quick Antibody-Mouse5W	i.m.
				5	CD47-mFc	Titer Max/CpG/Alum	s.c./i.m.
6	CCRF-CEM/CHO-K1-E5	无	i.p.

*i.m.肌内注射；s.c.皮下注射；i.p.腹腔注射。

(2)杂交瘤融合

脾细胞的获取和制备：将加强免疫后的小鼠处死后浸泡75％的酒精中。解剖取出脾脏，用研磨棒研磨后，经细胞筛网过滤后制备成单细胞悬液。将脾细胞悬液2000rpm离心5min，弃上清。加入2mL红细胞裂解液，室温裂解红细胞2min，加入PBS至20mL，1500rpm离心7min，弃上清，重悬后进行活细胞计数。收集培养瓶中的Sp2/0细胞，1000rpm离心5min后弃上清，重悬后进行活细胞计数。按脾细胞：Sp2/0细胞＝1:1的比例混合细胞，1500rpm离心7min后弃上清。用20mL电转缓冲液重悬细胞，1500rpm离心7min。弃上清，重复一次。分别用适量电转缓冲液重悬细胞，保证细胞浓度2×10⁷个细胞/mL左右。把细胞悬液加入9mL电转融合槽中融合。融合后将细胞悬液转入到含有20％FBS的15mL RPMI 1640完全培养基中，室温放置20min。用含1×HAT、1×BIOMYC3、20％FBS的RPMI 1640培养基重悬融合细胞。按100μl/孔将细胞悬液加到若干块96孔细胞培养板中，保证每孔细胞量约为4×10⁴个细胞/孔，置于37℃细胞培养箱中培养。5天后补加100μL/孔RPMI 1640完全培养基(含20％FBS，1×HAT，1×BIOMYC-3)。

(3)杂交瘤及亚克隆上清的筛选

融合一周后，取细胞上清，通过ELISA筛选出能结合CD47-his蛋白或细胞表面CD47的杂交瘤上清，利用CD47-his筛选针对CD47而非hFc、mFc的抗体。然后利用ELISA分析杂交瘤上清阻断CD47-SIRPα相互作用的能力。包被SIRPα-myc-his于酶标板上，加入重组人源蛋白CD47-hFc与杂交瘤上清的混合物孵育2h，加入HRP标记的anti human IgG Fc特异性抗体(Jackson Immuno Research)孵育1h，利用酶标仪检测450nm处的吸光值。将筛选获得的具有结合能力及阻断能力的杂交瘤母克隆扩大培养，进行结合活性及阻断活性的复测，再次筛选获得具有结合及阻断能力的杂交瘤阳性克隆。

利用有限稀释法将阳性细胞株进行亚克隆，培养一周后利用ELISA检测亚克隆上清与CD47分子的结合活性以及阻断CD47-SIRPα相互作用的活性，获得3种双阳性细胞株，分别标记为SHC025-26、SHC025-34、SHC025-58。

2、亚型的鉴定

参照鼠抗体亚型鉴定试剂盒SBA Clonotyping Systerm-C57BL/6-HRP(SouthernBiotech，货号：5300-05B)说明书对抗体进行亚型鉴定，结果如表3所示：

表3抗体亚型鉴定结果

命名	抗体亚型
		SHC025-26	IgG1/k
SHC025-34	IgG2c/k
		SHC025-58	IgG2b/k

3、单克隆抗体的制备

根据亚克隆上清活性分析结果确定单克隆抗体母克隆株SHC025-26、SHC025-34、SHC025-58，将其扩大培养。培养条件是含有10％胎牛血清、1x NAEE、1x丙酮酸钠、1％青链霉素双抗的1640培养基，待细胞汇合度大于>80％时，进将细胞传代扩培，待培养至约50ml时收集上清，纯化抗体。获得抗体经SDS-PAGE凝胶电泳确定纯度良好。

4、单克隆抗体测序

将经亚克隆操作的阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，取适量细胞按RNeasy PlusMini Kit(Qiagen，74134)试剂盒说明书提取总RNA，利用Prime Script 1st strand cDNASynthesis Kit(Takara，6110A)反转录试剂盒合成cDNA第一条链。

根据小鼠抗体亚型可变区设计特异性引物(5’端含有用于与真核表达载体发生同源重组的同源臂序列)，以cDNA为模板进行抗体可变区基因的PCR扩增，从而分别获得小鼠抗体轻链与重链可变区的基因片段；设计引物(参考文献：1.Anke Krebber,SusanneBornhauser,Jorg Burmester etal.Reliable cloning of functional antibodyvariable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing areengineered phage display system.Journal of Immunological Methods,1997,201:35–55；2.Simon KorenMiha

Colja Venturini etal.Antibody variable-region sequencing as a method for hybridoma cell-line authentication,2008,78:1071–1078)，进行DNA测序获得序列，测序结果见表4。

表4抗CD47鼠源单克隆抗体序列表

抗体	重链可变区氨基酸序列	轻链可变区氨基酸序列
			SHC025-26	SEQ ID NO:21	SEQ ID NO:24
SHC025-34	SEQ ID NO:22	SEQ ID NO:25
			SHC025-58	SEQ ID NO:23	SEQ ID NO:26

实施例4嵌合抗体的构建

将纯化后(纯化步骤见实施例1)的小鼠抗体轻链与重链可变区基因片段分别与线性化的含有人抗体轻链或重链恒定区的真核表达质粒共转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将混合液均匀涂布于含有相应抗生素的琼脂平板表面，于37℃恒温培养箱过夜培养后分别挑取若干单菌落进行DNA测序；将测序正确的嵌合抗体分别标记为SHC025-26CHI、SHC025-34CHI、SHC025-58CHI。

将测序正确的阳性克隆接种于含有相应抗生素的2×YT液体培养基中，于37℃振荡培养12小时以上，然后收集菌体进行质粒提取，从而获得嵌合抗体轻链与重链表达质粒，使用核酸定量分析仪检测质粒的浓度与纯度。

将嵌合抗体转染HEK293E细胞，表达纯化获得大量抗体，进行纯度检测、活性分析及亲和力的检测。

测序发现，在SHC025-26的重链CDR第118位，以及SHC025-58的轻链CDR第56位各自含有一个半胱氨酸，CDR区域的半胱氨酸在表达时会与抗体分子上的其他半胱氨酸随机配对氧化形成二硫桥，从而极大的影响抗体纯度。为解决之一问题，对SHC025-26CHI、SHC025-58CHI氨基酸序列进行如下改造：将SHC025-26CHI重链之C118突变为T，标记为SHC025-26CHI-T；将SHC025-58CHI轻链之C56突变为A，标记为SHC025-58CHI-A，利用定点突变的方法构建突变基因。嵌合抗体测序结果见表5。

表5抗CD47嵌合抗体序列表

嵌合抗体	重链可变区氨基酸序列	轻链可变区氨基酸序列
			SHC025-26CHI	SEQ ID NO:21	SEQ ID NO:24
SHC025-26CHI-T	SEQ ID NO:27	SEQ ID NO:24
			SHC025-34CHI	SEQ ID NO:22	SEQ ID NO:25
SHC025-58CHI	SEQ ID NO:23	SEQ ID NO:26
			SHC025-58CHI-A	SEQ ID NO:23	SEQ ID NO:28

实施例5人源化抗体的构建及生产

根据嵌合抗体的活性分析、亲和力KD值等结果选择SHC025-34CHI、SHC025-58CHI-A、SHC025-26CHI-T进行人源化抗体改造。

抗体的人源化改造，首先是通过与免疫基因数据库(IMGT)中的小鼠抗体序列进行比对，确认SHC025-34CHI、SHC025-58CHI-A、SHC025-26CHI-T抗体可变区的鼠源种系，经过同源比对，SHC025-34CHI、SHC025-58CHI-A、SHC025-26CHI-T抗体的重链可变区序列的FR区分别与小鼠抗体种系基因IGHV1-8*01、IGHV3-21*04以及IGHV1-2*02最为相似；抗体轻链可变区的FR序列则分别与小鼠抗体IGKV3-11*01、IGKV1-5*01以及IGKV4-1*01最为相似。以SHC025-34CHI/SHC025-58CHI-A抗体框架区序列FR1-FR3作为模板，在人框架区库中寻找3D结构相似但是免疫原性较低的全人框架替代SHC025-34CHI/SHC025-58CHI-A的FR1-FR3序列，重链/轻链全长序列进行3D建模并和原抗体重链/轻链序列进行结构比对分析，综合考虑抗原性和3D结构相似度，最终选择SHC025-34CHI的6条人源化重链可变区(参见SEQ IDNO:48、49、50、51、52、53)和4条人源化轻链可变区(参见SEQ ID NO:54、55、56、57)及SHC025-58CHI-A的6条人源化重链可变区(参见SEQ ID NO:58、59、60、61、62、63)和5条人源化轻链可变区(参见SEQ ID NO:64、65、66、67、68)进行下一步优化。SHC025-34CHI/SHC025-58CHI-A人源化抗体非CDR区序列均达到95％以上人源化。用SHC025-26CHI-T重轻链的可变区序列，在Protein Data Bank中进行结构比对分析，选择最相近的FR1-FR3序列替换掉鼠源序列，并将在结构模拟中显示对抗体结构稳定起到关键作用的的氨基酸位点回突变为鼠源性氨基酸残基。最终获得SHC025-26CHI-T的4条人源化重链可变区(参见SEQ ID NO:69、70、71、72)和2条人源化轻链可变区(参见SEQ ID NO:73、74)。

将以上设计好的人源化抗体轻链与重链可变区氨基酸序列反转录成相对应的核苷酸序列，并生成相邻片段之间含有互补序列的寡核苷酸片段，通过Overlap PCR将寡核苷酸片段退火后连接起来，再利用特异性引物(5’端含有用于与真核表达载体发生同源重组的同源臂序列)扩增出完整的轻链与重链可变区核苷酸片段；将纯化后的轻链可变区核苷酸片段与线性化的含有IgG4轻链恒定区的真核表达质粒共转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将纯化后的重链可变区核苷酸片段与含S228P/L235E突变的IgG4重链恒定区的真核表达质粒共转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，分别将转化质粒的感受态细胞均匀涂布于含有相应抗生素的琼脂平板表面，于37℃恒温培养箱过夜培养后分别挑取若干单菌落进行DNA测序。

将测序正确的阳性克隆接种于含有相应抗生素的2×YT液体培养基中，于37℃振荡培养12小时以上，然后收集菌体进行质粒提取，从而获得人源化抗体轻链与重链表达质粒，使用核酸定量分析仪检测质粒的浓度与纯度。

将质粒转染HEK293E细胞，表达纯化获得大量抗体，进行纯度检测、活性分析及亲和力的检测。

挑选纯度、活性和亲和力均较好的人源化抗体，标记为Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE，序列见表6。人源化抗体来源见表7。

表6抗CD47人源化抗体序列表

表7人源化序列设计信息

实施例6与猴CD47结合活性测定(ELISA)

采用protein based Elisa分析抗体的结合活性。食蟹猴CD47-His(0.1μg/孔，ACRO Biosystems，Cat.No.CD7-C52H1-50ug)包被96孔酶标板。本发明提供的抗CD47抗体作为一抗从2μg/mL开始，5倍梯度稀释加入酶标板，共8个浓度，浓度分别为2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL、0.64ng/mL、0.128ng/mL、0ng/mL，37℃孵育1.5h，阳性对照抗体为AB06.12-4P。二抗使用Anti-Human IgG HRP(Jackson，109-035-003，1:10000)，加入显色液TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，终止后利用酶标仪(thermo，Multiskan FC)读取OD450值。使用GraphPad生成EC50，结果如图1所示。

实验结果显示本发明提供的人源化抗CD47抗体Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE均具有与食蟹猴CD47结合的能力，且结合能力与阳性对照抗体AB06.12-4P相当。

实施例7与人CD47结合活性测定(ELISA)

采用ELISA分析抗体的结合活性。将人CD47-His蛋白(0.1ug/孔，实施例1、2中制得)包被到96孔酶标板，37℃孵育2h。用1xPBST清洗3次后用5％的脱脂牛奶4℃封闭过夜。用1xPBST清洗3次后，本发明提供的抗CD47抗体作为一抗从2μg/mL开始，5倍梯度稀释加入酶标板，共8个浓度，浓度分别为2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL、0.64ng/mL、0.128ng/mL、0ng/mL，37℃孵育1.5h，阳性对照抗体为AB06.12-4P；用1xPBST清洗5次后，二抗使用Anti-Human IgG HRP(Jackson，109-035-003，1:10000)，37℃孵育40min。用1xPBST清洗5次后，加入显色液TMB，终止后利用酶标仪(thermo，Multiskan FC)读取OD450值。使用GraphPad生成EC50，结果如图2所示。

实验结果显示本发明提供的人源化抗CD47抗体Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE均具有与人CD47结合的能力，且结合能力与阳性对照抗体AB06.12-4P相当。

实施例8与细胞表面CD47结合的测定(ELISA)

采用Cell based Elisa分析抗体的结合活性。CHO-K1-E5细胞以每孔1x10⁵个细胞的方式铺细胞板，置于37℃，5％CO₂的条件下过夜培养；第二天用4％的多聚甲醛固定后用脱脂牛奶封闭1h；用1xPBS轻柔清洗细胞板；本发明提供的抗CD47抗体作为一抗从2μg/mL开始，5倍梯度稀释加入细胞板，共8个浓度，浓度分别为2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL、0.64ng/mL、0.128ng/mL、0ng/mL，37℃孵育1.5h，阳性对照抗体为AB06.12-4P；二抗使用Anti-Human IgG HRP(Jackson，109-035-003，1:10000)，加入显色液TMB，终止后利用酶标仪(thermo，Multiskan FC)读取OD450值。使用GraphPad生成EC50，结果如图3所示。

实验结果显示，本发明提供的人源化抗CD47抗体Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE均可与细胞表面CD47结合，且结合能力与阳性对照抗体AB06.12-4P相当。

实施例9与人CD47蛋白的亲和力测定

利用Fortebio Octet对实施例1、2中制得的人源化抗CD47抗体结合抗原CD47(19-136)-hFC的亲和力进行测定。先将抗原CD47(19-136)-hFc生物素化标记，然后用10kD的超滤管，PBS离心超滤脱盐3-4次，Nanodrop测定生物素标记后抗原CD47-hFc-Biotin的实际浓度。将CD47-hFc-Biotin用SD缓冲液(0.02％Tween20+0.1％BSA溶液)稀释到浓度5ug/ml，所述人源化抗CD47抗体用SD缓冲液4倍浓度梯度稀释，使其浓度为10ug/ml、2.5ug/ml、0.625ug/ml、0ug/ml，选用SA传感器固化该抗原，按fortebio Octet RED96的操作规程进行亲和力测定，具体参数及实验结果如表8所示。

表8与人CD47蛋白的亲和力测定

实验结果显示，与阳性对照抗体相比，Hu26T-31-PE与人CD47蛋白结合具有更高的亲和力。

实施例10红细胞凝集实验

取5mL血液加入40mL PBS，2000rpm轻柔离心5min，弃上清，用PBS洗涤三次，然后用PBS重悬红细胞，按红细胞积压，配制2％的红细胞悬液。待分析抗体起始浓度为1-20uM之间，2倍梯度稀释，共24个浓度梯度。圆底96孔板中加入上述50μL不同浓度抗体，然后加入50ul上述2％的红细胞悬液，混匀，室温放置。2h后观察是否有凝集现象。兔多克隆抗体RBC抗体(Rockland，109-4139)作为红细胞凝集发生的阳性对照，结果如图4所示。如图4所示，96孔板从左至右加入的抗体(兔多克隆抗体RBC抗体、AB06.12-4P抗体及本发明待测抗体)浓度从20uM起始2倍梯度依次稀释，其中RBC表示阳性对照组(使用兔多克隆抗体RBC抗体，显著引起红细胞凝集)，PBS表示空白对照组。孔中红细胞小圆点状，边缘整齐表示不引起细胞凝集；边缘略不整齐表示少量红细胞凝集；片状，布满孔底表示大部分红细胞凝集。

经测定，专利申请WO2011/143624中公开的抗CD47抗体Hu5F9-G4在相同浓度范围内能引起显著的大部分红细胞凝集，此为抗CD47抗体的普遍不良现象。而在相同的条件下，如实验结果显示，本发明的Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE均不会引起红细胞凝集现象，本发明的抗体在此方面明显优于抗体Hu5F9-G4。

实施例11FACS检测CD47阻断活性实验

采用FACS检测本发明提供的抗CD47抗体阻断SIRPa结合到细胞表面CD47的能力。

CHO-K1-E5阳性细胞株作为CD47提供者，在梯度稀释的抗CD47抗体存在的情况下，观察CD47与SIRPa的结合能力。二抗使用PE Streptavidin(Biolegend，405203，1:200)来监测SIRPa-Biotin的变化。AB06.12-4P作为阻断SIRPa结合到细胞表面CD47的阳性对照。流式细胞仪(BD，FACSJazz)读取585nm波长下mean值，使用GraphPad生成IC50，结果如图5所示。

实验结果显示，阻断活性依次排序为Hu26T-31-PE≧Hu34-39-PE≧AB06.12-P﹥Hu58A-14-PE。

实施例12人胃癌NUGC-4移植瘤模型抗肿瘤试验

1、实验材料

(1)实验细胞及动物

NUGC-4人胃癌细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)；

NOD-Scid小鼠，雌性，5-8周龄，体重18-20克，购自上海灵畅生物科技有限公司；

(2)供试品及对照品对照品Isotype IgG4(货号AB170091)购自中美冠科生物技术有限公司，用作阴性对照品；

试验前，将本发明的人源化抗CD47抗体用PBS配制为0.6mg/mL和0.3mg/mL两个浓度，Isotype IgG4和AB 06.12-4P配制为0.6mg/mL。

(3)实验方法

用含有10％胎牛血清，100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素的RMPI1640培养基在37℃、5％CO₂的培养箱中培养NUGC-4人胃癌细胞。一周一次用2mL 1×EDTA溶液消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％时，收取细胞，计数，接种。将含有5×10⁶细胞PBS同100uL的Matrigel混合(终体积200μL)接种于小鼠的右后边，接种细胞数目为5×10⁶/只。待肿瘤生长至体积达150-200mm³时开始分组，腹腔给药每周3次，每周三次用游标卡尺测量肿瘤直径，计算肿瘤体积，肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b²，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。抗体的抑瘤疗效用相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。相对肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)。RTV＝V21/V0，其中V0是分组给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，V21为给药21天测量时的肿瘤体积。将给药组与溶媒组最后一天(day21)瘤体积用T-test进行分析，用GraphPad Prism进行。结果如表9所示。

表9人胃癌NUGC-4移植瘤模型抗肿瘤试验结果

***p＜0.001vs.Isotype IgG4；**p＜0.005vs.Isotype IgG4

实验结果显示，本发明提供的抗体在人胃癌NUGC-4细胞接种NOD-SCID小鼠移植瘤模型中具有较显著的抗肿瘤作用。3mg/kg剂量的Hu26T-31-PE和Hu34-39-PE与6mg/kg的参照抗体AB06.12-4P抑瘤作用相当，而6mg/kg剂量Hu26T-31-PE和Hu34-39-PE抑瘤作用优于6mg/kg参照抗体AB06.12-4P。停药一周后，6mg/kg的参照抗体组出现肿瘤复发现象，而Hu26T-31-PE和Hu34-39-PE组无复发现象(图6、图7)。提示本发明提供的抗CD47抗体出乎意料的具有更加显著抑制肿瘤生长的作用。

以上实施例证明本发明提供的抗CD47抗体具有显著的抗肿瘤作用，可明显抑制肿瘤增长，提示该抗体可在制备抗肿瘤药物中的应用，具有可预期的市场前景。

尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。

序列表

<110> 南京圣和药业股份有限公司

<120> 抗CD47抗体及其应用

<150> 2018110091768

<151> 2018-08-31

<160> 74

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Arg Cys Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val

1 5 10

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ile Thr Pro Gly Arg Gly Glu Thr

1 5

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Gly Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Phe Ile Phe Ser Arg Phe Gly

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr

1 5

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Arg Gln Gly Leu Leu Asp Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ala Arg Thr Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val

1 5 10

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Ser Leu Leu Asn Val Asn Asp Gln Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Phe Ala Ser

1

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr

1 5

<210> 16

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ser Thr Ser

1

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Thr

1 5

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Gln Asp Ile Asn Ser Phe

1 5

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<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Arg Ala Tyr

1

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Gln Gln Tyr Val Glu Phe Pro Pro Thr

1 5

<210> 21

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Ala Glu Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Cys Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val Trp Gly Thr Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Thr Pro Gly Arg Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Glu Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Leu Leu Asp Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Val

20 25 30

Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln

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His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 25

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro

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Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys

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<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Asp Ile Lys Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Gly Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Phe Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe

20 25 30

Leu Cys Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Tyr Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Val Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Val Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Glu Leu Lys

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<210> 27

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Ala Lys Phe

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Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Ala Glu Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

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Ala Arg Thr Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val Trp Gly Thr Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Asp Ile Lys Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Gly Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Phe Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Tyr Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Val Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Val Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 29

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Thr Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val Trp Gly Gln Gly

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<210> 30

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Thr Pro Gly Arg Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

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Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Gln Gly Leu Leu Asp Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

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Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser

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<210> 32

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Val

20 25 30

Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 33

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys

100 105

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Tyr Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Val Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Val Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 35

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

caggtgcagc tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaagc ccggtgccag cgtgaaagta 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactactaca tgaactgggt gaggcaggcc 120

cctggacaag gcctggagtg gatcggcagg atctaccccg gcagcggcct gacctactat 180

aacgccaagt tcaagggcag ggccaccgtg accgccgaca agtccaccag caccgtgtac 240

atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt attactgcgc caggaccagc 300

tacggcagca gcttccccca cgtgtggggc cagggcacca ccgtgaccgt gagctct 357

<210> 36

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

caggttcagc tgcaagagag cggtcccggc ctggtgaaac ccagccagac cctgagcctg 60

acctgcaagg ccagcggcta cactttcact aactactgga tcacctgggt gaagcagcga 120

cccggccagg gcctggagtg gatcggcgac atcacccctg ggaggggaga gaccaactac 180

aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccctg accgtggaca tcagcgcctc cactgcctat 240

atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcag caggtggggc 300

ctgaggaggg gcgattactg gggccaaggg accagcgtga ccgtgagctc t 351

<210> 37

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gaggtccagc tgctggagag cggcggtggc ctcgtgcagc ccggaggcag cctgaggctg 60

agctgcgcgg caagcggctt catcttcagc aggttcggca tggcctgggt gaggcagacc 120

ccagacaaga ggctggagtg ggtggcaact atcagcagcg gaggaagtta cacctactac 180

cccgacagcg tgaagggcag gctgaccatc agtagggaca acgccaagac caccctgtac 240

ctgcagatga ggagcctgaa gagcgaggac accgccatgt actactgcgc caggcagggc 300

ctgctcgact atctgtacgc cctggactat tggggccagg gcactgccgt gaccgtgagc 360

agc 363

<210> 38

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgca agagcagcca aagcctgctg aacgtgaacg accagaagaa ctacctggcc 120

tggtatcagc agaagccggg caaggccccc aagctgctca tctactttgc cagcaccagg 180

gagagcggcg tgcccagcag gttcagcggc agcggaagtg gcaccgactt caccctcacc 240

atcagctccc tgcaacccga ggacttcgcc acctactact gtcaacagca ctacagcaca 300

cccctgacct tcggccaggg caccaagttg gagatcaag 339

<210> 39

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gagatcgtgc tgacccagag ccctggcacc ttgagcctga gtcccggaga gagggccacc 60

ctgagctgca gggcctcaag ctccgtgagc agcagctatc tgaattggta tcagcagaag 120

agcggagcca gccccaagct gtggatctac agcaccagca acctggcaag cggcgtgccc 180

ggcaggttca gcggcagtgg cagcgggacc agctacagcc tgaccatcag tagcgtggag 240

gccgaggacg ccgccaccta ctactgccag cagtacagcg gataccctct gaccttcgga 300

gccggaacca agttggaggt gaag 324

<210> 40

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gacatccaga tgacccagag cccaagcagc gtgagcgcca gcatcggcga cagggtgacc 60

ataacctgca aggccagcca agacatcaac agcttcctgg catggttcca gcagaagccc 120

ggcaagagcc ccaggcccct gatctacagg gcctacaggc tggtagacgg ggtgcccagc 180

aggttcagcg gcgtgggcag cggccaggac tacagcctga ccatcagcag cctggactac 240

gaggacctgg gcatctacta ctgccagcag tacgtggagt tccccccgac cttcggtgca 300

gggaccatgc tggagctgaa g 321

<210> 41

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys

290 295 300

Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met

305 310 315 320

Asn Asp Glu

<210> 42

<211> 350

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn

1 5 10 15

Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn

20 25 30

Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr

35 40 45

Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys

85 90 95

Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys

100 105 110

Tyr Arg Val Val Ser Trp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

115 120 125

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

165 170 175

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

180 185 190

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

195 200 205

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

210 215 220

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

225 230 235 240

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

245 250 255

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

260 265 270

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

275 280 285

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

290 295 300

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

305 310 315 320

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

325 330 335

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345 350

<210> 43

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn

1 5 10 15

Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn

20 25 30

Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr

35 40 45

Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys

85 90 95

Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys

100 105 110

Tyr Arg Val Val Ser Trp His His His His His His

115 120

<210> 44

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn

1 5 10 15

Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn

20 25 30

Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr

35 40 45

Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys

85 90 95

Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys

100 105 110

Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile

115 120 125

Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile

145 150 155 160

Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp

165 170 175

Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His

180 185 190

Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg

195 200 205

Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys

210 215 220

Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu

225 230 235 240

Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr

245 250 255

Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu

260 265 270

Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp

275 280 285

Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val

290 295 300

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu

305 310 315 320

Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His

325 330 335

Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro

340 345 350

Gly Lys

<210> 45

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

20 25 30

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

50 55 60

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

85 90 95

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala

115 120 125

Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser

130 135 140

Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser

145 150 155 160

Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser

165 170 175

Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser

180 185 190

Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu

195 200 205

Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu

210 215 220

Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr

225 230 235 240

Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu

245 250 255

Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu

260 265 270

Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val

275 280 285

Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp

290 295 300

Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His

305 310 315 320

Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn

325 330 335

Glu Arg

<210> 46

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Thr Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile

35 40 45

Lys Asp Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Glu Tyr Ala

65 70 75 80

Gln Lys Phe Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Asn Ala Ala Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Pro Met Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

210 215 220

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

225 230 235 240

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 47

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala

20 25 30

Met Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile His Arg Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Val Pro Lys His Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln

100 105 110

Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

130 135 140

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 48

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Thr Pro Gly Arg Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 49

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Thr Pro Gly Arg Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Thr Pro Gly Arg Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 51

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Thr Pro Gly Arg Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser His

115

<210> 52

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Thr Pro Gly Arg Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 53

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Thr Pro Gly Arg Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 54

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys

100 105

<210> 55

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys

100 105

<210> 56

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys

100 105

<210> 57

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys

100 105

<210> 58

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Glu Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Leu Leu Asp Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 59

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Leu Leu Asp Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 60

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Leu Leu Asp Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 61

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Leu Leu Asp Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 62

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Leu Leu Asp Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 63

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Leu Leu Asp Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 64

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe

20 25 30

Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Tyr Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Val Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Val Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 65

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe

20 25 30

Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Tyr Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Val Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 66

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

Asp Ile Lys Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Gly Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Phe Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe

20 25 30

Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Tyr Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Val Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 67

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe

20 25 30

Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Tyr Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Val Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 68

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

Asp Ile Lys Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Gly Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Phe Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe

20 25 30

Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Tyr Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Val Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Val Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 69

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 70

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 71

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 72

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Pro His Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 73

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Val

20 25 30

Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 74

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Val

20 25 30

Asn Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

Claims

1.一种抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：

(1)所述重链可变区包含选自如下组的HCDR1、HCDR2和HCDR3：

(a1)如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列；

(a2)如SEQ ID NO:10、2和11所示的氨基酸序列；

(a3)如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列；和

(a4)如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列；

(2)所述轻链可变区包含选自如下组的LCDR1、LCDR2和LCDR3：

(a6)如SEQ ID NO:12、13和14所示的氨基酸序列；

(a7)如SEQ ID NO:15、16和17所示的氨基酸序列；和

(a8)如SEQ ID NO:18、19和20所示的氨基酸序列；

2.如权利要求1所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其具有：

所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:1、2和3或与SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:12、13和14或与SEQ ID NO:12、13和14所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区；

所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:10、2和11或与SEQ ID NO:10、2和11所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:12、13和14或与SEQ ID NO:12、13和14所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区；

所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:4、5和6或与SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:15、16和17或与SEQ ID NO:15、16和17所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区；或

所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:7、8和9或与SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:18、19和20或与SEQ ID NO:18、19和20所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区。

3.如权利要求1或2所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体或人源化抗体。

4.如权利要求1-3之任一项所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中：

(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：

(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：

5.如权利要求4所述的CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还含有鼠源的IgG1、IgG2或其变体的重链恒定区，鼠源的k链或其变体的轻链恒定区。

6.如权利要求1-3之任一项所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中

所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:21经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:21功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24，SEQID NO:24经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:24功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；

所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:22经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:22功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:25，SEQID NO:25经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:25功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；

所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:23功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:26，SEQID NO:26经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:26功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；

所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:27经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:27功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24，SEQID NO:24经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:24功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；或

所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:23功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:28，SEQID NO:28经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:28功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

7.如权利要求1-3之任一项所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD47抗体为人源化抗体，其中：

(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：

(c1)如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；

(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：

(c4)如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列；

8.如权利要求7所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中

所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:29经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:29功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:32，SEQID NO:32经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:32功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；

所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:30经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:30功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:33，SEQID NO:33经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:33功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；或

所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:31经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:31功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:34，SEQID NO:34经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:34功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

9.一种分离的核酸，其编码权利要求1-8之任一项所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段。

10.如权利要求9所述的核酸，其中：

(1)编码所述重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37所示；

(2)编码所述轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40所示。

11.一种表达载体，其包含如权利要求9或10所述的核酸。

12.一种宿主细胞，其转化如权利要求11所述的表达载体，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优先为哺乳动物细胞。

13.制备权利要求1-8任一项所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段的方法，包括在如权利要求12所述的宿主细胞中表达抗体，以及从宿主细胞中分离所述抗体的步骤。

14.一种药物组合物，其包含权利要求1-8之任一项所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体。

15.如权利要求1-8之任一项所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段或如权利要求14的药物组合物在制备用于抑制CD47活性的药物中的应用。

16.如权利要求15所述的应用，所述抑制CD47活性的药物用于治疗白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤和/或黑素瘤。