KR102477437B1 - 오토클레이브 멸균 방법을 이용한 광가교 바이오잉크의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
카복시메틸 키토산과 글리시딜 메타크릴레이트의 농도 비율을 조절하여 고온고압멸균 후에도 보관 안정성이 우수한 메타크릴화 카복시메틸 키토산 기반 바이오잉크 조성물 제조방법이 개시된다.
Description
본 발명은 오토클레이브 멸균 방법을 이용한 광가교 바이오잉크의 제조방법에 관한 것이다.
메타크릴화 카복시메틸 키토산(CMCS-MA) 용액은 오토클레이브(고온고압증기) 방법으로 멸균을 진행하면 보관 중 자동가교가 일어나 겔화되는 것으로 알려져 있다.
그러나 CMCS-MA 제조시 사용되는 카복시메틸 키토산(CMCS)와 글리시딜 메타크릴레이트(GMA)의 반응 비율이 오토클레이브 멸균시 자동가교에 영향을 미친다는 것은 알려진 바가 없다.
일 구체예에 따르면, 카복시메틸 키토산과 글리시딜 메타크릴레이트의 혼합 비율을 조절하여 고온고압멸균 후에도 보관 안정성이 우수한 바이오잉크를 제조하는 방법을 제공한다.
일 양상은 카복시메틸 키토산 용액 1%(w/v)에 대해 글리시딜 메타크릴레이트의 농도가 0.0045M 내지 0.015M이 되도록 혼합하여 메타크릴화 카복시메틸 키토산 용액을 제조하는 단계; 상기 메타크릴화 카복시메틸 키토산 용액을 고온고압증기 멸균이 가능한 용기에 충진하는 단계; 및 충진된 용기를 고온고압증기멸균을 진행하는 단계를 포함하는 바이오잉크 조성물 제조방법을 제공한다.
상기 카복시메틸 키토산은 카복실화도가 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다.
상기 카복시메틸 키토산은 1%(w/v) 수용액의 20℃에서의 점도가 5 내지 15 mPa·s, 7 내지 13 mPa·s, 9 내지 11 mPa·s, 또는 10 mPa·s일 수 있다.
상기 카복시메틸 키토산은 탈아세틸화도가 80 내지 95%, 85 내지 95%, 88 내지 95%, 80 내지 92%, 85 내지 92%, 88 내지 92%, 80 내지 90%, 85 내지 90%, 88 내지 90%, 또는 90%일 수 있다.
상기 카복시메틸 키토산의 평균 분자량은 500 내지 50000 Da, 1000 내지 50000 Da, 5000 내지 50000 Da, 10000 내지 50000 Da, 20000 내지 50000 Da, 30000 내지 50000 Da, 1000 내지 50000 Da, 5000 내지 50000 Da, 10000 내지 50000 Da, 20000 내지 50000 Da, 30000 내지 50000 Da, 500 내지 10000 Da, 1000 내지 10000 Da, 5000 내지 10000 Da, 500 내지 5000 Da, 1000 내지 5000 Da, 또는 500 내지 1000 Da일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 메타크릴화 카복시메틸 키토산은 상기 메타크릴화 카복시메틸 키토산은 하기 화학식 1 및 화학식 2의 반복단위를 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 화학식 1에서 R1은 H 또는 카르복시메틸기(-CH2CO2H)이고, 상기 R2 및 R4는 각각 독립적으로 H, 아세틸기, 카르복시메틸기, 및 글리시딜 메타크릴레이트(
)로 이루어진 군에서 선택된 것이고, 상기 R3는 H, 또는 글리시딜 메타크릴레이트이고, 상기 R1 내지 R4는 적어도 하나의 카르복시메틸기와 적어도 하나의 글리시딜 메타크릴레이트기를 포함하며, 상기 n과 m은 0 이상의 정수이며, n + m은 200 내지 20,000이다.
CMCS와 GMA가 반응하면 CMCS-MA가 합성될 수 있다. (하기 반응식 1 참고)
[반응식 1]
CMCS와 GMA는 고리 열림 반응을 진행하는 것일 수 있다. 메타크릴화 카복시메틸 키토산 용액은 혼합 후 교반을 수행할 수 있다. 상기 교반은 예를 들면 40 내지 60℃, 또는 45 내지 55℃로 중탕하면서 400 내지 800rpm, 또는 500 내지 700rpm으로 교반하는 것일 수 있고, 일 실시예에 따르면, 50℃로 중탕하면서 600 rpm으로 교반하는 것일 수 있다.
상기 카복시메틸 키토산 용액의 농도는 0.1%(w/v) 내지 10%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 7%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 5%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 3%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 1%(w/v), 1%(w/v) 내지 10%(w/v), 1%(w/v) 내지 7%(w/v), 1%(w/v) 내지 5%(w/v), 1%(w/v) 내지 3%(w/v), 또는 1%(w/v)일 수 있다.
상기 메타크릴화 카복시메틸 키토산의 메타크릴아마이드기 치환도는 0.2 x 10-4 내지 1.7 x 10-4 mol/g일 수 있다.
상기 제조방법은 메타크릴화 카복시메틸 키토산 용액을 필터링하거나 투석하여 불순물 또는 잔존 GMA를 제거하는 과정을 더 포함할 수 있다.
상기 CMCS-MA 용액은 건조하여 분말화시킬 수 있다. CMCS-MA 분말은 보관 시 변형이 일어나지 않으며, 다시 주사용수에 용해시켜도 물성의 변화가 거의 없어, 보관이 용이한 장점을 가진다.
일 실시예에 따르면, 상기 혼합 용액의 용매는 증류수 또는 주사용수일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 바이오잉크 조성물은 고온고압멸균 후 21일 동안 자동가교가 일어나지 않는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 고온고압멸균은 100 내지 140℃, 110 내지 130℃, 115 내지 125℃, 또는 121℃에서 5 내지 40분, 10 내지 30분, 15 내지 25분, 또는 20분 동안 실시하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 용기는 프리필드 시린지일 수 있다.
상기 제조방법은 고온고압증기멸균을 진행하는 단계 이후에 리보플라빈을 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.
메타크릴화 카복시메틸 키토산과 리보플라빈의 혼합은 리보플라빈 농도가 50 내지 200 μM, 100 내지 200 μM, 50 내지 150 μM, 100 내지 150 μM, 또는 120 μM인 용액과 혼합하는 것일 수 있고, 혼합하는 비율은 부피를 기준으로 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 또는 12:1일 수 있다.
다른 양상은, 상기 바이오잉크 제조방법으로 제조된 메타크릴화 카복시메틸 키토산 기반 바이오잉크를 제공한다.
일 구체예에 따른 제조방법을 이용하면, 고온고압멸균 후에도 보관 안정성이 우수한 메타크릴화 카복시메틸 키토산 기반 바이오잉크를 제조할 수 있다.
도 1은 메타크릴화 카복시메틸 키토산의 1H-NMR 분석 결과가 카복시메틸 키토산과 글리시딜 메타크릴레이트와 혼합 비율에 따라 달라지는 것을 확인한 결과이다.
도 2 및 도 3은 메타크릴화 카복시메틸 키토산의 제조시 글리시딜 메타크릴레이트(GMA)의 비율에 따라 고온고압멸균 후 보관안정성이 달라짐을 확인한 결과이다.
도 4는 고온고압증기 멸균한 CMCS-MA를 21일간 보관 후 점도 변화를 관찰한 것이다.
도 5는 메타크릴화 카복시메틸 키토산의 제조시 글리시딜 메타크릴레이트(GMA)의 비율에 따라 광가교 시간이 변화함을 확인한 결과이다.
도 6은 메타크릴화 카복시메틸 키토산의 제조시 글리시딜 메타크릴레이트(GMA)의 비율에 따라 L-929 세포 증식에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 2 및 도 3은 메타크릴화 카복시메틸 키토산의 제조시 글리시딜 메타크릴레이트(GMA)의 비율에 따라 고온고압멸균 후 보관안정성이 달라짐을 확인한 결과이다.
도 4는 고온고압증기 멸균한 CMCS-MA를 21일간 보관 후 점도 변화를 관찰한 것이다.
도 5는 메타크릴화 카복시메틸 키토산의 제조시 글리시딜 메타크릴레이트(GMA)의 비율에 따라 광가교 시간이 변화함을 확인한 결과이다.
도 6은 메타크릴화 카복시메틸 키토산의 제조시 글리시딜 메타크릴레이트(GMA)의 비율에 따라 L-929 세포 증식에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: CMCS 용액 제조
카복시메틸 키토산(Santa Cruz Biotechnology Inc., USA, deacetylation degree 90%, Carboxylation Degree: ≥80%, Viscosity(1% Carboxymethyl chitosan was dissolved in an aqueous solution at 20 ℃): 10 mPa·s)를 준비하였다.
카복시메틸 키토산(CMCS) 10g과 주사용수 1L를 혼합하고, 차광상태에서 600 rpm으로 4시간 교반하여 1%(w/v) CMCS 용액을 제조하였다. 이물질 및 용해되지 않은 CMCS를 제거하기 위해 0.45 ㎛ 필터로 필터링하였다.
필터링한 1%(w/v) CMCS 용액에 GMA(Glycidyl Methacrylate, ≥97.0%, Sigma aldrich)의 농도가 0.0045M, 0.009M, 0.015M, 0.035M, 또는 0.06M이 되도록 혼합하고, 차광상태에서 50℃(중탕) 및 600 rpm 조건으로 교반하였다. 제조된 5종의 CMCS-MA 용액은 각각 CM-1GMA, CM-2GMA, CM-3GMA, CM-4GMA, CM-5GMA 라고 명명하였다. CMCS와 GMA의 혼합 용액을 교반하면서 pH meter(LAQUA F-72, Horiba, Japan)로 pH를 측정하였으며, pH가 안정화될 때까지 반응하여 CMCS-MA를 제조하였다.
실시예 2: CMCS-MA의 투석 및 동결건조
실시예 1에서 제조된 CMCS-MA에 잔존하는 GMA를 제거하기 위해 접선유동여과시스템(Tangential flow filtration system, PALL, USA, LV centramate)에 여과필터(MWCO: 50kD) 2개를 부착하여 투석을 진행하였다. 투석된 CMCS_MA 용액을 동결건조하여 CMCS-MA를 수득하였다. 수득한 CMCS-MA를 D2O(Deuterium oxide, 151882, sigma aldrich)에 용해하고 1H-NMR 분석을 진행하였다.
도 1에 따르면, CMCS에는 2.07ppm에 shift가 발생하였고 CMCS-MA에서는 2.07ppm 및 1.88ppm에서 shift가 발생하였다. GMA 농도가 상대적으로 낮은 CM-1GMA, CM-2GMA, 및 CM-3GMA에서는 1.88ppm 보다 2.07ppm에서 높은 shift가 나타났다. 그러나 GMA 농도가 상대적으로 높은 CM-4GMA 및 CM-5GMA에서는 2.07ppm 보다 1.88ppm에서 높은 shift가 나타났다. 결론적으로, CMCS와 혼합하는 GMA의 농도가 높을수록 1.88ppm의 shift가 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 3: CMCS-MA용액을 멸균 후 상태 변화
실시예 2에서 수득한 CMCS-MA를 주사용수에 용해하여 7%(w/v) CMCS-MA를 제조하였다. 이후 고온고압증기 멸균이 가능한 프리필드 주사기에 시험물질을 충진 후, 121℃, 20분동안 고온고압증기멸균을 진행하였다. 이후 21일 동안 암실에서 냉동보관 후 시험물질의 상태를 육안으로 확인하였다.
도 2 및 도 3에 따르면, CMCS, CMCS-1GMA 내지 CMCS-3GMA는 21일 보관 후에도 자동가교가 일어나지 않았으나, CMCS-4GMA 및 CMCS-5GMA는 21일 보관 후에 자동가교가 일어났다.
실시예 4: 고온고압멸균한 CMCS-MA의 점도 변화
실시예 2에서 수득한 CMCS-MA를 주사용수에 용해하여 7%(w/v) CMCS-MA를 제조하였다. 이후 고온고압증기 멸균이 가능한 프리필드 주사기에 시험물질을 충진 후 121℃, 20분 동안 고온고압증기 멸균을 진행하였다. 이후 암실에서 냉장보관하면서 1일, 7일, 21일 후 점도 변화를 측정하였다. 점도 변화는 회전형 점도계(DV2T, Brookfield, spindle NO:18, RPM:1, 37℃)로 측정하였다.
도 4에 따르면, CMCS-1GMA, CMCS-2GMA, 및 CMCS-3GMA는 1일차부터 21일차까지 점도가 일정하게 유지되었으나, CMCS-4GMA 및 CMCS-5GMA는 7일차부터 점도가 크게 상승하여 21일차에는 경화가 이루어져 점도 측정이 불가능하였다.
실시예 5: 시험물질과 광개시제를 혼합 후 광가교 실험
CMCS-MA 시험물질과 광개시제를 혼합 후 청광 조사에 의한 광가교 시간 분석을 진행하였다. 시험물질(실시예 1의 CMCS-1GMA 내지 CMCS-5GMA)을 120μM 리보플라빈(Riboflavin 5′-Monophosphate Sodium Salt, sc-296265, santa cruz)과 부피비 9 대 1로 혼합하였다. 이후 24 well plate에 리보플라빈이 혼합된 시험물질을 200μL씩 투입 후 5초부터 60초까지 5초 간격으로 광조사기(Bio resin curing system, FP SQUARED, minimum peak wavelength: 457nm, maximum peak wavelength: 463nm)를 이용하여 청광 조사를 진행하였으며, 매 5초 간격마다 시험물질의 겔 여부를 확인하였다.
도 5에 따르면, GMA의 농도가 높을수록 광가교 시간이 짧아지는 것을 확인하였다.
실시예 6: 시험물질과 광개시제를 혼합 후 세포증식 실험
제조된 시험물질의 생물학적 안정성을 확인하고자 세포증식실험을 진행하였다.
시험물질(실시예 1의 CMCS-1GMA 내지 CMCS-5GMA)을 120μM 리보프라빈과 부피비 9 대 1로 혼합하여 시험물질 CM-1GMA_RF, CM-2GMA_RF, CM-3GMA_RF, CM-4GMA_RF, CM-5GMA_RF를 제조하였으며, 시제품화된 GelMA(GelMA Bioink LAP 0.25%, Cellink, USA)를 대조군으로 하였다.
실험방법은 시험물질에 마우스 지방세포주인 L-929 세포 3×106(cells/100μL)를 투입 후 고루 혼합하고 24well plate에 세포가 혼합된 시험물질을 200μL씩 투입하고 1분간 청광 조사를 진행하여 시험물질을 겔화하였다. (대조군은 UV 램프에서 1분간 조사를 진행하였다.) 이후 FBS(S 101-01 Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, Heat-Inactivated, Welgene, korea)가 포함된 MEM(LM007-60 Minimum Essential Medium Eagle (MEM) (1X), liquid, Welgene, korea) 세포배양 배지 1mL를 시험물질에 투입하고 37℃, 5% CO2 조건에서 1일 그리고 7일간 배양하였다. 분석일이 되었을 때 DPBS(LB 001-04 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid, Welgene, korea)로 배양액을 제거하고 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Japan)이 포함된 MEM을 세포가 혼합된 시험물질에 투입하고 4시간 동안 반응을 진행하였다. 이후 마이크로플레이트분광도계(mobi, Microdigital co., Ltd. Korea)를 이용하여 450nm 파장에서 흡광도를 촬영하였다.
도 6에 따르면, 1일차에는 모든 시험물질이 비슷한 세포 증식을 나타냈다. 7일차에는 CMCS-1GMA 내지 CMCS-3GMA는 대조군 GelMA보다 우수한 세포 증식을 나타냈으며, CMCS-4GMA는 GelMA와 비슷한 세포 증식을 나타냈고, CMCS-5GMA_RF는 다른 시험물질 및 대조군보다 세포 증식이 낮은 것으로 나타났다.
실험결과를 종합하면, 오토클레이브 멸균 후에도 보관 안정성이 우수하며, 신속하게 광가교되고, 세포 증식이 우수한 것은 CMCS-3GMA인 것으로 확인되었다.
Claims (5)
- 카복시메틸 키토산 용액 1%(w/v)에 대해 글리시딜 메타크릴레이트의 농도가 0.009M 내지 0.015M이 되도록 혼합하여 메타크릴화 카복시메틸 키토산을 제조하는 단계;
상기 메타크릴화 카복시메틸 키토산을 고온고압멸균이 가능한 용기에 충진하는 단계; 및
충진된 용기를 고온고압멸균을 진행하는 단계를 포함하는 바이오잉크 조성물 제조방법으로서,
상기 바이오잉크 조성물은 고온고압멸균 후 21일 동안 자동가교가 일어나지 않고,
상기 바이오잉크 조성물을 120 μM 농도의 리보플라빈과 부피비 9 대 1로 혼합한 후 463 nm 파장의 광을 조사했을 때 35초 이내에 겔화되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 메타크릴화 카복시메틸 키토산은 상기 메타크릴화 카복시메틸 키토산은 하기 화학식 1 및 화학식 2의 반복단위를 포함하는,
바이오잉크 조성물 제조방법:
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 화학식 1에서 R1은 H 또는 카르복시메틸기(-CH2CO2H)이고,
상기 R2 및 R4는 각각 독립적으로 H, 아세틸기, 카르복시메틸기, 및 글리시딜 메타크릴레이트()로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 R3는 H, 또는 글리시딜 메타크릴레이트이고,
상기 R1 내지 R4는 적어도 하나의 카르복시메틸기와 적어도 하나의 글리시딜 메타크릴레이트기를 포함하며,
상기 n과 m은 0 이상의 정수이며, n + m은 200 내지 20,000이다. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 고온고압멸균은 100 내지 140℃에서 5 내지 40분 동안 실시하는 것인,
바이오잉크 조성물 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 용기는 프리필드 시린지인,
바이오잉크 조성물 제조방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20250018028A (ko) | 2023-07-28 | 2025-02-04 | 주식회사 매트릭셀바이오 | 생체 반응성 하이드로겔을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 그 제조 방법 |
| KR20250046916A (ko) | 2023-09-27 | 2025-04-03 | 주식회사 매트릭셀바이오 | 다성분 하이드로겔을 포함하는 바이오 잉크 조성물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 3d 바이오 프린팅 방법 |
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| KR960705597A (ko) * | 1994-08-19 | 1996-11-08 | 타다오 구로쯔미 | 프리필드 시린지 의약품의 멸균방법 |
| KR101829136B1 (ko) | 2016-08-11 | 2018-02-13 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 가시광선 광경화 수용성 키토산 유도체, 키토산 하이드로겔 및 이의 제조방법 |
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2022
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