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KR102532079B1 - 전체 세포 생체변환을 통한 스테비올 글리코시드의 생산 - Google Patents

전체 세포 생체변환을 통한 스테비올 글리코시드의 생산 Download PDF

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KR102532079B1
KR102532079B1 KR1020217004366A KR20217004366A KR102532079B1 KR 102532079 B1 KR102532079 B1 KR 102532079B1 KR 1020217004366 A KR1020217004366 A KR 1020217004366A KR 20217004366 A KR20217004366 A KR 20217004366A KR 102532079 B1 KR102532079 B1 KR 102532079B1
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아지쿠마 파라일 쿠마란
크리스틴 니콜 에스. 산토스
제이슨 에릭 도널드
메리 엘리자베스 파울러
리안 엔. 필리페
크리스토퍼 스캇 프레이
아론 러브
Original Assignee
마누스 바이오, 인크.
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Abstract

다양한 측면 및 구현예에서, 본 발명은 저급 글리코실화 중간체로부터 고급 글리코실화 생성물을 생산하기 위한 미생물 세포 및 방법을 제공한다. 미생물 세포는 중간체의 글리코실화를 위해, 세포질에서 하나 이상의 UDP-의존성 글리코실 트랜스퍼라제 효소를 발현한다. 미생물 균주를 중간체를 포함하는 식물 추출물 또는 이의 분획과 배양할 때, 이들 글리코실화 중간체는 세포에 의한 추가 글리코실화를 위해 이용 가능하며, 고급 글리코실화 생성물은 배지 및/또는 미생물 세포로부터 회수될 수 있다.

Description

전체 세포 생체변환을 통한 스테비올 글리코시드의 생산
우선권
본 출원은 2018년 7월 16일 출원된 미국 가출원 번호 62/698,617에 대한 우선권, 및 그 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
배경
소분자의 글리코실트랜스퍼라제는 식물계에서 큰 다중유전자 패밀리에 의해 암호화된다. 이들 효소는 당을 핵산당에서 광범위한 이차 대사산물로 전달하여, 수용체 분자의 물리적 및 화학적 특성을 변경한다. 예를 들어, 스테비올 글리코시드는 남미의 특정 지역 원산인 엉거시과(Asteraceae) (국화과(Compositae)) 패밀리의 다년생 관목, 스테비아 레보디아나 베르토니의 잎에서 발견되는 화합물의 종류이다. 이들은 위치 C13 및 C19에서 탄수화물 잔기의 존재에 의해 달라지는, 단일 염기, 스테비올에 의해 구조적으로 특징지어진다. 이들은 총 건조 중량의 대략 10% 내지 20%를 구성하는, 스테비아 잎에 축적된다. 건조 중량 기준으로, 스테비아 잎에서 발견되는 4가지 주요 글리코시드는 일반적으로 스테비오시드 (9.1%), 레바우디오시드 A (3.8%), 레바우디오시드 C (0.6-1.0%) 및 둘코시드 A (0.3%)를 포함한다. 레바우디오시드 B, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M 및 O, 둘코시드 B, 스테비올비오시드 및 루부소시드를 비롯한, 다른 스테비올 글리코시드는 소량 또는 미량으로 존재한다.
소량의 글리코실화 생성물 레바우디오시드 M (RebM)은 수크로스보다 200-350 배 더 강력한 것으로 추정되며, 약간 쓴 또는 감초 뒷맛과 함께 깨끗한, 단맛을 가진 것으로 기술된다. Prakash I. 등, Development of Next Generation Stevia Sweetener: Rebaudioside M, Foods 3(1), 162-175 (2014). RebM은 글로벌 식품 산업에서 큰 관심이지만, 스테비아 추출물의 낮은 보급률은 이의 합성을 위한 혁신적인 과정을 필요로 한다.
천연 식물 추출물의 소량 산물인 고부가가치 글리코시드를 생산하기 위한 경제적인 방법이 여전히 필요하다.
발명의 개요
다양한 측면 및 구현예에서, 본 발명은 저급 글리코실화 중간체로부터 고급 글리코실화 생성물을 생산하기 위한 미생물 세포 및 방법을 제공한다. 미생물 세포는 중간체의 글리코실화를 위한 하나 이상의 UDP-의존성 글리코실트랜스퍼라제 효소를 발현한다. 글리코시드 중간체를 포함하는 식물 추출물 또는 이의 분획과 함께 미생물 균주를 배양할 때, 이들 중간체는 미생물 세포에 의해 추가 글리코실화가 가능하다. 다양한 구현예에서, 고급 글리코실화 생성물은 배지 및/또는 미생물 세포로부터 회수된다.
글리코시드 중간체는 예를 들어 식물 추출물에 자연적으로 발견되는 것들, 그 중에서도, 글리코실화 테르페노이드, 플라보노이드, 카나비노이드, 폴리케타이드, 스틸베노이드, 및 폴리페놀을 포함하는, 임의의 글리코실화 이차 대사산물일 수 있다. 일부 구현예에서, 글리코실화 중간체는 글리코실화 테르페노이드, 예를 들어 스테비올 글리코시드 또는 모그로시드이고, 감미료로서의 용도를 찾을 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물의 생합성은 미생물 세포에서 글리코시드 중간체의 적어도 2개의 글리코실화 반응을 수반한다.
일부 구현예에서, 상기 글리코시드 중간체는 스테비아 잎 추출물에서 유래한다. 예를 들어, RebM 및 다른 고급 글리코실화 생성물은 스테비올 글리코시드 중간체 예를 들어 그 중에서도 스테비오시드, 스테비올비오시드, 레바우디오시드 A (RebA), 및 레바우디오시드 C (RebC)로부터 생합성될 수 있다. 미생물 세포는 낮은 값의 중간체의 글리코실화를 위해, 세포질에서 하나 이상의 UDP-의존성 글리코실 트랜스퍼라제 효소를 발현한다. 미생물 균주를 상기 스테비올 글리코시드 중간체를 포함하는 스테비아 잎 추출물 또는 이의 분획을 함께 배양하는 경우, 이들 중간체는 추가 글리코실화를 위해 세포에서 이용 가능하고, 이들 생성물은 배지 및/또는 미생물 세포로부터 회수할 수 있다. 따라서, 이 과정은 스테비아 잎 추출물에서 고급 중간체, 즉 1 내지　5개의　글리코실화를 갖는 스테비올 글리코시드 (뿐만 아니라 일부 구현예에서 아글리콘 코어, 스테비올)를 사용한다. 스테비아 잎 추출물의 고급 중간체는 스테비올 글리코시드의 기존 산업 추출에서 쉽게 구할 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 미생물 세포는 글리코시드 중간체를 글리코실화하는 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 UGT 효소를 발현하고, 표 1에 열거된 것들 및 서열 번호 1-45로서 본원에서 제공된 것들, 뿐만 아니라 이의 유도체로부터 선택될 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 UGT 효소는 1-2' 글리코실화 UGT 효소, 1-3' 글리코실화 UGT 효소, 및 O-글리코실화 UGT 효소로부터 독립적으로 선택된다. 다양한 구현예에서, 이들 효소는 막 전위 또는 분비 신호를 함유하지 않는다는 점에서, 세포 내에서 발현된다.
일부 구현예에서, 특히 스테비아 잎 추출물의 스테비올 글리코시드 중간체의 글리코실화에 대하여, 상기 미생물 세포는 4개의 UGT 효소, 예를 들어 13-O UGT 글리코실화 효소, 19-O UGT 글리코실화 효소, 1-2' UGT 글리코실화 효소, 및 1-3' UGT 글리코실화 효소를 발현한다.
다양한 구현예에서, 상기 미생물 세포는 1-3' 글리코실화 UGT 효소를 발현한다. 예를 들어, 상기 1-3' 글리코실화 UGT 효소는 SrUGT76G1, MbUGT1-3, 및 이의 유도체 (예를 들어, UGT76G1_L200A 또는 MbUGT1-3_1, MbUGT1-3_1.5, 또는 MbUGT1-3_2)로부터 선택될 수 있다.
이들 및 다른 구현예에서, 상기 미생물 세포는 1-2' 글리코실화 UGT 효소를 발현한다. 예를 들어, 상기 1-2' 글리코실화 UGT 효소는 SrUGT91D2, SrUGT91D1, SrUGT91D2e, OsUGT1-2, MbUGT1,2, MbUGT1,2.2, 및 이의 유도체로부터 선택될 수 있다.
이들 또는 다른 구현예에서, 상기 미생물 세포는 C13 O-글리코실화 UGT 효소를 발현한다. 예를 들어, 상기 C13 O-글리코실화 UGT 효소는 SrUGT85C2 및 이의 유도체 (예를 들어, MbUGTC13)로부터 선택될 수 있다.
이들 또는 다른 구현예에서, 상기 미생물 세포는 C19 O-글리코실화 UGT 효소를 발현한다. 예를 들어, 상기 C19 O-글리코실화 효소는 SrUGT74G1, MbUGTc19, 및 이의 유도체 (예를 들어, MbUGTc19-2)로부터 선택될 수 있다.
전체 세포 전환은 세포 내에서 발현되는 효소가 외부 공급 기질 (예를 들어, 글리코실화 중간체)에 작용하고 세포가 UDP-글루코스 보조인자 재생을 제공하는 것이 필요하다. 이는 외인성 UDP-글루코스 공급 또는 UDP-글루코스 전구체 또는 UDP-글루코스 재생 메커니즘 또는 UDP-글루코스 재생 효소계를 필요로 하는, 세포 외부에서 정제되거나 분비되는 효소에 의존하는 과정과 대조적이다. 본 발명의 구현예에서, 촉매작용 (글리코실화)은 살아있는 미생물 세포로 수행된다. UDP-글루코스 보조인자 재순환은 외부에서 제공되는 추가 효소 또는 기질 공급을 필요로 하지 않고 고유 세포 대사를 사용하여 발생한다.
본 개시에 따르면, 미생물 세포에 대한 유전적 변형은 세포 내 발현된 효소에 의한 추가 글리코실화를 위해 글리코시드 중간체를 이용 가능하게 허용한다. 일부 구현예에서, 고급 글리코실화 생성물은 용해된 세포에서 추출되는 것과는 반대로, 생성물은 배지로부터 회수될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 미생물 세포는 UDP-글루코스 가용성을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 이론에 얽매이지 않고, 이러한 변형은 또한 글루코스 가용성에 대해 세포에 스트레스를 가하여, 글리코시드 중간체를 세포로 도입하기 위한 내인성 수송체의 발현 증가를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 이론에 얽매이지 않고, 상기 세포는 유전적 변형 또는 배지 구성성분을 통해 투과성 있게 되어, 생성물 및 기질의 수동적 확산을 허용한다.
다양한 구현예에서, 상기 미생물 세포는 하나 이상의 내인성 수송체의 과발현을 가지며 (예를 들어, 모 미생물 균주와 비교하여), 또는 특정 구현예에서, 재조합 및/또는 조작된 수송 단백질을 발현하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 상기 미생물 세포는 하나 이상의 추가 카피의 내인성 수송 단백질, 또는 이의 유도체를 발현한다. 예를 들어, 수송 단백질의 발현 또는 활성은 생성물, 예를 들어 RebM 및/또는 RebD 뿐만 아니라 다른 고급 글리코실화 생성물을 내보내는 동안, 스테비올 글리코시드 기질 (예를 들어, 중 하나 이상 스테비오시드, 스테비올비오시드, RebA, 및/또는 RebC)의 세포 내로 수송을 증가하기 위해 변경될 수 있다. 미생물 세포에서 변경된 활성 또는 기질 특이성을 위해 과발현되거나 조작될 수 있는 예시적 수송 단백질은 대장균 acrAD, xylE, ascF, bglF, chbA, ptsG/crr, wzxE, rfbX, 뿐만 아니라 이의 병렬상동체 또는 유도체를 포함한다. 다른 수송 단백질은 원하는 글리코시드 중간체를 수송하는 박테리아 또는 내인성 수송 단백질로부터 선택된 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 수송체는 숙주 종, 또는 다른 박테리아 또는 효모 종으로부터 유래될 수 있고, 특정 글리코시드 중간체 또는 생성물에　대한 친화도를 조정하도록 조작될 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 방법은 글리코시드 중간체의 원하는 생성물로의 적어도 40% 전환, 또는 적어도 50% 전환, 또는 적어도 75% 전환을 유발한다 (예를 들어, 스테비오시드, 스테비올비오시드, 및 RebA의 RebD, RebM, 및/또는 다른 고급 글리코실화 레바우디오시드로의 전환). RebM의 생산에서, 생성물 프로필은 RebD 보다 RebM을 강하게 선호할 수 있다.
상기 방법은 배치 발효, 유가 발효, 연속 발효, 또는 반연속 발효에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 방법은 약 72시간 미만, 또는 일부 구현예에서, 약 48시간 미만, 또는 약 24시간 미만의 배양 시간으로 배치 발효에 의해 수행된다.
일부 측면에서, 본 발명은 고급 스테비올 글리코시드, 예를 들어 RebM을 포함하는 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 표적 스테비올 글리코시드를 제품, 예를 들어 식품, 음료, 구강 관리 제품, 감미료, 향미제, 또는 기타 제품에　포함시키는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명은 스테비올 글리코시드, 모그로시드, 수크랄로스, 아스파탐, 네오탐, 아드반탐, 아세설팜 컬륨, 사카린, 시클라메이트, 네오헤스페리딘 디히드로칼콘, 그네티폴린 E, 및/또는 피케탄올 4'-O-β-D-글루코피라노시드 중　2개 이상과 같은　복수의 고강도 감미료를 포함하는 감미료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면 및 구현예는 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1. RebM의 구조. 스테비올 골격 (디테르페노이드)을 박스에 나타낸다. RebM은 6개의 글리코실화를 함유한다: (1) C13 O-글리코실화, (2) C13 1-2' 글리코실화, (3) C13 1-3' 글리코실화, (4) C19 O-글리코실화, (5) C19 1-2' 글리코실화, 및 (6) C19 1-3' 글리코실화.
도 2. 스테비올 및 스테비올 글리코시드 중간체에 대한 UGT 효소의 작용에 의해 생성된 글리코실화 생성물.
도 3. 람노스를 함유하는 스테비올 글리코시드 중간체에 대한 UGT 효소의 작용에 의해 생성된 글리코실화 생성물.
도 4. 스테비올비오시드의 RebM으로의 전환. RebM 경로의 5개의 주요 화합물에 대해, UGT 효소가 결여된 대조군 균주에서 이들 화합물의 총 농도에 비하여 화합물 농도를 나타낸다. 균주는 0.2 mM 스테비올비오시드를 공급하고 추출 전 48시간 동안 기질과 함께 배양하였다. 균주 3 및 4는 스테비올비오시드의 전환을 나타내지 않는 반면, 균주 5는 RebD 및 RebM로의 실질적인 전환을 나타낸다.
도 5. 스테비오시드 및 RebA의 RebM로의 전환. 잎 추출물에서 발견되는 2개의 시판 중간체, 스테비오시드 및 RebA의 RebM로의 생물전환을 균주 1 내지 5를 사용하여 나타내고 있다. 또한 스테비올 코어의 생물전환을 나타낸다. 값은 총 스테비올 글리코시드 조성물의 백분율로 보고된다. 모든 균주에 의한 스테비올의 RebM로의 전환은 모든 균주가 RebM을 형성함 수 있음을 나타낸다. 스테비올비오시드의 경우에서와 같이, 스테비오시드 및 RebA 모두 RebM으로 전환되지만, 오직 균주 5에서만이다. 스테비오시드 및 RebA로부터의 전환의 경우, RebD:RebM의 비율은 강하게 RebM을 선호한다 (1:20).
도 6. 96-웰 플레이트에서 스테비올 글리코시드의 생물전환. RebM 경로의 5개의 주요 화합물에 대해, UGT 효소가 발현되거나 발현되지 않은　화합물 농도를 나타낸다. 균주는 0.5 g/L의 스테비오시드/RebA 잎 추출물을 공급하고 샘플링 전에 48시간 동안 기질과 함께 배양하였다.
도 7. 생물반응기 규모에서 스테비오시드/RebA 잎 추출물의 생물전환. RebM 경로의 5개의 주요 화합물에 대해, 배지의　 화합물 농도를 발효 전반에 걸쳐 다양한 시점에서 샘플링하였다. 균주는 2 g/L의 스테비오시드/RebA 잎 추출물을 공급하고 총 30시간 동안 기질과 함께 배양하였다.
도 8. UDP-글루코스로의 천연 대장균 유동을 증가시키기 위한 유전적 변형. 대사산물: G6P, 글루코스-6-인산염; G1P, 글루코스-1-인산염; 6PGL, 6-포스포글루코노-1,5-락톤; 6PG, 6-포스포글루코네이트; R5P, 리보스-5-인산염; PRPP, 5-포스포리보실-1-피로인산염; UMP, 우리딘 일인산염; UDP, 우리딘 이인산염; UTP, 우리딘 삼인산염; UDP-Glu, UDP-글루코스; UDP-Gal, UDP-갈락토스; UDP-GlcNAc, UDP-N-아세틸글루코사민; CTP, 시티딘 삼인산염; dUDP, 디옥시우리딘-이인산염; RebA, 레바우디오시드 A; RebM, 레바우디오시드 M. 효소: 1. glk, 글루코키나제; 2. pgi, 글루코스-6-인산염 이소메라제; 3. zwf, 글루코스-6-인산염-1-탈수소효소; 4. pgl, 6-포스포글루코노락토나아제; 5. edd, 포스포글루코네이트 탈수효소; 6. gnd, 6-포스포글루코네이트 탈수소효소; 7. rpiA, 리보스-5-인산염 이소메라제 또는 rpe, 리불로오스-인산염 3-에피머라제; 8. prs, 리보스-인산염 디포스포키나제; 9. pyrEF, 오로테이트 포스포리보실트랜스퍼라제 및 오로티딘-5'인산염-탈탄산효소; 10. pyrK, 우리딜레이트 키나제; 11. ndk, UDP 키나제; 12. murG, N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제; 13. nrdABEF, 리보뉴클레오시드-이인산염 환원효소; 14. pyrG, CTP 합성효소; 15. pgm, 포스포글루코무타제; 16. galU, UDP-글루코스 피로포스포릴라제; 17. galETKM, UDP-글루코스-4-에피머라제 / 갈락토스-1-인산염 우리딜릴트랜스퍼라제 / 갈락토키나제 / 갈락토스-1-에피머라제; 18. ushA, 5'-뉴클레오티드분해효소 / UDP- 당 가수분해효소; 19. UGT, UDP-글리코실트랜스퍼라제. 도식은 균주 1에서 균주 5로 이어지는 순차적 게놈 변형을　예시한다. 균주 1은 기본 대장균 균주이다. 균주 2는 17의 결실을　가지며, 균주 3은 18의 추가 결실을 갖는다. 균주 4는 균주 3으로부터 2를 결실시켜 만들었다. 균주 5는 15 및 16을 과발현하여 균주 4로부터 만들었다.
다양한 측면 및 구현예에서, 본 발명은 저급 글리코실화 중간체로부터 고급 글리코실화 생성물을 생산하기 위한 미생물 세포 및 방법을 제공한다. 다양한 구현예에서, 미생물 세포는 중간체의 글리코실화를 위해 하나 이상의 UDP-의존성 글리코실 트랜스퍼라제 효소 (예를 들어, 세포 내로)를 발현한다. 다양한 구현예에서, 미생물 세포는 UDP-글루코스의 가용성을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖는다. 미생물 균주를 글리코시드 중간체 (예를 들어, 식물 추출물 또는 이의 분획으로부터)와 함께 배양할 때, 이들 글리코시드 중간체는 세포 내로-발현된 글리코실트랜스퍼라제 효소에 의해 추가 글리코실화를 위해 세포에서 사용 가능하다. 일부 구현예에서, 고급 글리코실화 생성물은 배지로부터 회수할 수 있으며, 또는 일부 구현예에서, 배지 및 미생물 세포로부터 회수된다.
글리코시드 중간체는 임의의 글리코실화 이차 대사산물, 예를 들어 그 중에서도, 글리코실화 테르페노이드, 글리코실화 플라보노이드, 글리코실화 카나비노이드, 글리코실화 폴리케타이드, 글리코실화 스틸베노이드, 및 글리코실화 폴리페놀을 비롯한, 식물 추출물에서 자연적으로 발견되는 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 글리코시드 중간체는 글리코실화 테르페노이드, 예를 들어 스테비올 글리코시드 또는 모그로시드이다. 일부 구현예에서, 글리코시드 중간체는 그 중에서도, 글루코실, 갈락토실, 만노실, 자일로실, 및 람노실기로부터 선택된 글리코실기를 비롯한, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 글리코실기를 갖는다. 다양한 구현예에서, 글리코실화 생성물은 적어도 4개의 글리코실기, 또는 적어도 5개의 글리코실기, 또는 적어도 6개의 글리코실기를 갖는다. 다른 구현예에서, 생성물은 7개, 8개, 9개 이상의 글리코실기를 갖는다. 일부 구현예에서, 생성물의 생합성은 미생물 세포에 의한 중간체의 적어도 2개의 글리코실화를 수반한다.
일부 구현예에서, 글리코시드 중간체는 스테비아 잎 추출물로부터 유래한다. 예를 들어, 5개, 6개 이상의 글리코실화를 갖는 스테비올 글리코시드 (예를 들어 RebD 또는 RebM)는 그 중에서도, 스테비오시드, 스테비올비오시드, 레바우디오시드 A, 둘코시드 A, 둘코시드 B, 레바우디오시드 C, 및 레바우디오시드 F와 같은 스테비올 글리코시드 중간체로부터 생합성될 수 있다. 미생물 세포는 이들 낮은 값의 전구체의 글리코실화를 위한 하나 이상의 UDP-의존성 글리코실 트랜스퍼라제 효소를 발현한다. 미생물 균주를 스테비올 글리코시드 중간체를 포함하는 스테비아 잎 추출물 또는 이의 분획과 배양할 때, 이들 중간체는 RebD 또는 RebM 또는 다른 고급 글리코실화 생성물 (예를 들어, RebI)에 대한 추가 글리코실화를 위해 사용 가능하며, 이는 배지 및/또는 미생물 세포로부터 회수될 수 있다.
다양한 구현예에서, UDP-의존성 글리코실 트랜스퍼라제 효소는 효소가 막 전위 또는 분비 펩티드 또는 도메인을 보유하지 않는다는 점에서 "세포 내로" 발현된다. 따라서, UGT 효소의 발현은 세포질에서 일어나며, 이들 효소는 분비 또는 수송 신호를 통해 세포 외부로 향하지 않는다. 다양한 구현예에서, UGT 효소는 막 고정　도메인을　포함하지 않는다. 즉, 다양한 구현예에서 UGT 막 관통 도메인을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 과정은 스테비아 잎 추출물의 고급 중간체, 즉 스테비올 (아글리콘 중간체) 및 1 내지 5개의 글리코실화를 갖는 스테비올 글리코시드를 사용하며, 이는 추가 글리코실화를 위해 미생물 세포에서 사용 가능하다. 스테비아 잎 추출물의 고급 중간체는 스테비올 글리코시드 기존 산업적 추출로부터 쉽게 구할 수 있다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 잎 추출물은 주로 경로 중간체 스테비오시드 및 레바우디오시드 A (RebA)를 함유할 수 있다. 다양한 구현예에서, 스테비아 잎 추출물은 스테비올 글리코시드의 추출이다. 일부 구현예에서, 추출물은 주요한 구성성분으로서, 스테비오시드, 스테비올비오시드, 및 레바우디오시드 A 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 추출물은 주요한 구성성분으로서 둘코시드 A, 둘코시드 B, RebC 및/또는 RebF 중 하나 이상을 포함한다. 주요한 구성성분은 일반적으로 추출물 또는 이의 분획에서 스테비올 글리코시드의 적어도 약 10%를 구성하지만, 일부 구현예에서, 추출물 또는 이의 분획에서 스테비올 글리코시드의 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%를 구성할 수 있다.
RebM은 도 1에 예시되어 있다. RebM은 스테비올 코어의 6개의 글리코실화를 함유한다: (1) C13 O-글리코실화, (2) C13 1-2' 글리코실화, (3) C13 1-3' 글리코실화, (4) C19 O-글리코실화, (5) C19 1-2' 글리코실화, 및 (6) C19 1-3' 글리코실화. 다양한 글리코실화 생성물이 가능하지만 (도 2), RebM은 4개의 UGT 효소의 작용을 통해　스테비올로부터　합성될 수 있으며, UGT 글리코실화 효소는 각각 여러 기질에 작용할 수 있다. 예를 들어, UGT91D2 및 OsUGT1-2 모두 스테비올모노시드로부터 스테비올비오시드 (C13에서 작용에 의해), 뿐만 아니라 RebA로부터 RebD (C19에서 작용에 의해)를 생산할 수 있는 1-2' 글리코실화 효소이다. 추가로, UGT76G1은 스테비오시드로부터 RebA (C13에서 작용에 의해), 뿐만 아니라 RebD로부터 RebM (C19에서 작용에 의해)을 생산할 수 있는 1-3' 글리코실화 효소이다.
스테비올 및 스테비올 글리코시드의 글리코실화를 위한 UGT 효소 (RebM의 생합성을 위한 것을 포함)는 US 2017/0332673에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 예시적 UGT 효소는 하기 표 1에 열거되어 있다 (참조된 특허 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨):
Figure 112021017673056-pct00001
예시적 UGT 효소에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 1-17로서 본 개시에서 제공된다. 서열 번호 1은 스테비아 레바우디아나 UGT85C2이다. 서열 번호 13은 P215T 치환, 및 안정성을 높이기 위해 2번째 위치에서 Ala의 삽입을 갖는 SrUGT85C2이다. 서열 번호 2는 스테비아 레바우디아나 UGT74G1 (2번째 위치에서 Ala의 삽입을 가짐). 서열 번호 8 및 12는 SrUGT74G1에 기초한 원형 치환체이다 (MbUGTC19 및 MbUGTC19-2). 서열 번호 3은 스테비아 레바우디아나 UGT76G1이다. 1-3' 글리코실화 활성을 갖는 원형 치환체는 서열 번호 10 (MbUGT1-3) 및 서열 번호 15, 16, 및 17로서 개시된다 (각각, MbUGT1-3_1, MbUGT1-3_1.5, 및 MbUGT1-3_2). L200A 치환, 및 2번째 위치에서 Ala를 갖는 UGT76G1은 서열 번호 14로서 개시된다. 스테비아 레바우디아나 UGT91D1, UGT91D2, 및 UGT91D2e는 서열 번호 4, 5, 및 6으로서 개시된다. 오리자 사티바 UGT1-2는 서열 번호 7로서 개시된다. MbUGT1,2 및 MbUGT1,2.2는 1-2' 글리코실화 활성을 가진 원형 치환체 효소이다 (서열 번호 9 및 11).
추가 UGT 효소는 시라이티아 그로스베노리 (나한과), 모모르디카 카란티아 (여주), 쿠쿠미스 사티바 (오이), 쿠커비타 맥시마 (스쿼시), 쿠커비타 모스차타 (스쿼시, 펌킨), 플러너스 페르시카 (복숭아), 테오브로마 카카오 (카카오), 코르코러스 캡설러리스 (백색 황마), 지지푸스 주주베 (대추야자), 비티스 비니훼라 (포도덩굴), 저글런스 리지아 (호두), 헤비어 브라질리언시스 (고무나무), 마니호트 에스쿠렌타 (카사바), 세팔로투스 폴리큘러스 (낭상엽 식물), 및 커피나 아라비카 (커피) 종으로부터 서열 번호 18 내지 46으로 제공된다. UGT 효소는 원하는 생성물 및 이용 가능한 중간체에 따라 선택하고 선택적으로 조작할 수 있다.
다양한 구현예에서, 미생물 세포는 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 UGT 효소를 발현한다. 일부 구현예에서, UGT 효소는 표 2에서 열거된 것을 비롯한, 스테비올 글리코시드 기질을 글시코실화한다. 일부 구현예에서, 미생물 세포는 스테비올 글리코시드 중간체를 글리코실화하는 4개의 UGT 효소, 예를 들어 13-O UGT 글리코실화 효소, 19-O UGT 글리코실화 효소, 1-2' UGT 글리코실화 효소, 및 1-3' UGT 글리코실화 효소를 발현한다. 스테비아 잎의 글리코실화 중간체에 대한 이들 일반적인 종류의 UGT 효소의 작용이 도 2 및 3에 도시되어 있다.
다양한 구현예에서, 미생물 세포는 1-3' 글리코실화 UGT 효소를 발현한다. 예를 들어, 1-3' 글리코실화 UGT 효소는 SrUGT76G1, MbUGT1-3_1, MbUGT1-3_1.5, 및 MbUGT1-3_2, 및 이의 유도체로부터 선택될 수 있다.
이들 및 다른 구현예에서, 미생물 세포는 1-2' 글리코실화 UGT 효소를 발현한다. 예를 들어, 1-2' 글리코실화 UGT 효소는 SrUGT91D2, SrUGT91D1, SrUGT91D2e, OsUGT1-2, MbUGT1,2, MbUGT1,2.2, 및 이의 유도체로부터 선택될 수 있다.
이들 또는 다른 구현예에서, 미생물 세포는 C13 O-글리코실화 UGT 효소를 발현한다. 예를 들어, C13 O-글리코실화 UGT 효소는 SrUGT85C2 및 이의 유도체 (예를 들어, MbUGTC13)로부터 선택될 수 있다.
이들 또는 다른 구현예에서, 미생물 세포는 C19 O-글리코실화 UGT 효소를 발현한다. 예를 들어, C19 O-글리코실화 효소는 SrUGT74G1, MbUGTc19, 및 이의 유도체 (예를 들어, MbUGTc19-2)로부터 선택될 수 있다.
이들 또는 다른 구현예에서, 미생물 세포는 1-3' 글리코실화 UGT 효소 및 1-2' 글리코실화 UGT 효소를 발현한다. 일부 구현예에서, 미생물 세포는 1-3' 글리코실화 UGT 효소, 1-2' 글리코실화 UGT 효소, 및 C13 O-글리코실화 UGT 효소를 발현한다. 일부 구현예에서, 미생물 세포는 1-3' 글리코실화 UGT 효소, 1-2' 글리코실화 UGT 효소, C19 O-글리코실화 UGT 효소, 및 C19 O-글리코실화 UGT 효소를 발현한다. 일부 구현예에서, 미생물 세포는 1-3' 글리코실화 UGT 효소, 1-2' 글리코실화 UGT 효소, C19 O-글리코실화 UGT 효소, 및 C13 O-글리코실화 UGT 효소를 발현한다. 일부 구현예에서, 미생물 세포는 SrUGT85C2 또는 이의 유도체 (예를 들어, MbUGTC13), MbUGT1,2.2 또는 이의 유도체, SrUGT74G1 또는 이의 유도체 (예를 들어, MbUGTc19 or MbUGTc19-2), 및 SrUGT76G1 또는 MbUGT1-3_1 또는 이의 유도체 (예를 들어, 76G1_L200A, MbUGT1-3_1.5, 또는 MbUGT1-3_2)를 발현한다. 이론에 얽매이지 않고, 조작된 UGT 효소는 RebM (뿐만 아니라 고급 글리코실화 생성물)에 대해 증가된 탄소 유동을 제공할 수 있으며, 저급 글리코실화 중간체에 대한 실질적인 활성의 손실 없이, 더 큰 기질을 더 잘 수용할 수 있는 기질 결합 포켓 덕분이다. 이러한 구현예에서, UGT 효소 (예를 들어 1-3' 및 1-2' 글리코실화 UGT 효소)는 RebA 또는 RebD와 같은 보다 고도로 글리코실화된 스테비올 기질을 사용하여 증가된 활성 속도 (예를 들어, 기질 결합 및 전환율)를 가질 수 있다.
UGT 효소의 유도체는 일반적으로 서열 번호 1 내지 46 중 하나 이상에 대해 적어도 약 50% 동일성, 적어도 약 60% 동일성, 적어도 약 70% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 85% 동일성, 또는 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유도체는 서열 번호 1 내지 46 중 하나에 대해 1 내지 20개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 5개의 아미노산 변형 (아미노산 치환, 삽입, 및 결실로부터 독립적으로 선택됨)을 갖는다. 일부 구현예에서, 예를 들어 스테비올 글리코시드 중간체로부터의 RebM 및 다른 고급 스테비올 글리코시드 (예를 들어, 적어도 5개의 글리코실기를 갖는 것)의 생산에 관하여, 이들 UGT 효소의 유도체는 서열 번호 1 내지 17 중 하나 이상에 대해 적어도 약 50% 동일성, 적어도 약 60% 동일성, 적어도 약 70% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 85% 동일성, 또는 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유도체는 서열 번호 1 내지 17 중 하나 이상에 대해 1 내지 20개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 5개의 아미노산 변형 (아미노산 치환, 삽입, 및 결실로부터 독립적으로 선택됨)을 갖는다.
일부 구현예에서, 미생물 세포는 서열 번호 15, 서열 번호 16, 또는 서열 번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1-3' UGT 효소를 발현한다. 일부 구현예에서, 1-3' UGT는 서열 번호 15, 16, 또는 17에 대해 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 1-3' UGT 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 15, 16, 또는 17에 대해 적어도 약 85% 동일하며, 또는 서열 번호 15, 16, 또는 17에 대해 적어도 약 90% 동일하며 또는 서열 번호 15, 16, 또는 17에 대해 적어도 약 95% 동일하며, 또는 서열 번호 15, 16, 또는 17에 대해 적어도 약 98% 동일하다. 일부 구현예에서, 1-3' UGT 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 15, 16, 또는 17의 아미노산을 포함한다.
예를 들어, 아미노산 서열은 서열 번호 15, 16, 또는 17의 아미노산 서열에 관하여, 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 20개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 서열 번호 15, 16, 또는 17의 아미노산 서열에 관하여, 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 1 내지 10개의 아미노산 변형 (예를 들어, 1 내지 5개)을 갖는다. 서열 번호 15, 16, 또는 17의 아미노산 서열에 대한 아미노산 변형은 이용 가능한 효소 구조 및 상동성 모델의 구축에 의해 유도될 수 있다. 예시적 구조는, 예를 들어, Li, 등, Crystal Structure of Medicago truncatula UGT85H2-insights into the Structural Basis of a Multifunctional (iso) Flavonoid Glycosyltransferase, J. of Mol. Biol. 370.5 (2007): 951-963에 기술되어 있다. 공개적으로 이용 가능한 결정 구조 (예를 들어, PDB 항목: 2PQ6)를 아미노산 변형을 알리기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 기질의 결합을 개선하고/거나 촉매 측쇄를 갖는 이들 기질의 반응 기하 구조를 개선하기 위해 활성 부위 또는 활성 부위 부근에서 하나 이상의 아미노산 변형이 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 1-3' UGT 효소는 서열 번호 3 (스테비아 레바우디아나 UGT76G1)의 위치 29, 200, 357, 및 414에 대응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 서열 번호 15 및 17의 효소에 포함된 (서열 번호 15에서 각각, 위치 183, 354, 54, 및 111) 이들 위치에서 치환은 활성의 극적인 개선을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 번호 15의 위치 183, 354, 54, 및 111에 대응하는 위치에서 아미노산의 동일성은 다른 위치에서 추가 변형을 허용한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 1-3' UGT 효소는 서열 번호 15 또는 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 UGT 효소는 하기를 포함한다: 서열 번호 15의 위치 54에 대응하는 위치에서 글리신 (G) 또는 트레오닌 (T); 서열 번호 15의 위치 111에 대응하는 위치에서 류신 (L) 또는 이소류신 (I); 서열 번호 15의 위치 183에 대응하는 위치에서 메티오닌 (M) 또는 류신 (L); 및 서열 번호 15의 위치 354에 대응하는 위치에서 알라닌 (A), 또는 글리신 (G), 또는 세린 (S). 일부 구현예에서, 1-3' UGT 효소는 서열 번호 15의 위치 183에 대응하는 위치에서 메티오닌 (M)을 포함한다. 일부 구현예에서, 1-3' UGT 효소는 서열 번호 15의 위치 54에 대응하는 위치에서 글리신 (G)을 포함한다. 일부 구현예에서, 1-3' UGT 효소는 서열 번호 15의 위치 111에 대응하는 위치에서 류신 (L)을 포함한다. 일부 구현예에서, 1-3' UGT는 서열 번호 15의 위치 183에 대응하는 위치에서 2 또는 3개의 메티오닌 (M), 서열 번호 15의 위치 54에 대응하는 위치에서 글리신 (G), 및 서열 번호 15의 위치 111에 대응하는 위치에서 류신 (L)을 갖는다. 이들 변형은 효소의 활성에 실질적인 개선을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 1-3' UGT 효소는 서열 번호 15의 위치 155에 대응하는 위치 이후에, 5 내지 약 15개의 아미노산, 예를 들어 6 내지 12개의 아미노산, 또는 약 6개 또는 약 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 삽입은 주로 글리신 및 세린 잔기인 융통성이 있는 친수성 서열이다. 일부 구현예에서, 서열은 GSGGSG (서열 번호 47) 또는 GSGGSGGSG (서열 번호 48)이다.
다양한 구현예에서, 1-3' UGT 효소는 UGT76G1-L200A (서열 번호 14)에 비해 스테비오시드의 Reb A로의 개선된 전환, 및 RebD의 RebM으로의 개선된 전환을 나타낸다. 이러한 개선된 전환은 스테비오시드 또는 RebD 기질이 1-3' UGT 효소를 발현하는 미생물 세포에 공급되는 생물전환 분석에서 나타난다. 개선된 전환은 재조합적으로 발현된 1-3' UGT를 함유하는 세포 용해물과의 반응, 또는 정제된 또는 부분적으로 정제된 1-3' UGT과의 시험관 내 반응에서 입증될 수 있다.
효소의 아미노산 서열에 대한 변화는 이의 활성을 변경하거나 측정 가능한 효과가 없을 수 있다. 측정　가능한 효과가　없는 조용한 변화는 종종　활성 부위 및 기질 결합 부위에서 떨어진 용매 노출 표면에 대한 보존적 치환 및 작은 삽입 또는 결실이다. 대조적으로, 효소 활성은 비보존적 치환, 큰 삽입 또는 결실, 및 활성 부위, 기질 결합 부위 내, 및 단백질 접힘 또는 형태 형성에 중요한 매몰 위치에서의 변화에 의해 영향을 받을 가능성이 더 높다. 효소 활성을 변경하는 변화는 반응 속도를 증가 또는 감소시키거나 특정 기질에 대한 친화성 또는 특이성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 기질 결합 부위의 크기를 증가시키는 변화는 효소가 더 큰 기질에 작용하도록 허용할 수 있고 촉매 아미노산 측쇄를 기질의 표적 부위에 더 가깝게 위치시키는 변화는 효소 속도를 증가시킬 수 있다.
효소의 3차원 구조와 관련 활성 부위, 기질 결합 부위 및 기타 상호 작용 부위의 위치에 대한 지식은 유도체의 합리적 설계를 촉진하고 특정 변화의 표현형에 대한 기계적 통찰력을 제공할 수 있다. 식물 UGT는 비교적 낮은 아미노산 서열 동일성을 가지면서 고도로 보존된 2차 및 3차 구조를 공유한다. Osmani et al, Substrate specificity of plant UDP-dependent glycosyltransferases predicted from crystal structures and homology modeling, Phytochemistry 70 (2009) 325-347. UGT의 당 수용체 및 당 공여자 기질은 N- 및 C-말단 도메인 사이에 형성된 틈새에 수용된다. 1차 서열의 여러 영역은 구조적으로 보존된 도메인뿐만 아니라 이들이 아미노산 서열 및 서열 길이에 대해 모두 다른 루프 영역을 포함하는 기질 결합 포켓의 형성에 기여한다.
UGT 유도체의 구축은 알려진 구조와 비교하여 상동성 모델링을 기반으로 안내될 수 있다. 예를 들어, SrUGT76G1_L200A의 결정 구조 분석 및 MbUGT3-1_1에 대한 SrUGT76G1의 아미노산 서열 정렬을 기반으로, 스테비오시드의 스테비올 코어는 MbUGT3-1_1: I244, L280, W351, A354, I357, M362, 및 T438의 하기 잔기에 가까운 (4 Å 이내) 것으로 예측된다. 추가로, C19 1-2 글리코실화는 T438에 가까운 (4 Å이내) 것으로 예측된다. RebD의 스테비올 코어는 MbUGT3-1_1: L239, M242, I244, L280, I353, A354, 및 I357의 하기 소수성 측쇄에 가까운 (4 Å이내) 것으로 예측된다. C13 1-2' 글리코실화는 MbUGT3-1_1: S301 및 D77의 하기 수소 결합 측쇄에 가까운 (4 Å내) 것으로 예측된다. MbUGT3-1_1의 V341-Q352 및 K355-A367 나선의 위치 및 아미노산 함량은 L200A에 대응하는 돌연변이가 이들 나선 사이 루프에 있기 때문에 촉매 작용에 중요할 수 있다. MbUGT3-1_1의 위치 L76 및/또는 D77은 스테비오시드의 C13 글리코실화와 상호작용할 수 있다.
UGT 효소 중 하나 이상의 아미노산 서열은 세포의 전환을 감소시키기 위해 위치 2에 삽입되거나 치환된 알라닌을 선택적으로 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 UGT 효소는 생체 내 추가 안정성을 제공하기 위해 위치 2에 삽입되거나 치환된 알라닌 아미노산 잔기를 포함한다.
아미노산 서열의 동일성, 즉 서열 동일성의 백분율은 서열 정렬을 통해서 결정될 수 있다. 이러한 정렬은 Karlin 및 Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877)에　의해 기술된 것과 같은, 여러 알려진 알고리즘, hmmalign (HMMER 패키지) 또는 CLUSTAL 알고리즘 (Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)을 사용하여 수행될 수 있다. 서열 동일성 (서열 매칭)의 등급은 예를 들어 BLAST, BLAT 또는 BlastZ (또는 BlastX)를 사용하여 계산될 수 있다. 유사한 알고리즘은　 Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램으로 통합되었다. BLAST 단백질 정렬은 BLASTP 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다, 점수 = 50, 단어 길이 = 3. 비교 목적을 위해, 갭 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST는 Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402에 기술된 바와 같이 사용된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램의 디폴트 매개 변수가 사용된다.
UGT 효소는 미생물 세포의 염색체로 통합될 수 있거나, 대안적으로, 염색체　외로　발현된다. 예를 들어, UGT 효소는 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 효모 인공 염색체 (YAC)로부터 발현될 수 있다.
UGT 효소의 발현은 예를 들어, 유전자 모듈 (예를 들어, 오페론) 또는 UGT 효소의 독립적 발현을 사용하여 최적의 활성을 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 유전자의 발현 또는 오페론은 상이한 (예를 들어, 강한, 중간, 또는 약한) 강도를 갖는 유도성 또는 구성적 프로모터와 같은 프로모터의 선택을 통해 조절될 수 있다. 상이한 강도의 프로모터의 여러 비제한적인 예시는 Trc, T5 및 T7을 포함한다. 추가로, 유전자의 발현 또는 오페론은 세포에서 유전자 또는 오페론의 카피 수 조작을 통해 조절될 수 있다.　일부 구현예에서, 세포는 각 UGT 효소의 단일 카피를 발현한다. 일부 구현예에서, 유전자의 발현 또는 오페론은 모듈 내에서 유전자의 순서를 조작하여 조절될 수 있으며, 여기서 먼저 전사된 유전자는 일반적으로 더 높은 수준에서 발현된다. 일부 구현예에서, 유전자의 발현 또는 오페론은 하나 이상의 유전자 또는 오페론의 염색체 내로의 통합을 통해 조절된다.
UGT 발현의 최적화는 또한 적절한 프로모터 및 리보솜 결합 부위의 선택을 통해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 고-카피 수 플라스미드, 또는 단일, 저- 또는 중-카피 수 플라스미드의 선택을 포함할 수 있다. 전사 종결 단계는 또한 스템-루프와 같은 구조의 도입 또는 제거를 통해, 유전자 발현의 조절을 위해 표적화될 수 있다.
전체 세포 전환은 발현된 효소 (예를 들어, 세포 내 발현된 효소)에 의한 글리코실화를 위해 세포에서 사용 가능한 기질 (예를 들어, 글리코시드 중간체) 및 바람직하게는 세포 외 배지로부터 추출될 수 있는 생성물을 필요로 한다. 전체 세포계는 세포가 UDP-글루코스 보조인자 재생을 제공하기 때문에, 이점을 갖는다. 이는 외인성 UDP-글루코스 공급 또는 UDP-글루코스 전구체 또는 UDP-글루코스 재생 메커니즘 또는 UDP-글루코스 재생 효소계를 필요로 하는, 세포 용해 또는 세포 외부 분비로부터 효소를 사용하는 과정과 대조적이다. 본 발명의 구현예에서, 촉매작용 (글리코실화)은 살아있는 미생물 세포를 사용하여 수행되고, UDP-글루코스 보조인자 재순환은 UDP-글루코스 재생을 위한 효소 공급 또는 기질 공급을 필요로 하지 않는 세포 대사를　사용하여　발생한다.
US 2017/0332673은 다운스트림 스테비올 생합성 경로, 및 글루코스로부터 RebM의 생산을 유도하는 UGT 효소와 함께, MEP 경로 효소를 과발현하는 대장균 균주를 기술하고 있다. 그러나, 이들 균주는 RebM로의 공급된 스테비올 글리코시드 중간체의 생촉매작용을 수행하지 않으며, 이는, 부분적으로 숙주 세포가 스테비올 글리코시드 기질에 대한 접근을 획득할 수 없기 때문일 것이다. 본 개시에 따르면, 미생물 세포에 대한 유전적 변형은 전체 세포계에서 추가 글리코실화를 위해 글리코실화 중간체를 사용 가능하게 허용한다. 또한, 생성물은 세포 외 배지로부터 회수될 수 있으며, 이는 생성물의 다운스트림 정제 및 처리를 용이하게 한다.
일부 구현예에서, 미생물 세포는 UDP-글루코스 가용성을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 이론에 얽매이지 않고, 이들 변형은 또한 세포 내로 스테비올 글리코시드를 도입하는 내인성 수송체의 발현 증가를 초래하는, 글루코스 가용성에 대해 세포에 스트레스를 줄 수 있다. 지수 성장하는 대장균에서 야생형 UDP-글루코스 수준은 약 2.5 mM이다 (Bennett BD, Kimball EH, Gao M, Osterhout R, Van dien SJ, Rabinowitz JD. Absolute metabolite concentrations and implied enzyme active site occupancy in Escherichia coli. Nat Chem Biol. 2009;5(8):593-9.). 일부 구현예에서, 숙주 세포에 대한 유전적 변형은 지수 성장하는 세포 (예를 들어, UGT 효소의 재조합 발현을 갖지 않음)에서 UDP-글루코스를 예를 들어, 적어도 5 mM, 또는 적어도 10 mM까지 증가시키도록 조작된다.
일부 구현예에서, 미생물 세포는 UDP-글루코스를 소비하는 효소를 암호화하는 유전자의 결실, 불활성화, 또는 감소된 활성 또는 발현을 갖는다. 예를 들어, 미생물 세포는 ushA (UDP-당 가수 분해 효소) 및/또는 galE, galT, galK, 및 galM (UDP-글루코스로부터 UDP-갈락토스 생합성을 담당함), 또는 미생물 종에서 이의 병렬상동체 중 하나 이상의 결실, 불활성화, 또는 감소된 활성 또는 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, galETKM 유전자는 발현이 불활성화되거나, 결실되거나, 실질적으로 감소된다. 대안적으로 또는 추가로, 미생물 세포는 대장균 otsA (트레할로스-6-인산염 합성효소), 또는 미생물 종에서 이의 병렬상동체의 결실, 불활성화, 또는 감소된 활성 또는 발현을 갖는다. 대안적으로 또는 추가로, 미생물 세포는 대장균 ugd (UDP-글루코스 6-탈수소효소), 또는 미생물 종에서 이의 병렬상동체의 결실, 불활성화, 또는 감소된 활성 또는 발현을 갖는다. otsA 및 ugd의 활성을 감소시키거나 제거하면 각각 트레할로스 또는 UDP-글루쿠로니데이트에 대한 UDP-글루코스 싱크를 제거하거나 감소시킬 수 있다.
감소되거나 제거될 수 있는 다른 UDP-글루코스 싱크는 지질 글리코실화 및 LPS 생합성을 담당하는 유전자, 및 글리코실화 운데카프레닐-이인산염 (UPP)을 담당하는 유전자의 활성 또는 발현을 제거하거나 감소하는 것을 포함한다. 글리코실화 지질 또는 LPS 생합성에 관여하는 유전자는 대장균 waaG (지질다당류 글루코실트랜스퍼라제 1), 대장균 waaO (UDP-D-글루코스:(글루코실)LPS α-1,3-글루코실트랜스퍼라제)), 및 대장균 waaJ (UDP-글루코스:(글리코실)LPS α-1,2-글루코실트랜스퍼라제))를 포함한다. 글리코실화 운데카프레닐-이인산염 (UPP)을 담당하는 유전자는 대장균 yfdG (추정 박테로프레놀 연결된 글루코스 트랜스로카제), 대장균 yfdH (박테로프레놀 글루코실 트랜스퍼라제), 대장균 yfdI (혈청형 특이적 글루코실 트랜스퍼라제), 및 대장균 wcaJ (운데카프레닐-인산염 글루코스 포스포트랜스퍼라제)를 포함한다. 이들 유전자 생성물 (또는 미생물 세포에서 대응하는 병렬상동체) 중 하나 이상의 활성 또는 발현의 결실, 불활성화, 또는 감소는 UDP-글루코스 가용성을 증가시킬 수 있다.
이들 또는 다른 구현예에서, 미생물 세포는 UDP-글루코스의 전구체를 소비하는 효소를 암호화하는 유전자의 결실, 불활성화, 또는 감소된 활성 또는 발현을 갖는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 미생물 세포는 pgi (글루코스-6 인산염 이소메라제), 또는 숙주 세포의 미생물 종에서 이의 병렬상동체의 결실, 불활성화, 또는 감소된 활성 또는 발현을 갖는다.
이들 또는 다른 구현예에서, 세포는 글루코스-6-인산염을 UDP-글루코스로 전환하는데 관여하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자의 과발현 또는 증가된 활성을 갖는다. 예를 들어, pgm (포스포글루코무타제) 및/또는 galU (UTP-글루코스-1-인산염 우리딜릴트랜스퍼라제) (또는 이의 병렬상동체 또는 유도체)은 효소 생산성을 증가시키기 위해 과발현되거나 변형될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 글루코스-6-인산염을 글루코스-1-인산염으로 전환하는, 대장균 ycjU (β-포스포글루코무타제), 및 글루코스-1-인산염을 UDP로 전환하는, 비피도박테리움 비피덤 ugpA, 또는 이들 효소의 병렬상동체 또는 유도체 효소는 생산성을 증가시키기 위해 과발현되거나 변형될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 미생물 세포는 오탄당 인산염 경로 (PPP)로의 유동을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형, 예를 들어 NADP+-의존성 글루코스-6-인산염 탈수소효소인, 대장균 zwf (또는 이의 상동체 또는 조작된 유도체)의 과발현 또는 증가된 활성을 갖는다.
대안적으로 또는 추가로, 미생물 세포는 글루코스 수송을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖는다. 이러한 변형은 대장균 galP (갈락토스:H+동시수송체) 및 대장균 glk (글루코키나제), 또는 대안적으로 자이모모나스 모빌리스 glf 및 대장균 glk, 또는 이들 유전자의 상동체, 병렬상동체, 또는 조작된 유도체의 증가된 발현 또는 활성을 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 미생물 세포는 UTP 생산 및 재순환을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖는다. 이러한 변형은 대장균 pyrH (UMP 키나제), 대장균 cmk (시티딜레이트 키나제), 대장균 adk (아데닐레이트 키나제), 또는 대장균 ndk (뉴클레오시드 이인산염 키나제), 또는 이들 효소의 상동체, 병렬상동체, 또는 조작된 유도체의 증가된 발현 또는 활성을 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 미생물 세포는 UDP 생산을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖는다. 이러한 변형은 이의 상동체, 병렬상동체, 또는 조작된 유도체를 비롯한, 대장균 upp (우라실 포스포리보실트랜스퍼라제), 대장균 dctA (C4 디카르복실레이트/오로테이트:H+동시수송체), 대장균 pyrE (오로테이트 포스포리보실트랜스퍼라제), 및 대장균 pyrF (오로티딘-5'-인산염 탈탄산효소) 중 하나 이상의 과발현 또는 증가된 활성을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 미생물 세포는 upp, pyrH 및 cmk, 또는 이의 상동체 또는 조작된 유도체를 과발현하거나 이의 활성을 증가시킨다. 대안적으로, 미생물 세포는 dctA, pyre, pyrH 및 cmk, 또는 이의 상동체 또는 조작된 유도체를 과발현하거나 이의 활성을 증가시킨다.
대안적으로 또는 추가로, 미생물 세포는 글루코스 흡수 조절을 제거하거나 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 미생물 세포는 대장균에서 작은 조절 RNA인, sgrS의 결실, 불활성화 또는 감소된 발현을 가질 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 미생물 세포는 글루코스-1-인산염의 탈인산화를 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 가질 수 있다. 예시적 변형은 대장균 agp (글루코스-1-포스파타제), 대장균 yihX (α-D-글루코스-1-인산염 포스파타제), 대장균 ybiV (당 포스파타제), 대장균 yidA (당 포스파타제), 대장균 yigL (인당 포스파타제), 및 대장균 phoA (알카라인 포스파타제), 또는 미생물 세포에서 이의 병렬상동체 중 하나 이상의 결실, 비활성화, 또는 감소된 발현 또는 활성을 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 미생물 세포는 글루코스-1-인산염의 TDP-글루코스로의 전환을 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 가질 수 있다. 예시적 변형은 대장균 rffH (dTDP-글루코스 피로포스포릴라제) 및 대장균 rfbA (dTDP 글루코스 피로포스포릴라제), 또는 미생물 세포에서 이의 병렬상동체 중 하나 이상의 결실, 비활성화, 또는 감소된 발현 또는 활성을 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 미생물 세포는 글루코스-1-인산염의 ADP-글루코스로의 전환을 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 가질 수 있다. 예시적 변형은 대장균 gigC (글루코스-1-인산염 아데닐릴트랜스퍼라제), 또는 미생물 세포에서 이의 병렬상동체 중 하나 이상의 결실, 비활성화, 또는 감소된 발현 또는 활성을 포함한다.
일부 구현예에서, 미생물 세포는 하기 유전적 변형을 포함하는 박테리아 세포이다: ushA 및 galETKM은 결실, 비활성화, 또는 발현이 감소되며; pgi는 결실, 비활성화, 또는 발현이 감소되며; 그리고 pgm 및 galU는 과발현되거나 보완된다.
일부 구현예에서, 내인성 유전자는 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변경함으로써 효소 활성을 비활성화 또는 감소시키거나, 발현 조절 서열의 편집을 통해 발현을 감소시키기 위해 편집된다. 편집은 내인성 프로모터, 리보솜 결합 서열, 또는 다른 발현 조절 서열을 변형시킬 수 있고/있거나, 일부 구현예에서 유전자 조절에서 트랜스-작용 및/또는 시스-작용 인자를 변형시킨다. 게놈 편집은 CRISPR/Cas 게놈 편집 기술, 또는 징크 핑거 뉴클레아제 및 TALEN을 사용하는 유사한 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 내인성 유전자는 상동성 재조합에 의해 대체된다.
다양한 구현예에서 미생물 세포는 전구체 (예를 들어, 하나 이상의 식물 효소를 포함함)의 생산을 위한 재조합 생합성 경로를 발현하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 구현예에 따라 RebM (및 다른 고급 글리코실화 생성물)을 생산하는 미생물 세포에 대해, 스테비올 생합성 경로, 예를 들어 코파닐 합성효소, 카우렌 합성효소, 카우렌 산화효소 및/또는 카우레노산 수산화효소를 발현하지 않기 때문에, RebM 및 다른 고급 글리코실화 생성물의 생산은 세포에 대한 스테비올 글리코시드 중간체의 공급에 의존적이다.
다양한 구현예에서, 미생물 세포는 에스케리치아 속, 바실러스 속, 로도박터 속, 자이모모나스 속, 또는 슈도모나스 속으로부터 선택된 박테리아이다. 일부 구현예에서, 박테리아 종은 에스케리치아 콜리, 바실러스 서브틸리스, 로도박터 캡술라투스, 로도박터 스페로이드스, 자이모모나스 모빌리스, 또는 슈도모나스 푸티다로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 박테리아 세포는 대장균이다.
다른 구현예에서, 세포는 진균 세포 예를 들어 예를 들어, 사카로미세스 속, 스키조사카로미세스 속, 피치아 속, 파피아 속, 클루이베로마이세스 속, 칸디다 속, 탈라로마이세스 속, 브레타노마이세스 속, 파키솔렌 속, 데바리오마이세스 속, 야로위아 속, 및 산업 배수체 효모 균주와 같은 효모 세포이다. 한 구현예에서, 효모는 사카로미세스 세레비시아, 피치아 파스토리스, 및 야로위아 리포리티카를 비롯한, 사카로미세스, 피치아, 또는 야로위아의 종일 수 있다. 일부 구현예에서, 효모 세포는 추가 글리코실화를 위해 세포 내로 글리코시드 중간체를 도입하는, 하나 이상의 박테리아 수송체, 또는 이의 유도체를 발현한다.
다양한 구현예에서, 미생물 세포는 하나 이상의 내인성 수송체의 과발현을 갖거나 (예를 들어, 모　미생물　균주와 비교하여), 또는 특정 구현예에서, 재조합 및/또는 조작된 수송 단백질을 발현하도록　변형된다. 일부 구현예에서, 미생물 세포는 내인성 수송 단백질, 또는 이의 유도체의 하나 이상의 추가 카피를 발현한다. 예를 들어, 수송 단백질의 발현 또는 활성은 생성물, 예를 들어 RebM 및/또는 RebD, 및/또는 다른 고급 글리코실화 스테비올 글리코시드를 배출하는 동안, 스테비올 글리코시드 중간체 (예를 들어, 그 중에서도 스테비오시드, 스테비올비오시드, 및 RebA 중 하나 이상)의 세포 내로의 수송을 증가시키기 위해 변형될 수 있다.
미생물 세포에서 변경된 활성 또는 기질 특이성을 위해 과발현되거나 조작될 수 있는 예시적 수송 단백질은 대장균 acrAD, xylE, ascF, bglF, chbA, ptsG/crr, wzxE, rfbX, 뿐만 아니라 병렬상동체 또는 이의 유도체를 포함한다. 이들 단백질의 유도체 및 병렬상동체는 일반적으로 대장균 수송 단백질에 대해 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50% 동일성, 적어도 약 60% 동일성, 적어도 약 70% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 85% 동일성, 또는 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
acrAD는 Aires JR 및 Nikaido H., Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli, J Bacteriol. 2005; 187(6):1923-9에 기술된 대장균 다중약물 유출 펌프이다. 추가로 상동체 구조는 Yu, EW, 등, Structural basis of multiple drug-binding capacity of the AcrB multidrug efflux pump, Science 2003; 300(5621):976-80에 기술되어 있다.
xylE는 글루코스 수송체와 상동성을 갖는 대장균 자일로스 수송체이다. xylE는 Sun L, 등, Crystal structure of a bacterial homologue of glucose transporters GLUT-1-4 , Nature 2012;490(7420):361-6에 의해 기술된 구조와 함께, Sumiya M, 등, Molecular genetics of a receptor protein for D-xylose, encoded by the gene xylF, in Escherichia coli , Recept Channels 1995;3(2):117-28에 기술되어 있다.
ascF는 Hall BG 및 Xu L, Nucleotide sequence, function, activation, and evolution of the cryptic asc operon of Escherichia coli K12 , Mol. Biol. Evol. 1992;9(4):688-706에 의해 기술된다. asc 오페론은 대장균에서 셀로비오스 대사에 역할을 하는 것으로 간주된다.
bglF는 Schnetz K, 등, Identification of catalytic residues in the beta-glucoside permease of Escherichia coli by site-specific mutagenesis and demonstration of interdomain cross-reactivity between the beta-glucoside and glucose systems, J. Biol. Chem. 1990;265(23):13464-71에 의해 기술된다. 상동 구조는 Herzberg O., An atomic model for protein-protein phosphoryl group transfer, J. Biol. Chem. 1992;276(34):24819-23에 기술되어 있다. bglF는 베타-글루코시드의 수송 및 인산화를 촉매 작용한다.
chba는 Keyhani NO, 등, The transport/phosphorylation of N,N'-diacetylchitobiose in Escherichia coli . Characterization of phosphor-IIB(Chb) and of a potential transition state analogue in the phosphotransfer reaction between the proteins IIA(Chb) and IIB(Chb). J. Biol. Chem. 2000;275(42):33102-9에 기술되어 있고; Tang C, 등, Solution structure of enzyme IIA(Chitobiose) from the N,N'-diacetylchitobiose branch of the Escherichia coli phosphotransferase system. J. Biol. Chem. 2005;280(12):11770-80에 기술된 구조와 함께이다. 포스포에놀피루베이트-의존성 당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (당 PTS)은 세포 막을 거친 이들의 전위에 수반하는 도입 당 기질의 인산화를 촉매작용하는 주요 탄수화물 능동 수송 시스템이다.
ptsG는 포스포트랜스퍼라제 수송 시스템 (PTS)의 글루코스-특이적 투과효소를 암호화하고 Meins M, 등, Glucose permease of Escherichia coli . Purification of the IIGIc subunit and functional characterization of its oligomeric forms. J. Biol. Chem. 1988;263(26):12986-93에 기술되어 있다. 구조는 Cai M, 등, Solution structure of the phosphoryl transfer complex between the signal-transducing protein IIAGlucose and the cytoplasmic domain of the glucose transporter IICBGlucose of the Escherichia coli glucose phosphotransferase system. J. Biol. Chem. 2003;278(27):25191-206에 기술되어 있다.
분자 수송에서 wzxE 및 이의 역할은 Rick PD, 등, Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 2003;278(19):16534-42에서 기술된다.
rfbx는 Hong Y, 등, Progress in our understanding of wzx flippase for translocation of bacterial membrane lipid-linked oligosaccharide. J. Bacteriol. 2018;200(1)에 기술된 지질다당류 수송체이다.
다른 수송 단백질은 세포 내로 원하는 글리코시드 중간체를 수송하고/하거나 세포 밖으로 원하는 생성물을 내보내는 박테리아 또는 내인성 수송 단백질로부터 선택된 것을 포함한다. 예를 들어, 수송체는 숙주 종, 또는 다른 박테리아 또는 효모 종으로부터일 수 있고, 특정 글리코시드 중간체 또는 생성물에 대한 이의 친화성을 조정하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 ampG, araE, araJ, bcr, cynX, emrA, emrB, emrD, emrE, emrK, emrY, entS, exuT, fsr, fucP, galP, garP, glpT, gudP, gudT, hcaT, hsrA, kgtP, lacY, lgoT, lplT, lptA, lptB, lptC, lptD, lptE, lptF, lptG, mdfA, mdtD, mdtG, mdtH, mdtM, mdtL, mhpT, msbA, nanT, narK, narU, nepI, nimT, nupG, proP, setA, setB, setC, shiA, tfaP, tolC, tsgA, uhpT, xapB, xylE, yaaU, yajR, ybjJ, ycaD, ydeA, ydeF, ydfJ, ydhC, ydhP, ydjE, ydjK, ydiM, ydiN, yebQ, ydcO, yegT, yfaV, yfcJ, ygaY, ygcE, ygcS, yhhS, yhjE, yhjX, yidT, yihN, yjhB, 및 ynfM으로부터 선택된 대장균 수송체에 대해 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50% 동일한 수송체를 과발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 수송체는 대장균 수송체에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일하다.
일부 구현예에서, 미생물 세포는 진핵 세포, 예를 들어 효모, 진균 또는 식물 세포로부터의 수송체에 대해 적어도 50% 동일한 수송 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, 수송 단백질은 ABC 패밀리 수송체이며, 이는 선택적으로 서브클래스 PDR (다약제 내성) 수송체, MDR (다중 약물 내성) 수송체, MFS 패밀리 (주요 조절자 수퍼패밀리) 수송체, 또는 SWEET (PQ-루프, 타액, 또는 MtN3 패밀리로도 알려짐) 패밀리 수송체이다. 다른 구현예에서, 수송 단백질은 하기로부터 선택된 패밀리이다: AAAP, SulP, LCT, APC, MOP, ZIP, MPT, VIC, CPA2, ThrE, OPT, Trk, BASS, DMT, MC, AEC, Amt, Nramp, TRP-CC, ACR3, NCS1, PiT, ArsAB, IISP, GUP, MIT, Ctr, 및 CDF.
일부 구현예에서, 수송체는 ABC 패밀리 수송 단백질 (ATP-결합 카세트 수송체로도 알려짐)이며, 이는 일반적으로 다중 서브유닛을 포함하고, 이 중 하나 이상은 막 관통 단백질이고, 이 중 하나 이상은 막-연관 ATP아제이다. ATP아제 서브유닛은 아데노신 삼인산염 (ATP) 결합 및 가수 분해의 에너지를 활용하여 기질의 흡수 또는 배출을 위해, 막을 가로질러 다양한 기질의 전위를 활성화한다. ABC 패밀리 수송체는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 서브클래스일 수 있다: ABCA, ABCB, ABCC, ABCD, ABCE, ABCF, 및 ABCG.
일부 구현예에서, 수송 단백질은 MFS 패밀리 수송 단백질 (주요 조절자 수퍼패밀리로도 알려짐)이며, 이는 화학 삼투성 이온 구배에 반응하여　작은 용질을 수송할 수 있는 단일-폴리펩티드 2차 담체이다. MFS 수송 단백질에 의해 수송되는 화합물은 단순 당, 올리고당, 이노시톨, 약물, 아미노산, 뉴클레오시드, 유기인산염 에스테르, 크렙스 회로 대사산물, 및 다양한 유기 및 무기 음이온 및 양이온을 포함할 수 있다. 예시로서, MFS 수송 단백질은 XylE (대장균 유래), QacA (S. 아우레우스 유래), Bmr (B. 서브틸리스 유래), UhpT (대장균 유래), LacY (대장균 유래), FucP (대장균 유래), 및 ExtU (대장균 유래)를 포함한다.
일부 구현예에서, 수송체는 수송 단백질의 SWEET (당은 결국 배출 수송체가 될 것임) 패밀리이며 (PQ-루프, 타액 또는 MtN3 패밀리로도 알려짐), 이는 당 수송체의 패밀리이며 TOG 수퍼패밀리의 구성원이다. SWEET의 진핵 패밀리 구성원은 3+1+3 반복 배열된 7개의 막관통 세그먼트 (TMS)를 갖는다. 예시로서, SWEET 수송체 단백질은 SWEET1, SWEET2, SWEET9, SWEET12, SWEET13, 및 SWEET14를 포함한다.
일부 구현예에서, 수송 단백질은 S. 세레비시아의 수송 단백질에 대해 적어도 50% 동일하다. 일부 구현예에서, 수송체는 S. 세레비시아 수송체에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일하다. 예시적 S. 세레비시아 수송 단백질은 AC1, ADP1, ANT1, AQR1, AQY3, ARN1, ARN2, ARR3, ATG22, ATP4, ATP7, ATP19, ATR1, ATX2, AUS1, AVT3, AVT5, AVT6, AVT7, AZR1, CAF16, CCH1, COT1, CRC1, CTR3, DAL4, DNF1, DNF2, DTR1, DUR3, ECM3, ECM27, ENB1, ERS1, FEN2, FLR1, FSF1, FUR4, GAP1, GET3, GEX2, GGC1, GUP1, HOL1, HCT10, HXT3, HXT5, HXT8, HXT9, HXT11, HXT15, KHA1, ITR1, LEU5, LYP1, MCH1, MCH5, MDL2, MME1, MNR2, MPH2, MPH3, MRS2, MRS3, MTM1, MUP3, NFT1, OAC1, ODC2, OPT1, ORT1, PCA1, PDR1, PDR3, PDR5, PDR8, PDR10, PDR11, PDR12, PDR15, PDR18, PDRI, PDRI 1, PET8, PHO89, PIC2, PMA2, PMC1, PMR1, PRM10, PUT4, QDR1, QDR2, QDR3, RCH1, SAL1, SAM3, SBH2, SEO1, SGE1, SIT1, SLY41, SMF1, SNF3, SNQ2, SPF1, SRP101, SSU1, STE6, STL1, SUL1, TAT2, THI7, THI73, TIM8, TIM13, TOK1, TOM7, TOM70, TPN1, TPO1, TPO2, TPO3, TPO4, TRK2, UGA4, VBA3, VBA5, VCX1, VMA1, VMA3, VMA4, VMA6, VMR1, VPS73, YEA6, YHK8, YIA6, YMC1, YMD8, YOR1, YPK9, YVC1, ZRT1; YBR241C, YBR287W, YDR061W, YDR338C, YFR045W, YGL114W, YGR125W, YIL166C, YKL050C, YMR253C, YMR279C, YNL095C, YOL075C, YPR003C, 및 YPR011C를 포함한다.
일부 구현예에서, S. 세레비시아 수송 단백질은 ADP1, AQR1, ARN1, ARN2, ATR1, AUS1, AZR1, DAL4, DTR1, ENB1, FLR1, GEX2, HOL1, HXT3, HXT8, HXT11, NFT1, PDR1, PDR3, PDR5, PDR8, PDR10, PDR11, PDR12, PDR15, PDR18, QDR1, QDR2, QDR3, SEO1, SGE1, SIT1, SNQ2, SSU1, STE6, THI7, THI73, TIM8, TPN1, TPO1, TPO2, TPO3, TPO4, YHK8, YMD8, YOR1, 및 YVC1 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, S. 세레비시아 수송 단백질은 FLR1, PDR1, PDR3, PDR5, PDR10, PDR15, SNQ2, TPO1, 및 YOR1 중 하나 이상으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 수송체는 XP_013706116.1 (브라시카 나푸스 유래), NP_001288941.1 (브라시카 라파 유래), NEC1 (페투이나 하이브리다 유래), 및 SWEET13 (트리티쿰 우라르투 유래)에 대해 적어도 50%, 적어도 60% 동일, 적어도 70 동일, 적어도 80% 동일, 또는 적어도 90 또는 95% 동일하다.
RebM의 생합성에 대한 다양한 구현예에서, 방법은 스테비오시드, 스테비올비오시드, 및 RebA의 RebM으로의 적어도 40% 전환, 또는 적어도 50% 전환, 또는 적어도 75% 전환을 초래한다. 일부 구현예에서, RebM 대 RebD의 비율은 적어도 2:1, 또는 적어도 4:1, 또는 적어도 6:1, 또는 적어도 8:1, 또는 적어도 9:1, 또는 적어도 10:1, 또는 적어도 15:1, 또는 적어도 20:1이다.
방법은 배치 발효, 유가 발효, 연속 발효, 또는 반연속 발효에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 방법은 약 72시간 미만, 또는 일부 구현예에서, 약 48시간 미만, 또는 약 24시간 미만의 배양 시간으로 배치 발효 또는 유가 발효에 의해 수행된다.
천연 UGT 효소는 일반적으로 식물 효소 (이는 종종 20-24℃ 범위의 최적 온도를 가짐) 또는 식물 효소로부터 유래된 것인 반면, 본 개시는 일부 구현예에서 24℃ 이상, 예를 들어 약 24℃ 내지 약 37℃, 또는 약 27℃ 내지 약 37℃, 또는 약 30℃ 내지 약 37℃ 온도에서 효소 생산성을 갖는, 미생물 세포 (예를 들어, 대장균과 같은 박테리아 세포)에서 높은 수율로 글리코실화 생성물의 생산을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 성장 또는 생산 단계 배지는 성장 또는 생존력에 큰 영향을 주지 않으면서, 세포 투과성을 향상시키기에 충분한 양으로 하나 이상의 세제를 함유할 수 있다. 예시적 세제는 그 중에서도, 트윈 20, 트리톤 X-100, 및 SDS를 포함한다.
일부 구현예에서, 공정은 대규모 생산을 위해 확장 가능하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 배양물의 크기는 적어도 약 100 L, 적어도 약 200 L, 적어도 약 500 L, 적어도 약 1,000 L, 또는 적어도 약 10,000 L이다.
다양한 구현예에서, 방법은 세포 배양물 또는 세포 용해물로부터 글리코실화 생성물을 회수하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 배양물은 적어도 약 100 mg/L, 또는 적어도 약 200 mg/L, 또는 적어도 약 500 mg/L, 또는 적어도 약 1 g/L, 또는 적어도 약 2 g/L, 또는 적어도 약 5 g/L, 또는 적어도 약 10 g/L, 또는 적어도 약 20 g/L, 또는 적어도 약 30 g/L, 또는 적어도 약 40 g/L, 또는 적어도 약 50 g/L의 글리코실화 생성물을 생산하며, 이는 일부 구현예에서 배양 배지로부터 추출된다.
일부 구현예에서, 글리코실화 생성물 (예를 들어, RebM)은 배지 구성성분으로부터 추출된다. 따라서, 일부 구현예에서, 방법은 숙주 세포로부터 성장 배지를 분리하고, 성장 배지로부터 원하는 글리코실화 생성물 (예를 들어, RebM)을 단리하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, RebM과 같은 생성물은 세포 물질로부터 추가로 추출된다.
일부 측면에서, 본 발명은 글리코실화 생성물, 예를 들어 RebM을 포함하는 제품을 제조하는 방법을 제공한다. 방법은　 표적 스테비올 글리코시드 (본 개시 내용에 따라 생산됨)를 제품, 예를 들어 식품, 음료, 구강 관리 제품, 감미료, 향미제 또는 다른 제품으로 통합시키는 것을 포함한다. 본 발명에 따라 제조된, 정제된 스테비올 글리코시드는 식품, 음료, 결착제 (예를 들어, 전분, 섬유, 검, 지방 및 지방 모방체, 유화제), 약학 조성물, 담배 제품, 기능식품 조성물, 구강 위생 조성물, 및 화장품 조성물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 제품에 사용될 수 있다. RebM을 조합하여 사용할 수 있는 향미의 비제한적인 예시는 라임, 레몬, 오렌지, 과일, 바나나, 포도, 배, 파인애플, 망고, 비터 아몬드, 콜라, 시나몬, 설탕, 솜사탕 및 바닐라 향을 포함한다. 다른 식품 성분의 비제한적 예시는 향미제, 산미료 및 아미노산, 착색제, 증량제, 변형 전분, 검, 질감제, 방부제, 항산화제, 유화제, 안정제, 증점제 및 겔화제를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 스테비올 글리코시드, 모그로시드, 수크랄로스, 아스파탐, 네오탐, 아드반탐, 아세설팜 칼륨, 사카린, 시클라메이트, 네오헤스페리딘 디히드로칼콘, 그네티폴린 E, 및/또는 피케탄올 4'-O-β-D-글루코피라노시드 중 2개 이상을 포함하는 복수의 고강도 감미료를 포함하는 감미료　제품을　제조하는 방법을 제공한다. 방법은 감미료 제품을 식품, 음료, 구강 관리 제품, 감미료, 향미제, 또는 상기 기술된 것들을 포함하는 다른 제품에 통합시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
표적 스테비올 글리코시드(들), 예를 들어 RebM, 및 이들을 포함하는 감미료 조성물은 다양한 생리 활성 물질 또는 기능성 구성 요소와 조합하여 사용할 수 있다. 기능성 구성 요소는 일반적으로 카로티노이드, 식이 섬유, 지방산, 사포닌, 항산화제, 기능 식품, 플라보노이드, 이소티오시아네이트, 페놀, 식물성 스테롤 및 스타놀 (피토스테롤 및　피토스타놀); 폴리올; 프리바이오틱스, 프로바이오틱스; 식물성 에스트로겐; 콩 단백질; 황화물/티올; 아미노산; 단백질; 비타민; 및 무기질과 같은 범주로 분류된다. 기능성 구성 요소는 또한 심혈관, 콜레스테롤 감소, 및 항염증과 같은 건강상의 이점을 기준으로 분류될 수도 있다.
또한, 표적 스테비올 글리코시드(들), 예를 들어 RebM, 및 본 발명에 따라 얻어진 감미료 조성물은 제로 칼로리, 감소된 칼로리 또는 당뇨병 환자용 음료 및 향상된 맛 특성이 있는 식품 제품을 생산하기 위해 고강도 감미제로서 적용될 수 있다. 이는 또한 음료, 식품, 의약품, 및 설탕을 사용할 수 없는 다른 제품에 사용할 수 있다. 게다가, RebM 및 감미료 조성물은 인간 소비 전용 음료, 식품, 및 다른 제품뿐만 아니라 개선된 특성이 있는 동물 먹이 및 사료에서 감미제로서 사용할 수 있다.
표적 스테비올 글리코시드(들) 및 감미료 조성물이 사용될 수 있는 제품의 예시는 보드카, 포도주, 맥주, 술, 및 사케 등과 같은 알코올 음료; 천연 주스; 청량 음료; 탄산 음료; 다이어트 음료; 제로 칼로리 음료; 칼로리 감소 음료 및 음식; 요구르트 음료; 인스턴트 주스;　인스턴트 커피; 분말 형태의 인스턴트 음료; 통조림 제품; 시럽; 된장; 간장; 식초;　드레싱;　마요네즈;　케첩;　카레;　수프;　인스턴트 부용; 분말 간장;　분말 식초; 비스킷 종류; 쌀 비스킷; 크래커; 빵; 초콜릿; 캐러멜;　사탕; 츄잉검; 젤리; 푸딩; 보존 과일 및 채소; 생크림; 잼;　마멀레이드; 꽃풀;　분유;　아이스크림; 셔벗; 병에 포장된 채소 및 과일; 통조림 및 삶은 콩; 달게 한 소스로 삶은 고기 및 식품; 농업용 식물성 식품; 해산물; 햄;　소시지;　생선 햄;　생선 소시지;　어묵; 튀긴 생선 제품;　건어물; 냉동 식품;　보존 해초;　보존육;　담배;　의약품; 및 기타 다수를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
식품, 음료, 의약품, 화장품, 탁상용　제품, 및 츄잉껌과 같은 제품의 제조 동안, 혼합, 반죽, 용해, 산세, 침투, 삼출, 살수, 분무, 주입 및 다른 방법과 같은 기존 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예는 하기 비제한적인 실시예에서 입증된다.
실시예
표 2는 스테비아 잎 추출물의 3개 배치의 스테비올 글리코시드 함량을 나타낸다. RebM으로의 경로 상의, 2개의 중간체, RebA 및 스테비오시드가 배치에서 두 가지 주요 글리코시드이다.
Figure 112021017673056-pct00002
도 4는 글리코실화 스테비올 글리코시드 중간체의 생물전환을 나타낸다. 실험에서, 0.2 mM 스테비올비오시드를 96 웰 플레이트에서 조작된 대장균 균주에 공급하였다. 생성물 형성은 48시간 후 조사하였다. 스테비올비오시드와 같은 초기 중간체의 전체 세포 생물전환이 가능하지만, 천연 대장균의 경우 글리코실화 기질은 UGT 효소에서 사용할 수 없다 (균주 5는 실질적인 활성을 나타내는 반면, 균주 3 및 4는 무시할 정도의 활성을 나타냄). 균주의 세부 사항은 도 8에 기술되어 있다. 도 4에 보고된 값은 대조군 대비 화합물 농도이다 (각각의 화합물 농도는 빈 벡터 대조군에 대한 이들 화합물의 총 농도로 나눔). 균주 5에 함유된 변형은 스테비올비오시드의 RebM으로의 생물전환을 입증한다.
각각의 균주 1-5는 단일 카피 플라스미드인 BAC (박테리아 인공 염색체)를 함유하였고, 이는 4개의 UGT 효소: MbUGTC13, MbUGT1.2_2, MbUGTc19_2, 및 76G1_L200A를 개별적으로 발현한다. 대조군은 동일한 BAC 백본을 함유하지만 UGT 효소는 없다.
도 8은 RebM 경로에서 UGT에 대한 중요한 기질인, UDP-글루코스로의 천연 대장균 유동을 증가시키는 유전적 변형을 나타낸다. UDP-글루코스로의 천연 유동보다 더 커짐은 UGT에 사용할 수 있는 기질의 양을 증가시킴으로써 RebM 형성을 더 크게 허용할 수 있다. 균주 5에서 발생한 변형은 공급 스테비올 글리코시드를 RebM으로 전환하는 세포의 능력을 또한 유발한다. 균주 2 및 3의 경우, UDP-글루코스 (ushA, galETKM)를 소비하는 효소를 결실시켰다. 균주 4는 UDP-글루코스의 전구체, 글루코스-6-인산염 (G6P)를 소비하는 효소 (pgi)을 결실시킴으로써 균주 3으로부터 구축하였다. 균주 5는 글루코스-1-인산염 (G1P)을 통해 G6P를 UDP-글루코스 (pgm, galU)로 전환하기 위해 사용되는 2개의 효소를 과발현시킴으로써 균주 4로부터 구축하였다.
도 5는 잎 추출물에서 발견되는 2개의 시판 중간체, 스테비오시드 및 RebA의 RebM으로의 전환을 나타낸다. 또한 스테비올 코어의 생물전환을 나타낸다. 값은 총 스테비올 글리코시드 조성물의 백분율로서 보고된다. 모든 균주에 의한 스테비올의 RebM으로의 전환은 모든 균주가 RebM을 형성할 수 있음을 나타낸다. 스테비올비오시드의 경우, 스테비오시드 및 RebA 모두 RebM으로 전환되지만, 오직 균주 5에서만이다. 오직 균주 5만이 스테비올 글리코시드를 UGT 효소에 사용 가능하게 할 것이다. 스테비오시드 및 RebA로부터의 전환의 경우, RebD:RebM의 비율은 강하게 RebM을 선호한다 (1:20). RebM은 배지로 분비되었다.
도 6은 96-웰 플레이트에서 스테비올 글리코시드의 생물전환을 나타낸다. 이들 연구에서, 76G1_L200A는 MbUGT1-3_1.5로 대체되었다. RebM 경로의 5가지 주요 화합물에 대해, 화합물 농도를 UGT 효소가 발현되거나 발현되지 않은 상태로 나타낸다. 균주에 0.5 g/L의 스테비오시드/RebA 잎 추출물을 공급하고 샘플링 전 48시간 동안 기질과 함께 배양하였다. 나타낸 바와 같이, 세포는 단지 소량의 RebI 및 RebD와 함께, 거의 독점적으로 RebM을 만든다.
초기 생물반응기 실험에 균주를 사용하였다. 구체적으로, RebM-생산 균주를 적합한 항생제와 함께 10 mL의 LB (루리아-베르타니) 액체 배지를 함유하는 50 mL 원심분리 튜브에 작업용 세포 은행으로부터 접종하였다. 첫 번째 종자를 37℃에서 진탕 배양기에서 20시간 동안 배양하였다. 20시간 후, 첫 번째 종자를 사용하여 500 mL 삼각 플라스크에 100 mL의 발효 배지를 접종하여 두 번째 종자 배양을 시작하였다. 이러한 두 번째 종자를 각각 170 mL의 발효 배지를 함유하는, 생물반응기로 이동시키기 전에 10시간 동안 배양하였다. 샘플링은 매 10시간마다 수행하였다. LC-MS-MS 및 YSI를 사용하여 배지의 관련 대사산물을 정량하였다. 흡광도 600 nm에서 분광 광도계를 통해 세포 밀도를 측정하였다. 도 7은 생물반응기 규모에서 스테비오시드/RebA 잎 추출물의 생물전환을 나타낸다. RebM 경로의 5가지 주요 화합물에 대해, 배지의 화합물 농도를 발효에 걸쳐 다양한 시점에서 샘플링하였다. 균주에 2 g/L의 스테비오시드/RebA 잎 추출물을 공급하고 총 30시간 동안 기질과 배양하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 스테비오시드 및 RebA는 시간이 지남에 따라 손실되며, RebM, RebI, 및 RebD와 같은 고도로 글리코실화된 생성물이 이에 상응하여 증가한다.
스테비올비오시드, 스테비오시드, 및 RebA와 같은 경로 중간체를 RebM으로 전환하는 UGT 효소는 대장균 세포질에서 발현되며 따라서 중간체를 아마도 수송체의 작용 또는 증가된 막 투과성을 통해, UGT 효소가 사용 가능하게 만드는 것이 필요하다.
스테비올 글리코시드는 천연 대장균 균주에 의해 흡수되지 않을 큰 분자이다. 이는 균주 1에 의한 스테비올비오시드의 RebM로의 무시할 만한 전환을 설명할 것이다. 균주 1-4는 초기, 비-글리코실화 중간체(스테비올)를 흡수하고 이를 RebM으로 전환시킬 수 있으며, 무시할 만한 전환의 이유가 세포질로의 스테비올 글리코시드 흡수의 결여이며, 이러한 조건하에 경로 중간체 상의 UGT 효소의 비활성이 아님을 시사한다.
서열
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MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL
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(서열 번호 7)
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(서열 번호 9)
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(서열 번호 10)
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(서열 번호 11)
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>MbUGTC13 (스테비아 레바우디아나 UGT85C2, P215T)
(서열 번호 13)
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>76G1_L200A [스테비아 레바우디아나, L200A]
(서열 번호 14)
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(서열 번호 15)
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>MbUGT1-3_2 [원형 치환체]
(서열 번호 17)
MAFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHGGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRLMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLGSGGSGRRRRIILFPVPFQGHINPMLQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELQMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLPRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQIAKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLEHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSQS
>SgUGT720-269-1 (시라이티아 그로스베노리)
(서열 번호 18)
MEDRNAMDMSRIKYRPQPLRPASMVQPRVLLFPFPALGHVKPFLSLAELLSDAGIDVVFLSTEYNHRRISNTEALASRFPTLHFETIPDGLPPNESRALADGPLYFSMREGTKPRFRQLIQSLNDGRWPITCIITDIMLSSPIEVAEEFGIPVIAFCPCSARYLSIHFFIPKLVEEGQIPYADDDPIGEIQGVPLFEGLLRRNHLPGSWSDKSADISFSHGLINQTLAAGRASALILNTFDELEAPFLTHLSSIFNKIYTIGPLHALSKSRLGDSSSSASALSGFWKEDRACMSWLDCQPPRSVVFVSFGSTMKMKADELREFWYGLVSSGKPFLCVLRSDVVSGGEAAELIEQMAEEEGAGGKLGMVVEWAAQEKVLSHPAVGGFLTHCGWNSTVESIAAGVPMMCWPILGDQPSNATWIDRVWKIGVERNNREWDRLTVEKMVRALMEGQKRVEIQRSMEKLSKLANEKVVRGINLHPTISLKKDTPTTSEHPRHEFENMRGMNYEMLVGNAIKSPTLTKK
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(서열 번호 19)
MTIFFSVEILVLGIAEFAAIAMDAAQQGDTTTILMLPWLGYGHLSAFLELAKSLSRRNFHIYFCSTSVNLDAIKPKLPSSFSDSIQFVELHLPSSPEFPPHLHTTNGLPPTLMPALHQAFSMAAQHFESILQTLAPHLLIYDSLQPWAPRVASSLKIPAINFNTTGVFVISQGLHPIHYPHSKFPFSEFVLHNHWKAMYSTADGASTERTRKRGEAFLYCLHASCSVILINSFRELEGKYMDYLSVLLNKKVVPVGPLVYEPNQDGEDEGYSSIKNWLDKKEPSSTVFVSFGSEYFPSKEEMEEIAHGLEASEVNFIWVVRFPQGDNTSGIEDALPKGFLERAGERGMVVKGWAPQAKILKHWSTGGFVSHCGWNSVMESMMFGVPIIGVPMHVDQPFNAGLVEEAGVGVEAKRDPDGKIQRDEVAKLIKEVVVEKTREDVRKKAREMSEILRSKGEEKFDEMVAEISLLLKI
>SgUGT74-345-2 (시라이티아 그로스베노리)
(서열 번호 20)
MDETTVNGGRRASDVVVFAFPRHGHMSPMLQFSKRLVSKGLRVTFLITTSATESLRLNLPPSSSLDLQVISDVPESNDIATLEGYLRSFKATVSKTLADFIDGIGNPPKFIVYDSVMPWVQEVARGRGLDAAPFFTQSSAVNHILNHVYGGSLSIPAPENTAVSLPSMPVLQAEDLPAFPDDPEVVMNFMTSQFSNFQDAKWIFFNTFDQLECKKQSQVVNWMADRWPIKTVGPTIPSAYLDDGRLEDDRAFGLNLLKPEDGKNTRQWQWLDSKDTASVLYISFGSLAILQEEQVKELAYFLKDTNLSFLWVLRDSELQKLPHNFVQETSHRGLVVNWCSQLQVLSHRAVSCFVTHCGWNSTLEALSLGVPMVAIPQWVDQTTNAKFVADVWRVGVRVKKKDERIVTKEELEASIRQVVQGEGRNEFKHNAIKWKKLAKEAVDEGGSSDKNIEEFVKTIA
>SgUGT75-281-2 (시라이티아 그로스베노리)
(서열 번호 21)
MGDNGDGGEKKELKENVKKGKELGRQAIGEGYINPSLQLARRLISLGVNVTFATTVLAGRRMKNKTHQTATTPGLSFATFSDGFDDETLKPNGDLTHYFSELRRCGSESLTHLITSAANEGRPITFVIYSLLLSWAADIASTYDIPSALFFAQPATVLALYFYYFHGYGDTICSKLQDPSSYIELPGLPLLTSQDMPSFFSPSGPHAFILPPMREQAEFLGRQSQPKVLVNTFDALEADALRAIDKLKMLAIGPLIPSALLGGNDSSDASFCGDLFQVSSEDYIEWLNSKPDSSVVYISVGSICVLSDEQEDELVHALLNSGHTFLWVKRSKENNEGVKQETDEEKLKKLEEQGKMVSWCRQVEVLKHPALGCFLTHCGWNSTIESLVSGLPVVAFPQQIDQATNAKLIEDVWKTGVRVKANTEGIVEREEIRRCLDLVMGSRDGQKEEIERNAKKWKELARQAIGEGGSSDSNLKTFLWEIDLEI
>SgUGT720-269-4 (시라이티아 그로스베노리)
(서열 번호 22)
MAEQAHDLLHVLLFPFPAEGHIKPFLCLAELLCNAGFHVTFLNTDYNHRRLHNLHLLAARFPSLHFESISDGLPPDQPRDILDPKFFISICQVTKPLFRELLLSYKRISSVQTGRPPITCVITDVIFRFPIDVAEELDIPVFSFCTFSARFMFLYFWIPKLIEDGQLPYPNGNINQKLYGVAPEAEGLLRCKDLPGHWAFADELKDDQLNFVDQTTASSRSSGLILNTFDDLEAPFLGRLSTIFKKIYAVGPIHSLLNSHHCGLWKEDHSCLAWLDSRAAKSVVFVSFGSLVKITSRQLMEFWHGLLNSGKSFLFVLRSDVVEGDDEKQVVKEIYETKAEGKWLVVGWAPQEKVLAHEAVGGFLTHSGWNSILESIAAGVPMISCPKIGDQSSNCTWISKVWKIGLEMEDRYDRVSVETMVRSIMEQEGEKMQKTIAELAKQAKYKVSKDGTSYQNLECLIQDIKKLNQIEGFINNPNFSDLLRV
>SgUGT94-289-2 (시라이티아 그로스베노리)
(서열 번호 23)
MDAQQGHTTTILMLPWVGYGHLLPFLELAKSLSRRKLFHIYFCSTSVSLDAIKPKLPPSISSDDSIQLVELRLPSSPELPPHLHTTNGLPSHLMPALHQAFVMAAQHFQVILQTLAPHLLIYDILQPWAPQVASSLNIPAINFSTTGASMLSRTLHPTHYPSSKFPISEFVLHNHWRAMYTTADGALTEEGHKIEETLANCLHTSCGVVLVNSFRELETKYIDYLSVLLNKKVVPVGPLVYEPNQEGEDEGYSSIKNWLDKKEPSSTVFVSFGTEYFPSKEEMEEIAYGLELSEVNFIWVLRFPQGDSTSTIEDALPKGFLERAGERAMVVKGWAPQAKILKHWSTGGLVSHCGWNSMMEGMMFGVPIIAVPMHLDQPFNAGLVEEAGVGVEAKRDSDGKIQREEVAKSIKEVVIEKTREDVRKKAREMDTKHGPTYFSRSKVSSFGRLYKINRPTTLTVGRFWSKQIKMKRE
>SgUGT94-289-1 (시라이티아 그로스베노리)
(서열 번호 24)
MDAQRGHTTTILMFPWLGYGHLSAFLELAKSLSRRNFHIYFCSTSVNLDAIKPKLPSSSSSDSIQLVELCLPSSPDQLPPHLHTTNALPPHLMPTLHQAFSMAAQHFAAILHTLAPHLLIYDSFQPWAPQLASSLNIPAINFNTTGASVLTRMLHATHYPSSKFPISEFVLHDYWKAMYSAAGGAVTKKDHKIGETLANCLHASCSVILINSFRELEEKYMDYLSVLLNKKVVPVGPLVYEPNQDGEDEGYSSIKNWLDKKEPSSTVFVSFGSEYFPSKEEMEEIAHGLEASEVHFIWVVRFPQGDNTSAIEDALPKGFLERVGERGMVVKGWAPQAKILKHWSTGGFVSHCGWNSVMESMMFGVPIIGVPMHLDQPFNAGLAEEAGVGVEAKRDPDGKIQRDEVAKLIKEVVVEKTREDVRKKAREMSEILRSKGEEKMDEMVAAISLFLKI
>XP_022151474.1 7-디옥시로가네틱 산 글루코실트랜스퍼라제 유사 [모모르디카 카란티아]
(서열 번호 25)
MAQPQTQARVLVFPYPTVGHIKPFLSLAELLADGGLDVVFLSTEYNHRRIPNLEALASRFPTLHFDTIPDGLPIDKPRVIIGGELYTSMRDGVKQRLRQVLQSYNDGSSPITCVICDVMLSGPIEAAEELGIPVVTFCPYSARYLCAHFVMPKLIEEGQIPFTDGNLAGEIQGVPLFGGLLRRDHLPGFWFVKSLSDEVWSHAFLNQTLAVGRTSALIINTLDELEAPFLAHLSSTFDKIYPIGPLDALSKSRLGDSSSSSTVLTAFWKEDQACMSWLDSQPPKSVIFVSFGSTMRMTADKLVEFWHGLVNSGTRFLCVLRSDIVEGGGAADLIKQVGETGNGIVVEWAAQEKVLAHRAVGGFLTHCGWNSTMESIAAGVPMMCWQIYGDQMINATWIGKVWKIGIERDDKWDRSTVEKMIKELMEGEKGAEIQRSMEKFSKLANDKVVKGGTSFENLELIVEYLKKLKPSN
>XP_022151546.1 7-디옥시로가네틱 산 글루코실트랜스퍼라제 유사 [모모르디카 카란티아]
(서열 번호 26)
MAQPRVLLFPFPAMGHVKPFLSLAELLSDAGVEVVFLSTEYNHRRIPDIGALAARFPTLHFETIPDGLPPDQPRVLADGHLYFSMLDGTKPRFRQLIQSLNGNPRPITCIINDVMLSSPIEVAEEFGIPVIAFCPCSARFLSVHFFMPNFIEEAQIPYTDENPMGKIEEATVFEGLLRRKDLPGLWCAKSSNISFSHRFINQTIAAGRASALILNTFDELESPFLNHLSSIFPKIYCIGPLNALSRSRLGKSSSSSSALAGFWKEDQAYMSWLESQPPRSVIFVSFGSTMKMEAWKLAEFWYGLVNSGSPFLFVFRPDCVINSGDAAEVMEGRGRGMVVEWASQEKVLAHPAVGGFLTHCGWNSTVESIVAGVPMMCCPIVADQLSNATWIHKVWKIGIEGDEKWDRSTVEMMIKELMESQKGTEIRTSIEMLSKLANEKVVKGGTSLNNFELLVEDIKTLRRPYT
>XP_022151514.1 7-디옥시로가네틱 산 글루코실트랜스퍼라제 유사 [모모르디카 카란티아]
(서열 번호 27)
MEQSDSNSDDHQHHVLLFPFPAKGHIKPFLCLAQLLCGAGLQVTFLNTDHNHRRIDDRHRRLLATQFPMLHFKSISDGLPPDHPRDLLDGKLIASMRRVTESLFRQLLLSYNGYGNGTNNVSNSGRRPPISCVITDVIFSFPVEVAEELGIPVFSFATFSARFLFLYFWIPKLIQEGQLPFPDGKTNQELYGVPGAEGIIRCKDLPGSWSVEAVAKNDPMNFVKQTLASSRSSGLILNTFEDLEAPFVTHLSNTFDKIYTIGPIHSLLGTSHCGLWKEDYACLAWLDARPRKSVVFVSFGSLVKTTSRELMELWHGLVSSGKSFLLVLRSDVVEGEDEEQVVKEILESNGEGKWLVVGWAPQEEVLAHEAIGGFLTHSGWNSTMESIAAGVPMVCWPKIGDQPSNCTWVSRVWKVGLEMEERYDRSTVARMARSMMEQEGKEMERRIAELAKRVKYRVGKDGESYRNLESLIRDIKITKSSN
>XP_004147933.2 예상: 7-디옥시로가네틱 산 글루코실트랜스퍼라제 유사 [쿠쿠미스 사티버스]
(서열 번호 28)
MGLSPTDHVLLFPFPAKGHIKPFFCLAHLLCNAGLRVTFLSTEHHHQKLHNLTHLAAQIPSLHFQSISDGLSLDHPRNLLDGQLFKSMPQVTKPLFRQLLLSYKDGTSPITCVITDLILRFPMDVAQELDIPVFCFSTFSARFLFLYFSIPKLLEDGQIPYPEGNSNQVLHGIPGAEGLLRCKDLPGYWSVEAVANYNPMNFVNQTIATSKSHGLILNTFDELEVPFITNLSKIYKKVYTIGPIHSLLKKSVQTQYEFWKEDHSCLAWLDSQPPRSVMFVSFGSIVKLKSSQLKEFWNGLVDSGKAFLLVLRSDALVEETGEEDEKQKELVIKEIMETKEEGRWVIVNWAPQEKVLEHKAIGGFLTHSGWNSTLESVAVGVPMVSWPQIGDQPSNATWLSKVWKIGVEMEDSYDRSTVESKVRSIMEHEDKKMENAIVELAKRVDDRVSKEGTSYQNLQRLIEDIEGFKLN
>XP_022978164.1 7-디옥시로가네틱 산 글루코실트랜스퍼라제 유사 [쿠커비타 맥시마]
(서열 번호 29)
MELSHTHHVLLFPFPAKGHIKPFFSLAQLLCNAGLRVTFLNTDHHHRRIHDLNRLAAQLPTLHFDSVSDGLPPDEPRNVFDGKLYESIRQVTSSLFRELLVSYNNGTSSGRPPITCVITDVMFRFPIDIAEELGIPVFTFSTFSARFLFLIFWIPKLLEDGQLRYPEQELHGVPGAEGLIRWKDLPGFWSVEDVADWDPMNFVNQTLATSRSSGLILNTFDELEAPFLTSLSKIYKKIYSLGPINSLLKNFQSQPQYNLWKEDHSCMAWLDSQPRKSVVFVSFGSVVKLTSRQLMEFWNGLVNSGMPFLLVLRSDVIEAGEEVVREIMERKAEGRWVIVSWAPQEEVLAHDAVGGFLTHSGWNSTLESLAAGVPMISWPQIGDQTSNSTWISKVWRIGLQLEDGFDSSTIETMVRSIMDQTMEKTVAELAERAKNRASKNGTSYRNFQTLIQDITNIIETHI
>XP_022950128.1 7-디옥시로가네틱 산 글루코실트랜스퍼라제 유사 [쿠커비타 모스차타]
(서열 번호 30)
MELSPTHHLLLFPFPAKGHIKPFFSLAQLLCNAGARVTFLNTDHHHRRIHDLDRLAAQLPTLHFDSVSDGLPPDESRNVFDGKLYESIRQVTSSLFRELLVSYNNGTSSGRPPITCVITDCMFRFPIDIAEELGIPVFTFSTFSARFLFLFFWIPKLLEDGQLRYPEQELHGVPGAEGLIRCKDLPGFLSDEDVAHWKPINFVNQILATSRSSGLILNTFDELEAPFLTSLSKIYKKIYSLGPINSLLKNFQSQPQYNLWKEDHSCMAWLDSQPPKSVVFVSFGSVVKLTNRQLVEFWNGLVNSGKPFLLVLRSDVIEAGEEVVRENMERKAEGRWMIVSWAPQEEVLAHDAVGGFLTHSGWNSTLESLAAGVPMISWTQIGDQTSNSTWVSKVWRIGLQLEDGFDSFTIETMVRSVMDQTMEKTVAELAERAKNRASKNGTSYRNFQTLIQDITNIIETHI
>XP_020422423.1 7-디옥시로가네틱 산 글루코실트랜스퍼라제 [플러너스 페르시카]
(서열 번호 31)
MAMKQPHVIIFPFPLQGHMKPLLCLAELLCHAGLHVTYVNTHHNHQRLANRQALSTHFPTLHFESISDGLPEDDPRTLNSQLLIALKTSIRPHFRELLKTISLKAESNDTLVPPPSCIMTDGLVTFAFDVAEELGLPILSFNVPCPRYLWTCLCLPKLIENGQLPFQDDDMNVEITGVPGMEGLLHRQDLPGFCRVKQADHPSLQFAINETQTLKRASALILDTVYELDAPCISHMALMFPKIYTLGPLHALLNSQIGDMSRGLASHGSLWKSDLNCMTWLDSQPSKSIIYVSFGTLVHLTRAQVIEFWYGLVNSGHPFLWVMRSDITSGDHQIPAELENGTKERGCIVDWVSQEEVLAHKSVGGFLTHSGWNSTLESIVAGLPMICWPKLGDHYIISSTVCRQWKIGLQLNENCDRSNIESMVQTLMGSKREEIQSSMDAISKLSRDSVAEGGSSHNNLEQLIEYIRNLQHQN
>EOY07351.1 UDP-글루코실 트랜스퍼라제 85A3, 추정 [테오브로마 카카오]
(서열 번호 32)
MRQPHVLVLPFPAQGHIKPMLCLAELLCQAGLRVTFLNTHHSHRRLNNLQDLSTRFPTLHFESVSDGLPEDHPRNLVHFMHLVHSIKNVTKPLLRDLLTSLSLKTDIPPVSCIIADGILSFAIDVAEELQIKVIIFRTISSCCLWSYLCVPKLIQQGELQFSDSDMGQKVSSVPEMKGSLRLHDRPYSFGLKQLEDPNFQFFVSETQAMTRASAVIFNTFDSLEAPVLSQMIPLLPKVYTIGPLHALRKARLGDLSQHSSFNGNLREADHNCITWLDSQPLRSVVYVSFGSHVVLTSEELLEFWHGLVNSGKRFLWVLRPDIIAGEKDHNQIIAREPDLGTKEKGLLVDWAPQEEVLAHPSVGGFLTHCGWNSTLESMVAGVPMLCWPKLPDQLVNSSCVSEVWKIGLDLKDMCDRSTVEKMVRALMEDRREEVMRSVDGISKLARESVSHGGSSSSNLEMLIQELET
>XP_022155979.1 베타-D-글루코실 크로세틴 베타-1,6-글루코실트랜스퍼라제 유사 [모모르디카 카란티아]
(서열 번호 33)
MDAHQQAEHTTTILMLPWVGYGHLTAYLELAKALSRRNFHIYYCSTPVNIESIKPKLTIPCSSIQFVELHLPSSDDLPPNLHTTNGLPSHLMPTLHQAFSAAAPLFEEILQTLCPHLLIYDSLQPWAPKIASSLKIPALNFNTSGVSVIAQALHAIHHPDSKFPLSDFILHNYWKSTYTTADGGASEKTRRAREAFLYCLNSSGNAILINTFRELEGEYIDYLSLLLNKKVIPIGPLVYEPNQDEDQDEEYRSIKNWLDKKEPCSTVFVSFGSEYFPSNEEMEEIAPGLEESGANFIWVVRFPKLENRNGIIEEGLLERAGERGMVIKEWAPQARILRHGSIGGFVSHCGWNSVMESIICGVPVIGVPMRVDQPYNAGLVEEAGVGVEAKRDPDGKIQRHEVSKLIKQVVVEKTRDDVRKKVAQMSEILRRKGDEKIDEMVALISLLPKG
>XP_022986080.1 베타-D-글루코실 크로세틴 베타-1,6-글루코실트랜스퍼라제 유사 [쿠커비타 맥시마]
(서열 번호 34)
MDAQKAVDTPPTTVLMLPWIGYGHLSAYLELAKALSRRNFHVYFCSTPVNLDSIKPNLIPPPSSIQFVDLHLPSSPELPPHLHTTNGLPSHLKPTLHQAFSAAAQHFEAILQTLSPHLLIYDSLQPWAPRIASSLNIPAINFNTTAVSIIAHALHSVHYPDSKFPFSDFVLHDYWKAKYTTADGATSEKIRRGAEAFLYCLNASCDVVLVNSFRELEGEYMDYLSVLLKKKVVSVGPLVYEPSEGEEDEEYWRIKKWLDEKEALSTVLVSFGSEYFPSKEEMEEIAHGLEESEANFIWVVRFPKGEESCRGIEEALPKGFVERAGERAMVVKKWAPQGKILKHGSIGGFVSHCGWNSVLESIRFGVPVIGVPMHLDQPYNAGLLEEAGIGVEAKRDADGKIQRDQVASLIKRVVVEKTREDIWKTVREMREVLRRRDDDMIDEMVAEISVVLKI
>XP_022156002.1 베타-D-글루코실 크로세틴 베타-1,6-글루코실트랜스퍼라제 유사 [모모르디카 카란티아]
(서열 번호 35)
MDARQQAEHTTTILMLPWVGYGHLSAYLELAKALSRRNFHIYYCSTPVNIESIKPKLTIPCSSIQFVELHLPFSDDLPPNLHTTNGLPSHLMPALHQAFSAAAPLFEAILQTLCPHLLIYDSLQPWAPQIASSLKIPALNFNTTGVSVIARALHTIHHPDSKFPLSEIVLHNYWKATHATADGANPEKFRRDLEALLCCLHSSCNAILINTFRELEGEYIDYLSLLLNKKVTPIGPLVYEPNQDEEQDEEYRSIKNWLDKKEPYSTIFVSFGSEYFPSNEEMEEIARGLEESGANFIWVVRFHKLENGNGITEEGLLERAGERGMVIQGWAPQARILRHGSIGGFVSHCGWNSVMESIICGVPVIGVPMGLDQPYNAGLVEEAGVGVEAKRDPDGKIQRHEVSKLIKQVVVEKTRDDVRKKVAQMSEILRRKGDEKIDEMVALISLLLKG
>XP_022943327.1 베타-D-글루코실 크로세틴 베타-1,6-글루코실트랜스퍼라제 유사 [쿠커비타 모스차타]
(서열 번호 36)
MDAQKAVDTPPTTVLMLPWIGYGHLSAYLELAKALSRRNFHVYFCSTPVNLDSIKPNLIPPPPSIQFVDLHLPSSPELPPHLHTTNGLPSHLKPTLHQAFSAAAQHFEAILQTLSPHLLIYDSLQPWAPRIASSLNIPAINFNTTAVSIIAHALHSVHYPDSKFPFSDFVLHDYWKAKYTTADGATSEKTRRGVEAFLYCLNASCDVVLVNSFRELEGEYMDYLSVLLKKKVVSVGPLVYEPSEGEEDEEYWRIKKWLDEKEALSTVLVSFGSEYFPPKEEMEEIAHGLEESEANFIWVVRFPKGEESSSRGIEEALPKGFVERAGERAMVVKKWAPQGKILKHGSIGGFVSHCGWNSVLESIRFGVPVIGAPMHLDQPYNAGLLEEAGIGVEAKRDADGKIQRDQVASLIKQVVVEKTREDIWKKVREMREVLRRRDDDDMMIDEMVAVISVVLKI
>XP_022996307.1 베타-D-글루코실 크로세틴 베타 -1,6-글루코실트랜스퍼라제 유사 [쿠커비타 맥시마]
(서열 번호 37)
MSSNLFLKISIPFGRLRDSALNCSVFHCKLHLAIAIAMDAQQAANKSPTATTIFMLPWAGYGHLSAYLELAKALSTRNFHIYFCSTPVSLASIKPRLIPSCSSIQFVELHLPSSDEFPPHLHTTNGLPSRLVPTFHQAFSEAAQTFEAFLQTLRPHLLIYDSLQPWAPRIASSLNIPAINFFTAGAFAVSHVLRAFHYPDSQFPSSDFVLHSRWKIKNTTAESPTQAKLPKIGEAIGYCLNASRGVILTNSFRELEGKYIDYLSVILKKRVFPIGPLVYQPNQDEEDEDYSRIKNWLDRKEASSTVLVSFGSEFFLSKEETEAIAHGLEQSEANFIWGIRFPKGAKKNAIEEALPEGFLERAGGRAMVVEEWVPQGKILKHGSIGGFVSHCGWNSAMESIVCGVPIIGIPMQVDQPFNAGILEEAGVGVEAKRDSDGKIQRDEVAKLIKEVVVERTREDIRNKLEKINEILRSRREEKLDELATEISLLSRN
>XP_022957664.1 베타-D-글루코실 크로세틴 베타-1,6-글루코실트랜스퍼라제 유사 [쿠커비타 모스차타]
(서열 번호 38)
MDAQQAANKSPTASTIFMLPWVGYGHLSAYLELAKALSTRNFHVYFCSTPVSLASIKPRLIPSCSSIQFVELHLPSSDEFPPHLHTTNGLPAHLVPTIHQAFAAAAQTFEAFLQTLRPHLLIYDSLQPWAPRIASSLNIPAINFFTAGAFAVSHVLRAFHYPDSQFPSSDFVLHSRWKIKNTTAESPTQVKIPKIGEAIGYCLNASRGVILTNSFRELEGKYIDYLSVILKKRVLPIGPLVYQPNQDEEDEDYSRIKNWLDRKEASSTVLVSFGSEFFLSKEETEAIAHGLEQSEANFIWGIRFPKGAKKNAIEEALPEGFLERVGGRAMVVEEWVPQGKILKHGNIGGFVSHCGWNSAMESIMCGVPVIGIPMQVDQPFNAGILEEAGVGVEAKRDSDGKIQRDEVAKLIKEVVVERTREDIRNKLEEINEILRTRREEKLDELATEISLLCKN
>OMO57892.1 UDP-글루쿠로노실/UDP-글루코실트랜스퍼라제 [코르코러스 캡설러리스]
(서열 번호 39)
MDSKQKKMSVLMFPWLAYGHISPFLELAKKLSKRNFHTFFFSTPINLNSIKSKLSPKYAQSIQFVELHLPSLPDLPPHYHTTNGLPPHLMNTLKKAFDMSSLQFSKILKTLNPDLLVYDFIQPWAPLLALSNKIPAVHFLCTSAAMSSFSVHAFKKPCEDFPFPNIYVHGNFMNAKFNNMENCSSDDSISDQDRVLQCFERSTKIILVKTFEELEGKFMDYLSVLLNKKIVPTGPLTQDPNEDEGDDDERTKLLLEWLNKKSKSSTVFVSFGSEYFLSKEEREEIAYGLELSKVNFIWVIRFPLGENKTNLEEALPQGFLQRVSERGLVVENWAPQAKILQHSSIGGFVSHCGWSSVMESLKFGVPIIAIPMHLDQPLNARLVVDVGVGLEVIRNHGSLEREEIAKLIKEVVLGNGNDGEIVRRKAREMSNHIKKKGEKDMDELVEELMLICKMKPNSCHLS
>XP_015886141.1 예상: 베타-D-글루코실 크로세틴 베타-1,6-글루코실트랜스퍼라제 유사 동형 X1 [지지푸스 주주바]
(서열 번호 40)
MMERQRSIKVLMFPWLAHGHISPFLELAKRLTDRNFQIYFCSTPVNLTSVKPKLSQKYSSSIKLVELHLPSLPDLPPHYHTTNGLALNLIPTLKKAFDMSSSSFSTILSTIKPDLLIYDFLQPWAPQLASCMNIPAVNFLSAGASMVSFVLHSIKYNGDDHDDEFLTTELHLSDSMEAKFAEMTESSPDEHIDRAVTCLERSNSLILIKSFRELEGKYLDYLSLSFAKKVVPIGPLVAQDTNPEDDSMDIINWLDKKEKSSTVFVSFGSEYYLTNEEMEEIAYGLELSKVNFIWVVRFPLGQKMAVEEALPKGFLERVGEKGMVVEDWAPQMKILGHSSIGGFVSHCGWSSLMESLKLGVPIIAMPMQLDQPINAKLVERSGVGLEVKRDKNGRIEREYLAKVIREIVVEKARQDIEKKAREMSNIITEKGEEEIDNVVEELAKLCGM
>XP_002271587.3 예상: 베타-D-글루코실 크로세틴 베타-1,6-글루코실트랜스퍼라제 유사 [비티스 비니페라]
(서열 번호 41)
MDARQSDGISVLMFPWLAHGHISPFLQLAKKLSKRNFSIYFCSTPVNLDPIKGKLSESYSLSIQLVKLHLPSLPELPPQYHTTNGLPPHLMPTLKMAFDMASPNFSNILKTLHPDLLIYDFLQPWAPAAASSLNIPAVQFLSTGATLQSFLAHRHRKPGIEFPFQEIHLPDYEIGRLNRFLEPSAGRISDRDRANQCLERSSRFSLIKTFREIEAKYLDYVSDLTKKKMVTVGPLLQDPEDEDEATDIVEWLNKKCEASAVFVSFGSEYFVSKEEMEEIAHGLELSNVDFIWVVRFPMGEKIRLEDALPPGFLHRLGDRGMVVEGWAPQRKILGHSSIGGFVSHCGWSSVMEGMKFGVPIIAMPMHLDQPINAKLVEAVGVGREVKRDENRKLEREEIAKVIKEVVGEKNGENVRRKARELSETLRKKGDEEIDVVVEELKQLCSY
>XP_018840205.1 예상: 베타-D-글루코실 크로세틴 베타-1,6-글루코실트랜스퍼라제 유사 [저글런스 리지아]
(서열 번호 42)
MDTARKRIRVVMLPWLAHGHISPFLELSKKLAKRNFHIYFCSTPVNLSSIKPKLSGKYSRSIQLVELHLPSLPELPPQYHTTKGLPPHLNATLKRAFDMAGPHFSNILKTLSPDLLIYDFLQPWAPAIAASQNIPAINFLSTGAAMTSFVLHAMKKPGDEFPFPEIHLDECMKTRFVDLPEDHSPSDDHNHISDKDRALKCFERSSGFVMMKTFEELEGKYINFLSHLMQKKIVPVGPLVQNPVRGDHEKAKTLEWLDKRKQSSAVFVSFGTEYFLSKEEMEEIAYGLELSNVNFIWVVRFPEGEKVKLEEALPEGFLQRVGEKGMVVEGWAPQAKILMHPSIGGFVSHCGWSSVMESIDFGVPIVAIPMQLDQPVNAKVVEQAGVGVEVKRDRDGKLEREEVATVIREVVMGNIGESVRKKEREMRDNIRKKGEEKMDGVAQELVQLYGNGIKNV
>XP_021652171.1 베타-D-글루코실 크로세틴 베타-1,6-글루코실트랜스퍼라제 유사 [헤비어 브라질리언시스]
(서열 번호 43)
METLQRRKISVLMFPWLAHGHLSPFLELSKKLNKRNFHVYFCSTPVNLDSIKPKLSAEYSFSIQLVELHLPSSPELPLHYHTTNGLPPHLMKNLKNAFDMASSSFFNILKTLKPDLLIYDFIQPWAPALASSLNIPAVNFLCTSMAMSCFGLHLNNQEAKFPFPGIYPRDYMRMKVFGALESSSNDIKDGERAGRCMDQSFHLILAKTFRELEGKYIDYLSVKLMKKIVPVGPLVQDPIFEDDEKIMDHHQVIKWLEKKERLSTVFVSFGTEYFLSTEEMEEIAYGLELSKAHFIWVVRFPTGEKINLEESLPKRYLERVQERGKIVEGWAPQQKILRHSSIGGFVSHCGWSSIMESMKFGVPIIAMPMNLDQPVNSRIVEDAGVGIEVRRNKSGELEREEIAKTIRKVVVEKDGKNVSRKAREMSDTIRKKGEEEIDGVVDELLQLCDVKTNYLQ
>XP_021619073.1 베타-D-글루코실 크로세틴 베타-1,6-글루코실트랜스퍼라제 유사 [마니호트 에스쿠렌타]
(서열 번호 44)
MATAQTRKISVLMFPWLAHGHLSPFLELSKKLANRNFHVYFCSTPVNLDSIKPKLSPEYHFSIQFVELHLPSSPELPSHYHTTNGLPPHLMKTLKKAFDMASSSFFNILKTLNPDLLIYDFLQPWAPALASSLNIPAVNFLCSSMAMSCFGLNLNKNKEIKFLFPEIYPRDYMEMKLFRVFESSSNQIKDGERAGRCIDQSFHVILAKTFRELEGKYIDYVSVKCNKKIVPVGPLVEDTIHEDDEKTMDHHHHHHDEVIKWLEKKERSTTVFVSFGSEYFLSKEEMEEIAHGLELSKVNFIWVVRFPKGEKINLEESLPEGYLERIQERGKIVEGWAPQRKILGHSSIGGFVSHCGWSSIMESMKLGVPIIAMPMNLDQPINSRIVEAAGVGIEVSRNQSGELEREEMAKTIRKVVVEREGVYVRRKAREMSDVLRKKGEEEIDGVVDELVQLCDMKTNYL
>GAV83746.1 UDPGT 도메인 함유 단백질 [세팔로투스 폴리큘러스]
(서열 번호 45)
MDLKRRSIRVLMLPWLAHGHISPFLELAKKLTNRNFLIYFCSTPINLNSIKPKLSSKYSFSIQLVELHLPSLPELPPHYHTTNGLPLHLMNTLKTAFDMASPSFLNILKTLKPDLLICDHLQPWAPSLASSLNIPAIIFPTNSAIMMAFSLHHAKNPGEEFPFPSININDDMVKSINFLHSASNGLTDMDRVLQCLERSSNTMLLKTFRQLEAKYVDYSSALLKKKIVLAGPLVQVPDNEDEKIEIIKWLDSRGQSSTVFVSFGSEYFLSKEEREDIAHGLELSKVNFIWVVRFPVGEKVKLEEALPNGFAERIGERGLVVEGWAPQAMILSHSSIGGFVSHCGWSSMMESMKFGVPIIAMPMHIDQPLNARLVEDVGVGLEIKRNKDGRFEREELARVIKEVLVYKNGDAVRSKAREMSEHIKKNGDQEIDGVADALVKLCEMKTNSLNQD
>커피아 아라비카 UGT_1,6
(서열 번호 46)
MENHATFNVLMLPWLAHGHVSPYLELAKKLTARNFNVYLCSSPATLSSVRSKLTEKFSQSIHLVELHLPKLPELPAEYHTTNGLPPHLMPTLKDAFDMAKPNFCNVLKSLKPDLLIYDLLQPWAPEAASAFNIPAVVFISSSATMTSFGLHFFKNPGTKYPYGNAIFYRDYESVFVENLTRRDRDTYRVINCMERSSKIILIKGFNEIEGKYFDYFSCLTGKKVVPVGPLVQDPVLDDEDCRIMQWLNKKEKGSTVFVSFGSEYFLSKKDMEEIAHGLEVSNVDFIWVVRFPKGENIVIEETLPKGFFERVGERGLVVNGWAPQAKILTHPNVGGFVSHCGWNSVMESMKFGLPIIAMPMHLDQPINARLIEEVGAGVEVLRDSKGKLHRERMAETINKVMKEASGESVRKKARELQEKLELKGDEEIDDVVKELVQLCATKNKRNGLHYY
>원형 치환체 링커 서열
(서열 번호 47)
GSGGSG
>원형 치환체 링커 서열
(서열 번호 48)
GSGGSGGSG
SEQUENCE LISTING <110> Manus Bio, Inc. <120> PRODUCTION OF STEVIOL GYLCOSIDES THROUGH WHOLE CELL BIOTRANSFORMATION <130> MAN-018PC/107590-5018 <140> PCT/US19/41957 <141> 2019-07-16 <150> 62/698,617 <151> 2018-07-16 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 481 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 1 Met Asp Ala Met Ala Thr Thr Glu Lys Lys Pro His Val Ile Phe Ile 1 5 10 15 Pro Phe Pro Ala Gln Ser His Ile Lys Ala Met Leu Lys Leu Ala Gln 20 25 30 Leu Leu His His Lys Gly Leu Gln Ile Thr Phe Val Asn Thr Asp Phe 35 40 45 Ile His Asn Gln Phe Leu Glu Ser Ser Gly Pro His Cys Leu Asp Gly 50 55 60 Ala Pro Gly Phe Arg Phe Glu Thr Ile Pro Asp Gly Val Ser His Ser 65 70 75 80 Pro Glu Ala Ser Ile Pro Ile Arg Glu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Glu 85 90 95 Thr Asn Phe Leu Asp Arg Phe Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Pro Asp 100 105 110 Pro Pro Thr Cys Ile Ile Ser Asp Gly Phe Leu Ser Val Phe Thr Ile 115 120 125 Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gly Ile Pro Val Met Met Tyr Trp Thr Leu 130 135 140 Ala Ala Cys Gly Phe 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Val Asp Leu Pro Glu Asp His Ser Pro Ser Asp Asp His Asn His Ile 180 185 190 Ser Asp Lys Asp Arg Ala Leu Lys Cys Phe Glu Arg Ser Ser Gly Phe 195 200 205 Val Met Met Lys Thr Phe Glu Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Ile Asn Phe 210 215 220 Leu Ser His Leu Met Gln Lys Lys Ile Val Pro Val Gly Pro Leu Val 225 230 235 240 Gln Asn Pro Val Arg Gly Asp His Glu Lys Ala Lys Thr Leu Glu Trp 245 250 255 Leu Asp Lys Arg Lys Gln Ser Ser Ala Val Phe Val Ser Phe Gly Thr 260 265 270 Glu Tyr Phe Leu Ser Lys Glu Glu Met Glu Glu Ile Ala Tyr Gly Leu 275 280 285 Glu Leu Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val Val Arg Phe Pro Glu Gly 290 295 300 Glu Lys Val Lys Leu Glu Glu Ala Leu Pro Glu Gly Phe Leu Gln Arg 305 310 315 320 Val Gly Glu Lys Gly Met Val Val Glu Gly Trp Ala Pro Gln Ala Lys 325 330 335 Ile Leu Met His Pro Ser Ile Gly Gly Phe Val Ser His Cys Gly Trp 340 345 350 Ser Ser Val Met Glu Ser Ile Asp Phe Gly Val Pro Ile Val Ala Ile 355 360 365 Pro Met Gln Leu Asp Gln Pro Val Asn Ala Lys Val Val Glu Gln Ala 370 375 380 Gly 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Leu Ala Ser Ser Leu Asn Ile Pro Ala Val Asn Phe Leu Cys Thr Ser 130 135 140 Met Ala Met Ser Cys Phe Gly Leu His Leu Asn Asn Gln Glu Ala Lys 145 150 155 160 Phe Pro Phe Pro Gly Ile Tyr Pro Arg Asp Tyr Met Arg Met Lys Val 165 170 175 Phe Gly Ala Leu Glu Ser Ser Ser Asn Asp Ile Lys Asp Gly Glu Arg 180 185 190 Ala Gly Arg Cys Met Asp Gln Ser Phe His Leu Ile Leu Ala Lys Thr 195 200 205 Phe Arg Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Ile Asp Tyr Leu Ser Val Lys Leu 210 215 220 Met Lys Lys Ile Val Pro Val Gly Pro Leu Val Gln Asp Pro Ile Phe 225 230 235 240 Glu Asp Asp Glu Lys Ile Met Asp His His Gln Val Ile Lys Trp Leu 245 250 255 Glu Lys Lys Glu Arg Leu Ser Thr Val Phe Val Ser Phe Gly Thr Glu 260 265 270 Tyr Phe Leu Ser Thr Glu Glu Met Glu Glu Ile Ala Tyr Gly Leu Glu 275 280 285 Leu Ser Lys Ala His Phe Ile Trp Val Val Arg Phe Pro Thr Gly Glu 290 295 300 Lys Ile Asn Leu Glu Glu Ser Leu Pro Lys Arg Tyr Leu Glu Arg Val 305 310 315 320 Gln Glu Arg Gly Lys Ile Val Glu Gly Trp Ala Pro Gln Gln Lys Ile 325 330 335 Leu Arg His Ser Ser Ile Gly Gly Phe Val Ser His Cys Gly Trp Ser 340 345 350 Ser Ile Met Glu Ser Met Lys Phe Gly Val Pro Ile Ile Ala Met Pro 355 360 365 Met Asn Leu Asp Gln Pro Val Asn Ser Arg Ile Val Glu Asp Ala Gly 370 375 380 Val Gly Ile Glu Val Arg Arg Asn Lys Ser Gly Glu Leu Glu Arg Glu 385 390 395 400 Glu Ile Ala Lys Thr Ile Arg Lys Val Val Val Glu Lys Asp Gly Lys 405 410 415 Asn Val Ser Arg Lys Ala Arg Glu Met Ser Asp Thr Ile Arg Lys Lys 420 425 430 Gly Glu Glu Glu Ile Asp Gly Val Val Asp Glu Leu Leu Gln Leu Cys 435 440 445 Asp Val Lys Thr Asn Tyr Leu Gln 450 455 <210> 44 <211> 461 <212> PRT <213> Manihot esculenta <400> 44 Met Ala Thr Ala Gln Thr Arg Lys Ile Ser Val Leu Met Phe Pro Trp 1 5 10 15 Leu Ala His Gly His Leu Ser Pro Phe Leu Glu Leu Ser Lys Lys Leu 20 25 30 Ala Asn Arg Asn Phe His Val Tyr Phe Cys Ser Thr Pro Val Asn Leu 35 40 45 Asp Ser Ile Lys Pro Lys Leu Ser Pro Glu Tyr His Phe Ser Ile Gln 50 55 60 Phe Val Glu Leu His Leu Pro Ser Ser Pro Glu Leu Pro Ser His Tyr 65 70 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Ile Ala His Gly Leu Glu Leu Ser Lys Val Asn Phe Ile Trp Val Val 290 295 300 Arg Phe Pro Lys Gly Glu Lys Ile Asn Leu Glu Glu Ser Leu Pro Glu 305 310 315 320 Gly Tyr Leu Glu Arg Ile Gln Glu Arg Gly Lys Ile Val Glu Gly Trp 325 330 335 Ala Pro Gln Arg Lys Ile Leu Gly His Ser Ser Ile Gly Gly Phe Val 340 345 350 Ser His Cys Gly Trp Ser Ser Ile Met Glu Ser Met Lys Leu Gly Val 355 360 365 Pro Ile Ile Ala Met Pro Met Asn Leu Asp Gln Pro Ile Asn Ser Arg 370 375 380 Ile Val Glu Ala Ala Gly Val Gly Ile Glu Val Ser Arg Asn Gln Ser 385 390 395 400 Gly Glu Leu Glu Arg Glu Glu Met Ala Lys Thr Ile Arg Lys Val Val 405 410 415 Val Glu Arg Glu Gly Val Tyr Val Arg Arg Lys Ala Arg Glu Met Ser 420 425 430 Asp Val Leu Arg Lys Lys Gly Glu Glu Glu Ile Asp Gly Val Val Asp 435 440 445 Glu Leu Val Gln Leu Cys Asp Met Lys Thr Asn Tyr Leu 450 455 460 <210> 45 <211> 452 <212> PRT <213> Cephalotus follicularis <400> 45 Met Asp Leu Lys Arg Arg Ser Ile Arg Val Leu Met Leu Pro Trp Leu 1 5 10 15 Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Leu Glu Leu Ala Lys Lys Leu Thr 20 25 30 Asn Arg Asn Phe Leu Ile Tyr Phe Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Asn 35 40 45 Ser Ile Lys Pro Lys Leu Ser Ser Lys Tyr Ser Phe Ser Ile Gln Leu 50 55 60 Val Glu Leu His Leu Pro Ser Leu Pro Glu Leu Pro Pro His Tyr His 65 70 75 80 Thr Thr Asn Gly Leu Pro Leu His Leu Met Asn Thr Leu Lys Thr Ala 85 90 95 Phe Asp Met Ala Ser Pro Ser Phe Leu Asn Ile Leu Lys Thr Leu Lys 100 105 110 Pro Asp Leu Leu Ile Cys Asp His Leu Gln Pro Trp Ala Pro Ser Leu 115 120 125 Ala Ser Ser Leu Asn Ile Pro Ala Ile Ile Phe Pro Thr Asn Ser Ala 130 135 140 Ile Met Met Ala Phe Ser Leu His His Ala Lys Asn Pro Gly Glu Glu 145 150 155 160 Phe Pro Phe Pro Ser Ile Asn Ile Asn Asp Asp Met Val Lys Ser Ile 165 170 175 Asn Phe Leu His Ser Ala Ser Asn Gly Leu Thr Asp Met Asp Arg Val 180 185 190 Leu Gln Cys Leu Glu Arg Ser Ser Asn Thr Met Leu Leu Lys Thr Phe 195 200 205 Arg Gln Leu Glu Ala Lys Tyr Val Asp Tyr Ser Ser Ala Leu Leu Lys 210 215 220 Lys Lys Ile Val Leu Ala Gly Pro Leu Val Gln 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390 395 400 Met Lys Glu Ala Ser Gly Glu Ser Val Arg Lys Lys Ala Arg Glu Leu 405 410 415 Gln Glu Lys Leu Glu Leu Lys Gly Asp Glu Glu Ile Asp Asp Val Val 420 425 430 Lys Glu Leu Val Gln Leu Cys Ala Thr Lys Asn Lys Arg Asn Gly Leu 435 440 445 His Tyr Tyr 450 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 47 Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 48 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5

Claims (106)

  1. 스테비올 글리코시드 중간체로부터 스테비올 글리코시드 생성물을 생산하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    세포 내에서 하나 이상의 UDP-의존성 글리코실 트랜스퍼라제 효소 (UGT 효소)를 발현하는 박테리아 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 UGT 효소는 스테비올 및 스테비올 글리코시드 기질을 글리코실화하고, 박테리아 세포는 하기의 유전적 변형을 포함하는 단계:
    UDP-당 가수 분해 효소 및 하나 이상의 UDP-갈락토스 생합성 효소의 결실, 불활성화, 또는 감소된 활성 또는 발현;
    글루코스-6-인산염 이소메라제의 결실, 불활성화, 또는 감소된 활성 또는 발현; 및
    포스포글루코무타제 및 UTP-글루코스-1-인산염 우리딜릴트랜스퍼라제의 과발현;
    박테리아 세포를 스테비올 글리코시드 중간체를 포함하는 스테비아 잎 추출물 또는 이의 분획과 함께 배양하여 UDP-글루코스 보조인자로부터의 하나 이상의 글리코실 기의 효소 전달에 의해 스테비올 글리코시드 중간체를 스테비올 글리코시드 생성물로 글리코실화하는 단계; 및
    스테비올 글리코시드 생성물을 회수하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 스테비올 글리코시드 중간체는 스테비오시드, 스테비올비오시드, 레바우디오시드 A, 둘코시드 A, 둘코시드 B, 레바우디오시드 C, 및 레바우디오시드 F 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 추출물은 주요 구성성분으로서 스테비오시드, 스테비올비오시드, 및 레바우디오시드 A를 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 스테비올 글리코시드 생성물은 RebM을 포함하는 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 스테비올 글리코시드 생성물은 RebK, RebC+1, 및/또는 RebC+2를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 에스케리치아 속, 바실러스 속, 로도박터 속, 자이모모나스 속, 또는 슈도모나스 속인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스, 로도박터 캡술라투스, 로도박터 스페로이드스, 자이모모나스 모빌리스, 또는 슈도모나스 푸티다인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 대장균인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 ushA 및 galETKM이 결실되고; pgi가 결실되고; 그리고 pgm 및 galU가 과발현되는 유전적 변형을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 1-3' 글리코실화 UGT 효소를 발현하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 1-3' 글리코실화 UGT 효소는 서열 번호 15, 서열 번호 16, 또는 서열 번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 1-2' 글리코실화 UGT 효소를 발현하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 기질의 C13 히드록실을 글리코실화하는 UGT 효소를 발현하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 기질의 C19 히드록실을 글리코실화하는 UGT 효소를 발현하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 1-3' 글리코실화 UGT 효소 및 1-2' 글리코실화 UGT 효소를 발현하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 1-3' 글리코실화 UGT 효소, 1-2' 글리코실화 UGT 효소, C19 O-글리코실화 UGT 효소 및 C13 O-글리코실화 UGT 효소를 발현하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 UGT 효소는 박테리아 세포의 염색체로 통합되거나 또는 염색체외에서 발현되는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, galETKM 유전자는 발현이 불활성화, 결실, 또는 감소되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 트레할로스-6-인산염 합성효소의 결실, 불활성화, 또는 감소된 활성 또는 발현을 갖는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 UDP-글루코스 6-탈수소효소의 결실, 불활성화, 또는 감소된 활성 또는 발현을 갖는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 ycjU (β-포스포글루코무타제) 및 비피도박테리움 비피덤 ugpA의 과발현 또는 증가된 활성 또는 발현을 갖는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 오탄당 인산염 경로 (PPP)로의 유동을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖고, 이는 대장균 zwf의 과발현인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 UTP 생산 및 재순환을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖고, 이는 대장균 pyrH (UMP 키나제), 대장균 cmk (시티딜레이트 키나제), 대장균 adk (아데닐레이트 키나제), 또는 대장균 ndk (뉴클레오시드 이인산염 키나제)의 증가된 발현 또는 활성으로부터 선택된 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 UDP 생산을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖고, 이는 upp (우라실 포스포리보실트랜스퍼라제), pyrH (UMP 키나제), cmk (시티딜레이트 키나제); dctA (C4 디카르복실레이트/오로테이트:H+ 동시수송체), pyrE (오로테이트 포스포리보실트랜스퍼라제), pyrH (UMP 키나제) 및 cmk (시티딜레이트 키나제)의 과발현 또는 증가된 활성으로부터 선택된 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 글루코스 흡수의 조절을 제거하거나 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖고, 이는 sgrS 작은 조절 RNA의 결실, 불활성화, 또는 감소된 발현을 포함하는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 글루코스-1-인산염의 TDP-글루코스로의 전환을 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖고, 이는 dTDP-글루코스 피로포스포릴라제 유전자의 결실, 불활성화, 또는 감소된 발현 또는 활성을 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 글루코스-1-인산염의 ADP-글루코스로의 전환을 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖고, 이는 글루코스-1-인산염 아데닐릴트랜스퍼라제의 결실, 불활성화, 또는 감소된 발현 또는 활성을 포함하는 것인 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 방법은 중량 기준으로 스테비올 글리코시드 중간체의 스테비올 글리코시드 생성물로의 적어도 40% 전환을 초래하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 방법은 중량 기준으로 스테비올 글리코시드 중간체의 스테비올 글리코시드 생성물로의 적어도 50% 전환을 초래하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 방법은 중량 기준으로 스테비올 글리코시드 중간체의 스테비올 글리코시드 생성물로의 적어도 75% 전환을 초래하는 방법.
  31. 제1항에 있어서, 적어도 5:1의 RebM 대 RebD 비율이 스테비올 글리코시드 생성물로서 회수되는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 방법은 배치(batch) 발효, 연속 발효, 또는 반연속 발효에 의해 수행되는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 방법은 공급 배치 발효에 의해 수행되는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 스테비올 글리코시드 중간체는 박테리아 세포와 72시간 이하 동안 배양되는 방법.
  35. 제2항에 있어서, 상기 스테비올 글리코시드 글리코실화 생성물은 RebD, RebE, RebI, 또는 RebB를 포함하는 것인 방법.
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