KR102536687B1 - 리보핵산의 무세포 생산 - Google Patents

Abstract

일부 측면에서, 리보핵산의 무세포 생산을 위한 방법 및 조성물이 본원에서 제공된다.

Description

리보핵산의 무세포 생산

관련 출원

이 출원은 2016년 4월 6일에 출원된 미국 가출원 제62/319,220호 및 2017년 1월 31일에 출원된 미국 가출원 제62/452,550호의 35 U.S.C. § 119(e) 하의 우선권을 주장하며, 이들의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

리보핵산 (RNA)은 생명체에 편재한다. RNA는 단백질의 조절 및 합성을 위한 DNA로부터의 지시를 운반하는, 세포에서의 정보의 핵심적 메신저로서 작용한다. RNA는 생명공학에서 흥미로운데, 이는 세포에서 mRNA 수준을 합성적으로 조정하는 것 (양성적으로 mRNA의 도입을 통해 또는 음성적으로 siRNA 또는 dsRNA의 도입을 통해)이 농업 작물 보호, 항암 치료제, 및 백신과 같은 분야에서 적용을 갖기 때문이다. 예를 들어, RNA 간섭 (RNAi)은 유전자를 "턴 오프"시키는 유전자의 DNA 서열을 사용하는 세포적 메커니즘 - "침묵화"로 지칭되는 프로세스를 지칭한다. 동물, 식물, 및 진균을 비롯한 폭넓게 다양한 유기체에서, RNAi는 이중-가닥 RNA (dsRNA)에 의해 촉발된다. 기능적 단일-가닥 (예를 들어 mRNA) 및 이중-가닥 RNA 분자는 살아있는 세포에서 및 정제된 재조합 효소 및 정제된 뉴클레오티드 트리포스페이트를 사용하여 시험관 내에서 생산되었다 (예를 들어, 유럽 특허 제1631675호 및 미국 특허 출원 공개 제2014/0271559 A1호 참조, 이들의 각각은 본원에 참조로 포함됨). 그럼에도 불구하고, 광범위한 상업적 적용을 가능하게 하는 규모에서의 RNA의 생산은 현재 비용이 엄청나게 높다.

RNA의 생산 (생합성)을 위한 방법, 조성물, 세포, 구축물, 및 시스템이 본원에서 제공된다. 일반적으로, 바이오매스 물질로부터의 중합체성 RNA는 그의 구성요소 단량체로 효소적으로 해중합되고, 그 후 이들 단량체는 그들의 동족체 삼인산화된 변이체로 인산화되며 (일련의 키나제를 통해), 이는 이어서 상응하는 핵산 (예를 들어, DNA) 주형을 사용하여 중합체성 RNA로 중합된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법, 조성물, 세포, 구축물, 및 시스템은 무세포 조건 하에서, 예를 들어, 적어도 1종의 세포 용해물, 정제된 단백질의 조합, 또는 세포 용해물(들) 및 정제된 단백질(들)의 조합을 사용하여 RNA의 생산에 사용된다. 본 개시내용은, 일부 실시양태에서, 세포 용해물을 사용한 바이오매스 (예를 들어, 내인성 세포 RNA))로부터의 RNA의 바람직한 합성 RNA (예를 들어, 합성 단일-가닥 또는 이중-가닥 RNA)로의 전환에 기초한다. 먼저, 바이오매스로부터의 RNA (예를 들어, 내인성 RNA), 예컨대 메신저 RNA (mRNA), 운반 RNA (tRNA), 및/또는 리보솜 RNA (rRNA) (예를 들어, 세포 용해물에 존재함)를 1종 이상의 뉴클레아제에 의해 그의 단량체성 형태인 5'-뉴클레오시드 모노포스페이트 (NMP)로 해중합시킨다 (도 1, 반응 1). 다음으로, 이들 뉴클레아제, 뿐만 아니라 천연 뉴클레아제 및 포스파타제를 불활성화시키거나 부분적으로 불활성화시키고 (예를 들어, 열 불활성화를 통해), NMP를 일련의 열안정성 키나제 활성에 의해 리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (NTP)로 인산화시킨다 (도 1, 반응 2). 마지막으로, NTP를 핵산 (예를 들어, DNA) 주형을 사용하여 RNA 폴리머라제 (예를 들어, 열안정성 RNA 폴리머라제)에 의해 중합시켜 바람직한 RNA를 형성한다 (도 1, 반응 3). 바람직한 합성 RNA는 임의로 세포 용해물로부터 정제될 수 있다.

따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 (a) (i) RNA, 및 (ii) RNA를 해중합시키는 효소적 활성, 열안정성 키나제 활성, 및 열안정성 RNA 폴리머라제 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 효소적 활성을 포함하는 적어도 1종의 세포 용해물 혼합물을, RNA의 해중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션하여 뉴클레오시드 모노포스페이트를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 제조하는 단계; (b) 단계 (a)에서 제조된 세포 용해물 혼합물을, 열안정성 키나제 활성 및 열안정성 RNA 폴리머라제 활성을 완전히 불활성화시키지 않고 내인성 뉴클레아제 및 포스파타제를 불활성화시키거나 부분적으로 불활성화시키는 온도 (예를 들어, 50 내지 80℃)로 가열하여, 열-불활성화된 뉴클레아제 및 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 제조하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 제조된 세포 용해물 혼합물을 에너지 공급원 (예를 들어, ATP 재생 시스템) 및 데옥시리보핵산 (DNA) 주형 (예를 들어, 관심의 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유함)의 존재 하에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 생성 및 뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션하여 관심의 RNA를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는, 리보핵산 (RNA)의 무세포 생산 (생합성) 방법을 제공한다.

세포 용해물 혼합물은, RNA를 포함하고, 리보뉴클레아제로서 작용하고/거나, 키나제로서 작용하고/거나, RNA 폴리머라제로서 작용하는 적어도 1종의 효소 (적어도 1종의 융합 효소를 포함함)를 발현하는 세포로부터 얻어진 단일 세포 용해물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포 용해물 혼합물은 적어도 2종의 (예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 또는 6종의) 세포 용해물을 포함할 수 있으며, 적어도 1종의 세포 용해물은 RNA를 포함하는 세포로부터 얻어지고, 적어도 1종의 세포 용해물 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 또는 5종)은 뉴클레아제로서 작용하고/거나, 키나제로서 작용하고/거나, RNA 폴리머라제로서 작용하는 적어도 1종의 효소를 발현하는 세포로부터 얻어진다.

효소 또는 융합 효소는, 효소 또는 융합 효소가 뉴클레아제 활성을 나타내는 (핵산을 절단하거나 해중합시키는; 예를 들어, RN아제 R) 경우, "뉴클레아제로서 작용하는" 것으로 간주된다. 효소 또는 융합 효소는, 효소 또는 융합 효소가 키나제 활성을 나타내는 (한 분자로부터 또다른 분자로의 포스페이트 기의 전달을 촉매하는; 예를 들어 폴리포스페이트 키나제) 경우, "키나제로서 작용하는" 것으로 간주된다. 효소 또는 융합 효소는, 효소 또는 융합 효소가 폴리머라제 활성을 나타내는 (뉴클레오티드를 어셈블리하여 핵산을 생산하는; 예를 들어, RNA 폴리머라제) 경우, "폴리머라제로서 작용하는" 것으로 간주된다.

일부 실시양태에서, 단계 (a)의 RNA는 메신저 RNA (mRNA), 운반 RNA (tRNA), 또는 리보솜 RNA (rRNA)이다.

일부 실시양태에서, 세포 용해물 혼합물은 적어도 1종의 리보뉴클레아제, 적어도 1종의 열안정성 키나제, 및/또는 적어도 1종의 RNA 폴리머라제 (예를 들어, 열안정성 RNA 폴리머라제)를 포함한다. 융합 효소의 용도는 또한 본 개시내용에 의해 포괄된다. 예를 들어 세포 용해물 혼합물은 리보뉴클레아제 및 키나제의 융합, 또는 다중 키나제의 융합을 포함할 수 있다. 다른 융합 효소는 본 개시내용에 의해 포괄된다.

본 개시내용의 다른 측면은 적어도 1종의 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제 (예를 들어, 열안정성 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제), 적어도 1종의 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제 (예를 들어, 열안정성 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제), 및 적어도 1종의 폴리포스페이트 키나제 (예를 들어, 열안정성 폴리포스페이트 키나제)를 포함하는 조작된 세포, 세포 용해물, 및 세포 용해물 혼합물을 제공한다. 세포는 일부 실시양태에서, 또한 적어도 1종의 리보뉴클레아제 및/또는 적어도 1종의 RNA 폴리머라제 (예를 들어, 열안정성 RNA 폴리머라제)를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, RNA를 생산하는 (생합성하는) 방법은 (a) RNA (예를 들어, mRNA, tRNA, 및/또는 rRNA), RN아제 R, 열안정성 키나제 (예를 들어, PfPyrH, TthAdk, TthCmk, PfGmk, AaNdk, TePpk, 및/또는 PPK2 (예를 들어, 표 6 참조), 및 열안정성 T7 RNA 폴리머라제를 포함하는 배양된 세포 (예를 들어, 조작된 세포)를 용해시킴으로써, 세포 용해물을 제조하는 단계, (b) 단계 (a)에서 제조된 세포 용해물을 RNA의 5'-NMP로의 해중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션함으로써, 5'-NMP를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 단계, (c) 단계 (b)에서 제조된 세포 용해물을 60 내지 80℃로 가열하여, 열안정성 키나제 및 열안정성 RNA 폴리머라제를 완전히 불활성화시키지 않고 내인성 뉴클레아제 및 포스파타제를 불활성화시킴으로써, 열-불활성화된 뉴클레아제 및 포스파타제를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 단계, 및 (d) 단계 (c)에서 제조된 세포 용해물을 에너지 공급원 (예를 들어, 폴리포스페이트를 포함하는 ATP 재생 시스템) 및 조작된 핵산 (예를 들어, DNA) 주형 (예를 들어, 관심의 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유함)의 존재 하에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 생성 및 뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션하여 관심의 RNA를 생산하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, RNA, RN아제 R, 열안정성 키나제, 및 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 배양된 세포 (예를 들어, 조작된 세포)의 단일 균주에 함유된다. 다른 실시양태에서, 상기 활성/성분의 하위세트를 함유하는 배양된 세포 (예를 들어, 조작된 세포)를 용해시키고, 용해물을 합하여 상기 단계 (a)에 기재된 모든 효소적 활성을 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생성한다. 일부 실시양태에서, 정제된 효소의 형태의 효소적 활성은 상기 단계 (a)에 기재된 용해물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 용해물 및/또는 정제된 단백질은 상기 단계 (c)에 기재된 열-불활성화 단계 전에 합해진다. 다른 실시양태에서, 용해물 및/또는 정제된 단백질은 상기 단계 (c)에 기재된 열 불활성화 단계 후에 합해진다.

관심의 RNA는 단일-가닥 RNA 및 이중-가닥 RNA를 비롯한 임의의 형태의 RNA일 수 있다. 예를 들어, 관심의 RNA는 메신저 RNA (mRNA), 안티센스 RNA, 마이크로 RNA, 작은 간섭 RNA (siRNA), 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)일 수 있다. 다른 RNA 간섭 (RNAi) 분자는 본원에 포괄된다.

본 발명의 몇몇 실시양태의 상세사항을 첨부된 도면 및 상세한 설명에 제시한다. 본 발명의 다른 측면, 목적, 및 이점은 설명으로부터 및 청구항으로부터 명백할 것이다.

도 1은 본원에 기재된 바와 같은 무세포 RNA 생산의 개략도를 나타낸다. 바이오매스로부터의 RNA (예를 들어, 내인성 RNA), 뉴클레아제, 열안정성 키나제, 및/또는 열안정성 RNA 폴리머라제를 함유하는 세포를 용해시키고 (또는 합하고, 용해시키고), 생성된 세포 용해물(들)을 RNA의 해중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션한다. 그 후, 세포 용해물을 가열하여 뉴클레아제 및 임의의 내인성 포스파타제를 불활성화시킨다 (열안정성 키나제 및 열안정성 RNA 폴리머라제를 불활성화시키지 않고). 그 후, 세포 용해물을 관심의 RNA를 코딩하는 조작된 DNA 주형의 존재 하에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 생성 및 뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션함으로써, 관심의 RNA (예를 들어, ssRNA 또는 dsRNA)를 생산한다. 대안적으로, 개별적인 정제된 경로 효소 (예를 들어, RNA 폴리머라제, 예컨대 열안정성 RNA 폴리머라제)를 열 불활성화 단계 후에 세포 용해물에 첨가할 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 세포 용해물을 제조하는 데 사용되는 조작된 세포는 상기 기재된 효소적 활성, 예를 들어, 뉴클레아제, 열안정성 키나제 및/또는 열안정성 RNA 폴리머라제 중 1종 이상을 발현하지 않는다.
도 2a는 에너지 생성을 위한 폴리포스페이트-의존성 키나제 경로의 개략도를 나타낸다. 도 2b는 본 개시내용의 방법 및 시스템에 사용하기 위한 추가의 예시적인 에너지 전환 경로의 개략도를 나타낸다. UMP 키나제 (예를 들어, 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus)로부터 얻어짐) 및 폴리포스페이트 키나제 (예를 들어, 써모시네코코쿠스 엘롱가투스 (Thermosynechococcus elongatus), 칼디리네아 아에로필라 (Caldilinea aerophila), 데이노코쿠스 게오써말리스 (Deinococcus geothermalis), 메이오써무스 루버 (Meiothermus ruber), 메이오써무스 실바누스 (Meiothermus silvanus), 데이노코쿠스 게오써말리스, 아나에로리네아 써모필라 (Anaerolinea thermophila), 클로로바쿨룸 테피둠 (Chlorobaculum tepidum), 오세아니써무스 프로푼두스 (Oceanithermus profundus), 로세이플렉수스 카스텐홀치이 (Roseiflexus castenholzii), 로세이플렉수스 종 (Roseiflexus sp.), 또는 트루에페라 라디오빅트릭스 (Truepera radiovictrix)로부터 얻어짐)는 UMP를 UDP로 전환시키는 데 사용될 수 있고, NDP 키나제 (예를 들어, 아퀴펙스 아에오리쿠스 (Aquifex aeolicus) ndk 유전자에 의해 코딩됨) 및 폴리포스페이트 키나제는 UDP를 UTP로 전환시키는 데 사용될 수 있다. CMP 키나제 (예를 들어, 써무스 써모필루스 (Thermus thermophilus)로부터 얻어짐) 및 폴리포스페이트 키나제는 CMP를 CDP로 전환시키는 데 사용될 수 있고, NDP 키나제 및 폴리포스페이트 키나제는 CDP를 CTP로 전환시키는 데 사용될 수 있다. GMP 키나제 (예를 들어, 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima)로부터 얻어짐) 및 폴리포스페이트 키나제는 GMP를 GDP로 전환시키는 데 사용될 수 있고, NDP 키나제 및 폴리포스페이트 키나제는 GDP를 GTP로 전환시키는 데 사용될 수 있다. AMP 키나제 (예를 들어, 써무스 써모필루스로부터 얻어짐) 및 폴리포스페이트 키나제는 AMP를 ADP로 전환시키는 데 사용될 수 있고, NDP 키나제 (예를 들어, 아퀴펙스 아에오리쿠스 ndk 유전자에 의해 코딩됨) 및 폴리포스페이트 키나제는 ADP를 ATP로 전환시키는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 부류 III PPK2 효소 (예를 들어, 표 6 참조)는 AMP를 ATP로 전환시키는 데 사용될 수 있다.
도 3a는 이중-가닥 RNA의 생합성에 사용된 DNA 주형의 예의 개략도를 나타낸다. 플라스미드의 일부로서 코딩되는 DNA 주형은 관심의 코딩 영역에 작동적으로 연결된 프로모터 및 1개 이상의 종결자를 포함하는 단일 코딩 영역을 함유한다. 전사 후, RNA는 세포내 뉴클레오티드 염기 쌍형성을 통해 헤어핀 구조로 폴딩된다. 단독으로 또는 플라스미드의 일부로서 코딩되는 DNA 주형은 도메인 2에 의해 분리된 2개의 상보적 도메인 (1 및 3)을 함유한다. 도 3b는 이중-가닥 RNA의 생합성에 사용된 DNA 주형의 또다른 예의 개략도를 나타낸다. DNA 주형은 상보적 가닥 상에 커버링 프로모터 서열을 함유한다. 각각의 주형 가닥으로부터 전사된 RNA 서열은 전사 후 어닐링한다. 도 3c는 이중-가닥 RNA의 생합성에 사용된 DNA 주형의 또다른 예의 개략도를 나타낸다. 플라스미드의 일부로서 코딩되는 DNA 주형은 상보적 가닥 상에 관심의 코딩 영역에 작동적으로 연결된 커버링 프로모터 서열, 뿐만 아니라 초과 전사를 방지하기 위한 1개 이상의 종결자 서열을 함유한다. 도 3d는 이중-가닥 RNA의 생합성에 사용된 DNA 주형의 또다른 예의 개략도를 나타낸다. 플라스미드의 일부로서 코딩되는 DNA 주형은 독립적인 카세트를 함유하며, 각각은 상보적 서열의 전사를 유도하는 관심의 코딩 영역에 작동적으로 연결된 프로모터 및 1개 이상의 종결자를 포함하고, 이는 전사 후 어닐링한다. 도 3e는 이중-가닥 RNA의 생합성에 사용된 DNA 주형의 또다른 예의 개략도를 나타낸다. DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 ssRNA 주형을 제조하는 데 사용되고, RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 이중-가닥 RNA를 제조하는 데 사용된다.
도 4는 본 개시내용의 무세포 RNA 생산 방법의 또다른 예의 개략도를 나타낸다. 프로세스는 조작된 세포가 표준 발효 기법을 사용하여 제조되는 단일 발효 용기로 시작한다. 발효로부터 생성된 바이오매스를 임의로 미세여과 (MF)에 의해 농축시킨 후, 예를 들어 기계적 균질화를 통해 용해시킨다. 그 후, 용해물을 제2 발효 용기 내로 펌핑하고, 여기서, 발효된 뉴클레아제 효소는 RNA를 그의 단량체성 구성요소로 전환시킨다. 전체 반응물을 가열하여 임의의 내인성 포스파타제 또는 뉴클레아제 (예를 들어, RN아제) 활성 뿐만 아니라, RNA 생성물 안정성 및/또는 정확도에 해로울 임의의 다른 외인성/도입된 세포적 (예를 들어, 뉴클레아제) 활성을 불활성화시킨다. 열 불활성화 후, 폴리포스페이트를 일련의 열안정성 키나제를 통한 NMP의 NTP로의 인산화를 위한 고-에너지 포스페이트의 공급원으로서 반응물에 공급한 후, dsRNA로 중합시킨다. 하류 프로세싱을 사용하여 순도를 중량 기준으로 99％ (예를 들어, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％, 또는 99％) dsRNA만큼으로 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 프로세싱은 순도를 50 내지 60％, 50 내지 70％, 50 내지 80％, 50 내지 90％, 50 내지 95％, 70 내지 80％, 70 내지 90％, 또는 70 내지 95％로 증가시키는 데 사용될 수 있다. 예시적인 하류 프로세스는 단백질 침전제 (예를 들어, 아세트산암모늄)의 첨가로 시작한 후, 디스크 적층 원심분리 (DSC) 또는 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 생성물 스트림으로부터 단백질, 지질 및 일부 DNA를 제거한다. 그 후, 한외여과를 실행하여 염을 제거하고, 부피를 감소시킨다. 생성물 스트림에의 염화리튬의 첨가는 dsRNA 생성물의 침전을 발생시키고, 이어서 디스크 적층 원심분리를 사용하여 벌크 액체로부터 분리되어 80％ 순도 dsRNA 생성물 스트림을 생성한다. 추가의 크로마토그래피 연마는 99％ 순수한 생성물을 생성한다 (Nilsen, TW. Cold Spring Harb Protoc. 2012 Dec 1;2012(12)).
도 5a 내지 5b는 정제된 이. 콜라이 (E. coli) RNA의 소화에 의한 리보뉴클레아제 활성의 비교를 나타낸다. (도 5a) 뉴클레아제 처리로의 산-가용성 뉴클레오티드 (모노뉴클레오티드 및 짧은 올리고뉴클레오티드)의 방출은 벤조나제, RN아제 A, RN아제 R, 및 뉴클레아제 P1로 가장 급속하였다. (도 5b) 반응 생성물의 LC-MS 분석은 RN아제 R 및 뉴클레아제 P1 처리로의 RNA로부터의 NMP의 방출을 입증하였다.
도 6은 외인성 RN아제 R을 사용한 용해물 RNA의 해중합을 나타내는 그래프이며, 생성물은 5'-NMP를 구체적으로 확인하기 위해 UPLC에 의해 분석되었다. RN아제 R의 부재 하에서, 용해물은 5'-NMP의 느린 축적을 발생시킨 내인성 RN아제 활성을 나타내었다 (어두운 회색 실선). 외인성 RN아제 R의 첨가는 2' 또는 3' NMP 축적 (밝은 회색 선)의 속도에 영향을 미치지 않고, 급속한 5'-NMP 방출 (어두운 회색 파선)을 발생시켰다. 따라서, RN아제 R의 과발현은 5'-NMP 전환에 대한 중합체성 RNA의 속도를 가속화시키고, 이는 추출물에 존재하는 포스파타제/뉴클레아제 활성의 유해한 효과를 감소시킨다. 실험은 50％ 용해물의 최종 농도에서 수행하였다.
도 7a 내지 7c는 배치 단계에서 성장된 1L 생물반응기 배양물에서의 RN아제 R 과발현의 결과를 나타낸다. (도 7a) 이중 배양물에서의 단백질 발현의 SDS-PAGE 분석. 비어있는 벡터 배양물은 비어있는 단백질 발현 벡터 (pETDuet-1)를 함유하였다. RN아제 R 배양물은 pETDuet-1 내로 클로닝된 이. 콜라이 rnr을 함유하였다. 유도된 배양물로부터의 샘플 (+)은 우측에서 화살표에 의해 지시된 RN아제 R의 강한 발현 (C-말단 헥사시스티딘 태그로 MW 92.9 kDa)을 나타내었다. (도 7b) 비어있는 벡터 (어두운 회색) 및 RN아제 R-발현 균주 (밝은 회색)의 성장 동역학 (유도전 및 유도후 성장을 포괄함)은 RN아제 R 과발현이 세포 성장에 유해하지 않았음을 입증하였다. 파선은 지수 곡선 핏을 나타낸다. (도 7c) 과발현된 RN아제 R은 산-가용성 뉴클레오티드를 방출하는 배치-성장된 바이오매스의 용해물에서 활성이었다. 비어있는 벡터 균주 (어두운 회색 실선)에서, 외인성 RN아제 R을 첨가하는 것은 뉴클레오티드 방출의 속도를 증가시켰다 (어두운 회색 파선). 대조적으로, RN아제 R을 발현하는 균주는 용해 시 급속한 뉴클레오티드 방출을 나타내었다 (밝은 회색 실선). 외인성 RN아제 R을 첨가하는 것은 뉴클레오티드 방출의 속도 또는 최종 뉴클레오티드 수율을 증가시키지 않았다 (밝은 회색 파선). 실험은 50％ 용해물의 최종 농도에서 수행하였다.
도 8은 고-밀도 용해물에서의 해중합 속도에 대한 킬레이트화 Mg²⁺의 효과를 기재하는 그래프이다. 비어있는 벡터를 함유하는 바이오매스로부터 제조된 용해물 (어두운 회색)은 EDTA에 불감성이었다. 과발현된 RN아제 R을 갖는 용해물 (밝은 회색)은 Mg²⁺ 제거와 함께 급속한 RNA 해중합을 나타내었으며, 8 mM EDTA는 최대 해중합 속도를 제공하였다. 실험은 90％ 용해물의 최종 농도에서 수행하였다.
도 9a 내지 9d는 용해물에서의 외인성 동위원소적으로-표지된 "무거운" NMP (hNMP)의 안정성을 입증하는 그래프를 나타낸다: (도 9a) hAMP는 용해물에서 상대적으로 안정하였으며, 37℃에서 1시간 인큐베이션 후에 90％가 잔류하였다. (도 9b) hCMP는 용해물에서 분해되었으며, 대략 30분 후에 70％가 잔류하였다. 10 mM 오르토바나듐산나트륨 (점선) (몇몇 포스파타제 및 키나제의 억제제)의 첨가는 안정성을 유의하게 개선시켰다. (도 9c) hUMP는 용해물에서 분해되었으며, 대략 20분 후에 70％가 잔류하였다. 인산나트륨 (150 mM) (파선) 및 오르토바나듐산나트륨 (점선)은 안정성을 유의하게 개선시켰다. (도 9d) hGMP는 용해물에서 분해되었으며, 대략 10분 후에 70％가 잔류하였다. 오르토바나듐산나트륨은 안정성을 유의하게 개선시켰으며, 30분 후에 70％ hGMP가 잔류하였다.
도 10은 용해물에서의 외인성 NTP의 안정성에 대한 열 불활성화의 효과를 입증하는 그래프이다. 용해물을 70℃에서 예비-인큐베이션한 후, 온도를 37℃로 저하시키고, NTP의 등몰 혼합물 (ATP, CTP, UTP, 및 GTP)을 첨가하였다. 예비-인큐베이션 시간은 우측에서 범례에 열거한다. 대조군 용해물 (열 불활성화로 처리하지 않음)은 NTP를 급속하게 소비하였다 (T=0분). 예비-인큐베이션 시간을 증가시키는 것은 NTP를 안정화시켰으며, 70℃에서 15분으로 NTP아제 활성을 제거하였다 (T=15분).
도 11a 내지 11b는 용해물에서의 NMP 및 dsRNA의 안정성에 대한 열 불활성화의 효과를 입증하는 그래프이다. (도 11a) 열 불활성화는 용해물에서 NMP를 안정화시켰다. 용해물을 37℃에서 외인성 RN아제 R (용해물 + RN아제 R) (t = 0분 내지 5분)로 처리하여 NMP를 방출시킨 후, 70℃에서 열 불활성화시켰다 (t = 5분 내지 25분). 그 후, 온도를 37℃로 저하시키고, 반응물을 추가의 60분 동안 인큐베이션하였다. NMP는 열 불활성화 후에 용해물에서 크게 안정하였다. (도 11b) 열 불활성화는 용해물에서의 전사 반응의 반응물 및 생성물을 안정화시켰다. 용해물을 지시된 온도에서 15분 동안 예비-인큐베이션한 후, 온도를 37℃로 저하시키고, 전사 반응물을 첨가하였다. 70℃ 및 80℃에서의 열 불활성화는 기질 및 생성물을 충분히 안정화시켜 양성 대조군과 유사한 검출가능한 전사 생성물을 생성하였지만 (용해물 없음), 60℃는 그렇지 않았다.
도 12는 ATP 소비에 대한 루시페라제 검정에 의해 정량화된 피. 푸리오수스 (P. furiosus)로부터의 UMP 키나제 (PfPyrH)의 온도-의존적 활성을 입증하는 그래프이다. 정제된 PfPyrH의 비활성은 인큐베이션 온도에 크게 불감성이었다.
도 13은 루시페라제를 통해 측정된 이. 콜라이로부터의 Adk (EcAdk)에 비해 티. 써모필루스 (T. thermophilus)로부터의 AMP 키나제 (TthAdk)의 온도-의존적 활성을 입증하는 그래프이다. 정제된 EcAdk는 60℃ 미만의 온도에서 활성이었다. TthAdk는 보다 높은 비활성을 가졌으며, 70℃에서 최대였다.
도 14는 루시페라제를 통해 측정된 티. 써모필루스로부터의 CMP 키나제 (TthCmk)의 온도-의존적 활성을 입증하는 그래프이다. 정제된 TthCmk는 온도에 상대적으로 불감성이었으며, 37 내지 80℃에서 높은 활성을 갖는다.
도 15는 루시페라제를 통해 측정된 이. 콜라이 (EcGmk), 티. 써모필루스 (TthGmk), 및 티. 마리티마 (T. maritima) (TmGmk)로부터의 GMP 키나제의 온도-의존적 활성을 입증하는 그래프이다. 정제된 EcGmk (어두운 회색)는 보다 낮은 온도에서 보다 활성이었던 반면, TthGmk (밝은 회색) 및 TmGmk (중간 회색)는 70℃에서 가장 활성이었다.
도 16은 루시페라제를 통해 측정된 에이. 아에오리쿠스 (A. aeolicus)로부터의 정제된 NDP 키나제 (AaNdk)의 활성을 입증하는 데이터의 그래프이다. 정제된 AaNdk는 ATP 및 GDP를 기질로서 사용하여 37 내지 80℃에서 고도로 활성이었으며, 50℃에서 최적 활성을 가졌다.
도 17은 루시페라제를 통해 측정된 이. 콜라이 (EcPpk), 써모시네코코쿠스 엘롱가투스 (TePpk), 및 써무스 써모필루스 (TthPpk)로부터의 정제된 폴리포스페이트 키나제 1 (PPK1) 효소의 활성을 입증하는 그래프이다. EcPpk는 60℃ 이하의 온도에서 가장 활성이었던 반면, TePpk는 70℃에서 최적으로 활성이었다. TthPpk는 상대적으로 낮은 활성을 나타내었다.
도 18은 37℃에서 그들의 각각의 제조자에 의해 권고되는 조건을 사용한 완충제에서의 시판되는 T7 RNA 폴리머라제의 활성을 입증하는 그래프이다. 써모T7 (ThermoT7) 및 메가스크립트 (MegaScript) 폴리머라제는 두가닥 DNA 주형 (예를 들어 도 3b에서)으로 시험된 조건 하에서의 NEB 폴리머라제보다 더 높은 비활성을 나타내었다.
도 19는 두가닥 DNA 주형으로의 표준화된 반응 조건 하에서 37℃ 및 50℃에서 희석액 용해물에서의 T7 RNA 폴리머라제 활성을 비교하는 그래프이다. 37℃에서, 써모T7은 가장 높은 비활성을 나타내었다. 50℃에서, 단지 써모T7만이 검출가능한 활성을 가졌으며, 10 g/L/시 dsRNA 초과를 생산하였다.
도 20은 완충제 및 고-밀도 열-불활성화된 용해물에서의 써모T7 활성의 활성을 입증하는 그래프이다. 써모T7 활성은 열-불활성화 후에 원심분리에 의해 정화된 용해물에서 가장 높았다. 정화 단계를 생략하는 것은 활성의 60％ 감소를 발생시켰지만, 비정화된 매트릭스에서의 폴리머라제 활성은 완충제 단독에서보다 더 컸다.
도 21은 승온에 대한 써모T7의 내성을 입증하는 그래프이다. 50℃에서 써모T7을 예비-인큐베이션하는 것은 37℃에서 검정된 후속의 폴리머라제 활성에 대한 효과를 갖지 않았다. 60℃ 및 70℃에서 예비-인큐베이션하는 것은 효소 기능의 급속한 비가역적 억제를 발생시켰다.
도 22a는 이. 콜라이 균주 GL16-170에서 에이. 써모필라 (A. thermophila) PPK2에 대한 발현 및 용해도 데이터를 나타내는 SDS-PAGE 겔의 화상이다. MW: 비염색된 단백질 표준, 넓은 범위 (Unstained Protein Standard, Broad Range) (뉴잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs) 카탈로그 # P7704). -: 예비-유도 배양. +: 수확 시 유도된 배양. L: 정화된 용해물 중의 가용성 단백질. 에이. 써모필라 PPK2: 33 kDa. 도 22b는 열-불활성화된 용해물에서의 에이. 써모필라 PPK2의 ATP 생성을 나타내는 그래프이다. 채워진 원은 ADP로부터의 ATP 생성을 나타낸다. 비어있는 원은 AMP로부터의 ATP 생성을 나타낸다. 둘 다의 기질에 대해, 에이. 써모필라 PPK2는 ATP를 400 mM/시를 초과하는 속도로 생성한다.
도 23은 무세포 dsRNA 생산에서의 에너지 생성을 위한 열안정성 부류 III PPK2의 적용을 입증하는 아가로스 겔의 화상이다. 좌측 레인은 NTP로부터의 dsRNA 합성을 입증하는 양성 대조군을 함유한다. 중간 레인은 에너지 공급원으로서 외인성 ATP를 사용한 뉴클레오티드 키나제-발현 용해물에서의 NMP로부터의 dsRNA 합성을 입증하는 양성 대조군을 함유한다. 우측 레인은 뉴클레오티드 키나제 및 씨. 아에로필라 (C. aerophila) Ppk-발현 용해물을 사용한 NMP 및 HMP로부터의 dsRNA 합성을 입증하는 반응을 함유한다. 각각의 경우, 무세포 RNA 합성 반응은 Mn²⁺ 독립적이다. 폴리머라제가 없는 반응은 각각의 용해물-함유 반응의 배경 핵산 함량을 예시하는 음성 대조군으로서 포함된다.
도 24는 무세포 dsRNA 생산에서의 에너지 생성을 위한 열안정성 부류 III PPK2의 적용을 입증하는 아가로스 겔의 화상이다. 좌측 레인은 NTP로부터의 dsRNA 합성을 입증하는 양성 대조군을 함유한다. 중간 레인은 에너지 공급원으로서 외인성 ATP를 사용한 뉴클레오티드 키나제-발현 용해물에서의 NMP로부터의 dsRNA 합성을 입증하는 양성 대조군을 함유한다. 우측 레인은 뉴클레오티드 키나제 및 씨. 아에로필라 Ppk-발현 용해물을 사용한 NMP 및 HMP로부터의 dsRNA 합성을 입증하는 반응을 함유한다. 씨. 아에로필라 PPK2로, dsRNA 합성은 AMP 키나제 및 외인성 ADP의 부재 하에서 진행된다.

일부 측면에서, 핵산 (예를 들어, RNA 또는 DNA)의 무세포 생산 (생합성)을 위한 방법, 조성물, 세포, 구축물, 및 시스템이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 유형의 유기체 (예를 들어, 박테리아 세포의 집단)를 적어도 1종의 뉴클레아제, 적어도 1종의 열안정성 키나제 및 적어도 1종의 열안정성 폴리머라제 (예를 들어, RNA 또는 DNA 폴리머라제)를 발현하도록 조작한다. 조작된 세포를 효소 발현을 발생시키는 조건 하에서 성장시킨다 (배양한다). 일부 실시양태에서, 조작된 세포를 바람직한 세포 밀도로 성장시킬 수 있고, 그 후 특정 효소의 발현을 유도할 (활성화시킬) 수 있다. 따라서, 특정 효소의 전사는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 그 후, 세포 (예를 들어, 조작된 및/또는 비-조작된 세포)를 용해시켜 (예를 들어, 기계적으로, 화학적으로, 또는 효소적으로 파괴하여), RNA (예를 들어, ssRNA 또는 dsRNA)의 무세포 생산에 요구되는 효소적 활성을 포함하는 세포 용해물을 제조한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 RNA (예를 들어, mRNA, tRNA, 및/또는 rRNA)를 함유하는 세포를 세포 용해 단계 전에 경로 효소를 함유하는 조작된 세포와 혼합한다. 다른 실시양태에서, 중합체성 RNA를 함유하는 세포로부터 얻어진 세포 용해물(들)을 경로 효소를 함유하는 조작된 세포로부터 얻어진 세포 용해물(들)과 합한다 (혼합한다). 추가의 다른 실시양태에서, 1종 이상의 정제된 경로 효소를 조작된 세포로부터 얻어진 세포 용해물(들)과 합한다 (혼합한다). "경로 효소"는 관심의 RNA (예를 들어, 중합체성 RNA로부터 시작함)를 생합성하는 데 요구되는 효소이다.

RNA를 합성하기 위해, 세포 용해물 (또는 세포 용해물 혼합물)을, 숙주-유래된 (내인성) RNA의 바람직한 수율의 5'-뉴클레오시드 모노포스페이트 (NMP, 또는 뉴클레오시드 모노포스페이트)로의 뉴클레아제-매개된 (예를 들어, RN아제-매개된) 해중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션한다. 그 후, 일부 실시양태에서, 세포 용해물 (또는 세포 용해물 혼합물)을 가열하여, 포스파타제 및 뉴클레아제 (예를 들어, RN아제), 뿐만 아니라 숙주-유래된 RNA의 해중합을 용이하게 하기 위해 세포 용해물에 이전에 첨가된 임의의 외인성 뉴클레아제(들)를 비롯한 대다수의 숙주-유래된 효소를 불활성화시킨다. 열 불활성화 단계 후, 세포 용해물을 열안정성 키나제 (예를 들어, 열안정성 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제 및 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제)에 의해, 예를 들어, 열안정성 폴리포스페이트 키나제를 사용하여, 및 에너지 공급원으로서 폴리포스페이트의 첨가에 의해 NMP의 NTP (뉴클레오시드 트리포스페이트)로의 인산화를 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션한다. 이어서, 생성된 NTP를 용해물에 존재하는 (예를 들어, 조작된 세포에 의해 발현되고, 세포 용해물의 세포 성분으로서 포함되는, 또는 세포 용해물에 나중에 첨가되는) 조작된 주형 (예를 들어, DNA 주형)을 사용하여 RNA 폴리머라제 (예를 들어, 열안정성 RNA 폴리머라제)에 의해 RNA로 중합시킨다.

무세포 생산

"무세포 생산"은 살아있는 세포를 사용하지 않고 생체분자 또는 화학적 화합물의 합성을 위한 생물학적 프로세스의 사용이다. 세포를 용해시키고, 둘 다 효소를 함유하는 비정제된 (조성) 부분 또는 부분적으로-정제된 부분을 바람직한 생성물의 생산에 사용한다. 일부 실시양태에서, 정제된 효소를 세포 용해물에 첨가할 수 있다. 예로서, 세포를 배양하고, 수확하고, 고압 균질화 또는 다른 세포 용해 방법 (예를 들어, 화학적 세포 용해)에 의해 용해시킨다. 무세포 반응은 배치 또는 공급-배치 방식으로 수행될 수 있다. 일부 예에서, 효소적 경로는 반응기의 작업 부피를 충전하고, 세포내 환경보다 더 희석액일 수 있다. 그러나, 막 회합된 촉매를 비롯한 실질적으로 모든 세포성 촉매가 제공된다. 내막은 세포 용해 동안 단편화되고, 이들 막의 단편은 막 소포를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Swartz, AIChE Journal, 2012, 58(1), 5-13]을 참조한다.

본 개시내용의 무세포 방법, 조성물, 및 시스템은 본원에서 보다 상세하게 논의되는 세포 용해물 (예를 들어, 조성 또는 부분적으로 정제된 세포 용해물)을 이용한다. 예를 들어, 기계적 수단 (예를 들어, 전단 또는 파쇄)에 의해 제조된 세포 용해물은 화학적으로-투과화된 세포와는 별개이다. 상기 논의된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 세포 용해 (예를 들어, 기계적 세포 용해) 동안, 내부 세포막은 반전된 막 소포가 세포 용해물에서 형성되도록 단편화된다. 이러한 반전된 막 소포는 화학적 세포 투과화 방법을 통해 생성되지 않는다. 용해된 (예를 들어, 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 또는 95％) 세포는 더이상 무손상이 아니다. 따라서, 구멍 (작은 홀)을 함유하는 무손상 세포인 투과화된 세포는 용해된 세포로 간주되지 않는다.

본원에서 제공된 방법은 일반적으로 무세포이고, 세포 용해물을 사용하고, 일부 실시양태에서, 이는 투과화된 세포를 사용하기 위한 방법의 일부 단계에 대해 적어도 유리할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 RNA 생산 방법의 적어도 하나의 단계에서 투과화된 세포의 사용을 배제하지 않는다.

본원에 기재된 실시양태 중 많은 것은 특정 효소를 포함하는 "배양된 세포를 용해시키는 것"을 지칭하지만, 상기 어구는 단일 배양물 (예를 들어, RNA를 합성하는 데 필요한 모든 효소를 함유함)로부터 얻어진 세포의 클론 집단을 용해시키는 것, 뿐만 아니라 각각 상이한 세포 배양물 (예를 들어, 각각 RNA 및/또는 중합체성 RNA 기질을 합성하는 데 필요한 1종 이상의 효소를 함유함)로부터 얻어진 세포의 1종 초과의 클론 집단을 용해시키는 것을 포괄하는 것으로 의도됨이 이해되어야 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 1종의 열안정성 키나제를 발현하는 세포 (예를 들어, 조작된 세포)의 집단은 함께 배양되고, 1종의 세포 용해물을 제조하는 데 사용될 수 있고, 상이한 열안정성 키나제를 발현하는 세포 (예를 들어, 조작된 세포)의 또다른 집단은 함께 배양되고, 또다른 세포 용해물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 그 후, 각각 상이한 열안정성 키나제를 포함하는 이들 2종의 세포 용해물은 본 개시내용의 RNA 생합성 방법에 사용하기 위해 합해질 수 있다.

리보핵산의 뉴클레오시드 모노포스페이트로의 해중합

본 개시내용은 일련의 효소적 반응을 포함하는 무세포 프로세스를 통한 세포 용해물을 사용한 바이오매스로부터의 RNA (예를 들어, 내인성 세포 RNA)로부터 바람직한 합성 RNA로의 전환에 기초한다. 먼저, 숙주 세포로부터 유래된, 세포 용해물에 존재하는 RNA (예를 들어, 내인성 RNA)를 뉴클레아제에 의해 그의 구성요소 단량체로 전환시킨다. 바이오매스로부터의 RNA (예를 들어, 내인성 RNA)는 전형적으로 리보솜 RNA (rRNA), 메신저 RNA (mRNA), 운반 RNA (tRNA), 다른 RNA, 또는 이들의 조합을 포함한다. RNA의 해중합 또는 분해는 간단히 "단량체"로도 지칭되는 5'-뉴클레오시드 모노포스페이트 (5'-NMP)의 풀을 발생시킨다. 뉴클레오시드 디포스페이트로 전환되고, 뉴클레오시드 트리포스페이트로 전환되는 이들 단량체는 관심의 RNA의 하류 중합/합성을 위한 출발 물질로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 관심의 RNA는 ssRNA (예를 들어, mRNA)이다. 일부 실시양태에서, 관심의 RNA는 dsRNA이다.

관심의 RNA를 합성하는 데 요구되는 RNA (예를 들어, 내인성 RNA)의 양은 예를 들어, 관심의 RNA의 바람직한 길이 및 수율 뿐만 아니라 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 세포)의 RNA (예를 들어, 내인성 RNA)의 뉴클레오티드 조성에 비한 RNA의 뉴클레오티드 조성에 따라 다양할 수 있다. 전형적으로, 박테리아 세포에 대해, 예를 들어, RNA (예를 들어, 내인성 RNA) 함량은 총 세포 질량의 5 내지 50％의 범위이다. 출발 물질의 질량은 예를 들어, 하기 방정식을 사용하여 계산될 수 있다: (RNA의 킬로그램 (kg)/건조 세포 중량의 킬로그램) x 100％.

내인성 RNA는 화학적 또는 효소적 수단에 의해 그의 구성요소 단량체로 해중합되거나 분해될 수 있다. 그러나, RNA의 화학적 가수분해는 전형적으로 2'- 및 3'-NMP를 생성하는데, 이는 RNA로 중합될 수 없다. 따라서, 본원에서 제공된 바와 같은 방법, 조성물, 및 시스템은 일차적으로 내인성 RNA의 해중합을 위한 효소를 사용한다. "RNA를 해중합시키는 효소"는 RNA에서 2개의 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 촉매한다. 따라서, "RNA를 해중합시키는 효소"는 RNA (중합체성 RNA)를 그의 단량체성 형태-뉴클레오시드 모노포스페이트 (NMP)로 전환시킨다. 효소에 따라, RNA의 효소적 해중합은 3'-NMP, 5'-NMP 또는 3'-NMP 및 5'-NMP의 조합을 생성할 수 있다. 3'-NTP (3'-NDP로부터 전환되며, 이는 3'-NMP로부터 전환됨)는 중합하는 것이 가능하지 않기 때문에, 5'-NMP (이는 그 후 5'-NDP로, 그 후 5'-NTP로 전환됨)를 생성하는 효소 (예를 들어, RN아제 R)이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 3'-NMP를 생성하는 효소는 조작된 세포의 게놈 DNA로부터 제거되어 RNA 생산의 효율을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합에 사용되는 효소는 RN아제 R이다. 일부 실시양태에서, 사용되는 RN아제 R의 농도는 0.1 내지 1.0 mg/mL (예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9. 또는 1.0 mg/mL)이다. 일부 실시양태에서, 사용되는 RN아제 R의 농도는 0.4 내지 0.6 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 사용되는 RN아제 R의 농도는 0.5 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 사용되는 RN아제 R의 농도는 1.0 mg/mL 초과이다.

RNA를 해중합시키는 효소의 예로는 제한 없이, 리보뉴클레아제 (RN아제, 예를 들어, RN아제 R)를 비롯한 뉴클레아제 및 포스포디에스테라제를 들 수 있다. 뉴클레아제는 보다 작은 성분 (예를 들어, 뉴클레오시드 모노포스페이트로도 지칭되는 단량체, 또는 올리고뉴클레오티드)으로의 핵산의 분해를 촉매한다. 포스포디에스테라제는 포스포디에스테르 결합의 분해를 촉매한다. RNA를 해중합시키는 이들 효소는 전장 유전자에 의해 또는 유전자 융합물 (예를 들어, 2종의 상이한 효소적 활성을 코딩하는 적어도 2종의 상이한 유전자 (또는 유전자의 단편)를 포함하는 DNA)에 의해 코딩될 수 있다.

RN아제는 세포에서 RNA 성숙 및 턴 오버를 조절하는 기능을 한다. 각각의 RN아제는 특이적 기질 선호도-dsRNA 또는 ssRNA를 갖는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상이한 RN아제의 조합, 또는 상이한 뉴클레아제의 조합은 일반적으로 바이오매스-유래된 중합체성 RNA (예를 들어, 내인성 RNA)를 해중합시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 1 내지 6, 1 내지 7, 1 내지 8, 1 내지 9, 또는 1 내지 10종의 상이한 뉴클레아제는 RNA를 해중합시키는 데 조합으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종, 적어도 6종, 적어도 7종, 적어도 8종, 적어도 9종, 또는 적어도 10종의 상이한 뉴클레아제는 RNA를 해중합시키는 데 조합으로 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 바와 같이 사용하기 위한 뉴클레아제의 비-제한적 예는 표 1에 포함된다. 일부 실시양태에서, 사용되는 뉴클레아제는 RN아제 R이다.

<표 1>

리보핵산을 해중합시키는 효소

RNA를 해중합시키는 효소 (예를 들어, RN아제)는 숙주 세포에 대해 내인성 (숙주-유래됨)일 수 있거나, 이들은 숙주 세포 내로 외인적으로 도입된 조작된 핵산 (예를 들어, 에피솜 벡터 상에 있거나, 숙주 세포의 게놈 내로 통합됨)에 의해 코딩될 수 있다.

일부 실시양태에서, RNA를 해중합시키는 효소를 코딩하는 조작된 핵산은 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된다. 따라서, 일부 실시양태에서, RNA를 해중합시키는 효소를 코딩하는 조작된 핵산의 발현은 시간적으로 또는 공간적으로 조절된다. 예를 들어, 핵산은 효소의 활성이 세포 성장 또는 다른 대사적 프로세스를 방해하지 않도록, 숙주 세포의 주변세포질로 재위치화되거나, 그에서 격리된 효소 (예를 들어, RN아제)를 코딩하도록 조작될 수 있다. 세포 용해 시, 재위치화된 효소는 주변세포질로부터 방출되고, 내인성 RNA와 접촉되고, RNA를 단량체성 형태로 해중합시킨다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 2011년 11월 10일에 공개된 국제 공개 제WO 2011/140516호를 참조한다.

"RNA의 해중합을 발생시키는 조건"은 관련 기술분야에 공지되어 있거나, 예를 들어, pH, 온도, 시간의 길이, 및 세포 용해물의 염 농도 뿐만 아니라 임의의 외인성 조인자를 비롯한 뉴클레아제 (예를 들어, RN아제) 활성을 위한 최적 조건을 고려하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 이전에 기재된 것들을 비롯한 예 (예를 들어, 문헌 [Wong, C.H. et al. J. Am. Chem. Soc., 105: 115-117, 1983], EP1587947B1, [Cheng ZF, Deutscher MP. J Biol Chem. 277:21624-21629, 2002] 참조).

일부 실시양태에서, 금속 이온 (예를 들어, Mg²⁺)은 해중합 반응으로부터 고갈된다. 일부 실시양태에서, 금속 이온 (예를 들어, Mg²⁺)의 농도는 8 mM 이하 (예를 들어, 8 mM 미만, 7 mM 미만, 6 mM 미만, 5 mM 미만, 4 mM 미만, 3 mM 미만, 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.5 mM 미만)이다. 일부 실시양태에서, 금속 이온 (예를 들어, Mg²⁺)의 농도는 0.1 mM 내지 8 mM, 0.1 mM 내지 7 mM, 또는 0.1 mM 내지 5 mM이다.

RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물의 pH는 3.0 내지 8.0의 값을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 pH 값은 3.0 내지 8.0, 4.0 내지 8.0, 5.0 내지 8.0, 6.0 내지 8.0, 7.0 내지 8.0, 3.0 내지 7.0, 4.0 내지 7.0, 5.0 내지 7.0, 6.0 내지 7.0, 3.0 내지 6.0, 4.0 내지 6.0, 5.0 내지 6.0, 3.0 내지 5.0, 3.0 내지 4.0, 또는 4.0 내지 5.0이다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 pH 값은 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 또는 8.0이다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 pH 값은 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5이다. 세포 용해물의 pH는 필요에 따라 조정될 수 있다.

RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물의 온도는 15℃ 내지 70℃일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물의 온도는 15 내지 60℃, 15 내지 50℃, 15 내지 40℃, 15 내지 30℃, 25 내지 70℃, 25 내지 60℃, 25 내지 50℃, 25 내지 40℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 또는 30 내지 50℃이다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물의 온도는 37℃이다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물의 온도는 15℃, 25℃, 32℃, 37℃, 40℃, 42℃, 45℃, 50℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 또는 70℃이다.

RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물은 5분 (min) 내지 72시간 (hrs) 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물은 5 내지 10분, 5 내지 15분, 5 내지 20분, 5 내지 30분, 또는 5분 내지 48시간 동안 인큐베이션된다. 예를 들어, RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물은 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 또는 48시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물은 37℃의 온도에서 24시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물은 37℃의 온도에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물은 7.0의 pH를 갖고, 37℃의 온도에서 15분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물은 RNA의 5'-NMP로의 65％ 초과의 전환을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA는 50 mM/시, 100 mM/시 또는 200 mM/시의 (또는 적어도) 속도로 5'-NMP로 전환된다.

일부 실시양태에서, 염은 예를 들어, 효소 응집을 방지하기 위해 세포 용해물에 첨가된다. 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 또는 이들의 조합은 세포 용해물에 첨가될 수 있다. RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물 중의 염의 농도는 5 mM 내지 1 M일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물 중의 염의 농도는 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, 또는 1 M이다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물은 40 내지 60 mM 인산칼륨, 1 내지 5 mM MnCl₂, 및/또는 10 내지 50 mM MgCl₂ (예를 들어, 20 mM MgCl₂)를 포함하는 혼합물을 포함한다.

일부 실시양태에서, 완충제는 예를 들어, 특정 pH 값 및/또는 염 농도를 달성하기 위해 세포 용해물에 첨가된다. 완충제의 예로는 제한 없이, 포스페이트 완충제, 트리스 (Tris) 완충제, MOPS 완충제, HEPES 완충제, 시트레이트 완충제, 아세테이트 완충제, 말레이트 완충제, MES 완충제, 히스티딘 완충제, PIPES 완충제, 비스-트리스 완충제, 및 에탄올아민 완충제를 들 수 있다.

RNA의 해중합은 5'-AMP, 5'-UMP, 5'-CMP, 및 5'-GMP를 비롯한 5'-NMP의 생성을 발생시킨다. NMP는 세포 용해물에 상대적으로 등몰량으로 존재할 수 있으며, RNA의 해중합은 NMP의 임의의 미리 결정된 비를 발생시키지 않는다.

일부 실시양태에서, 용해 시 세포 중의 내인성 RNA의 50 내지 98％는 5'-NMP로 전환된다 (이로 해중합된다). 예를 들어, 50 내지 95％, 50 내지 90％, 50 내지 85％, 50 내지 80％, 75 내지 98％, 75 내지 95％, 75 내지 90％, 75 내지 85％ 또는 75 내지 80％ RNA는 5'-NMP로 전환된다 (이로 해중합된다). 일부 실시양태에서, 용해 시 세포 중의 내인성 RNA의 65 내지 70％는 5'-NMP로 전환된다 (이로 해중합된다). 보다 낮은 수율은 또한 허용가능하다.

무익 회로의 소거

내인성 및/또는 외인성 뉴클레아제에 의한 바이오매스로부터의 RNA (예를 들어, 내인성 RNA)의 그의 단량체성 구성요소로의 전환 후, 전형적으로 RNA 생합성에 유해한 효과를 가질 수 있는 뉴클레아제 및 포스파타제를 비롯한 몇몇 효소가 세포 용해물에 잔류한다. 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)는 다수의 포스파타제를 가지며, 이들 중 많은 것은 NTP, NDP, 및 NMP를 탈인산화시킨다. RNA 해중합 후의 NMP의 탈인산화는 비-인산화된 뉴클레오시드의 축적 및 사용가능한 NMP 기질의 소실을 발생시키며, 따라서 합성 RNA 수율을 감소시킨다. RNA 해중합 후의 NMP, NDP, 또는 NTP의 탈인산화는 NMP가 NDP 및 NTP로 인산화되고, 이것이 이번에는 그들의 NMP 또는 뉴클레오시드 출발점으로 다시 탈인산화되는 무익 에너지 회로 (낮은 수율의 합성 RNA를 생산하는 에너지 회로)를 발생시킨다. 무익 회로는 단위 에너지 투입 (예를 들어, 폴리포스페이트, ATP, 또는 고 에너지 포스페이트의 다른 공급원) 당 RNA 생성물의 수율을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 효소적 활성은 숙주 게놈으로부터의 제거에 의해 소거된다. 일부 실시양태에서, 효소적 활성은 열 불활성화에 의해 소거된다. 일부 실시양태에서, 효소적 활성은 프로테아제 표적화에 의해 소거된다. 일부 실시양태에서, 효소적 활성은 화학적 억제제의 사용을 통해 소거된다. 상기 접근법 중 임의의 것의 조합은 또한 사용될 수 있다.

본원에서 제공된 바와 같은 RNA의 생합성에 유해한 효소는, 효소가 숙주 세포 (예를 들어, 박테리아 세포) 생존 및/또는 성장에 필수적이지 않다면, 숙주 세포를 조작하는 프로세스 동안 숙주 세포 게놈으로부터 결실될 수 있다. 효소 또는 효소 활성의 결실은 예를 들어, 숙주 세포 게놈에서 필수적 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키거나 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 효소는, 효소가 숙주 세포의 생존에 불가결한 경우, "숙주 세포 생존에 필수적"이다. 즉, 숙주 세포가 특정 효소의 발현 및/또는 활성 없이 생존할 수 없는 경우, 그 효소는 숙주 세포 생존에 필수적인 것으로 간주된다. 유사하게, 효소는, 효소가 숙주 세포의 성장에 불가결한 경우, "숙주 세포 성장에 필수적"이다. 즉, 숙주 세포가 특정 효소의 발현 및/또는 활성 없이 분열하고/거나 성장할 수 없는 경우, 그 효소는 숙주 세포 성장에 필수적인 것으로 간주된다.

RNA의 생합성에 유해한 효소가 숙주 세포 생존 및/또는 성장에 필수적인 경우, 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키거나 변형시키는 것이 가능하지 않을 수 있다. 이러한 예에서, 효소는 열 불활성화될 수 있다. "열 불활성화"는 내인성 뉴클레아제 및 포스파타제를 불활성화시키는 (또는 적어도 부분적으로 불활성화시키는) 데 충분한 온도로 세포 용해물을 가열하는 프로세스를 지칭한다. 일반적으로, 열 불활성화의 프로세스는 유해한 효소의 변성 (의 언폴딩)을 포함한다. 내인성 세포 단백질이 변성하는 온도는 유기체 사이에 다양하다. 이. 콜라이에서, 예를 들어, 내인성 세포 효소는 일반적으로 41℃ 초과의 온도에서 변성한다. 변성 온도는 다른 유기체에 대해서는 41℃ 초과 또는 미만일 수 있다. 본원에서 제공된 바와 같은 세포 용해물의 효소는 40℃ 내지 95℃, 또는 그 이상의 온도에서 열 불활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 효소는 40 내지 90℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 40 내지 50℃, 50 내지 80℃, 50 내지 70℃, 50 내지 60℃, 60 내지 80℃, 60 내지 70℃, 또는 70 내지 80℃의 온도에서 열 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물의 효소는 40℃, 42℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 또는 95℃의 온도에서 열 불활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 효소는 50 내지 80℃의 온도에서 열 불활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 효소는 70℃의 온도에서 열 불활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 효소는 60℃의 온도에서 열 불활성화될 수 있다. 또한, 유해한 효소의 화학적 억제제를 도입하는 것이 가능할 수 있다. 이러한 억제제로는 오르토바나듐산나트륨 (단백질 포스포티로실 포스파타제의 억제제), 플루오르화나트륨 (포스포세릴 및 포스포트레오닐 포스파타제의 억제제), 피로인산나트륨 (포스파타제 억제제), 인산나트륨, 및/또는 인산칼륨을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

세포 용해물을 승온에서 인큐베이션하여 내인성 효소의 열 불활성화를 달성하는 시간의 기간은 예를 들어, 세포 용해물의 부피, 및 세포 용해물이 제조된 유기체에 따라 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물은 35℃ 내지 80℃의 온도에서 2분 (min) 내지 48시간 (hr) 동안 인큐베이션된다. 예를 들어, 세포 용해물은 35℃ 내지 80℃의 온도에서 2분, 4분, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분, 또는 1시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물은 35℃ 내지 80℃의 온도에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 36, 42, 또는 48시간 동안 인큐베이션된다.

일부 실시양태에서, 효소는 60 내지 80℃의 온도에서 10 내지 20분 동안 열 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 효소는 70℃의 온도에서 15분 동안 열 불활성화된다.

일부 실시양태에서, 내인성 RNA를 해중합시키는 효소는 효소를 열에 보다 민감성이 되게 하는 1종 이상의 변형 (예를 들어, 돌연변이)을 포함한다. 이들 효소는 "열-민감성 효소"로 지칭된다. 열-민감성 효소는 그들의 야생형 대응물의 그것보다 더 낮은 온도에서 변성하며 불활성화되고/거나, 열-민감성 효소의 활성을 감소시키는 데 요구되는 시간의 기간이 그들의 야생형 대응물의 그것보다 더 짧다.

열 불활성화된 효소는, 일부 예에서, 활성을 어느 정도 보유할 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 열-불활성화된 효소의 활성 수준은 열 불활성화되지 않은 동일한 효소의 활성 수준의 50％ 미만일 수 있다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 효소의 활성 수준은 열 불활성화되지 않은 동일한 효소의 활성 수준의 40％ 미만, 30％ 미만, 20％ 미만, 10％ 미만, 5％ 미만, 1％ 미만, 또는 0.1％ 미만이다.

따라서, 효소의 활성은 완전히 소거되거나 감소될 수 있다. 효소는, 효소의 변성된 (열 불활성화된) 형태가 그의 천연 형태의 효소에 의해 촉매되는 반응을 더이상 촉매하지 않는 경우, 완전히 불활성화된 것으로 간주된다. 열-불활성화된 변성된 효소는, 열-불활성화된 효소의 활성이 가열되지 않은 효소 (예를 들어, 그의 천연 환경에서)의 활성에 비해 적어도 50％ 감소되는 경우, "불활성화된" 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 효소의 활성은 가열되지 않은 효소의 활성에 비해 50 내지 100％ 감소된다. 예를 들어, 열-불활성화된 효소의 활성은 가열되지 않은 효소의 활성에 비해 50 내지 90％, 50 내지 85％, 50 내지 80％, 50 내지 75％, 50 내지 70％, 50 내지 65％, 50 내지 60％, 또는 50 내지 55％ 감소된다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 효소의 활성은 가열되지 않은 효소의 활성에 비해 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％, 또는 100％ 감소된다.

열 불활성화되거나, 숙주 세포의 게놈으로부터 결실될 수 있는 효소의 예로는 제한 없이, 뉴클레아제 (예를 들어, RN아제 III, RN아제 I, RN아제 R, PNP아제, RN아제 II, 및 RN아제 T), 포스파타제 (예를 들어, 뉴클레오시드 모노포스파타제, 뉴클레오시드 디포스파타제, 뉴클레오시드 트리포스파타제), 및 RNA를 해중합시키거나 뉴클레오티드를 탈인산화시키는 다른 효소를 들 수 있다. RNA를 해중합시키는 효소는 RNA 분자를 절단하거나, 부분적으로 가수분해하거나, 완전히 가수분해할 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 표 2는 열 불활성화되거나, 일부 예에서, 조작된 숙주 세포로부터 결실될 수 있는 뉴클레아제의 비-제한적 예의 목록을 제공한다. 표 3은 열 불활성화되거나, 일부 예에서, 조작된 숙주 세포로부터 결실될 수 있는 포스파타제의 비-제한적 예의 목록을 제공한다. 이들 및 다른 뉴클레아제 및 포스파타제의 열 불활성화는 본 개시내용에 의해 포괄된다.

<표 2>

뉴클레아제의 예

<표 3>

포스파타제의 예.

이. 콜라이 RN아제 III은 dsRNA 뿐만 아니라 일부 단일-가닥 mRNA 분자를 우선적으로 절단한다. 세포 용해물 중의 RN아제 III의 존재는 고 농도의 합성 RNA (예를 들어, dsRNA)의 축적을 제한할 수 있는데, 이는 합성 RNA가 용이하게 절단되기 때문이다. RN아제 III도, RN아제 III을 코딩하는 유전자, rnc도 세포 생존력에 필수적이지 않으며, 따라서, 일부 실시양태에서, rnc는 조작된 숙주 세포에서 결실되거나 돌연변이된다. 다른 실시양태에서, RN아제 III은 내인성 RNA의 해중합 후 열 불활성화된다.

이. 콜라이 RN아제 I은 무손상 세포에서 주변세포질 공간에 국재화되고, rRNA, mRNA, 및 tRNA를 비롯한 폭넓은 범위의 RNA 분자의 해중합을 촉매한다. 생리학적 조건 하에서, 이 효소의 주변세포질 국재화는 효소가 세포 내에서 RNA 안정성에 거의 영향을 갖지 않음을 의미하지만; 그러나, 세포 용해물에서 주변세포질 및 세포질의 혼합은 RN아제 I이 세포 RNA에 접근하는 것을 허용한다. 세포 용해물 중의 RN아제I의 존재는 RNA 분해를 통해 합성 RNA의 수율을 감소시킬 수 있다. RN아제 I도, RN아제 I을 코딩하는 유전자, rna도 세포 생존력에 필수적이지 않으며, 따라서, 일부 실시양태에서, rna는 조작된 숙주 세포에서 결실되거나 돌연변이된다. 다른 실시양태에서, RN아제 I은 내인성 RNA의 해중합 후 열 불활성화된다.

이. 콜라이 RN아제 R 및 RN아제 T는 dsRNA, rRNA, tRNA, 및 mRNA, 뿐만 아니라 작은 비구조화된 RNA 분자의 해중합을 촉매한다. 상기 효소도, 각각 상기 효소를 코딩하는 유전자, rnr 및 rnt도 세포 생존력에 필수적이지 않으며, 따라서, 일부 실시양태에서, rnr 및/또는 rnt는 조작된 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 숙주 세포)에서 결실되거나 돌연변이된다. 다른 실시양태에서, RN아제 R 및/또는 RN아제 T는 내인성 RNA의 해중합 후 열 불활성화된다.

이. 콜라이 RN아제 E 및 PNP아제는 세포에서 mRNA 턴오버를 담당하는 데그라다솜의 성분이다. RN아제 E는 PNP아제 및 RN아제 II와 함께 기능하여 세포 mRNA 풀을 턴 오버시키는 것으로 생각된다. RN아제 E를 코딩하는 유전자, rne의 파괴는 이. 콜라이에서 치명적이다. 따라서, 일부 실시양태에서, RN아제 E는 내인성 RNA의 해중합 후 열 불활성화된다. PNP아제도, PNP아제를 코딩하는 유전자, pnp도 세포 생존력에 필수적이지 않으며, 따라서, 일부 실시양태에서, pnp는 조작된 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 숙주 세포)에서 결실되거나 돌연변이된다. 다른 실시양태에서, PNP아제는 내인성 RNA의 해중합 후 열 불활성화된다.

이. 콜라이 RN아제 II는 mRNA 및 tRNA 둘 다를 3'→ 5' 방향으로 해중합시킨다. RN아제 II도, RN아제 II를 코딩하는 유전자, rnb도 세포 생존력에 필수적이지 않으며, 따라서, 일부 실시양태에서, rnb는 조작된 숙주 세포에서 결실되거나 돌연변이된다. 다른 실시양태에서, RN아제 II는 내인성 RNA의 해중합 후 열 불활성화된다.

pnp도, rnb도 숙주 세포 생존에 필수적이지 않은 반면, 동시에 둘 다의 파괴는 치명적일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, PNP아제 및 RN아제 II 둘 다는 열 불활성화된다.

뉴클레오시드 모노포스페이트의 뉴클레오시드 트리포스페이트로의 인산화

내인성 RNA의 그의 단량체성 형태로의 전환 후, 및 내인성 뉴클레아제 및 포스파타제의 열 불활성화 후, 세포 용해물 중의 생성된 뉴클레오시드 모노포스페이트 (NMP)는 이들이 중합되어 바람직한 합성 RNA, 예컨대 이중-가닥 RNA 또는 단일-가닥 RNA (예를 들어, mRNA 또는 안티센스 RNA)를 형성하기 전에 인산화된다. 이 프로세스는 고도로 에너지 의존적이며, 따라서, 이 프로세스는 에너지 공급원을 요구한다. 포스페이트는 전형적으로 고-에너지 포스페이트 공급원, 예컨대, 예를 들어, 포스포에놀피루베이트, ATP, 또는 폴리포스페이트로부터 공여된다.

일부 실시양태에서, 에너지 공급원은 세포 용해물에 직접적으로 첨가되는 ATP이다. 다른 실시양태에서, 에너지 공급원은 ATP 재생 시스템을 사용하여 제공된다. 예를 들어, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 키나제는 ATP를 생성하는 데 사용될 수 있다. 다른 예는 ATP를 생성하는 아세틸-포스페이트 및 아세테이트 키나제; ATP를 생성하는 포스포-크레아틴 및 크레아틴 키나제; 및 ATP를 생성하는 포스포에놀피루베이트 및 피루베이트 키나제의 사용을 포함하였다. 다른 ATP (또는 다른 에너지) 재생 시스템이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 에너지 공급원의 적어도 1종의 성분은 세포 용해물 또는 세포 용해물 혼합물에 첨가된다. 에너지 공급원의 "성분"은 에너지 (예를 들어, ATP)를 생성하는 데 요구되는 기질(들) 및 효소(들)를 포함한다. 이들 성분의 비-제한적 예로는 폴리포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 아세틸-포스페이트, 아세테이트 키나제, 포스포-크레아틴, 크레아틴 키나제, 포스포에놀피루베이트, 및 피루베이트 키나제를 들 수 있다.

키나제는 고-에너지, 포스페이트-공여 분자, 예컨대 ATP로부터 특이적 기질/분자로의 포스페이트 기의 전달을 촉매하는 효소이다. 이 프로세스는 인산화로 지칭되며, 여기서, 기질은 포스페이트 기를 얻고, 고-에너지 ATP 분자는 포스페이트 기를 공여한다. 이 에스테르교환은 인산화된 기질 및 ADP를 생성한다. 본 개시내용의 키나제는 일부 실시양태에서, NMP를 NDP로, 및 NDP를 NTP로 전환시킨다.

일부 실시양태에서, 키나제는 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제이며, 이는 ATP로부터 NMP로의 고-에너지 포스페이트의 전달을 촉매하여, ADP 및 NDP를 발생시킨다. 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제의 비-제한적 예는 표 4 및 5에 제공된다. 하기 논의되는 바와 같이, 표 4 및 5에 열거된 효소의 열안정성 변이체는 본 개시내용에 의해 포괄된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물은 하기 4가지 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제 중 1종 이상 (또는 전부)을 포함한다: 열안정성 우리딜레이트 키나제, 열안정성 시티딜레이트 키나제, 열안정성 구아닐레이트 키나제 및 열안정성 아데닐레이트 키나제. 일부 실시양태에서, UMP 키나제는 피로코쿠스 푸리오수스 (예를 들어, 서열식별번호 (SEQ ID NO): 3 또는 서열식별번호: 3에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체)로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, CMP 키나제는 써무스 써모필루스 (예를 들어, 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 4에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체)로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, GMP 키나제는 써모토가 마리티마 (예를 들어, 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 5에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체)로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, AMP 키나제는 써무스 써모필루스 (예를 들어, 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 6에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체)로부터 얻어진다.

따라서, 일부 실시양태에서, NMP 키나제는 서열식별번호: 3 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 의해 확인되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, NMP 키나제는 서열식별번호: 3 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, NMP 키나제는 서열식별번호: 3 내지 6 중 어느 하나에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 75％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 또는 적어도 99％ 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 개시내용은 본원에 기재된 효소 뿐만 아니라 효소의 변이체 (예를 들어, "PPK2 변이체") 중 임의의 1종 이상의 용도를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 변이체 효소는 참조 효소와 특정 정도의 서열 동일성을 공유할 수 있다. 용어 "동일성"은 서열을 비교함으로써 측정된 바와 같은 2개 이상의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 관계를 지칭한다. 동일성은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (예를 들어, "알고리듬")에 의해 다루어진 갭 정렬 (있는 경우)로 2개 이상의 서열 중 보다 작은 것 사이의 동일한 매치의 퍼센트를 측정한다. 관련된 분자의 동일성은 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 그것이 아미노산 또는 핵산 서열에 적용될 때 "퍼센트 (％) 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요할 경우 갭을 도입한 후, 최대 퍼센트 동일성을 달성하는 제2 서열의 아미노산 서열 또는 핵산 서열에서의 잔기와 동일한 후보 아미노산 또는 핵산 서열에서의 잔기 (아미노산 잔기 또는 핵산 잔기)의 백분율로서 정의된다. 동일성은 퍼센트 동일성의 계산에 의존하지만, 계산에 도입된 갭 및 페널티로 인해 값에 있어서 상이할 수 있다. 특정 서열의 변이체는 본원에 기재되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 서열 정렬 프로그램 및 파라미터에 의해 측정된 바로, 특정 참조 서열의 그것과 적어도 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 그러나 100％ 미만의 서열 동일성을 가질 수 있다.

2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 측정은 수학적 알고리듬을 사용하여 달성될 수 있다. 동일성을 측정하는 기법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 성문화되어 있다. 2개의 서열 사이의 상동성을 측정하기 위한 예시적인 컴퓨터 소프트웨어로는 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J. et al. Nucleic Acids Research, 12(1): 387, 1984), BLAST 스위트 (Altschul, S. F. et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389, 1997), 및 FASTA (Altschul, S. F. et al. J. Molec. Biol. 215: 403, 1990)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 기법으로는 스미스-와터만 (Smith-Waterman) 알고리듬 (Smith, T.F. et al. J. Mol. Biol. 147: 195, 1981); 니들만-운쉬 (Needleman-Wunsch) 알고리듬 (Needleman, S.B. et al. J. Mol. Biol. 48: 443, 1970); 및 고속 최적 글로벌 서열 정렬 알고리듬 (Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm) (FOGSAA) (Chakraborty, A. et al. Sci Rep.3: 1746, 2013)을 들 수 있다.

<표 4>

뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제의 예

일부 실시양태에서, 키나제는 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제이며, 이는 포스포릴 기를 NDP에 전달하여 NTP를 발생시킨다. 포스포릴 기의 공여자는 제한 없이, ATP, 폴리포스페이트 중합체, 또는 포스포에놀피루베이트이다. NDP를 NTP로 전환시키는 키나제의 비-제한적 예로는 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제, 폴리포스페이트 키나제, 및 피루베이트 키나제를 들 수 있다. 하기 논의되는 바와 같이, 상기 효소의 열안정성 변이체는 본 개시내용에 의해 포괄된다. 일부 실시양태에서, NDP 키나제(들)는 아퀴펙스 아에오리쿠스 (예를 들어, 서열식별번호: 9, 또는 서열식별번호: 9에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체)로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, NDP 키나제는 서열식별번호: 9에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, NDP 키나제는 서열식별번호: 9에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 75％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 또는 적어도 99％ 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

NMP의 NTP로의 인산화는 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트-의존성 키나제 경로를 통해 일어나며 (도 2a 및 2b), 여기서, 고-에너지 포스페이트는 폴리포스페이트 키나제 (PPK)를 통해 폴리포스페이트로부터 ADP로 전달된다. 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 키나제는 폴리포스페이트 키나제 1 (PPK1) 족에 속하며, 이는 고-에너지 포스페이트를 폴리포스페이트로부터 ADP로 전달하여 ATP를 형성한다. 이 ATP는 이어서 NMP 키나제 (예를 들어, AMP 키나제, UMP 키나제, GMP 키나제, 및 CMP 키나제)에 의해 NMP를 그들의 동족체 리보뉴클레오티드 디포스페이트 (NDP)로 전환시키는 데 사용된다. 더욱이, ATP는 이어서 뉴클레오티드 디포스페이트 키나제에 의해 NDP를 NTP로 전환시키는 데 사용된다. 예를 들어, 예시적인 효소에 대해서는 표 5 및 6을 참조한다.

일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 키나제는 폴리포스페이트 키나제 2 (PPK2) 족에 속한다. 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 키나제는 부류 I PPK2 족에 속하며, 이는 고-에너지 포스페이트를 폴리포스페이트로부터 NDP로 전달하여 NTP를 형성한다. 상기 시스템에 의해 생성된 ATP는 NMP를 NDP로 전환시키는 고-에너지 포스페이트 공여자로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 키나제는 부류 III PPK2 족에 속하며, 이는 고-에너지 포스페이트를 폴리포스페이트로부터 NMP 및 NDP로 전달하여 NTP를 형성한다. 일부 실시양태에서, 부류 III PPK2는 단독으로 NMP로부터 NTP를 생성하는 데 사용된다. 다른 실시양태에서, 부류 III PPK2는 다른 키나제와 조합으로 사용된다. 부류 III PPK2는 ADP, AMP, 및 폴리포스페이트로부터 ATP를 생성하며, 이는 이어서 NMP 및 NDP 키나제에 의해 NMP를 NTP로 전환시키는 데 사용된다.

본원에서 제공된 바와 같이 사용하기 위한 PPK2 효소의 비-제한적 예를 표 6 (서열식별번호: 8 내지 18)에 열거한다. 따라서, 일부 실시양태에서, PPK2 효소는 열안정성이다. 예를 들어, PPK2 효소는 열안정성 부류 III PPK2 효소일 수 있으며, 이는 폴리포스페이트 중합에 비해 ATP 합성을 선호하고, ADP 및 AMP 둘 다를 ATP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, PPK2 효소는 폴리포스페이트, 예컨대 헥사메타포스페이트를 ATP로 예를 들어, 시간 당 10 내지 800 mM (예를 들어, 시간 당 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 또는 800 mM)의 범위의 속도로 전환시키는 데 사용된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 생합성 방법은 서열식별번호: 8 내지 18 중 어느 하나에 의해 확인되는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 PPK2 효소를 이용한다. 일부 실시양태에서, PPK2 효소는 서열식별번호: 8 내지 18 중 어느 하나에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, PPK2 효소는 서열식별번호: 8 내지 18 중 어느 하나에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 75％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 또는 적어도 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 개시내용은 또한 융합 효소를 포괄한다. 융합 효소는 각각 상이한 효소의 활성에 상응하는 다중 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 독립적인 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제 및 독립적인 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제를 사용하기 보다는, 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제 활성 및 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제 활성 둘 다를 갖는 융합 효소 (또는 임의의 다른 효소)를 사용할 수 있다.

<표 5>

경로 효소의 예

<표 6>

PPK2 효소의 예

뉴클레오시드 트리포스페이트의 리보핵산으로의 중합

관심의 RNA의 생합성에서 최종 단계는 예를 들어, DNA-의존성 RNA 폴리머라제를 사용한 NTP의 RNA (예를 들어, dsRNA 또는 ssRNA) 목표 생성물로의 중합이다. 프로세스의 이 단계에서, 관심의 RNA를 코딩하도록 설계된 DNA는 관심의 RNA의 합성을 위한 주형으로서 기능한다. DNA 주형은 일부 예에서, 관심의 RNA의 전사를 선택적으로 유도하는 전사 프로모터를 갖도록 조작될 수 있다. DNA 주형의 예를 도 3a에 나타낸다. DNA 주형은 3개의 RNA 도메인을 코딩한다: 센스 도메인 (도메인 1), 가요성 힌지 도메인 (도메인 2) 및 센스 도메인에 상보적인 도메인 (안티센스 도메인 3). DNA 주형의 전사 후, 안티센스 도메인은 센스 도메인에 결합하여 (혼성화하여) 이중-가닥 RNA 헤어핀 줄기 도메인 및 인접한 헤어핀 루프 도메인을 형성한다. DNA 주형의 다른 예를 도 3b 내지 3e에 나타낸다. 도 3b에서 DNA 주형은 상보적 가닥 상에 수렴 프로모터 서열을 함유한다. 각각의 주형 가닥으로부터 전사된 RNA 서열은 전사 후에 어닐링한다. 플라스미드의 일부로서 코딩되는 도 3c에서의 DNA 주형은 상보적 가닥 상에 수렴 프로모터 서열, 뿐만 아니라 초과 전사를 최소화하기 위한 1개 이상의 종결자 서열을 함유한다. 플라스미드의 일부로서 코딩되는 도 3d에서의 DNA 주형은 상보적 서열의 전사를 유도하는 독립적인 프로모터-종결자 카세트를 함유하며, 이는 전사 후에 어닐링한다. 도 3e에서의 DNA 주형은 단일 RNA 도메인을 코딩한다. DNA-의존성 RNA 폴리머라제 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 둘 다의 사용은 이중-가닥 RNA 목표 생성물을 생성한다.

RNA의 중합은 NTP, 전사 프로모터를 포함하는 DNA 주형, 및 전사 프로모터에 특이적인 폴리머라제 (RNA 폴리머라제)를 요구한다. 전형적으로, 본원에서 제공된 바와 같이 사용하기 위한 폴리머라제는 단일 서브유닛 폴리머라제이고, 그의 동족체 전사 프로모터에 대해 고도로 특이적이고, 높은 정확도를 갖고, 고도로 효율적이다. 폴리머라제의 예로는 제한 없이, T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제, 및 SP6 RNA 폴리머라제를 들 수 있다. 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제는 T7 파지 프로모터에 대해 고도로 특이적인 DNA-의존성 RNA 폴리머라제이다. 99 KD 효소는 T7 프로모터의 제어 하에서 클로닝된 DNA 서열로부터의 시험관내 RNA 합성을 촉매한다. 박테리오파지 T3 RNA 폴리머라제는 T3 파지 프로모터에 대해 고도로 특이적인 DNA-의존성 RNA 폴리머라제이다. 99 KD 효소는 T3 프로모터 하에서 클로닝된 DNA 서열로부터의 시험관내 RNA 합성을 촉매한다. 박테리오파지 SP6 RNA 폴리머라제는 SP6 파지 프로모터에 대해 고도로 특이적인 DNA-의존성 RNA 폴리머라제이다. 98.5 KD 폴리머라제는 SP6 프로모터 하에서 클로닝된 DNA 주형으로부터의 시험관내 RNA 합성을 촉매한다. T7, T3, 및 SP6 폴리머라제의 각각은 37 내지 40℃에서 최적으로 활성이다. 일부 실시양태에서, T7, T3, 및 SP6 폴리머라제의 열안정성 변이체가 사용된다. 열안정성 변이체 폴리머라제는 전형적으로 40℃ 초과 (또는 약 50 내지 60℃)의 온도에서 최적으로 활성이다.

"RNA의 생합성을 위한 조건"으로도 지칭되는 "뉴클레오시드 트리포스페이트의 생성 및 뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합을 발생시키는 조건"은 예를 들어, pH, 온도, 시간의 길이, 및 세포 용해물의 염 농도 뿐만 아니라 임의의 외인성 조인자를 비롯한 폴리머라제 활성을 위한 최적 조건을 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

RNA의 생합성 동안의 세포 용해물의 pH는 3.0 내지 8.0의 값을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 pH 값은 3.0 내지 8.0, 4.0 내지 8.0, 5.0 내지 8.0, 6.0 내지 8.0, 7.0 내지 8.0, 3.0 내지 7.0, 4.0 내지 7.0, 5.0 내지 7.0, 6.0 내지 7.0, 3.0 내지 6.0, 4.0 내지 6.0, 5.0 내지 6.0, 3.0 내지 5.0, 3.0 내지 4.0, 또는 4.0 내지 5.0이다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 pH 값은 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 또는 8.0이다. 일부 실시양태에서, RNA의 생합성 동안의 세포 용해물의 pH 값은 7.0이다.

RNA의 생합성 동안의 세포 용해물의 온도는 15℃ 내지 70℃일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA의 생합성 동안의 세포 용해물의 온도는 15 내지 60℃, 15 내지 50℃, 15 내지 40℃, 15 내지 30℃, 25 내지 70℃, 25 내지 60℃, 25 내지 50℃, 25 내지 40℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 40 내지 50℃, 50 내지 70℃, 또는 50 내지 60℃일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA의 생합성 동안의 세포 용해물의 온도는 15℃, 25℃, 32℃, 37℃, 42℃, 45℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 또는 70℃이다. 일부 실시양태에서, RNA의 생합성 동안의 세포 용해물의 온도는 50℃이다.

RNA의 생합성 동안의 세포 용해물은 15분 (min) 내지 72시간 (hrs) 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA의 생합성 동안의 세포 용해물은 30분 내지 48시간 동안 인큐베이션된다. 예를 들어, RNA의 생합성 동안의 세포 용해물은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 또는 48시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA의 생합성 동안의 세포 용해물은 3시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, RNA의 생합성 동안의 세포 용해물은 37℃의 온도에서 24시간 동안 인큐베이션된다.

일부 실시양태에서, RNA의 생합성 동안의 세포 용해물은 7.0의 pH에서 50℃의 온도에서 2 내지 4시간 동안 인큐베이션된다.

일부 폴리머라제 활성은 금속 이온의 존재를 요구할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 금속 이온은 세포 용해물에 첨가된다. 금속 이온의 비-제한적 예로는 Mg2⁺, Li⁺, Na⁺, K⁺, Ni2⁺, Ca2⁺, Cu2⁺, 및 Mn2⁺를 들 수 있다. 다른 금속 이온이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 초과의 금속 이온이 사용될 수 있다. 세포 용해물 중의 금속 이온의 농도는 0.1 mM 내지 100 mM, 또는 10 mM 내지 50 mM일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물 중의 금속 이온의 농도는 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5., 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 50.0, 60.0, 70.0, 80.0, 90.0, 또는 100.0 mM이다.

일부 실시양태에서, 염은 예를 들어, 효소 응집을 방지하기 위해 세포 용해물에 첨가된다. 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 또는 이들의 조합은 세포 용해물에 첨가될 수 있다. RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물 중의 염의 농도는 5 mM 내지 1 M일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물 중의 염의 농도는 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, 또는 1 M이다.

열안정성 효소

본 개시내용의 무세포 RNA-생합성 방법의 한 가지 이점은 내인성 RNA를 합성 이중-가닥 RNA로 전환시키는 데 필요한 모든 효소가 예를 들어, 단일 조작된 세포에서 발현될 수 있다 (그러나 그럴 필요는 없음)는 점이다. 예를 들어, 조작된 세포의 클론 집단을 바람직한 세포 밀도로 배양하고, 세포를 용해시키고, 내인성 RNA의 그의 단량체 형태로의 해중합을 발생시키는 조건 하에서 (예를 들어, 30 내지 37℃의 온도에서) 인큐베이션하고, 내인성 뉴클레아제 및 포스파타제를 불활성화시키는 데 충분한 온도 (예를 들어, 40 내지 90℃)로 처리하고, RNA (예를 들어, dsRNA 또는 ssRNA)의 중합을 발생시키는 조건 (예를 들어, 30 내지 50℃) 하에서 인큐베이션한다. 목표 생성물 합성 RNA로 진행하기 위해, NMP의 NDP로의 (예를 들어, 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제 및/또는 폴리포스페이트 키나제), NDP로부터 NTP로의 (예를 들어, 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제 및/또는 폴리포스페이트 키나제), 및 NTP로부터 RNA로의 (예를 들어, 폴리머라제) 전환에 요구되는 효소는 내인성 뉴클레아제 (및/또는 외인성 뉴클레아제) 및 포스파타제의 열 불활성화 동안 변성을 회피하도록 열안정성이어야 한다. 열안정성은 상대적으로 높은 온도에서 변성을 저항하는 효소의 특성을 지칭한다. 예를 들어, 효소가 42℃의 온도에서 변성되는 (불활성화되는) 경우, 유사한 활성 (예를 들어, 키나제 활성)을 갖는 효소는, 그것이 42℃에서 변성되지 않는 경우 "열안정성"인 것으로 간주된다.

효소 (예를 들어, 키나제 또는 폴리머라제)는, 효소가 (a) 다른 천연 효소를 변성시키는 높은 온도로의 일시적 노출 후에 활성을 보유하거나, (b) 천연 효소가 낮은 속도로 기능하는 중간 내지 높은 온도로의 일시적 노출 후에 높은 속도로 기능하는 경우, 열안정성인 것으로 간주된다.

일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 그렇지 않다면 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 변성시킬 상대적으로 높은 온도 (예를 들어, 이. 콜라이로부터 얻어진 키나제에 대해 41℃ 초과, 많은 RNA 폴리머라제에 대해 37℃ 초과)로의 일시적 노출 후 50％ 초과의 활성을 보유한다. 일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 그렇지 않다면 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 변성시킬 상대적으로 높은 온도로의 일시적 노출 후 50 내지 100％ 활성을 보유한다. 예를 들어, 열안정성 효소는 그렇지 않다면 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 변성시킬 상대적으로 높은 온도로의 일시적 노출 후 50 내지 90％, 50 내지 85％, 50 내지 80％, 50 내지 75％, 50 내지 70％, 50 내지 65％, 50 내지 60％, 또는 50 내지 55％ 활성을 보유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 그렇지 않다면 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 변성시킬 상대적으로 높은 온도로의 일시적 노출 후 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％, 또는 100％ 활성을 보유한다.

일부 실시양태에서, 중간 내지 높은 온도 (예를 들어, 42 내지 80℃)로의 일시적 노출 후에 열안정성 효소의 활성은 유사한 (비-열안정성) 천연 효소의 활성보다 더 크다 (예를 들어, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％, 또는 100％ 더 큼).

열안정성 키나제의 활성은 예를 들어, 키나제가 인산화시킬 수 있는 NMP 또는 NDP의 양에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 열안정성 키나제는 상대적으로 높은 온도 (예를 들어, 42℃)에서 37℃에서 유사한 전환을 완료하는 데 요구되는 동일한 시간에 50％ 초과의 NMP를 NDP로, 또는 50％ 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 열안정성 키나제는 상대적으로 높은 온도 (예를 들어, 42℃)에서 37℃에서 유사한 전환을 완료하는 데 요구되는 동일한 시간에 60％ 초과의 NMP를 NDP로, 또는 60％ 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 열안정성 키나제는 상대적으로 높은 온도 (예를 들어, 42℃)에서 37℃에서 유사한 전환을 완료하는 데 요구되는 동일한 시간에 70％의 NMP를 NDP로, 또는 70％ 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 열안정성 키나제는 상대적으로 높은 온도 (예를 들어, 42℃)에서 37℃에서 유사한 전환을 완료하는 데 요구되는 동일한 시간에 80％ 초과의 NMP를 NDP로, 또는 80％ 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 열안정성 키나제는 상대적으로 높은 온도 (예를 들어, 42℃)에서 37℃에서 유사한 전환을 완료하는 데 요구되는 동일한 시간에 90％ 초과의 NMP를 NDP로, 또는 90％ 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다.

열안정성 폴리머라제의 활성은 예를 들어, 정확도 및 중합 동역학 (예를 들어, 중합의 속도)에 기초하여 평가된다. 따라서, 열안정성 T7 폴리머라제의 1 유닛은 예를 들어, 37℃ 초과의 온도에서 (예를 들어, 50℃에서) 30분 내에 10 nmole의 NTP를 산 불용성 물질 내로 혼입시킬 수 있다.

열안정성 효소 (예를 들어, 키나제 또는 폴리머라제)는 42℃ 내지 80℃, 또는 그 이상의 온도에서 활성인 채로 잔류할 수 있다 (반응을 촉매할 수 있다). 일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 42 내지 80℃, 42 내지 70℃, 42 내지 60℃, 42 내지 50℃, 50 내지 80℃, 50 내지 70℃, 50 내지 60℃, 60 내지 80℃, 60 내지 70℃, 또는 70 내지 80℃의 온도에서 활성인 채로 잔류한다. 예를 들어, 열안정성 효소는 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 또는 80℃의 온도에서 활성인 채로 잔류할 수 있다. 열안정성 효소는 상대적으로 높은 온도에서 15분 내지 48시간, 또는 그 이상 동안 활성인 채로 잔류할 수 있다. 예를 들어, 열안정성 효소는 상대적으로 높은 온도에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 36, 42, 또는 48시간 동안 활성인 채로 잔류할 수 있다.

열안정성 NMP 키나제의 비-제한적 예를 표 5 및 7에 열거한다. 다른 열안정성 키나제로는 열안정성 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제, 열안정성 피루베이트 키나제, 및 열안정성 폴리포스페이트 키나제를 들 수 있다 (예를 들어, 표 6 참조). 다른 열안정성 키나제는 본 개시내용에 의해 포괄된다.

<표 7>

열안정성 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제의 예.

RNA 폴리머라제의 비-제한적 예를 표 8에 열거한다. 열안정성 RNA 폴리머라제를 비롯한 다른 RNA 폴리머라제는 본 개시내용에 의해 포괄된다.

<표 8>

RNA 폴리머라제의 예

열안정성 RNA 폴리머라제는 야생형 효소를 변형시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 변형 (예를 들어, 돌연변이)은 공지되어 있다. 예를 들어, 변이체 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 하기 점 돌연변이 중 1종 이상을 포함할 수 있다: V426L, A702V, V795I, S430P, F849I, S633I, F880Y, C510R, 및 S767G (EP2377928 및 EP1261696A1, 이들의 각각은 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 변이체 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 V426L, A702V, 및 V795I 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 S430P, F849I, S633I, 및 F880Y 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 F880Y, S430P, F849I, S633I, C510R, 및 S767G 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 Y639V, H784G, E593G, 및 V685A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 S430P, N433T, S633P, F849I, 및 F880Y 돌연변이를 포함한다. 다른 변이체 및 재조합 열안정성 폴리머라제는 본 개시내용에 의해 포괄된다.

일부 실시양태에서, 열안정성 T7 폴리머라제는 관심의 RNA를 생산하는 데 사용된다. 예를 들어, 1 내지 2％ 총 단백질의 농도를 갖는 열안정성 T7 폴리머라제 (예를 들어, 40 내지 60℃의 온도에서 인큐베이션됨)는 관심의 RNA를 2 g/L/시 초과 (또는 예를 들어, 2 g/L/시 내지 10 g/L/시)의 속도로 합성하는 데 사용될 수 있다. 또다른 예로서, 3 내지 5％ 총 단백질의 농도를 갖는 열안정성 T7 폴리머라제 (예를 들어, 40 내지 60℃의 온도에서 인큐베이션됨)는 관심의 RNA를 10 g/L/시 초과 (또는 예를 들어, 10 g/L/시 내지 20 g/L/시)의 속도로 합성하는 데 사용될 수 있다.

본 개시내용의 많은 실시양태는 열안정성 폴리머라제/효소의 용도를 기재하지만, 다른 효소/폴리머라제가 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 예를 들어, 열안정성 효소(들)의 활성의 임의의 감소 또는 소실을 보상하기 위해, 열-불활성화된 세포 용해물에 외인적으로 첨가될 수 있다.

관심의 RNA

본 개시내용의 방법은 관심의 RNA를 생합성하는 데 사용된다. RNA는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA는 이중-가닥 RNA 간섭 분자이다. 예를 들어, 관심의 RNA는 siRNA 또는 헤어핀 RNA 간섭 분자일 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 관심의 RNA는 DNA 주형에 의해 코딩되며, 그의 예를 도 3a 내지 3e에 나타낸다. 도 3a의 주형을 사용하여 생산된 RNA는 센스 도메인 (도메인 1), 가요성 힌지 도메인 (도메인 2) 및 센스 도메인에 상보적인 도메인 (안티센스 도메인 3)을 포함한다. DNA 주형의 전사 후, 안티센스 도메인은 센스 도메인에 결합하여 (혼성화하여) 이중-가닥 RNA 헤어핀 줄기 도메인 및 인접한 헤어핀 루프 (힌지) 도메인을 형성한다.

이중-가닥 헤어핀 줄기 도메인은 2개의 상보적 핵산 도메인 (예를 들어, 별개의 뉴클레오티드 서열)의 서로에의 결합에 의해 형성된다. 핵산 도메인은, 이들이 서로에게 결합하여 (왓슨-크릭 (Watson-Crick) 상호작용을 통한 염기 쌍, 혼성화하여) 이중-가닥 핵산을 형성하는 경우, "상보적"이다. 관심의 RNA를 코딩하는 DNA 주형의 상보적 도메인은 예를 들어, 바람직한 목표 생성물에 따라 다양할 수 있다. 상보적 도메인은 예를 들어, 4 내지 1000 뉴클레오티드, 또는 그 이상의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 상보적 도메인은 4 내지 10, 4 내지 20, 4 내지 30, 4 내지 50, 4 내지 60, 4 내지 70, 4 내지 80, 4 내지 90, 4 내지 100, 4 내지 200, 4 내지 300, 4 내지 400, 또는 4 내지 500, 또는 4 내지 1000 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상보적 도메인은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상보적 도메인은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.

헤어핀 루프 도메인은 또한 2개의 상보적 핵산 도메인의 결합에 의해 형성된다. 헤어핀 루프 도메인은 2개의 상보적 도메인 사이에 개재하는 서열이다. 전형적으로, 헤어핀 루프 도메인은 비-특이적이며, 이는 그것이 세포내로 또는 또다른 핵산에 결합하도록 설계되지 않음을 의미한다. 헤어핀 루프 도메인은 상보적 도메인의 결합 시 루프-유사 구조를 형성하여 이중-가닥 헤어핀 줄기 도메인을 형성한다. 일부 실시양태에서, 헤어핀 루프 도메인은 4 내지 500 뉴클레오티드, 또는 그 이상의 길이를 갖는다. 예를 들어, 헤어핀 루프 도메인은 4 내지 10, 4 내지 20, 4 내지 30, 4 내지 50, 4 내지 60, 4 내지 70, 4 내지 80, 4 내지 90, 4 내지 100, 4 내지 200, 4 내지 300, 4 내지 400, 또는 4 내지 500 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤어핀 루프 도메인은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.

본 개시내용의 "이중-가닥 RNA"는 단일-가닥 영역 (예를 들어, 루프 또는 오버행)을 함유하지 않는 전체적으로 이중-가닥 분자, 뿐만 아니라 이중-가닥 영역 및 단일-가닥 영역 (예를 들어, 루프 또는 오버행)을 함유하는 부분적으로 이중-가닥 분자를 포괄한다. 도 3a의 하부에 나타내어진 dsRNA 생성물은 부분적으로 이중-가닥 분자로 간주되는 반면, 도 3b의 하부에 나타내어진 dsRNA 생성물은 전체적으로 이중-가닥 분자로 간주된다.

관심의 "단일-가닥 RNA"의 예로는 메신저 RNA (mRNA) 및 안티센스 RNA를 들 수 있다. 따라서, mRNA 및 다른 단일-가닥 RNA 분자를 합성하는 방법이 본원에서 제공된다.

이들 방법은 (a) RNA, RNA를 해중합시키는 효소, 열안정성 키나제, 열안정성 RNA 폴리머라제를 포함하는 배양된 조작된 세포를 용해시키는 단계, (b) 단계 (a)에서 제조된 세포 용해물을 RNA의 해중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션함으로써, 뉴클레오시드 모노포스페이트를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 단계, (c) 단계 (b)에서 제조된 세포 용해물을, 열안정성 키나제 및 열안정성 RNA 폴리머라제를 불활성화시키지 않고 내인성 뉴클레아제 및 포스파타제를 불활성화시키는 온도로 가열함으로써, 열-불활성화된 뉴클레아제 및 포스파타제를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 단계, 및 (d) (c)에서 제조된 세포 용해물을 에너지 공급원 및 관심의 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유하는 조작된 DNA 주형의 존재 하에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 생성 및 뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션함으로써, 관심의 mRNA를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

대안적으로, 이러한 방법은 (a) 내인성 중합체성 RNA, RNA를 해중합시키는 효소, 열안정성 뉴클레오시드 모노포스페이트 (NMP) 키나제, 열안정성 뉴클레오시드 디포스페이트 (NDP) 키나제, 열안정성 PPK2 키나제, 및/또는 폴리포스페이트를 포함하는 조작된 세포로부터 얻어진 세포 용해물을 합하여 세포 용해물 혼합물을 제조하는 단계, (b) 단계 (a)에서 제조된 세포 용해물 혼합물을 RNA의 해중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션함으로써, 뉴클레오시드 모노포스페이트를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 단계, (c) 단계 (b)에서 제조된 세포 용해물을, 열안정성 키나제 및 열안정성 RNA 폴리머라제를 불활성화시키지 않고 포스파타제 및 RN아제 (및 RNA 안정성 또는 중합 정확도에 해로울 수 있는 임의의 다른 활성, 예컨대 천연 RNA 폴리머라제, NMP 리덕타제, 및/또는 뉴클레오시다제)를 불활성화시키는 온도로 가열함으로써, 열-불활성화된 포스파타제 및 RN아제 (및 다른 유해한 세포 활성)를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 단계, 및 (d) 단계 (c)에서 제조된 세포 용해물을 에너지 공급원 및 관심의 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유하는 조작된 DNA 주형의 존재 하에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 생성 및 뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션함으로써, mRNA를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 단일 표적 도메인을 함유하는 RNA를 코딩하는 DNA 주형은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 예컨대, 예를 들어, T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 전사되고, 생성된 RNA 전사체는 상보적 RNA 분자를 합성하여 dsRNA를 생성하기 위한, RNA-의존성 RNA 폴리머라제, 예컨대, 예를 들어, 파지 Φ6 RdRP에 대한 주형으로서 기능한다. 예를 들어, 도 3b를 참조한다. 파지 Φ6은 슈도모나스 (Pseudomonas) 속의 구성원을 감염시키는 이중 가닥 RNA 바이러스이다. 이 파지는 RNA 주형을 사용하여 RNA를 합성할 수 있는 RdRP를 코딩하여 dsRNA 분자를 생성한다. Φ6 RdRP는 프라이머 분자가 결여된 RNA를 중합시킬 수 있으며, 따라서, 폴리머라제는 단지 주형 RNA를 요구한다 (Wright, S. et al., 2012. Journal of Virology. Mar;86(5):2837-49; Van Dijk, AA., et al., 2004. J Gen Virol. May;85(Pt 5), 본원에 참조로 포함됨). 다른 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 (RdRP)는 본 개시내용에 의해 포괄된다.

일부 실시양태에서, 조작된 세포는 관심의 RNA를 코딩하는 DNA 주형을 포함한다. RNA를 코딩하는 DNA 주형은 조작된 세포의 게놈 DNA 내로 통합될 수 있거나, DNA 주형은 플라스미드 상의 조작된 세포 내로 도입될 수 있다. 다른 실시양태에서, DNA 주형은 관심의 RNA의 생합성 동안 (예를 들어, 열 불활성화 단계 후) 세포 용해물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물 중의 DNA 주형의 농도는 0.05 내지 1 μg/μl이다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물 중의 DNA 주형의 농도는 0.05 μg/μl, 0.1 μg/μl, 0.5 μg/μl, 1.0 μg/μl이다.

상기 논의된 바와 같이, 관심의 RNA 목표 생성물의 다른 예로는 메신저 RNA (mRNA) 및 짧은/작은-간섭 RNA (siRNA) (분해를 위한 특정 mRNA를 특이적으로 표적화하도록 설계된 합성 RNA 두가닥)를 들 수 있다.

일부 실시양태에서, RNA 목표 생성물 (관심의 생합성된 RNA)의 농도는 세포 용해물의 적어도 1 g/L 내지 50 g/L이다. 예를 들어, RNA 목표 생성물의 농도는 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 g/L, 또는 그 이상일 수 있다.

일부 실시양태에서, 관심의 RNA는 관심의 표적 핵산에 결합하도록 설계되며, 예를 들어, 치료제, 예방제, 또는 진단제로서 사용된다.

프로테아제 표적화

본 개시내용의 조작된 세포는 핵산, 예컨대 RNA의 생산에 부정적 영향을 가질 수 있는 세포의 건강에 불가결한 효소를 발현할 (예를 들어, 내인적으로 발현할) 수 있다. 이러한 효소는 본원에서 "표적 효소"로 지칭된다. 예를 들어, 조작된 세포에 의해 발현되는 표적 효소는 기질 또는 조인자에 대해 RNA 생합성 경로에 공급되는 전구체의 속도를 증가시키는 효소와 경쟁할 수 있다. 또다른 예로서, 조작된 세포에 의해 발현되는 표적 효소는 기질 또는 조인자에 대해 RNA 생합성 경로의 핵심적 경로 진입 효소인 효소와 경쟁할 수 있다. 추가의 또다른 예로서, 조작된 세포에 의해 발현되는 표적 효소는 기질 또는 조인자에 대해 RNA 생합성 경로의 기질 또는 조인자를 공급하는 효소와 경쟁할 수 있다.

이 부정적 영향을 무효화하거나, 감소시키기 위해, 표적 효소는, 표적 효소가 "표적화되고", RNA 생산 동안 불활성화를 위해 절단될 수 있도록, 그들의 단백질 서열에 부위-특이적 프로테아제-인식 서열을 포함하도록 변형될 수 있다 (예를 들어, 2012년 3월 1일에 공개된 미국 공개 제2012/0052547 A1호; 및 2015년 2월 12일에 공개된 국제 공개 제WO 2015/021058 A2호 참조, 이들의 각각은 본원에 참조로 포함됨).

부위-특이적 프로테아제-인식 서열을 함유하는 표적 효소의 절단은 동족체 부위-특이적 프로테아제와의 접촉으로부터 발생되며, 이는 세포 성장 단계 동안 (예를 들어, 조작된 세포가 배양될 때) 세포의 주변세포질 (표적 효소와 별개임)에 격리되고, RNA 생산 단계 동안 (예를 들어, 세포 용해물을 제조하기 위한 세포 용해 후) 표적 효소와 접촉된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포는 일부 실시양태에서, (i) RNA 생산의 속도에 부정적으로 영향을 미치고, 표적 효소의 단백질 서열에 부위-특이적 프로테아제-인식 서열을 포함하는 표적 효소를 코딩하는 조작된 핵산, 및 (ii) 표적 효소의 부위-특이적 프로테아제-인식 서열을 절단하고, 주변세포질-표적화 서열을 포함하는 부위-특이적 프로테아제를 코딩하는 조작된 핵산을 포함한다. 이 주변세포질-표적화 서열은 세포가 용해될 때까지 부위-특이적 프로테아제를 세포의 주변세포질 공간으로 격리시키는 것을 담당한다. 주변세포질-표적화 서열의 예는 하기에 제공된다.

본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 프로테아제의 예로는 제한 없이, 알라닌 카르복시펩티다제, 아르밀라리아 멜레아 (Armillaria mellea)로부터 얻어진 프로테아제, 아스타신, 박테리아 류실 아미노펩티다제, 암 응혈원, 카텝신 B, 클로스트리파인, 시토솔 알라닐 아미노펩티다제, 엘라스타제, 엔도프로테이나제 Brg-C, 엔테로키나제, 가스트릭신, 젤라티나제, Gly-X 카르복시펩티다제, 글리실 엔도펩티다제, 인간 리보바이러스 3C 프로테아제, 히포더민 C, Iga-특이적 세린 엔도펩티다제, 류실 아미노펩티다제, 류실 엔도펩티다제, lysC, 리소좀성 프로-X 카르복시펩티다제, 리실 아미노펩티다제, 메티오닐 아미노펩티다제, 믹소박터, 나르딜리신, 췌장 엔도펩티다제 E, 피코르나인 2B, 피코르나인 3C, 프로엔도펩티다제, 프롤릴 아미노펩티다제, 프로단백질 전환효소 I, 프로단백질 전환효소 II, 루셀리신, 사카로펩신, 세메노겔라제, T-플라스미노겐 활성화제, 트롬빈, 조직 칼리크레인, 담배 식각 바이러스 (TEV)로부터 얻어진 프로테아제, 토가비린, 트립토파닐 아미노펩티다제, U-플라스미노겐 활성화제, V8, 베놈빈 B, 베놈빈 BB 및 Xaa-프로 아미노펩티다제를 들 수 있다.

주변세포질 표적화

핵산 (예를 들어, RNA) 생합성 경로의 효소는 세포의 건강 (예를 들어, 생존력)에 부정적 영향을 갖는 적어도 1종의 효소를 포함할 수 있다. 이 부정적 영향을 무효화하거나 감소시키기 위해, 효소는, 효소가 그것이 자연적으로 위치하지 않는 및 효소가 세포의 건강에 부정적으로 영향을 미치지 않는 세포 또는 세포외 구획으로 재위치화되도록, 재위치화 서열을 포함하도록 변형될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 2011년 11월 10일에 공개된 공개 제US-2011-0275116-A1호 참조). 예를 들어, 생합성 경로의 효소는 세포의 주변세포질 공간으로 재위치화될 수 있다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포는 주변세포질-표적화 서열에 연결된 핵산 (예를 들어, RNA) 생합성 경로의 적어도 1종의 효소를 포함한다. "주변세포질-표적화 서열"은 그것이 연결된 단백질을 세포의 주변세포질로 표적화하는 아미노산 서열이다. 주변세포질-표적화 서열에 연결된 단백질은 단백질이 발현되는 세포의 주변세포질에 격리될 것이다.

주변세포질-표적화 서열은 예를 들어, 박테리아 분비 단백질의 N-말단으로부터 유래될 수 있다. 서열은 길이에 있어서, 약 15 내지 약 70 아미노산으로 다양하다. 주변세포질-표적화 서열의 1차 아미노산 서열은 다양하지만, 일반적으로 하기 성분을 비롯한 공통적인 구조를 갖는다: (i) N-말단 부분은 다양한 길이를 갖고, 일반적으로 순 양 전하를 운반하고; (ii) 그 다음은 약 6 내지 약 15 아미노산의 중심 소수성 코어이고, (iii) 마지막 성분은 신호 펩티다제에 대한 절단 부위를 한정하는 4 내지 6개의 아미노산을 포함한다.

본 개시내용의 주변세포질-표적화 서열은 일부 실시양태에서, 그람 음성 박테리아에서 분비되는 단백질로부터 유래될 수 있다. 분비된 단백질은 박테라아에 의해, 또는 박테리아를 감염시키는 박테리오파지에 의해 코딩될 수 있다. 분비된 단백질의 그람 음성 박테리아 공급원의 예로는 제한 없이, 에스케리키아 (Escherichia), 슈도모나스, 클레브시엘라 (Klebsiella), 살모넬라 (Salmonella), 카울로박터 (Caulobacter), 메틸로모나스 (Methylomonas), 아세토박터 (Acetobacter), 아크로모박터 (Achromobacter), 아시네토박터 (Acinetobacter), 아에로모나스 (Aeromonas), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 알칼리게네스 (Alcaligenes), 아조토박터 (Azotobacter), 부르크홀데리아 (Burkholderia), 시트로박터 (Citrobacter), 코마모나스 (Comamonas), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 리조비움 (Rhizobium), 비브리오 (Vibrio), 및 크산토모나스 (Xanthomonas) 속의 구성원을 들 수 있다.

본 개시내용에 따라 사용하기 위한 주변세포질-표적화 서열의 예로는 제한 없이,

MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA (서열식별번호: 19);

MKQSTIALALLPLLFTPVTKA (서열식별번호: 20);

MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA (서열식별번호: 21);

MNKKVLTLSAVMASMLFGAAAHA (서열식별번호: 22);

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (서열식별번호: 23);

MKKIWLALAGLVLAFSASA (서열식별번호: 24);

MMTKIKLLMLIIFYLIISASAHA (서열식별번호: 25);

MKQALRVAFGFLILWASVLHA (서열식별번호: 26);

MRVLLFLLLSLFMLPAFS (서열식별번호: 27); 및

MANNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA (서열식별번호: 28)

로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 들 수 있다.

조작된 세포

본 개시내용의 조작된 세포는 전형적으로 RNA를 생합성하는 데 요구되는 효소적 활성 중 적어도 1종, 대부분, 또는 전부를 포함한다. "조작된 세포"는 적어도 1종의 조작된 (예를 들어, 재조합 또는 합성) 핵산을 포함하거나, 그렇지 않다면 이들이 그들의 천연-발생 대응물과 구조적으로 및/또는 기능적으로 구별되도록 변형된 세포이다. 따라서, 조작된 핵산을 함유하는 세포는 "조작된 세포"로 간주된다.

본 개시내용의 조작된 세포는 일부 실시양태에서, RNA, RNA를 해중합시키는 효소, 열안정성 키나제, 및/또는 열안정성 폴리머라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 관심의 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유하는 DNA 주형을 더 포함한다.

조작된 세포는 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커를 발현한다. 선택가능한 마커는 전형적으로 세포의 형질감염 후 (또는 외래 핵산을 세포 내로 도입하는데 사용되는 다른 절차 후) 조작된 핵산을 흡수하고 발현한 조작된 세포를 선택하는 데 사용된다. 따라서, 생성물을 코딩하는 핵산은 또한 선택가능한 마커를 코딩할 수 있다. 선택가능한 마커의 예로는 제한 없이, 항생제에 대한 내성 또는 민감성을 증가시키거나 감소시키는 단백질 (예를 들어, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 테트라시클린 내성 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자) 또는 다른 화합물을 코딩하는 유전자를 들 수 있다. 선택가능한 마커의 추가의 예로는 제한 없이, 세포가 그렇지 않다면 필수적인 영양분이 결핍된 배지에서 성장하는 것을 가능하게 하는 단백질을 코딩하는 유전자를 들 수 있다 (영양요구성 마커). 다른 선택가능한 마커는 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.

조작된 세포는, 핵산 (예를 들어, 조작된 핵산)에 의해 코딩된 생성물이 세포에서 생성되는 경우, 생성물을 "발현한다". 유전자 발현은 핵산의 형태의 유전적 지시가 생성물, 예컨대 단백질 (예를 들어, 효소)을 합성하는 데 사용되는 프로세스를 지칭함이 관련 기술분야에 공지되어 있다.

조작된 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 또는 다른 유형의 세포이다.

본 개시내용의 조작된 박테리아 세포로는 제한 없이, 조작된 에스케리키아 종, 스트렙토미세스 (Streptomyces) 종, 지모모나스 (Zymomonas) 종, 아세토박터 종, 시트로박터 종, 시네코시스티스 (Synechocystis) 종, 리조비움 종, 클로스트리디움 (Clostridium) 종, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 종, 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 종, 크산토모나스 종, 락토바실루스 (Lactobacillus) 종, 락토코쿠스 (Lactococcus) 종, 바실루스 (Bacillus) 종, 알칼리게네스 종, 슈도모나스 종, 아에로모나스 종, 아조토박터 종, 코마모나스 종, 미코박테리움 (Mycobacterium) 종, 로도코쿠스 (Rhodococcus) 종, 글루코노박터 (Gluconobacter) 종, 랄스토니아 (Ralstonia) 종, 악시디티오바실루스 (Acidithiobacillus) 종, 미크로루나투스 (Microlunatus) 종, 게오박터 (Geobacter) 종, 게오바실루스 (Geobacillus) 종, 아르트로박터 (Arthrobacter) 종, 플라보박테리움 (Flavobacterium) 종, 세라티아 (Serratia) 종, 사카로폴리스포라 (Saccharopolyspora) 종, 써무스 (Thermus) 종, 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas) 종, 크로모박테리움 (Chromobacterium) 종, 시노리조비움 (Sinorhizobium) 종, 사카로폴리스포라 종, 아그로박테리움 종, 및 판토에아 종을 들 수 있다.

본 개시내용의 조작된 효모 세포로는 제한 없이, 조작된 사카로미세스 (Saccharomyces) 종, 쉬조사카로미세스 (Schizosaccharomyces), 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 야로위아 (Yarrowia) 및 피치아 (Pichia)를 들 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포는 조작된 에스케리키아 콜라이 세포, 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 세포, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 세포, 사카로미세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 세포, 또는 락토바실루스 브레비스 (Lactobacillus brevis) 세포이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포는 조작된 에스케리키아 콜라이 세포이다.

조작된 핵산

"핵산"은 함께 공유적으로 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드이며, 일부 예에서, 포스포디에스테르 결합 (예를 들어, 포스포디에스테르 "골격")을 함유할 수 있다. 핵산 (예를 들어, 핵산의 성분, 또는 부분)은 천연 발생이거나 조작될 수 있다. "천연 발생" 핵산은 인간 개입의 부재 하에서 자연에 존재하는 세포에 존재한다. "조작된 핵산"은 재조합 핵산 및 합성 핵산을 포함한다. "재조합 핵산"은 핵산 분자 (예를 들어, 동일한 종으로부터 또는 상이한 종으로부터)를 연결함으로써 구축된 분자를 지칭하며, 전형적으로, 살아있는 세포에서 복제할 수 있다. "합성 핵산"은 생물학적으로 합성되거나, 화학적으로 합성되거나, 다른 수단에 의해 합성되거나 증폭된 분자를 지칭한다. 합성 핵산은 화학적으로 변형되거나, 다른 식으로 변형되지만, 천연-발생 핵산 분자와 염기 쌍형성할 수 없는 핵산을 포함한다. 재조합 및 합성 핵산은 또한 상기 중 어느 하나의 복제로부터 발생되는 그러한 분자를 포함한다. 조작된 핵산은 천연 발생인 핵산의 부분을 함유할 수 있지만, 전체로서, 조작된 핵산은 천연적으로 발생하지 않으며, 인간 개입을 요구한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 생성물을 코딩하는 핵산은 재조합 핵산 또는 합성 핵산이다. 다른 실시양태에서, 생성물을 코딩하는 핵산은 천연 발생이다.

본원에서 제공된 바와 같은 RNA를 코딩하는 조작된 핵산은 핵산의 나머지의 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산의 제어 영역인 "프로모터"에 작동적으로 연결될 수 있다. 프로모터는 발현을 유도하거나, 그것이 조절하는 핵산의 전사를 유도한다.

프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 절편의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 얻어질 수 있는 바와 같이, 유전자 또는 서열과 천연적으로 회합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다.

일부 실시양태에서, 코딩 핵산 서열은 그의 천연 환경에서 코딩된 서열과 통상적으로 회합되지 않는 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 제어 하에 위치화될 수 있다. 이러한 프로모터는 다른 유전자의 프로모터; 임의의 다른 세포로부터 단리된 프로모터; 및 "천연 발생"이 아닌 합성 프로모터 또는 인핸서, 예컨대, 예를 들어, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 관련 기술분야에 공지된 유전자 조작의 방법을 통해 발현을 변경시킨 돌연변이를 함유하는 것들을 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것 외에도, 서열은 재조합 클로닝 및/또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 비롯한 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다.

프로모터는, 그것이 그 핵산의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 ("유도하기") 위해 그것이 조절하는 핵산에 관하여 정확한 기능적 위치 및 배향에 있는 경우, "작동적으로 연결된" 것으로 간주된다.

본 개시내용의 조작된 핵산은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 함유할 수 있다. "구성적 프로모터"는 세포에서 일정하게 활성인 프로모터를 지칭한다. "유도성 프로모터"는 인듀서 또는 유도제의 존재 하에서, 그에 의해 영향을 받거나, 그에 의해 접촉되거나, 억제를 유발하는 인자의 부재 하에서 활성화되는 경우, 전사적 활성을 개시하거나 향상시키는 프로모터를 지칭한다. 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 유도성 프로모터는 본원에 기재되거나, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 예로는 제한 없이, 화학적으로/생화학적으로-조절된 및 물리적으로-조절된 프로모터, 예컨대 알콜-조절된 프로모터, 테트라시클린-조절된 프로모터, 스테로이드-조절된 프로모터, 금속-조절된 프로모터, 발병기전-조절된 프로모터, 온도/열-유도성, 포스페이트-조절된 (예를 들어, PhoA), 및 광-조절된 프로모터를 들 수 있다.

인듀서 또는 유도제는 유도성 프로모터로부터의 전사 활성을 조절하는 데 있어서 활성이도록 하는 방식으로 유도성 프로모터와 접촉하는 내인성 또는 통상적으로 외인성 조건 (예를 들어, 광), 화합물 (예를 들어, 화학적 또는 비-화학적 화합물) 또는 단백질일 수 있다. 따라서, 핵산의 "전사를 조절하는 신호"는 유도성 프로모터에 작용하는 인듀서 신호를 지칭한다. 전사를 조절하는 신호는 사용되는 조절 시스템에 따라 전사를 활성화시키거나 불활성화시킬 수 있다. 전사의 활성화는 전사를 유도하는 프로모터에 직접적으로 작용하거나, 프로모터가 전사를 유도하는 것을 방지하는 리프레서의 불활성화에 의해 프로모터에 간접적으로 작용하는 것을 포함할 수 있다. 반대로, 전사의 탈활성화는 전사를 방지하는 프로모터에 직접적으로 작용하거나, 리프레서를 활성화시킨 후, 이것이 프로모터에 작용함으로써 프로모터에 간접적으로 작용하는 것을 포함할 수 있다.

조작된 핵산은 제한 없이, 형질전환, 형질감염 (예를 들어, 화학적 (예를 들어, 인산칼슘, 양이온성 중합체, 또는 리포솜) 또는 비-화학적 (예를 들어, 전기천공, 초음파천공, 임페일펙션, 광학 형질감염, 수력학적 형질감염)), 및 형질도입 (예를 들어, 바이러스 형질도입)을 비롯한 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.

천연 발생 세포내 핵산에 의해 코딩된 효소 또는 다른 단백질은 "내인성 효소" 또는 "내인성 단백질"로 지칭될 수 있다.

세포 배양물 및 세포 용해물

전형적으로, 조작된 세포는 배양된다. "배양"은 세포를 제어된 조건 하에서, 전형적으로 그들의 천연 환경 외부에서 성장시키는 프로세스를 지칭한다. 예를 들어, 조작된 세포, 예컨대 조작된 박테리아 세포는 액체 "배양 배지"로도 지칭되는 액체 영양분 브로쓰 중의 세포 현탁액으로서 성장될 수 있다.

통상적으로 사용되는 박테리아 에스케리키아 콜라이 성장 배지의 예로는 제한 없이, LB (용원성 브로쓰) 밀러 (Miller) 브로쓰 (1％ NaCl): 1％ 펩톤, 0.5％ 효모 추출물, 및 1％ NaCl; LB (용원성 브로쓰) 레녹스 브로쓰 (Lennox Broth) (0.5％ NaCl): 1％ 펩톤, 0.5％ 효모 추출물, 및 0.5％ NaCl; SOB 배지 (수퍼 옵티멀 브로쓰 (Super Optimal Broth)): 2％ 펩톤, 0.5％ 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄; SOC 배지 (이화성 리프레서를 갖는 수퍼 옵티멀 브로쓰): SOB + 20 mM 글루코스; 2x YT 브로쓰 (2x 효모 추출물 및 트립톤 (Tryptone)): 1.6％ 펩톤, 1％ 효모 추출물, 및 0.5％ NaCl; TB (테리픽 브로쓰 (Terrific Broth)) 배지: 1.2％ 펩톤, 2.4％ 효모 추출물, 72 mM K₂HPO₄, 17 mM KH₂PO₄ 및 0.4％ 글리세롤; 및 SB (수퍼 브로쓰 (Super Broth)) 배지: 3.2％ 펩톤, 2％ 효모 추출물, 및 0.5％ NaCl 및 또는 코르츠 (Korz) 배지 (Korz, DJ et al. 1995)를 들 수 있다.

고 밀도 박테리아 에스케리키아 콜라이 성장 배지의 예로는 DNA그로 (DNAGro)™ 배지, 프로그로 (ProGro)™ 배지, 오토 (Auto)X™ 배지, 데토 (Deto)X™ 배지, 인듀(Indu)X™ 배지, 및 섹프로(SecPro)™ 배지를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 조작된 세포는 효소 또는 핵산의 발현을 발생시키는 조건 하에서 배양된다. 이러한 배양 조건은 발현되는 특정 생성물 및 생성물의 바람직한 양에 의존할 것이다.

일부 실시양태에서, 조작된 세포는 30℃ 내지 40℃의 온도에서 배양된다. 예를 들어, 조작된 세포는 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃ 또는 40℃의 온도에서 배양될 수 있다. 전형적으로, 조작된 세포, 예컨대 조작된 이. 콜라이 세포는 37℃의 온도에서 배양된다.

일부 실시양태에서, 조작된 세포는 12시간 내지 72시간, 또는 그 이상의 시간의 기간 동안 배양된다. 예를 들어, 조작된 세포는 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 또는 72시간의 시간의 기간 동안 배양될 수 있다. 전형적으로, 조작된 세포, 예컨대 조작된 박테리아 세포는 12 내지 24시간의 시간의 기간 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 37℃의 온도에서 12 내지 24시간 동안 배양된다.

일부 실시양태에서, 조작된 세포는 (예를 들어, 액체 세포 배양 배지 중) 5 내지 200의 600 nm의 파장에서 측정된 광학 밀도 (OD600)로 배양된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 또는 200의 OD600으로 배양된다.

일부 실시양태에서, 조작된 세포는 1 x 10⁸ (OD < 1) 내지 2 x 10¹¹ (OD ~ 200) 생존성 세포/ml 세포 배양 배지의 밀도로 배양된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 1 x 10⁸, 2 x 10⁸, 3 x 10⁸, 4 x 10⁸, 5 x 10⁸, 6 x 10⁸, 7 x 10⁸, 8 x 10⁸, 9 x 10⁸, 1 x 10⁹, 2 x 10⁹, 3 x 10⁹, 4 x 10⁹, 5 x 10⁹, 6 x 10⁹, 7 x 10⁹, 8 x 10⁹, 9 x 10⁹, 1 x 10¹⁰, 2 x 10¹⁰, 3 x 10¹⁰, 4 x 10¹⁰, 5 x 10¹⁰, 6 x 10¹⁰, 7 x 10¹⁰, 8 x 10¹⁰, 9 x 10¹⁰, 1 x 10¹¹, 또는 2 x 10¹¹ 생존성 세포/ml (전환 인자: OD 1 = 8 x 10⁸ 세포/ml)의 밀도로 배양된다.

일부 실시양태에서, 조작된 세포는 생물반응기에서 배양된다. 생물반응기는 단순히 세포가 배양되는 용기, 예컨대 단일-사용 (일회용), 오토블레이빙가능하거나, 멸균가능할 수 있는 배양 플라스크, 접시, 또는 백을 지칭한다. 생물반응기는 유리로 제조될 수 있거나, 이는 중합체-기재일 수 있거나, 이는 다른 물질로 제조될 수 있다.

생물반응기의 예로는 제한 없이, 교반된 탱크 (예를 들어, 잘 혼합된) 생물반응기 및 관상 (예를 들어, 플러그 유동) 생물반응기, 공수 생물반응기, 막 교반된 탱크, 스핀 필터 교반된 탱크, 비브리오믹서, 유동층 반응기, 및 막 생물반응기를 들 수 있다. 생물반응기를 작동하는 방식은 배치 또는 연속적 프로세스일 수 있으며, 배양되는 조작된 세포에 의존할 것이다. 생물반응기는 공급물 및 생성물 스트림이 시스템으로부터 연속적으로 공급되고 철수되는 경우 연속적이다. 배치 생물반응기는 연속적 재순환 유동을 가질 수 있지만, 영양분 또는 생성물 수확물의 연속적 공급은 갖지 않는다. 간헐적-수확 및 공급된-배치 (또는 배치 공급된) 배양을 위해, 세포를 조성에 있어서 배치 배지와 유사한 배지에서 보다 낮은 생존성 세포 밀도로 접종한다. 세포를 영양분이 다소 고갈되고, 세포가 고정적인 성장 단계에 접근할 때까지, 필수적으로 외부 조작 없이 지수적으로 성장시킨다. 이 시점에서, 간헐적 수확 배치-공급된 프로세스를 위해, 세포 및 생성물의 부분을 수확할 수 있으며, 제거된 배양 배지를 신선한 배지로 보충한다. 이 프로세스는 수 회 반복될 수 있다. 재조합 단백질 및 항체의 생산을 위해, 공급된-배치 프로세스가 사용될 수 있다. 세포가 지수적으로 성장하고 있는 반면, 영양분은 고갈되고 있고, 농축된 공급 배지 (예를 들어, 10 내지 15배 농축된 기저 배지)는 추가의 영양분을 공급하기 위해 연속적으로 또는 간헐적으로 첨가되며, 이는 세포 농도 및 생산 단계의 길이를 추가로 증가시킨다. 신선한 배지는 배양 배지 (브로쓰)의 제거 없이 세포 농도에 비례적으로 첨가될 수 있다. 배지의 첨가를 보충하기 위해, 공급된 배치 배양은 생물반응기의 전체 용량보다 훨씬 더 낮은 부피 (예를 들어, 최대 부피의 대략 40％ 내지 50％)에서 시작된다.

본 개시내용의 일부 방법은 RNA (예를 들어, ssRNA 또는 dsRNA)의 대규모 생산에 관한 것이다. 대규모 생산 방법을 위해, 조작된 세포는 액체 배양 배지에서 5 리터 (L) 내지 250,000 L, 또는 그 이상의 부피로 성장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 액체 배양 배지에서 10 L, 100 L, 1000 L, 10000 L, 또는 100000 L 초과의 (또는 그와 동등한) 부피로 성장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 액체 배양 배지에서 5 L, 10 L, 15 L, 20 L, 25 L, 30 L, 35 L, 40 L, 45 L, 50 L, 100 L, 500 L, 1000 L, 5000 L, 10000 L, 100000 L, 150000 L, 200000 L, 250000 L, 또는 그 이상의 부피로 성장된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 액체 배양 배지에서 5 L 내지 10 L, 5 L 내지 15 L, 5 L 내지 20 L, 5 L 내지 25 L, 5 L 내지 30 L, 5 L 내지 35 L, 5 L 내지 40 L, 5 L 내지 45 L, 10 L 내지 15 L, 10 L 내지 20 L, 10 L 내지 25 L, 20 L 내지 30 L, 10 L 내지 35 L, 10 L 내지 40 L, 10 L 내지 45 L, 10 L 내지 50 L, 15 L 내지 20 L, 15 L 내지 25 L, 15 L 내지 30 L, 15 L 내지 35 L, 15 L 내지 40 L, 15 L 내지 45 L, 또는 15 내지 50 L의 부피로 성장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 액체 배양 배지에서 100 L 내지 300000 L, 100 L 내지 200000 L, 내지 100 L 내지 100000 L의 부피로 성장될 수 있다.

전형적으로, 조작된 세포의 배양 후에는 세포를 용해시키는 것이 이어진다. "용해"는 세포가 예를 들어, 바이러스적, 효소적, 기계적, 또는 삼투적 메커니즘에 의해 부수어지는 프로세스를 지칭한다. "세포 용해물"은 예를 들어, 세포소기관, 막 지질, 단백질, 핵산 및 반전된 막 소포를 비롯한 용해된 세포 (예를 들어, 용해된 조작된 세포)의 내용물을 함유하는 유체를 지칭한다. 본 개시내용의 세포 용해물은 본원에서 제공된 바와 같이 조작된 세포의 임의의 집단을 용해시킴으로써 제조될 수 있다.

"용해"로 지칭되는 세포 용해의 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것은 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 이러한 세포 용해 방법으로는 제한 없이, 물리적 용해, 예컨대 균질화를 들 수 있다.

세포 용해는 주의깊게 제어된 세포 환경을 교란시켜, 비조절된 내인성 프로테아제 및 포스파타제에 의한 단백질 분해 및 변형을 발생시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 프로테아제 억제제 및/또는 포스파타제 억제제는 용해 전에 세포 용해물 또는 세포에 첨가될 수 있거나, 이들 활성은 열 불활성화, 유전자 불활성화, 또는 프로테아제 표적화에 의해 제거될 수 있다.

세포 용해물은 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 영양분과 합해질 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물은 Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄Cl, NaCl, MgSO₄, CaCl₂와 합해질 수 있다. 다른 영양분의 예로는 제한 없이, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 오로트산마그네슘, 시트르산마그네슘, 일염기성 인산칼륨, 이염기성 인산칼륨, 삼염기성 인산칼륨, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 삼염기성 인산나트륨, 일염기성 인산암모늄, 이염기성 인산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 및 수산화암모늄을 들 수 있다.

세포 용해물은 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 조인자와 합해질 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물은 아데노신 디포스페이트 (ADP), 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+), 또는 효소의 활성에 요구되는 다른 비-단백질 화학적 화합물 (예를 들어, 유기 이온 및 조효소)과 합해질 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포 용해물은 RNA 해중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물은 ssRNA 또는 dsRNA의 생성을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션된다.

단일 반응에 사용되는 세포 용해물의 부피는 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 부피는 0.001 내지 250 m³이다. 예를 들어, 세포 용해물의 부피는 0.001 m³, 0.01 m³, 0.1 m³, 1 m³, 5 m³, 10 m³, 15 m³, 20 m³, 25 m³, 30 m³, 35 m³, 40 m³, 45 m³, 50 m³, 55 m³, 60 m³, 65 m³, 70 m³, 75 m³, 80 m³, 85 m³, 90 m³, 95 m³, 100 m³, 105 m³, 110 m³, 115 m³, 120 m³, 125 m³, 130 m³, 135 m³, 140 m³, 145 m³, 150 m³, 155 m³, 160 m³, 165 m³, 170 m³, 175 m³, 180 m³, 185 m³, 190 m³, 195 m³, 200 m³, 205 m³, 210 m³, 215 m³, 220 m³, 225 m³, 230 m³, 235 m³, 240 m³, 245 m³, 또는 250 m³일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 부피는 25 m³ 내지 250 m³, 50 m³ 내지 250 m³, 또는 100 m³ 내지 250 m³이다.

하류 프로세싱

본원에서 제공된 방법 및 시스템은 일부 실시양태에서, RNA (예를 들어, dsRNA, ssRNA) 생성물을 1 내지 50 g/L (예를 들어, 30, 35, 40, 45, 또는 50 g/L)의 농도로 생성한다. 하류 프로세싱은 순도를 중량 기준으로 99％ (예를 들어, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99 중량％) dsRNA만큼 증가시킨다. 하류 프로세싱의 예를 도 4에 나타내며, 이는 단백질 침전제 (예를 들어, 아세트산암모늄)의 첨가로 시작한 후, 디스크-적층 원심분리 (DSC)로 단백질, 지질, 및 일부 DNA를 생성물 스트림으로부터 제거한다. 그 후, 한외여과를 실행하여 염 및 부피를 제거한다. 생성물 스트림에의 염화리튬의 첨가는 RNA 생성물의 침전을 발생시키며, 이를 이어서 디스크 적층 원심분리를 사용하여 벌크 액체로부터 분리하여, 예를 들어, 약 80％ 순도 RNA 생성물 스트림을 수득한다. 추가의 크로마토그래피 연마는 약 99％ 순수한 생성물을 생성한다.

추가의 실시양태

본 개시내용의 추가의 실시양태는 하기 넘버링된 단락 1 내지 46에 의해 포괄된다:

1. (a) RNA, RNA를 해중합시키는 효소, 열안정성 키나제, 열안정성 RNA 폴리머라제를 포함하는 배양된 조작된 세포를 용해시킴으로써, 세포 용해물을 제조하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 제조된 세포 용해물을, RNA의 해중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션함으로써, 뉴클레오시드 모노포스페이트를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 단계;

(c) 단계 (b)에서 제조된 세포 용해물을, 열안정성 키나제 및 열안정성 RNA 폴리머라제를 불활성화시키지 않고 내인성 뉴클레아제 및 포스파타제를 불활성화시키는 온도로 가열함으로써, 열-불활성화된 뉴클레아제 및 포스파타제를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 단계; 및

(d) (c)에서 제조된 세포 용해물을 에너지 공급원 및 관심의 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유하는 조작된 DNA 주형의 존재 하에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 생성 및 뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션함으로써, 관심의 RNA를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 단계를

을 포함하는, 리보핵산 (RNA)의 무세포 생합성 방법.

2. 단락 1에 있어서, 에너지 공급원이 폴리포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 또는 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 키나제 둘 다인 방법.

3. 단락 1 또는 2에 있어서, 배양된 조작된 세포가 조작된 DNA 주형을 포함하는 것인 방법.

4. 단락 1 또는 2에 있어서, 조작된 DNA 주형이 단계 (d)의 세포 용해물에 첨가되는 것인 방법.

5. 단락 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, ATP 재생 시스템이 단계 (d)의 세포 용해물에 첨가되는 것인 방법.

6. 단락 1에 있어서, 배양된 조작된 세포가 열안정성 폴리포스페이트 키나제를 더 포함하는 것인 방법.

7. 단락 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)의 조작된 세포의 RNA가 내인성 RNA인 방법.

8. 단락 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, RNA가 리보솜 RNA, 메신저 RNA, 운반 RNA, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.

9. 단락 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 배양된 조작된 세포가 RNA를 해중합시키는 적어도 2종의 효소를 포함하는 것인 방법.

10. 단락 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, RNA를 해중합시키는 효소가 S1 뉴클레아제, 뉴클레아제 P1, RN아제 II, RN아제 III, RN아제 R, RN아제 JI, NucA, PNP아제, RN아제 T, RN아제 E, RN아제G 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

11. 단락 10에 있어서, RNA를 해중합시키는 효소가 뉴클레아제 P1인 방법.

12. 단락 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b)의 세포 용해물이 Mg²⁺-킬레이트화제를 포함하는 것인 방법.

13. 단락 12에 있어서, Mg²⁺-킬레이트화제가 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)인 방법.

14. 단락 13에 있어서, EDTA의 농도가 0.1 mM 내지 25 mM인 방법.

15. 단락 14에 있어서, EDTA의 농도가 8 mM인 방법.

16. 단락 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 키나제가 열안정성 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제를 포함하는 것인 방법.

17. 단락 16에 있어서, 열안정성 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제가 열안정성 우리딜레이트 키나제, 열안정성 시티딜레이트 키나제, 열안정성 구아닐레이트 키나제, 및 열안정성 아데닐레이트 키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

18. 단락 17에 있어서, 안정한 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제가 pyrH 유전자에 의해 코딩되는 열안정성 피로코쿠스 푸리오수스 우리딜레이트 키나제 (PfPyrH), adk 유전자에 의해 코딩되는 열안정성 써무스 써모필루스 아데닐레이트 키나제 (TthAdk), cmk 유전자에 의해 코딩되는 열안정성 써무스 써모필루스 시티딜레이트 키나제 (TthCmk), 및 gmk 유전자에 의해 코딩되는 열안정성 피로코쿠스 푸리오수스 구아닐레이트 키나제 (PfGmk)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

19. 단락 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 키나제가 열안정성 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제를 포함하는 것인 방법.

20. 단락 19에 있어서, 열안정성 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제가 열안정성 뉴클레오시드 포스페이트 키나제, 열안정성 피루베이트 키나제, 및 열안정성 폴리포스페이트 키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

21. 단락 20에 있어서, 열안정성 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제 중 적어도 1종이 ndk 유전자에 의해 코딩되는 열안정성 아퀴펙스 아에오리쿠스 효소인 방법.

22. 단락 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 세포가 열안정성 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제 및 열안정성 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제를 포함하는 것인 방법.

23. 단락 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 배양된 조작된 세포가 열안정성 우리딜레이트 키나제, 열안정성 시티딜레이트 키나제, 열안정성 구아닐레이트 키나제, 열안정성 아데닐레이트 키나제, 및 열안정성 폴리포스페이트 키나제를 포함하는 것인 방법.

24. 단락 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 RNA 폴리머라제가 열안정성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제인 방법.

25. 단락 24에 있어서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제가 열안정성 T7 RNA 폴리머라제, 열안정성 SP6 RNA 폴리머라제, 및 열안정성 T3 RNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

26. 단락 25에 있어서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제가 열안정성 T7 RNA 폴리머라제인 방법.

27. 단락 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 단계 (c)에서의 온도가 적어도 50℃인 방법.

28. 단락 27에 있어서, 단계 (c)에서의 온도가 50℃ 내지 80℃인 방법.

29. 단락 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 단계 (c)가 세포 용해물을 적어도 15분 동안 가열하는 것을 포함하는 것인 방법.

30. 단락 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 단계 (c)가 세포 용해물을 적어도 65℃의 온도로 15분 동안 가열하는 것을 포함하는 것인 방법.

31. 단락 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 단계 (d)에서의 뉴클레오시드 트리포스페이트가 15 내지 30 mM/시의 속도로 생성되는 것인 방법.

32. 단락 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 단계 (d)에서 생산된 관심의 RNA가 이중-가닥 RNA인 방법.

33. 단락 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 단계 (d)에서 생산된 관심의 RNA가 RNA 간섭 분자인 방법.

34. 단락 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 단계 (d)에서 생산된 관심의 RNA가 힌지 도메인에 의해 연결된 상보적 도메인을 함유하는 mRNA인 방법.

35. 단락 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 단계 (d)에서 생산된 관심의 RNA가 적어도 4 g/L, 적어도 6 g/L, 적어도 6 g/L, 또는 적어도 10 g/L의 농도로 제조되는 것인 방법.

36. 단락 35에 있어서, 이중-가닥 RNA를 정제하는 것을 더 포함하는 방법.

37. 단락 36에 있어서, 정제 단계가 단계 (d)의 세포 용해물을 단백질 침전제와 합하고, 침전된 단백질, 지질, 및 DNA를 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.

38. 단락 1 내지 37 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 세포 용해물.

39. RNA, RNA를 해중합시키는 효소, 열안정성 키나제 및 열안정성 RNA 폴리머라제를 포함하는 조작된 세포.

40. 단락 39에 있어서, 관심의 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유하는 조작된 DNA 주형을 더 포함하는 조작된 세포.

41. 단락 39 또는 40의 조작된 세포의 집단.

42. 단락 39의 조작된 세포를 세포 배양 배지에서 유지하는 것을 포함하는 방법.

43. 단락 42에 있어서, 배양된 조작된 세포를 용해시켜 세포 용해물을 제조하는 것을 더 포함하는 방법.

44. 단락 43에 있어서, 세포 용해물을 RNA의 해중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션하여, 뉴클레오시드 모노포스페이트를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 것을 더 포함하는 방법.

45. 단락 44에 있어서, 세포 용해물을, 열안정성 키나제 및 열안정성 RNA 폴리머라제를 불활성화시키지 않고 내인성 뉴클레아제 및 포스파타제를 불활성화시키는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 뉴클레아제 및 포스파타제를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 것을 더 포함하는 방법.

46. 단락 45에 있어서, 열-불활성화된 뉴클레아제 및 포스파타제를 포함하는 세포 용해물을 에너지 공급원 및 관심의 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유하는 조작된 DNA 주형의 존재 하에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 생성 및 뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션하여, 관심의 RNA를 포함하는 세포 용해물을 제조하는 것을 더 포함하는 방법.

실시예

실시예 1

뉴클레아제 하향선택

용해물 RNA를 소화시키기 위한 최적의 뉴클레아제(들)를 확인하기 위해, 일련의 스크리닝 실험을, 5'-NMP 또는 올리고뉴클레오티드를 생성하는 그들의 능력에 기초하여 선택된 시판되는 효소를 사용하여 수행하였다. 이들 효소의 활성을 먼저 정제된 이. 콜라이 RNA 및 제조자에 의해 권고된 반응 조건을 사용하여 측정하고, 여기서, RNA 해중합을 산-가용성 뉴클레오티드의 방출에 의해 모니터링하였다. 이들 조건 하에서, 4가지 뉴클레아제는 배경에 비해 해중합 활성을 입증하였다. 양성 대조군으로서 기능하는 엔도뉴클레아제 벤조나제 및 RN아제 A는 RNA의 산-가용성 뉴클레오티드로의 즉시 전환을 생성하였다 (도 5a). 엑소뉴클레아제 P1 및 RN아제 R로의 RNA의 처리는 RNA의 산-가용성 뉴클레오티드로의 시간-의존성 전환을 생성하였으며, RN아제 R은 2시간에 거의 100％ 해중합에 도달하였다. 나머지 뉴클레아제 (종결자 엑소뉴클레아제, RN아제 III 및 RN아제 T)는 이 검정에서 검출가능한 해중합을 생성하지 않았다. 후속의 LC-MS에 의한 분석은 RN아제 R 및 뉴클레아제 P1로 처리된 샘플에서 NMP 유리를 밝혀내었지만, 벤조나제 또는 RN아제 A는 그렇지 않았다 (도 5b). 이들 결과는 RN아제 R 및 뉴클레아제 P1이 용해물 RNA를 5'-NMP로 해중합시키는 데 적합할 수 있음을 시사한다. RN아제 R은 그의 DN아제 활성의 결여, dsRNA 및 구조화된 RNA를 분해하는 그의 능력, 및 그의 향상하는 3' → 5' 엑소뉴클레아제 활성을 비롯한 몇몇 이유 때문에 추가의 연구를 위해 선택되었다.

용해물에서의 RNA 해중합

그 후, RN아제 R을 박테리아 용해물에서 내인성 RNA를 해중합시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. 이들 실험에서, 정제된 RN아제 R (0.5 mg/mL 최종 농도)을 용해물 (50％ 최종 농도)에 첨가하고, 유리 뉴클레오티드를 UPLC에 의해 정량화하였다. 대표적인 실험을 도 6에 나타낸다. 정제된 RN아제 R을 용해물에 첨가하는 것은 용해물 RNA로부터 5'-NMP의 급속한 방출을 발생시켰으며, 최대 NMP 유리는 5 내지 10분 후였다. 급속한 해중합의 이 초기 기간 후, NMP 농도는 안정화하였으며, 그 후 서서히 감소하기 시작하였다. 내인성 RN아제 활성은 또한 비록 훨씬 더 느린 속도에서지만, 5'-NMP 유리를 발생시켰다. 중요하게는, RN아제 R 첨가는 RNA로부터의 2' 또는 3' NMP 유리의 속도를 증가시키지 않았으며, 이는 그의 공지된 작용 메커니즘과 일치한다. 다수의 독립적인 실험에 걸쳐, 용해물에의 RN아제 R의 첨가는 5 내지 10분에 200 mM/시를 초과하는 속도로 용해물 RNA의 5'-NMP로의 68％의 전환을 발생시켰다.

RN아제 R 발현의 독성을 평가하기 위해, 2가지 박테리아 균주를 구축하였다. 한 균주는 비어있는 단백질 발현 벡터로 형질전환된 기본 균주 (GL16-170)를 포함하였고, 다른 것은 RN아제 R을 코딩하는 동일한 단백질 발현 벡터로 형질전환된 GL16-170을 포함하였다. 둘 다의 균주를 배치 조건 하에서 1L 생물반응기에서 성장시키고, OD600 = 20에서 유도하고, 글루코스 소진 전에 수확하였다. 유도는 RN아제 R의 강한 발현을 생성하였으며 (도 7a), 성장 속도의 검출가능한 변화는 없었다 (도 7b). 용해 및 50％ 희석 시, RN아제 R을 발현하는 균주는 RNA의 산-가용성 뉴클레오티드로의 급속한 해중합을 나타내었으며 (도 7c), 이는 과발현된 RN아제 R이 기능적이었음을 지시한다. 주목할 만 하게는, 정제된 효소를 반응물에 첨가함으로써 공급된 추가의 RN아제 R 활성은 해중합의 속도 또는 산-가용성 뉴클레오티드의 수율을 증가시키지 않았으며, 이는 과발현된 RN아제 R이 용해 및 희석 시 충분히 활성임을 시사한다.

다음으로, 과발현된 RN아제 R의 활성을 고-밀도 용해물에서 평가하였다. 리보솜 구조를 안정화시키고, rRNA를 뉴클레아제로부터 보호하는 것으로 공지된 Mg²⁺는 또한 RN아제 R 활성에 요구된다 (적은 양으로). 따라서, 해중합 속도를 다양한 농도의 EDTA의 존재 하에서 측정하였다 (도 8). 비어있는 벡터 균주로부터의 용해물은 EDTA에 대해 불감성인 상대적으로 느린 해중합 속도를 나타낸 반면, 과발현된 RN아제 R을 갖는 용해물은 증가하는 EDTA 농도에 따라 더 높은 해중합의 속도를 나타내었으며, 최대 속도는 8 mM EDTA에서였다. 8 mM 초과에서, 해중합 속도는 아마도 Mg²⁺-의존성 RN아제 R의 불활성화로 인해 감소하였다. 함께 취해져, 이들 결과는 과발현된 RN아제 R이 비-독성이며, 용해 시 활성화될 수 있음을 시사한다.

용해물에서의 NMP 안정성

RNA 해중합 후, 생성된 NMP 풀은 dsRNA로의 중합 전에 NTP로 점진적으로 인산화된다. 유해한 효소적 활성, 예컨대 뉴클레오시드로의 NMP 분해 및 후속의 당 및 염기로의 가수분해는 dsRNA 수율에 부정적으로 영향을 미친다. 따라서, 개별적 NMP의 안정성을 용해물에서 평가하였다. 안정성 평가를, 동위원소적으로-표지된 "무거운" NMP (hAMP, hCMP, hUMP, 및 hGMP)를 용해물에 첨가하고, LC-MS를 사용하여 시간 경과에 따라 풍부도를 정량화함으로써 수행하였다 (도 9a 내지 9d, 실선). 상대적으로 안정한 hAMP와 대조적으로, hCMP, hUMP, 및 hGMP는 용해물에 의해 활발하게 분해되며, 대략적 반감기 (t_1/2)는 각각 1시간, 30분, 및 20분이다.

NMP의 대사의 한 가지 경로는 뉴클레오시드로의 탈인산화이다. 탈인산화가 NMP 분해에 기여하고 있는지 여부를 평가하기 위해, 안정성 평가를 저렴한 포스파타제 억제제의 첨가와 함께 반복하였다. 증가된 농도의 포스페이트 (PO₄, 150 mM), 뿐만 아니라 구조적 모방체 오르토바나데이트 (VO₄, 10 mM)를 용해물과 함께 예비-인큐베이션한 후, hNMP 첨가를 하였다. 포스페이트 농도를 증가시키는 것은 hUMP (t_1/2

60분)를 안정화시킨 반면, hCMP 및 hGMP에는 최소로 영향을 미쳤다 (도 9a 내지 9d, 파선). 대조적으로, 오르토바나데이트는 hCMP (t_1/2 >> 60분), hUMP (t_1/2

60분), 및 hGMP (t_1/2

45분)를 안정화시켰다 (도 9a 내지 9d, 점선). 함께 취해져, 이들 안정성 평가는 용해물에서 13 mM/시의 전체 NMP 분해 속도를 한정하며, 15분 후에 외인적으로-첨가된 NMP의 70％가 존재한다. 심지어 포스파타제 억제제의 부재 하에서, RN아제 R-의존성 해중합의 속도 (> 200 mM/시)에 비해 상대적으로 낮은 속도의 hNMP 소비 (13 mM/시)는 RNA로부터 방출된 NMP가 dsRNA로의 중합에 이용가능해야 함을 시사하였다.

열 불활성화의 개발

NMP, 뿐만 아니라 NDP, NTP, 및 dsRNA를 안정화시키기 위해, 열 불활성화 프로토콜을 개발하였다. 목적은 용해물에서 뉴클레오티드 및 RNA 분해 활성을 소거할 가장 낮은 온도 및 가장 짧은 인큐베이션 시간을 확인하는 것이었다. 열 불활성화의 효능을 평가하기 위해, NTP 소비 속도 (37℃에서)를 열 불활성화의 시간 및 온도를 다양화한 LC-MS에 의해 열-불활성화된 용해물에 걸쳐 비교하였다. 열 불활성화 전에, 용해물은 NTP를 대략 120 mM/시로 소비하였다 (도 10). 70℃ 미만의 온도는 NTP아제 활성에 영향을 미치지 않은 반면, 70℃에서의 인큐베이션은 NTP아제 활성의 시간-의존성 감소를 생성하였다. NTP아제 활성의 완전한 억제는 70℃에서 15분 인큐베이션 후에 일어났다 (도 10).

다음으로, 이들 조건을 용해물에서 NMP 및 dsRNA를 안정화시키는 그들의 능력에 대해 평가하였다. NMP 분해에 대한 열 불활성화의 효과를 평가하기 위해, 용해물을 외인성 RN아제 R로 처리하여 RNA를 방출시킨 후, 70℃에서 열 불활성화 처리하였다. 불활성화 후, 온도를 37℃로 저하시키고, 반응물을 추가의 60분 동안 인큐베이션하였다. 도 11a에 나타난 바와 같이, RN아제 R로 5분 동안 처리는 RNA를 급속하게 해중합시켰다. 열 불활성화 및 37℃에서의 인큐베이션 후에, NMP 농도는 변화하지 않았으며, 이는 선택된 열-불활성화 조건이 NMP를 안정하게 만들었음을 시사한다.

마지막으로, 이들 조건을 용해물에서 시험관내 전사 반응의 반응물 및 생성물 (NTP 및 dsRNA를 포함함)을 안정화시키는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 먼저, 용해물을 승온에서 15분 동안 예비-인큐베이션하였다. 그 후, 온도를 37℃로 저하시키고, 전사 반응물 (외인성 NTP, DNA 주형, 및 정제된 T7 RNA 폴리머라제를 포함함)을 첨가하였다. 도 11b에 나타난 바와 같이, 70℃ 이상에서 열 불활성화된 용해물에서의 전사 반응은 양성 대조군 반응 (완충제에서 수행됨)과 질적으로 유사한 RNA 생성물을 생성하였다. 60℃에서 수행된 반응에서 RNA 생성물은 나타나지 않았다.

함께 취해져, 이들 결과는 15분 동안 70℃ 인큐베이션이 무세포 반응에서 NMP, NTP, 및 dsRNA를 안정화시키는 데 충분함을 시사한다.

열안정성 키나제의 선택 및 평가

열-불활성화 후에, 일련의 키나제 활성은 RNA로부터 유리된 5'-NMP를 중합되어 dsRNA를 형성할 수 있는 NTP로 순차적으로 인산화시키는 데 요구된다. NMP 및 NDP를 인산화시키기 위해 ATP로부터 고-에너지 포스페이트 기를 사용하는 이들 키나제는 고온 인큐베이션 후에 활성인 채로 잔류하는 데 충분히 열안정성일 뿐만 아니라, NTP를 고속으로 (1 g dsRNA/L/시에 대해 21 mM/시 NTP) 생성하는 데 충분히 활성이어야 한다. 호열성 유기체로부터의 효소를 이. 콜라이에서의 성공적 발현 및 재조합 효소의 생화학적 특징화의 문헌 보고에 기초하여 평가를 위해 선택하였다 (표 9).

<표 9>

각각의 부류의 활성에 대해 시험된 열안정성 키나제의 기원.

dsRNA의 무세포 생산을 위한 이들 효소의 적합성을 평가하기 위해, 효소를 N-말단 헥사시스티딘 태그로 이. 콜라이 단백질 발현 벡터 내로 클로닝하고, 과발현시키고, 고정화 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC)를 사용하여 정제하였다. 정제된 효소의 활성을 먼저 루시페라제-커플링 검정을 사용하여 정량화하였으며, 여기서, ATP의 소비는 NMP 및 NDP 인산화를 위한 대리로서 기능하였다. 검정을 다양한 인큐베이션 온도에서 수행하여 각각의 효소에 대한 최적의 반응 온도를 측정하였다.

티. 써모필루스 및 이. 콜라이로부터의 UMP 키나제 (pyrH 유전자에 의해 코딩됨)의 발현은 시험된 유도 및 정제 조건 하에서 불용성 단백질을 생성하였다. 피. 푸리오수스로부터의 정제된 PyrH는 크게 온도-독립적인 대략 2 μmol/분/mg 단백질의 비활성을 나타내었다 (도 12). 이 비활성에 기초하여, PfPyrH를 1％ 총 단백질로 발현하는 고-밀도 세포 용해물 (90g dcw/L)은 과량의 ATP의 존재 하에서, UMP를 50 mM/시 초과의 속도로 인산화시킬 것이다 (표 10). 1 g/L/시에서의 dsRNA 생산은 대략 5.25 mM/시의 UMP 키나제 활성을 요구하기 때문에, PfPyrH를 추가의 평가를 위해 선택하였다. 표 10은 고-밀도 (90 g dcw/L) 용해물에서의 예측된 PyrH 속도를 나타내며, 이는 PfPyrH가 총 용해물 단백질의 1％를 구성함을 가정한다.

<표 10>

예측된 PyrH 반응 속도

이. 콜라이 및 티. 써모필루스로부터의 AMP 키나제 (adk 유전자에 의해 코딩됨)의 발현은 가용성 재조합 단백질을 생성한 반면, 써모시네코코쿠스 (Thermosynechococcus) 효소는 시험된 발현 및 정제 조건 하에서 불용성이었다. 정제된 이. 콜라이 효소는 37℃ 및 50℃에서 활성이었지만, 보다 높은 온도에서는 검출가능한 활성을 나타내지 않았다 (도 13). 티. 써모필루스 효소는 모든 시험된 온도에서 이. 콜라이 효소보다 더 높은 비활성을 나타내었으며, 최적의 활성은 70℃에서 mg 효소 당 거의 1 mM/분이었다. 이 활성은 효소가 고-밀도 용해물 중에서 총 단백질의 0.01％에서 발현되는 경우, 용해물에서 AMP 인산화의 250 mM/시 초과의 예상된 속도로 해석된다 (표 11). 대략 5.25 mM/시의 AMP 키나제 활성이 1 g/L/시 dsRNA를 합성하는 데 요구되기 때문에, TthAdk를 추가의 연구를 위해 선택하였다. 표 11은 고-밀도 (90 g dcw/L) 용해물에서의 예측된 Adk 반응 속도를 나타내며, 이는 TthAdk가 총 용해물 단백질의 0.01％를 구성함을 가정한다.

<표 11>

예측된 Adk 반응 속도

이. 콜라이 및 피. 푸리오수스로부터의 CMP 키나제 (cmk 유전자에 의해 코딩됨)의 발현은 불용성 단백질을 생성한 반면, 티. 써모필루스 효소의 발현은 시험된 조건 하에서 가용성 단백질을 생성하였다. 티. 써모필루스 CMP 키나제는 온도에 크게 독립적인 활성을 나타내었지만, 효소 활성은 60℃ 초과의 온도에서 약간 감소하였다 (도 14). 이들 결과에 기초하여, 총 단백질의 0.02％에서 고-밀도 용해물에서의 TthCmk의 발현은 5.25 mM/시 표적을 훨씬 초과하여, 30 내지 45 mM/시의 CMP 키나제 활성을 생성할 것이다 (온도에 따라, 표 12). 따라서, TthCmk를 추가의 평가를 위해 선택하였다. 표 12는 고-밀도 (90 g dcw/L) 용해물에서의 예측된 Cmk 반응 속도를 나타내며, 이는 TthCmk가 총 용해물 단백질의 0.02％를 구성함을 가정한다.

<표 12>

예측된 Cmk 반응 속도

시험된 CMP 키나제와 대조적으로, 이. 콜라이, 티. 써모필루스, 및 티. 마리티마로부터의 GMP 키나제의 발현은 가용성 재조합 단백질을 생성하였다. 이. 콜라이 효소는 37℃에서 가장 높은 시험된 비활성을 가졌지만, 보다 높은 온도에서는 덜 활성이었다 (도 14). 티. 써모필루스 및 티. 마리티마 효소 둘 다는 보다 높은 온도에서 최적의 활성을 나타낸 반면, 티. 마리티마 효소는 모든 시험된 온도에서 보다 활성이었다. TmGmk의 측정된 비활성에 기초하여, 총 단백질의 0.1％에서 고-밀도 세포 용해물에서의 발현은 5.25 mM/시의 표적 속도에 비해, 과량의 ATP의 존재 하에서 70℃에서 60 mM/시 초과의 예상된 속도를 생성할 것이다 (표 13). 따라서, TmGmk를 추가의 평가를 위해 선택하였다. 표 13은 고-밀도 (90 g dcw/L) 용해물에서의 예측된 Gmk 반응 속도를 나타내며, 이는 TmGmk가 총 용해물 단백질의 0.1％를 구성함을 가정한다.

<표 13>

예측된 Gmk 반응 속도

단일 기질에 대해 크게 특이적인 NMP 키나제와는 달리, NDP 키나제는 ADP, CDP, UDP, 및 GDP를 인산화시킨다. NDP 키나제를 비교하기 위해, 호열균 티. 써모필루스 및 에이. 아에오리쿠스로부터의 효소를 클로닝하고, 이. 콜라이에서 발현시켰다. 티. 써모필루스 효소는 시험된 조건 하에서 불용성인 반면, 에이. 아에오리쿠스 효소의 발현은 가용성 단백질을 생성하였다. 기질로서 ATP 및 GDP를 사용한 루시페라제 검정에서의 활성 측정은 AaNdk가 넓은 범위의 온도에 걸쳐 고도로 활성이며, 50℃의 온도 최적을 가짐을 밝혀내었다 (도 16). 기질에 걸친 비교는 각각의 뉴클레오티드에 대해 50℃에서 100 μmol/분/mg 초과의 비활성을 밝혀내었으며, 이는 AaNdk가 다중 NDP 기질을 인산화시킬 수 있음을 확인시켜 주었다 (표 14). 이들 측정에 기초하여, 0.01％ 총 단백질에서 고 밀도 용해물에서의 AaNdk의 발현은 60 mM/시를 훨씬 초과하는 UDP 키나제 속도로 해석된다. 21 mM/시의 NDP 키나제 활성이 1 g/L/시 dsRNA 합성을 지지하는 데 요구됨을 고려하여, AaNdk를 추가의 평가를 위해 선택하였다. 표 14는 50℃에서, AaNdk가 CDP, UDP, 및 GDP 기질로 고도로 활성임을 나타낸다.

<표 14>

기질에 의한 AaNdk 비활성.

폴리포스페이트 키나제 (Ppk)는 중합체성 포스페이트 쇄 및 아데노신 뉴클레오티드 사이의 고-에너지 포스페이트 기를 가역적으로 전달한다. 이. 콜라이 뿐만 아니라 호열성 유기체 티. 써모필루스 및 써모시네코코쿠스 엘롱가투스로부터의 효소를 비롯한 유형 I 족의 폴리포스페이트 키나제에 속하는 다중 Ppk 효소를 활성에 대해 평가하였다. 이들 효소를, 이들이 널리 특성화된 유형 I족에 속하였거나, 활성인 것으로 이전에 나타났기 때문에, 시험을 위해 선택하였다. Ppk 효소의 발현 및 정제는 가용성 단백질을 생성하였으며, 이를 그 후 기질로서 ADP 및 나트륨 헥사메타포스페이트를 사용한 루시페라제 검정 시스템에서 활성에 대해 시험하였다. 도 17에 나타난 바와 같이, 모든 시험된 Ppk 효소의 비활성은 다른 키나제 활성에 비해 낮았다. 이. 콜라이 Ppk는 보다 낮은 온도 (60℃ 이하)에서 가장 높은 비활성을 가진 반면, 써모시네코코쿠스 효소는 70℃에서 가장 높은 활성을 가졌다. 추가적으로, 열 불활성화 조건 (15분 동안 70℃) 하에서 이. 콜라이 효소의 인큐베이션은 비가역적 불활성화를 발생시켰다 (도시하지 않음). 써모시네코코쿠스 효소의 비활성에 기초하여, 총 단백질의 2％에서 고 밀도 용해물에서의 발현은 70℃에서 42 mM/시의 예상된 속도를 발생시킬 것이며 (표 15), 이는 1 g/L/시 dsRNA 합성을 지지하기 위해 요구되는 ATP 생성 속도와 매칭된다. 그러나, 보다 낮은 온도 (예를 들어, 50℃)에서 무세포 dsRNA 합성은 TePpk의 보다 높은 발현 (4％ 총 단백질 초과)을 요구할 것이다. 표 15는 고-밀도 (90 g dcw/L) 용해물에서의 예측된 Ppk 반응 속도를 나타내며, 이는 TePpk가 총 용해물 단백질의 2％를 구성함을 가정한다.

<표 15>

예측된 PPK1 반응 속도

각각의 효소적 활성을 정제된 시스템에서 평가한 후, 효소를 열-불활성화된 용해물에서 활성에 대해 시험하였다. 개별적 키나제를 발현하는 용해물을 70℃에서 15분 동안 예비-인큐베이션한 후, 기질을 첨가하였다. 정제된 반응에서와 같이, ATP 소비 (NMP 및 NDP 키나제에 대해) 또는 ATP 생성 (폴리포스페이트 키나제에 대해)을 루시페라제 검정 키트를 사용하여 정량화하였다. 하기 표 16에 나타난 바와 같이, NMP 및 NDP 인산화의 속도는 표적을 훨씬 초과하였다.

<표 16>

열-불활성화된 용해물에서의 키나제 활성

개별적 키나제가 용해물에서 충분히 활성이었음을 확인한 후 (Ppk를 제외하고), 키나제를 다중-효소 시스템에서 NMP를 NTP로 전환시키는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 이들 연구에서, 개별적 키나제를 발현하는 용해물 (5가지)의 등부피를 합하고, 열-불활성화시킨 후, LC-MS에 의해 NMP의 등몰 믹스로부터의 NTP의 ATP-의존성 생성에 대해 검정하였다. 표 17에 나타난 바와 같이, 전체 NTP 생성 속도는 UTP, CTP, 및 GTP에 대해 24 mM/시를 초과하였으며, 이는 용해물의 단순한 혼합물이 반응 조건의 임의의 최적화 없이 적당한 ATP의 존재 하에서 1 g/L/시 dsRNA의 합성을 지지하는 데 충분한 속도로 NTP를 제공할 수 있었음을 시사한다.

<표 17>

기질로서 NMP 및 고-에너지 포스페이트 공여자로서 ATP의 등몰 혼합물을 사용한, 개별적 키나제 활성을 발현하는 용해물의 열-불활성화된 1:1 혼합물에서의 NTP의 생성

RNA 폴리머라제 하향선택

RNA의 NMP로의 해중합 및 NMP의 그들의 상응하는 NTP로의 인산화 후, RNA 폴리머라제는 NTP를 dsRNA 생성물로 전환시킬 것이 요구된다. 박테리오파지 T7로부터의 RNA 폴리머라제는 몇몇 이유로 재조합 시스템에 사용하기에 매력적인 효소이다. T7 RNA 폴리머라제는 단일 서브유닛을 포함하며 (박테리아류 및 진핵생물류로부터의 많은 RNA 폴리머라제와는 달리), 생화학적 및 분자 생물학 연구에 의해 광범위하게 특징화되었다. 추가적으로, 개선된 열안정성을 부여하는 다중 T7 RNA 폴리머라제 돌연변이체가 기재되었다 (표 18 참조).

<표 18>

활성 및 열안정성에 대해 평가된 T7 RNA 폴리머라제의 목록

먼저, 시판되는 T7 RNA 폴리머라제의 활성을 두가닥 DNA 주형 (예를 들어 도 3b) 및 37℃ 반응 온도를 사용하여 평가하였다. RNA의 생성을 콴트 (Quant)-iT RNA 키트 (브로드 레인지) (써모 피셔 사이언티픽 (써모 피셔 Scientific))를 사용하여 시간 경과에 따라 정량화하였다. 각각의 제조자에 의해 권고된 조건 하에서, 써모T7 및 메가스크립트 효소는 고도로 활성이었던 반면, NEB 효소는 유의하게 더 낮은 활성을 나타내었다 (도 18).

다음으로, T7 RNA 폴리머라제의 LVI 돌연변이체를 N-말단 헥사시스티딘 태그로 클로닝하고, 이. 콜라이에서 발현시키고, IMAC를 사용하여 정제하였다.

다음으로, 메가스크립트 및 써모T7 폴리머라제의 활성을 표준화된 반응 조건 하에서 희석액 열-불활성화된 용해물 (35％ 최종 용해물 농도)에서 LVI 돌연변이체 폴리머라제와 함께 시험하였다 (도 19). 정제된 시스템에서와 같이, 써모T7은 메가스크립트 효소보다 37℃에서 더 높은 비활성을 나타낸다 (3.1 nmol RNA/분/mg 단백질). LVI 돌연변이체는 시험된 3가지 효소 중 가장 낮은 비활성 (0.33 nmol/분/mg)을 가졌다. 50℃에서 그렇지 않다면 동일한 조건 하에서 시험한 경우, 메가스크립트 효소도, LVI 돌연변이체도 임의의 검출가능한 활성을 나타내지 않았다. 대조적으로, 써모T7의 활성은 37℃에서보다 더 높았다. 써모T7 폴리머라제와 같은 검정에서 총 단백질의 대략 4％로, RNA 합성 속도는 두가닥 DNA 주형 및 써모T7 폴리머라제로 50℃에서 11 g/L/시를 초과하였다 (도 19). 그 후, 써모T7를 추가의 특징화를 위해 선택하였다.

희석액 열-불활성화된 용해물에서 50℃에서 써모T7의 활성을 확인한 후, 써모T7의 활성을 규모의 무세포 dsRNA 생산에 대표적인 조건 하에서 조사하였다. 용해물의 증가된 농도 외에도, 규모의 반응은 열 불활성화 프로세스로부터 발생하는 침전된 용해물 성분 (예를 들어, 단백질)을 포함할 수 있다. 이들 조건 하에서 써모T7의 성능을 평가하기 위해, RNA 중합을 열 불활성화 후에 침전된 단백질을 제거하기 위한 정화와 함께 또는 없이 열-불활성화된 고-밀도 용해물 (68％ 최종 용해물 농도)에서 정량화하였다 (도 20). RNA 합성 속도는 완충제에서보다 매트릭스에서 유의하게 더 높았으며, 가장 높은 속도는 원심분리에 의해 정화된 열-불활성화된 매트릭스에서 발생하였다. 비정화된 반응에서, 전체 RNA 합성 속도 (2-시간 반응에 걸쳐)는 써모T7 폴리머라제와 같은 검정에서 총 단백질의 1.4％로 2 g/L/시 초과였다.

마지막으로, 써모T7의 열안정성을 보다 높은 온도에서 시험하여 이 프로그램에서 이전에 확립된 열 불활성화 조건과의 혼화성을 평가하였다. 이들 연구에서, 써모T7 효소를 승온 (50 내지 70℃)에서 다양한 길이의 시간 (0 내지 15분) 동안 예비-인큐베이션하고, 잔류 활성을 37℃에서 정량화하였다. 도 21에 나타난 바와 같이, 50℃에서의 인큐베이션은 효소에 의해 양호하게 내성화되지만, 보다 높은 온도는 폴리머라제 활성의 급속한 비가역적 불활성화를 발생시킨다. 따라서, 이들 실험에서, 이 특정 써모 T7은 50 내지 70℃에서 열-불활성화와 혼화성이 아니었다. 따라서, 일부 예에서, 정제된 써모T7 효소는 열적 불활성화 후에 무세포 반응에 첨가될 수 있거나, 예를 들어 70℃에서 충분한 반감기를 갖는 교체 T7 RNA 폴리머라제 돌연변이체가 사용될 수 있다.

물질 및 방법

뉴클레오티드 분석

뉴클레오티드 모노포스페이트 (AMP, CMP, UMP, 및 GMP)의 분석을 질량 분광분석법 (LC-MS)과 커플링된 액체 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 샘플을 ZIC-cHILIC 칼럼 (2.1 x 20 mm, 3 μm 내경) (머크 (Merck))을 구비한 애질런트 (Agilent) 1100 시리즈 HPLC를 사용하여 실온에서 0.5 mL/분의 유속 및 2 μL 주사 부피로 분리하였다. 이동상은 20 mM 아세트산암모늄 (A) 및 90％ 아세토니트릴 중 20 mM 아세트산암모늄 (B)으로 이루어졌다. 분리 방법은 3.5분 동안 15 내지 50％의 구배 (B), 그 후 1.5분 동안 50％ (B), 그 후 3분 동안 15％ B로 이루어졌다. 정량화를 ABSciex API 3200 질량 분광광도계 상에서 전기분사 이온화 (모세관 전압: -3000V, 온도: 600℃, 탈용매화 기체: 20 psi)를 사용하여 다중 반응 모니터링 (MRM) 모드로 수행하였다. 뉴클레오티드 모노포스페이트, 디포스페이트, 및 트리포스페이트 종 (NMP, NDP, 및 NTP)의 분석은 상기 기재된 방법을 하기 분리 구배로 사용하였다: 3.5분 동안 15％ B 내지 50％ B, 그 후 2.5분 동안 50％ B, 그 후 4분 동안 15％ B. 피크 면적을 정제된 화합물 (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich))로 이루어진 표준 곡선과 비교하였다. 용해물 중의 샘플의 분석을 위해, 표준 곡선을 하기 기재되는 샘플 제조 단계에서와 같이 산-켄칭하고, 정화시키고, pH-중화시키고, 여과한 용해물 배경에서 작성하였다.

2'-, 3'-, 및 5'-NMP의 분석을 액퀴티 (ACQUITY) CSH 플루오로-페닐 칼럼 (2.1 x 150 mm, 1.7 μm 내경) (워터스 (Waters))을 구비한 액퀴티 H-부류 UPLC (워터스)를 사용한 액체 크로마토그래피에 의해 40℃에서 0.5 mL/분의 유속 및 0.5 μL 주사 부피로 수행하였다. 이동상은 0.2％ 포름산 중 10 mM 아세트산암모늄 (A) 및 95％ 아세토니트릴, 0.2％ 포름산 중 10 mM 아세트산암모늄 (B)으로 이루어졌다. 분리 방법은 2.8분 동안 1％ B, 그 후 2.2분 동안 1％ 내지 30％ B의 구배, 그 후 7분 동안 100％ B, 그 후 3분 동안 1％ B로 이루어졌다. 정량화를 액퀴티 UPLC PDA (워터스)를 사용하여 260, 254, 및 210 nm에서 수행하였다. 피크 면적을 정제된 화합물 (바이오로그 라이프 사이언스 인스티튜트 (Biolog Life Science Institute)로부터 구입한 2' 및 3' CMP, UMP, 및 GMP를 제외하고, 시그마-알드리치로부터 구입함)로 이루어진 표준 곡선과 비교하였다. 용해물 중의 샘플의 분석을 위해, 표준 곡선을 하기 기재되는 샘플 제조 단계에서와 같이 산-켄칭하고, 정화시키고, pH-중화시키고, 여과한 용해물 배경에서 작성하였다.

이. 콜라이 RNA의 추출 및 정제

확립된 프로토콜 (Mohanty, B. K., Giladi, H., Maples, V. F., & Kushner, S. R. (2008). Analysis of RNA decay, processing, and polyadenylation in Escherichia coli and other prokaryotes. Methods in enzymology, 447, 3-29)에 따라, RNA를 추출하고, 고-밀도 이. 콜라이 용해물 (단백질 농도: 40 내지 50 mg/mL)로부터 정제하였다. 동결된 이. 콜라이 용해물 400 μL마다에 대해, 20 mM 아세트산 67 μL를 첨가하여 RN아제 활성을 감소시켰다. 샘플을 비드조에서 37℃에서 해동시켰다. 해동 즉시, 트리메틸(테트라데실)암모늄 브로마이드 (시그마-알드리치)의 10％ (w/v) 용액 400 μL를 첨가하였다. 그 후, 생성된 현탁액을 10,000 x g에서 미세원심분리기에서 4℃에서 원심분리에 의해 정화시키고, 상청액을 제거하였다. 펠릿을 35％ 에탄올 중 염화리튬 (시그마-알드리치)의 2M 용액 1 mL에 재현탁시켰다. 현탁액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 15,000 x g에서 4℃에서 6분 동안 원심분리에 의해 정화시키고, 상청액을 제거하였다. 그 후, 펠릿을 물 중 염화리튬의 2M 용액 1 mL에 재현탁시키고, 실온에서 2분 동안 인큐베이션한 후, 15,000 x g에서 6분 동안 정화시켰다. 그 후, 상청액을 제거하고, 나머지 펠릿을 70％ 에탄올에 재현탁시킴으로써 세척하고, 최대 속도 (21,000 x g)에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 그 후, 상청액을 제거하고, 펠릿을 실온에서 15분 동안 공기-건조시켰다. 그 후, 펠릿을 200 μL 뉴클레아제-무함유수에 재현탁시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 RNA를 가용화시켰다. RNA 용액을 원심분리 (4℃에서 5분 동안 최대 속도)에 의해 정화시키고, 가용성 RNA를 함유하는 상청액을 멸균 RN아제-무함유 튜브로 옮기고, -20℃에서 저장하였다.

뉴클레아제 하향선택

뉴클레아제는 하기와 같이 상업적 공급원으로부터 얻었다: 벤조나제 및 뉴클레아제 P1은 시그마-알드리치로부터 얻었고, RN아제 R, 종결자 엑소뉴클레아제, 및 RN아제 III은 에피센터 (Epicentre)로부터 얻었고, RN아제 A는 써모 피셔 (Thermo Fisher)로부터 얻었고, 엑소뉴클레아제 T는 뉴잉글랜드 바이오랩스로부터 얻었다. 스크리닝 검정을 위해, 각각의 효소 용액 1 μL를 2X 검정 완충제 (100 mM 인산칼륨 pH 7.4, 10 mM 염화마그네슘, 1 mM 염화아연) 100 μL에 첨가한 후, 등부피의 1 mM RNA 용액 (약 340 ng/μL)과 시간 t = 0에서 합하고, 잘 혼합하였다. 반응물을 37℃에서 인큐베이션하고, 20 μL를 얼음 상에서 산 켄칭 용액 (0.2M 황산 180 μL)으로 옮김으로써 주기적으로 샘플링하였다. 시간 과정의 완료 후, 켄칭된 샘플을 3,000 x g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리에 의해 정화시켰다. 그 후, 각각의 샘플로부터의 상청액 170 μL를 UV-투명 96-웰 반 면적 플레이트 (코닝 (Corning))로 옮기고, 산-가용성 뉴클레오티드를 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 260 nm에서의 흡광도에 의해 정량화하고, 각각의 모노뉴클레오티드에 대해 개별적 소광 계수를 평균함으로써 10665 M^-1 cm^-1의 소광 계수를 추정하였다. 후속의 LC-MS에 의한 분석을 위해, 45 μL 정화된 상청액을 2.5 M 수산화칼륨 5 μL로 pH-중화시켰다. 총 뉴클레오티드 풀 (즉, 100％ 해중합)을 RNA의 알칼리성 가수분해에 의해 측정하였다: RNA를 등부피의 0.2M 수산화칼륨과 합한 후, 99℃로 20분 동안 가열하였다. 그 후, 알칼리성-가수분해된 샘플을 켄칭하고, 상기 기재된 바와 같이 분석하였다.

단백질 발현 및 정제

재조합 단백질을 관련 유전자를 헥사시스티딘 태그와 함께 코딩하는 합성 DNA로부터 pETDuet-1 (노바젠 (Novagen)) 내로 클로닝하였다. 플라스미드를 이. 콜라이 T7익스프레스 (T7Express) (뉴잉글랜드 바이오랩스) 내로 형질전환시킨 후, 50 μg/mL 카르베니실린으로 보충된 ZYM-505 배지 (Studier, F. W. (2005). Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein expression and purification, 41(1), 207-234)를 사용하여 1 L 배양물에서 성장시켰다. 발현을 A₆₀₀ = 0.6에서 유도하였다. RN아제 R 및 키나제에 대해, 발현을 0.1 mM IPTG로 유도하고, 온도를 16℃로 저하시키고, 배양물을 16℃에서 24시간 동안 성장시켰다. T7 RNA 폴리머라제에 대해, 발현을 0.8 mM IPTG로 유도하고, 배양물을 37℃에서 3시간 동안 성장시켰다. 바이오매스를 원심분리에 의해 수확하고, 상청액을 디캔팅한 후, 세포 펠릿을 -80℃에서 저장하였다. 세포 펠릿을 해동시키고, 벤조나제 (0.04 μL/mL)로 보충된 4 부피 B-PER 컴플리트 (Complete) (써모 피셔 사이언티픽) 내로의 재현탁, 및 실온에서 15분 동안 부드러운 교반과 함께 인큐베이션에 의해 용해시켰다. 그 후, 용해물을 16,000 x g에서 4℃에서 1시간 동안 원심분리에 의해 정화시켰다. 단백질을 히스 그래비트랩 (His GraviTrap) 칼럼 (GE 헬스케어 (GE Healthcare)) 또는 악타프라임 플러스 (AKTAPrime Plus) FPLC 시스템에 연결된 히스트랩 (HisTrap) HP 칼럼 (GE 헬스케어)을 사용한 고정화 금속 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 둘 다의 방법에 대해, 칼럼을 평형화/세척 완충제 (50 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4, 500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸)에서 평형화시키고, 용해물로 로딩한 후, 30 칼럼 부피 평형화/세척 완충제로 세척하였다. 단백질을 용리 완충제 (50 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸)로 용리하였다. 키나제의 정제를 위해, 평형화/세척 및 용리 완충제는 포스페이트 완충제 대신 50 mM 트리스-HCl pH 7.5를 사용하였다. 용리 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 단백질 함량을 BCA (써모 피셔 사이언티픽)에 의해 정량화하였다. 그 후, 분획을 합하고, 완충제를 투석에 의해 1000 부피 2X 저장 완충제로 교환하였다. RN아제 R에 대해, 2X 저장 완충제는 추가의 500 mM NaCl로 보충된 2X PBS로 이루어졌다. T7 RNA 폴리머라제에 대해, 2X 저장 완충제는 2X PBS로 이루어졌다. 키나제에 대해, 2X 저장 완충제는 100 mM NaCl을 갖는 100 mM 트리스-HCl pH 7.0로 이루어졌다. 투석 후, 단백질을 등부피의 100％ 글리세롤 (50％ 최종 농도)과 혼합하고, -20℃에서 저장하였다.

세포 용해물 제조

이. 콜라이 균주 GL16-170 (BL21(DE3).t526pgi.Δedd.ΔtktB.ΔtolC_wt-7-E1.ΔmgsA*-F3.ΔappA*.Δamn*-F1.nagD(keio)::zeoR-1.ΔphoA*.t352BAA1644.ΔushA*-C4.rna::tolC-B04) 및 GL14-322 (BL21(DE3).t526pgi.Δedd.ΔtktB.ΔtolC_wt-7-E1.ΔmgsA*-F3.ΔappA*.Δamn*-F1.nagD(keio)::zeoR-1.ΔphoA*.t352BAA1644.ΔushA::tolC-A01)를 10L 생물반응기에서 코르츠 배지에서 배치 단계의 종료까지 성장시킨 후, 원심분리에 의해 수확하고, -80℃에서 동결시켰다. 펠릿을 58.8 mM 이염기성 인산칼륨에 10％ 건조 세포 중량으로 재현탁시키고, 15,000 psi에서 4℃로 냉각된 판다플러스 (PandaPLUS) 균질화기 (GEA 니로 사오비 (GEA Niro Soavi))를 통한 2회 통과를 사용하여 용해시켰다. 용해물을 16,000 x g에서 4℃에서 1시간 동안 원심분리에 의해 정화시키고, 단백질 함량을 BCA 검정 (써모 피셔)에 의해 분석한 후, -80℃에서 저장하였다.

외인성 RN아제 R을 사용한 용해물 RNA의 해중합

GL16-170 용해물 (단백질 함량 34.5 mg/mL) 및 RN아제 R 용액 (300 mM 인산칼륨 완충제 pH 7.4, 200 mM KCl, 2 mM MgCl₂ 중 1 mg/mL)을 2℃에서 예비-평형화시킨 후, 반응을 개시시켰다. 시간 t = 0에서, 50 μL의 이. 콜라이 용해물 및 50 μL RN아제 R 용액을 혼합하고, 예열된 37℃ 블록으로 옮김으로써 반응을 개시시켰다. 데옥시콜레이트를 포함하는 반응물을, 용해물을 물 중 5X 나트륨 데옥시콜레이트 용액의 0.2 부피와 예비혼합하고, 개시 전에 2℃에서 15분 동안 인큐베이션한 것을 제외하고는, 상기 기재된 바와 같이 어셈블리하였다. 개시 후, 반응물을 37℃에서 인큐베이션하고, 10 μL를 얼음 상에서 산 켄칭 용액 (0.2M 황산 90 μL)으로 옮김으로써 주기적으로 샘플링하였다. 시간 과정의 완료 후, 켄칭된 샘플을 3,200 x g에서 2℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 정화시켰다. 해중합을 먼저 산-가용성 뉴클레오티드의 흡광도에 의해 정량화하였다: 켄칭되고 정화된 반응물 10 μL를 UV-투명 96-웰 반 면적 플레이트 (코닝)에서 0.2M 황산 160 μL에 첨가하였다. 산-가용성 뉴클레오티드를 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 260 nm에서의 흡광도에 의해 정량화하였다 (상기 참조). 해중합을 또한 5', 2', 및 3' NMP의 UPLC 분석에 의해 정량화하였다: 각각의 산-켄칭된 샘플 30 μL를 1M KOH 10 μL를 첨가함으로써 pH-중화시킨 후, 0.2 μm 필터를 통해 통과시킨 후, UPLC 분석하였다. 총 뉴클레오티드 풀 (즉, 100％ 해중합)을 용해물 RNA의 알칼리성 가수분해에 의해 측정하였다: 50 μL 용해물을 0.2M 수산화칼륨 150 μL와 합한 후, 99℃로 20분 동안 가열하였다. 그 후, 알칼리성-가수분해된 샘플을 켄칭하고, 상기 기재된 바와 같이 분석하였다.

과발현된 RN아제 R을 사용한 용해물에서의 RNA의 해중합

이. 콜라이 균주 GL16-170을 C-말단 헥사시스티딘 태그와 함께 이. 콜라이 rnr 유전자를 코딩하는 pETDuet-1로 형질전환시켰다. 이 균주를 비어있는 pETDuet-1로 형질전환된 GL16-170과 함께 배치 단계에서 50 mg/L 카르베니실린으로 보충된 코르츠 배지에서 성장시켰다. 배양물을 A₆₀₀ = 20에서 0.8 mM IPTG로 유도하고, 유도 시 추가의 10 g/L 글루코스로 보충하였다. 유도 1시간 후, 바이오매스를 원심분리에 의해 수확하고, 동결시켰다. 용해물을 상기 기재된 바와 같이 동결된 바이오매스로부터 제조하였다 (단백질 농도: 비어있는 pETDuet-1을 갖는 GL16-170 바이오매스에 대해 36.6 mg/mL; 클로닝된 RN아제 R을 운반하는 pETDuet-1을 갖는 GL16-170에 대해 53.2 mg/mL). 희석액 용해물에서의 해중합을 상기 기재된 바와 같이 반응물 중 50％ 최종 용해물 농도로 평가하였다. 농축된 용해물에서의 해중합을 9 부피 용해물을 1 부피 10X EDTA 용액과 함께 2℃에서 5분 동안 예비-인큐베이션함으로써 평가하였다. 그 후, 반응을 예열된 37℃ 블록으로 옮기고, 상기 기재된 바와 같이 샘플링함으로써 개시시켰다.

NMP 안정성 평가

4 부피의 GL14-322 용해물 (단백질 농도: 50.5 mg/mL)을 얼음 상에서 1 부피의 포스파타제 억제제 용액 (50 mM 인산칼륨 pH 7.4, 150 mM 인산칼륨 pH 7.4, 또는 10 mM 오르토바나듐산나트륨의 최종 농도)과 합하였다. 동위원소적으로 표지된 NMP (아데노신-¹³C₁₀,¹⁵N₅ 5'-모노포스페이트, 시티딘-¹⁵N₃-5'-모노포스페이트, 우리딘-¹⁵N₂-5'-모노포스페이트, 및 구아노신-¹⁵N₅-5'-모노포스페이트 [시그마-알드리치], 각각 25 mM)의 등몰 용액을 물 중에서 제조하였다. 용해물 및 NMP를 37℃로 10분 동안 평형화시킨 후, 반응을 개시시켰다. 반응을 개시시키기 위해, 90 μL 용해물 용액을 10 μL NMP 용액에 첨가하고, 반응물을 잘 혼합하였다. 반응을 지시된 시점에서 샘플링함으로써 모니터링하였다. 샘플링 동안, 반응 혼합물 12 μL를 얼음 상에서 0.2M 황산 108 μL로 옮겼다. 그 후, 켄칭된 반응물을 원심분리에 의해 정화시키고, pH-중화시키고, 상기 기재된 바와 같은 LC-MS 분석을 위해 여과하였다.

열 불활성화의 개발

GL14-322 용해물을 얼음 상에서 5개의 미세원심분리기 튜브 내로 분취한 후, 바람직한 열 불활성화 온도에서 평형화된 열 블록으로 옮겼다. 지시된 시간에서, 튜브를 얼음 상에서 냉각시킨 후, 원심분리 (5분 동안 21,000 x g)에 의해 정화시키고, 상청액을 수확하였다. 열-불활성화된 용해물로부터의 상청액을 NTP의 등몰 혼합물 (시그마-알드리치, 각각 25 mM)과 함께 37℃에서 10분 동안 평형화시켰다. 시간 t = 0에서, 9 부피의 열-불활성화된 용해물 상청액을 1 부피의 NTP 용액과 합하고, 반응을 산 켄칭 용액 내로 샘플링함으로써 모니터링하고, pH-중화시키고, 여과하고, 상기 기재된 바와 같이 LC-MS에 의해 분석하였다. 용해물에서의 전사 반응을 위해, 10 μL 반응을 감소된 양의 효소 믹스 (최종 반응 부피의 5％), 및 열-불활성화된 용해물 상청액 (최종 반응 부피의 40％)을 포함하는 것을 제외하고, 메가스크립트 T7 전사 키트 (써모 피셔)를 키트 지시서에 따라 사용하여 수행하였다. 양성 대조군 반응은 메가스크립트 반응 완충제 단독에서 수행한 반면, 음성 대조군 반응은 용해물을 포함하였지만, 효소 믹스를 생략하였다. 반응을 1 kb DNA 래더 (뉴잉글랜드 바이오랩스)와 함께 SYBR 세이프 (SYBR Safe) (인비트로젠 (Invitrogen))로 염색된 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다.

뉴클레오티드 키나제 활성 검정

뉴클레오티드 키나제를 다양한 온도 (37℃, 50℃, 60℃, 70℃, 및 80℃)에서, 50 mM 트리스-HCl pH 7.0, 4 mM MgSO₄, 4 mM ATP, 및 4 mM의 상응하는 NMP 또는 NDP로 이루어진 완충제에서 검정하였다. 반응 완충제 (1.2X 농축물) 및 효소 용액 (0.5 mg/mL)을 반응 온도에서 1분 동안 예비-평형화시킨 후, 반응을 개시시켰다. 시간 t = 0에서, 80 μL 반응 완충제를 20 μL 효소와 혼합함으로써 반응을 개시시켰다. 반응을 지시된 시점에서 샘플링함으로써 모니터링하였다. 샘플링 동안, 반응 혼합물 15 μL를 얼음 상에서 0.2M 황산 135 μL로 옮겼다. 반응의 완료 후, 샘플을 상기 기재된 바와 같이 1M KOH로 pH-중화시킨 후, 빙냉된 물에서 1:10 희석하였다. ATP를 각각의 샘플에서 ATP 생체발광 검정 키트 (ATP Bioluminescent Assay Kit) (시그마-알드리치)를 키트 지시서에 따라 사용하여 정량화하였다. 용해물에서의 반응을 위해, 상기 프로토콜을 하기와 같이 변형하였다: 용해물을 개별적 반응 튜브 내로 분취한 후, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 열-불활성화시켰다. 반응 완충제 (2X 농축물) 및 열-불활성화된 용해물을 반응 온도에서 예비-평형화시키고, 등부피의 용해물 및 반응 완충제를 합함으로써 반응을 개시시켰다. 반응을 개별적 반응 튜브를 9 부피 산 켄칭 용액으로 켄칭함으로써 샘플링한 후, 상기 기재된 바와 같이 분석하였다.

용해물에서의 키나제의 조합된 활성 (즉, NMP로부터 NTP로)을 검정하기 위해, 각각의 키나제를 개별적으로 발현하는 용해물을 1:1 비로 혼합하고, 10 μL 분취액으로 나눈 후, 상기 기재된 바와 같이 열-불활성화시켰다. 키나제 활성을 50 mM 트리스-HCl pH 7.0, 16 mM MgSO₄, 2 mM 각각의 뉴클레오티드 모노포스페이트 (AMP, CMP, UMP, 및 GMP), 및 16 mM ATP로 이루어진 완충제에서 분석하였다. 반응 온도에서 예비-평형화된 반응 완충제 (2X 농축물)를 등부피의 용해물과 합하여 반응을 개시시켰다. 반응을 70℃에서 수행하고, 개별적 반응 튜브를 9 부피 산 켄칭 용액으로 켄칭함으로써 샘플링한 후, 상기 기재된 바와 같이 분석하였다.

폴리포스페이트 키나제 활성 검정

폴리포스페이트 키나제를 다양한 온도 (37℃, 50℃, 60℃, 70℃, 및 80℃)에서, 50 mM 트리스-HCl pH 7.0, 4 mM MgSO₄, 25 mM (NH₄)₂SO₄, 1 mM ADP, 및 1 mM 나트륨 헥사메타포스페이트로 이루어진 완충제에서 검정하였다. 반응 완충제 (1.2X 농축물) 및 효소 용액 (0.25 mg/mL)을 반응 온도에서 1분 동안 예비-평형화시킨 후, 반응을 개시시켰다. 시간 t = 0에서, 80 μL 반응 완충제를 20 μL 효소와 혼합함으로써 반응을 개시시켰다. 반응을 지시된 시점에서 샘플링함으로써 모니터링하였다. 샘플링 동안, 반응 혼합물 15 μL를 얼음 상에서 0.2M 황산 135 μL로 옮겼다. 반응의 완료 후, 샘플을 상기 기재된 바와 같이 1M KOH로 pH-중화시킨 후, 빙냉된 물에서 1:10 희석하였다. ATP를 각각의 샘플에서 ATP 생체발광 검정 키트 (시그마-알드리치)를 키트 지시서에 따라 사용하여 정량화하였다. 용해물에서의 반응을 위해, 상기 프로토콜을 하기와 같이 변형하였다: 용해물을 개별적 반응 튜브 내로 분취한 후, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 열-불활성화시켰다. 반응 완충제 (2X 농축물) 및 열-불활성화된 용해물을 반응 온도에서 예비-평형화시키고, 등부피의 용해물 및 반응 완충제를 합함으로써 반응을 개시시켰다. 반응을 개별적 반응 튜브를 9 부피 산 켄칭 용액으로 켄칭함으로써 샘플링한 후, 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. 용해물에서의 반응 속도를, 동일한 반응 조건 하에서 대조군 용해물 (과발현된 폴리포스페이트 키나제가 없음)로부터의 신호를 감함으로써 계산하였다.

전사 주형의 생성

두가닥 DNA 주형을 합성 g블록 (gBlock) DNA (인테그레이티드 DNA 테크놀로지스 (Integrated DNA Technologies))의 PCR 증폭에 의해 제조하였다. 반응물을 정제하고, 이소프로판올 침전에 의해 농축시켰다.

RNA 폴리머라제 하향선택

시판되는 RNA 폴리머라제를 각각의 제조자에 의해 권고된 조건을 사용하여 비교하였다. 각각의 50 μL 반응물은 10X 반응 완충제 (제조자에 의해 공급됨), NTP, DNA 주형 (0.5 μg), 및 효소로 이루어졌다. NEB T7 RNA 폴리머라제에 대해, 반응물은 0.5 mM 각각의 NTP, 5 mM DTT, 및 100 U 효소를 포함하였다. 써모T7 폴리머라제를 갖는 반응물은 DTT가 생략된 것을 제외하고는 동일하였다. 메가스크립트 T7을 갖는 반응물은 7.5 mM 각각의 NTP 및 5 μL 효소 믹스를 포함하였다. 효소 농도를 BCA 검정 (써모 피셔)에 의해 측정하였다. 반응을 지시된 시점에서 샘플링함으로써 모니터링하였다. 샘플링 동안, 반응 혼합물 10 μL를 RNA 켄칭 용액 (10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA) 90 μL로 옮기고, 얼음 상에서 저장하였다. 켄칭 용액 중 RNA 샘플을 콴트-iT RNA 브로드 레인지 검정 키트 (써모 피셔)를 키트 지시서에 따라 사용하여 정량화하였다. 메가스크립트 키트를 사용하여 제조되고, 키트 지시서에 따라 정제된, 정제된 dsRNA의 연속 희석액을 사용하여 정량화를 위한 표준 곡선을 구축하였다. 반응을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정성적으로 분석하였다.

용해물에서의 RNA 폴리머라제 평가

GL14-322 용해물을 열-불활성화시키고, 이전에 기재된 바와 같이 원심분리에 의해 정화시켰다. 각각의 20 μL 반응물은 정화된 용해물 (7 μL), 10X 조인자 용액 (300 mM MgCl₂, 20 mM 스페르미딘), NTP (각각 7.5 mM, pH-중화된 스톡 용액으로부터 제조됨), DNA 주형 (0.6 μg), 및 효소 (1 μL)로 이루어졌다. 반응물을 37℃ 또는 50℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 9 부피 RNA 켄칭 용액을 첨가함으로써 켄칭하였다. 켄칭된 반응물을 켄칭 용액에서 10배 더 희석하였다 (최종 희석: 100배). 그 후, 희석된 반응물을 콴트-iT 키트를 사용하여 정량화하였다 (상기 참조). 반응에 의해 생산된 RNA를 대조군 반응 (RNA 폴리머라제가 생략됨)에서 정량화된 RNA를 감함으로써 계산하였다.

고-밀도 용해물에서의 RNA 폴리머라제 검정을 하기 변형으로 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 각각의 100 μL 반응물은 용해물 (67.5 μL), 10X 조인자 용액 (300 mM MgCl₂, 20 mM 스페르미딘), NTP (각각 7.5 mM, pH-중화된 스톡 용액으로부터 제조됨), DNA 주형 (3 μg), 및 효소 (10 μL)로 이루어졌다. 비정화된 반응 매트릭스에서 수행되는 반응을 위해, GL14-322 용해물 (67.5 μL)을 개별적 반응 튜브 내로 분취한 후, 이전에 기재된 바와 같이 열-불활성화시켰다. 추가의 반응물을 열-불활성화된 매트릭스에 첨가한 후, 균질해질 때까지 볼텍싱함으로써 잘 혼합하였다. 완충제에서 수행되는 반응에 대해, 10X 조인자 용액은 300 mM MgCl₂, 20 mM 스페르미딘, 및 400 mM DTT로 이루어졌다. 또한, 50 mM 인산칼륨 pH 7.4는 완충제-만의 반응에 포함되었다. 모든 반응물을 50℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 반응물로부터의 샘플을 9 부피 RNA 켄칭 용액을 첨가함으로써 켄칭한 후, 최대 속도 (21,000 x g)에서 1분 동안 원심분리에 의해 정화시켰다. 이들 반응물로부터의 상청액을 켄칭 용액에서 40배 더 희석한 후 (최종 희석: 400배), 콴트-iT 키트를 사용하여 정량화하였다 (상기 참조).

실시예 2

열안정성 PPK2 효소를 이. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈-최적화하고, 합성하고, pETDuet-1 (노바젠) 내로 클로닝하였다. 그 후, 플라스미드를 GL16-170 내로 형질전환시켰다. 대조군 균주를 생성하기 위해, 비어있는 pETDuet-1 플라스미드를 GL16-170 내로 형질전환시켰다. 5 mL 용원성 브로쓰 (LB)에서 밤새 예비배양 후, 균주를 1L LB에서 37℃에서 세포 밀도가 대략 0.5의 OD₆₀₀에 도달할 때까지 배양하였다. 그 후, 배양물을 얼음 상에서 간단히 냉각시키고, PPK2 발현을 이소프로필 티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 0.25 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 유도하였다. 유도 후, 배양물을 20℃에서 대략 16시간 동안 성장시켰다. 배양물을 원심분리에 의해 수확하고, 세포 펠릿을 -80℃에서 저장하였다. 동결된 펠릿을 해동시키고, 2 펠릿 부피 150 mM MOPS-NaOH pH 7에 재현탁시키고, 15,000 psi에서 에멀시플렉스 (EmulsiFlex) C3 균질화기 (아베스틴 (Avestin))를 통한 4회 통과를 사용하여 균질화시킴으로써 용해물을 제조하였다. 그 후, 용해물을 15,000 x g에서 4℃에서 1시간 동안 원심분리에 의해 정화시켰다. 용해물의 분취액을 -80℃에서 동결시킨 후 사용하였다.

그 후, 열안정성 PPK2 활성을 열-불활성화된 용해물에서 측정하였다. PPK2 효소를 발현하는 해동된 용해물을 먼저, 1:10 희석한 디. 게오써말리스 (D. geothermalis) PPK2 용해물을 제외하고, 대조군 균주로부터 제조된 용해물 내로 1:100 희석하였다. 염화망간 (MnCl₂) 및 나트륨 헥사메타포스페이트 (HMP)의 예비-냉각된 용액을 각각 10 mM 및 1 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 그 후, 용해물을 예열된 70℃ 써모사이클러에서 15분 동안 인큐베이션에 의해 열-불활성화시켰다. 그 후, 열-불활성화된 용해물을 10 mM MnCl₂, 2 mM 아데노신 디포스페이트 (ADP) 또는 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 및 9 mM HMP로 이루어진 등부피의 2X 반응 완충제와 혼합함으로써 반응을 개시시켰다. 반응물을 70℃에서 인큐베이션하고, 시점을, 반응 혼합물의 분취액을 제거하고, 얼음 상에서 9부 켄칭 용액 (200 mM H₂SO₄)으로 희석함으로써 취하였다. 초기 시점 (t₀)을, 용해물을 켄칭 용액과 직접적으로 혼합하고, 켄칭된 용해물을 얼음 상에서 15분 동안 저장한 후, 2X 반응 완충제를 첨가함으로써 취하였다. 검정의 결말에서, 켄칭된 시점 용액을 3,200 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 정화시켰다. 그 후, 켄칭된 반응물로부터의 상청액을, 3부 켄칭된 반응 용액을 1부 중화 용액 (1M KOH)과 혼합함으로써 pH 중화시켰다. 그 후, 켄칭되고 중화된 샘플을 물로 1:10 희석한 후, 아데노신 5'-트리포스페이트 (ATP) 생체발광 검정 키트 (시그마-알드리치 카탈로그 #: FLAA)를 키트 지시서에 따라 사용하여 정량화하였다. 초기 반응 속도를 대조군 용해물로부터 ATP 농도를 감하는 PPK2-함유 반응물 중의 ATP의 축적에 기초하여 계산하였다.

5개의 부류 III PPK2 효소는 70℃에서 용해물에서의 가용성 발현, 열안정성, 및 높은 반응 속도를 나타내었다. 대표적인 발현 및 활성 데이터를 도 22a 내지 22b에 나타낸다.

각각의 시험된 효소에 대한 발현 및 동역학 데이터의 요약을 표 17에 나타낸다. 씨. 아에로필라, 로세이플렉수스 (Roseiflexus), 에이. 써모필라, 및 알. 카스텐홀치이 (R. castenholzii) 효소는 기질로서 HMP를 사용하여 AMP 및 ADP를 ATP로 급속하게 전환시켰다. 디. 게오써말리스 효소는 AMP 및 ADP 기질 둘 다에 대해 다른 시험된 PPK2보다 대략 20x 더 낮은 전환 속도를 나타내었다.

<표 17>

용해물에서의 열안정성 부류 III PPK2 효소에 대한 발현 및 속도 데이터의 요약.

실시예 3

그 후, 열안정성 씨. 아에로필라 PPK2를 사용하여 NMP, ADP, 및 HMP로부터 dsRNA의 무세포 생산을 위한 ATP를 공급하였다. 무세포 dsRNA 합성 반응을 표 18에 상세화된 키나제를 개별적으로 과발현하는 6개의 이. 콜라이 용해물의 혼합물로 수행하였다.

<표 18>

NMP 및 HMP로부터 dsRNA를 생산하는 데 사용된 키나제.

먼저, 표 18에 상세화된 용해물을 얼음 상에서 등부피로 합하였다. 염화망간 (MnCl₂), 황산마그네슘 (MgSO₄), 및 나트륨 헥사메타포스페이트 (HMP)의 예비-냉각된 용액을 각각 0 내지 2.5 mM, 30 mM, 및 1 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 그 후, 용해물 혼합물을 예열된 70℃ 써모사이클러에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 열-불활성화시켰다. 반응을 개시시키기 위해, 열-불활성화된 용해물을 하기 성분과 합하였다: 20 μL의 총 부피로, 뉴클레오티드 모노포스페이트 (아데노신 5'-모노포스페이트, 시티딘 5'-모노포스페이트, 우리딘 5'-모노포스페이트, 및 구아노신 5'-모노포스페이트, 각각 2 mM), 50 mM 트리스 pH 7.0, 30 mM MgSO₄, 0 내지 2.5 mM MnCl_2, 1 mM 아데노신 5'-디포스페이트, 2 mM 스페르미딘, 1.5 μg 플라스미드 DNA 주형, 및 3 μg 열안정성 T7 RNA 폴리머라제 (S430P, F849I, F880Y)의 등몰 혼합물. 대조군으로서, dsRNA를 2 mM NTP (용해물, ADP, 및 HMP가 생략됨)의 등몰 혼합물로부터 합성하였다. 추가의 대조군으로서, dsRNA를 2 mM NMP (PPK2-발현 용해물, ADP, 및 HMP가 생략되지만, 8 mM ATP를 에너지 공급원으로서 포함함)의 등몰 혼합물로부터 합성하였다. 음성 대조군으로서, 이중 반응을 폴리머라제를 생략하여 수행하였다. 모든 반응물을 50℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 9 부피 TE+ 완충제 (10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA)의 첨가에 의해 종결시켰다. 샘플을 등부피의 2X RNA 로딩 염료 (Loading Dye) (뉴잉글랜드 바이오랩스)와 혼합하고, 70℃로 10분 동안 가열한 후, 아가로스/TAE 겔 전기영동하였다.

도 23에 나타난 바와 같이, 바람직한 dsRNA 생성물을 NTP를 사용하여 완충제에서 (좌측 레인), NMP 및 ATP로부터 뉴클레오티드 키나제-발현 용해물에서 (중간 레인), 및 NMP 및 HMP로부터 뉴클레오티드 키나제 및 폴리포스페이트 키나제-발현 용해물에서 (우측 레인) 생산하였다. 염화망간은 임의의 반응에서 요구되지 않았으며, 이는 씨. 아에로필라 효소가 Mn²⁺ 뿐만 아니라 조인자로서 Mg²⁺를 이용할 수 있음을 입증한다. 따라서, Mn²⁺는 씨. 아에로필라 PPK2를 함유하는 무세포 반응에 선험적으로 요구되지 않는다.

도 24에 나타난 바와 같이, 바람직한 dsRNA 생성물을 NTP를 사용하여 완충제에서 (좌측 레인), NMP 및 ATP로부터 뉴클레오티드 키나제-발현 용해물에서 (중간 레인), 및 NMP 및 HMP로부터 뉴클레오티드 키나제 및 폴리포스페이트 키나제-발현 용해물에서 (우측 레인) 생산하였다. NMP 및 HMP로부터의 dsRNA 생산은 외인성 ADP 또는 티. 써모필루스 AMP 키나제를 요구하지 않았다. 따라서, 씨. 아에로필라 PPK2는 무세포 반응에서 NMP 및 HMP로부터 dsRNA를 생산하는 5-키나제 시스템의 일부로서 사용될 수 있다.

다른 실시양태

청구항에서, 단수 형태는 반대로 지시되거나, 그렇지 않다면 맥락으로부터 명백하지 않다면, 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은, 반대로 지시되거나, 그렇지 않다면 맥락으로부터 명백하지 않다면, 군 구성원의 하나, 하나 초과, 또는 전부가 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하거나, 채용되거나, 그렇지 않다면 관련되는 경우, 만족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 군의 정확하게 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하거나, 채용되거나, 그렇지 않다면 관련되는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 군 구성원의 하나 초과, 또는 전부가 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하거나, 채용되거나, 그렇지 않다면 관련되는 실시양태를 포함한다.

더욱이, 본 발명은 열거된 청구항 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 조항, 및 설명적 용어가 또다른 청구항 내로 도입된 모든 변형, 조합, 및 순열을 포괄한다. 예를 들어, 또다른 청구항에 종속된 임의의 청구항은 동일한 기초 청구항에 종속된 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 요소가 목록으로서, 예를 들어, 마쿠시 군 형식으로 제시되는 경우, 요소의 각각의 하위군은 또한 개시되며, 임의의 요소(들)는 군으로부터 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 측면이 특정 요소 및/또는 특색을 포함하는 것으로 지칭되는 경우, 본 발명 또는 본 발명의 측면의 특정 실시양태는 이러한 요소 및/또는 특색으로 이루어지거나, 본질적으로 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 간명함의 목적을 위해, 그러한 실시양태는 본원에서 글자 그대로 구체적으로 제시되지는 않았다. 또한, 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 개방적이며, 추가의 요소 또는 단계의 포함을 허용하는 것으로 의도됨을 유념한다. 범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 더욱이, 달리 지시되거나, 그렇지 않다면 맥락 및 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해로부터 명백하지 않다면, 범위로서 표현된 값은 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는다면, 본 발명의 상이한 실시양태에서 언급된 범위 내의 임의의 구체적인 값 또는 하위-범위를, 범위의 하한의 단위의 1/10까지 가정할 수 있다.

이 출원은 다양한 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 저널 논문, 및 다른 간행물을 언급하며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 임의의 포함된 참고문헌 및 본 명세서 사이에 상충되는 것이 있는 경우, 본 명세서가 지배할 것이다. 또한, 종래 기술 내에 해당되는 본 발명의 임의의 특정 실시양태는 청구항 중 임의의 하나 이상으로부터 분명하게 배제될 수 있다. 이러한 실시양태는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 이들은 배제가 본원에 분명하게 제시되지 않는 경우라 하더라도 배제될 수 있다. 본 발명의 임의의 특정 실시양태는 종래 기술의 존재와 관련되든 그렇지 않든, 임의의 이유로 임의의 청구항으로부터 배제될 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 통상의 실험 이하를 사용하여 본원에 기재된 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 본원에 기재된 본 실시양태의 범위는 상기 설명에 제한되는 것으로 의도되지 않지만, 오히려 첨부된 청구항에 제시된 바와 같다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이 설명에 대한 다양한 변화 및 변형이 하기 청구항에 정의된 바와 같은 본 발명의 정신 또는 범위로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

참고문헌

1. Maekewa K., Tsunasawa S., Dibo G., Sakiyama F. 1991. "Primary structure of nuclease P1 from Penicillium citrinum." Eur. J. Biochem. 200:651-661.

2. Volbeda A., Lahm A., Sakiyama F., Suck D. 1991. Crystal structure of Penicillium citrinum P1 nuclease at 2.8-A resolution. EMBO J. 10:1607-1618(1991)

3. Romier C., Dominguez R., Lahm A., Dahl O., Suck D. 1998. Recognition of single-stranded DNA by nuclease P1: high resolution crystal structures of complexes with substrate analogs. Proteins 32:414-424

4. Cheng Z.F., Deutscher M.P. 2002. Purification and characterization of the Escherichia coli exoribonuclease RNase R. Comparison with RNase II. J. Biol. Chem. 277:21624-21629.

5. Zilhao R., Camelo L., Arraiano C.M. 1993. DNA sequencing and expression of the gene rnb encoding Escherichia coli ribonuclease II. Mol. Microbiol. 8:43-51

6. March P.E., Ahnn J., Inouye M. 1985. The DNA sequence of the gene (rnc) encoding ribonuclease III of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 13:4677-4685

7. Chen S.M., Takiff H.E., Barber A.M., Dubois G.C., Bardwell J.C., Court D.L. 1990. Expression and characterization of RNase III and Era proteins. Products of the rnc operon of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 265:2888-2895

8. Robertson H.D., Webster R.E., Zinder N.D. 1968. Purification and properties of ribonuclease III from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 243:82-91.

9. Molina L., Bernal P., Udaondo Z., Segura A., Ramos J.L.2013. Complete Genome Sequence of a Pseudomonas putida Clinical Isolate, Strain H8234. Genome Announc. 1:E00496-13; and Cheng, Z.F. and M.P. Deutscher. 2002. Purification and characterization of the Escherichia coli exoribonuclease RNAse R. Comparison with RNAse II. J Biol Chem. 277(24).

10. Even S., Pellegrini O., Zig L., Labas V., Vinh J., Brechemmier-Baey D., Putzer H. 2005. Ribonucleases J1 and J2: two novel endoribonucleases in B.subtilis with functional homology to E. coli RNase E. Nucleic Acids Res. 33:2141-2152.

11. Li de la Sierra-Gallay I., Zig L., Jamalli A., Putzer H. 2008. Structural insights into the dual activity of RNase J. Nat. Struct. Mol. Biol. 15:206-212.

12. Ball T.K., Saurugger P.N., Benedick M.J. 1987. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli. Gene 57:183-192.

13. Biedermann K., Jepsen P.K., Riise E., Svendsen I. 1989. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Res. Commun. 54:17-27.

14. Shlyapnikov S.V., Lunin V.V., Perbandt M., Polyakov K.M., Lunin V.Y., Levdikov V.M., Betzel C., Mikhailov A.M. 2000. Atomic structure of the Serratia marcescens endonuclease at 1.1 A resolution and the enzyme reaction mechanism. Acta Crystallogr. D 56:567-572.

15. Zuo Y., Deutscher M.P. 2002. Mechanism of action of RNase T. I. Identification of residues required for catalysis, substrate binding, and dimerization. J. Biol. Chem. 277:50155-50159.

16. Zuo Y., Zheng H., Wang Y., Chruszcz M., Cymborowski M., Skarina T., Savchenko A., Malhotra A., Minor W. 2007. Crystal structure of RNase T, an exoribonuclease involved in tRNA maturation and end turnover. Structure 15:417-428.

17. Huang S., Deutscher M.P. 1992. Sequence and transcriptional analysis of the Escherichia coli rnt gene encoding RNase T. J. Biol. Chem. 267:25609-25613.

18. Chauhan A.K., Miczak A., Taraseviciene L., Apirion D. 1991. Sequencing and expression of the rne gene of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 19:125-129.

19. Cormack R.S., Genereaux J.L., Mackie G.A. 1993. RNase E activity is conferred by a single polypeptide: overexpression, purification, and properties of the ams/rne/hmp1 gene product.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:9006-9010.

20. Meador J. III, Kennell D. 1990. Cloning and sequencing the gene encoding Escherichia coli ribonuclease I: exact physical mapping using the genome library. Gene 95:1-7.

21. Awano N., Rajagopal V., Arbing M., Patel S., Hunt J., Inouye M., Phadtare S. 2010. Escherichia coli RNase R has dual activities, helicase and RNase. J. Bacteriol. 192:1344-1352.

22. Regnier P., Grunberg-Manago M., Portier C. 1987. Nucleotide sequence of the pnp gene of Escherichia coli encoding polynucleotide phosphorylase. Homology of the primary structure of the protein with the RNA-binding domain of ribosomal protein S1. J. Biol. Chem. 262:63-68.

23. Kimhi Y., Littauer U.Z. 1968. Purification and properties of polynucleotide phosphorylase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 243:231-240.

24. Shi Z., Yang W.Z., Lin-Chao S., Chak K.F., Yuan H.S. 2008. Crystal structure of Escherichia coli PNPase: central channel residues are involved in processive RNA degradation. RNA 14:2361-2371.

25. Thaller M.C., Schippa S., Bonci A., Cresti S., Rossolini G.M. 1997. Identification of the gene (aphA) encoding the class B acid phosphatase/phosphotransferase of Escherichia coli MG1655 and characterization of its product. FEMS Microbiol. Lett. 146:191-198.

26. Forleo C., Benvenuti M., Calderone V., Schippa S., Docquier J.D., Thaller M.C., Rossolini G.M., Mangani S. 2003. Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray characterization of the class B acid phosphatase (AphA) from Escherichia coli. Acta Crystallogr. D 59:1058-1060.

27. Shuttleworth H., Taylor J., Minton N. 1986. Sequence of the gene for alkaline phosphatase from Escherichia coli JM83. Nucleic Acids Res. 14:8689-8689.

28. Bradshaw R.A., Cancedda F., Ericsson L.H., Neumann P.A., Piccoli S.P., Schlesinger M.J., Shriefer K., Walsh K.A. 1981. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3473-3477.

29. Li C., Ichikawa J.K., Ravetto J.J., Kuo H.-C., Fu J.C., Clarke S. 1994. A new gene involved in stationary-phase survival located at 59 minutes on the Escherichia coli chromosome. J. Bacteriol. 176:6015-6022.

30. Kuznetsova E., Proudfoot M., Gonzalez C.F., Brown G., Omelchenko M.V., Borozan I., Carmel L., Wolf Y.I., Mori H., Savchenko A.V., Arrowsmith C.H., Koonin E.V., Edwards A.M., Yakunin A.F. 2006. Genome-wide analysis of substrate specificities of the Escherichia coli haloacid dehalogenase-like phosphatase family. J. Biol. Chem. 281:36149-36161.

31. Burns D.M., Beacham I.R. 1986. Nucleotide sequence and transcriptional analysis of the E. coli ushA gene, encoding periplasmic UDP-sugar hydrolase (5'-nucleotidase): regulation of the ushA gene, and the signal sequence of its encoded protein product. Nucleic Acids Res. 14:4325-4342.

32. Knoefel T., Straeter N. 1999. X-ray structure of the Escherichia coli periplasmic 5'-nucleotidase containing a dimetal catalytic site. Nat. Struct. Biol. 6:448-453.

33. Tremblay L.W., Dunaway-Mariano D., Allen K.N. 2006. Structure and activity analyses of Escherichia coli K-12 NagD provide insight into the evolution of biochemical function in the haloalkanoic acid dehalogenase superfamily. Biochemistry 45:1183-1193.

34. Golovan S., Wang G., Zhang J., Forsberg C.W. 2000. Characterization and overproduction of the Escherichia coli appA encoded bifunctional enzyme that exhibits both phytase and acid phosphatase activities. Can. J. Microbiol. 46:59-71.

35. Greiner R., Jany K.-D. 1991. Characterization of a phytase from Escherichia coli. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 372:664-665.

36. El Bakkouri M, Gutsche I, Kanjee U, Zhao B, Yu M, Goret G, Schoehn G, Burmeister WP, Houry WA. 2010. Structure of RavA MoxR AAA+ protein reveals the design principles of a molecular cage modulating the inducible lysine decarboxylase activity. Proc Natl Acad Sci U S A 107(52);22499-504. PMID: 21148420

37. Tchigvintsev A, Tchigvintsev D, Flick R, Popovic A, Dong A, Xu X, Brown G, Lu W, Wu H, Cui H, Dombrowski L, Joo JC, Beloglazova N, Min J, Savchenko A, Caudy AA, Rabinowitz JD, Murzin AG, Yakunin AF. 2013. Biochemical and structural studies of conserved maf proteins revealed nucleotide pyrophosphatases with a preference for modified nucleotides. Chem Biol 20(11);1386-98. PMID: 24210219

38. Zhang J., Inouye M. 2002. MazG, a nucleoside triphosphate pyrophosphohydrolase, interacts with Era, an essential GTPase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 184:5323-5329.

39. Smallshaw J.E., Kelln R.A. 1992. Cloning, nucleotide sequence and expression of the Escherichia coli K-12 pyrH gene encoding UMP kinase. Life Sci. Adv. (Genet.) 11:59-65.

40. Briozzo P., Evrin C., Meyer P., Assairi L., Joly N., Barzu O., Gilles A.-M. 2005.

Structure of Escherichia coli UMP kinase differs from that of other nucleoside monophosphate kinases and sheds new light on enzyme regulation. J. Biol. Chem. 280:25533-25540.

41. Masui R., Kurokawa K., Nakagawa N., Tokunaga F., Koyama Y., Shibata T., Oshima T., Yokoyama S., Yasunaga T., Kuramitsu S. Complete genome sequence of Thermus thermophilus HB8. Submitted (NOV-2004) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases.

42. Marco-Marin C., Escamilla-Honrubia J.M., Rubio V. 2005. First-time crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of a bacterial-archaeal type UMP kinase, a key enzyme in microbial pyrimidine biosynthesis. Biochim. Biophys. Acta 1747:271-275.

43. Marco-Marin C., Escamilla-Honrubia J.M., Rubio V. 2005. First-time crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of a bacterial-archaeal type UMP kinase, a key enzyme in microbial pyrimidine biosynthesis. Biochim. Biophys. Acta 1747:271-275.

44. Fricke J., Neuhard J., Kelln R.A., Pedersen S. 1995. The cmk gene encoding cytidine monophosphate kinase is located in the rpsA operon and is required for normal replication rate in Escherichia coli. J. Bacteriol. 177:517-523.

45. Briozzo P., Golinelli-Pimpaneau B., Gilles A.M., Gaucher J.F., Burlacu-Miron S., Sakamoto H., Janin J., Barzu O. 1998. Structures of Escherichia coli CMP kinase alone and in complex with CDP: a new fold of the nucleoside monophosphate binding domain and insights into cytosine nucleotide specificity. Structure 6:1517-1527.

46. Maeder D.L., Weiss R.B., Dunn D.M., Cherry J.L., Gonzalez J.M., DiRuggiero J., Robb F.T. 1999. Divergence of the hyperthermophilic archaea Pyrococcus furiosus and P. horikoshii inferred from complete genomic sequences. Genetics 152:1299-1305.

47. Gentry D, Bengra C, Ikehara K, Cashel M. 1993. Guanylate kinase of Escherichia coli K-12." J Biol Chem 1993;268(19);14316-21. PMID: 8390989.

48. Hible G, Daalova P, Gilles AM, Cherfils J. 2006. Crystal structures of GMP kinase in complex with ganciclovir monophosphate and Ap5G." Biochimie 88(9);1157-64. PMID: 16690197

49. Nelson K.E., Clayton R.A., Gill S.R., Gwinn M.L., Dodson R.J., Haft D.H., Hickey E.K., Peterson J.D., Nelson W.C., Ketchum K.A., McDonald L.A., Utterback T.R., Malek J.A., Linher K.D., Garrett M.M., Stewart A.M., Cotton M.D., Pratt M.S. Fraser C.M. 1999. Evidence for lateral gene transfer between Archaea and Bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima. Nature 399:323-329.

50. Brune M., Schumann R., Wittinghofer F. 1985. Cloning and sequencing of the adenylate kinase gene (adk) of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 13:7139-7151.

51. Berry M.B., Bae E., Bilderback T.R., Glaser M., Phillips G.N. Jr. 2006. Crystal structure of ADP/AMP complex of Escherichia coli adenylate kinase. Proteins 62:555-556.

52. Henne A., Brueggemann H., Raasch C., Wiezer A., Hartsch T., Liesegang H., Johann A., Lienard T., Gohl O., Martinez-Arias R., Jacobi C., Starkuviene V., Schlenczeck S., Dencker S., Huber R., Klenk H.-P., Kramer W., Merkl R., Gottschalk G., Fritz H.-J. 2004. The genome sequence of the extreme thermophile Thermus thermophilus. Nat. Biotechnol. 22:547-553.

53. Tan ZW, Liu J, Zhang XF, Meng FG, Zhang YZ.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2010. Expression, purification and enzymatic characterization of adenylate kinase of Thermus thermophilus HB27 in Escherichia coli..Jan;30(1):1-6

54. Moffatt B.A., Dunn J.J., Studier F.W. 1984. Nucleotide sequence of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol. 173:265-269.

55. Sousa R., Chung Y.J., Rose J.P., Wang B.-C. 1993. Crystal structure of bacteriophage T7 RNA polymerase at 3.3-A resolution. Nature 364:593-599.

56. Mindich L., Nemhauser I., Gottlieb P., Romantschuk M., Carton J., Frucht S., Strassman J., Bamford D.H., Kalkkinen N. 1988. Nucleotide sequence of the large double-stranded RNA segment of bacteriophage phi 6: genes specifying the viral replicase and transcriptase. J. Virol. 62:1180-1185.

57. McGraw N.J., Bailey J.N., Cleaves G.R., Dembinski D.R., Gocke C.R., Joliffe L.K., Macwright R.S., McAllister W.T. 1985. Sequence and analysis of the gene for bacteriophage T3 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 13:6753-6766.

58. Kotani H., Ishizaki Y., Hiraoka N., Obayashi A. 1987. Nucleotide sequence and expression of the cloned gene of bacteriophage SP6 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 15:2653-2664.

서열

이. 콜라이 RN아제 R

티. 엘롱가투스 Ppk (PPK1)

피. 푸리오수스 Umk

티. 써모필루스 Cmk

티. 마리티마 Gmk

티. 써모필루스 Adk

에이. 아에오리쿠스 Ndk

메이오써무스 루버 DM 1279 PPK2

메이오써무스 실바누스 DSM 9946 PPK2

데이노코쿠스 게오써말리스 DSM 11300 PPK2

써모시네코코쿠스 엘롱가투스 BP-1 PPK2

아나에로리네아 써모필라 UNI-1 PPK2

칼디리네아 아에로필라 DSM 14535 PPK2

클로로바쿨룸 테피둠 TLS PPK2

오세아니써무스 프로푼두스 DSM 14977 PPK2

로세이플렉수스 카스텐홀치이 DSM 13941 PPK2

로세이플렉수스 종 RS-1 PPK2

트루에페라 라디오빅트릭스 DSM 17093 PPK2

SEQUENCE LISTING <110> GreenLight Biosciences, Inc. <120> CELL-FREE PRODUCTION OF RIBONUCLEIC ACID <130> G0830.70020WO00 <140> Not Yet Assigned <141> 2017-04-06 <150> US 62/452,550 <151> 2017-01-31 <150> US 62/319,220 <151> 2016-04-06 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 813 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ser Gln Asp Pro Phe Gln Glu Arg Glu Ala Glu Lys Tyr Ala Asn 1 5 10 15 Pro Ile Pro Ser Arg Glu Phe Ile Leu Glu His Leu Thr Lys Arg Glu 20 25 30 Lys Pro Ala Ser Arg Asp Glu Leu Ala Val Glu Leu His Ile Glu Gly 35 40 45 Glu Glu Gln Leu Glu Gly Leu Arg Arg Arg Leu Arg Ala Met Glu Arg 50 55 60 Asp Gly Gln Leu Val Phe Thr Arg Arg Gln Cys Tyr Ala Leu Pro Glu 65 70 75 80 Arg Leu Asp Leu Val Lys Gly Thr Val Ile Gly His Arg Asp Gly Tyr 85 90 95 Gly Phe Leu Arg Val Glu Gly Arg Lys Asp Asp Leu Tyr Leu Ser Ser 100 105 110 Glu Gln Met Lys Thr Cys Ile His Gly Asp Gln Val Leu Ala Gln Pro 115 120 125 Leu Gly Ala Asp Arg Lys Gly Arg Arg Glu Ala Arg Ile Val Arg Val 130 135 140 Leu Val Pro Lys Thr Ser Gln Ile Val Gly Arg Tyr Phe Thr Glu Ala 145 150 155 160 Gly Val Gly Phe Val Val Pro Asp Asp Ser Arg Leu Ser Phe Asp Ile 165 170 175 Leu Ile Pro Pro Asp Gln Ile Met Gly Ala Arg Met Gly Phe Val Val 180 185 190 Val Val Glu Leu Thr Gln Arg Pro Thr Arg Arg Thr Lys Ala Val Gly 195 200 205 Lys Ile Val Glu Val Leu Gly Asp Asn Met Gly Thr Gly Met Ala Val 210 215 220 Asp Ile Ala Leu Arg Thr His Glu Ile Pro Tyr Ile Trp Pro Gln Ala 225 230 235 240 Val Glu Gln Gln Val Ala Gly Leu Lys Glu Glu Val Pro Glu Glu Ala 245 250 255 Lys Ala Gly Arg Val Asp Leu Arg Asp Leu Pro Leu Val Thr Ile Asp 260 265 270 Gly Glu Asp Ala Arg Asp Phe Asp Asp Ala Val Tyr Cys Glu Lys Lys 275 280 285 Arg Gly Gly Gly Trp Arg Leu Trp Val Ala Ile Ala Asp Val Ser Tyr 290 295 300 Tyr Val Arg Pro Ser Thr Pro Leu Asp Arg Glu Ala Arg Asn Arg Gly 305 310 315 320 Thr Ser Val Tyr Phe Pro Ser Gln Val Ile Pro Met Leu Pro Glu Val 325 330 335 Leu Ser Asn Gly Leu Cys Ser Leu Asn Pro Gln Val Asp Arg Leu Cys 340 345 350 Met Val Cys Glu Met Thr Val Ser Ser Lys Gly Arg Leu Thr Gly Tyr 355 360 365 Lys Phe Tyr Glu Ala Val Met Ser Ser His Ala Arg Leu Thr Tyr Thr 370 375 380 Lys Val Trp His Ile Leu Gln Gly Asp Gln Asp Leu Arg Glu Gln Tyr 385 390 395 400 Ala Pro Leu Val Lys His Leu Glu Glu Leu His Asn Leu Tyr Lys Val 405 410 415 Leu Asp Lys Ala Arg Glu Glu Arg Gly Gly Ile Ser Phe Glu Ser Glu 420 425 430 Glu Ala Lys Phe Ile Phe Asn Ala Glu Arg Arg Ile Glu Arg Ile Glu 435 440 445 Gln Thr Gln Arg Asn Asp Ala His Lys Leu Ile Glu Glu Cys Met Ile 450 455 460 Leu Ala Asn Ile Ser Ala Ala Arg Phe Val Glu Lys Ala Lys Glu Pro 465 470 475 480 Ala Leu Phe Arg Ile His Asp Lys Pro Ser Thr Glu Ala Ile Thr Ser 485 490 495 Phe Arg Ser Val Leu Ala Glu Leu Gly Leu Glu Leu Pro Gly Gly Asn 500 505 510 Lys Pro Glu Pro Arg Asp Tyr Ala Glu Leu Leu Glu Ser Val Ala Asp 515 520 525 Arg Pro Asp Ala Glu Met Leu Gln Thr Met Leu Leu Arg Ser Met Lys 530 535 540 Gln Ala Ile Tyr Asp Pro Glu Asn Arg Gly His Phe Gly Leu Ala Leu 545 550 555 560 Gln Ser Tyr Ala His Phe Thr Ser Pro Ile Arg Arg Tyr Pro Asp Leu 565 570 575 Thr Leu His Arg Ala Ile Lys Tyr Leu Leu Ala Lys Glu Gln Gly His 580 585 590 Gln Gly Asn Thr Thr Glu Thr Gly Gly Tyr His Tyr Ser Met Glu Glu 595 600 605 Met Leu Gln Leu Gly Gln His Cys Ser Met Ala Glu Arg Arg Ala Asp 610 615 620 Glu Ala Thr Arg Asp Val Ala Asp Trp Leu Lys Cys Asp Phe Met Leu 625 630 635 640 Asp Gln Val Gly Asn Val Phe Lys Gly Val Ile Ser Ser Val Thr Gly 645 650 655 Phe Gly Phe Phe Val Arg Leu Asp Asp Leu Phe Ile Asp Gly Leu Val 660 665 670 His Val Ser Ser Leu Asp Asn Asp Tyr Tyr Arg Phe Asp Gln Val Gly 675 680 685 Gln Arg Leu Met Gly Glu Ser Ser Gly Gln Thr Tyr Arg Leu Gly Asp 690 695 700 Arg Val Glu Val Arg Val Glu Ala Val Asn Met Asp Glu Arg Lys Ile 705 710 715 720 Asp Phe Ser Leu Ile Ser Ser Glu Arg Ala Pro Arg Asn Val Gly Lys 725 730 735 Thr Ala Arg Glu Lys Ala Lys Lys Gly Asp Ala Gly Lys Lys Gly Gly 740 745 750 Lys Arg Arg Gln Val Gly Lys Lys Val Asn Phe Glu Pro Asp Ser Ala 755 760 765 Phe Arg Gly Glu Lys Lys Thr Lys Pro Lys Ala Ala Lys Lys Asp Ala 770 775 780 Arg Lys Ala Lys Lys Pro Ser Ala Lys Thr Gln Lys Ile Ala Ala Ala 785 790 795 800 Thr Lys Ala Lys Arg Ala Ala Lys Lys Lys Val Ala Glu 805 810 <210> 2 <211> 732 <212> PRT <213> Thermosynechococcus elongatus <400> 2 Met Pro Ser Ala Lys Ser Pro Arg Arg Lys Ala Pro Glu Pro Ile Asp 1 5 10 15 Leu Asp Asn Pro Gln Tyr Tyr Phe Asn Arg Ser Leu Ser Trp Leu Glu 20 25 30 Phe Asn Lys Arg Val Leu His Glu Ala Tyr Asp Pro Arg Thr Pro Leu 35 40 45 Leu Glu Arg Leu Lys Phe Met Ala Ile Phe Ser Ser Asn Leu Asp Glu 50 55 60 Phe Phe Met Val Arg Val Ala Gly Leu Lys Gln Gln Val Glu Ser Gly 65 70 75 80 Ile Leu Gln Val Gly Ala Asp Gly Met Pro Pro Ala Glu Gln Leu Gln 85 90 95 Ala Val Arg Gln Tyr Leu Leu Pro Ile Val Thr Glu Gln His Arg Tyr 100 105 110 Phe Asp Gln Glu Leu Arg Ala Leu Leu Ala Lys Glu Ser Ile Phe Leu 115 120 125 Thr Arg Phe Asn Glu Leu Thr Pro Glu Gln Gln Ala Tyr Leu Asn Asp 130 135 140 Tyr Phe Gln Ala Gln Val Phe Pro Val Leu Thr Pro Leu Ala Val Asp 145 150 155 160 Pro Ala His Pro Phe Pro Tyr Ile Ser Ser Leu Ser Leu Asn Leu Ala 165 170 175 Val Leu Ile Arg Asp Pro Glu Ser Gly Gln Glu Arg Leu Ala Arg Val 180 185 190 Lys Val Pro Asn Gln Phe Pro Arg Phe Val Ala Leu Pro Gln His Leu 195 200 205 His Ser Pro Gln Gly Val His Trp Leu Gly Val Pro Leu Glu Glu Ile 210 215 220 Ile Ala His Asn Leu Ser Ala Leu Phe Pro Gly Met Glu Ile Glu Ala 225 230 235 240 Tyr Phe Ala Phe Arg Ile Thr Arg Ser Ala Asp Leu Glu Leu Glu Thr 245 250 255 Asp Lys Ala Asp Asp Leu Leu Ile Ala Ile Glu Gln Glu Ile Arg Lys 260 265 270 Arg Arg Phe Gly Ser Val Val Arg Leu Glu Val Gln Arg Gly Ile Pro 275 280 285 Pro Leu Leu Arg Gln Thr Leu Met Glu Glu Met Asp Leu Glu Glu Ile 290 295 300 Asp Val Tyr Glu Leu Glu Gly Leu Leu Cys Leu Asn Asp Leu Phe Ala 305 310 315 320 Phe Met Gly Leu Pro Leu Pro Gln Phe Lys Asp Pro Glu Trp Gln Pro 325 330 335 Gln Val Pro Pro Ser Phe Gln Arg Val Glu Glu Arg Glu Ser Met Phe 340 345 350 Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Leu Gly Thr Asp Tyr Trp Glu Ala 355 360 365 Val Ala Asn Glu Leu Phe Ser Leu Ile Arg Glu Gly Asp Ile Ile Val 370 375 380 His His Pro Tyr His Ser Phe Ala Ala Thr Val Gln Arg Phe Ile Thr 385 390 395 400 Leu Ala Ala His Asp Pro Gln Val Leu Ala Ile Lys Ile Thr Leu Tyr 405 410 415 Arg Thr Ser Gly Asp Ser Pro Ile Val Ser Ala Leu Ile Lys Ala Ala 420 425 430 Glu Asn Gly Lys Gln Val Ala Val Leu Val Glu Leu Lys Ala Arg Phe 435 440 445 Asp Glu Glu Asn Asn Ile Leu Trp Ala Arg Lys Leu Glu Lys Val Gly 450 455 460 Val His Val Val Tyr Gly Val Pro Gly Leu Lys Thr His Thr Lys Thr 465 470 475 480 Val Leu Val Val Arg Gln Glu Ala Gly Gln Ile Arg Arg Tyr Val His 485 490 495 Ile Gly Thr Gly Asn Tyr Asn Pro Lys Thr Ala Ser Leu Tyr Glu Asp 500 505 510 Leu Gly Leu Phe Ser Cys Arg Glu Glu Leu Gly Ala Asp Leu Ser Glu 515 520 525 Leu Phe Asn Val Leu Thr Gly Tyr Ala Arg Gln Arg Asp Tyr Arg Lys 530 535 540 Leu Leu Val Ala Pro Val Thr Met Arg Asp Arg Thr Leu Gln Leu Ile 545 550 555 560 Tyr Arg Glu Ile Glu His Ala Arg Asn Gly Gln Pro Ala Arg Ile Ile 565 570 575 Ala Lys Met Asn Ala Ile Thr Asp Thr Gln Val Ile Arg Ala Leu Tyr 580 585 590 Glu Ala Ser Gln Ala Gly Val Asp Ile Asp Leu Ile Ile Arg Gly Met 595 600 605 Cys Cys Leu Arg Pro Gly Val Pro Gly Val Ser Asp Arg Ile Arg Val 610 615 620 Ile Ser Ile Ile Gly Arg Phe Leu Glu His Ser Arg Ile Phe Tyr Phe 625 630 635 640 Gly Asn Asn Gly Asp Pro Glu Tyr Tyr Ile Gly Ser Ala Asp Trp Arg 645 650 655 Ser Arg Asn Leu Asp Arg Arg Val Glu Ala Ile Thr Pro Ile Glu Asp 660 665 670 Pro Ala Ile Gln Leu Glu Leu Lys Glu Arg Leu Glu Ile Met Leu Ala 675 680 685 Asp Asn Arg Gln Ala Trp Glu Leu Gln Pro Asp Gly Thr Tyr Arg Gln 690 695 700 Arg Gln Pro Ala Pro Gly Glu Ala Glu Arg Gly Thr His Ser Val Leu 705 710 715 720 Met Ala Arg Thr Leu Lys Asp Val Gln Gly Ser His 725 730 <210> 3 <211> 225 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 3 Met Arg Ile Val Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Leu Val Pro Glu Asn 1 5 10 15 Pro Asp Ile Asp Phe Ile Lys Glu Ile Ala Tyr Gln Leu Thr Lys Val 20 25 30 Ser Glu Asp His Glu Val Ala Val Val Val Gly Gly Gly Lys Leu Ala 35 40 45 Arg Lys Tyr Ile Glu Val Ala Glu Lys Phe Asn Ser Ser Glu Thr Phe 50 55 60 Lys Asp Phe Ile Gly Ile Gln Ile Thr Arg Ala Asn Ala Met Leu Leu 65 70 75 80 Ile Ala Ala Leu Arg Glu Lys Ala Tyr Pro Val Val Val Glu Asp Phe 85 90 95 Trp Glu Ala Trp Lys Ala Val Gln Leu Lys Lys Ile Pro Val Met Gly 100 105 110 Gly Thr His Pro Gly His Thr Thr Asp Ala Val Ala Ala Leu Leu Ala 115 120 125 Glu Phe Leu Lys Ala Asp Leu Leu Val Val Ile Thr Asn Val Asp Gly 130 135 140 Val Tyr Thr Ala Asp Pro Lys Lys Asp Pro Thr Ala Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 Lys Met Lys Pro Glu Glu Leu Leu Glu Ile Val Gly Lys Gly Ile Glu 165 170 175 Lys Ala Gly Ser Ser Ser Val Ile Asp Pro Leu Ala Ala Lys Ile Ile 180 185 190 Ala Arg Ser Gly Ile Lys Thr Ile Val Ile Gly Lys Glu Asp Ala Lys 195 200 205 Asp Leu Phe Arg Val Ile Lys Gly Asp His Asn Gly Thr Thr Ile Glu 210 215 220 Pro 225 <210> 4 <211> 208 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 4 Met Arg Gly Ile Val Thr Ile Asp Gly Pro Ser Ala Ser Gly Lys Ser 1 5 10 15 Ser Val Ala Arg Arg Val Ala Ala Ala Leu Gly Val Pro Tyr Leu Ser 20 25 30 Ser Gly Leu Leu Tyr Arg Ala Ala Ala Phe Leu Ala Leu Arg Ala Gly 35 40 45 Val Asp Pro Gly Asp Glu Glu Gly Leu Leu Ala Leu Leu Glu Gly Leu 50 55 60 Gly Val Arg Leu Leu Ala Gln Ala Glu Gly Asn Arg Val Leu Ala Asp 65 70 75 80 Gly Glu Asp Leu Thr Ser Phe Leu His Thr Pro Glu Val Asp Arg Val 85 90 95 Val Ser Ala Val Ala Arg Leu Pro Gly Val Arg Ala Trp Val Asn Arg 100 105 110 Arg Leu Lys Glu Val Pro Pro Pro Phe Val Ala Glu Gly Arg Asp Met 115 120 125 Gly Thr Ala Val Phe Pro Glu Ala Ala His Lys Phe Tyr Leu Thr Ala 130 135 140 Ser Pro Glu Val Arg Ala Trp Arg Arg Ala Arg Glu Arg Pro Gln Ala 145 150 155 160 Tyr Glu Glu Val Leu Arg Asp Leu Leu Arg Arg Asp Glu Arg Asp Lys 165 170 175 Ala Gln Ser Ala Pro Ala Pro Asp Ala Leu Val Leu Asp Thr Gly Gly 180 185 190 Met Thr Leu Asp Glu Val Val Ala Trp Val Leu Ala His Ile Arg Arg 195 200 205 <210> 5 <211> 207 <212> PRT <213> Thermatoga maritima <400> 5 Met Lys Gly Gln Leu Phe Val Ile Cys Gly Pro Ser Gly Ala Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ser Ile Ile Lys Glu Val Leu Lys Arg Leu Asp Asn Val Val Phe 20 25 30 Ser Val Ser Cys Thr Thr Arg Pro Lys Arg Pro His Glu Glu Asp Gly 35 40 45 Lys Asp Tyr Phe Phe Ile Thr Glu Glu Glu Phe Leu Lys Arg Val Glu 50 55 60 Arg Gly Glu Phe Leu Glu Trp Ala Arg Val His Gly His Leu Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Leu Arg Ser Phe Val Glu Ser His Ile Asn Glu Gly Lys Asp Val 85 90 95 Val Leu Asp Ile Asp Val Gln Gly Ala Leu Ser Val Lys Lys Lys Tyr 100 105 110 Ser Asn Thr Val Phe Ile Tyr Val Ala Pro Pro Ser Tyr Ala Asp Leu 115 120 125 Arg Glu Arg Ile Leu Lys Arg Gly Thr Glu Lys Glu Ala Asp Val Leu 130 135 140 Val Arg Leu Glu Asn Ala Lys Trp Glu Leu Met Phe Met Asp Glu Phe 145 150 155 160 Asp Tyr Ile Val Val Asn Glu Asn Leu Glu Asp Ala Val Glu Met Val 165 170 175 Val Ser Ile Val Arg Ser Glu Arg Ala Lys Val Thr Arg Asn Gln Asp 180 185 190 Lys Ile Glu Arg Phe Lys Met Glu Val Lys Gly Trp Lys Lys Leu 195 200 205 <210> 6 <211> 186 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 6 Met Asp Val Gly Gln Ala Val Ile Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly 1 5 10 15 Lys Gly Thr Gln Ala Ser Arg Leu Ala Gln Glu Leu Gly Phe Lys Lys 20 25 30 Leu Ser Thr Gly Asp Ile Leu Arg Asp His Val Ala Arg Gly Thr Pro 35 40 45 Leu Gly Glu Arg Val Arg Pro Ile Met Glu Arg Gly Asp Leu Val Pro 50 55 60 Asp Asp Leu Ile Leu Glu Leu Ile Arg Glu Glu Leu Ala Glu Arg Val 65 70 75 80 Ile Phe Asp Gly Phe Pro Arg Thr Leu Ala Gln Ala Glu Ala Leu Asp 85 90 95 Arg Leu Leu Ser Glu Thr Gly Thr Arg Leu Leu Gly Val Val Leu Val 100 105 110 Glu Val Pro Glu Glu Glu Leu Val Arg Arg Ile Leu Arg Arg Ala Glu 115 120 125 Leu Glu Gly Arg Ser Asp Asp Asn Glu Glu Thr Val Arg Arg Arg Leu 130 135 140 Glu Val Tyr Arg Glu Lys Thr Glu Pro Leu Val Gly Tyr Tyr Glu Ala 145 150 155 160 Arg Gly Val Leu Lys Arg Val Asp Gly Leu Gly Thr Pro Asp Glu Val 165 170 175 Tyr Ala Arg Ile Arg Ala Ala Leu Gly Ile 180 185 <210> 7 <211> 142 <212> PRT <213> Aquifex aeolicus <400> 7 Met Ala Val Glu Arg Thr Leu Ile Ile Val Lys Pro Asp Ala Met Glu 1 5 10 15 Lys Gly Ala Leu Gly Lys Ile Leu Asp Arg Phe Ile Gln Glu Gly Phe 20 25 30 Gln Ile Lys Ala Leu Lys Met Phe Arg Phe Thr Pro Glu Lys Ala Gly 35 40 45 Glu Phe Tyr Tyr Val His Arg Glu Arg Pro Phe Phe Gln Glu Leu Val 50 55 60 Glu Phe Met Ser Ser Gly Pro Val Val Ala Ala Val Leu Glu Gly Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ile Lys Arg Val Arg Glu Ile Ile Gly Pro Thr Asp Ser Glu 85 90 95 Glu Ala Arg Lys Val Ala Pro Asn Ser Ile Arg Ala Gln Phe Gly Thr 100 105 110 Asp Lys Gly Lys Asn Ala Ile His Ala Ser Asp Ser Pro Glu Ser Ala 115 120 125 Gln Tyr Glu Ile Cys Phe Ile Phe Ser Gly Leu Glu Ile Val 130 135 140 <210> 8 <211> 280 <212> PRT <213> Meiothermus ruber <400> 8 Met Gly Phe Cys Ser Ile Glu Phe Leu Met Gly Ala Gln Met Lys Lys 1 5 10 15 Tyr Arg Val Gln Pro Asp Gly Arg Phe Glu Leu Lys Arg Phe Asp Pro 20 25 30 Asp Asp Thr Ser Ala Phe Glu Gly Gly Lys Gln Ala Ala Leu Glu Ala 35 40 45 Leu Ala Val Leu Asn Arg Arg Leu Glu Lys Leu Gln Glu Leu Leu Tyr 50 55 60 Ala Glu Gly Gln His Lys Val Leu Val Val Leu Gln Ala Met Asp Ala 65 70 75 80 Gly Gly Lys Asp Gly Thr Ile Arg Val Val Phe Asp Gly Val Asn Pro 85 90 95 Ser Gly Val Arg Val Ala Ser Phe Gly Val Pro Thr Glu Gln Glu Leu 100 105 110 Ala Arg Asp Tyr Leu Trp Arg Val His Gln Gln Val Pro Arg Lys Gly 115 120 125 Glu Leu Val Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu Val Val 130 135 140 Arg Val Lys Asn Leu Val Pro Gln Gln Val Trp Gln Lys Arg Tyr Arg 145 150 155 160 His Ile Arg Glu Phe Glu Arg Met Leu Ala Asp Glu Gly Thr Thr Ile 165 170 175 Leu Lys Phe Phe Leu His Ile Ser Lys Asp Glu Gln Arg Gln Arg Leu 180 185 190 Gln Glu Arg Leu Asp Asn Pro Glu Lys Arg Trp Lys Phe Arg Met Gly 195 200 205 Asp Leu Glu Asp Arg Arg Leu Trp Asp Arg Tyr Gln Glu Ala Tyr Glu 210 215 220 Ala Ala Ile Arg Glu Thr Ser Thr Glu Tyr Ala Pro Trp Tyr Val Ile 225 230 235 240 Pro Ala Asn Lys Asn Trp Tyr Arg Asn Trp Leu Val Ser His Ile Leu 245 250 255 Val Glu Thr Leu Glu Gly Leu Ala Met Gln Tyr Pro Gln Pro Glu Thr 260 265 270 Ala Ser Glu Lys Ile Val Ile Glu 275 280 <210> 9 <211> 268 <212> PRT <213> Meiothermus silvanus <400> 9 Met Ala Lys Thr Ile Gly Ala Thr Leu Asn Leu Gln Asp Ile Asp Pro 1 5 10 15 Arg Ser Thr Pro Gly Phe Asn Gly Asp Lys Glu Lys Ala Leu Ala Leu 20 25 30 Leu Glu Lys Leu Thr Ala Arg Leu Asp Glu Leu Gln Glu Gln Leu Tyr 35 40 45 Ala Glu His Gln His Arg Val Leu Val Ile Leu Gln Gly Met Asp Thr 50 55 60 Ser Gly Lys Asp Gly Thr Ile Arg His Val Phe Lys Asn Val Asp Pro 65 70 75 80 Leu Gly Val Arg Val Val Ala Phe Lys Ala Pro Thr Pro Pro Glu Leu 85 90 95 Glu Arg Asp Tyr Leu Trp Arg Val His Gln His Val Pro Ala Asn Gly 100 105 110 Glu Leu Val Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu Val Ala 115 120 125 Arg Val His Asn Leu Val Pro Pro Ala Ile Trp Ser Arg Arg Tyr Asp 130 135 140 His Ile Asn Ala Phe Glu Lys Met Leu Val Asp Glu Gly Thr Thr Val 145 150 155 160 Leu Lys Phe Phe Leu His Ile Ser Lys Glu Glu Gln Lys Lys Arg Leu 165 170 175 Leu Glu Arg Leu Val Glu Ala Asp Lys His Trp Lys Phe Asp Pro Gln 180 185 190 Asp Leu Val Glu Arg Gly Tyr Trp Glu Asp Tyr Met Glu Ala Tyr Gln 195 200 205 Asp Val Leu Asp Lys Thr His Thr Gln Tyr Ala Pro Trp His Val Ile 210 215 220 Pro Ala Asp Arg Lys Trp Tyr Arg Asn Leu Gln Val Ser Arg Leu Leu 225 230 235 240 Val Glu Ala Leu Glu Gly Leu Arg Met Lys Tyr Pro Arg Pro Lys Leu 245 250 255 Asn Ile Pro Arg Leu Lys Ser Glu Leu Glu Lys Met 260 265 <210> 10 <211> 266 <212> PRT <213> Deinococcus geothermalis <400> 10 Met Gln Leu Asp Arg Tyr Arg Val Pro Pro Gly Gln Arg Val Arg Leu 1 5 10 15 Ser Asn Trp Pro Thr Asp Asp Asp Gly Gly Leu Ser Lys Ala Glu Gly 20 25 30 Glu Ala Leu Leu Pro Asp Leu Gln Gln Arg Leu Ala Asn Leu Gln Glu 35 40 45 Arg Leu Tyr Ala Glu Ser Gln Gln Ala Leu Leu Ile Val Leu Gln Ala 50 55 60 Arg Asp Ala Gly Gly Lys Asp Gly Thr Val Lys His Val Ile Gly Ala 65 70 75 80 Phe Asn Pro Ser Gly Val Gln Val Ser Asn Phe Lys Val Pro Thr Glu 85 90 95 Glu Glu Arg Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Ile His Arg Gln Thr Pro 100 105 110 Arg Leu Gly Met Ile Gly Val Phe Asn Arg Ser Gln Tyr Glu Asp Val 115 120 125 Leu Val Thr Arg Val His His Leu Ile Asp Asp Gln Thr Ala Gln Arg 130 135 140 Arg Leu Lys His Ile Cys Ala Phe Glu Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly 145 150 155 160 Thr Arg Ile Val Lys Phe Tyr Leu His Ile Ser Pro Glu Glu Gln Lys 165 170 175 Lys Arg Leu Glu Ala Arg Leu Ala Asp Pro Ser Lys His Trp Lys Phe 180 185 190 Asn Pro Gly Asp Leu Gln Glu Arg Ala His Trp Asp Ala Tyr Thr Ala 195 200 205 Val Tyr Glu Asp Val Leu Thr Thr Ser Thr Pro Ala Ala Pro Trp Tyr 210 215 220 Val Val Pro Ala Asp Arg Lys Trp Phe Arg Asn Leu Leu Val Ser Gln 225 230 235 240 Ile Leu Val Gln Thr Leu Glu Glu Met Asn Pro Gln Phe Pro Ala Pro 245 250 255 Ala Phe Asn Ala Ala Asp Leu Arg Ile Val 260 265 <210> 11 <211> 300 <212> PRT <213> Thermosynechococcus elongatus <400> 11 Met Ile Pro Gln Asp Phe Leu Asp Glu Ile Asn Pro Asp Arg Tyr Ile 1 5 10 15 Val Pro Ala Gly Gly Asn Phe His Trp Lys Asp Tyr Asp Pro Gly Asp 20 25 30 Thr Ala Gly Leu Lys Ser Lys Val Glu Ala Gln Glu Leu Leu Ala Ala 35 40 45 Gly Ile Lys Lys Leu Ala Ala Tyr Gln Asp Val Leu Tyr Ala Gln Asn 50 55 60 Ile Tyr Gly Leu Leu Ile Ile Phe Gln Ala Met Asp Ala Ala Gly Lys 65 70 75 80 Asp Ser Thr Ile Lys His Val Met Ser Gly Leu Asn Pro Gln Ala Cys 85 90 95 Arg Val Tyr Ser Phe Lys Ala Pro Ser Ala Glu Glu Leu Asp His Asp 100 105 110 Phe Leu Trp Arg Ala Asn Arg Ala Leu Pro Glu Arg Gly Cys Ile Gly 115 120 125 Ile Phe Asn Arg Ser Tyr Tyr Glu Glu Val Leu Val Val Arg Val His 130 135 140 Pro Asp Leu Leu Asn Arg Gln Gln Leu Pro Pro Glu Thr Lys Thr Lys 145 150 155 160 His Ile Trp Lys Glu Arg Phe Glu Asp Ile Asn His Tyr Glu Arg Tyr 165 170 175 Leu Thr Arg Asn Gly Ile Leu Ile Leu Lys Phe Phe Leu His Ile Ser 180 185 190 Lys Ala Glu Gln Lys Lys Arg Phe Leu Glu Arg Ile Ser Arg Pro Glu 195 200 205 Lys Asn Trp Lys Phe Ser Ile Glu Asp Val Arg Asp Arg Ala His Trp 210 215 220 Asp Asp Tyr Gln Gln Ala Tyr Ala Asp Val Phe Arg His Thr Ser Thr 225 230 235 240 Lys Trp Ala Pro Trp His Ile Ile Pro Ala Asn His Lys Trp Phe Ala 245 250 255 Arg Leu Met Val Ala His Phe Ile Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Leu Asn 260 265 270 Leu His Tyr Pro Met Leu Ser Glu Ala His Arg Glu Gln Leu Leu Glu 275 280 285 Ala Lys Ala Leu Leu Glu Asn Glu Pro Asp Glu Asp 290 295 300 <210> 12 <211> 281 <212> PRT <213> Anaerolinea thermophila <400> 12 Met Gly Glu Ala Met Glu Arg Tyr Phe Ile Lys Pro Gly Glu Lys Val 1 5 10 15 Arg Leu Lys Asp Trp Ser Pro Asp Pro Pro Lys Asp Phe Glu Gly Asp 20 25 30 Lys Glu Ser Thr Arg Ala Ala Val Ala Glu Leu Asn Arg Lys Leu Glu 35 40 45 Val Leu Gln Glu Arg Leu Tyr Ala Glu Arg Lys His Lys Val Leu Val 50 55 60 Ile Leu Gln Gly Met Asp Thr Ser Gly Lys Asp Gly Val Ile Arg Ser 65 70 75 80 Val Phe Glu Gly Val Asn Pro Gln Gly Val Lys Val Ala Asn Phe Lys 85 90 95 Val Pro Thr Gln Glu Glu Leu Asp His Asp Tyr Leu Trp Arg Val His 100 105 110 Lys Val Val Pro Gly Lys Gly Glu Ile Val Ile Phe Asn Arg Ser His 115 120 125 Tyr Glu Asp Val Leu Val Val Arg Val His Asn Leu Val Pro Pro Glu 130 135 140 Val Trp Lys Lys Arg Tyr Glu Gln Ile Asn Gln Phe Glu Arg Leu Leu 145 150 155 160 His Glu Thr Gly Thr Thr Ile Leu Lys Phe Phe Leu Phe Ile Ser Arg 165 170 175 Glu Glu Gln Lys Gln Arg Leu Leu Glu Arg Leu Ala Asp Pro Ala Lys 180 185 190 His Trp Lys Phe Asn Pro Gly Asp Leu Lys Glu Arg Ala Leu Trp Glu 195 200 205 Glu Tyr Glu Lys Ala Tyr Glu Asp Val Leu Ser Arg Thr Ser Thr Glu 210 215 220 Tyr Ala Pro Trp Ile Leu Val Pro Ala Asp Lys Lys Trp Tyr Arg Asp 225 230 235 240 Trp Val Ile Ser Arg Val Leu Val Glu Thr Leu Glu Gly Leu Glu Ile 245 250 255 Gln Leu Pro Pro Pro Leu Ala Asp Ala Glu Thr Tyr Arg Arg Gln Leu 260 265 270 Leu Glu Glu Asp Ala Pro Glu Ser Arg 275 280 <210> 13 <211> 270 <212> PRT <213> Caldilinea aerophila <400> 13 Met Asp Val Asp Arg Tyr Arg Val Pro Pro Gly Ser Thr Ile His Leu 1 5 10 15 Ser Gln Trp Pro Pro Asp Asp Arg Ser Leu Tyr Glu Gly Asp Lys Lys 20 25 30 Gln Gly Lys Gln Asp Leu Ser Ala Leu Asn Arg Arg Leu Glu Thr Leu 35 40 45 Gln Glu Leu Leu Tyr Ala Glu Gly Lys His Lys Val Leu Ile Ile Leu 50 55 60 Gln Gly Met Asp Thr Ser Gly Lys Asp Gly Val Ile Arg His Val Phe 65 70 75 80 Asn Gly Val Asn Pro Gln Gly Val Lys Val Ala Ser Phe Lys Val Pro 85 90 95 Thr Ala Val Glu Leu Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Ile His Arg Gln 100 105 110 Thr Pro Gly Ser Gly Glu Ile Val Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu 115 120 125 Asp Val Leu Val Val Arg Val His Gly Leu Val Pro Pro Glu Val Trp 130 135 140 Ala Arg Arg Tyr Glu His Ile Asn Ala Phe Glu Lys Leu Leu Val Asp 145 150 155 160 Glu Gly Thr Thr Ile Leu Lys Phe Phe Leu His Ile Ser Lys Glu Glu 165 170 175 Gln Arg Gln Arg Leu Leu Glu Arg Leu Glu Met Pro Glu Lys Arg Trp 180 185 190 Lys Phe Ser Val Gly Asp Leu Ala Glu Arg Lys Arg Trp Asp Glu Tyr 195 200 205 Met Ala Ala Tyr Glu Ala Val Leu Ser Lys Thr Ser Thr Glu Tyr Ala 210 215 220 Pro Trp Tyr Ile Val Pro Ser Asp Arg Lys Trp Tyr Arg Asn Leu Val 225 230 235 240 Ile Ser His Val Ile Ile Asn Ala Leu Glu Gly Leu Asn Met Arg Tyr 245 250 255 Pro Gln Pro Glu Asp Ile Ala Phe Asp Thr Ile Val Ile Glu 260 265 270 <210> 14 <211> 294 <212> PRT <213> Chlorobaculum tepidum <400> 14 Met Lys Leu Asp Leu Asp Ala Phe Arg Ile Gln Pro Gly Lys Lys Pro 1 5 10 15 Asn Leu Ala Lys Arg Pro Thr Arg Ile Asp Pro Val Tyr Arg Ser Lys 20 25 30 Gly Glu Tyr His Glu Leu Leu Ala Asn His Val Ala Glu Leu Ser Lys 35 40 45 Leu Gln Asn Val Leu Tyr Ala Asp Asn Arg Tyr Ala Ile Leu Leu Ile 50 55 60 Phe Gln Ala Met Asp Ala Ala Gly Lys Asp Ser Ala Ile Lys His Val 65 70 75 80 Met Ser Gly Val Asn Pro Gln Gly Cys Gln Val Tyr Ser Phe Lys His 85 90 95 Pro Ser Ala Thr Glu Leu Glu His Asp Phe Leu Trp Arg Thr Asn Cys 100 105 110 Val Leu Pro Glu Arg Gly Arg Ile Gly Ile Phe Asn Arg Ser Tyr Tyr 115 120 125 Glu Glu Val Leu Val Val Arg Val His Pro Glu Ile Leu Glu Met Gln 130 135 140 Asn Ile Pro His Asn Leu Ala His Asn Gly Lys Val Trp Asp His Arg 145 150 155 160 Tyr Arg Ser Ile Val Ser His Glu Gln His Leu His Cys Asn Gly Thr 165 170 175 Arg Ile Val Lys Phe Tyr Leu His Leu Ser Lys Glu Glu Gln Arg Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Glu Arg Ile Asp Asp Pro Asn Lys Asn Trp Lys Phe Ser 195 200 205 Thr Ala Asp Leu Glu Glu Arg Lys Phe Trp Asp Gln Tyr Met Glu Ala 210 215 220 Tyr Glu Ser Cys Leu Gln Glu Thr Ser Thr Lys Asp Ser Pro Trp Phe 225 230 235 240 Ala Val Pro Ala Asp Asp Lys Lys Asn Ala Arg Leu Ile Val Ser Arg 245 250 255 Ile Val Leu Asp Thr Leu Glu Ser Leu Asn Leu Lys Tyr Pro Glu Pro 260 265 270 Ser Pro Glu Arg Arg Lys Glu Leu Leu Asp Ile Arg Lys Arg Leu Glu 275 280 285 Asn Pro Glu Asn Gly Lys 290 <210> 15 <211> 269 <212> PRT <213> Oceanithermus profundus <400> 15 Met Asp Val Ser Arg Tyr Arg Val Pro Pro Gly Ser Gly Phe Asp Pro 1 5 10 15 Glu Ala Trp Pro Thr Arg Glu Asp Asp Asp Phe Ala Gly Gly Lys Lys 20 25 30 Glu Ala Lys Lys Glu Leu Ala Arg Leu Ala Val Arg Leu Gly Glu Leu 35 40 45 Gln Ala Arg Leu Tyr Ala Glu Gly Arg Gln Ala Leu Leu Ile Val Leu 50 55 60 Gln Gly Met Asp Thr Ala Gly Lys Asp Gly Thr Ile Arg His Val Phe 65 70 75 80 Arg Ala Val Asn Pro Gln Gly Val Arg Val Thr Ser Phe Lys Lys Pro 85 90 95 Thr Ala Leu Glu Leu Ala His Asp Tyr Leu Trp Arg Val His Arg His 100 105 110 Ala Pro Ala Arg Gly Glu Ile Gly Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu 115 120 125 Asp Val Leu Val Val Arg Val His Glu Leu Val Pro Pro Glu Val Trp 130 135 140 Gly Arg Arg Tyr Asp His Ile Asn Ala Phe Glu Arg Leu Leu Ala Asp 145 150 155 160 Glu Gly Thr Arg Ile Val Lys Phe Phe Leu His Ile Ser Lys Asp Glu 165 170 175 Gln Lys Arg Arg Leu Glu Ala Arg Leu Glu Asn Pro Arg Lys His Trp 180 185 190 Lys Phe Asn Pro Ala Asp Leu Ser Glu Arg Ala Arg Trp Gly Asp Tyr 195 200 205 Ala Ala Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Ser Arg Thr Ser Ser Asp Arg Ala 210 215 220 Pro Trp Tyr Ala Val Pro Ala Asp Arg Lys Trp Gln Arg Asn Arg Ile 225 230 235 240 Val Ala Gln Val Leu Val Asp Ala Leu Glu Ala Met Asp Pro Arg Phe 245 250 255 Pro Arg Val Asp Phe Asp Pro Ala Ser Val Arg Val Glu 260 265 <210> 16 <211> 290 <212> PRT <213> Roseiflexus castenholzii <400> 16 Met Tyr Ala Gln Arg Val Val Pro Gly Met Arg Val Arg Leu His Asp 1 5 10 15 Ile Asp Pro Asp Ala Asn Gly Gly Leu Asn Lys Asp Glu Gly Arg Ala 20 25 30 Arg Phe Ala Glu Leu Asn Ala Glu Leu Asp Val Met Gln Glu Glu Leu 35 40 45 Tyr Ala Ala Gly Ile His Ala Leu Leu Leu Ile Leu Gln Gly Met Asp 50 55 60 Thr Ala Gly Lys Asp Gly Ala Ile Arg Asn Val Met Leu Asn Leu Asn 65 70 75 80 Pro Gln Gly Cys Arg Val Glu Ser Phe Lys Val Pro Thr Glu Glu Glu 85 90 95 Leu Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Val His Arg Val Val Pro Arg Lys 100 105 110 Gly Met Val Gly Val Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu Val 115 120 125 Val Arg Val His Ser Leu Val Pro Glu Ser Val Trp Arg Ala Arg Tyr 130 135 140 Asp Gln Ile Asn Ala Phe Glu Arg Leu Leu Ala Asp Thr Gly Thr Ile 145 150 155 160 Ile Val Lys Cys Phe Leu His Ile Ser Lys Glu Glu Gln Glu Gln Arg 165 170 175 Leu Leu Ala Arg Glu Arg Asp Val Ser Lys Ala Trp Lys Leu Ser Ala 180 185 190 Gly Asp Trp Arg Glu Arg Ala Phe Trp Asp Asp Tyr Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Glu Ala Leu Thr Arg Cys Ser Thr Asp Tyr Ala Pro Trp Tyr Ile 210 215 220 Ile Pro Ala Asn Arg Lys Trp Tyr Arg Asp Leu Ala Ile Ser Glu Ala 225 230 235 240 Leu Val Glu Thr Leu Arg Pro Tyr Arg Asp Asp Trp Arg Arg Ala Leu 245 250 255 Asp Ala Met Ser Arg Ala Arg Arg Ala Glu Leu Glu Ala Phe Arg Ala 260 265 270 Glu Gln His Ala Met Glu Gly Arg Pro Gln Gly Ala Gly Gly Val Ser 275 280 285 Arg Arg 290 <210> 17 <211> 282 <212> PRT <213> Roseiflexus sp. <400> 17 Met His Tyr Ala His Thr Val Ile Pro Gly Thr Gln Val Arg Leu Arg 1 5 10 15 Asp Ile Asp Pro Asp Ala Ser Gly Gly Leu Thr Lys Asp Glu Gly Arg 20 25 30 Glu Arg Phe Ala Ser Phe Asn Ala Thr Leu Asp Ala Met Gln Glu Glu 35 40 45 Leu Tyr Ala Ala Gly Val His Ala Leu Leu Leu Ile Leu Gln Gly Met 50 55 60 Asp Thr Ala Gly Lys Asp Gly Ala Ile Arg Asn Val Met His Asn Leu 65 70 75 80 Asn Pro Gln Gly Cys Arg Val Glu Ser Phe Lys Val Pro Thr Glu Glu 85 90 95 Glu Leu Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Val His Lys Val Val Pro Arg 100 105 110 Lys Gly Met Val Gly Val Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu 115 120 125 Val Val Arg Val His Ser Leu Val Pro Glu His Val Trp Arg Ala Arg 130 135 140 Tyr Asp Gln Ile Asn Ala Phe Glu Arg Leu Leu Thr Asp Thr Gly Thr 145 150 155 160 Ile Ile Val Lys Cys Phe Leu His Ile Ser Lys Asp Glu Gln Glu Lys 165 170 175 Arg Leu Leu Ala Arg Glu Gln Asp Val Thr Lys Ala Trp Lys Leu Ser 180 185 190 Ala Gly Asp Trp Arg Glu Arg Glu Arg Trp Asp Glu Tyr Met Ala Ala 195 200 205 Tyr Glu Glu Ala Leu Thr Arg Cys Ser Thr Glu Tyr Ala Pro Trp Tyr 210 215 220 Ile Ile Pro Ala Asn Arg Lys Trp Tyr Arg Asp Leu Ala Ile Ser Glu 225 230 235 240 Val Leu Val Glu Thr Leu Arg Pro Tyr Arg Asp Asp Trp Gln Arg Ala 245 250 255 Leu Asp Ala Met Ser Gln Ala Arg Leu Ala Glu Leu Lys Ala Phe Arg 260 265 270 His Gln Gln Thr Ala Gly Ala Thr Arg Leu 275 280 <210> 18 <211> 274 <212> PRT <213> Truepera radiovictrix <400> 18 Met Ser Gln Gly Ser Ala Lys Gly Leu Gly Lys Leu Asp Lys Lys Val 1 5 10 15 Tyr Ala Arg Glu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Glu Leu Val Lys Leu Gln 20 25 30 Gly Trp Ile Lys Ala Gln Gly Leu Lys Val Val Val Leu Phe Glu Gly 35 40 45 Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Ser Thr Ile Thr Arg Ile Thr Gln Pro 50 55 60 Leu Asn Pro Arg Val Cys Arg Val Val Ala Leu Gly Ala Pro Thr Glu 65 70 75 80 Arg Glu Arg Thr Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Val His His Leu Pro 85 90 95 Ala Ala Gly Glu Met Val Leu Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala 100 105 110 Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Thr Glu Ala Glu Tyr Arg Glu 115 120 125 Phe Leu His Ala Cys Pro Thr Phe Glu Arg Leu Leu Leu Asp Ala Gly 130 135 140 Ile Ile Leu Ile Lys Tyr Trp Phe Ser Val Ser Ala Ala Glu Gln Glu 145 150 155 160 Arg Arg Met Arg Arg Arg Asn Glu Asn Pro Ala Lys Arg Trp Lys Leu 165 170 175 Ser Pro Met Asp Leu Glu Ala Arg Ala Arg Trp Val Ala Tyr Ser Lys 180 185 190 Ala Lys Asp Ala Met Phe Tyr His Thr Asp Thr Lys Ala Ser Pro Trp 195 200 205 Tyr Val Val Asn Ala Glu Asp Lys Arg Arg Ala His Leu Ser Cys Ile 210 215 220 Ala His Leu Leu Ser Leu Ile Pro Tyr Glu Asp Leu Thr Pro Pro Pro 225 230 235 240 Leu Glu Met Pro Pro Arg Asp Leu Ala Gly Ala Asp Glu Gly Tyr Glu 245 250 255 Arg Pro Asp Lys Ala His Gln Thr Trp Val Pro Asp Tyr Val Pro Pro 260 265 270 Thr Arg <210> 19 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 19 Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr 1 5 10 15 Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala 20 25 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 20 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 1 5 10 15 Pro Val Thr Lys Ala 20 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 21 Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala 1 5 10 15 Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala 20 25 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 22 Met Asn Lys Lys Val Leu Thr Leu Ser Ala Val Met Ala Ser Met Leu 1 5 10 15 Phe Gly Ala Ala Ala His Ala 20 <210> 23 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 23 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 24 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 25 Met Met Thr Lys Ile Lys Leu Leu Met Leu Ile Ile Phe Tyr Leu Ile 1 5 10 15 Ile Ser Ala Ser Ala His Ala 20 <210> 26 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 26 Met Lys Gln Ala Leu Arg Val Ala Phe Gly Phe Leu Ile Leu Trp Ala 1 5 10 15 Ser Val Leu His Ala 20 <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 27 Met Arg Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Phe Met Leu Pro Ala 1 5 10 15 Phe Ser <210> 28 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 28 Met Ala Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala 1 5 10 15 Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu 20 25 30 Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala 35

Claims (88)

1. (a) 리보핵산 (RNA), 리보뉴클레아제, 열안정성 키나제, 및 열안정성 RNA 폴리머라제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 인큐베이션하여 해중합된 뉴클레오시드 모노포스페이트를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 제조하는 단계;
   (b) 단계 (a)에서 제조된 세포 용해물 혼합물을, 열안정성 키나제 및 열안정성 RNA 폴리머라제를 불활성화시키지 않고 내인성 뉴클레아제 및 포스파타제를 불활성화시키거나 부분적으로 불활성화시키는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 뉴클레아제 및 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 제조하는 단계; 및
   (c) 단계 (b)에서 제조된 세포 용해물 혼합물을 에너지 공급원 및 관심의 RNA를 코딩하는 데옥시리보핵산 (DNA) 주형의 존재 하에서 인큐베이션하여 관심의 RNA를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 제조하는 단계
   를 포함하는, RNA의 무세포 생합성 방법.
2. 제1항에 있어서, 세포 용해물 혼합물이 적어도 2종의 세포 용해물을 포함하며, 여기서 적어도 2종의 세포 용해물 중 1종의 세포 용해물은 RNA를 포함하는 세포로부터 얻어지고, 적어도 2종의 세포 용해물 중 1종의 세포 용해물은 리보뉴클레아제, 키나제 및/또는 RNA 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 얻어지는 것인 방법.
3. (a) 리보핵산 (RNA) 및 리보뉴클레아제를 포함하는 혼합물을 인큐베이션하여 뉴클레오시드 모노포스페이트 (NMP)를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계;
   (b) 단계 (a)에서 제조된 혼합물을, 리보뉴클레아제, 및 임의의 잠재적인 내인성 뉴클레아제 및/또는 내인성 포스파타제를 불활성화시키거나 부분적으로 불활성화시키는 온도로 가열하는 단계; 및
   (c) 단계 (b)로부터의 NMP를 에너지 공급원, 관심의 RNA를 코딩하는 데옥시리보핵산 (DNA) 주형, RNA 폴리머라제 및 키나제의 존재 하에서 인큐베이션하여 관심의 RNA를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계
   를 포함하는, RNA의 무세포 합성 방법.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 리보뉴클레아제가 S1 뉴클레아제, 뉴클레아제 P1, RN아제 II, RN아제 III, RN아제 R, RN아제 JI, NucA, PNP아제, RN아제 T, RN아제 E, 및 RN아제G로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 키나제가 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트 키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제가 우리딜레이트 키나제, 시티딜레이트 키나제, 구아닐레이트 키나제, 및 아데닐레이트 키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
7. 제5항에 있어서, 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제가 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) 우리딜레이트 키나제, 써무스 써모필루스 (Thermus thermophilus) 아데닐레이트 키나제, 써무스 써모필루스 시티딜레이트 키나제, 및 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) 구아닐레이트 키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
8. 제5항에 있어서, 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제가 아퀴펙스 아에오리쿠스 (Aquifex aeolicus) 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제인 방법.
9. 제5항에 있어서, 폴리포스페이트 키나제가 폴리포스페이트 키나제 1 (PPK1) 또는 폴리포스페이트 키나제 2 (PPK2)인 방법.
10. 제9항에 있어서, PPK1 효소가 써모시네코코쿠스 엘롱가투스 (Thermosynechococcus elongatus) PPK1 효소로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나; PPK2 효소가 부류 III PPK2 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 부류 III PPK2 효소가 메이오써무스 루버 (Meiothermus ruber), 메이오써무스 실바누스 (Meiothermus silvanus), 데이노코쿠스 게오써말리스 (Deinococcus geothermalis), 써모시네코코쿠스 엘롱가투스 (Thermosynechococcus elongatus), 아나에로리네아 써모필라 (Anaerolinea thermophila), 칼디리네아 아에로필라 (Caldilinea aerophila), 클로로바쿨룸 테피둠 (Chlorobaculum tepidum), 오세아니써무스 프로푼두스 (Oceanithermus profundus), 로세이플렉수스 카스텐홀치이 (Roseiflexus castenholzii), 로세이플렉수스 종 (Roseiflexus sp.), 및 트루에페라 라디오빅트릭스 (Truepera radiovictrix) PPK2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
12. 제10항에 있어서, 부류 III PPK2 효소가 서열식별번호 (SEQ ID NO): 8 내지 18 중 어느 하나에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 부류 III PPK2 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 세포 용해물 혼합물이 리보뉴클레아제, 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트 키나제를 포함하는 것인 방법.
14. 제1항 또는 제3항에 있어서, RNA 폴리머라제가 DNA-의존성 RNA 폴리머라제인 방법.
15. 제14항에 있어서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제가 T7 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, 및 T3 RNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
16. 제1항 또는 제3항에 있어서, 에너지 공급원이 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 또는 ATP 재생 시스템인 방법.
17. 제16항에 있어서, ATP 재생 시스템이 폴리포스페이트를 포함하는 것인 방법.
18. 제17항에 있어서, 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트이고/거나 ATP 재생 시스템이 뉴클레오시드 모노포스페이트 및 폴리포스페이트 키나제를 추가로 포함하는 것인 방법.
19. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    (i) 단계 (a)의 혼합물이 관심의 RNA를 코딩하는 DNA 주형을 포함하고/거나;
    (ii) 단계 (a)의 혼합물이 Mg²⁺-킬레이트화제를 더 포함하거나; 또는 염화망간 (MnCl₂) 및/또는 황산마그네슘 (MgSO₄)을 더 포함하고/거나;
    (iii) 단계 (b)의 온도가 50℃ 내지 80℃이고/거나;
    (iv) 관심의 RNA를 코딩하는 DNA 주형이 단계 (c)의 혼합물에 첨가되고/거나;
    (v) 관심의 RNA가 적어도 1 g/L의 농도로 생산되고/거나;
    (vi) 단계 (c)의 혼합물이 염화망간 (MnCl₂) 및/또는 황산마그네슘 (MgSO₄)을 더 포함하고/거나;
    (vii) 에너지 공급원, 또는 에너지 공급원의 성분이 단계 (c)의 혼합물에 첨가되고/거나;
    (viii) 정제된 효소 또는 융합 효소가 단계 (a) 및/또는 단계 (c)의 혼합물에 첨가되며, 여기서 정제된 효소 또는 융합 효소는 리보뉴클레아제, 키나제, 및/또는 RNA 폴리머라제이고/거나;
    (ix) 세포가 박테리아 세포 또는 효모 세포이고/거나;
    (x) 세포가 에스케리키아 콜라이 세포인 방법.
20. 제19항에 있어서, Mg²⁺-킬레이트화제가 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)인 방법.
21. 제1항 또는 제3항에 있어서, 관심의 RNA가 단일-가닥 RNA 또는 이중-가닥 RNA인 방법.
22. 제21항에 있어서, 단일-가닥 RNA가 메신저 RNA (mRNA), 안티센스 RNA, 또는 힌지 도메인에 의해 서로에게 연결된 상보적 도메인을 함유하는 단일-가닥 RNA인 방법.
23. 제21항에 있어서, 이중-가닥 RNA가 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)인 방법.
24. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    (d) 관심의 RNA를 정제하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 관심의 RNA를 정제하는 단계가 열-불활성화된 혼합물을 단백질 침전제와 합하고, 침전된 단백질, 지질, 및 DNA를 제거함으로써 수행되는 것인 방법.
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 삭제
37. 삭제
38. 삭제
39. 삭제
40. 삭제
41. 삭제
42. 삭제
43. 삭제
44. 삭제
45. 삭제
46. 삭제
47. 삭제
48. 삭제
49. 삭제
50. 삭제
51. 삭제
52. 삭제
53. 삭제
54. 삭제
55. 삭제
56. 삭제
57. 삭제
58. 삭제
59. 삭제
60. 삭제
61. 삭제
62. 삭제
63. 삭제
64. 삭제
65. 삭제
66. 삭제
67. 삭제
68. 삭제
69. 삭제
70. 삭제
71. 삭제
72. 삭제
73. 삭제
74. 삭제
75. 삭제
76. 삭제
77. 삭제
78. 삭제
79. 삭제
80. 삭제
81. 삭제
82. 삭제
83. 삭제
84. 삭제
85. 삭제
86. 삭제
87. 삭제
88. 삭제

Images