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KR102527430B1 - Gst-pi 유전자 조정을 위한 rna 간섭 제제 - Google Patents

Gst-pi 유전자 조정을 위한 rna 간섭 제제 Download PDF

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KR102527430B1
KR102527430B1 KR1020177020898A KR20177020898A KR102527430B1 KR 102527430 B1 KR102527430 B1 KR 102527430B1 KR 1020177020898 A KR1020177020898 A KR 1020177020898A KR 20177020898 A KR20177020898 A KR 20177020898A KR 102527430 B1 KR102527430 B1 KR 102527430B1
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KR
South Korea
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synthetic oligonucleotide
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웬빈 잉
겐지로우 미노미
옌스 하르보르트
히로카즈 다카하시
에리카 데라다
준 장
모하마드 아흐마디안
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닛토덴코 가부시키가이샤
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Publication date
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Abstract

본 발명은 RNA 간섭을 사용하여 인간 GST-π 의 발현을 조정하기 위한 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. RNA 간섭 분자는 악성 종양과 같은 질환의 예방 또는 치료 방법에서 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 중 하나 이상 수식된 또는 화학적으로-수식된 다양한 siRNA 구조가 제공된다. 유리한 구조는 시드 영역에 위치하는 2'-데옥시 뉴클레오티드, 뿐만 아니라 다른 뉴클레오티드 수식을 갖는 siRNA 를 포함한다.

Description

GST-PI 유전자 조정을 위한 RNA 간섭 제제 {RNA INTERFERENCE AGENTS FOR GST-PI GENE MODULATION}
발명의 기술 분야
본 발명은 핵산 기반 분자로 구성되는 생물의약품 및 치료제의 분야와 관련된다. 더 상세하게는, 본 발명은 인간 GST-π 의 발현을 조정하기 위해 RNA 간섭 (RNA interference) (RNAi) 을 이용하는 화합물 및 조성물, 및 그것의 용도와 관련된다.
서열목록
본 출원은 2015 년 12 월 20 일에 생성된 ASCII 파일로서 전자적으로 제출되는 파일명이 ND5123385WO_SL.txt 인 서열목록을 포함하며, 이는 100,000 바이트 크기이고, 본원에 그 전체가 참조로 포함된다.
다양한 인간 암 조직이 돌연변이된 KRAS 유전자의 출현과 상관관계가 있는 것으로 발견되었다. 일부 경우에서, 조직은 또한 상승된 수준의 글루타티온 S-트랜스퍼라제 Pi (Glutathione S-Tranferase Pi) (GST-π) 발현을 나타낸다. (Miyanishi 등, Gastroenterology, 2001, Vol. 121:865-874, Abstract) 예를 들어, 상승된 혈청 GST-π 수준이 다양한 위장 악성종양을 갖는 환자에서 관찰되었다. (Niitsu 등, Cancer, 1989, Vol.63, No. 2, pp. 317-323, Abstract)
GST-π 는 소수성 및 친전자성 화합물과 환원된 글루타티온과의 콘주게이션을 촉매작용함으로써 해독에서 한 역할을 하는 효소의 GST 패밀리의 구성원이다. GST-π 발현은 시험관내에서 siRNA 로 감소될 수 있다. (Niitsu 등, US 2014/0315975 A1). 그러나, 현존하는 siRNA 제제에는 불충분한 활성, 오프 타겟 효과 (off target effect), 혈청 안정성의 결여, 및 생체내 효력 또는 효능의 결여와 같은 많은 단점이 존재한다.
암과 관련된 유전자의 발현을 조정하기 위한 조성물 및 방법에 관한 절실한 필요가 존재한다. 특히, GST-π 발현의 억제에 기반하는 치료제는 고도로 강력하고 안정적인 siRNA 서열 및 구조를 요구할 것이며, 이는 오프 타겟 효과를 감소시킬 수 있다.
필요한 것은 악성 종양과 같은 질환을 치료하기 위한 용도로 GST-π 발현을 조정하기 위한 siRNA 서열, 화합물 및 구조이다.
본 발명은 RNA 간섭을 사용하여 인간 GST-π 의 발현을 조정하기 위한 화합물, 조성물 및 방법과 관련된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 GST-π 의 RNA 간섭 유전자 침묵화 (gene silencing) 를 위한 분자를 제공한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 구조, 분자 및 조성물은 악성 종양을 포함하는, GST-π 와 관련되는 질환의 예방 또는 치료 또는 병태 또는 장애의 증상의 완화 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예는 하기를 포함한다:
센스 가닥 (sense strand) 및 안티센스 가닥 (antisense strand) 을 포함하는 GST-π 의 발현을 억제하기 위한 핵산 분자로서, 여기서 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 듀플렉스 영역 (duplex region) 을 형성하는, 핵산 분자. 핵산 분자는 GST-π 의 발현을 억제하기 위한 siRNA 분자일 수 있고, 수식된 (modified) 또는 화학적으로-수식된 (chemically-modified) 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, GST-π 의 발현을 억제하기 위한 핵산 siRNA 분자는 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 치환된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 2'-데옥시 뉴클레오티드는 siRNA 분자의 시드 영역 (seed region) 에 있을 수 있다. 특정 양상에서, GST-π 의 발현을 억제하기 위한 siRNA 분자는 데옥시뉴클레오티드를 안티센스 가닥의 복수의 위치에 가질 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 유리하게는 GST-π mRNA 의 발현을 300 pM 미만의 IC50 으로 억제할 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 생체내에서 분자의 단일 투여 후에 GST-π mRNA 의 발현 수준을 적어도 25% 만큼 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 감소된, 또는 적어도 50-배, 또는 적어도 100-배 만큼 감소된 패신저 가닥 (passenger strand) 오프 타겟 활성 (off target activity) 을 가질 수 있다.
본 발명의 구현예는 또한 siRNA 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 담체는 지질 분자, 또는 리포좀일 수 있다. 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 세포를 포함한다.
본 발명에서 또한 고려되는 것은 siRNA 를 함유하는 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 GST-π 발현과 관련되는 질환을 치료하는 방법이며, 여기에서 질환은 악성 종양, 암, 돌연변이된 KRAS 를 발현하는 세포에 의해 야기되는 암, 육종, 또는 암종이다.
도 1: 도 1 은 GST-π 를 표적으로 삼는 본 발명의 siRNA 에 의한 생체내에서의 동소이식 (orthotopic) 폐암 종양의 현저한 감소를 보여준다. GST-π siRNA 는 리포좀 제형으로 2 ㎎/㎏ 의 용량으로 A549 동소이식 폐암 종양을 나타내는 무흉선 누드 마우스에게 투여되었다. 처리 그룹 및 비히클 컨트롤 그룹에 관해 부검시 최종 원발성 종양 중량이 측정되었다. 이러한 6-주 연구에서 GST-π siRNA 는 폐암 종양의 억제에 관해 유의미한 효능을 보였다. 도 1 에서 보여지는 바와 같이, 43 일 후에, GST-π siRNA 는 현저하게 유리한 종양 억제를 보였으며, 최종 원발성 종양 평균 중량은 컨트롤과 비교할 때 2.8-배 만큼 유의미하게 감소했다.
도 2: 도 2 는 GST-π siRNA 에 관한 생체내에서의 종양 억제 효능을 보여준다. A549 세포를 사용하는 암 이종이식 모델이 0.75 ㎎/㎏ 의 비교적 낮은 용량의 siRNA 와 함께 이용되었다. GST-π siRNA 는 수일 내에 유리한 종양 억제를 보였다. 36 일 후에, GST-π siRNA 는 현저하게 유리한 종양 억제를 보였으며, 최종 종양 평균 부피는 컨트롤과 비교할 때 약 2-배 만큼 유의미하게 감소했다.
도 3: 도 3 은 도 2 의 종점에서의 GST-π siRNA 에 관한 생체내에서의 종양 억제 효능을 보여준다. GST-π siRNA 는 유리한 종양 억제를 보였으며, 평균 종양 중량은 2-배 초과 만큼 감소했다.
도 4: 도 4 는 본 발명의 GST-π siRNA 가 시험관내에서 세포자멸사에 의한 암 세포 사망을 크게 증가시켰다는 것을 보여준다. GST-π siRNA 는 세포 생존력의 손실과 관련되는 세포자멸사에 관한 바이오마커인 PUMA 의 상향조절을 야기했다. 도 4 에서, GST-π siRNA 의 트랜스펙션 후 2-6 일로부터 PUMA 의 발현이 크게 증가되었다.
도 5: 도 5 는 본 발명의 GST-π siRNA 가 생체내에서 A549 이종이식 종양에 관해 녹다운 효능을 제공했다는 것을 보여준다. 무흉선 누드 (nu/nu) 암컷 마우스 (Charles River) 에서 GST-π 를 표적으로 삼는 siRNA 로 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 관찰되었다. 도 5 에서 보여지는 바와 같이, 4 ㎎/㎏ 의 용량에서, 주사 후 24 시간에 GST-π mRNA 의 약 40% 의 유의미한 감소가 검출되었다.
도 6: 도 6 은 본 발명의 GST-π siRNA 가 생체내에서 췌장암 이종이식 종양을 억제했다는 것을 보여준다. GST-π siRNA 는 생체내에서 리포좀 제형으로 무흉선 누드 암컷 마우스, 6 내지 8 주령의 췌장암 이종이식 종양에 투여될 때 유전자 침묵화 효력을 제공했다. 도 6 에서 보여지는 바와 같이, 0.375 ㎎/㎏ 내지 3 ㎎/㎏ 범위의 용량의 GST-π 를 표적으로 삼는 siRNA 로 용량 반응이 수득되었다. GST-π siRNA 는 투여 후 수일 내에 유리한 종양 억제를 보였으며, 종양 부피는 종점에서 약 2-배 만큼 감소했다.
도 7: 도 7 은 본 발명의 GST-π siRNA 가 증가된 혈청 안정성을 나타냈다는 것을 보여준다. 도 7 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 의 센스 가닥 (도 7, 위쪽) 및 안티센스 가닥 (도 7, 아래쪽) 둘 모두에 관한 혈청 중 반감기 (t½) 는 약 100 분이었다.
도 8: 도 8 은 본 발명의 GST-π siRNA 가 혈장 중 제형에서 향상된 안정성을 나타냈다는 것을 보여준다. 도 8 은 PBS 중 50% 인간 혈청 중 GST-π siRNA 의 리포좀 제형의 인큐베이션, 및 다양한 시점에서의 남은 siRNA 의 검출을 보여준다. 도 8 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 의 제형의 혈장 중 반감기 (t½) 는 100 시간 보다 유의미하게 더 길었다.
도 9: 도 9 는 GST-π siRNA 의 가이드 가닥 (guide strand) 에 관한 시험관내 녹다운을 보여준다. 도 9 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 의 가이드 가닥 녹다운은 대략 지수적이었으며, 이와 비교되게 스크램블드 서열 (scrambled sequence) 에 관한 컨트롤은 효과를 나타내지 않았다.
도 10: 도 10 은 도 9 의 GST-π siRNA 의 패신저 가닥 (passenger strand) 에 관한 시험관내 녹다운을 보여준다. 도 10 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 에 관한 패신저 가닥 오프 타겟 녹다운이 크게 감소되었으며, 본질적으로 효과를 나타내지 않았다.
도 11: 도 11 은 몇 개의 고활성 GST-π siRNA 의 가이드 가닥에 관한 시험관내 녹다운을 보여준다. 도 11 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 의 가이드 가닥 녹다운 활성은 대략 지수적이었다.
도 12: 도 12 는 도 11 의 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 관한 시험관내 녹다운을 보여준다. 도 12 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 에 관한 패신저 가닥 오프 타겟 녹다운 활성은 약 500 pM 미만에서 유의미하게 감소되었다.
도 13: 도 13 은 고활성 GST-π siRNA 의 가이드 가닥에 관한 시험관내 녹다운을 보여준다. 도 13 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 의 가이드 가닥 녹다운 활성은 대략 지수적이었다.
도 14: 도 14 는 도 13 의 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 관한 시험관내 녹다운을 보여준다. 도 14 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 에 관한 패신저 가닥 오프 타겟 녹다운 활성은 유의미하게 감소되었다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 GST-π 의 발현을 조정하기 위한 핵산 기반 치료제에 관한 화합물, 조성물 및 방법과 관련된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 RNA 간섭에서 활성인 분자, 뿐만 아니라 GST-π 의 발현을 침묵화할 수 있는 구조 및 조성물을 제공한다.
본 공개의 구조 및 조성물은 다양한 질환 예컨대 악성 종양을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 치료적 RNAi 분자의 전달 및 흡수를 위한 조성물, 뿐만 아니라 그의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 RNA-기반 조성물은 악성 종양, 예컨대 암의 예방 또는 치료 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 치료적 조성물은 RNA 간섭에서 활성인 핵산 분자를 포함한다. 치료적 핵산 분자는 유전자 침묵화를 위해 GSTP1 (GST-π) 를 표적으로 삼을 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 작은 간섭하는 RNA (siRNA) 로서 활성일 수 있고 GST-π 유전자 발현을 조절 또는 침묵화할 수 있는 다양한 분자를 제공한다.
본 발명의 siRNA 는 악성 종양의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예는 또한 본 발명의 siRNA 를 악성 종양의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위한 비히클, 제형, 또는 지질 나노입자 제형을 제공한다. 본 발명은 또한 siRNA 를 치료제로서 포유동물에게 투여하는 방법을 고려한다.
본 발명의 치료적 분자 및 조성물은 화합물 또는 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 GST-π 관련되는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 RNA 간섭을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명의 화합물을 악성 종양의 예방 또는 치료를 위해 사용할 수 있다.
일부 양상에서, 악성 종양은 다양한 질환, 예를 들어, GST-π 를 고도로 발현하는 암, 돌연변이된 KRAS 를 발현하는 세포에 의해 야기되는 암, 육종, 섬유육종, 악성 섬유질 조직구종, 지방육종, 횡문근육종, 평활근육종, 맥관육종, 카포시 육종, 림프관육종, 활막 육종, 연골육종, 골육종, 및 암종에서 나타날 수 있다.
특정 양상에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 화합물을 임의의 장기 또는 조직에서의 악성 종양 및 암, 예를 들어, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담도암, 신장암, 요도암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 난소암, 피부암, 백혈병, 악성 림프종, 상피성 악성 종양, 및 비-상피성 악성 종양의 예방 또는 치료를 위해 사용할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 치료적 분자의 조합은 GST-π 유전자 발현의 침묵화 또는 억제를 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 다양한 RNAi 분자를 제공하며, 여기에서 각 분자는 폴리뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리뉴클레오티드 안티센스 가닥을 갖고; 분자의 각 가닥은 15 내지 30 개 뉴클레오티드 길이를 갖고; 안티센스 가닥의 15 내지 30 개 뉴클레오티드의 인접 영역 (contiguous region) 은 GST-π 를 인코딩하는 mRNA 의 서열에 상보적이고; 센스 가닥의 적어도 일부분은 안티센스 가닥의 적어도 일부분에 상보적이고, 분자는 15 내지 30 개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는다.
본 발명의 RNAi 분자는 분자의 듀플렉스 영역에 위치하는, GST-π 를 인코딩하는 mRNA 의 서열에 상보적인 안티센스 가닥의 15 내지 30 개 뉴클레오티드의 인접 영역을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi 분자는 GST-π 를 인코딩하는 mRNA 의 서열에 상보적인 안티센스 가닥의 15 내지 30 개 뉴클레오티드의 인접 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 구현예는 또한 이를 필요로 하는 포유동물에서 악성 종양의 하나 이상의 증상의 예방, 치료 또는 완화, 또는 악성 종양을 발달시킬 위험의 감소, 또는 악성 종양의 개시의 지연을 위한 방법을 제공할 수 있다.
GST-π 및 RNAi 분자
예시적 표적 인간 글루타티온 S-전달효소 pi (인간 GST-π) mRNA 의 핵산 서열이 GenBank 접근 번호 NM_000852.3 (hGSTP1) 에 개시되어 있고, 986 개 뉴클레오티드 길이이다.
당업자는 보고된 서열이 시간의 흐름에 따라 변화할 수 있고 본원에서 핵산 분자에 필요한 임의의 변화를 그에 맞춰 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 구현예는 작은 핵산 분자를 사용하는 GST-π 발현의 유전자 침묵화를 위한 조성물 및 방법을 제공할 수 있다. 핵산 분자의 예는 RNA 간섭에서 활성인 분자 (RNAi 분자), 짧은 간섭하는 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자, 뿐만 아니라 DNA-지향되는 RNA (ddRNA), Piwi-상호작용 RNA (piRNA), 및 리피트 (repeat) 연합된 siRNA (rasiRNA) 를 포함한다. 이러한 분자들은 GST-π 유전자 발현에 대한 RNA 간섭을 매개할 수 있다.
본원에서 개시된 조성물 및 방법은 또한 대상체에서 다양한 종류의 악성 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 방법은 GST-π 를 인코딩하는 유전자의 발현을 하향 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 GST-π 단백질 및/또는 GST-π 단백질을 인코딩하는 유전자, GST-π 와 관련되는 질환, 병태 또는 장애, 예컨대 악성 종양의 유지 및/또는 발달과 관련되는 단백질 및/또는 GST-π 를 인코딩하는 유전자의 발현을, 독립적으로 또는 조합으로, 조정 또는 조절할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 GST-π 의 예시적인 서열과 관련하여 기재된다. 당업자는 본 발명의 다양한 양상 및 구현예가 임의의 관련된 GST-π 유전자, 서열, 또는 변이체, 예컨대 동족체 유전자 및 전사체 변이체, 및, 임의의 GST-π 유전자와 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 을 포함하는, 다형성에 관한 것이라는 점을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 GST-π 유전자, 예를 들어 인간 GST-π 의 발현을 하향조절하는 이중-가닥 짧은 간섭하는 핵산 (siRNA) 분자를 제공할 수 있다.
본 발명의 RNAi 분자는 GST-π 및 임의의 상동성 서열을, 예를 들어, 상보적 서열을 사용하여 또는 추가의 표적 서열을 제공할 수 있는 비-표준적 (non-canonical) 염기쌍, 예를 들어, 미스매치 (mismatch) 및/또는 워블 (wobble) 염기쌍을 편입시킴으로써, 표적으로 삼을 수 있다.
미스매치가 확인되는 경우에, 비-표준적 염기쌍, 예를 들어, 미스매치 및/또는 워블 염기가 사용되어 하나 초과의 유전자 서열을 표적으로 삼는 핵산 분자를 생성할 수 있다.
예를 들어, 비-표준적 염기쌍 예컨대 UU 및 CC 염기쌍이 사용되어 서열 상동성을 공유하는 상이한 GST-π 표적에 관한 서열을 표적화할 수 있는 핵산 분자를 생성할 수 있다. 따라서, RNAi 분자는 상동성 유전자 사이에 보존되어 있는 뉴클레오티드 서열을 표적으로 삼을 수 있고, 단일 RNAi 분자가 사용되어 하나 초과의 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
일부 양상에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 GST-π mRNA 에 대해 활성인 RNAi 분자를 포함하며, 여기에서 RNAi 분자는 GST-π 서열을 인코딩하는 임의의 mRNA 에 상보적인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 공개의 RNAi 분자는 GST-π RNA 에 대한 활성을 가질 수 있으며, 여기에서 RNAi 분자는 변이체 GST-π 인코딩 서열을 갖는 RNA, 예를 들어, 악성 종양과 관련되는 것으로 당업계에 알려진 돌연변이체 GST-π 유전자에 상보적인 서열을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 RNAi 분자는 GST-π 유전자의 뉴클레오티드 서열과 상호작용하고 GST-π 유전자 발현의 침묵화를 매개할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
GST-π 의 발현을 억제하기 위한 핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가질 수 있으며, 이들 가닥은 듀플렉스 영역을 형성한다. 핵산 분자가 듀플렉스 영역에 갖는 뉴클레오티드 중 하나 이상은 수식 또는 화학적으로-수식될 수 있으며, 그러한 수식은 당해 기술에 공지되어 있는 것들을 포함한다. siRNA 의 오버행 (overhang) 에 있는 임의의 뉴클레오티드가 또한 수식 또는 화학적으로-수식될 수 있다.
일부 구현예에서, 바람직한 수식된 또는 화학적으로-수식된 뉴클레오티드는 2'-데옥시 뉴클레오티드이다. 추가 구현예에서, 수식된 또는 화학적으로-수식된 뉴클레오티드는 2'-O-알킬 치환된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드, 락트 (locked) 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 바람직한 구조는 데옥시뉴클레오티드를 복수의 위치에 함유하는 안티센스 가닥을 가질 수 있으며, 복수의 위치는 하기 중 하나이다: 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터, 위치 4, 6 및 8 의 각각; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터, 위치 3, 5 및 7 의 각각; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터, 위치 1, 3, 5 및 7 의 각각; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터, 위치 3-8 의 각각; 및 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 5-8 의 각각. 임의의 이들 구조는 듀플렉스 영역에서 하나 이상의 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드와 조합될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 GST-π mRNA 의 발현을 약 300 pM 미만, 또는 약 200 pM 미만, 또는 약 100 pM 미만, 또는 약 50 pM 미만의 유리한 IC50 으로 억제할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 분자는 단일 투여시에 생체내에서 GST-π mRNA 의 발현 수준을 적어도 25% 만큼 억제할 수 있다.
본원에서 기재된 바와 같은 하나 이상의 siRNA 를 약학적으로 허용가능한 담체와의 조합으로 함유할 수 있는 약학적 조성물이 본 발명에서 고려된다. 당업계에서 알려진 것들, 뿐만 아니라 지질 분자, 나노입자, 또는 리포좀 (이들은 모두 siRNA 분자를 캡슐화할 수 있다) 을 포함하는 임의의 적합한 담체가 사용될 수 있다.
본 발명은 GST-π 발현과 관련되는 질환의 치료 방법을 공개하며, 이 방법은 siRNA 중 하나 이상을 함유하는 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 치료될 질환은 그 중에서도 악성 종양, 암, 돌연변이된 KRAS 를 발현하는 세포에 의해 야기되는 암, 육종, 및 암종을 포함할 수 있다.
GST-π mRNA 를 표적으로 삼는 본 발명의 RNAi 분자의 예가 표 1 에서 보여진다.
표 1: GST-π 에 관한 RNAi 분자 서열
Figure 112017071726252-pct00001
Figure 112017071726252-pct00002
Figure 112017071726252-pct00003
표 1 에 관한 기호설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C, 및 데옥시티미딘을 지칭한다.
GST-π mRNA 를 표적으로 삼는 본 발명의 RNAi 분자의 예가 표 2 에서 보여진다.
표 2: GST-π 에 관한 RNAi 분자 서열
Figure 112017071726252-pct00004
표 2 에 관한 기호설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C, 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄은 2'-OMe-치환된, 예를 들어, U 을 지칭한다. 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 수식된, 역전된, 또는 화학적으로 수식된 뉴클레오티드이다. "s" 글자는 포스포로티오에이트 연결기를 나타낸다.
GST-π mRNA 를 표적으로 삼는 본 발명의 RNAi 분자의 예가 표 3 에서 보여진다.
표 3: GST-π 에 관한 RNAi 분자 서열
Figure 112017071726252-pct00005
표 3 에 관한 기호설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C, 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄은 2'-OMe-치환된, 예를 들어, U 을 지칭한다. 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 수식된, 역전된, 또는 화학적으로 수식된 뉴클레오티드이다.
GST-π mRNA 를 표적으로 삼는 본 발명의 RNAi 분자의 예가 표 4 에서 보여진다.
표 4: GST-π 에 관한 RNAi 분자 서열
Figure 112017071726252-pct00006
표 4 에 관한 기호설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C, 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄은 2'-OMe-치환된, 예를 들어, U 을 지칭한다. 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 수식된, 역전된, 또는 화학적으로 수식된 뉴클레오티드이다.
GST-π mRNA 를 표적으로 삼는 본 발명의 RNAi 분자의 예가 표 5 에서 보여진다.
표 5: GST-π 에 관한 RNAi 분자 서열
Figure 112017071726252-pct00007
표 5 에 관한 기호설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C, 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄은 2'-OMe-치환된, 예를 들어, U 을 지칭한다. 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 수식된, 역전된, 또는 화학적으로 수식된 뉴클레오티드이다.
GST-π mRNA 를 표적으로 삼는 본 발명의 RNAi 분자의 예가 표 6 에서 보여진다.
표 6: GST-π 에 관한 RNAi 분자 서열
Figure 112017071726252-pct00008
표 6 에 관한 기호설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C, 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄은 2'-OMe-치환된, 예를 들어, U 을 지칭한다. 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 수식된, 역전된, 또는 화학적으로 수식된 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다양한 핵산 분자를 제공하며, 여기에서: a) 분자는 폴리뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리뉴클레오티드 안티센스 가닥을 갖고; b) 분자의 각 가닥은 15 내지 30 개 뉴클레오티드 길이이고; c) 안티센스 가닥의 15 내지 30 개 뉴클레오티드의 인접 영역은 GST-π 를 인코딩하는 mRNA 의 서열에 상보적이고; d) 센스 가닥의 적어도 일부분은 안티센스 가닥의 적어도 일부분에 상보적이고, 분자는 15 내지 30 개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 분자의 듀플렉스 영역에 위치하는, GST-π 를 인코딩하는 mRNA 의 서열에 상보적인 안티센스 가닥의 15 내지 30 개 뉴클레오티드의 인접 영역을 가질 수 있다.
추가 구현예에서, 핵산 분자는 GST-π 를 인코딩하는 mRNA 의 서열에 상보적인 안티센스 가닥의 15 내지 30 개 뉴클레오티드의 인접 영역을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 핵산 분자의 각 가닥은 18 내지 22 개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 핵산 분자의 듀플렉스 영역은 19 개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
대안적인 형태에서, 핵산 분자는, 단일 가닥으로서 연결되어 있고 루프에 의해 하나의 말단에서 연결된 듀플렉스 영역을 형성하는 폴리뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리뉴클레오티드 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
본 공개의 핵산 분자의 일부 구현예는 블런트 엔드 (blunt end) 를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 하나 이상의 3' 오버행을 가질 수 있다.
본 발명은 유전자 침묵화에 관해 활성인 RNAi 분자인 다양한 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 분자는 dsRNA, siRNA, 마이크로-RNA, 또는 유전자 침묵화에 관해 활성인 shRNA, 뿐만 아니라 DNA-지향되는 RNA (ddRNA), Piwi-상호작용 RNA (piRNA), 또는 리피트 연합된 siRNA (rasiRNA) 일 수 있다. 핵산 분자는 GST-π 의 발현의 억제에 관해 활성일 수 있다.
본 발명의 구현예는 또한 100 pM 미만의 GST-π 의 녹다운에 관한 IC50 을 갖는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 추가의 구현예는 50 pM 미만의 GST-π 의 녹다운에 관한 IC50 을 갖는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자 중 하나 이상을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 함유하는 조성물을 고려한다. 특정 구현예에서, 담체는 지질 분자 또는 리포좀일 수 있다.
본 발명의 화합물 및 조성물은 화합물 또는 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 GST-π 관련되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에서 유용하다.
본 발명의 방법은 본 발명의 화합물을 악성 종양의 예방 또는 치료를 위해 이용할 수 있다. 악성 종양은 다양한 질환, 예를 들어, GST-π 발현과 관련되는 암, 돌연변이된 KRAS 를 발현하는 세포에 의해 야기되는 암, 육종, 섬유육종, 악성 섬유질 조직구종, 지방육종, 횡문근육종, 평활근육종, 맥관육종, 카포시 육종, 림프관육종, 활막 육종, 연골육종, 골육종, 암종, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 맹장암, 결장직장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담도암, 항문 암, 신장암, 요도암, 비뇨기 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 난소암, 피부암, 백혈병, 악성 림프종, 상피성 악성 종양, 및 비-상피성 악성 종양에서 나타날 수 있다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA
본 발명의 구현예는 치료적 용도를 위해 향상된 특성, 예컨대 유전자 침묵화에 관한 증가된 활성 및 효력을 제공하는 수식된 또는 화학적으로-수식된 siRNA 분자를 망라한다. 본 발명은 증가된 혈청 안정성, 뿐만 아니라 감소된 오프 타겟 효과를, 유전자 조정 및 유전자 침묵화에 관한 siRNA 분자의 활성 및 효력의 손실 없이, 가질 수 있는 수식된 또는 화학적으로-수식된 siRNA 분자를 제공한다. 일부 양상에서, 본 발명은 siRNA 의 안정성 및 효능을 향상시키는 수식 또는 화학 수식을 다양한 조합으로 갖는 siRNA 를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자는 적어도 10-배, 또는 적어도 20-배, 또는 적어도 30-배, 또는 적어도 50-배, 또는 적어도 100-배 만큼 감소된 패신저 가닥 오프 타겟 활성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어들 수식된 및 화학적으로-수식된은 천연 발생 뉴클레오티드의 구조 또는 siRNA 의 핵산 구조에서 만들어진 변화를 지칭하며, 이는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체, 변경된 뉴클레오티드, 비-표준 뉴클레오티드, 비-천연 발생 뉴클레오티드, 및 이들의 조합을 갖는 siRNA 를 망라한다.
일부 구현예에서, siRNA 에서의 수식된 또는 화학적으로-수식된 구조의 수는 모든 구조적 구성요소, 및/또는 siRNA 분자의 모든 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 뉴클레오티드의 당 기의 수식, 뉴클레오티드의 핵염기의 수식, 핵산 골격 또는 연결기의 수식, siRNA 가닥의 말단에서의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 구조의 수식, 및 이들의 조합을 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 당의 2' 탄소에서 치환의 수식을 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 가닥의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양쪽 말단에서 수식을 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 가닥 사이의 상보성 미스매치를 초래하는 수식을 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 5'-프로필아민 말단, 5'-인산화된 말단, 3'-퓨로마이신 말단, 또는 3'-바이오틴 말단 기를 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 2'-플루오로 치환된 리보뉴클레오티드, 2'-OMe 치환된 리보뉴클레오티드, 2'-데옥시 리보뉴클레오티드, 2'-아미노 치환된 리보뉴클레오티드, 2'-티오 치환된 리보뉴클레오티드를 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 하나 이상의 5-할로우리딘, 5-할로시티딘, 5-메틸시티딘, 리보티미딘, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 4-티오우리딘, 또는 5-아미노알릴우리딘을 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 하나 이상의 포스포로티오에이트 기를 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 하나 이상의 2'-플루오로 치환된 리보뉴클레오티드, 2'-플루오로우리딘, 2'-플루오로시티딘, 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 2'-데옥시아데노신, 또는 2'-데옥시구아노신을 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결기를 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 하나 이상의 알킬렌 디올 연결기, 옥시-알킬티오 연결기, 또는 옥시카보닐옥시 연결기를 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 하나 이상의 데옥시비염기성 기, 이노신, N3-메틸-우리딘, N6,N6-디메틸-아데노신, 슈도우리딘, 퓨린 리보뉴클레오사이드, 및 리바비린을 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 하나 이상의 3' 또는 5' 역전된 말단기를 갖는 siRNA 를 포함한다.
수식된 및 화학적으로-수식된 siRNA 의 예는 하나 이상의 5-(2-아미노)프로필우리딘, 5-브로모우리딘, 아데노신, 8-브로모 구아노신, 7-데아자-아데노신, 또는 N6-메틸 아데노신을 갖는 siRNA 를 포함한다.
GST-π 를 조정하고 악성 종양을 치료하기 위한 방법
본 발명의 구현예는 GST-π 및/또는 GST-π 단백질의 발현을 하향 조절 또는 억제하는데 사용될 수 있는 RNAi 분자를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 RNAi 분자는 악성 종양과 같은 질환 또는 병태와 관련될 수 있는 GST-π 일배체형 다형성으로부터 비롯되는 GST-π 및/또는 GST-π 단백질의 발현을 하향 조절 또는 억제하는데 사용될 수 있다.
GST-π 단백질 또는 mRNA 수준의 모니터링을 사용하여 유전자 침묵화를 특성규명하고, 본 발명의 화합물 및 조성물의 효능을 확인할 수 있다.
본 공개의 RNAi 분자는 개별적으로, 또는 다른 siRNA 와의 조합으로 하나 이상의 유전자의 발현을 조정하기 위해 사용될 수 있다.
본 공개의 RNAi 분자는 개별적으로, 또는 조합으로, 또는 다른 알려진 약물과 함께 악성 종양을 포함하는 GST-π 와 관련되는 질환의 예방 또는 치료 또는 병태 또는 장애의 증상의 완화를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 RNAi 분자는 GST-π 의 발현을 서열-특이적 방식으로 조정 또는 억제하는데 사용될 수 있다.
본 공개의 RNAi 분자는 가이드 가닥을 포함할 수 있으며, 가이드 가닥의 일련의 인접 뉴클레오티드는 GST-π mRNA 에 적어도 부분적으로 상보적이다.
특정 양상에서, 악성 종양은 본 발명의 RNAi 분자를 사용하여 RNA 간섭에 의해 치료될 수 있다.
악성 종양의 치료는 적합한 세포 기반 모델, 뿐만 아니라 생체외 또는 생체내 동물 모델에서 특성규명될 수 있다.
악성 종양의 치료는 병든 조직의 세포에서의 GST-π mRNA 의 수준 또는 GST-π 단백질의 수준을 확인함으로써 특성규명될 수 있다.
악성 종양의 치료는 병든 장기 또는 조직의 비-침습적 의료 스캐닝에 의해 특성규명될 수 있다.
본 발명의 구현예는 그것을 필요로 하는 대상체에서 GST-π 관련되는 질환 또는 병태의 증상을 예방, 치료, 또는 완화하는 방법을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에서 악성 종양의 증상을 예방, 치료, 또는 완화하는 방법은 대상체에게 본 발명의 RNAi 분자를 투여하여 대상체 또는 유기체에서 GST-π 유전자의 발현을 조정하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 세포 또는 유기체를 본 발명의 RNAi 분자와 접촉시킴으로써 세포 또는 유기체에서 GST-π 유전자의 발현을 하향 조절하는 방법을 고려한다.
본 발명의 구현예는 상기 예에 따라 수식된 또는 화학적으로-수식된 표 1-6 의 siRNA 분자를 망라한다.
RNA 간섭
RNA 간섭 (RNA Interference) (RNAi) 은 짧은 간섭하는 RNA (siRNA) 에 의해 매개되는 동물에서의 서열-특징적 전사후 유전자 침묵화를 지칭한다. 예를 들어, Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33; Fire et al., Nature, 1998, Vol. 391, pp. 806811; Sharp, Genes & Development, 1999, Vol. 13, pp. 139-141 을 참고한다.
세포에서의 RNAi 반응은 이중가닥 RNA (dsRNA) 에 의해 유발될 수 있지만, 그 메카니즘은 아직 완전히 이해되지 않고 있다. 세포에서의 특정 dsRNA 는 다이서 (Dicer) 효소, 리보뉴클레아제 III 효소의 작용을 받을 수 있다. 예를 들어, Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33; Hammond et al., Nature, 2000, Vol. 404, pp. 293-296 을 참고한다. 다이서는 dsRNA 를 dsRNA 의 더 짧은 조각인 siRNA 로 가공할 수 있다.
일반적으로, siRNA 는 약 21 내지 약 23 개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 약 19 개 뉴클레오티드 길이의 염기쌍 듀플렉스 영역을 포함할 수 있다.
RNAi 은 RNA 유도되는 침묵화 복합체 (RNA induced silencing complex) (RISC) 로서 알려진 엔도뉴클레아제 복합체를 수반한다. siRNA 는 RISC 복합체에 진입하여 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 갖는 단일가닥 RNA 표적의 절단을 매개하는 안티센스 또는 가이드 가닥을 갖는다. siRNA 의 다른 가닥은 패신저 가닥이다. 표적 RNA 의 절단은 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 영역의 중간에서 일어난다. 예를 들어, Elbashir et al., Genes & Development, 2001, Vol. 15, pp. 188-200 을 참고한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "센스 가닥" 은 siRNA 분자의 대응하는 안티센스 가닥의 적어도 일부분에 부분적으로 또는 전체적으로 상보적인 siRNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. siRNA 분자의 센스 가닥은 표적 핵산 서열과 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안티센스 가닥" 은 표적 핵산 서열의 적어도 일부분에 부분적으로 또는 전체적으로 상보적인 siRNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. siRNA 분자의 안티센스 가닥은 siRNA 분자의 대응하는 센스 가닥의 적어도 일부분에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다.
RNAi 분자는 RNA 간섭을 서열-특이적 방식으로 매개함으로써 유전자 발현을 하향 조절 또는 녹 다운할 수 있다. 예를 들어, Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33; Elbashir et al., Nature, 2001, Vol. 411, pp. 494-498; Kreutzer et al., WO2000/044895; Zernicka-Goetz et al., WO2001/36646; Fire et al., WO1999/032619; Plaetinck et al., WO2000/01846; Mello et al., WO2001/029058 을 참고한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 발현에 관한 용어들 "억제," "하향-조절," 또는 "감소" 는 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 수준, 또는 인코딩된 단백질 중 하나 이상의 활성이 본 발명의 RNAi 분자 또는 siRNA 의 부재시에 관찰되는 것보다 아래로 감소되는 것을 의미한다. 예를 들어, 발현의 수준, mRNA 의 수준, 또는 인코딩된 단백질 활성의 수준은 본 발명의 RNAi 분자 또는 siRNA 의 부재시에 관찰되는 것보다 적어도 1%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 90%, 또는 그 이상 만큼 감소될 수 있다.
RNAi 분자는 또한 바이러스 유전자 발현을 녹 다운하고, 그에 따라 바이러스 복제에 영향을 미치는데 사용될 수 있다.
RNAi 분자는 별개의 폴리뉴클레오티드 가닥: 센스 가닥 또는 패신저 가닥, 및 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥으로부터 만들어질 수 있다. 가이드 및 패신저 가닥은 적어도 부분적으로 상보적이다. 가이드 가닥 및 패신저 가닥은 약 15 내지 약 49 개의 염기쌍을 갖는 듀플렉스 영역을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, siRNA 의 듀플렉스 영역은 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 또는 49 개의 염기쌍을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, RNAi 분자는 RISC 복합체에서 활성일 수 있으며, RISC 에 관해 활성인 듀플렉스 영역의 길이를 갖는다.
추가 구현예에서, RNAi 분자는 다이서 기질로서 활성이어서, RISC 복합체에서 활성일 수 있는 RNAi 분자로 전환될 수 있다.
일부 양상에서, RNAi 분자는 상보적 가이드 및 패신저 서열 부분을 긴 분자의 대향하는 말단들에 가질 수 있으며, 그에 따라 분자는 상보적 서열 부분들로 듀플렉스 영역을 형성할 수 있고, 가닥들은 듀플렉스 영역의 하나의 말단에 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 링커에 의해 연결된다. 예를 들어, 헤어핀 배열, 또는 스템 및 루프 배열. 가닥들과의 링커 상호작용은 공유 결합 또는 비-공유 상호작용일 수 있다.
본 공개의 RNAi 분자는 핵산의 센스 영역을 핵산의 안티센스 영역에 연결시키는 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드, 또는 혼합된 뉴클레오티드/비-뉴클레오티드 링커를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 링커는 2 개 이상의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 뉴클레오티드 길이의 링커일 수 있다. 뉴클레오티드 링커는 핵산 압타머 (aptamer) 일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "압타머" 또는 "핵산 압타머" 는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 지칭하며, 여기서 상기 핵산 분자는 그것의 자연적 환경에서 표적 분자에 의해 인지되는 서열을 포함하는 서열을 갖는다. 대안적으로, 압타머는 표적 분자에 결합하는 핵산 분자일 수 있으며, 여기에서 표적 분자는 핵산에 자연적으로 결합하지 않는다. 예를 들어, 압타머는 단백질의 리간드-결합 도메인에 결합하여, 이로써 천연 발생 리간드와 단백질의 상호작용을 방지하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Gold et al., Annu Rev Biochem, 1995, Vol. 64, pp. 763-797; Brody et al., J. Biotechnol., 2000, Vol. 74, pp. 5-13; Hermann et al., Science, 2000, Vol. 287, pp. 820-825 를 참고한다.
비-뉴클레오티드 링커의 예는 무염기성 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질, 폴리탄화수소, 또는 다른 폴리머 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 예컨대 2 내지 100 개의 에틸렌 글리콜 단위체를 갖는 것들을 포함한다. 일부 예가 Seela et al., Nucleic Acids Research, 1987, Vol. 15, pp. 3113-3129; Cload et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, Vol. 113, pp. 6324-6326; Jaeschke et al., Tetrahedron Lett., 1993, Vol. 34, pp. 301; Arnold et al., WO1989/002439; Usman et al., WO1995/006731; Dudycz et al., WO1995/011910, and Ferentz et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, Vol. 113, pp. 4000-4002 에 기재되어 있다.
RNAi 분자는 듀플렉스 영역으로부터의 오버행을 하나 이상 가질 수 있다. 오버행은 비-염기쌍, 단일 가닥 영역이며, 1 내지 8 개 뉴클레오티드 길이, 또는 그 이상일 수 있다. 오버행은 3'-말단 오버행일 수 있으며, 여기서 가닥의 3'-말단은 1 내지 8 개 뉴클레오티드의 단일 가닥 영역을 갖는다. 오버행은 5'-말단 오버행일 수 있으며, 여기서 가닥의 5'-말단은 1 내지 8 개 뉴클레오티드의 단일 가닥 영역을 갖는다.
RNAi 분자의 오버행은 동일한 길이를 가질 수 있거나, 또는 상이한 길이를 가질 수 있다.
RNAi 분자는 하나 이상의 블런트 엔드를 가질 수 있으며, 여기에서 듀플렉스 영역은 오버행으로 끝나지 않고, 가닥들은 듀플렉스 영역의 말단까지 염기쌍을 이룬다.
본 공개의 RNAi 분자는 하나 이상의 블런트 엔드를 가질 수 있거나, 또는 하나 이상의 오버행을 가질 수 있거나, 또는 블런트 엔드와 오버행 말단의 조합을 가질 수 있다.
RNAi 분자의 가닥의 5'-말단은 블런트 엔드에 있을 수 있거나, 또는 오버행에 있을 수 있다. RNAi 분자의 가닥의 3'-말단은 블런트 엔드에 있을 수 있거나, 또는 오버행에 있을 수 있다.
RNAi 분자의 가닥의 5'-말단은 블런트 엔드에 있을 수 있으며, 한편 3'-말단은 오버행에 있다. RNAi 분자의 가닥의 3'-말단은 블런트 엔드에 있을 수 있으며, 한편 5'-말단은 오버행에 있다.
일부 구현예에서, RNAi 분자의 양쪽 말단은 블런트 엔드이다.
추가 구현예에서, RNAi 분자의 양쪽 말단은 오버행을 갖는다.
5'- 및 3'-말단의 오버행은 상이한 길이를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, RNAi 분자는 블런트 엔드를 가질 수 있으며, 여기에서 안티센스 가닥의 5'-말단 및 센스 가닥의 3'-말단은 어떠한 오버행 뉴클레오티드도 갖지 않는다.
추가 구현예에서, RNAi 분자는 블런트 엔드를 가질 수 있으며, 여기에서 안티센스 가닥의 3'-말단 및 센스 가닥의 5'-말단은 어떠한 오버행 뉴클레오티드도 갖지 않는다.
RNAi 분자는 듀플렉스 영역의 염기 쌍형성에서 미스매치를 가질 수 있다.
RNAi 분자의 오버행에서의 임의의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드일 수 있다.
하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드는 5'-말단에 있을 수 있으며, 여기에서 RNAi 분자의 다른 가닥의 3'-말단은 오버행을 갖지 않을 수 있거나, 또는 데옥시리보뉴클레오티드 오버행을 갖지 않을 수 있다.
하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드는 3'-말단에 있을 수 있으며, 여기에서 RNAi 분자의 다른 가닥의 5'-말단은 오버행을 갖지 않을 수 있거나, 또는 데옥시리보뉴클레오티드 오버행을 갖지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi 분자의 오버행 뉴클레오티드 중 하나 이상, 또는 전부는 2'-데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다.
다이서 기질 RNAi 분자
일부 양상에서, RNAi 분자는 가공되어 RISC 활성 RNAi 분자를 초래할 수 있는, 다이서 기질로서 적합한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, Rossi 등, US2005/0244858 을 참고한다.
다이서 기질인 이중가닥 RNA (dsRNA) 은 다이서에 의해 가공되어 활성 RNAi 분자를 생산하기에 충분한 길이를 가질 수 있고, 추가로 하기 특성 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 다이서 기질 dsRNA 는 비대칭일 수 있으며, 예를 들어, 3' 오버행을 안티센스 가닥에 갖고, (ii) 다이서 기질 dsRNA 는 활성 RNAi 분자로의 dsRNA 의 다이서 결합 및 가공의 방향을 가이드하는 수식된 3' 말단을 센스 가닥에 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 에서 가장 긴 가닥은 24-30 개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 는 대칭 또는 비대칭일 수 있다.
일부 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 22-28 개 뉴클레오티드의 센스 가닥 및 24-30 개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 오버행을 안티센스 가닥의 3' 말단에 가질 수 있다.
추가 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 센스 가닥 25 개 뉴클레오티드 길이, 및 안티센스 가닥 27 개 뉴클레오티드 길이와, 2 염기 3'-오버행을 가질 수 있다. 오버행은 1, 2 또는 3 개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 센스 가닥은 또한 5' 인산염을 가질 수 있다.
비대칭 다이서 기질 dsRNA 는 센스 가닥의 3'-말단에 리보뉴클레오티드 중 2 개 대신에 데옥시리보뉴클레오티드 2 개를 가질 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 의 센스 가닥은 약 22 내지 약 30, 또는 약 22 내지 약 28; 또는 약 24 내지 약 30; 또는 약 25 내지 약 30; 또는 약 26 내지 약 30; 또는 약 26 내지 29; 또는 약 27 내지 약 28 개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 의 센스 가닥은 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
특정 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 적어도 약 25 개 뉴클레오티드 길이, 및 약 30 개 이하의 뉴클레오티드 길이의 센스 및 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 26 내지 29 개 뉴클레오티드 길이의 센스 및 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 27 개 뉴클레오티드 길이의 센스 및 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 의 센스 및 안티센스 가닥은 블런트 엔드인 경우와 같이 동일한 길이일 수 있거나, 또는 오버행을 갖는 경우와 같이 상이한 길이일 수 있거나, 또는 블런트 엔드 및 오버행을 가질 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 는 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27 개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 가질 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 의 안티센스 가닥은 생물학적 조건 하에, 예컨대 진핵 세포의 세포질 내에서, 센스 가닥의 서열의 적어도 일부분에 어닐링되는 임의의 서열을 가질 수 있다.
센스 및 안티센스 가닥을 갖는 다이서 기질은 제 3 구조, 예컨대 링커 기 또는 링커 올리고뉴클레오티드에 의해 연결될 수 있다. 링커는 dsRNA 의 2 개의 가닥을 연결시켜서, 예를 들어, 어닐링 후에 헤어핀이 형성된다.
다이서 기질의 센스 및 안티센스 가닥은 일반적으로 상보적이지만, 염기 쌍형성에서 미스매치를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 비대칭이며, 센스 가닥은 22-28 개 뉴클레오티드를 갖고 안티센스 가닥은 24-30 개 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 의 가닥 중 하나, 특히 안티센스 가닥의 영역은 적어도 19 개 뉴클레오티드의 서열 길이를 가질 수 있으며, 여기서 이들 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 3' 말단에 인접한 21-뉴클레오티드 영역에 있고 표적 유전자로부터 생산된 RNA 의 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보적이다.
다이서 기질 dsRNA 의 안티센스 가닥은 1 내지 9 개 리보뉴클레오티드를 5'-말단에 가져서, 22-28 개 뉴클레오티드의 길이를 초래할 수 있다. 안티센스 가닥이 21 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 때, 그 때 1-7 개 리보뉴클레오티드, 또는 2-5 개 리보뉴클레오티드, 또는 4 개 리보뉴클레오티드가 3'-말단에 첨가될 수 있다. 첨가된 리보뉴클레오티드는 임의의 서열을 가질 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 의 센스 가닥은 24-30 개 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 센스 가닥은 안티센스 가닥과 실질적으로 상보적이어서, 생물학적 조건 하에 안티센스 가닥에 어닐링될 수 있다.
RNAi 분자의 사용 방법
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 분자의 직접 적용에 의해, 또는 담체 또는 희석제와 조합된 분자로, 세포 또는 조직에 전달될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 담체 또는 희석제, 또는 세포 내로의 진입을 보조하고, 촉진하거나 용이하게 하도록 작용하는 임의의 다른 전달 비히클, 예를 들어 바이러스 서열, 바이러스 물질, 또는 지질 또는 리포솜 제형과 분자의 직접 적용에 의해 세포, 조직, 기관 또는 대상체에 전달 또는 투여될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 양이온성 지질과 복합화되고, 리포솜 내에 패키징되고, 또는 다르게는 표적 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 핵산 또는 핵산 복합체는 생체외, 또는 생체내로 직접 진피 적용, 경피 적용 또는 주사를 통해 관련 조직에 국소 투여될 수 있다.
전달 시스템은 예를 들어, 수성 및 비수성 겔, 크림, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 리포솜, 연고, 수용액 및 비수용액, 로션, 에어로졸, 탄화수소 베이스 및 분말을 포함할 수 있으며, 가용화제 및 투과 증강제와 같은 부형제를 함유할 수 있다.
본 개시물의 조성물 및 방법은, 핵산 분자의 발현을 허용하는 방식으로 본 발명의 하나 이상의 RNAi 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 DNA 또는 RNA 벡터에 삽입된 전사 단위로부터 발현될 수 있다. 재조합 벡터는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 핵산 분자의 일시적 발현이 가능하도록 바이러스 벡터가 사용될 수 있다.
예를 들어, 벡터는 듀플렉스의 RNAi 분자의 두 가닥 모두, 또는 자가 상보성이며 따라서 RNAi 분자를 형성하는 단일 핵산 분자를 인코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 발현 벡터는 둘 이상의 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
핵산 분자는 진핵생물 프로모터로부터 세포 내에 발현될 수 있다. 당업자는 임의의 핵산이 적절한 DNA/RNA 벡터로부터 진핵생물 세포에서 발현될 수 있다는 것을 인지하고 있다.
일부 양상에서, 발현 구축물에 의해 인코딩된 dsRNA 구축물의 전사를 위하여, 세포 내로 발현 구축물이 도입되도록 바이러스 구축물을 사용할 수 있다.
지질 제형은 정맥내, 근육내, 또는 복강내 주사, 또는 경구 또는 흡입으로 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 방법에 의해 동물에 투여될 수 있다.
올리고뉴클레오티드를 투여하기 위한 약학적으로 허용가능한 제형이 공지되어 있으며 사용될 수 있다.
시험관내 녹다운에 관한 예시 프로토콜
트랜스펙션 전 1 일에, 세포를 96-웰 플레이트에 10% FBS 를 함유하는 100 ㎕ 의 DMEM (HyClone Cat. # SH30243.01) 을 함유하는 웰 마다 2 x 103 개의 세포를 플레이팅하고, 공기 중에 5% CO2 의 가습된 분위기를 함유하는 37℃ 인큐베이터에서 배양했다. 트랜스펙션 전에, 배지를 2% FBS 를 함유하는 90 ㎕ 의 Opti-MEM I 감소된 혈청 배지 (Life Technologies Cat. # 31985-070) 로 교체했다. 그 후, 0.2 ㎕ 의 리포펙타민 RNAiMax (Life Technologies Cat. # 13778-100) 를 5 분 동안 실온에서 4.8 ㎕ 의 Opti-MEM I 와 혼합했다. 그 후, 1 ㎕ 의 siRNA 를 4 ㎕ 의 Opti-MEM I 와 혼합하고, LF2000 용액과 조합하고, 볼텍스하지 않으면서 부드럽게 혼합했다. 실온에서 5 분 후에, 혼합물을 추가의 10 분 동안 실온에서 인큐베이션하여 RNA-RNAiMax 복합체가 형성되게 했다. 또한, 10 ㎕ 의 RNA-RNAiMax 복합체를 웰에 첨가하고, 플레이트를 손으로 부드럽게 진탕했다. 세포를 공기 중에 5% CO2 의 가습된 분위기를 함유하는 37℃ 인큐베이터에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 배지를 2% FBS 를 함유하는 신선한 Opti-MEM I 감소된 혈청 배지로 교체했다. 트랜스펙션 후 24 시간에, 세포를 빙랭 PBS 로 1 회 세정했다. 세포를 50 ㎕ 의 Cell-to-Ct 세포용해 버퍼 (Life Technologies Cat. # 4391851 C) 로 5-30 분 동안 실온에서 용해했다. 5 ㎕ 의 정지액을 첨가하고, 그것을 2 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. mRNA 수준을 RT-qPCR 에 의해 TAQMAN 을 이용하여 즉시 측정했다. 샘플을 -80 ℃ 에서 냉동하고 나중에 분석할 수 있었다.
혈청 안정성에 관한 예시 프로토콜
0.2 ㎎/㎖ siRNA 를 10% 인간 혈청과 함께 37 ℃ 에서 인큐베이션했다. 특정 시점 (0, 5, 15 및 30 min) 에서, 200 ㎕ 의 샘플을 분주하고, 200 ㎕ 추출 용매 (클로로포름: 페놀: 이소아밀 알코올 =24:25:1) 로 추출했다. 샘플을 볼텍싱하고, 13,000 rpm 에서 10 분 동안 RT 에서 원심분리하고, 그 후 최상층 용액을 옮기고, 그것을 0.45 ㎛ 필터로 여과했다. 여과물을 300 ㎕ HPLC 주사 바이알 내로 옮겼다. LCMS 를 위한, 이동상은 MPA: H2O 중 100 mM HFIP + 7 mM TEA, MPB: 50 % 메탄올 + 50% 아세토니트릴이었다. 칼럼: Waters Acquity OST 2.1 x 50 mm, 1.7 ㎛.
실시예
실시예 1: GST-π 를 표적으로 삼는 본 발명의 siRNA 는 시험관내에서 유전자 침묵화에 관해 활성인 것으로 밝혀졌다. 유전자 녹다운에 관한 GST-π siRNA 의 용량-의존적 활성은 약 250 피코몰 (pM) 미만, 및 최소 1 pM 의 IC50 을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 siRNA 녹다운 효능을 확인했다. 표 7 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 에 관한 용량 의존적 녹다운이 표 1 의 siRNA 로 관찰되었다.
표 7: A549 세포주에서 GST-π mRNA 에 관한 용량 의존적 녹다운
Figure 112017071726252-pct00009
표 7 에서 보여지는 바와 같이, 표 1 의 GST-π siRNA 의 활성은 17-235 pM 범위였으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제를 포함하는 많은 용도에 적합하다.
실시예 2: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 영역에 위치하는 데옥시뉴클레오티드를 갖는 본 발명의 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 유리하게는 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 BU2' (SEQ ID NO:131 및 157) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 녹다운 효능을 확인했다. 표 8 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 BU2' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 8: 구조 BU2' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure 112017071726252-pct00010
표 8 에서 보여지는 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 영역에 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 BU2' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성이 듀플렉스 영역에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 예상외로 최대 6-배 만큼 증가되었다.
이들 데이터는 안티센스 가닥의 시드 영역의 위치 3, 5 및 7 에, 또는 위치 4, 6 및 8 에 위치하는 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 가 듀플렉스 영역에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다는 것을 보여준다.
안티센스 가닥의 시드 영역에 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 관해 표 8 에서 보여지는 활성은 5 내지 8 pM 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 3: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 영역에 위치하는 데옥시뉴클레오티드를 갖는 본 발명의 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 및 유리하게는 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 A9' (SEQ ID NO:183 및 195) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 녹다운 효능을 확인했다. 표 9 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 A9' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 9: 구조 A9' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure 112017071726252-pct00011
표 9 에서 보여지는 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 영역에 3 내지 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 A9' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성은 듀플렉스 영역에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 최대 24-배 만큼 증가되었다.
이들 데이터는 안티센스 가닥의 시드 영역의 위치 4, 6 및 8 에, 또는 위치 1, 3, 5 및 7 에, 또는 위치 3-8 에, 또는 위치 5-8 에, 또는 위치 3, 5 및 7 에 위치하는 3 내지 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 가 듀플렉스 영역에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다는 것을 보여준다.
안티센스 가닥의 시드 영역에 3 내지 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 관해 표 9 에서 보여지는 활성은 1 내지 15 pM 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 4: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 영역에 위치하는 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 및 유리하게는 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 B13' (SEQ ID NO:207 및 222) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 녹다운 효능을 확인했다. 표 10 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 B13' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 10: 구조 B13' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure 112017071726252-pct00012
표 10 에서 보여지는 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 영역에 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 B13' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성은 듀플렉스 영역에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 증가되었다.
이들 데이터는 안티센스 가닥의 시드 영역의 위치 4, 6 및 8 에 위치하는 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 가 듀플렉스 영역에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다는 것을 보여준다.
안티센스 가닥의 시드 영역에 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 관해 표 10 에서 보여지는 활성은 11 pM 의 피코몰 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 5: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 영역에 위치하는 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 및 유리하게는 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 B4' (SEQ ID NO:261 및 273) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 녹다운 효능을 확인했다. 표 11 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 B4' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 11: 구조 B4' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure 112017071726252-pct00013
표 11 에서 보여지는 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 영역에 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 B4' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성은 듀플렉스 영역에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 2-배 초과 만큼 증가되었다.
이들 데이터는 안티센스 가닥의 시드 영역의 위치 3-8 에 위치하는 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 가 듀플렉스 영역에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다는 것을 보여준다.
안티센스 가닥의 시드 영역에 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 관한 표 11 에서 보여지는 활성은 113 pM 의 피코몰 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 6: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 영역에 위치하는 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 및 유리하게는 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 B2' (SEQ ID NO:237 및 249) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 녹다운 효능을 확인했다. 표 12 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 B2' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 12: 구조 B2' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure 112017071726252-pct00014
표 12 에서 보여지는 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 영역에 3 내지 4 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 B2' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성은 듀플렉스 영역에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 최대 4-배 만큼 증가되었다.
이들 데이터는 안티센스 가닥의 시드 영역의 위치 5-8 에, 또는 위치 1, 3, 5 및 7 에, 또는 위치 3, 5 및 7 에 위치하는 3 내지 4 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 이 듀플렉스 영역에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다는 것을 보여준다.
안티센스 가닥의 시드 영역에 3 내지 4 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 관한 표 12 에서 보여지는 활성은 30-100 pM 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 7: 하나 이상의 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드를 함유하는 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 BU2' (SEQ ID NO:131 및 157) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 녹다운 효능을 확인했다. 표 13 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 BU2' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 13: 구조 BU2' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure 112017071726252-pct00015
표 13 에서 보여지는 바와 같이, 하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 BU2' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성은 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 최대 10-배 만큼 증가되었다.
이들 데이터는 하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 가 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다는 것을 보여준다.
하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 관한 표 13 에서 보여지는 활성은 3 내지 13 pM 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 8: 하나 이상의 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드를 함유하는 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 B13' (SEQ ID NO:207 및 222) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 녹다운 효능을 확인했다. 표 14 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 B13' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 14: 구조 B13' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure 112017071726252-pct00016
표 14 에서 보여지는 바와 같이, 비-오버행 위치에 위치하는 3 개의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 B13' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성은 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 약 3-배 만큼 증가되었다.
이들 데이터는 하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 가 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공했다는 것을 보여준다.
하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 관한 표 14 에서 보여지는 활성은 6 pM 의 피코몰 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 9: 동소이식 A549 폐암 마우스 모델. 본 발명의 GST-π siRNA 는 생체내에서 동소이식 폐암 종양의 현저한 감소를 나타낼 수 있다. 이 실시예에서, GST-π siRNA 는 생체내에서 리포좀 제형으로 무흉선 누드 마우스의 동소이식 폐암 종양에 투여될 때 유전자 녹다운 효력을 제공했다.
일반적으로, 동소이식 종양 모델은 약물 효능 및 효력에 관한 직접적인 임상 관련성, 뿐만 아니라 개선된 예측의 능력을 나타낼 수 있다. 동소이식 종양 모델에서, 종양 세포는 세포가 유래되는 장기와 동일한 종류의 장기 내로 직접적으로 이식된다.
처리 그룹 및 비히클 컨트롤 그룹에 관해 부검시 측정된 최종 원발성 종양 중량을 비교함으로써 인간 폐암 A549 에 대한 siRNA 제형의 항종양 효능을 평가했다.
도 1 은 구조 BU2 (SEQ ID NO:61 및 126) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 관한 생체내에서의 동소이식 폐암 종양 억제를 보여준다. 동소이식 A549 폐암 마우스 모델을 2 ㎎/㎏ 의 비교적 낮은 용량의 GST-π 를 표적으로 삼는 siRNA 와 함께 이용했다.
이러한 6-주 연구에서 GST-π siRNA 는 유의미하고 예상외로 유리한 폐 종양 억제 효능을 보였다. 도 1 에서 보여지는 바와 같이, 43 일 후에, GST-π siRNA 는 현저하게 유리한 종양 억제 효능을 보였으며, 최종 종양 평균 중량은 컨트롤과 비교할 때 2.8-배 만큼 유의미하게 감소했다.
이러한 연구에서, 수컷 NCr nu/nu 마우스, 5-6 주령을 사용했다. 실험 동물을 실험 기간 동안 HEPA 여과되는 환경에서 유지했다. siRNA 제형을 사용 전에 4℃ 에서 보관하고, 마우스에 주사하기 10 분 전에 실온으로 가온했다.
이러한 A549 인간 폐암 동소이식 모델에 관해, 외과적 동소 이식 (SOI) 을 하는 날에, A549 종양 이종이식편을 보유하는 동물의 피하 부위로부터 스톡 종양을 수확하고 RPMI-1640 배지에 놓았다. 괴사 조직을 제거하고, 생존가능한 조직을 1.5-2 ㎣ 조각으로 잘랐다. 동물을 이소플루란 흡입으로 마취하고, 수술 부위를 요오드 및 알코올로 멸균했다. 한 쌍의 외과용 가위를 사용하여 마우스의 왼쪽 가슴 벽에 대략 1.5 ㎝ 길이의 횡행 절개를 수행했다. 제 3 및 제 4 갈비뼈 사이에서 늑골간 절개를 수행했고, 왼쪽 폐를 노출시켰다. 하나의 A549 종양 단편을 8-0 외과용 봉합사 (나일론) 를 사용하여 폐의 표면에 이식했다. 가슴 벽을 6-0 외과용 봉합사 (실크) 로 닫았다. 25 G X 1 ½ 바늘을 갖는 3 cc 주사기를 사용하여 흉내 천자에 의해 폐를 재-팽창시키켜 흉강의 남은 공기를 빼냈다. 가슴 벽을 6-0 외과용 실크 봉합사로 닫았다. 위에 기재된 모든 수술 절차를 HEPA 여과되는 층류 후드 하에서 7 x 배율 현미경을 이용하여 수행했다.
종양 이식 후 3 일에, 모델 종양-보유 마우스를 그룹 당 10 마리 마우스의 그룹으로 무작위로 나누었다. 관심의 그룹에 관해, 10 마리 마우스의 처리를 종양 이식 후 3 일에 개시했다.
관심의 그룹에 관해, 제형은 (이온화가능 지질:콜레스테롤:DOPE:DOPC:DPPE-PEG-2K:DSPE-PEG-2K), 리포좀 조성물이었다. 리포좀은 GST-π siRNA 를 캡슐화했다.
연구 종점을 위해, 처리 개시 후 42 일에 실험 마우스를 희생시켰다. 후속의 분석을 위해 원발성 종양을 잘라내고 전자 밸런스에서 계량했다.
화합물 독성의 추정을 위해, 처리된 및 컨트롤 그룹 내 마우스의 평균 체중을 전체 실험 기간 동안 정상 범위 내에서 유지했다. 마우스에서 독성의 다른 증상이 관찰되지 않았다.
실시예 10: 본 발명의 GST-π siRNA 는 생체내에서 암 이종이식 종양의 현저한 감소를 나타냈다. GST-π siRNA 는 생체내에서 리포좀 제형으로 암 이종이식 종양에 투여될 때 유전자 녹다운 효력을 제공했다.
도 2 는 GST-π siRNA (SEQ ID NO:156 및 182) 에 관한 종양 억제 효능을 보여준다. 암 이종이식 모델을 0.75 ㎎/㎏ 의 비교적 낮은 용량의 GST-π 를 표적으로 삼는 siRNA 와 함께 이용했다.
GST-π siRNA 는 투여 후 수일 내에 유의미하고 예상외로 유리한 종양 억제 효능을 보였다. 36 일 후에, GST-π siRNA 는 현저하게 유리한 종양 억제 효능을 보였으며, 종양 부피는 컨트롤과 비교할 때 2-배 만큼 감소했다.
도 3 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 는 종점 일에 유의미하고 예상외로 유리한 종양 억제 효능을 입증했다. 특히, 종양 중량은 2-배 초과 만큼 감소했다.
GST-π siRNA 를 조성 (이온화가능 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 리포좀 제형의 2 회 주사 (제 1 일 및 제 15 일) 로 투여했다.
암 이종이식 모델에 관해, A549 세포주를 ATCC 로부터 수득했다. 세포를 10% 우태 혈청 및 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보강된 배양 배지에서 유지했다. 세포를 접종 전 48 시간에 분할하여 세포가 수확될 때 로그기 성장에 있게 했다. 세포를 트립신-EDTA 로 약간 트립신화하고, 조직 배양물로부터 수확했다. 생존 세포의 수를 트립판 블루의 존재 하에 혈구계에서 카운트 및 확인했다 (오직 생존 세포를 카운트한다). 세포를 혈청 없는 배지에 5 x 107/㎖ 의 농도로 재현탁시켰다. 그 후 세포 현탁액을 주사를 위해 얼음 해동된 BD 마트리겔과 1:1 비로 잘 혼합했다.
마우스는 Charles River Laboratory 무흉선 누드 (nu/nu) 암컷 마우스 (면역-약화된, 6-8 주령, 그룹 당 7-8 마리의 마우스) 였다.
종양 모델 제조를 위해, 각 마우스에 25 G 바늘 및 주사기를 사용하여 2.5 x 106 개 A549 세포의 0.1 ㎖ 접종물을, 마우스 당 하나의 접종물을 오른쪽 옆구리에 피하 접종했다. 마우스를 접종을 위해 마취하지 않았다.
종양 부피 측정 및 무작위화를 위해, 종양 크기를 0.1 mm 가까이로 측정했다. 종양 부피를 다음 식을 사용하여 계산했다: 종양 부피 = 길이 x 너비2/2. 확립된 종양이 대략 120 - 175 ㎣ 에 도달하고, 평균 종양 부피가 약 150 ㎣ 이 되었을 때, 마우스를 다양한 비히클 컨트롤 및 처리 그룹에 배정하여 처리된 그룹 내 평균 종양 부피가 비히클 컨트롤 그룹 내 평균 종양 부피의 10% 내이고, 이상적으로, 종양 부피의 CV% 가 25% 미만이 되게 했다. 동일한 날에, 시험품 및 컨트롤 비히클을 투약 레지멘에 따라 투여했다. 종양 부피를 제 1 주 동안 3 회, 연구 종료일을 포함하여, 나머지 주 동안 2 회 모니터링했다.
투여량 투여를 위해, 투약 일에, 시험품을 -80 ℃ 냉동고에서 꺼내어 얼음 위에서 해동시켰다. 주사기에 넣기 전에, 제형을 함유하는 병을 손으로 몇 번 뒤집었다. 모든 시험품을 IV 에 의해 0.75 ㎎/㎏, q2w X 2, 10 ㎖/㎏ 로 투여했다.
체중에 관해, 마우스를 0.1 g 가까이로 계량했다. 체중을 첫번째 용량에 관한 투약 후 7 일 내에 매일 모니터링 및 기록했다. 체중을 몇 주 동안, 연구 종료일을 포함하여, 나머지 주 동안 2 회 모니터링 및 기록했다.
종양 수집을 위해, 첫번째 투약 후 28 일에, 종양 부피를 측정하고, 종양을 중량 측정을 위해 해부하고, PD 바이오마커 연구를 위해 보관했다. 종양 중량을 기록했다.
실시예 11: 본 발명의 GST-π siRNA 는 시험관내에서 암 세포의 세포자멸사에 의한 증가된 암 세포 사망을 입증했다. GST-π siRNA 는 GST-π 녹다운을 제공했으며, 이는 세포 생존력의 손실과 관련되는 세포자멸사에 관한 바이오마커인 PUMA 의 상향조절을 야기했다.
시드 영역 내 데옥시뉴클레오티드의 조합, 2'-F 치환된 데옥시뉴클레오티드, 및 2'-OMe 치환된 리보뉴클레오티드를 함유한, GST-π siRNA SEQ ID NO:156 및 182 는 암 세포의 예상외로 증가된 세포자멸사를 제공했다.
GST-π siRNA SEQ ID NO:156 및 182 에 관한 PUMA 의 발현 수준이 도 4 에서 보여지는 바와 같이 측정되었다. 도 4 에서, PUMA 의 발현은 GST-π siRNA 의 트랜스펙션 후 2-4 일로부터 크게 증가되었다.
이들 데이터는 시드 영역 내 데옥시뉴클레오티드의 조합, 2'-F 치환된 데옥시뉴클레오티드, 및 2'-OMe 치환된 리보뉴클레오티드를 함유하는 GST-π siRNA 의 구조가 암 세포의 예상외로 증가된 세포자멸사를 제공했다는 것을 보여준다.
PUMA 바이오마커에 관한 프로토콜은 다음과 같았다. 트랜스펙션 전 1 일에, 세포를 96-웰 플레이트에 10% FBS 를 함유하는 100 ㎕ 의 DMEM (HyClone Cat. # SH30243.01) 을 포함하는 웰 마다 2 x 103 개의 세포를 플레이팅하고, 공기 중에 5% CO2 의 가습된 분위기를 함유하는 37℃ 인큐베이터에서 배양했다. 다음 날, 트랜스펙션 전에 배지를 2% FBS 를 함유하는 90 ㎕ 의 Opti-MEM I 감소된 혈청 배지 (Life Technologies Cat. # 31985-070) 로 교체했다. 그 후, 0.2 ㎕ 의 리포펙타민 RNAiMAX (Life Technologies Cat. #13778-100) 를 5 분 동안 실온에서 4.8 ㎕ 의 Opti-MEM I 와 혼합했다. 1 ㎕ 의 GST-π siRNA (스톡 농도 1 μM) 를 4 ㎕ 의 Opti-MEM I 와 혼합하고, RNAiMAX 용액과 조합하고, 그 후 부드럽게 혼합했다. 혼합물을 10 분 동안 실온에서 인큐베이션하여 RNA-RNAiMAX 복합체가 형성되게 했다. 10 ㎕ 의 RNA-RNAiMAX 복합체를 웰 마다 첨가하여, siRNA 의 최종 농도가 10 nM 이 되게 했다. 세포를 2 시간 동안 인큐베이션하고, 배지를 2% FBS 를 함유하는 신선한 Opti-MEM I 감소된 혈청 배지로 교체했다. 트랜스펙션 후 1, 2, 3, 4, 및 6 일에, 세포를 빙랭 PBS 로 1 회 세정하고, 그 후 50 ㎕ 의 Cell-to-Ct 세포용해 버퍼 (Life Technologies Cat. # 4391851 C) 로 5-30 분 동안 실온에서 용해했다. 5 ㎕ 의 정지액을 첨가하고, 2 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. PUMA (BBC3, Cat# Hs00248075, Life Technologies) mRNA 수준을 qPCR 에 의해 TAQMAN 을 이용하여 측정했다.
실시예 12: 본 발명의 GST-π siRNA 는 생체내에서 암 이종이식 종양의 현저한 감소를 나타낼 수 있다. GST-π siRNA 는 생체내에서 리포좀 제형으로 암 이종이식 종양에 투여될 때 유전자 녹다운 효력을 제공할 수 있다.
도 5 는 GST-π siRNA (SEQ ID NO:61 및 126) 에 관한 종양 억제 효능을 보여준다. GST-π 를 표적으로 삼는 siRNA 로 생체내에서 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 관찰되었다. 암 이종이식 모델을 GST-π 를 표적으로 삼는 siRNA 와 함께 이용했다.
GST-π siRNA 는 투여 후 수일 내에 유의미하고 예상외로 유리한 종양 억제 효능을 보였다. 도 5 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 에 의한 처리는 지질 제형 중 주사 후 4 일에 GST-π mRNA 발현의 유의미한 감소를 초래했다. 4 ㎎/㎏ 의 더 높은 용량에서, 주사 후 24 시간에 약 40% 의 유의미한 감소가 검출되었다.
GST-π siRNA 를 조성 (이온화가능 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 리포좀 제형의 10 mL/㎏ 의 단일 주사로 투여했다.
암 이종이식 모델에 관해, A549 세포주를 ATCC 로부터 수득했다. 세포를 10% 우태 혈청 및 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보강된 RPMI-1640 에서 유지했다. 세포를 접종 전 48 시간에 분할하여 세포가 수확될 때 로그기 성장에 있게 했다. 세포를 트립신-EDTA 로 약간 트립신화하고, 조직 배양물로부터 수확했다. 생존 세포의 수를 트립판 블루의 존재 하에 혈구계에서 카운트 및 확인했다 (오직 생존 세포를 카운트한다). 세포를 혈청 없는 RPMI 배지에 4 x 107/㎖ 의 농도로 재현탁시켰다. 그 후 세포 현탁액을 주사를 위해 얼음 해동된 BD 마트리겔과 1:1 비로 잘 혼합했다.
마우스는 Charles River Laboratory 무흉선 누드 (nu/nu) 암컷 마우스 (면역-약화된, 6-8 주령, 그룹 당 3 마리의 마우스) 였다.
종양 모델 제조를 위해, 각 마우스에 25 G 바늘 및 주사기를 사용하여 2 x 106 개 A549 세포의 0.1 ㎖ 접종물을, 마우스 당 하나의 접종물을 오른쪽 옆구리에 피하 접종했다. 마우스를 접종을 위해 마취하지 않았다.
종양 부피 측정 및 무작위화를 위해, 종양 크기를 0.1 mm 가까이로 측정했다. 종양 부피를 다음 식을 사용하여 계산했다: 종양 부피 = 길이 x 너비2/2. 종양 부피를 1 주 2 회 모니터링했다. 확립된 종양이 대략 350 - 600 ㎣ 에 도달했을 때, 마우스를 다양한 시점에서 그룹에 배정했다. 동일한 날에, 시험품을 투약 레지멘에 따라 투여했다.
투여량 투여를 위해, 확립된 종양이 대략 350 - 600 ㎣ 에 도달한 날에, 시험품을 4℃ 냉장고에서 꺼냈다. 주사기에 넣기 전에, 제형을 함유하는 병을 손으로 몇 번 뒤집어서 균질한 용액을 만들었다.
체중에 관해, 마우스를 0.1 g 가까이로 계량했다. 체중을 몇 주 동안, 연구 종료일을 포함하여, 나머지 주 동안 2 회 모니터링 및 기록했다.
종양 수집을 위해, 동물을 과다투여된 CO2 에 의해 희생시키고, 종양을 투약 후 0, 24, 48, 72, 96 (선택적), 및 168 시간에 해부했다. 종양을 먼저 습윤 계량하고, 그 후 KD, 분포 및 바이오마커 분석을 위해 3 개의 부분으로 분리했다. 샘플을 액체 질소 중에 급속 냉동시키고, 가공될 준비가 될 때까지 -80 ℃ 에서 보관했다.
실시예 13: 본 발명의 GST-π siRNA 는 생체내에서 췌장암 이종이식 종양을 억제했다. GST-π siRNA 는 생체내에서 리포좀 제형으로 췌장암 이종이식 종양에 투여될 때 유전자 녹다운 효력을 제공했다.
이러한 이종이식 모델에서, 각 마우스에 2.5 x 106 개 PANC-1 세포의 0.1 ㎖ 접종물을 오른쪽 옆구리에 피하 접종했다. Charles River 무흉선 누드 암컷 마우스 (6 내지 8 주령) 를 사용했다. 종양 크기를 0.1 mm 가까이로 측정했다. 확립된 종양이 대략 150 - 250 ㎣ (평균 종양 부피 약 200 ㎣) 에 도달했을 때, 마우스를 다양한 비히클 컨트롤 및 처리 그룹에 배정하여 처리된 그룹 내 평균 종양 부피가 비히클 컨트롤 그룹 내 평균 종양 부피의 10% 내이도록 했다. 동일한 날에, 시험품 및 컨트롤 비히클을 투약 레지멘에 따라 투여했다. 종양 부피를 제 1 주 동안 3 회, 연구 종료일을 포함하여, 나머지 주 동안 2 회 모니터링했다.
도 6 은 GST-π siRNA (SEQ ID NO:61 및 126) 에 관한 종양 억제 효능을 보여준다. 도 6 에서 보여지는 바와 같이, 0.375 ㎎/㎏ 내지 3 ㎎/㎏ 범위의 용량의 GST-π 를 표적으로 삼는 siRNA 로 용량 반응이 수득되었다. GST-π siRNA 는 투여 후 수일 내에 유의미하고 예상외로 유리한 종양 억제 효능을 보였다. 따라서, GST-π siRNA 는 종점에서 유의미하고 예상외로 유리한 종양 억제 효능을 입증했다.
GST-π siRNA 를 조성 (이온화가능 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 리포좀 제형으로 투여했다.
실시예 14: 본 발명의 GST-π siRNA 는 증가된 혈청 안정성을 나타냈다.
도 7 은 인간 혈청 중 인큐베이션 및 HPLS/LCMS 에 의한 다양한 시점에서의 남은 siRNA 의 검출을 보여준다. 도 7 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA (SEQ ID NO:61 및 126) 의 센스 가닥 (도 7, 위쪽) 및 안티센스 가닥 (도 7, 아래쪽) 둘 모두에 관한 혈청 중 반감기 (t½) 는 약 100 분이었다.
실시예 15: 본 발명의 GST-π siRNA 는 혈장 중 제형에서 향상된 안정성을 나타냈다.
도 8 은 혈장 중 제형의 인큐베이션 및 다양한 시점에서의 남은 siRNA 의 검출을 보여준다. 도 8 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA (SEQ ID NO:61 및 126) 의 제형의 혈장 중 반감기 (t½) 는 100 시간 보다 유의미하게 더 길었다.
GST-π siRNA 를 조성 (이온화 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 리포좀 제형으로 제조했다. 리포좀 나노입자에 관한 z-평균 크기는 40.0 nm 였고, siRNA 는 91% 캡슐화되었다.
제형을 PBS 중 50% 인간 혈청 중 40min, 1.5h, 3h, 24h, 및 96h 동안 인큐베이션했다. GST-π siRNA 의 양을 ELISA-기반 검정에 의해 확인했다.
실시예 16: 본 발명의 GST-π siRNA 는 패신저 가닥에 의한 감소된 오프 타겟 효과를 나타냈다.
GST-π siRNA (SEQ ID NO:156 및 182) 에 관해, 도 9 는 가이드 가닥에 관한 시험관내 녹다운은 대략 지수적이었다는 것을 보여주며, 이와 비교되게 스크램블드 서열에 관한 컨트롤은 효과를 나타내지 않았다. 이러한 siRNA 의 IC50 은 5 pM 로 측정되었다. 도 10 은 동일한 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 관한 시험관내 녹다운을 보여준다. 도 10 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 에 관한 패신저 가닥 오프 타겟 녹다운은 100-배 초과 만큼 크게 감소되었다.
GST-π siRNA (SEQ ID NO:187 및 199), (SEQ ID NO:189 및 201), 및 (SEQ ID NO:190 및 202) 에 관해, 도 11 은 가이드 가닥에 관한 시험관내 녹다운이 대략 지수적이었다는 것을 보여준다. 이들 siRNA 의 IC50s 은 각각 6, 7, 및 5 pM 로 측정되었다. 도 12 에서 보여지는 바와 같이, 이들 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 관한 시험관내 녹다운은 적어도 10-배 만큼 유의미하게 감소되었다. 이들 GST-π siRNA 는 모두 듀플렉스 영역의 시드 영역에 데옥시뉴클레오티드를 가졌으며, 듀플렉스 영역에 다른 수식은 갖지 않았다.
GST-π siRNA (SEQ ID NO:217 및 232) 에 관해, 도 13 은 이러한 고활성 GST-π siRNA 의 가이드 가닥에 관한 시험관내 녹다운이 대략 지수적이었다는 것을 보여준다. 이러한 siRNA 의 IC50 은 11 pM 로 측정되었다. 도 14 에서 보여지는 바와 같이, 이러한 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 관한 시험관내 녹다운은 100-배 초과 만큼 유의미하게 감소되었다. 이러한 GST-π siRNA 는 듀플렉스 영역의 시드 영역에 데옥시뉴클레오티드를 가졌으며, 듀플렉스 영역에 다른 수식은 갖지 않았다.
오프 타겟 효과를 레닐라 루시퍼라아제 (Renilla luciferase) 유전자를 인코딩하는 발현 리포터 플라스미드 psiCHECK-2 (Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega, Cat#:E1960) 를 사용하여 확인했다. siRNA 농도는 전형적으로 50 pM 이었다. 프로토콜: 제 1 일에, HeLa 세포를 5 내지 7.5 x 103/100ul/웰 로 시딩했다. 제 2 일에, 세포 밀집도 약 80% 에서 동시트랜스펙션시켰다. 제 3 일에, 루시퍼라아제 활성 측정을 위해 세포를 수확했다. 루시퍼라아제 활성을 Promega 의 루시퍼라아제 검정 시스템 (E4550) 을 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 측정했다.
psiCHECK-2 벡터는 레닐라 루시퍼라아제의 리포터 유전자에 융합된 표적 유전자의 발현의 변화를 모니터링하는 것을 가능하게 했다. siRNA 구축물을 다중 클로닝 영역 내로 클로닝하고, 벡터를 siRNA 와 함께 HeLa 세포 내로 동시트랜스펙션시켰다. 특이적 siRNA 가 표적 mRNA 에 결합하고 RNAi 과정을 개시하는 경우에, 융합된 레닐라 루시퍼라아제: 구축물 mRNA 는 절단되고 그 후에 분해되어, 레닐라 루시퍼라아제 신호를 감소시킬 것이다.
예를 들어, BU2' 구조를 갖는 siRNA 에 관한 플라스미드 인서트 (insert) 는 다음과 같았다:
PsiCHECK-2 (F) 플라스미드 인서트:
Figure 112017071726252-pct00017
PsiCHECK-2 (R) 플라스미드 인서트:
Figure 112017071726252-pct00018
실시예 17: 본 발명의 GST-π siRNA 는 유리하게는 감소된 miRNA-유사 오프 타겟 효과를 나타냈으며, 이는 시드-의존적 비의도적 오프 타겟 유전자 침묵화이다.
GST-π siRNA (SEQ ID NO:156 및 182), (SEQ ID NO:187 및 199), (SEQ ID NO:189 및 201), (SEQ ID NO:190 및 202), 및 (SEQ ID NO:217 및 232) 에 관해, miRNA 를 모방하는 오프 타겟 활성은 본질적으로 무시해도 좋은 것으로 밝혀졌다. 이들 GST-π siRNA 에 관한 시드-의존적 비의도적 오프 타겟 유전자 침묵화는 가이드 가닥의 온 타겟 (on-target) 활성 보다 적어도 10-배 내지 100-배 더 낮았다.
miRNA-관련된 오프 타겟 효과를 시험하기 위해, 안티센스 가닥의 5' 말단의 전체 시드-함유 영역, 위치 1-8 에는 상보적이나, 나머지 비-시드 영역, 위치 9-21 에는 상보적이지 않은 시드-매칭된 표적 서열의 1 내지 4 개의 리피트 (repeat) 를 루시퍼라아제 mRNA 의 3'UTR 에 대응하는 영역 내로 도입하여, 시드-의존적 비의도적 오프 타겟 효과의 효율을 확인했다. 플라스미드 인서트를 사용하여 miRNA 를 모방하여 시드 영역에서 완벽한 매칭 및 비-시드 영역에서 미스매치 (벌지 (bulge)) 를 갖게 했다.
예를 들어, BU2' 구조를 갖는 siRNA 에 관한 플라스미드 인서트는 다음과 같았다:
PsiCHECK-2 (Fmi1) 플라스미드 인서트:
Figure 112017071726252-pct00019
PsiCHECK-2 (Fmi2) 플라스미드 인서트:
Figure 112017071726252-pct00020
PsiCHECK-2 (Fmi3) 플라스미드 인서트:
Figure 112017071726252-pct00021
PsiCHECK-2 (Fmi4) 플라스미드 인서트:
Figure 112017071726252-pct00022
본원에서 기재된 구현예는 제한적이 아니고, 당업자는 개선된 RNAi 활성을 갖는 핵산 분자를 식별하기 위해 과도한 실험과정 없이 본원에서 기재된 변형예의 특정 조합이 시험될 수 있다는 것을 쉽게 인지할 수 있다.
본원에서 구체적으로 언급된 모든 공보, 특허 및 문헌은 그 전체가 모든 목적을 위해 참고로 편입된다.
본 발명은 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 물질, 및 시약에 제한되지 않으며, 이들은 달라질 수 있다. 또한 본원에서 사용된 용어는 오직 특정한 구현예를 설명하기 위한 것으로 이해될 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것이 의도되지 않는다. 설명의 범위 및 주제에서 벗어나지 않으면서 본원에서 개시된 설명에 다양한 치환 및 수식이 만들어질 수 있고, 이들 구현예는 이러한 설명 및 첨부된 청구항들의 범위 내에 있다는 것이 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
본 명세서에서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", "하나의", 및 "그러한" 은 문맥이 명백히 다르게 언급하지 않으면 복수의 언급 대상을 포함한다는 점에 주의해야 한다. 또한, 용어들 "하나" (또는 "하나의"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나" 는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어들 "포함한다," "포함하는", "함유하는," "포함되여", 및 "갖는" 은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 확장적으로 및 비제한적으로 이해되어야 한다는 점에 또한 주의해야 한다.
본원에서 값의 범위의 언급은, 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 단지 범위 내에 있는 각 별개의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서의 역할을 하는 것으로 의도되고, 각 별개의 값은 마치 그것이 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 편입된다. 마쿠쉬 그룹에 관해, 당업자는 이러한 설명이 개별적인 구성원, 뿐만 아니라 마쿠쉬 그룹의 구성원의 하위기를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
추가의 상세한 설명 없이, 당업자는, 상기 설명에 기반하여, 본 발명을 그것의 최대한의 정도까지 이용할 수 있다고 여겨진다. 하기 특정 구현예는, 따라서, 단지 예시적으로 해석될 것이고, 공개의 나머지를 어떤 식으로든 제한하지 않는다.
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특색은 동일한, 대등한, 또는 유사한 목적에 기여하는 대안적인 특색으로 대체될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> NITTO DENKO CORPORATION <120> RNA INTERFERENCE AGENTS FOR GST-PI GENE MODULATION <130> ND5123385WO <140> PCT/US15/67553 <141> 2015-12-28 <150> JP2014_266198 <151> 2014-12-26 <150> 62/266,664 <151> 2015-12-13 <150> 62/184,239 <151> 2015-06-24 <160> 290 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1 ucccagaacc agggaggcat t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2 cuuuugagac ccugcuguct t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 3 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8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 8 gagacccugc ugucccagat t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 9 gcuggaagga ggagguggut t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 10 cuggaaggag gagguggugt t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 11 ucagggccag agcuggaagt t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 12 ugagacccug cugucccagt t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 13 agggccagag cuggaaggat t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 14 agcuggaagg aggagguggt t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 15 agacccugcu gucccagaat t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 16 gagcuggaag gaggaggugt t 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 17 ugcuguccca gaaccagggt t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 18 cccagaacca gggaggcaat t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 19 ccagaaccag ggaggcaagt t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 20 uuugagaccc ugcuguccct t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 21 gacccugcug ucccagaact t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 22 gaucagggcc agagcuggat t 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 23 agccuuuuga gacccugcut t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 24 gccuuuugag acccugcugt t 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 25 ccuuuugaga cccugcugut t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 26 cgccuuuuga gacccugcat t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 27 ccuacaccgu ggucuauuut t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 28 ugugggagac cagaucucct t 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 29 gcgggaggca gaguuugcct t 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 30 ccuuucucca ggaccaauat t 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 31 acccugcugu cccagaacct t 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 32 ggucuauuuc ccaguucgat t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 33 cccuggugga cauggugaat t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 34 acaucucccu caucuacact t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 35 gcaaggauga cuaugugaat t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 36 ccuucgcuga cuacaaccut t 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 37 cuggcagauc agggccagat t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 38 gacggagacc ucacccugut t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 39 cgggcaagga ugacuaugut t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 40 cuuuugagac ccugcuguat t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 41 gagcuggaag gaggagguat t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 42 acccugcugu cccagaacat t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 43 ugcuguccca gaaccaggat t 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 44 agccuuuuga gacccugcat t 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 45 ccuuuugaga cccugcugat t 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 46 ugaagccuuu ugagacccut t 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 47 acugaagccu uuugagacct t 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 48 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21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 53 ucucccucau cuacaccaat t 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 54 ccucaucuac accaacuaut t 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 55 cccucaucua caccaacuat t 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 56 caacugaagc cuuuugagat t 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 57 aacugaagcc uuuugagact t 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 58 cugaagccuu uugagaccct t 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 59 ucccucaucu acaccaacut t 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 60 gcucccucau cuacaccaat t 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 61 gaagccuuuu gagacccuat t 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 62 acugaagccu uuugagacat t 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 63 cucccucauc uacaccaaat t 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 64 ccucaucuac accaacuaat t 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 65 accaauaaaa uuucuaagat t 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 66 ugccucccug guucugggac a 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 67 gacagcaggg ucucaaaagg c 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 68 cucccugguu cugggacagc a 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 69 ccucccuggu ucugggacag c 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 70 gcagggucuc aaaaggcuuc a 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 71 ugggacagca gggucucaaa a 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 72 ggacagcagg gucucaaaag g 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 73 ucugggacag cagggucuca a 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 74 accaccuccu ccuuccagct c 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 75 caccaccucc uccuuccagc t 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 76 cuuccagcuc uggcccugat c 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 77 cugggacagc agggucucaa a 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 78 uccuuccagc ucuggcccug a 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 79 ccaccuccuc cuuccagcuc t 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 80 uucugggaca gcagggucuc a 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 81 caccuccucc uuccagcuct g 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 82 cccugguucu gggacagcag g 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 83 uugccucccu gguucuggga c 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 84 cuugccuccc ugguucuggg a 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 85 gggacagcag ggucucaaaa g 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 86 guucugggac agcaggguct c 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 87 uccagcucug gcccugauct g 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 88 agcagggucu caaaaggcut c 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 89 cagcaggguc ucaaaaggct t 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 90 acagcagggu cucaaaaggc t 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 91 ugcagggucu caaaaggcgt c 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 92 aaauagacca cgguguaggg c 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 93 ggagaucugg ucucccacaa t 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 94 ggcaaacucu gccucccgct c 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 95 uauugguccu ggagaaagga a 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 96 gguucuggga cagcaggguc t 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 97 ucgaacuggg aaauagacca c 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 98 uucaccaugu ccaccagggc t 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 99 guguagauga gggagaugua t 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 100 uucacauagu cauccuugcc c 21 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 101 agguuguagu 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 114 ugccuucaca uagucaucct t 21 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 115 gugccuucac auagucaucc t 21 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 116 guugguguag augagggaga t 21 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 117 cagggucuca aaaggcuuca g 21 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 126 uagggucuca aaaggcuuca g 21 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 127 ugucucaaaa ggcuucagut g 21 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 128 uuugguguag augagggaga t 21 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 129 uuaguuggug uagaugaggg a 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 130 ucuuagaaau uuuauugguc c 21 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> a, c, t, g, u, unknown or other <400> 131 gaagccuuuu gagacccuan n 21 <210> 132 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 132 gaagccuuuu gagacccuau u 21 <210> 133 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 133 gaagccuuuu gagacccuau u 21 <210> 134 <211> 21 <212> RNA <213> 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Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 138 gaagccuuuu gagacccuau u 21 <210> 139 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 139 gaagccuuuu gagacccuau u 21 <210> 140 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 140 gaagccuuuu gagacccuau u 21 <210> 141 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 141 gaagccuuuu gagacccuau u 21 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 142 gaagccuuuu gagacccuat t 21 <210> 143 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 143 gaagccuuuu gagacccuau u 21 <210> 144 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 144 gaagccuuuu gagacccuau u 21 <210> 145 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 145 gaagccuuuu gagacccuau u 21 <210> 146 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 146 gaagccuuuu 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (5)..(6) <223> 2'-deoxy-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 201 auaguuggug uagaugaggu u 21 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 202 auaguuggug uagaugaggu u 21 <210> 203 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-nucleotide <220> <221> modified_base <222> 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 288 ctcgaggggc aactctacgc aaaacagacc ctgctctacg caaaacagac cctgctgtcc 60 caggcggccg c 71 <210> 289 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 289 ctcgaggggc aactctacgc aaaacagacc ctgctctacg caaaacagac cctgctctac 60 gcaaaacaga ccctgctgtc ccaggcggcc gc 92 <210> 290 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 290 ctcgaggggc aactctacgc aaaacagacc ctgctctacg caaaacagac cctgctctac 60 gcaaaacaga ccctgctcta cgcaaaacag accctgctgt cccaggcggc cgc 113

Claims (70)

  1. 센스 가닥 (sense strand) 및 안티센스 가닥 (antisense strand) 을 포함하는 GST-π 의 발현을 억제하기 위한 핵산 분자로서, 여기에서 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 듀플렉스 영역 (duplex region) 을 형성하고, 안티센스 가닥은 UAGGGUCUCAAAAGGCUUCNN (SEQ ID NO:157) 의 뉴클레오티드 서열을 갖고, 센스 가닥은 GAAGCCUUUUGAGACCCUANN (SEQ ID NO:131) 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 (상기 뉴클레오티드 서열에서, A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭하고, N 은 A, G, C, U, 2'-OMe-치환된 U, 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C, 2'-데옥시-U 또는 2'-데옥시-T 을 지칭함), 핵산 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, 듀플렉스 영역의 뉴클레오티드 중 하나 이상이 수식된 (modified) 또는 화학적으로-수식된 (chemically-modified), 핵산 분자.
  3. 제 2 항에 있어서, 수식된 또는 화학적으로-수식된 뉴클레오티드가 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 치환된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드, 락트 (locked) 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합인, 핵산 분자.
  4. 제 2 항에 있어서, 안티센스 가닥은 데옥시뉴클레오티드를 복수의 위치에 가지며, 복수의 위치는 하기 중 하나인, 핵산 분자:
    안티센스 가닥의 5' 말단으로부터, 위치 4, 6 및 8 의 각각;
    안티센스 가닥의 5' 말단으로부터, 위치 3, 5 및 7 의 각각;
    안티센스 가닥의 5' 말단으로부터, 위치 1, 3, 5 및 7 의 각각;
    안티센스 가닥의 5' 말단으로부터, 위치 3-8 의 각각; 또는
    안티센스 가닥의 5' 말단으로부터, 위치 5-8 의 각각.
  5. 제 4 항에 있어서, 분자가 하나 이상의 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드를 듀플렉스 영역에 갖는, 핵산 분자.
  6. 제 2 항에 있어서, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:182 이고, 센스 가닥은 SEQ ID NO:156 인, 핵산 분자.
  7. 제 2 항에 있어서, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:180 이고, 센스 가닥은 SEQ ID NO:154 인, 핵산 분자.
  8. 제 2 항에 있어서, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:181 이고, 센스 가닥은 SEQ ID NO:155 인, 핵산 분자.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 GST-π mRNA 의 발현을 50 pM 미만의 IC50 으로 억제하는, 핵산 분자.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자의 단일 투여가 GST-π mRNA 의 발현 수준을 생체내에서 적어도 25% 만큼 억제하는, 핵산 분자.
  11. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 패신저 가닥 (passenger strand) 이 적어도 50-배 만큼 감소된 오프 타겟 활성 (off target activity) 을 갖는, 핵산 분자.
  12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, GST-π 발현과 관련되는 질환의 치료를 위한 약학적 조성물로서,
    상기 질환은 악성 종양, 암, 돌연변이된 KRAS 를 발현하는 세포에 의해 야기되는 암, 육종, 또는 암종인, 약학적 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 담체가 지질 분자 또는 리포좀을 포함하는, 약학적 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  15. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 세포.
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