KR102579520B1

KR102579520B1 - Galnac 산 유도체의 제조 방법

Info

Publication number: KR102579520B1
Application number: KR1020177036266A
Authority: KR
Inventors: 외르크 릴; 르네 트뤼사르디
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2016-08-02
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2036-08-02
Also published as: EP3331892B1; HK1250717A1; AU2016302697A1; CN107709342A; BR112017021926A2; CA2982825A1; MX2017015662A; JP2018523643A; CA2982825C; ES2744437T3; US20180162894A1; AU2016302697B2; SI3331892T1; IL256528B; JP6940477B2; MX369556B; IL256528A; PL3331892T3; HRP20191589T1; CN107709342B

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I 의 GalNAc 유도체:

(식 중, n 은 0 내지 10 의 정수임) 및 이의 염, 이의 상응하는 거울상체 및/또는 광학 이성질체의 신규한 제조 방법을 포함한다. 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체는 치료적으로 가치있는 GalNAc 올리고뉴클레오타이드 콘쥬게이트의 제조에 사용될 수 있다.

Description

GALNAC 산 유도체의 제조 방법 {PROCESSES FOR THE PREPARATION OF GALNAC ACID DERIVATIVES}

본 발명은 하기 화학식 I 의 GalNAc 유도체:

(식 중, n 은 0 내지 10 의 정수임), 및 이의 염, 이의 상응하는 거울상체 및/또는 광학 이성질체의 신규한 제조 방법에 관한 것이다.

화학식 I 의 GalNAc 유도체는 통상 GalNAc 잔기 및 특정 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 콘쥬게이트의 표적화 잔기이다. GalNAc 잔기는 간 세포 상에 위치하는 아시알로당단백질 수용체에 대한 그의 친화성으로 인해 간 세포에 대한 올리고뉴클레오타이드 콘쥬게이트의 기능적 전달을 가능하게 한다. 이러한 GalNAc 클러스터 안티센스 콘쥬게이트는 약동학적 조절자로서 작용하는 잠재력을 갖고, 예를 들어, PCT 공개 WO 2012/083046 또는 US 특허 출원 공개 US 2011/0207799 에 기재되어 있다. 이들 공개문헌도 역시 GalNAc 유도체의 제조 방법을 기재하고 있지만, 상기 방법이 기술적 규모 합성에 대한 표준을 충족시키지 못하는 것으로 밝혀졌다.

따라서 본 발명의 과제는 산업적 규모 방법에 대한 필요성을 충족시키는 화학식 I 의 GalNAc 유도체의 개선된 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 과제는 치료적으로 가치있는 GalNAc 올리고뉴클레오타이드 콘쥬게이트의 제조를 위한 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체의 용도 및 이러한 콘쥬게이트의 제조 방법이다.

상기 과제는 하기를 포함하는 본 발명의 방법으로 달성될 수 있을 것이다:

a) 하기 화학식 II 의 트리아민 염:

(식 중, R¹ 은 에스테르 보호기이고, X 는 산의 음이온임) 과 하기 화학식 III 의 테트라히드로피란 산:

(식 중, n 은 상기와 같고, R² 는 히드록시 보호기임) 과의, 펩타이드 커플링제, 아민 염기 및 유기 용매의 존재 하에서의 커플링으로 하기 화학식 IV 의 GalNAc 에스테르:

(식 중, n, R¹ 및 R² 는 상기와 같음) 를 형성하는 단계;

b) 무기 염기의 존재 하에서 에스테르 보호기 R¹ 및 히드록시 보호기 R² 의 제거로 하기 화학식 V 의 GalNAc 산 염:

(식 중, n 은 상기와 같고, M 은 금속 양이온임) 을 형성하는 단계;

및

c) 임의로 화학식 V 의 GalNAc 산 염을 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체로 변환시키는 단계.

하기 정의는 본원에서 본 발명을 설명하는데 사용된 다양한 용어의 의미 및 범주를 설명하고 정의하기 위해 언급된다.

키랄 탄소가 화학 구조 내에 존재할 때마다, 그 키랄 탄소와 연합된 모든 입체이성질체가 순수한 입체이성질체 뿐 아니라 이의 혼합물로서 구조에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

용어 "C_1-7 알킬" 은 1 내지 7 개의 탄소 원자의, 더욱 특정한 구현예에서는 1 내지 4 개의 탄소 원자의 1가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 기를 나타낸다. 알킬의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, iso-부틸, sec-부틸, 또는 tert-부틸을 포함한다.

용어 페닐-C_1-7-알킬은 상기 정의된 바와 같은 C_1-7 알킬 기에 부착된 페닐 기를 표시한다. 특정 예는 벤질 기이다.

페닐 기는 할로겐, 예컨대 염소, 브롬 또는 요오드로 또는 상기 정의된 바와 같은 C_1-7-알킬 기로 임의로 치환될 수 있다.

용어 "아미노-보호기" 는 아미노 기를 보호하는 것으로 의도되는 기를 나타내고, 벤질, 벤질옥시카르보닐, 카르보벤질옥시 (CBZ 또는 Z), 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (FMOC), p-메톡시벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, tert-부톡시카르보닐 (BOC), 및 트리플루오로아세틸을 포함한다. 이들 기의 추가의 예는 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapter 7; E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry", J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5, 및 T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, NY, 1981 에서 찾을 수 있다. 바람직한 아미노 보호기는 FMOC 및 BOC 이다.

용어 "히드록시-보호기" 및 용어 "에스테르 보호기" 는 히드록시 기를 보호하는 것으로 의도되는 기를 나타내고, 에스테르- 및 에테르-형성 기, 특히 테트라히드로피라닐, 벤조일, 아세틸, 카르바모일, 벤질 및 실릴에테르 (예를 들어, TBS, TBDPS) 기를 포함한다. 이들 기의 추가의 예는 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapters 2-3; E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry", J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5, 및 T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, NY, 1981 에서 찾을 수 있다.

바람직한 구현예에서, GalNAc 유도체는 하기 화학식 Ia (식 중, n 은 상기와 같음) 를 갖는다.

마찬가지로 화학식 Ia 에 따르면, 중간체 II, III, IV, X, XI, XII, XIII, XIV, XX, XXI 및 XXII 는 그의 키랄 중심에 동일한 입체화학을 공유한다.

화학식 II 의 트리아민 염 (빌딩 블록 A) 의 합성:

방법은 하기 단계를 포함한다:

a1) 하기 화학식 X 의 카르복실산:

(식 중, R^3' 및 R⁴ 는 상이하고 서로 독립적으로 아미노 보호기임) 을 하기 화학식 XI 의 에스테르:

(식 중, R¹ 은 에스테르 보호기이고, R^3' 및 R⁴ 는 상기와 같음) 로 변환시키는 단계;

b1) 아미노 보호기 R⁴ 를 제거하고 하기 화학식 XII 의 아민 염:

(식 중, R¹ 및 R^3' 는 상기와 같고, X^- 는 산 음이온임) 을 후속하여 형성하는 단계;

c1) 화학식 XII 의 아민 염을 하기 화학식 XIII 의 헥산산 유도체:

(식 중, R^3" 및 R^3"' 는 아미노 보호기임) 와 커플링시켜, 하기 화학식 XIV 의 보호된 트리아민:

(식 중, R^3', R^3", R^3"' 및 R¹ 은 상기와 같음) 을 형성하는 단계;

d1) 화학식 XIV 의 보호된 트리아민을 산으로, 화학식 II 의 트리아민 염으로 전환시키는 단계.

단계 a1) 은 화학식 X 의 카르복실산을 알코올 R¹OH 로, 활성화제, 아민 촉매 및 유기 용매의 존재 하에 화학식 XI 의 각각의 에스테르로 변환시키는 것을 포함한다.

에스테르 보호기가 염기성 조건 하에서 분할가능해야만 하기 때문에 적합한 알코올 R¹OH 는 식 중 R¹ 이 C_1-7 알킬 또는 페닐-C_1-7 알킬이고, 페닐 기가 할로겐 또는 C_1-7 알킬로 임의 치환되는 것들이다. 특히 적합한 것은 C_1-4 지방족 알코올, 예컨대 메탄올 또는 에탄올 또는 벤질알코올이다. 바람직한 알코올은 벤질알코올이다.

아미노 보호기 R^3', R^3" 및 R^3"' 가 그 제거를 위한 조건에 있어서 R⁴ 와 상이한 것이 중요하다. 적합하게는 산성 조건 하에서 분할가능한 아미노 보호기, 예컨대 바람직한 Boc 기가 R^3', R^3" 및 R^3"' 에 대해 선택된다.

염기성 조건 하에서 또는 수소첨가분해에 의해 분할가능한 R⁴ 아미노 보호기에 대해, 예컨대 FMOC (염기성 조건) 또는 Z (수소첨가분해) 가 바람직하게는 선택된다. FMOC 는 R⁴ 에 대한 바람직한 아미노 보호기이다.

적합한 활성화제는 당업자에게 공지된 고전적인 카르보디이미드, 예컨대 N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드 (DCC), N,N'-디이소프로필 카르보디이미드 (DIC) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 로부터 선택될 수 있으나, 바람직하게는 DCC 가 사용된다.

아민 촉매, 바람직하게는 4-(디메틸아미노) 피리딘의 존재가 에스테르화에 대해 유리하다.

에스테르화는 대체로 할로겐화된 탄화수소, 예컨대 디클로로메탄과 같은 비양자성 유기 용매 중에서 20℃ 내지 50℃ 의 온도에서 수행된다.

첫번째 단계 중의 단계 b1) 은 유기 용매의 존재 하에서, 지방족 아민으로의 아미노 보호기 R⁴, 바람직하게는 Fmoc 의 제거를 수반한다.

편의상 지방족 아민은 이차 지방족 아민, 예컨대 디메틸아민, 디에틸아민, 모르폴린 또는 피페라진이다. 바람직하게는 디에틸 아민이 적용된다.

반응은 대체로 20℃ 내지 50℃ 의 반응 온도에서 적합한 유기 용매 중에서, 예컨대 테트라히드로푸란과 같은 극성 비양자성 용매 중에서 수행된다.

과량의 아민은 적합하게는 적합한 용매, 예를 들어 아세토니트릴로의 공비 증류에 의해 제거될 수 있다.

단계 b1) 의 두번째 단계에서, 자유 아민은 적합한 산을 이용해 화학식 XII 의 아민 염으로 변환된다.

적합한 산은, 무기산, 예컨대 염산 또는 인산 또는 술폰산이다. 바람직하게는 술폰산, 예컨대 메탄술폰산 또는 p-톨루엔술폰산, 더욱 바람직하게는 메탄술폰산이 사용될 수 있다.

X 는 따라서 적용된 산의 음이온을 나타낸다.

자유 아민은 대체로 단리되지 않으므로, 반응은 통상 실온에서 단계 b1) 에서 사용된 아세토니트릴에서 일어날 수 있다.

화학식 XII 의 형성된 아민 염은 대체로 여과에 의해 단리될 수 있다.

하기 화학식 XII 의 아민 염:

(식 중, R¹ 및 R^3' 는 아민 보호기이고, X^- 는 산의 음이온임) 은 당업계에 공지되지 않은 화합물이고, 따라서 본 발명의 추가의 구현예를 구성한다.

추가의 바람직한 구현예에서, 화학식 XII 의 아민 염에서 R¹ 은 벤질이고, R^3' 는 Boc 이고, X 는 메탄술폰산의 음이온이다.

단계 c1) 은 화학식 XII 의 아민 염 (식 중, R¹, R^3' 및 X 는 상기 정의된 바와 같고, 그러나 바람직하게는 식 중, R¹ 은 벤질이고, R^3' 는 Boc 이고, X 는 메탄술폰산의 음이온임) 과 화학식 XIII 의 헥산산 유도체 (식 중, R^3" 및 R^3"' 는 상기 정의된 바와 같고, 그러나 바람직하게는 Boc 임) 와 커플링제로의, 아민 염기 및 유기 용매의 존재 하에서의 커플링, 및 화학식 XIV 의 보호된 트리아민의 형성을 수반한다.

커플링은 카르보디이미드 커플링제, 예컨대 DCC (N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드), EDC (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드) 또는 EDC·HCl (N-(3-디메틸아미노프로필)-N`-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 및 부가제, 예컨대 HOBt (1-히드록시벤즈트리아졸), HOSu (N-히드록시숙신이미드), TBTU (N,N,N',N'-테트라메틸-O-(벤조트리아졸-1-일)우로늄 테트라플루오로보레이트, HBTU (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 또는 HOAt (1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 및 이들의 통상의 조합, 예컨대 TBTU/HOBt 또는 HBTU/HOAt 를 사용하는 당업자에게 공지된 고전적인 방법을 따를 수 있다.

바람직한 구현예에서, n-프로필포스폰산 무수물 (T3P) 은 커플링제로서 삼차 아민 염기, 예컨대 트리에틸아민 또는 N-에틸디이소프로필아민과 함께, 그러나 바람직하게는 N-에틸디이소프로필아민과 함께 선택된다.

화학식 XIII 의 헥산산 유도체, 특히 Boc 보호된 유도체는 시판되는 화합물이다.

커플링 반응은 통상 극성 비양자성 용매, 예컨대 아세토니트릴 또는 테트라히드로푸란 또는 이의 혼합물 중에서 0℃ 내지 50℃ 의 범위의 반응 온도에서 일어난다.

화학식 XIV 의 미정제의 보호된 트리아민의 단리는 용매를 제거함으로써 일어날 수 있다. 예를 들어 아세토니트릴로의 후속 결정화는 다음 단계 d1) 에 대해 쉽게 사용될 수 있는 고 순도를 가진 생성물을 산출한다.

바람직한 구현예에서, 화학식 XIV 의 보호된 트리아민에서 R¹ 은 벤질이고, R^3', R^3" 및 R^3"' 는 Boc 이다.

단계 d1) 은 화학식 XIV 의 보호된 트리아민 (식 중, R¹, R^3', R^3" 및 R^3"' 는 상기와 같고, 바람직하게는 식 중, R¹ 은 벤질이고, R^3', R^3" 및 R^3"' 는 Boc 임) 의, 유기 용매의 존재 하에서 산을 이용한 화학식 II 의 트리아민 염으로의 전환을 수반한다.

적합한 산은 무기산, 예컨대 염산 또는 인산, 트리플루오로아세트산 또는 술폰산이다. 바람직하게는 술폰, 예컨대 메탄술폰산 또는 p-톨루엔술폰산, 더욱 바람직하게는 메탄술폰산이 사용될 수 있다.

바람직하게는 각각의 산의 4 eq 내지 10 eq 의 과량이 사용된다.

반응은 통상 적합한 극성 비양자성 용매 중에서 20℃ 내지 80℃ 의 반응 온도에서 수행된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 전환은 화학식 II 의 산출되는 트리아민 염을 결정화하는 것을 방지하는 극성 비양자성 용매 중에서 수행된다. 특히 바람직한 용매는, 단계 a) 에서 화학식 II 의 테트라히드로피란 산을 이용한 후속 커플링에 쉽게 사용될 수 있는 에멀젼의 형태로의 화학식 II 의 산출되는 트리아민 염을 남기는 아세토니트릴이다.

화학식 III 의 테트라히드로피란 산 (빌딩 블록 B) 의 합성:

화학식 III 의 테트라히드로피란 산의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다:

a2) 하기 화학식 XX 의 디올:

(식 중, n 은 0 내지 10 의 정수임) 을 하기 화학식 XXI 의 알코올 에스테르:

(식 중, n 은 상기와 같고, R⁵ 는 에스테르 보호기임) 로 변환시키는 단계;

b2) 화학식 XXI 의 알코올 에스테르와 하기 화학식 XXII 의 테트라히드로피란 유도체:

(식 중, R² 및 R⁶ 은 서로 독립적으로 히드록시 보호기임) 와의 커플링으로 하기 화학식 XXIII 의 테트라히드로피란 에스테르:

(식 중, R² 및 R⁵ 는 상기와 같음) 를 형성하는 단계;

c2) 에스테르 기 R⁵ 의 제거로, 화학식 III 의 테트라히드로피란 산을 형성하는 단계.

단계 a2) 는 화학식 XX 의 디올의 화학식 XXI 의 알코올 에스테르로의 변환을 필요로 한다.

화학식 XX 의 디올은 n 개의 반복 -(CH₂-)-O- 단위를 특징으로 한다. 정수 n 은 대체로 0 내지 10, 그러나 바람직하게는 0 내지 5, 더욱 바람직하게는 0 내지 2 로부터 선택된다. 바람직한 디올은 시판되는 2-[2-(2-히드록시에톡시) 에톡시]에탄올 (n=1) 이다.

단계 a2) 의 첫번째 단계에서, 화학식 XX 의 디올은 알칼리 금속 알코올레이트로 탈양자화된다.

적합한 알칼리 금속 알코올레이트는 소듐- 또는 포타슘-삼차 알코올레이트, 예컨대 소듐- 또는 포타슘 t-부틸레이트 또는 소듐- 또는 포타슘 아밀레이트이다.

탈양자화를 위해 극성 양자성 또는 극성 비양자성 용매, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드 또는 삼차 알코올, 예컨대 t-부탄올 또는 2-메틸-2-부탄올이 존재할 수 있고, 반응은 50℃ 내지 120℃ 에서 일어날 수 있다.

단계 a2) 의 두번째 단계에서, 아세트산 잔기는 할로겐 아세트산 또는 이의 적합한 염으로 도입된다.

적합한 할로겐 아세트산은 브로모- 또는 클로로-아세트산 또는 이의 알칼리 금속 염이다. 바람직한 구현예에서, 할로겐 아세트산의 염이 사용되고, 더욱 바람직하게는 소듐 클로로아세테이트가 사용된다.

반응은 극성 양자성 또는 극성 비양자성 용매에서, 통상 이전 단계에서와 같이 동일한 용매에서 일어날 수 있다.

반응 온도는 용매에 따라 다르나, 대체로 50℃ 내지 120℃ 에서 선택된다.

단계 a2) 의 세번째 단계에서, 중간 에스테르 염은 그의 단리 없이, 화학식 XXI 의 알코올 에스테르로 변환된다.

알코올 에스테르의 형성은 에스테르 보호기 R⁵ 의 도입을 의미한다.

당업계에서는 에스테르를 보호하는 많은 가능성을 알고있지만, 벤질 기가 가장 적합한 것으로 밝혀졌다. 이의 도입은 벤질 할로게나이드 또는 벤질 술포닐 에스테르, 그러나 바람직하게는 벤질 브로마이드로 일어날 수 있다.

에스테르화는 극성 비양자성 용매 중에서, 통상 20℃ 내지 120℃ 의 반응 온도에서 이전 단계에서와 동일한 용매 중에서 일어날 수 있다.

반응 혼합물로부터 알코올 에스테르의 단리는 적합한 용매, 예컨대 메틸 t-부틸 에테르로의 추출에 의해 그리고 용매의 제거에 의해 일어날 수 있다. 단계 b2) 는 화학식 XXI 의 알코올 에스테르와 화학식 XXII 의 테트라히드로피란 유도체와의 산 및 유기 용매의 존재 하에서의 반응으로 화학식 XXIII 의 테트라히드로피란 에스테르를 형성하는 것을 필요로 한다.

당업계에서는 많은 히드록시 보호기를 알고있지만, R² 및 R⁶ 은 바람직하게는 아세틸이다.

화학식 XXII 의 테트라히드로피란 유도체, 특히 아세틸 유도체는 시판되는 화합물이다.

적합한 산은 할로겐화된 술폰산, 예컨대 바람직한 트리플루오로메탄술폰산이다.

반응은 통상 디클로로메탄과 같은 극성 비양자성 용매의 존재 하에 0℃ 내지 140℃ 의 반응 온도에서 수행된다.

바람직한 구현예에서, 생성된 아세트산은 반응 과정에서 연속적으로 증류 제거된다.

반응 혼합물의 중화 후 화학식 XXIII 의 테트라히드로피란 에스테르는 용매의 제거에 의해 단리될 수 있다. 미정제 생성물은 이동상으로서 N-헵탄/아세톤 또는 바람직하게는 tert.부틸 메틸 에테르/아세톤을 이용하는 실리카 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.

바람직한 구현예에서 화학식 XXIII 의 테트라히드로피란 에스테르에서 R² 는 아세틸이고, R⁶ 은 벤질이다.

단계 c2) 는 에스테르 기 R⁶ 의 제거를 말한다.

에스테르 기의 제거는 원칙적으로 당업자에게 공지되고 문헌에 잘 기재된다.

바람직한 구현예로서 단계 c2) 는 수소첨가 촉매의 존재 하 수소로의 촉매적 수소첨가로의 벤질 기의 제거 및 화학식 III 의 테트라히드로피란 산의 형성을 수반한다.

벤질 기의 제거를 위한 전형적인 수소첨가 촉매는 탄소 상 팔라듐 (Pd/C) 이다.

반응은 통상 10℃ 내지 30℃ 의 반응 온도 및 1 bar 내지 5 bar 의 수소압에서 테트라히드로푸란과 같은 극성 비양자성 용매의 존재 하에 수행된다.

화학식 III 의 테트라히드로피란 산은 촉매의 여과 제거 후에, 본 발명의 방법의 단계 a) 에서의 후속 커플링을 위해 용액에서 직접 사용될 수 있다.

화학식 III 의 바람직한 테트라히드로피란 산에서 R² 는 아세틸이다.

또다른 구현예에서, 화학식 XXI 의 알코올 에스테르는 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다:

a3) 하기 화학식 XXV 의 2-아미노 아세테이트:

(식 중, R⁵ 는 상기와 같고, X 는 할로겐 원자임) 와 니트라이트 염과의 디아조화로 하기 화학식 XXVI 의 2-디아조 화합물:

(식 중, R⁵ 는 상기와 같음) 을 형성하는 단계; 및

b3) 화학식 XXVI 의 2-디아조 화합물을 화학식 XX 의 디올과 함께 화학식 XXI 의 원하는 알코올 에스테르로 변환시키는 단계.

단계 a3) 은 화학식 XXV 의 2-아미노 아세테이트의 디아조화 아미노 및 화학식 XXVI 의 2-디아조 화합물의 형성을 필요로 한다.

화학식 XXV 의 아미노 아세테이트는 히드로클로라이드 (X = Cl) 로서 적합하게 적용되는 시판 화합물이다.

디아조화는 대체로 알칼리 니트라이트, 바람직하게는 소듐 니트라이트와, -10℃ 내지 10℃, 바람직하게는 0℃ 내지 5℃ 의 반응 온도에서 물 및 무-극성 비양자성 용매의 용매 혼합물의 존재 하에서 수행된다.

적합한 무-극성 비양자성 용매는 메틸 tert. 부틸 에테르, 테트라히드로푸란, 2-메틸 테트라히드로푸란, 시클로펜틸 메틸 에테르, 디클로로메탄 및 톨루엔으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 톨루엔은 물과 1:1 v/v 혼합물로 사용된다.

수득된 화학식 XXVI 의 2-디아조 화합물은 단계 b3) 에서의 후속 변환을 위해 유기상에서 용해되어 유지된다.

단계 b3) 은 화학식 XXVI 의 2-디아조 화합물의 화학식 XX 의 디올로의 변환을 필요로 한다.

상기 요약된 바와 같이, 화학식 XX 의 디올은 n 개의 반복 -(CH₂-)-O- 단위를 특징으로 한다. 정수 n 은 대체로 0 내지 10, 그러나 바람직하게는 0 내지 5, 더욱 바람직하게는 0 내지 2 로부터 선택된다. 바람직한 디올은 시판되는 2-[2-(2-히드록시에톡시) 에톡시]에탄올 (n=1) 이다.

반응은 루이스산 및 무-극성 비양자성 용매의 존재 하에 -10℃ 내지 10℃, 바람직하게는 0℃ 내지 5℃ 에서 수행될 수 있다.

무-극성 비양자성 용매는 대체로 단계 a3) 에서 사용된 것과 동일하다.

전형적인 루이스산은 보론 트리할로게나이드, 예컨대 보론 트리플루오라이드 및 이의 시판 부가물, 예컨대 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트, 또는 로듐 (II) 아세테이트 또는 구리 (II) 트리플루오로메탄술포네이트로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 디에틸 에테레이트의 형태의 보론 트리플루오라이드가 적용된다.

화학식 XXI 의 알코올 에스테르는 유기 층의 분리, 증발에 의한 용매의 제거 및 임의로 크로마토그래피를 통한 미정제물의 추가 정제를 수반하는 통상의 워크업 절차에 의해 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다.

화학식 XXI 의 알코올 에스테르는 이후 후속 단계 b2) 에 대해 쉽게 사용될 수 있다.

빌딩 블록 A 및 B 의 어셈블리

단계 a) 는 화학식 II 의 트리아민 염의, 펩타이드 커플링제, 아민 염기 및 유기 용매의 존재 하에서의 화학식 III 의 테트라히드로피란 산으로의 커플링으로 화학식 IV 의 GalNAc 에스테르를 형성하는 것을 필요로 한다.

상기 기재된 바와 같이, 화학식 II 의 트리아민 염 및 화학식 III 의 테트라히드로피란 산 둘 다는 바람직하게는 이들의 합성으로부터 산출되는 반응 혼합물로부터 단리 없이 사용될 수 있다.

상기 요약된 바와 같이, 화학식 III 의 바람직한 테트라히드로피란 산에서 R² 는 아세틸이고, 화학식 II 의 바람직한 트리아민 염에서 R¹ 은 벤질이고, X 는 메탄술폰산의 음이온이다.

커플링은 카르보디이미드 커플링제, 예컨대 DCC 및 부가물, 예컨대 HOBt (1-히드록시벤즈트리아졸), HOSu (N-히드록시숙신이미드), TBTU (N,N,N',N'-테트라메틸-O-(벤조트리아졸-1-일)우로늄 테트라플루오로보레이트, HBTU (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 또는 HOAt (1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 및 이들의 통상의 조합, 예컨대 TBTU/HOBt 또는 HBTU/HOAt 를 사용하는 당업자에게 공지된 고전적인 방법을 따를 수 있다.

커플링 반응은 통상 극성 비양자성 용매, 예컨대 아세토니트릴 또는 테트라히드로푸란 또는 이의 혼합물 중에서 20℃ 내지 70℃ 의 범위의 반응 온도에서 일어난다.

형성된 메탄술폰산 및 과량의 아민 염기 및 커플링제는 커플링 반응의 완료 후 적합한 유기 용매에서, 예컨대 2-프로판올에서 미정제 생성물의 침전에 의해 제거될 수 있다.

대안적이고 바람직한 구현예에서, 단계 a) 및 b) 는 화학식 IV 의 GalNAc 에스테르의 단리 없이 하나의 단계에서 조합되고 수행될 수 있다. 따라서, 단계 a) 로부터의 반응 혼합물은 하기 단계 b) 에서 요약된 바와 같이 무기 염기로 직접 처리될 수 있다.

화학식 IV 의 바람직한 GalNAc 에스테르에서 R¹ 은 벤질이고 R² 는 아세틸이다.

단계 b) 는 무기 염기의 존재 하에 에스테르 보호기 R¹ 및 히드록시 보호기 R² 의 제거로 화학식 V 의 GalNAc 산 염을 형성하는 것을 필요로 한다.

대체로 화학식 IV 의 GalNAc 에스테르는 극성 유기 용매, 특히 알코올, 예컨대 메탄올에 용해된다.

M 은 금속 양이온, 통상 알칼리 또는 토금속 양이온, 예컨대 리튬, 소듐, 포타슘, 루비듐, 칼슘 또는 마그네슘, 그러나 바람직하게는 소듐, 포타슘 또는 칼슘, 더욱 바람직하게는 소듐을 나타낸다.

적합한 무기 염기는 따라서 전형적으로 수용액의 형태로 적용되는, 소듐-, 포타슘- 또는 칼슘-히드록사이드로부터 선택되는 알칼리 또는 알칼리 토금속 히드록사이드이다. 바람직하게는 수성 소듐 히드록사이드는 11 eq 내지 25 eq 의 과량으로 사용된다.

반응은 0℃ 내지 40℃ 의 온도에서 수행될 수 있다.

미정제 생성물은 용매의 증발에 의해 단리될 수 있다. 생성물의 추가의 정제는 극성 정지상 및 극성 이동상을 사용하는 분취형 역상 크로마토그래피에 의해 달성될 수 있다.

바람직한 극성 이동상은 변화하는 구배를 적용하였던 수성 소듐 수소 카보네이트 및 아세토니트릴의 혼합물인 것으로 밝혀졌다.

크로마토그래피로부터 선택된 분획의 농축은 화학식 V 의 순수한 GalNAc 산 염을 제공한다.

화학식 V 의 바람직한 GalNAc 산 염에서 R¹ 은 벤질이고, R² 는 아세틸이고, M 은 소듐이다.

화학식 V 의 GalNAc 염이, 화학식 V 의 GalNAc 산 염의 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체로의 변환을 포함하는 임의의 단계 c) 에 적용되는 경우에 농축은 필요하지 않다.

변환은 적합한 양이온 교환체로의 이온 교환에 의해 또는 대안적으로는 적합한 산, 예를 들어 인산 또는 술폰산, 예컨대 메탄 술폰산으로의 중화에 의해 수행될 수 있다.

화학식 I 의 원하는 GalNAc 산 유도체가 단리되는 경우 변환은 바람직하게는 메탄올 용액 중에서 일어날 수 있다. 용매의 제거는 원하는 생성물이 고 순도 및 수율이 되게 한다.

대안적으로, 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체가 올리고뉴클레오타이드와의 콘쥬게이션에 직접 적용되는 경우 변환은 적합하게는 극성 비양자성 용매, 예컨대 N,N'-디메틸포름아미드에서 수행된다.

추가 대안으로서 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체는 상기 요약된 바와 같이, 적합한 무기 염기의 존재 하에 화학식 V 의 GalNAc 염으로 다시 변환될 수 있다. 본 대안은 원칙적으로 금속 양이온을 변화시키는 것을 허용할 것이다.

용어 "염" 은 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체의 문맥에서 따라서 리튬, 소듐, 포타슘, 루비듐, 칼슘 또는 마그네슘, 그러나 바람직하게는 소듐, 포타슘 또는 칼슘, 더욱 바람직하게는 소듐으로부터 선택되는 양이온과의 알칼리 또는 토금속 염을 의미한다.

올리고뉴클레오타이드에 대한 콘쥬게이션

화학식 I 의 GalNAc 산 유도체 또는 화학식 V 의 GalNAc 산 염은 치료적으로 가치있는 GalNAc 올리고뉴클레오타이드 콘쥬게이트의 제조에 대해 처음에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 올리고뉴클레오타이드는 2 개 이상의 공유 연결된 뉴클레오사이드를 포함하는 분자로서 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 치료적으로 가치있는 올리고뉴클레오타이드로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 길이 7 내지 30 개의 뉴클레오타이드로서 합성된다.

올리고뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 개질된 RNA 또는 LNA 뉴클레오사이드 단량체 또는 이의 조합으로 이루어질 수 있다. LNA 뉴클레오사이드 단량체는 뉴클레오타이드의 리보오스 당 고리의 C2' 와 C4' 사이에 링커 기 (바이라디클 (biradicle) 또는 가교로서 언급됨) 를 포함하는 개질된 뉴클레오사이드이다. 이들 뉴클레오사이드는 또한 문헌에서 가교된 핵산 또는 바이시클릭 핵산 (BNA) 으로 불린다.

올리고뉴클레오타이드는 또한 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 아미노 링커, 예를 들어 C-6-아미노 링커를 함유할 수 있다.

GalNAc 폴리뉴클레오타이드 콘쥬게이트의 제조는 하기 단계를 포함한다:

a3) 상기 기재된 바와 같은 본 발명에 따라 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체 또는 화학식 V 의 GalNAc 산 염을 제조하는 단계 및

b3) 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체 또는 화학식 V 의 GalNAc 산 염을, 펩타이드 커플링 조건 하에서 폴리뉴클레오타이드에 콘쥬게이션시키는 단계.

화학식 V 의 GalNAc 산 염과의 콘쥬게이션이 바람직하다.

펩타이드 커플링 조건은 카르보디이미드 커플링제, 예컨대 DCC (N,N'-디시클로헥실카르보디이미드), EDC (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드) 또는 EDC·HCl (N-(3-디메틸아미노프로필)-N`-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 및 부가물, 예컨대 HOBt (1-히드록시벤즈트리아졸), HOSu (N-히드록시숙신이미드), TBTU (N,N,N',N'-테트라메틸-O-(벤조트리아졸-1-일)우로늄 테트라플루오로보레이트, HBTU (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 또는 HOAt (1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 및 이들의 통상의 조합, 예컨대 TBTU/HOBt 또는 HBTU/HOAt 를 사용하는 당업자에게 공지된 고전적인 방법이다.

예를 들어, US 특허 출원 공개 2011/0207799 는 GalNAc 유도체의 올리고뉴클레오타이드에 대한 콘쥬게이션의 참조를 위해 언급될 수 있다.

실시예

약어:

AcOH 아세트산

DMAP 4-(디메틸아미노)-피리딘

DMF N, N'-디메틸포름아미드

EtOH 에탄올

MeOH 메탄올

rt 실온

THF 테트라히드로푸란

TBME tert.-부틸 메틸 에테르

빌딩 블록 A:

실시예 1

벤질 (2S)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥사노에이트

234.0 g (500.0 mmol) (2S)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥산산을 500 ml 디클로로메탄, 62.0 ml (600 mmol, 1.2eq) 벤질 알코올에 현탁시키고, 3.05 g DMAP (25.0 mmol, 0.05 eq) 를 첨가하였다. 용액을 0 - 5℃ 로 40 분 동안 냉각시키고, 500 ml 디클로로메탄 중의 108.0 g (525.0 mmol, 1.05 eq) N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드의 용액을 적가하였다. 백색 현탁액을 1h 동안 0 - 5℃ 에서, 그 다음 15h 동안 실온에서 교반하였다. 현탁액을 G3 유리 필터로 여과하였고, 백색 필터 케이크를 총 250 ml 디클로로메탄으로 조금씩 세정하였다. 여과액을 650-10mbar/1h 에서 증발시켜 황색 오일을 수득하고, 이것을 2.0 L 에틸 아세테이트에 용해하고, 2.0 L 0.5M 염산, 2.0 L 1M NaHCO₃ 및 1.0 L 염수로 추출하고, 유기 층을 40℃/150-10mbar/5h 에서 건조상태로 증발시켜, 291.1 g 미정제 벤질 (2S)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노) 헥사노에이트를 백색 고체로서 104% 수율 및 96.4% 순도 (HPLC 면적-%; 대략 5% 벤질 알코올 함유) 로 수득하였다. 상기 물질을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. MS: m/z = 459.22735 (M-boc+H)⁺.

실시예 2

벤질 (2S)-2-아미노-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트 메탄술폰산 염

291.1 g 벤질 (500.0 mmol) (2S)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노) 헥사노에이트 (HPLC 순도; 95.8%; 대략 5% 벤질 알코올 함유) 를 1.4 L THF 중에 실온에서 용해하였다. 10 분 내에, 1.04 L 디에틸아민 (10.0 mol, 20eq) 을 첨가하였고, 연황색 용액을 2h 동안 실온에서 교반한 다음, 40℃/200-10mbar 에서 증발시키고, 200 ml 아세토니트릴을 첨가하고 다시 증발시켜 디에틸아민을 40℃/100-10mbar/1h 에서 효과적으로 제거하였다. 최종적으로, 268.1 g 의 황색 오일을 수득하였고, 이것을 2.5 L 아세토니트릴에 용해하였고, 10 분 동안 실온에서 교반하였다. 불용성 입자를 유리 섬유 필터로 여과하고, 500 ml 아세토니트릴로 세정하였다. 여과액을 10 분 동안 34.0 ml 메탄술폰산으로 20℃ - 25℃ 에서 적하 처리하였다. 형성된 백색 현탁액을 17h 동안 실온에서 교반하고, G3 유리 필터로 여과하였다. 필터 케이크를 500 ml 아세토니트릴로 조금씩 세정하였다. 백색 결정을 40℃/15mbar/4h 에서 건조시켜, 195.8 g 벤질 (2S)-2-아미노-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트 메탄술폰산 염을 백색 결정으로서 91% 수율 (2 단계) 및 99.3% 순도 (HPLC 면적-%) 로 수득하였다. MS: m/z = 337.2149 (M+H)⁺.

실시예 3

벤질 (2S)-2-[[(2S)-2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노일]아미노]-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트

190.0 g (439.0mmol) 벤질 (2S)-2-아미노-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트 메탄술폰산 염을 1.9 L THF 중에 실온에서 현탁시켰다. 335 ml (1.98 mol, 4.5 eq) N-에틸디이소프로필아민을 첨가하였고, 이에 의해 온도가 15℃ 로 약간 감소하였다. 그 다음, 213 g (615 mmol, 1.4 eq) (S)-2,6-비스((tert-부톡시카르보닐)아미노)헥산산을 첨가하고, 백색 현탁액을 실온에서 20 분 동안 교반하였다. 390 ml n-프로필포스폰산 무수물 (T3P - 에틸 아세테이트 중의 시클릭 삼량체 50% 로서, 659 mmol, 1.5 eq) 을 20 분 동안 20 - 25℃ (냉수 배쓰에서 냉각시킴) 에서 적가하였다. 산출되는 연황색의, 혼탁한 용액을 실온에서 1.5h 동안 교반하고, 분리 깔대기로 옮기고, 1.9 L TBME 로 희석하고, 1.9 L 물, 1.9 L 0.5M 염산, 1.9 L0.5M NaOH, 1.9 L 물 및 1.9 L 염수로 추출하였다. 분리된, 여전히 혼탁한 유기 층을 유리 섬유 필터로 여과하고, 필터를 100 ml TBME 로 세정하고, 수합된 여과액을 40℃/100mbar/1h 에서 증발시키고, 1.0 L TBME (물을 공비 제거하기 위해) 를 다시 첨가하고, 40℃/250-10mbar/1h 에서 증발시켜, 미정제 296.4 g 을 백색 고체 잔류물로서 수득하였다.

미정제 고체를 500 ml 아세토니트릴로 처리하고, 혼탁한 용액을 60 - 65℃ 로 10 분 동안 가열하였다. 혼합물을 20 - 25℃ 로 냉각시키고, 10 분 동안 교반하고, 유리 섬유 필터로 여과하고, 50 ml 아세토니트릴로 세정하였다. 연황색 용액을 40℃/100-10mbar/4h 에서 증발시켜, 295 g 벤질 (2S)-2-[[(2S)-2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노일]아미노]-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트를 베이지색 고체로서 101% (HPLC 순도: 100%, 부분입체이성질체 순도 (SS) 98.6%) 의 수율로 수득하고, 이것을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. MS: m/z = 565.3741 (M-boc+H)⁺.

실시예 4

벤질 (2S)-6-아미노-2-[[(2S)-2,6-디아미노헥사노일]아미노]헥사노에이트 트리-메탄술폰산 염

124.0 g (187 mmol) 벤질 (2S)-2-[[(2S)-2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노일]아미노]-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트를 1.25 L 아세토니트릴에 현탁하였다. 61.0 ml (935.0 mmol, 5.0eq) 메탄술폰산을 20 - 25℃ 에서 10 분 (기체 발생) 동안 첨가하였다. 산출된 오렌지색 현탁액을 40 분 내에 55 - 60℃ 로 가열하고, 또다시 1h 동안 55 - 60℃ 에서 교반하였다. 오렌지색-적색 에멀젼을 실온 (디보케이션 (debocation) 은 ¹H-NMR 에 의해 통제되었음) 으로 냉각시키고, 추가 정제 없이 A+B 어셈블리 단계, 실시예 8 에서 사용하였다. MS: m/z = 365.2558 (M+H)⁺.

빌딩 블록 B:

실시예 5a

벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트

30.0 g (200.0 mmol), 2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에탄올을 50 ml DMF 에, 20 - 25℃ 에서 용해한 다음, 메탄올 중의 46.0 ml 소듐 메톡시드 25% (200.0 mmol, 1.0 eq) 를 첨가하였다. 형성된 용액을 40℃/50mbar/0.5h 에서 증발시키고 (40 ml 용매의 제거), 50 ml DMF 를 다시 첨가하고, 40℃/20mbar/0.5h 에서 증발시켰다 (15 ml 용매의 제거). 약간 젤리같은 현탁액에 50 ml DMF 중의 13.9 g 브로모아세트산 (100 mmol, 0.5 eq) 의 용액을 20 - 25℃ 에서 첨가하고, 혼합물을 6h 동안 교반하였다. 11.9 ml 벤질 브로마이드 (100 mmol, 0.5 eq) 를 첨가하고, 혼합물을 또다시 16h 동안 20 - 25℃ 에서 교반하였다. 반응 혼합물을 이후 200 ml 염수로 처리하고, 200 ml TBME 으로 추출하였다. 분리된 TBME 층을 200 ml 염수로 추출하였고, 분리된 TBME 층을 이후 무수 소듐 술페이트로 건조시키고, 40℃/300-10mbar/1h 에서 여과 및 증발시켜 미정제 23.9 g 벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트를 수득하였다.

크로마토그래피 (600 g 실리카 60 (0.063-0.2 mm), 이동상: 에틸 아세테이트) 후, 총 7.85 g 벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트를 무색 오일로서 13% 수율 및 99.0% 순도 (HPLC 면적-%) 로 단리하였다. MS: m/z = 299.1517 (M+H)⁺.

실시예 5b

벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트

11.2 g 포타슘 tert.-부틸레이트 (100.0 mmol, 0.5eq) 를 70 ml 2-메틸-2-부탄올 (광 발열성 35℃) 에 현탁시킨 다음, 30.0 g (200.0 mmol) 2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에탄올을 5 분 동안 적가하였다. 적하 깔대기를 10 ml 2-메틸-2-부탄올 (45℃ 로 온도 증가) 로 린스하였고, 용액을 60 - 65℃ 로 가열시키고, 11.6 g (100 mmol, 0.5eq) 소듐 클로로아세테이트를 첨가하고 16h 동안 60 - 65℃ 에서 교반한 다음, 11.9 ml 벤질 브로마이드 (100 mmol, 0.5 eq) 를 첨가하고, 혼합물을 또다시 16h 동안 60 - 65℃ 에서 교반하였다. 반응 혼합물을 rt 로 냉각시킨 다음, 50 ml 물로 처리하고, 80 ml TBME 및 40 ml TBME 로 추출하였다. 수합된 TBME 층을 50 ml 반 포화 염수로 세정하고, 유기 층을 40℃/300-10mbar/1h 에서 증발시켜, 미정제 27.0 g 벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트를 수득하였다.

크로마토그래피 (270 g 실리카 60 (0.063-0.2 mm), 이동상: 에틸 아세테이트/n-헵탄 1/1 로 출발, 순수한 생성물이 가시적일 때, 이동상을 100% 에틸 아세테이트로 변화시킴) 후, 총 11.4 g 벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트를 거의 무색 오일로서 19% 수율 (소듐 클로로아세테이트로부터 38%) 및 99.0% 순도 (HPLC 면적-%) 로 단리하였다.

실시예 5c

벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트

40.3 g (200.0 mmol) 벤질 2-아미노아세테이트 히드로클로라이드를 340 ml 물에 용해하고, 340 ml 톨루엔을 0 - 5℃ 로, 60 분 동안 50 ml 물 중의 16.5 g (240 mmol, 1.2 eq) 소듐 니트라이트의 용액을 0 - 5℃ 에서 강한 교반 하에 적가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 0 - 5℃ 에서 교반하였다. 황색 톨루엔-층을 분리하고, 340 ml 1M NaHCO₃ 및 340 ml 염수로 세정하고, 분리된 톨루엔 층을 60 g 소듐 술페이트로 처리하고, 1 시간 동안 20 - 25℃ 에서 교반하였다. 황색 현탁액을 여과하고, 50 ml 톨루엔으로 세정하였다. 맑은 황색 톨루엔 용액은 최대 200.0 mmol 벤질 2-디아조아세테이트 (톨루엔 중의 ~8.5%) 를 함유한다. 상기 용액을 60 분 동안 적가하여, 0 - 5℃ 로 냉각시키고, 질소 기체의 발생 하에서 170 ml 톨루엔 중의 60.0 g (400 mmol) 트리에틸렌 글리콜 및 465 ㎕ (3.67 mmol, 0.02 eq) 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트의 혼합물을 잘 교반하였다. 황색 반응 혼합물을 90 분 동안 20 - 25℃ 에서 교반하였고, 이때 무색 용액이 형성되었다. 용액을 250 ml 염수로 추출하였고, 분리된 유기 층을 60 g 소듐 술페이트로 건조시키고, 여과하고, 100 ml 톨루엔으로 세정하고, 40℃/40-10mbar/1h 에서 증발시켜, 미정제 49.9 g 벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트를 수득하였다. 크로마토그래피를 Teledyne Isco CombiFlash (330 g 실리카 60 (0.035-0.070 mm Teledyne Isco Cat.No. 69-2203-330), 이동상: 15% 아세톤 85% n-헵탄에서 45 분 내에 30% 내지 70% 로의 구배, 분획 크기 20 ml 로 수행하였다. 조합된 분획은 33.88 g 벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트를 무색 오일로서 57% 의 총 수율 및 99.0% 순도 (HPLC 면적-%) 로 산출하였다.

실시예 6

벤질 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트

268.0 g 벤질 2-(2-(2-(2-히드록시에톡시)에톡시)에톡시)아세테이트 (900 mol) 를 2.4 L 디클로로메탄에 용해하였다. 385.0 g (2S,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-6-(아세톡시메틸)테트라히드로-2H-피란-2,4,5-트리일 트리아세테이트 (990 mmol, 1.1 eq) 및 12.0 ml 트리플루오로메탄술폰산 (135 mmol, 0.15 eq) 을 첨가하였다. 현탁액을 딘-스타크 분리기 (50 ml, AcOH 를 제거하기 위해) 로 환류로 가열하였다. 1h 후, 4.50 ml 트리플루오로메탄술폰산 (50.7 mmol, 0.05 eq) 및 50 ml 디클로로메탄을 오렌지색 현탁액에 첨가하고, 딘-스타크 분리기로부터 용매 (50 ml) 를 배출시켰다. 매 30 분 마다 상기 절차를, 총 6 회 (3h) 반복하였다. 총 4.5h 후, 적색 용액을 10 - 15℃ 로 냉각시키고, 30 분 내에 20 - 25℃ 에서 1.8 L 1M 소듐 수소 카보네이트 (1.8 mol, 2.0 eq) 의 용액 (CO₂ 발생, pH 7-8) 에 첨가하였다. 황색 유기 층을 분리시키고, 40℃/600-10mbar/3h 에서 증발시켜, 585.4 g 의 미정제 벤질 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트를 황색 오일 (HPLC 순도: 87%) 로서 수득하였다. 미정제 생성물을 700 ml 아세톤에 용해시키고, 미리 로딩된 실리카 컬럼 (3.0 kg 실리카 60; 0.063-0.2 mm) 에 충전하였다. 크로마토그래피를 이동상 (5:1 에서 1:2 까지의 구배) 으로서 n-헵탄/아세톤을 사용하여 수행하였다. 수합된 수집된 분획을 40℃/600-10mbar 에서 증발시키고 20 - 25℃/0.3mbar/3h 에서 건조시켜 465.0 g 벤질 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로-피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트를 황색 오일로서 83% 수율 및 100% 순도 (HPLC 면적-%) 로 수득하였다. MS: m/z = 628.2627 (M+H)⁺.

실시예 7

2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세트산

아르곤 분위기 하에, 456.0 g 벤질 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로-피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트 (727 mmol) 를 1.4 L THF 에 용해하였다. 4.56 g Pd/C 10% 를 첨가하고, 아르곤 분위기를 수소 (1 bar) 로 대체하였다. 검은색 현탁액을 20 - 25℃ 에서 2h 동안 수소첨가하였다. 수소 분위기를 아르곤으로 대체하였고, 검은색 현탁액을 여과하고, 필터 케이크를 총 400 ml THF 로 조금씩 세정하였다. 무색 여과액 (HPLC 순도: 71% 및 27% 톨루엔) 을 임의의 정제 없이 A+B 어셈블리 단계, 실시예 8 에서 사용하였다. MS: m/z = 538.2191 (M+H)⁺.

빌딩 블록 A 및 B 의 어셈블리

실시예 8a

벤질 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트

실시예 4 로부터의 벤질 (2S)-6-아미노-2-[[(2S)-2,6-디아미노헥사노일]아미노]헥사노에이트 트리-메탄술포네이트 (180.0 mmol) 의 적색-오렌지색 용액 (~1.4 L) 을 3.60 L 아세토니트릴로 희석하였다. 20 - 25℃ 에서, 365.0 ml N-에틸디이소프로필아민 (2.16 mol, 12.0 eq) 을 5 분 내에 첨가하였다. 형성된 점성의 슬러리에, 실시예 7 로부터의 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세트산 (720 mmol, 4.0 eq) 의 용액 (~2.25 L) 을 20 - 25℃ 에서 10 분 내에 첨가하였고, 이에 의해 온도가 40℃ 로 약간 증가하였다. 45 - 50℃ 에서, 425 ml n-프로필포스폰산 무수물 (T3P, 에틸 아세테이트 중의 삼량체 50%, 720 mmol, 4.0 eq) 의 용액을 10 분 내에 첨가하였다. 반응 용액을 1h 동안 45 - 50℃ 에서 교반하였다. 연황색 용액을 20 - 25℃ 로 냉각시키고 40℃/10mbar/6h 에서 증발시켜 미정제 1.06 kg 벤질 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트 (HPLC 순도: 24.1%) 를 수득하였다. 미정제 생성물을 3 부분으로 침전시켜, 메탄술폰산 N-에틸디이소프로필아민 및 잔류 T3P 를 제거하였다. 353 g 미정제 생성물을 7.0 L 2-프로판올에 용해하고, 1h 내에 -25℃ 로 냉각시키고, 1h 동안 -25℃ 에서 교반하고, 미리 냉각된 (-25℃) G3-유리-필터 (린스 없음) 로 여과하고, 침전된 생성물로부터의 일부가 반응기로부터 유리-웰 상에 퇴적되었다. 모든 침전물을 필터 및 유리-웰로부터 총 1.0 L THF 으로 조금씩 용해시켰다. 조합된 용액을 40℃/20mbar/6h 에서 증발시켜, 390.0 g 벤질 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트 (HPLC 순도: 71.9%) 를 수득하였고, 이것을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. MS: m/z = 1923.8438 (M+H)⁺

실시예 8b

소듐;(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트

벤질 (2S)-6-아미노-2-[[(2S)-2,6-디아미노헥사노일]아미노]헥사노에이트 트리-메탄술포네이트 (12.2 mmol) 의 적색-오렌지색 용액 (~95 ml) 을 240 ml 아세토니트릴로 희석하였다. 20 - 25℃ 에서, 30.0 ml N-에틸디이소프로필아민 (2.16 mol, 14.5 eq) 을 5 분 내에 첨가하였다. 형성된 점성의 슬러리에, 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세트산 (48.8 mmol, 4.0 eq) 의 용액 (~150 ml) 을 20 - 25℃ 에서 10 분 내에 첨가하였고, 이에 의해 온도가 40℃ 로 약간 증가하였다. 45 - 50℃ 에서, 28.8 ml n-프로필포스폰산 무수물 (T3P, 에틸 아세테이트 중 삼량체 50%, 48.8 mmol, 4.0 eq) 의 용액을 10 분 내에 첨가하였다. 반응 용액을 1h 동안 45 - 50℃ 에서 교반하였다. 연황색 용액을 20 - 25℃ 로 냉각시키고 40℃/10mbar/6h 에서 증발시켜, 미정제 73.6 g 벤질 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트 (HPLC 순도: 32%면적) 를 수득하였다.

68.0 g (11.0 mmol) 의 미정제 생성물을 340 ml 메탄올 20.0 ml (220 mmol, 20eq) 에 용해시키고, NaOH 10.8M 을 연황색 용액에 첨가하고, 온도를 32℃ 로 증가시키고, 반응 혼합물을 2.5h 동안 rt 에서 교반하였고, 이에 의해 현탁액이 형성되었다 (pH 12.0). 현탁액을 여과하고, 필터 케이크를 100.0 ml 메탄올로 세정하고, 여과액을 40℃/250-10mbar/2h 에서 증발시켜, 41.5 g 소듐 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트를 수득하였고, 그 다음 이것을 분취형 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다, 조건은 실시예 9 를 참고한다.

실시예 9

378.0 g (197.0 mmol, 미정제) 벤질 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트를 1.9 L 메탄올에 용해하였다. 10 분 내에, 200.0 mL 10.8 M 소듐 히드록사이드 용액 (2.16 mol, 11.0eq) 을 20 - 25℃ 에서 첨가하였다. 이에 의해 온도가 31℃ 로 증가하였다. 연황색 용액을 2h 동안 20 - 25℃ (pH 13.4) 에서 교반한 다음, 80.0 mL 5M 암모늄 클로라이드 용액을 첨가하였다 (pH 10.7). 연황색 용액을 이후 20 - 25℃/100-20mbar/5h 에서 증발시키고, 20-0.5mbar/1h 에서 건조시켜 미정제 543 g 소듐 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트 (HPLC 순도: 40.1%) 를 수득한 다음, 이것을 분취형 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

컬럼: Triart C18-120 26x15cm; 10um;

이동상: A: 2mM NaHCO₃ / B: 아세토니트릴;

구배:

자동온도조절: 실온

검출: 220 nm

용액: 543 g 을 4500 ml 2mM NaHCO₃ 에 용해하고 여과하였다 (GF5) ( = 5000 ml (109 mg/ml)

샘플 용액 / 주입: 실행 당 200 ml 샘플 = 21.8 g (25 회 실행)

농축: 조합된 분획 (46 L) 을 110 L 물로 희석하고, 상기 용액을 3 부분으로 RP C18 컬럼에 펌프하고, 물/MeOH 98/2, 그 다음 MeOH 로 세정하고 용리하고 회전 증발기 상에서 농축하여 1.18 kg 메탄올성 용액을 수득하였다. 분취용 HPLC 정제 단계의 1.18 kg 메탄올 용액의 4 분의 1, 즉, 295 g 을 40℃/20mbar/1h 에서, 그 다음 20 - 25℃/0.35mbar/14h 에서 건조상태로 증발시켜 43.5 g 소듐;(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트를 비정형 백색 분말로서, 99.88% HPLC 순도로 수득하였다. 상기 용액의 나머지 4 분의 3 (885 g) 을 다음 단계에서 사용하였다. MS: m/z = 1452.684 (M-H)^-.

실시예 10

(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥산산

실시예 9 로부터의 메탄올 용액 (885 g) 을 20 - 25℃ 에서 47.9 g Dowex (50x8 양이온-교환체; H₃O⁺ 농도 2.57 mmol/g) 로 처리하고, 1h 동안 (pH 3.1) 교반하고, 여과하고, 200 mL 메탄올로 세정하였다. 여과액을 20 - 25℃/15-50mbar 에서 증발시키고 20 - 25℃/0.01mbar/2h 에서 건조시켜 128.0 g (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥산산을 백색 비정형 분말로서, 99.77% HPLC 순도로 수득하였다. MS: m/z = 1452.684 (M-H)^-.

실시예 11

칼슘; (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트

0.10 g (0.068 mmol), (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥산산을 3.0 ml 메탄올 및 0.30 ml 물에 용해시키고, 2.60 mg (0.034 mmol, 0.5eq) 칼슘 히드록사이드를 첨가하고, 혼합물을 1h 동안 실온에서 교반하였다. 연한 혼탁한 용액을 40℃/200-10mbar/1h 에서 증발시켜 0.11 g 을 백색 고체로서 수득하였다. 99.60% HPLC 순도. MS: m/z = 1452.684 (M-H)^-.

올리고뉴클레오타이드에 대한 콘쥬게이션

실시예 11 (US 미국 출원 공개 2011/0207799 의 실시예 15 에 따름)

(20 mg, 0.014 mmol) (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥산산 (GalNAc 산) 을 피리딘 및 디클로로메탄으로 동시증발시켰다. 잔류물을 건조 DMF (0.9 ml) 에 용해시키고 아르곤 분위기 하에서 교반하면서 DMF 중의 N-히드록시숙신이미드 (HOSu) 의 용액 (1.6 mg, 0.014 mmol) 을 첨가하였다. 0℃ 에서 DMF 중의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) 의 용액 (3.2 mg, 0.016 mmol) 을 천천히 첨가하였다. 반응을 실온으로 가온시키고 밤새 교반하였다. 형성된 GalNAc N-히드록시숙신이미드 에스테르를 RNA 에 대한 콘쥬게이션을 위해 추가 정제 없이 사용하였다.

사용된 RNA 는 하기 서열을 갖는 아미노-개질된 RNA 였다:

5'-(NH₂C₆)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3' (SEQ ID 1), 식 중 u 및 c 는 상응하는 염기의 각각의 2'-O-메틸 뉴클레오타이드이고, s 는 포스포로티오에이트를 의미한다.

5'-말단에 C-6 아미노 링커가 구비된 RNA (2.54 μmol) 를 동결건조시키고 250 ㎕ 소듐 보레이트 완충액 (0.1 mol/L 소듐 보레이트, pH 8.5, 0.1 mol/L KCl) 및 1.1 mL DMSO 에 용해하였다. 8 ㎕ N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 의 첨가 후, DMF 중의 GalNAc N-히드록시숙신이미드 에스테르 (이론적으로 0.014 mmol) 의 용액을 연속 교반 하에서 RNA 용액에 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 35℃ 에서 밤새 진탕하였다. 반응을 RP-HPLC (Resource RPC 3 ml, 완충액: A: 물 중의 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트 (TEAA, 2.0 M, pH 7.0), B: 95% 아세토니트릴 중의 100 mM TEAA, 구배: 20 CV 중의 5% B 내지 22% B) 를 사용하여 모니터링하였다. EtOH 중의 소듐 아세테이트 (3 M) 를 사용하여 -20℃ 에서의 RNA 의 침전 후, RNA 콘쥬게이트를 상기 기재된 조건을 사용하여 정제하였다. 순수한 분획을 모으고, 원하는 콘쥬게이트를 소듐 아세테이트/EtOH 를 사용하여 침전시켜, 순수한 RNA 콘쥬게이트를 제공하였다. 콘쥬게이트는 59% 수율 (1.50 μmol) 로 단리되었다. 콘쥬게이트의 순도를 음이온 교환 HPLC (순도: 85.5%) 에 의해 분석하고, 정체를 ESI-MS 에 의해 확인하였다 ([M+H]¹⁺ _계산치: 8374.4; [M+H]¹⁺ _측정치: 8376.0).

Claims

하기 단계를 포함하는, 하기 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체:

(식 중, n 은 0 내지 10 의 정수임) 또는 이의 염, 이의 상응하는 거울상체 또는 광학 이성질체의 제조 방법:
a) 하기 화학식 II 의 트리아민 염:

(식 중, R¹ 은 에스테르 보호기이고, X 는 산의 음이온임) 과 하기 화학식 III 의 테트라히드로피란 산:

(식 중, R² 는 히드록시 보호기이고, n 은 상기와 같음) 과의, 펩타이드 커플링제, 아민 염기 및 유기 용매의 존재 하에서의 커플링으로 하기 화학식 IV 의 GalNAc 에스테르:

(식 중, R¹ 및 R² 및 n 은 상기와 같음) 를 형성하는 단계;
b) 무기 염기의 존재 하에서 에스테르 보호기 R¹ 및 히드록시 보호기 R² 의 제거로 하기 화학식 V 의 GalNAc 산 염:

(식 중, n 은 상기와 같고, M 은 금속 양이온임) 을 형성하는 단계;
및
c) 임의로 화학식 V 의 GalNAc 산 염을 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체로 변환시키는 단계.
제 1 항에 있어서, n 이 0 내지 5 의 정수이고, 에스테르 보호기 R¹ 이 C_1-7-알킬 또는 페닐-C_1-7-알킬이고, 페닐 기가 할로겐 또는 C_1-7-알킬로 임의 치환되고, 히드록시 보호기 R² 가 아세틸이고, X 가 술폰산의 음이온으로부터 선택되는 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 펩타이드 커플링제가 n-프로필포스폰산 무수물이고, 아민 염기가 삼차 아민인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 a) 에서의 커플링이 극성 비양자성 용매인 유기 용매에서 20℃ 내지 70℃ 의 반응 온도에서 일어나는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 b) 에서의 에스테르 보호기 R¹ 의 제거를 위한 무기 염기가 알칼리 히드록사이드인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 a) 및 b) 가 화학식 IV 의 GalNAc 에스테르의 단리 없이 하나의 단계에서 조합되고 수행되는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 화학식 V 의 GalNAc 산 염의 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체로의 임의적 변환이 양이온 교환을 통해 또는 산으로의 처리를 통해 수행되는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체가 하기 화학식 Ia 의 거울상체:

(식 중, n 은 상기와 같음) 또는 이의 염, 이의 상응하는 거울상체 또는 광학 이성질체인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 화학식 II 의 트리아민의 제조 방법이 하기 단계를 포함하는 제조 방법:
a1) 하기 화학식 X 의 카르복실산:

(식 중, R^3' 및 R⁴ 는 상이하고 서로 독립적으로 아미노 보호기임) 을 하기 화학식 XI 의 에스테르:

(식 중, R¹ 은 에스테르 보호기이고, R^3' 및 R⁴ 는 상기와 같음) 로 변환시키는 단계;
b1) 아미노 보호기 R⁴ 를 제거하고 하기 화학식 XII 의 아민 염:

(식 중, R¹ 및 R^3' 는 상기와 같고, X^- 는 산 음이온임) 을 후속하여 형성하는 단계;
c1) 화학식 XII 의 아민 염을 하기 화학식 XIII 의 헥산산 유도체:

(식 중, R^3" 및 R^3"' 는 아미노 보호기임) 와 커플링시켜, 하기 화학식 XIV 의 보호된 트리아민:

(식 중, R^3', R^3", R^3"' 및 R¹ 은 상기와 같음) 을 형성하는 단계;
d1) 화학식 XIV 의 보호된 트리아민을 산으로, 화학식 II 의 트리아민 염으로 전환시키는 단계.
제 9 항에 있어서, R^3', R^3" 및 R^3"' 가 동일하고 산성 조건 하에서 분할가능한 보호기이고, R⁴ 가 염기성 조건 하에서 또는 수소첨가분해에 의해 분할가능한 보호기인 제조 방법.
제 10 항에 있어서, R^3', R^3" 및 R^3"' 가 Boc 이고, R⁴ 가 FMOC 인 제조 방법.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a1) 에서의 변환이 벤질 알코올로, 활성화제, 아민 촉매 및 비양자성 유기 용매의 존재 하에 20℃ 내지 50℃ 의 반응 온도에서 일어나는 제조 방법.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노 보호기 R⁴ 가 FMOC 이고, 단계 b1) 에서의 이의 제거가 극성 비양자성 용매 중의 이차 지방족 아민으로 20℃ 내지 50℃ 의 반응 온도에서 수행되는 제조 방법.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b1) 에서의 화학식 XII 의 아민 염의 후속 형성이 술폰산으로 수행되는 제조 방법.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c1) 에서의 커플링이 커플링제로서 n-프로필포스폰산 무수물로, 삼차 아민 및 극성 비양자성 용매의 존재 하에 20℃ 내지 50℃ 의 반응 온도에서 수행되는 제조 방법.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d1) 에서 화학식 II 의 트리아민 염이 극성 비양자성 용매 중의 술폰산으로 20℃ 내지 80℃ 의 반응 온도에서 형성되는 제조 방법.
제 16 항에 있어서, 극성 비양자성 용매가 화학식 II 의 트리아민 염이 결정화되는 것을 방지하는 것으로 선택되는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 화학식 III 의 테트라히드로피란 산의 제조 방법이 하기 단계를 포함하는 제조 방법:
a2) 하기 화학식 XX 의 디올:

(식 중, n 은 상기와 같음) 을 하기 화학식 XXI 의 알코올 에스테르:

(식 중, n 은 상기와 같고, R⁵ 는 에스테르 보호기임) 로 변환시키는 단계;
b2) 화학식 XXI 의 알코올 에스테르와 하기 화학식 XXII 의 테트라히드로피란 유도체:

(식 중, R² 및 R⁶ 은 서로 독립적으로 히드록시 보호기임) 와의 커플링으로 하기 화학식 XXIII 의 테트라히드로피란 에스테르:

(식 중, n, R² 및 R⁵ 는 상기와 같음) 를 형성하는 단계;
c2) 에스테르 기의 제거로, 화학식 III 의 테트라히드로피란 산을 형성하는 단계.
제 18 항에 있어서, 히드록시 보호기 R² 가 아세틸이고, 에스테르 보호기 R⁵ 가 벤질이고, 히드록시 보호기 R⁶ 이 아세틸인 제조 방법.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 단계 a2) 의 첫번째 단계에서 화학식 XX 의 디올이 알칼리 금속 알코올레이트로, 극성 양자성 또는 극성 비양자성 용매의 존재 하에 50℃ 내지 120℃ 의 반응 온도에서 탈양자화되는 제조 방법.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 단계 a2) 의 두번째 단계에서 아세트산 잔기가 할로겐 아세트산 또는 이의 염으로, 극성 양자성 또는 극성 비양자성 용매의 존재 하에 50℃ 내지 120℃ 의 반응 온도에서 도입되는 제조 방법.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 단계 a2) 의 세번째 단계에서 화학식 XXI 의 알코올 에스테르 (식 중, R⁵ 는 벤질임) 가 극성 비양자성 용매 중의 벤질 할로게나이드 또는 벤질 술포닐에스테르로 20℃ 내지 120℃ 의 반응 온도에서 형성되는 제조 방법.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 단계 b2) 에서 화학식 XXI 의 알코올 에스테르가 화학식 XXII 의 테트라히드로피란 유도체와, 할로겐화된 술폰산의 존재 하에, 극성 비양자성 용매의 존재 하에 0℃ 내지 140℃ 의 반응 온도에서 커플링되는 제조 방법.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 단계 c2) 에서 벤질에스테르 기가 수소첨가 촉매의 존재 하에서 수소로의 촉매적 수소첨가에 의해 제거되는 제조 방법.
제 18 항에 있어서, 화학식 XXI 의 알코올 에스테르의 형성이 하기 단계를 포함하는 제조 방법:
a3) 하기 화학식 XXV 의 2-아미노 아세테이트:

(식 중, R⁵ 는 상기와 같고, X 는 할로겐 원자임) 와 니트라이트 염과의 디아조화로 하기 화학식 XXVI 의 2-디아조 화합물:

(식 중, R⁵ 는 상기와 같음) 을 형성하는 단계; 및
b3) 화학식 XXVI 의 2-디아조 화합물을 화학식 XX 의 디올과 함께 변환시키는 단계.
제 25 항에 있어서, 단계 a3) 에서의 디아조화가 알칼리 니트라이트로, 물 및 무-극성 비양자성 용매의 용매 혼합물의 존재 하에 -10℃ 내지 10℃ 의 반응 온도에서 수행되는 제조 방법.
제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 단계 b3) 에서의 2-디아조 화합물과 화학식 XX 의 디올과의 변환이 루이스산 및 무-극성 비양자성 용매의 존재 하에 -10℃ 내지 10℃ 의 반응 온도에서 수행되는 제조 방법.
하기 단계를 포함하는, GalNAc 올리고뉴클레오타이드 콘쥬게이트의 제조 방법:
a3) 제 1 항에 따라 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체 또는 화학식 V 의 GalNAc 산 염을 제조하는 단계, 및
b3) 화학식 I 의 GalNAc 산 유도체 또는 화학식 V 의 GalNAc 산 염을, 펩타이드 커플링 조건 하에서 올리고뉴클레오타이드와 콘쥬게이션시키는 단계.
제 28 항에 있어서, 화학식 V 의 GalNAc 산 염이 사용되는 제조 방법.
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