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KR102464243B1 - 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치 및 이를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법 - Google Patents

외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치 및 이를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법 Download PDF

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KR102464243B1 KR1020200039763A KR20200039763A KR102464243B1 KR 102464243 B1 KR102464243 B1 KR 102464243B1 KR 1020200039763 A KR1020200039763 A KR 1020200039763A KR 20200039763 A KR20200039763 A KR 20200039763A KR 102464243 B1 KR102464243 B1 KR 102464243B1
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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커를 검출할 수 있는 측방 유동 분석장치는 외상성 뇌손상 바이오마커를 함유한 혈액 샘플이 주입되는 샘플패드와, 상기 샘플패드로부터 외상성 뇌손상마커가 이동할 때 상기 마커에 혼합되어 외상성 뇌손상 바이오마커 복합체를 형성하는 프로브를 포함하는 흡착패드와, 상기 흡착패드에 유체 연통하며 상기 흡착패드로부터 외상성 뇌손상 바이오마커 복합체를 검출라인까지 모세관 이동시키는 다공성막을 포함하며, 상기 프로브에는 상기 외상성 뇌손상 바이오마커와 특이적으로 결합하는 특이적 결합물질이 표지된 항체로 이루어진 포획항체와, 1 마이크로초 이상의 비교적 긴 방출 수명을 갖는 형광물질이 표지된 항체로 이루어진 검출항체를 포함하며, 상기 특이적 결합물질 또는 형광물질이 표지된 항체에 대하여 적어도 2 이상의 다른 종 유래 항체의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 한다.

Description

외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치 및 이를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법{A traumatic brain injury dectecting appararatus and method}
본 발명은 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치 및 이를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 경도 외상성 뇌손상(mTBI) 마커인 신경교 섬유질 산성 단백질의 혈중 농도가 낮더라도 높은 민감도를 제공할 수 있는 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치 및 이를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법에 관한 것이다.
뇌손상은 세계적으로 높은 발생률을 자랑하고 있고, 통상 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔을 실시한 후 의미가 있는 뇌손상 여부를 판단하는데, 뇌손상 중 특히 경도 외상성 뇌손상(mild traumatic brain injury, mTBI)에 대해서 CT 스캔 상당수가 도움이 되지 않고, 방사선 노출만 클 뿐만 아니라 장소적, 시간적, 비용적 제한이 크다는 문제점이 있다.
최근 간단한 혈액 시험으로 모든 경도 외상성 뇌손상 (mTBI) 환자를 스크리닝하여 불필요한 CT 스캔 횟수를 줄여, 환자를 더욱 신속하게 퇴원시킬 수 있는 현장진단의 필요성이 증가함에 따라 이를 목표로 하는 몇 개의 연구가 보고되었다(Berger 등, 2007; Poli-de-Figueiredo 등, 2006).
그렇지만, 지금까지는 환자를 적절하게 분류할 수 있는 신뢰성이 높은 바이오 어세이는 보고된 바가 없다.
뇌손상 중증도를 판단하기 위해서는 혈액 검체 내 존재하는 미량의 바이오마커를 고민감도로 정확히 측정할 수 있는 바이오 어세이가 필요하고, 또한 응급실과 같은 현장진단에 적용 가능한 방법이어야 한다.
본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 임의의 뇌관련 외상 중증도를 검출 또는/및 분류를 위하여 혈액내 GFAP (glial fibrillary acidic protein, 신경교 섬유질 산성 단백질) 농도를 측방 유동 면역 분석 디바이스를 이용하여 고민감도로 측정할 수 있으며, 진단에 유용하고 신뢰성이 높은 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치 및 이를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치는 외상성 뇌손상 바이오마커를 함유한 혈액 샘플이 주입되는 샘플패드와, 상기 샘플패드로부터 외상성 뇌손상 바이오마커가 이동할 때 상기 마커에 혼합되어 외상성 뇌손상 바이오마커 복합체를 형성하는 프로브를 포함하는 흡착패드와, 상기 흡착패드에 유체 연통하며 상기 흡착패드로부터 외상성 뇌손상 바이오마커 복합체를 검출라인까지 모세관 이동시키는 다공성막을 포함하며, 상기 프로브에는 상기 외상성 뇌손상 바이오마커와 특이적으로 결합하는 특이적 결합물질이 표지된 항체로 이루어진 포획항체와, 1 마이크로초 이상의 비교적 긴 방출 수명을 갖는 형광물질이 표지된 항체로 이루어진 검출항체를 포함하며, 상기 특이적 결합물질 또는 형광물질이 표지된 항체에 대하여 적어도 2 이상의 다른 종 유래 항체의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 임의의 뇌관련 외상 중증도, 특히 경도 외상성 뇌손상을 위한 검출 또는/및 분류를 위하여 혈액내 적어도 GFAP 농도를 측방 유동 면역 분석 디바이스를 이용하여 고민감도로 측정할 수 있으며, 외상성 뇌손상 진단에 유용하고 신뢰성이 높은 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치 및 이를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치의 개략적인 개념도 및 그 분석 원리를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법을 설명하기 위한 플로우차트이다.
도 3은 다양한 GFAP 음성 혈장 샘플에 대하여 마우스 유래 항체를 사용하는 경우와 마우스와 토끼 유래 항체를 같이 사용하는 경우의 비특이 반응 감소를 확인하는 그래프이다.
도 4는 GFAP 음성 혈장 투입시, 마우스 및 토끼 유래 항체 쌍의 조합에 따른 비특이 현상을 나타내는 측방 유동 분석 센서 사진이다.
도 5는 마우스 및 토끼 유래 항체 쌍의 조합에 따른 GFAP 농도별 형광 신호 차이를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 혈장내 GFAP 농도별 형광 신호 차이를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 혈장내 GFAP 농도별 ELISA 테스트 결과를 나타내는 그래프이다.
이제, 본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치 및 이를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법에 대하여 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예는, 본 발명을 설명하기 위해 제공되며, 본 발명을 한정하려는 것이 아니다. 사실상, 당해 기술분야의 통상의 기술자에게는, 본 발명의 사상이나 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 다양한 수정과 변경을 행할 수 있다는 점이 명백할 것이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치(10)는 분석물(외상성 뇌손상 진단용 바이오 마커 포함)을 함유하는 시험 샘플이 주입되는 샘플패드(11)와, 상기 샘플패드(11)로부터 이동하는 분석물에 혼합되어 분석물 복합체를 형성하는 프로브를 포함하는 흡착패드(13)와, 상기 흡착패드(13)에 유체 연통하며 상기 흡착패드(13)로부터 분석물 복합체를 검출라인(20)까지 모세관 이동시키는 다공성막(18)과, 상기 다공성막(18)의 말단에 형성되어 모세관 작용 및 유체 흐름을 촉진시키며, 분석 후 폐기물을 수용하는 흡수패드(19)을 포함하며, 이들은 경질의 지지체로 지지하고 있을 수 있다.
여기서 "프로브"란 분석물에 포함된 외상성 뇌손상 바이오마커, 예컨대 신경교 섬유질 산성단백질(GFAP), 예컨데 S100B, UCH-L1, NSE, NeuN, CNPase, CAM-1, iNOS, MAP-1, MAP-2, SBDP145, SBDP120, III-tubulin, synaptic protein, neuroserpin, internexin, LC3, neurofacin, EAAT, DAT, nestin, cortin-1, CRMP, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-5, VCAM-1, NCAM-1, NCAM-L1, NCAM-120, NCAM-140, NL-CAM, AL-CAM, or C-CAM1 중 어느 하나와 특이적으로 결합하는 항체(3)를 포함한 포획항체(7)와, 항체(3)와 결합된 형광물질(6)을 포함한 검출항체(8)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치(10)에 있어서, 상기 흡착패드(13)는 프로브가 순차적으로 제공되는 제 1 및 제 2 흡착패드(14, 15)를 가질 수 있는데, 상기 제 1 흡착패드(14)는 상기 분석물 복합체를 형성하는 항체(3)와 결합하여 포획항체(7)을 형성하는 특이적 결합물질(2)을 제공할 수 있으며, 상기 제 2 흡착패드(15)는 분석물 복합체에 형광표지를 제공하도록 검출항체(8)을 형성하는 형광물질(6)을 제공할 수 있다.
상기 검출라인(20)상에는 상기 포획항체(7)에 포함된 결합물질(2)에 대해 선택적으로 결합을 할 수 있는 포획물질(5)이 고정화 되어 있다.
외상성 뇌손상 바이오마커는 상기 샘플패드(11)와 흡착패드(13)를 통과하면서 상기 특이적 결합물질(2)이 표지된 포획항체(7)와 상기 형광물질(6)이 표지된 검출항체(8)가 결합되어 특이적 분석물 복합체(20a)를 형성하고, 상기 특이적 분석물 복합체(20a)는 결합물질(2)과 포획물질(5)의 상호작용에 의해 상기 포획물질(5)이 도포된 검출라인(20)에 고정화 된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치(10)에 있어서, 상기 검출라인(20)에는 항원, 합텐, 항체, 단백질 A 또는 G, 아비딘, 스트렙트아비딘, 2차 항체 및 이들의 착물을 포함하는 생물학적 포획물질을 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 생물학적 포획물질은 스트렙트아비딘을 사용하였으며, 상기 프로브의 특이적 결합물질(2)인 비오틴에 대해서 특이적 결합을 할 수 있어서 바람직하다.
상기 포획물질은 상기 특이적 분석물 복합체(20a)에 대한 고정된 결합 자리를 제공하는 역할을 한다. 일부 예에서, 항체, 항원 등과 같은 분석물은 두 개의 결합 자리를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치(10)에 있어서, 상기 흡착 패드(13)는 포획 항체 없이 형광 표지된 항체(검출항체)를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 검출라인(20)에는 외상성 뇌손상 바이오마커 포획 항체를 포획 시약으로 고정화시켜, 외손상 뇌손상 마커-검출 항체 복합체와 반응하게 한다.
상기 분석물 복합체는 상기 검출라인(20)에 이르면 이들 결합 자리는 복합화된 프로브의 특이적 결합물질(2)이 차지한다.
상기 검출라인(20)은 샘플의 흐름에 대해 실질적으로 직각인 방향으로 선의 형태로 배치되는 데, 상기 검출라인(20)은 분석물의 존재를 나타낼 수 있긴 하지만, 상기 검출라인(20)만을 사용해서는 종종 시험 샘플 내의 분석물의 농도를 측정하기가 어렵다. 따라서 상기 다공성 막(18) 상에는 검출라인(20)의 하류 쪽에 위치하는 교정라인(22)을 구비한다.
상기 교정라인(22)에는 상기 다공성 막(18)을 통과하는 임의의 프로브에 대해 결합할 수 있는 포획물질이 제공될 수 있다.
특히, 분석물에 결합하지 않는 임의의 프로브(22a)들이 검출라인(20)을 통과하여 교정라인(22)의 포획물질과 결합되어 고정된다.
상기 교정라인(22)에서 이용되는 포획물질은 상기 검출라인(20)에서 사용되는 포획물질(5)과 상이할 수 있다.
상기 검출라인(20)과 상기 교정라인(22)에서 프로브 형광 신호는 시분해 형광 검사기(50)를 이용하여 측정될 수 있다.
상기 시분해 형광 검사기(50)는 상기 검출라인(20) 및 상기 교정라인(22)에 대해 펄스 여기광을 동시에 조사하도록 구성되고, 상기 검출라인(20) 및 상기 교정라인(22)의 형광물질로부터 방출된 형광신호를 동시에 수신할 수 있다.
상기 시분해 형광 검사기(50)는 광학 필터와 같은 기타 임의의 부품과 연동하는 하나 이상의 펄스화 여기원 및 광검출기를 이용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 형광물질은 1 마이크로초 이상의 긴 방출 수명을 지니는 것으로, 산란광 및 자체형광과 같은 배경 방해가 실질적으로 제거될 있도록 비교적 긴 방출 수명과 큰 스토크스 이동을 모두 갖는 사마륨 (Sm(III)), 디스프로슘 (Dy(III)), 유러퓸 (Eu(III)), 및 테르븀 (Tb(III))의 란탄족 킬레이트를 이용할 수 있다.
따라서 상기 시분해 형광 검사기(50)는 간단하고 비싸지 않은 디자인을 지닐 수 있다. 예를 들어, 발광 다이오드 (LED) 이용하여 형광물질을 여기 시키고, 모노크로미터 또는 좁은 방출띠폭 광학 필터와 같은 고가의 부품을 사용하지 않고 상기 검출라인(20) 및 교정라인(22)의 형광을 검출할 수도 있다.
한편 경도 외상성 뇌손상(mild traumatic brain injusry: mTBI)의 현장진단을 위한 마커 중 하나인 신경교 섬유질 산성 단백질(glial fibraillary acidic protein:GAFP)은 혈중 농도가 매우 낮기 때문에 본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 진단용 측방 유동 분석장치(10)의 민감도를 높이기 위하여, 상기 GAFP와 결합하는 포획/검출 항체 쌍을 달리하여 시분해 형광분석을 수행하였다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법을 설명하기 위한 플로우챠트이다.
[실험예 1]
본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법은 측방 유동 분석법 및 시분해 형광 기술을 사용하여 시료에서 바이오마커인 GFAP를 검출하는 것으로, 경도 외상성 뇌손상(mTBI) 마커를 함유하는 혈액 시료를 준비하는 단계(S10)와,
경도 외상성 뇌손상 바이오마커를 함유하는 혈액 시료를 샘플패드(11)에 주입하는 단계(S20)와,
상기 샘플패드(11)에 인접한 흡착패드(13)를 따라 외상성 뇌손상 바이오마커를 함유하는 혈액 시료를 모세관 현상으로 이동시키면서 특이적 결합물질(2)이 표지된 포획항체(7)와 형광물질(6)이 표지된 검출항체(8)로 이루어진 외상성 뇌손상 바이오마커 복합체(20a)를 형성하는 단계(S30)와
상기 외상성 뇌손상 바이오마커 복합체(20a)를 상기 흡착패드(13)에 유체 연통하는 다공성 막(18)을 따라 이동시켜 상기 다공성 막(18)의 검출라인(20)상의 포획물질(5)과 결합시키는 단계(S40)와,
상기 외상성 뇌손상 바이오마커에 결합하지 않는 임의의 프로브(22b)를 상기 검출라인(20)을 통과시켜 상기 교정라인(22)의 포획물질과 결합시키는 단계(S50)를 포함한다.
상기 시분해 형광 검사기(50)로부터 상기 검출라인(20)과 교정라인(22)에 광을 조사하여 상기 검출라인(20)과 교정라인(22)의 형광신호를 비교하여 외상성 뇌손상 바이오마커 농도를 측정하여 외상성 뇌손상을 진단하는 단계(S60)를 포함할 수 있다.
테스트 시료에서 GFAP의 존재 또는 양을 검출하기 위한 시분해 형광 면역 분석 방법은
i) 검출라인(20)에 근접하여 시분해 형광 검사기(50)를 배치하는 단계로서, 상기 시분해 형광 검사기(50)는 펄스 여기원 및 시간 게이팅된 검출기를 포함하는 단계;
ii) 펄스 여기원으로 검출라인(20)에서 형광물질을 여기시켜 상기 GFAP에 결합된 형광물질이 검출 신호를 방출하게 하는 단계; 및
iii) 시간 게이팅된 검출기로 검출 신호의 세기를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
먼저, 다양한 GFAP-음성 혈장 샘플(GFAP level~0 pg/mL)을 본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 현장진단용 측방 유동 분석장치(10)에 주입한 후 시분해 형광 측정방법을 사용하여 형광세기를 측정하였다.
해당 샘플들을 시중에 판매되는 ELISA KIT (Creative Diagnosctices, USA)를 통해 측정한 결과 모든 샘플에서 버퍼 수준의 매우 작은 광학신호(OD)가 측정됨을 확인하였다.
도 3은 다양한 GFAP음성 혈장 샘플에 대하여 마우스 유래 항체를 사용하는 경우와 마우스와 토끼 유래 항체를 동시 사용하는 경우의 비특이 반응 감소를 확인하는 그래프이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 마우스 유래 항체를 사용하는 경우 특정 GFAP 음성 혈장 샘플에서 비특이 특성을 나타내지만, 마우스와 토끼 유래 항체를 동시에 사용하는 경우 모든 GFAP 음성 혈장 샘플들에 대해서 일정한 형광 세기를 나타내고, 비특이 반응이 감소됨을 확인 할 수 있었다.
따라서 상기 흡착패드(13)에 있어서, 특이적 결합물질(2)은 바이오틴을 사용하며, 상기 형광물질로 유로퓸(Eu)을 사용하였고, 상기 바이오틴과 결합하여 포획항체(7)를 이루는 항체(3)와, 상기 형광물질(6)과 결합하여 검출항체(8)를 이루는 항체(3)를 마우스 유래 항체와 토끼 유래 항체를 동시에 사용하는 것이 일정한 세기를 나타내고 비특이 반응이 감소될 수 있어서 바람직함을 알 수 있다.
이는 상기 토끼 유래 항체만을 적용한 경우 민감도 구현이 어렵지만, 상기 토끼 유래 항체와 마우스 유래 항체를 동시에 사용한 경우, 저농도 구간의 민감도를 확보할 수 있기 때문이다.
상기 외상성 뇌손상 바이오마커로는 GFAP, S100B, UCH-L1, NSE, NeuN, CNPase, CAM-1, iNOS, MAP-1, MAP-2, SBDP145, SBDP120,
Figure 112020034061527-pat00001
III-tubulin, synaptic protein, neuroserpin, a-internexin, LC3, neurofacin, EAAT, DAT, nestin, corin-1, CRMP, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-5, VCAM-1, NCAM-1, NCAM-L1, NCAM-120, NCAM-140, NL-CAM, AL-CAM, 또는 C-CAM1가 사용될 수 있다.
이어서, 항체 유래에 따른 비특이 현상을 도 4 및 도 5를 참조하여 실험하였다
[실험예 2]
항체 유래에 따른 비특이 현상과 민감도를 실험하기 위하여 항체 유래에 따른 측방 유동 센서를 각각 제작하였다. 다양한 GFAP 농도를 갖는 혈장 샘플 준비를 위하여 GFAP 물질은 Hytest 사로부터 구입하고 GFAP 음성 혈장에 연속 희석하였다. 상용 ELISA 키트(Creative Diagnostics, USA)를 이용하여 제작된 GFAP 샘플 농도가 정확함을 확인하였다.
도 4는 GFAP 음성 혈장 투입 시, 마우스 및 토끼 유래 항체의 쌍 조합에 따른 비특이 현상을 나타내는 측방 유동 센서 사진이고, 도 5는 마우스 및 토끼 유래 항체의 쌍 조합에 따른 GFAP 농도별 형광 신호 차이를 나타내는 그래프이다.
여기서, 검출항체(8)와 포획항체(7)의 쌍을 (Det-Cap)으로 표시하며, 마우스 유래 항체를 M, 토끼유래 항체를 R, 마우스 및 토끼 유래 항체의 혼합물을 M+R로 표시 한다.
도 4를 참조하면, 검출항체(8)와 포획항체(7)의 쌍(Det-Cap)에 대하여 각각 토끼 유래 항체만을 사용한 경우(R-R)에 GFAP 음성 혈장에 대해서 비특이 신호가 밴드 형태로 심하게 나타나는 것을 확인 할 수 있다.
도 5 를 참조하면, 마우스 유래 항체와 토끼 유래 항체의 혼합물을 검출항체(8)로 사용하고, 토끼 유래 항체를 포획항체(7)로 사용한 조합이((M+R)-R), 마우스 유래 항체만을 검출항체(8)와 포획항체(7)의 쌍으로 사용한 경우(M-M) 혹은 마우스 유래 항체와 토끼 유래 항체를 각각 검출항체(8)와 포획항체(7)의 쌍으로 사용한 경우(M-R) 보다 GFAP 농도에 따른 형광 신호 크기 차이 및 낮은 농도 (25pg/mL) 에서도 형광 신호 크기가 가장 크다는 것을 확인할 수 있었다.
마우스 유래 항체만을 검출항체(8)와 포획항체(7)의 쌍으로 사용한 경우(M-M) 혹은 마우스와 토끼 유래 항체를 각각 검출항체(8)와 포획항체(7)로 사용한 경우(M-R)를 비교하면, 마우스 유래 항체와 토끼 유래 항체를 각각 검출항체(8)와 포획항체(7) 쌍으로 사용한 경우(M-R)가 형광 신호가 우수함을 확인 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 현장진단용 측방 유동 분석장치(10)에 있어서, 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이, 마우스 유래 항체를 검출항체(8)와 포획항체(7)로 각각 사용할 경우(M-M) 민감도가 낮아져 뇌손상 중증도를 판단하는 GFAP 농도 측정에 있어 한계가 있음을 알 수 있다.
또한, 일반적으로 마우스 유래 항체 보다 항체-항원 반응성이 10-100배 정도 높다고 알려진 토끼 유래 항체를 검출항체(8)와 포획 항체(7)로 각각 사용할 경우 측방 유동 센서 상에서 비특이 밴드를 발생시켜 신호를 왜곡하기 때문에 외상성 뇌손상 바이오마커인 GFAP 농도를 측정하는데 바람직하지 않다는 것을 알 수 있다.
또한, 마우스 유래 항체를 검출항체(8)로, 토끼 유래 항체를 포획항체(7)로 사용하면 비특이 밴드가 발생하지 않으며 마우스 유래 항체 단독으로 사용했을 때보다 민감도가 일부 증가하지만, GFAP 이용 뇌손상 중증도를 판별할 수 있는 수준의 농도를 판별하기에는 부족함을 알 수 있다.
따라서 검출항체(8)에 대하여 마우스 유래 항체와 토끼 유래 항체 혼합물을 사용하고, 포획항체(7)에 대하여 토끼 유래 항체를 사용한 경우((M+R)-R)에 충분한 민감도를 구현할 수 있으므로, 외상성 뇌손상 바이오마커의 농도를 측정하는데 바람직하다는 것을 알 수 있다.
[실험예 3]
이제 도 6a 및 도 6b를 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치를 이용하여 GFAP 측정 민감도를 살펴본다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치를 이용하여 다양한 GFAP 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 6b는 ELISA 방법을 이용하여 도 6a의 GFAP 농도를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치에 있어서, 유로퓸 나노입자가 결합된 토끼 유래 항체의 함량을 비특이 밴드가 생성되지 않을 정도로 흡착 패드 스프레이 용액 중 검출 항체 농도를 0.1% 내지 2% 미만, 바람직하게는 1%로 낮추면, 20~30pg/mL 사이의 저농도 구간의 민감도는 확보되지만 농도에 따른 신호 편차가 발생함을 알 수 있었다.
이에 유로퓸 나노입자가 결합된 마우스 유래 항체를 흡착 패드 스프레이 용액내 농도 3%~12%, 바람직하게는 3%를 첨가하여, 토끼와 마우스 유래 항체를 동시에 적용하면, GFAP 저농도 구간에서의 신호도 확보하고 농도에 따른 신호 편차 역시 개선하였다.
도 6a에 도시된 바와 같이, 뇌손상 중증도를 판단할 수 있는 GFAP 농도인 100pg/mL 미만 수준, 바람직하게는 50pg/mL 미만 수준에서도 민감도를 제공하여 TRF 기반 고감도 외상성 뇌손상 현장진단이 가능한 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치를 제공함을 알 수 있었다.
도 6b를 통해 실험에 사용된 GFAP 샘플 농도가 정확함을 상업적인 ELISA 키트 통해 확인할 수 있었다. 제조 예상 농도와 ELISA 측정농도 값이 편차가 적고, 상관성이 0.99 이상임을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에 따른 외상성 뇌손상 현장진단용 측방 유동 분석장치(10)는 전술한 바와 같이, 외상성 뇌손상 진단을 위하여 저농도 바이오마커 GAFP 농도가 100 pg/mL, 바람직하게는 50pg/mL 대해서도 민감도를 나타내므로 글라스고우 혼수척도(GCS, Glasgow coma scale)(눈뜨기, 언어기능, 운동기능)과 병행하여 진단하는 데 효과적임을 알 수 있다.
11 : 샘플패드 13 : 흡착패드
18 : 다공성막 19 : 흡수패드
50 : 시분해 형광 검사기

Claims (10)

  1. 외상성 뇌손상 바이오마커를 검출할 수 있는 시분해 형광분석 측방유동 분석장치에 있어서,
    외상성 뇌손상 바이오마커를 함유한 혈액 샘플이 주입되는 샘플패드와,
    상기 샘플패드로부터 외상성 뇌손상마커가 이동할 때 상기 마커에 혼합되어 외상성 뇌손상 바이오마커 복합체를 형성하는 프로브를 포함하는 흡착패드와,
    상기 흡착패드에 유체 연통하며 상기 흡착패드로부터 외상성 뇌손상 바이오마커 복합체를 검출라인까지 모세관 이동시키는 다공성막을 포함하며,
    상기 프로브에는 상기 외상성 뇌손상 바이오마커와 특이적으로 결합하는 특이적 결합물질이 표지된 항체로 이루어진 포획항체와, 1 마이크로초 이상의 비교적 긴 방출 수명을 갖는 형광물질이 표지된 항체로 이루어진 검출항체를 포함하며,
    상기 외상성 뇌손상 바이오마커는 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP)이며, 상기 특이적 결합물질은 바이오틴이 사용되며, 상기 형광물질로 유로퓸이 사용되고, 상기 검출항체용 항체로 마우스 유래 항체와 토끼 유래 항체의 혼합물이 사용되는
    외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 흡착패드는 상기 프로브가 순차적으로 제공되는 제 1 및 제 2 흡착패드를 포함하며, 상기 제 1 흡착패드는 상기 포획항체를 형성하는 특이적 결합물질을 제공하며, 상기 제 2 흡착패드는 상기 검출항체를 형성하는 형광물질을 제공하는 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 특이적 결합물질 또는 형광물질이 표지된 항체에 대하여 적어도 2 이상의 다른 종 유래 항체의 혼합물을 사용하는
    외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 유로퓸 입자가 결합되는 항체는 토끼 유래 항체 함량을 흡착 패드 스프레이 용액내 농도 0.1% 내지 2% 미만으로 하는 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 유로퓸 입자가 결합되는 항체에 마우스 유래 항체를 흡착 패드 스프레이 용액내 농도 3% 내지 12%를 첨가하는 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 포획항체로 토끼 유래 항체를 사용하여 외상성 뇌손상 바이오마커 중 하나인 GFAP 에 대하여 100 pg/mL 미만의 민감도로 검출하는 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치.
  9. 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법에 있어서,
    외상성 뇌손상 바이오마커를 함유하는 혈액 시료를 준비하는 단계와,
    외상성 뇌손상 바이오마커를 함유하는 혈액 시료를 샘플패드에 주입하는 단계와,
    상기 샘플패드에 인접한 흡착패드를 따라 외상성 뇌손상 바이오마커를 함유하는 혈액 시료를 모세관 현상으로 이동시키면서 특이적 결합물질과 형광물질이 각각 표지된 포획항체와 검출항체가 결합된 외상성 뇌손상 바이오마커 복합체를 형성하는 단계와
    상기 외상성 뇌손상 바이오마커 복합체를 상기 흡착패드에 유체 연통하는 다공성 막을 따라 상기 다공성 막상의 검출라인상의 포획물질과 결합시키는 단계와,
    상기 외상성 뇌손상 바이오마커에 결합하지 않는 임의의 프로브를 상기 검출라인을 통과시켜 교정라인의 포획물질과 결합시키는 단계와,
    시분해 형광 검사기로부터 상기 검출라인과 상기 교정라인에 광을 조사하여 상기 검출라인과 교정라인의 형광신호를 분석하여 외상성 뇌손상 바이오마커 농도를 측정하는 단계를 포함하는
    외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    글라스고우 혼수척도(GCS, Glasgow coma scale) (눈뜨기, 언어기능, 운동기능)과 병행하여 외상성 뇌손상을 진단하는 단계를 포함하는
    외상성 뇌손상 바이오마커 검출용 시분해 형광분석 측방유동 분석장치를 이용한 외상성 뇌손상 바이오마커 측정방법.
















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