KR102450674B1 - 안과용 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 눈의 여러 병태, 특히 각막의 병태에 사용될 수 있는 안과용 조성물을 포함한다. 또한, 상기 조성물을 이용하는 방법 및 상기 조성물을 포함하는 키트를 포함한다.

Description

안과용 조성물 및 이의 사용 방법

관련 출원

본 출원은 2015년 3월 5일에 출원된 뉴질랜드 특허 가출원 NZ 705727호의 우선권을 주장하며, 그 내용은 이로써 그 전문으로 본원에 포함된다.

본 발명의 분야

본 개시는 눈의 병태의 치료 및/또는 예방에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 각막을 증강하고 재생하고 눈의 굴절 이상을 수정하는데 사용될 수 있는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

이전에는, 분화된 세포는 조기 상태로 회귀하는 능력을 잃어버렸다고 생각하였다. 그러나 상기 견해는 다능성 줄기세포의 유도(세포 리프로그래밍(reprogramming)) 및 분화된 세포가 또 다른 표현형으로 전환될 수 있다는 것을 보여주는 증거에 의해 문제가 제기되어 왔다(Takahashi & Yamanaka 2006; Wernig et al. 2007; Yamanaka & Blau 2010; Gurdon & Melton 2008; Peran et al. 2011). 게다가, 현재는 주변 세포, 세포 외 기질, 및 성장 및 분화 인자를 포함하는 세포의 미세 환경이 세포 분화의 방향을 변경하는데 중요한 역할을 한다고 생각된다(Hakelien and Collas 2002). 상기 정보를 이용하여, 연구자들은 세포 리프로그래밍 및 줄기세포 기술을 이용하는 치료제 개발을 시작하였다.

눈의 각막은 눈의 총 굴절력(초점력)의 2/3 이상을 차지한다. 각막 형상의 작은 변화조차도 망막에 초점을 맞추도록 가져온 영상이 갖는 선명도에 극적인 영향을 줄 수 있다. 각막의 기질 층(눈의 투명한 앞 표면)은 대부분의 각막 조직을 포함하며 대부분 콜라겐 I 및 V형으로 꽉 채워진 콜라겐 원섬유로 구성된 고도로 조직화된 층판으로 구성된다(Marshall et al. 1993). 콜라겐 원섬유의 균일한 배열의 결과로서 기질 층의 고유한 구조는 각막의 인성(toughness) 및 투명성의 특성을 부여한다(Funderburgh 2000).

기질 세포(각막의 각막 기질 세포(keratocyte))를 각막으로부터 꺼내 단층으로 배양할 때, 이들은 섬유아세포의 형태적인 특성을 보이고 성상 세포에서 다핵 방추형 세포로 전환된다(Funderburgh et al. 2001). 통상적으로 관찰되는 각막 기질 세포의 또 다른 표현형은 상처 후 각막에서 발견되는 근섬유 아세포 형태이다(Jester et al. 1987). 외인성 성장 인자 및 사이토카인의 변화는 이들의 표현형 변화를 일으키는 것으로 생각된다(Funderburgh et al. 2001).

TGFβ 패밀리의 성장 인자는 연골 발생(연골) 분화의 가장 강한 유도 인자로 알려져 있다(Heng, Cao, & Lee 2004; Johnstone et al. 1998; Menetrey et al. 2000). TGFβ1은 닭 배아 섬유아세포에 의한 콜라겐 및 피브로넥틴의 합성을 자극한다(Ignotz and Massague 1986). 각막 기질 세포 경우, TGFβ1 및 TGFβ2는, 아마도 각막 기질 세포의 근섬유 아세포 표현형으로의 전환으로 인해, 흉터와 관련된 ECM 침착을 일으킨다고 알려져 있다(Funderburgh, Mann, Funderburgh, Corpuz, & Roth 2001). 반면, TGFβ3은 각막 섬유아세포가 섬유화 또는 흉터 없이 콜라겐 I형으로 구성된 ECM 침착을 생성하도록 유도한다는 것이 밝혀졌다(Karamichos, Hutcheon, & Zieske 2011). 또한, 특정 비-단백질성 화학 화합물, 예를 들어 덱사메타손(Johnstone, Hering, Caplan, Goldberg, & Yoo 1998), 아스코르브산(Farquharson, Berry, Barbara Mawer, Seawright, & Whitehead 1998), 및 에탄올(Kulyk & Hoffman 1996)이 시험관 내에서 연골 발생 분화를 촉진한다고 알려져 있다.

여러 가지 결함, 상처, 질환, 및 퇴행성 병태를 포함하여 각막에 영향을 주는 많은 병태가 존재한다. 근시는 각막의 과도한 곡률로 인해 생겨 눈으로 들어오는 빛이 망막 앞에 초점을 맞추게 된다. 일부 아시아 국가에서 인구의 70 내지 90%, 유럽 및 미국에서 30 내지 40%의 시력에 영향을 주는 세계적으로 가장 일반적인 시력 장애이다(Frederick 2002). 대부분 경우에, 근시는 학령기 아동에서 처음으로 발생하여 대략 20세까지 진행된다. 또한, 성인기에 황반 변성, 망막 박리, 및 녹내장의 유병률 증가와 관련된다(Ebenstein & Pruitt 2006).

근시는 가장 일반적으로는 처방 안경 또는 콘택트렌즈를 사용하여 교정된다. 그러나 이들 장치는 병태의 영구적인 치료를 제공하지 못하고, 어떤 활동 중에는 사용하기 적합하지 않다. 또한, 콘택트렌즈는 안구 감염, 및 각막 찰과상과 궤양을 포함한 더 심각한 병태와 관련된다. 어떤 경우에는, 굴절 교정 수술 또는 각막 굴절 교정술이 근시에 바람직하다. 그럼에도, 이들 치료는 경도 내지 중등도 근시의 단지 일시적인 교정만을 제공한다; 이들은 영구적인 치료가 아니고, 중증일 경우에는 적합하지 않다.

원추각막은 기질 박막화 및 보우만 층으로 알려진 각막의 일부분의 파괴와 관련된 확장성 각막 이상증이다. 각막 기질의 진행성 박막화는 전형적으로 수십 년에 걸쳐 일어나며 결과적으로 각막이 원뿔형으로 발전한다. 이는 결과적으로 불규칙한 난시 및 근시로 인한 시력 장애를 일으킨다. 원추각막의 병인은 아직 알려지지 않았지만 지속적인 눈 비비기 및 콘택트렌즈 착용과 같은 인자와 관련되어 왔다(Krachmer, Feder, & Belin 1984; Sherwin & Brookes 2004). 이는 사춘기와 같이 이른 시기에 나타나서 30 또는 40대까지 진행될 수 있다.

원추각막의 발생 빈도는 성별에 상관없이 전 세계 일반 인구의 2000명 중 대략 1명으로 추정되었다(Rabinowitz 1998). 원추각막은 전형적으로 주요 소득 및 자녀 양육 기간이 계속되는 성인 초기에 시작되기 때문에, 삶의 질의 손실 및 원추각막 치료의 경제적 부담은 중대한 공중 보건 문제를 제기한다. 프랑스에서 각막 이식의 28.8%(Legeais et al. 2001), 미국에서 11.4% 내지 15.4%(Cosar et al. 2002; Dobbins et al. 2000)를 차지한다고 연구자들에 의해 확인된바, 원추각막은 서양에서 각막 이식의 주요 적응증이다. 파시피카 및 마오리 집단에서 불균형적으로 높은 발생 빈도를 보이는 뉴질랜드에서 원추각막의 유병률이 특이하게 높다(Patel et al. 2005; Patel & McGhee 2013). 뉴질랜드에서, 실시된 모든 각막 이식의 대략 50%는 원추각막 때문이다(Edwards et al. 2002).

원추각막에 대해 여러 연구에도 불구하고, 기본 생화학적 과정은 거의 이해되지 않고 있다. 원추각막의 가족 발생 빈도는 병인학적 인자가 유전적이라는 것을 시사한다(Ihalainen 1985). 또한, 병태는 특정 생화학적 및 생체역학적 인자와 연관되어 왔을 수 있다. 예를 들어, 원추각막의 각막 박막화는 세포 외 바탕질(ECM)의 구성요소의 손실의 결과라고 밝혀졌다. 그러나 이는 이들의 파괴, 또는 이들의 결함 형성, 또는 이들의 조합에 기인할 수 있다(Klintworth & Damms 1995; Klintworth 1999; Jhanji et al. 2011). 각막 기질에서, 원추각막과 관련된 변화는 층판 및 각막 기질 세포의 수의 감소(Ku, Niederer, Patel, Sherwin, & McGhee 2008; Sherwin & Brookes 2004), 및 층판의 조직화 및 콜라겐 원섬유 질량의 분포에서의 변화(Meek et al. 2005)를 포함한다.

기질 층의 분해는 이상 단백질 분해 효소 활성에 기인할 수 있다고 생각된다(Fukuchi, Yue, Sugar, & Lam 1994). 원추각막의 각막은 효소 억제제의 수준 감소 및 분해 효소의 수준 증가를 보인다고 알려져 있다(Kenney & Brown 2003). 생체역학적 인자는 자외선 조사 및 역학적 외상에 의해 유발된 산화적 손상으로 인한 각박의 박막화 및 강성(rigidity)의 감소를 포함한다(Kenney & Brown 2003). 원추각막의 각막에 대한 생체역학적 연구는 탄성 및 강성도(stiffness)의 감소를 밝혔다; 그러나 그 원인은 알려지지 않고 있다(Edmund 1988). 콜라겐 교차결합의 감소가 원인이 될 수 있다고 제안되었다(Wollensak & Buddecke 1990). 현재 원추각막에 대한 만족스러운 동물 모델이 존재하지 않으며 연구는 대개 생체 외 환경에 제한되어 왔다.

병태의 중증도에 따라, 원추각막의 진행을 지연시키려는 시도에는 특수 안경 및 콘택트렌즈의 사용이 포함된다. 중증일 경우에, 각막 삽입, 기질 내 고리, 또는 각막 이식이 필수적이다(Jhanji, Sharma, & Vajpayee 2011). 전체 두께의 각막을 제거하고 공여 각막 조직으로 대체하는 수술인 전체 층 각막이식술(Penetrating keratoplasty)은 진행된 사례의 원추각막을 치료하는데 가장 흔히 사용되는 외과적 수술이다(Rabinowitz 1998). 원추각막은 원추각막 환자의 약 12-20%가 각막 이식을 필요로 하는 전 세계 각막 이식 수술의 주요한 적응증이다(Pramanik, Musch, Sutphin, & Farjo 2006).

로즈 K(Rose K) 렌즈로도 알려진 맞춤형 기체 투과성 렌즈와 같은 원추각막을 위한 초기 치료 옵션은 시력을 향상시키는데 주력해 왔다. 신규 치료법은 질환의 진행을 지연시키는 것을 목표로 한다. 각막 콜라겐 교차결합술(CXL: corneal collagen cross-linking)로도 알려진 치료법은 각막의 강성 및 생체역학적 안정성을 증가시키는 것을 고려한다. 이 시술에서는, 상피를 제거하고, 국소 리보플라빈 점적을 투여하고 각막을 370 nm의 자외선-A 광에 대략 30분간 노출한다(Ashwin & McDonnell 2010; G. Wollensak, Spoerl, & Seiler 2003). UV-A 광은 리보플라빈을 활성화함으로써 각막 기질 내 콜라겐 분자 사이의 공유 결합의 형성을 유도하는 반응성 산소 종을 생산한다고 생각된다(Spoerl, Huhle, & Seiler 1998; G. Wollensak et al. 2003). 그러나 상기 절차는 내피세포 손상의 가능성으로 인해 400 μm 미만의 얇은 각막의 치료에는 권장되지 않는다. 상기 치료는 각막의 강성도가 더 커지게 하지만, 각막 박막화의 문제를 다루지 못한다.

그러므로 각막에 영향을 주는 병태를 포함한 눈의 병태를 다루기 위한 치료 조성물 및 방법이 지속적으로 요구된다. 상대적으로 비침습적이고 쉽게 투여되는 요법이 특히 요구된다.

발명의 요약

본 발명자들은 각막 조직에서 콜라겐 발현 및 세포 외 바탕질 형성을 변경하도록 각막을 조절하기 위한 조성물 및 방법을 개발하였다. 본 조성물 및 방법은 각막을 재생 및/또는 증강함으로써 각막의 여러 병태 및 눈의 굴절 이상을 치료 및/또는 예방하는데 유용하다.

한 측면에서, 본 발명은 각막의 박막화 또는 불규칙성과 관련된 병태의 치료 또는 예방 방법으로서, 각막을 TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편, 및 덱사메타손 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함하는 조성물과 접촉함으로써 병태를 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.

여러 가지 측면에서,

TGFβ3 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.

덱사메타손은 덱사메타손 포스페이트이다.

조성물은 10 내지 100 ng/ml의 TGFβ3 폴리펩티드를 포함한다.

조성물은 40 내지 4000 ng/ml의 덱사메타손을 포함한다.

조성물은 점안제로서 제제화된다.

조성물은 젤란 검과 함께 제제화된다.

조성물은 1일 1회 또는 1일 2회 투여된다.

조성물은 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제와 동시 투여된다.

눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제는 마취제, 항염증제, 항균제, 및 윤활제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

조성물은 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리의 사용과 함께 투여된다.

콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물로의 처리 중 및/또는 후에 각막 형상을 성형 또는 유지하기에 적합하다.

콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물을 위한 담체로서 또는 조성물 용리 장치로서 작용하기에 적합하다.

각막 콜라겐 교차결합과 함께 조성물이 투여된다.

조성물의 투여는 교차결합 전 및/또는 후에 이루어진다.

병태는 원추각막, 근시, 및 난시로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 방법은 TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 조성물, 및 덱사메타손 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함하는 조성물의 동시 투여를 포함한다.

또 다른 한 측면에서, 본 발명은 각막의 손상 또는 상처의 치료 또는 예방 방법으로서, 각막을 TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편, 및 덱사메타손 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제와 접촉함으로써 각막의 손상 또는 상처를 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.

여러 측면에서,

TGFβ3 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.

덱사메타손은 덱사메타손 포스페이트이다.

조성물은 10 내지 100 ng/ml의 TGFβ3 폴리펩티드를 포함한다.

조성물은 40 내지 4000 ng/ml의 덱사메타손을 포함한다.

조성물은 점안제로서 제제화된다.

조성물은 젤란 검과 함께 제제화된다.

조성물은 1일 1회 또는 1일 2회 투여된다.

조성물은 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제와 동시 투여된다.

눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제는 마취제, 항염증제, 항균제, 및 윤활제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

조성물은 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리의 사용과 함께 투여된다.

콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물로의 처리 중 및/또는 후에 각막 형상을 성형 또는 유지하기에 적합하다.

콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물을 위한 담체로서 또는 조성물 용리 장치로서 작용하기에 적합하다.

각막의 손상 또는 상처는 찰과상, 열상, 궤양, 화상, 자창, 및 수술 중 하나 이상과 관련된다.

또 다른 측면에서, 방법은 TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 조성물, 및 덱사메타손 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함하는 조성물의 동시 투여를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 눈의 굴절 이상의 치료 또는 예방 방법으로서, 눈을 TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편, 및 덱사메타손 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함하는 조성물과 접촉함으로써 눈의 굴절 이상을 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.

여러 측면에서,

TGFβ3 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.

덱사메타손은 덱사메타손 포스페이트이다.

조성물은 10 내지 100 ng/ml의 TGFβ3 폴리펩티드를 포함한다.

조성물은 40 내지 4000 ng/ml의 덱사메타손을 포함한다.

조성물은 점안제로서 제제화된다.

조성물은 젤란 검과 함께 제제화된다.

조성물은 1일 1회 또는 1일 2회 투여된다.

조성물은 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제와 동시 투여된다.

눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제는 마취제, 항염증제, 항균제, 및 윤활제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

조성물은 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리와 함께 사용하기 위해 투여된다.

콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물로의 처리 중 및/또는 후에 각막 형상을 성형 또는 유지하기에 적합하다.

콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물을 위한 담체로서 또는 조성물 용리 장치로서 작용하기에 적합하다.

방법은 굴절 교정 수술 전에 또는 후에 실시된다.

눈의 굴절 이상은 근시, 원시, 난시, 및 노안 중 하나 이상과 관련된다.

또 다른 측면에서, 방법은 TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 조성물, 및 덱사메타손 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함하는 조성물의 동시 투여를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은

TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편, 및 덱사메타손 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함하는 조성물; 및

하나 이상의 콘택트렌즈

를 포함하는 키트를 포함한다.

여러 측면에서,

콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물로의 처리 중 및/또는 후에 각막 형상을 성형 또는 유지하기에 적합하다.

콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물을 위한 담체로서 또는 조성물 용리 장치로서 작용한다.

TGFβ3 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.

덱사메타손은 덱사메타손 포스페이트이다.

조성물은 10 내지 100 ng/ml의 TGFβ3 폴리펩티드를 포함한다.

조성물은 40 내지 4000 ng/ml의 덱사메타손을 포함한다.

조성물은 점안제로서 제제화된다.

조성물은 젤란 검과 함께 제제화된다.

조성물은 1일 1회 또는 1일 2회 투여용으로 제제화된다.

조성물은 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제와 동시에 제제화된다.

키트는 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제를 포함한다.

눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제는 마취제, 항염증제, 항균제, 및 윤활제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

키트는 콘택트렌즈 용액을 포함한다.

키트는 사용 설명서를 포함한다.

키트는 눈의 굴절 이상의 치료 또는 예방에 사용된다.

키트는 원추각막, 근시, 원시, 난시, 노안, 및 기질 이상증으로 이루어진 군으로부터 선택된 각막 병태의 치료 또는 예방에 사용된다.

키트는 찰과상, 열상, 궤양, 화상, 자창, 각막 융해, 및 수술 상처로 이루어진 군으로부터 선택된 각막 병태의 치료에 사용된다.

또 다른 측면에서, 키트는 별개 구성요소로서 TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 조성물, 및 덱사메타손 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함하는 조성물을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 각막 기질 세포에서 콜라겐 II형 발현의 유도 방법으로서, 각막 기질 세포를 TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편, 및 덱사메타손 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함하는 조성물과 접촉함으로써 각막 기질 세포에서 콜라겐 II형 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.

여러 측면에서,

TGFβ3 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.

덱사메타손은 덱사메타손 포스페이트이다.

조성물은 10 내지 100 ng/ml의 TGFβ3 폴리펩티드를 포함한다.

조성물은 40 내지 4000 ng/ml의 덱사메타손을 포함한다.

조성물은 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리를 통해 투여하기 위해 제제화된다.

조성물은 용액, 겔, 크림, 또는 유탁액으로서 투여하기 위해 제제화된다.

방법은 생체 내에서 실시된다.

방법은 생체 외에서 실시된다.

또 다른 측면에서, 방법은 TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 조성물, 및 덱사메타손 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함하는 조성물의 동시 투여를 포함한다.

상기 간략한 요약은 본 발명의 특정 실시양태의 특징 및 기술적 장점을 광범위하게 기재한다. 추가의 기술적 장점은 뒤따르는 본 발명의 상세한 설명 및 실시예에서 기재될 것이다.

본 발명의 특징이라고 생각되는 신규 특징은 수반되는 도면 및 실시예와 관련하여 고려할 때 본 발명의 상세한 설명으로부터 더 잘 이해될 것이다. 그러나 본원에서 제공되는 도면 및 실시예는 본 발명을 설명하는 것을 돕거나 본 발명의 이해를 넓히는 것을 돕고자 하며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

[도 1A]: 눈으로 들어오는 빛이 망막에 초점을 맞추지 못하게 되는 각막의 곡률의 증가에 의해 유발되는 근시를 나타내는 개략도.
[도 1B]: 각각 정상 각막 (A) 및 원추각막 (B)의 영상. (C): 중증의 원추각막의 샤임플러그(Scheimpflug) 이미지. 중심 각막에서 상당한 각막 박막화가 확인된다.
[도 2]: 기관형(organotypic) 절편 배양 장치.
[도 3]: 성체 수컷 위스타(Wistar) 쥐의 눈에 주입되는 성장 인자 점안제.
[도 4]: 쥐 눈을 영상화하기 위해 특이적으로 설치된 피닉스 마이크론(Phoenix Micron) IV 생체 내 눈 영상화 시스템.
[도 5]: (A): 나노 압자 시스템, (B): 각막 탄성 및 히스테리시스(hysteresis)를 계산하는데 사용되는 압입 과정 중에 얻은 전형적인 하중 변위 곡선의 개략도. P_max = 적용된 최대 하중; h_max = 침투 깊이; h_c = 접촉 깊이(팁(tip)과 시료 사이의 접촉의 높이); h_f = 최종 깊이; S = 무하중 강성도.
[도 6]: 인간 각막 반구피(button) (A) 및 쥐 안구 (B)를 고정하기 위해 고안된 나노 압입 장치. 현미경을 이용하여 각막의 중심 부분에 위치시키고 (C), 일단 위치가 정해지면 압자 프로브를 사용한다 (D).
[도 7]: 연골 발생 분화 배지에 접종된 각막의 각막 기질 세포. TGFβ3 및 덱사메타손을 포함하는 연골 발생 분화 배지에서 3주간 배양된 각막 기질 세포는 구체를 형성하였으며, 이는 (A) 구체의 주변부 주위에 네스틴; (B) 중심부 내에 콜라겐 II형으로 표지되었다. 그 후 배양 배지는 혈청을 포함하는 섬유아세포 증식 배지로 1주간 전환하였으며, 이는 구체로부터 세포가 퍼져 나가 접시를 채우도록 유발하였다 (C). 단층 내 세포는 II형 콜라겐에 대해 음성이지만 세포 클러스터는 콜라겐 II형에 대해 양성을 유지하였다 (D).
[도 8]: 혈청을 포함하는 섬유아세포 증식 배지에 접종된 각막의 각막 기질 세포. 대조군 섬유아세포 증식 배지에서 3주간 배양된 각막 기질 세포는 네스틴 (A), 및 콜라겐 II형 (B)에 대해 음성이었다. 그 후 전면(Confluent) 섬유아세포는 TGFβ3 및 덱사메타손을 포함하는 연골 발생 분화 배지에서 3주간 배양하였다 (C). 세포는 콜라겐 II형에 대해 음성을 유지하였다 (D). (E): 연골 발생 분화 배지에서 전면 섬유아세포의 펠렛 배양물. 배양물에서 3주 후에, 세포 펠렛은 절편으로 만들어 각막 기질 세포 마커 케라토칸에 대해 양성으로 표지되었고 (F), 연골 세포 특이적 II형 콜라겐에 대해 음성이었다 (G).
[도 9]: 대조군 배지에서 2주간 배양된 인간 각막 슬라이스 (A) 및 (D)는 각각 II형 콜라겐에 대해 음성이었고 I형 콜라겐에 대해 양성이었다. 연골 발생 분화 배지에서 1주간, (B) 및 (E), 및 2주간, (C) 및 (F) 배양되고 콜라겐 II형에 대해, (B) 및 (C), 및 I형에 대해, (E) 및 (F), 표지된 인간 각막 슬라이스. 2주간 처리된 각막 슬라이스에서 II형 콜라겐에 대해 강한 표지가 나타났지만 1주만 처리된 슬라이스는 II형 콜라겐에 대해 음성이었다. 연골 발생 분화 배지에서 두 가지 기간에 배양된 슬라이스는 대조군 처리된 슬라이스와 비교할 때 강도가 약하게 표지되긴 하지만, 천연 각막 콜라겐 I형에 대해 양성이었다.
[도 10]: (A) 대조군 배지 및 (B) 연골 발생 분화 배지에서 2주간 배양되고 콜라겐 II형에 대해 표지된 인간 각막 슬라이스. [도 9]에 나타낸 바와 유사한 결과를 얻었다. (C): 미처리된 각막; (D) 및 (E): TGFβ3 및 덱사메타손 처리된 쥐의 각막에서 II형 콜라겐의 광범위한 표지를 보이는 처리된 각막을 보여 주는 생체 내 실험. 각막의 전방(위) 부분에서 더 강한 표지를 보였다 (D). II형 콜라겐은 원섬유성으로 보였으며 ECM의 전체에 걸쳐 고르게 분포되었다.
[도 11]: 대조군 배지, (A), (C) 및 (E), 및 연골 발생 분화 배지, (B), (D) 및 (F)에서 2주간 시험관 내 배양되고 콜라겐 II형에 대해, (A) 및 (B), 및 비멘틴 에 대해, (C)-(F), 각각 표지된 원추각막의 각막 이식편. 정상 인간 각막에서 표지와 비교하여, 처리된 원추각막의 각막에서 II형 콜라겐의 표지 (B)가 더 약했다. 그러나 II형 콜라겐의 침착은 이전에 정상 인간 및 쥐 각막의 시험관 내 및 생체 내 처리 후에 보였던 것과 유사한 양상을 보였다. 원추각막의 이식편 (D) 및 (F)의 처리된 절반에서 섬유아세포 집단은 수가 증가하였으며 각막 기질 세포는 원추각막의 각막 (C) 및 (E)의 미처리된 절반과 비교할 때, 다수의 긴 세포 돌기를 가지며 더 건강하고 완전해 보였다 (F).
[도 12]: 대조군 배지 (A) 및 (C), 및 연골 발생 분화 배지 (B) 및 (D)에서 3주간 배양되고 알파 평활근 액틴(αSMA)에 대해, (A) 및 (B), 및 III형 콜라겐에 대해, (C) 및 (D), 표지된 생체 외 배양된 인간 원추각막의 각막. 연골 발생 분화 배지에서 배양된 각막과 비교할 때 대조군 배지에서 배양된 각막의 기질 층에서 αSMA에 대해 표지가 더 강했다 (A). 두 배지 중 어느 배지에서 배양된 각막도 III형 콜라겐에 대해 양성으로 표지되지 않았다.
[도 13]: 생체 내 처리된 각막의 각막 투명도. 처리 (A) 및 (C), 및 미처리, (B) 및 (D) 각막. 3주 후에 처리 및 미처리된 각막은 서로 구별되지 않았다. 각막의 정면도 (A) 및 (B)는 빛이 쉽게 통과하여 눈의 후부의 혈관이 매우 명확하게 보이는 투명한 각막을 보여준다. 8주에, 각막의 단면의 생체 내 영상화는 빛이 쉽게 통과하는 깨끗하고 투명한 각막을 보여준다. 각막 혼탁 또는 흉터의 징후는 없었다.
[도 14]: 생체 내 처리된 각막에서 콜라겐 II형 (A), 및 콜라겐 I형 (B)의 정량적 유전자 발현. 처리 1주 후에 II형 콜라겐 발현에서 초기 증가가 있었다. 처리 중단 시 II형 콜라겐 발현에서 현저한 감소가 있었다 (A). 천연 각막 콜라겐 I형 발현은 또한 초기에 상승 조절되었지만, 장기간(7주까지) 처리 시 그의 발현은 대조군의 미처리된 각막과 비슷하였다 (B).
[도 15]: 1주 생체 내 처리 및 미처리된 각막의 비교는 경도 (H) 및 감소된 탄성률 (Er)에서 유의한 차이를 보이지 않는다.
[도 16]: 2마리 쥐로부터의 3주간 생체 내 처리 및 미처리된 각막에서 얻은 하중 변형 곡선. 플롯된 값을 갖는 상응하는 그래프는 처리된 각막에서 탄성률 (Er) 및 경도 (H)에서 증가를 명확하게 보여준다.
[도 17]: 8주 처리 및 대조군 인간 원추각막의 각막의 탄성률 및 경도의 비교는 처리된 각막에서 두 매개변수에서 현저한 증가를 보여준다.
[도 18]: 처리 기간에 바라는 각막 형상을 유지하는 단단한 콘택트렌즈와 생체 내 세포 리프로그래밍과 병용하여 양의 눈에서 각막의 재성형.
[도 19]: (A) 피닉스 마이크론 IV 생체 내 눈 영상화 시스템. 영상화 시스템은 각막의 두께, 곡률, 및 투명도의 측정을 가능하게 한다. (B) OCT 부착은 여기서 보여준 영상과 유사하게 전안부의 가시화 및 각막의 두께 및 완전성의 측정을 가능하게 한다. 양에서 생체 외 각막의 생체역학을 측정하는데 사용될 (C) 나노 압자 및 (D) 장치를 나타내는 개략도. 결과는 영(Young)의 탄성률, 및 경도의 기준을 얻도록 분석될 수 있는 하중-변위 곡선으로 나타낸다. 양과 같이 대동물에서, 각막의 두께 (E)는 마이크론으로 나타내고 각막의 곡률 측정값 (F)은 휴대용 펜타캠(Pentacam)®을 이용하여 얻는다. 각막의 곡률 (F) 경우, 넓게 간격이 있는 유색의 윤곽은 곡률의 큰 반지름을 나타내고; 더 좁은 윤곽은 더 가파른 곡률의 영역을 나타낸다. 숫자는 각 지점에서 곡률의 반지름을 나타낸다.
[도 20]: 덱사메타손과 조합된 TGFβ3 만이 콜라겐 II형 침착을 생성한다. 양의 각막 조직을 (A) BMP6, (B) BMP6 + 히드로코르티손, (C) TGFβ3 + 히드로코르티손, (D) BMP6 + 덱사메타손, (E) TGFβ3 + 프레드니손, (F) TGFβ3 + 트리에센스(Triesense®), (G) 및 (H) 각각 20X 및 60X 배율의 TGFβ3 + 덱사메타손에서 배양하였고 연골 특이적 콜라겐 II형에 대해 표지하였다.
[도 21]: TGFβ3과 덱사메타손의 조합에 대해 용량 반응 연구. 양의 각막을 3주간 배양하고 콜라겐 II형에 대해 표지하였다.

하기 설명은 여러 대표적인 형태, 요소 등을 개시한다. 그러나 이러한 설명은 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니라 대표적인 실시양태의 설명으로서 대신 제공된다는 것을 알아야 한다.

정의

본원에서 각 경우에, 본 발명의 설명, 측면, 실시양태, 및 실시예에서, 용어 "포함하는(comprising, including 등)은 제한 없이 포괄적으로 이해되어야 한다. 따라서, 설명 및 청구항 전반에 걸쳐 문맥에 달리 명백하게 요구하지 않는다면, 용어 "포함한다", "포함하는" 등은 독점적인 의미와 반대로 포괄적인 의미, 즉 "포함하나 제한되지 않는" 의미로 해석되어야 한다.

본원에서 사용되는 "증강"은 각막 조직(예를 들어, 기질 층)을 포함하여 각막의 두께, 경도, 탄성률, 인장 강도, 및 규칙성 중 하나 이상을 증가시키는 방법을 언급한다. 증강은 각막의 특정 형상, 즉 각막의 곡률을 부여하는데 이용될 수 있다. 증강 방법은 눈, 또는 각막의 특정 병태가 존재하거나 존재하지 않을 때 실시된다. 증강은 각막의 세포 외 바탕질 내 구성요소(예를 들어, 콜라겐 II형)의 증가를 수반할 수 있다. 또한, 증강은 각막 내 세포(예를 들어, 각막 기질 세포)의 수의 증가를 수반할 수 있다. 세포의 수는 예를 들어 상기 세포의 증식 상태를 휴지에서 활성 상태로 변경함으로써 증가될 수 있다.

"동시 투여" 또는 "동시 투여하는"은 제제, 예를 들어 눈을 위한 치료제의 병용을 언급하고, 통합 제제(co-formulation)(즉, 복합제제(combination formulation))뿐 아니라 분리된 제제의 동시 또는 순차적 투여를 포함한다. 유사하게, "함께"는 치료 조성물과 치료 장치/수술의 병용을 언급한다. 이는 장치/수술의 사용에 앞서, 장치/수술과 동시에, 및/또는 장치/수술의 사용 후에 조성물의 사용을 포함할 수 있다.

각막의 "병태"는 각막의 질환, 결함, 손상, 상처, 변성 또는 기능장애의 상태를 언급한다. 병태는 각막 조직(예를 들어, 기질 층) 또는 각막 세포(예를 들어, 각막 기질 세포)에 영향을 줄 수 있다. 병태는 급성 질환, 예를 들어 찰과상 또는 궤양형성일 수 있거나, 만성 질환, 예를 들어 원추각막 또는 근시일 수 있다.

본원에서 사용되는 "각막"은 홍채, 동공, 및 전안방을 덮는 투명한 앞 부분을 언급한다. 이는 각막 상피, 보우만 층, 각막 기질, 데스메(Descemet's) 막, 및 각막 상피를 포함한다. 각막 기질 세포를 따라 규칙적으로 배열된 콜라겐 원섬유의 세포 외 바탕질을 포함하는 각막의 기질 층(고유질(sugstantia propria)이라고도 불림)이 특히 관심 받고 있다.

화학 유도체와 관련하여 "유도체"는 화학적으로 변형된 화합물을 언급한다. 본 개시는 본원에 기재된 각각의 화학 화합물뿐 아니라 화학적으로 변형된 형태, 예를 들어 염, 수소화물, 에스테르, 및 본래 화합물의 기타 변형을 포함하는 이의 임의의 유도체를 포함한다.

특히 폴리펩티드를 언급할 때, 본원에서 사용되는 "단리된"은 이의 천연 환경으로부터 분리된 분자를 언급한다. 단리된 분자는 생화학, 재조합, 및 합성 기술을 포함한 당 업계에 공지되고 사용되는 임의의 방법 또는 방법의 조합에 의해 얻을 수 있다. 단리된 구성요소를 얻기 위해서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 또는 증식 단계에 의해 제조될 수 있다. 인공적 수단, 즉, 비-천연 수단에 의해 얻은 폴리펩티드 및 펩티드가 특히 관심 받고 있다. 이는 합성 화학, 재조합 기술, 정제 프로토콜 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 천연, 재조합, 또는 합성 공급원으로부터 단리된 폴리펩티드가 포함된다. 또한, 화학 합성에 의해, 또는 세포 또는 무세포 번역 시스템에 도입될 수 있는 플라스미드, 벡터, 또는 기타 발현 구조물에 의해 생산된 폴리펩티드가 포함된다. 상기 폴리펩티드는 인간 개입 없이 이들이 자연에 존재할 때 폴리펩티드와 명백하게 구별된다.

용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"(예를 들어, 서열 번호 1), 및 기타 이러한 용어는, 간단하게, 본원에 기재된 분자를 언급한다. 이러한 용어는 이들 분자의 완전한 특성화를 제공하는 것으로 의도된 것은 아니다. 따라서, 단백질 또는 폴리펩티드는 특정 2차원 구조를 나타내는 특정 아미노산 서열을 갖는 것으로 특성화될 수 있지만, 청구된 실제 분자는 3차원 구조, 특정 결합에 대한 이동성 및 전체로서 분자의 다른 특성을 포함한 다른 특징을 보인다고 이해된다. 이는 본 개시에 의해 포함되는 분자 그 자체 및 전체로서 이의 특성이다. "단백질"과 "폴리펩티드"는 본원에서 호환적으로 사용된다.

TGFβ3 "폴리펩티드"는 임의의 공급원으로부터 얻은 폴리펩티드, 예를 들어 자연에 존재하는 단리된 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드, 및 합성 폴리펩티드를 언급하며, 자연에 존재하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드뿐 아니라 본원에서 상세하게 기재되는 바와 같은 변이 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 상기 서열의 단편을 포함한다. 또한, TGFβ3은 형질전환 성장 인자-베타3, TGFB3, ARVD, 및 FLJ16571로서 본원에서 언급될 수 있다.

아미노산 "서열 동일성"은 둘 이상의 폴리펩티드의 아미노산 대 아미노산 서열 비교를 언급한다. 시험 서열은 기준 서열과 동일할 수 있거나(즉, 100% 동일성 공유), 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 바람직한 측면에서, 아미노산 치환은 기준 아미노산과 비교하여 유사한 화학적 및/또는 물리학적 특성, 예를 들어 전하 또는 소수성을 가질 수 있다. 서열 동일성은 전형적으로 최고의 상동성 영역에서 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다. 서열 정렬 알고리즘, 예를 들어 블라스트(BLAST)® 서열 정렬 프로그램이 당 업계에 잘 알려지고 널리 사용된다. 서열 정렬을 기초로 하여, 퍼센트 동일성은 비교되는 폴리펩티드 서열들 사이에서 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 "굴절 이상"은 눈에 의해 빛의 초점을 맞추는데에 있어 이상을 언급한다. 굴절 이상은 구체 이상 및 원통 이상을 포함할 수 있다. 저위 수차와 고위 수차 둘 다 포함된다. 구체적으로, 근시, 원시, 난시, 부동시, 및 노안으로 나타나는 눈의 병태가 굴절 이상으로서 포함된다.

각막과 관련하여 "재생"은 각막 조직(예를 들어, 기질 층)을 포함한 각막의 형상, 두께, 규칙성, 경도, 탄성률, 및 인장 강도 중 하나 이상의 복원을 언급한다. 재생 방법은 각막, 즉, 각막 곡률에 특정 형상을 부여하는데 이용될 수 있다. 재생 방법은 눈 또는 각막의 특정 병태의 치료에 실시될 수 있다. 재생은 각막의 세포 외 바탕질 내 구성요소(예를 들어, 콜라겐 II형)의 증가를 수반할 수 있다. 또한, 재생은 각막에서 세포(예를 들어, 각막 기질 세포) 수의 증가를 수반할 수 있다. 세포 수는 예를 들어 상기 세포의 증식 상태를 휴지에서 활성 상태로 변경함으로써 증가될 수 있다.

세포의 "리프로그래밍", 예를 들어 각막 세포(예를 들어, 각막 기질 세포)의 리프로그래밍은 분화 상태에서 변화를 언급한다. 리프로그래밍은 세포 형태, 세포 유전자 발현(예를 들어, 콜라겐 I형 및/또는 II형 발현을 포함한 콜라겐 발현), 또는 세포 증식 단계(예를 들어, 휴지 또는 활성)에서 하나 이상의 변화와 관련된다.

용어 "피험체"는 인간 또는 비인간 동물을 언급한다.

"예방"은 병태, 예를 들어 눈의 병태, 특히 각막의 병태, 예를 들어 각막의 장애 또는 기타 결함의 개시의 정지 또는 지연을 언급한다. 예방 조치는 결과적으로 병태의 하나 이상의 증상의 정지 또는 지연, 또는 증상이 일어날 경우 증상의 감소를 가져올 것이다. 각막 병태의 예방은 본원에 상세하게 기재된 바와 같이 각막의 증강을 수반할 수 있다.

"치료"는 병태, 예를 들어 눈의 병태, 특히 각막의 병태, 예를 들어 각막의 장애 또는 기타 결함의 감소, 개선, 또는 해결을 언급한다. 치료는 결과적으로 병태의 하나 이상의 증상의 감소, 개선, 또는 제거를 가져올 것이다. 각막 병태의 치료는 본원에서 설명된 바와 같이 각막의 재생을 수반할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 본원에 상세하게 기재된 바와 같이 여러 병태의 치료, 여러 병태의 예방, 또는 여러 병태의 치료 및 예방 둘 다에 사용될 수 있다.

세포 및 조직 재생

세포 및 조직 재생 기술은 치료법에 상당한 가능성을 갖는다. 본원에 개시된 바와 같이, 발명자들은 각막 조직에서 콜라겐 II형 발현 및 세포 외 바탕질(ECM) 침착에 영향을 주기 위해서 제자리(in situ) 세포 리프로그래밍을 이용하여 세포를 조절하기 위한 조성물 및 방법을 개발하였다. 이는 결국 눈의 각막을 강화 및/또는 증강하는데 사용된다. 본 발명자들은 이로써 각막 기질의 바탕질의 제자리/생체 내 재생 및 증강의 고유한 접근법을 제공한다.

따라서, 개시된 방법은 근시 및 원추각막을 포함한 여러 각막 병태를 위한 생체 내 조직 공학 요법에 이용될 수 있다. 상기에 나타낸 바와 같이, 근시는 각막의 과도한 곡률을 특징으로 하는 반면(도 1A), 원추각막은 각막 박막화의 특징적인 양상을 일으키는 진행성 확장성 각막 이상증이다(도 1B; 문헌(Romero-Jimenez, Santodomingo-Rubido, & Wolffsohn 2010)으로부터 차용된 영상).

각막의 각막 기질 세포는 상대적으로 휴지 상태이고 이들이 섬유아세포 또는 근섬유 아세포 표현형으로 전환될 때 정상적으로 단지 다량의 세포 외 바탕질 (ECM)을 생산한다. 이들 표현형과 관련된 ECM 침착은 대개 각막의 섬유화 및 투명성의 손실을 일으킨다(Kadler, Baldock, Bella, & Boot-Handford 2007). 연골을 구성하는 세포인 연골 세포는 각막에서 발견되는 I형과 유사한 원섬유 콜라겐인 II형 콜라겐을 분비한다. 또한, II형 콜라겐은 병아리 각막의 발생 과정에서 각막 기질 세포에 의해 발현되고 이는 나중에서야 성숙 병아리 기질에서 I형으로 대체된다(Linsenmayer et al. 1990).

이전에, 발명자들은 성인 및 성체 쥐 각막의 기질 세포가 뉴런 계통을 지정하는 성장인자로 처리될 때 뉴런 특이적 단백질을 생산하도록 리프로그래밍될 수 있다는 것을 보였다(Greene et al. 2013). 상기 데이터는 성체 세포군이 시험관 내 및 생체 내 모두에서 성장 인자 환경의 조절에 의해 간단하게 리프로그래밍될 수 있다는 것을 증명해준다.

이제, 본원에서 증명된 바와 같이. 본 발명자들은 각막의 기질 세포를 형질전환 성장 인자 β3(TGFβ3) 및 덱사메타손으로 처리하여 세포들이 연골 특이적 원섬유 콜라겐, 콜라겐 II형을 생산하도록 시험관 내 및 생체 내에서 유도될 수 있다는 것을 보여준다(실시예 8 및 9). 특히, 본 발명자들은 인간 원추각막의 각막 생검 내 각막 기질 세포가 상기 두 화합물로 처리될 때 콜라겐 II형을 발현한다는 것을 증명하였다(실시예 8). 게다가, 동물 실험으로, 본 발명자들은 두 가지 화합물 TGFβ3 및 덱사메타손이 점안제를 이용하여 생체 내로 전달되어 콜라겐 II 침착을 자극할 수 있다는 것을 증명하였다(실시예 9). 특히, 콜라겐 II형의 침착은 균일하여 섬유화 또는 흉터, 및 각막 투명도에 영향 없이 각막의 생체역학을 향상시켰다(실시예 11 및 13).

이론에 얽매이기 바라지 않더라도, 기질 내 세포를 연골 세포 표현형으로 리프로그래밍하여 콜라겐 침착이 유발된다고 추측된다. 연골 세포는 각막에서 발견되는 I형과 유사한 원섬유 콜라겐일 뿐 아니라 병아리 각막의 발생 과정에서도 발현되는 II형 콜라겐을 분비한다고 알려져 있다(Linsenmayer et al. 1990). 이는 나중에서야 성숙한 기질에서 콜라겐 I형으로 대체된다(Linsenmayer et al. 1990).

본원에 기재된 결과에서, TGFβ3 및 덱사메타손으로 각막의 각막 기질 세포를 처리할 때 콜라겐 I형 발현에서 초기 증가가 확인되었다(실시예 12). 그러나 본 발명자들은 콜라겐 I형 침착의 관찰된 수준이 각막을 강성화하고/재성형하기에 불충분하다고 생각한다. 게다가, 콜라겐 II형의 침착이 치료 전략으로서 더 실현 가능할 것으로 생각된다. 콜라겐 II형이 예를 들어 원추각막의 각막에 존재하는 효소에 의한, 효소 분해에 감수성이 낮다는 것이 주목된다.

본 발명자들의 결과에 따라서, 각막의 생체역학적 특성을 향상시키기 위한 효과적인 치료법으로서 신규 ECM 분자를 생산하는데 각막 기질 세포의 리프로그래밍을 이용할 수 있다. 상기 접근법은 상기에 나타낸 바와 같이 각막 효소의 분해에 대한 감수성을 감소시키기 때문에 이로울 것으로 생각된다. 개시된 치료 모듈은 각막을 안정화하는 것뿐만 아니라 여러 각막 병태 및 눈의 굴절 이상을 포함한 눈의 병태를 위한 치료 보조를 제공하는 것을 목표로 한다. 따라서, 본 발명의 방법은, 예를 들어 확장성 각막에서 원추각막의 각질 기질 세포의 치료에 이용될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 방법은 본원에 상세하게 기재된 바와 같이, 근시 및 각막의 여러 기타 병태의 치료에 이용될 수 있다.

눈 및 각막에 영향을 주는 병태

본원에 기재된 조성물은 각막(예를 들어, 기질 층), 및 각막 세포(예를 들어, 각막 기질 세포)를 재생하거나 증강하는데 특별한 용도를 모색한다. 조성물은 각막의 박막화, 약화, 세포 손실, 조직 손실, 기질 손실, 콜라겐 손실, 및/또는 불규칙성을 다루는데 사용될 수 있다. 이런 방식으로, 본원에 기재된 조성물은 각막의 결함, 질환, 손상, 상처, 및/또는 변성뿐 아니라 눈의 굴절 이상을 수반하는 병태를 포함하는 눈에 영향을 주는 여러 병태에 이용될 수 있다.

특정 측면에서, 본 발명은 각막의 결함의 치료 방법을 포함한다. 특정 상황에서, 본 발명의 방법은 또한 각막 결함을 예방하는데 이용될 수 있다. 결함은 각막의 특정 병태와 관련될 수 있다. 대표적인 병태는 본원에서 상세하게 기재되는 원추각막, 및 각막 확장증 예를 들어 공모양 각막, 투명 변연부 변성(pellucid marginal degeneration), 및 후원추각막(예를 들어, 문헌(Arffa 1997; Krachmer et al. 1984; Rabonitz 2004; Jinabhai et al. 2010) 참조)을 포함하는 관련 병태를 포함한다. 특히 근시, 노안, 및 규칙 및 불규칙 난시를 포함한 난시가 또한 결함으로서 포함된다. 또한, 각막의 선천성 결함이 포함된다. 이들 중에는 편평 각막, 및 태아 알코올 증후군과 관련될 수 있는 소각막증, 터너(Turner) 증후군, 엘러스-단로스(Ehlers-Danlos) 증후군, 바일-마르케사니(Weill-Marchesani) 증후군, 와덴부르그(Waardenburg's) 증후군, 낸스-호란(Nance-Horan) 증후군, 및 코르넬리아 드 랑게(Cornelia de Lange's) 증후군이 있다. 또한, 엘러스-단로스증후군 IV형과 관련될 수 있는 공모양 각막(상기에 언급됨)이 포함된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 각막의 손상 또는 변성의 치료 방법을 포함한다. 특정 상황에서, 본 발명의 방법은 각막 손상을 예방하는데 이용될 수 있다. 손상 또는 변성은 각막의 특정 병태와 관련될 수 있다. 특히, 각막 융해, 예를 들어 류마티스 관절염과 같은 염증 질환과 관련된 각막 융해가 포함된다. 기타 대표적인 병태는 각막염, 예를 들어 변연부 각막염, 기질 각막염, 노출 각막염, 신경 영양 각막염, 사상 각막염, 장미증 각막염, 헤르페스 각막염을 포함한 바이러스 각막염, 진균 각막염, 원충 각막염, 및 기타 감염성 각막염, 예를 들어 매독 간질성 각막염, 미포자충 각막염, 타이거슨(Thygeson's) 각막염, 및 감염성 결정성 각막병증을 포함한다. 또한, 류마티스 관절염 베게너(Wegener) 육아육종, 전신성 홍반 루푸스, 재발성 다발 연골염, 및 결절 다발 동맥염과 같은 전신성 질환과 관련된 궤양성 각막염을 포함하는 말초 궤양성 각막염(PUK)로도 불리는 궤양성 각막염이 포함된다. 안구내염도 포함된다. 또한, 만성 각막 부종, 무렌(Mooren's) 궤양, 각막 함요, 소수포증, 테리안(Terrien's) 변성, 잘츠만(Salzman's) 변성, 구상 변성(spheroidal degeneration), 및 푸크스 이영양증(Fuch's dystrophy)이 포함된다. 상기 병태는 당 업계에 잘 알려져 있고 잘 특성화되어 있다. 예를 들어, 문헌(Jackson 2008; Denniston 2009; 및 Willshaw et al. 2000)을 참조한다. 추가적으로, 기질 이상증, 예를 들어, 격자 각막 이상증(예를 들어, 1형 및 2형), 과립 각막 이상증(예를 들어, 1형 및 2형), 황반 각막 이상증, 슈나이더(Schnyder) 각막 이상증, 선천성 기질 각막 이상증, 및 반점 각막 이상증이 포함된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 각막 상처의 치료 방법을 포함한다. 물리적 손상, 화학적 손상, 자외선 손상, 및/또는 특정 의약으로부터의 손상으로 인한 상처가 포함된다. 상처는 각막 찰과상, 각막 미란, 각막 자창, 막 파열, 각막 흉터, 또는 용해성 궤양, 무통 궤양, 및 표면 궤양을 포함한 각막 궤양과 관련될 수 있다. 또한, 외과적 창상, 방사상 각막 절개술 후 각막 손상, 각막이식술 후 급성적인 문제를 포함한 눈 수술과 관련된 상처 및 기타 손상을 포함하며, 이들은 지속적인 상피 결함을 포함한다. 추가적으로, 각막 융해, 예를 들어, 눈의 수술 또는 기타 치료(예를 들어, 국소 NSAID 투여) 후 각막 융해와 관련된 상처가 포함된다. 각막 융해는 감염성, 염증성, 또는 영양적 원인에 기인할 수 있다. 또한, 노화와 관련된 각막의 상처 및 손상이 포함된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 눈의 굴절 이상의 치료 또는 예방 방법을 포함한다. 상기 굴절 이상은 근시, 원시, 노안, 부동시, 고위 수차, 및 여러 난시를 포함하는 특정 병태와 관련될 수 있다. 고위 수차는 코마, 삼엽, 사엽, 구형 수차, 및 수학적 표현(예를 들어, 저니케(Zernike) 다항식)에 의해 확인되는 수차를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

각막의 병태는 자이델(Seidel's) 검사, 스페큘라 마이크로스코프(specular microscope), 각막 형태검사, 아이소메트릭(isometric) 단층촬영, 각막 두께 측정, 초음파, 세극등, 각막 찰과 표본, 및 생검을 포함할 수 있는, 형광 염색을 포함한 여러 방법에 의해 진단될 수 있다. 또한, 진단은 시력 및/또는 혼탁화의 평가를 수반할 수 있다. 각막의 병태는 통증, 눈부심, 이물감, 시력 감소, 부종, 백혈구 침윤, 플루오레세인 흡수, 혈관신생, 충혈, 및 두통, 구역, 및 피로와 같은 전신 증상 중 하나 이상의 증상과 관련될 수 있다. 유사하게, 굴절 이상의 증상은 시력 감소뿐 아니라 흐려 보임, 복시, 눈의 흐릿함, 시력 피로, 이물감, 문제의 눈부심 또는 광륜, 스타버스트(starburst) 양상, 잔상(ghost image), 야간시력 손상, 사시, 과도한 스테어링(excess staring), 과도한 깜박거림, 두통, 눈비빔, 안정 피로(eye strain), 눈 표면 건조, 눈 자극, 충혈, 및 눈의 경련을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

치료 조성물

상기에 나타낸 바와 같이, 본원에 기재된 조성물은 각막 및 눈의 굴절 이상에 영향을 주는 병태를 포함한 눈의 여러 병태의 치료 및/또는 예방에 이용될 수 있다. 조성물은 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제와 함께 TGFβ3 폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다.

여러 측면에서, 조성물은 구성요소(TGFβ3 폴리펩티드(또는 이의 변이체 또는 단편))와 덱사메타손(또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제)의 명시된 조합을 포함하도록 제제화될 수 있거나, 제1 구성요소(TGFβ3 폴리펩티드(또는 이의 변이체 또는 단편) 또는 별법으로 덱사메타손(또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제))을 투여 전에 첨가되는 제2 구성요소와 함께 포함하도록 제제화될 수 있다. 별법으로, 조성물은 제1 구성요소(TGFβ3 폴리펩티드(또는 이의 변이체 또는 단편) 또는 별법으로 덱사메타손(또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제))를 포함하도록 제제화될 수 있고, 이는 제2 구성요소를 포함하는 제제와 동시 또는 순차적인 투여로 사용된다.

한 측면에서, TGFβ3 폴리펩티드는 적어도 하기 아미노산 서열 ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILY YVGRTPKVEQ LSNMVVKSCK CS(서열 번호 1)(젠뱅크(GenBank) 참조번호 CAR70088.1)을 포함할 수 있다. TGFβ3 폴리펩티드는 상기에 나타낸 적어도 112개 아미노산을 포함할 수 있고, 25.5 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 별법으로, TGFβ3 폴리펩티드는 젠뱅크 참조번호 CAA33024.1; 젠뱅크 등록번호 CAA33024; 또는 NCBI 참조 서열 NP_003230.1로 확인되는 전구 폴리펩티드 서열의 아미노산 644-850(207개 아미노산)으로부터 유래할 수 있다.

다른 측면에서, TGFβ3 변이체 또는 단편이 이용될 수 있다. 예를 들어, 변이체 또는 단편은 본원에 기재된 바와 같은 서열 번호 1과 적어도 75% 서열 동일성, 서열 번호 1과 바람직하게는 적어도 80% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 85%, 가장 바람직하게는 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 약 100% 서열 동일성을 나타낼 수 있다. TGFβ3 변이체가 생물학적 활성, 예를 들어, 비변이 폴리펩티드와 비교하여 유사하거나 향상된 활성을 나타내는 경우 특히 관심 받고 있다.

또 다른 측면에서, 특정 단편이 이용될 수 있다. 예를 들어, TGFβ3 단편은 서열 번호 1의 적어도 80개 아미노산, 적어도 85개 아미노산, 더 바람직하게는 서열 번호 1의 적어도 90개 아미노산, 적어도 91개 아미노산, 적어도 92개 아미노산, 적어도 93개 아미노산, 적어도 94개 아미노산, 적어도 95개 아미노산, 적어도 96개 아미노산, 적어도 아미노산 97개 아미노산, 적어도 98개 아미노산, 적어도 99개 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 100개 아미노산, 적어도 101개 아미노산, 적어도 102개 아미노산, 적어도 103개 아미노산, 적어도 104개 아미노산, 적어도 105개 아미노산, 적어도 106개 아미노산, 107개 아미노산, 108개 아미노산, 109개 아미노산, 110개 아미노산, 또는 111개 아미노산을 포함할 수 있다. TGFβ3의 기능적 단편, 예를 들어, 생물학적 활성, 예를 들어, 기준 폴리펩티드와 유사하거나 향상된 활성을 나타내는 단편이 특히 관심 받고 있다.

특정 측면에서, TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편은 재조합 폴리펩티드로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 당 업계에 널리 알려지고 사용되는 세포 또는 무세포 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 이들 중에는, 세균, 진균, 식물, 및 포유동물 발현 시스템이 포함된다. 이. 콜라이(E. coli) 세포, CHO 세포, HEK 세포, 및 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 세포를 이용하는 발현 시스템이 구체적으로 포함된다. TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편은 인간 또는 비인간 발현 시스템에서 발현되는 인간 재조합 폴리펩티드로서 제공될 수 있다. TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편은 공지된 방법에 따라 이황화 결합된 동종이량체, 비글리코실화된 폴리펩티드 사슬로서 제공될 수 있다.

TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편은 잘 알려진 크로마토그래피 기술을 포함한 표준 방법에 의해 재조합 발현 시스템으로부터 단리될 수 있다. TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편은 폴리펩티드의 절단, 단리, 및/또는 위치지정을 용이하게 하는 서열 태그를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라, TGFβ3 폴리펩티드는 여러 판매처로부터 구입할 수 있다. 예를 들어, 재조합 인간 TGFβ3은 R&D 시스템스(R&D Systems)(카탈로그 번호. 243-B3-002; 243-B3-010), 바이오비젼(BioVision, Inc.)(카탈로그 번호. 4344-500; 4344-50; 4344-5), 또는 프로스펙 프로테인 스페셜리스트(Prospec Protein Specialists)(카탈로그 번호. CYT-113; CYT-319)로부터 구입할 수 있다.

TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편의 생물학적 활성은 널리 알려지고 사용되는 방법에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성은 밍크 폐 상피(Mv1Lu) 세포 증식의 억제하는 폴리펩티드 능력에 의해 배양물에서 측정될 수 있다(예를 들어, 문헌(Premaraj et al. 2006) 참조). 상기 측정에 의한 대표적인 활성은 ≤ 50 ng/ml의 ED₅₀으로 나타난다. 별법으로, 생물학적 활성은 생쥐 HT-2 세포(IL-2의 존재하에서 양의 적혈구에 의해 활성화된 BALB/c 비장)의 IL-4 유도된 증식의 용량 의존적 억제에 의해 측정될 수 있다(예를 들어, 문헌(Tsang et al. 1995) 참조). 상기 측정에 의한 대표적인 활성은 전형적으로 0.1 내지 0.5 ng/ml이다. 별법으로, 본원에 기재된 제제의 조합을 포함하는 조성물은 하기에 나타낸 방법을 이용하여 생물학적 활성에 대해 측정될 수 있다. 예를 들어, 각막 기질 세포에서 콜라겐 II형(예를 들어, 콜라겐 II형, 알파 1)의 유도는 면역조직화학적 분석, 단백질 분석, 웨스턴 블롯 분석, 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 분석, 및 정량 PCR 기술 중 하나 이상에 의해 평가될 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이, 조성물은 또한 덱사메타손, 이의 유도체 및/또는 관련 스테로이드 제제를 포함할 수 있다. 덱사메타손은 하기 화학 구조를 갖는 것으로 특성화된다:

덱사메타손의 상호는, 예를 들어, 데카드론(Decadron)®, 덱사손(Dexasone)®, 디오덱스(Diodex)®, 헥사드롤(Hexadrol)®, 맥시덱스(Maxidex)®, 및 미님스(Minims)®를 포함한다.

여러 측면에서, 덱사메타손의 유도체는 이의 임의의 에스테르 및 염을 포함하여 사용될 수 있다. 대표적인 유도체는 덱사메타손-17-아세테이트(CAS RN: 1177-87-3), 덱사메타손 디소듐 포스페이트(CAS RN: 2392-39-4), 덱사메타손 발레레이트(CAS RN: 14899-36-6), 덱사메타손-21-이소니코티네이트(CAS RN: 2265-64-7), 덱사메타손 팔미테이트(CAS RN: 33755-46-3), 덱사메타손 프로피오네이트(CAS RN: 55541-30-5), 덱사메타손 아세퓨레이트(CAS RN: 83880-70-0), 덱사메타손-21-갈락토시드(CAS RN: 92901-23-0), 덱사메타손 21-티오피발레이트, 덱사메타손 21-티오펜타노에이트, 덱사메타손 21-티올-2-메틸-부타노에이트, 덱사메타손 21-티올-3-메틸-부타노에이트, 덱사메타손 21-티오헥사노에이트, 덱사메타손 21-티올-4-메틸-펜타노에이트, 덱사메타손 21-티올-3,3-디메틸-부타노에이트, 덱사메타손 21-티올-2-에틸-부타노에이트, 덱사메타손 21-티오옥타노에이트, 덱사메타손 21-티올-2-에틸-헥사노에이트, 덱사메타손 21-티오노나노에이트, 덱사메타손 21-티오데카노에이트, 덱사메타손 21-p-플루오로티오벤조에이트 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히, 덱사메타손 알코올 및 덱사메타손 소듐 포스페이트가 포함된다. 또한, US 4177268호에 기재된 바와 같이, 덱사메타손 유도체가 포함된다.

조성물은 덱사메타손 대신에 또는 이에 첨가하여 관련 스테로이드 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기타 코르티코이트 스테로이드가 덱사메타손 대신에 또는 이와 함께 이용될 수 있다. 쿠프맨(Coopman) 분류에 따른 C군 스테로이드가 관련 스테로이드로서 사용하기에 바람직하며, 이는 덱사메타손, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 베타메타손, 베타메타손 소듐 포스페이트, 및 플루오코르톨론과 같은 베타메타손-형 스테로이드를 포함한다. 기타 관련 스테로이드 제제는 플루오로메탈론, 로토프렌돌, 메드리손, 프레드니솔론, 프레드니손, 리멕솔론, 히드로코르티손, 로독사미드, 또는 이의 임의의 유도체 또는 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히, 플루오로메탈론 아세테이트, 플루오로메탈론 알코올, 프레드니솔론 아세테이트, 프레드니솔론 소듐 포스페이트, 로토프렌돌 에타보네이트, 히드로코르티손 아세테이트, 및 로독사미드 트로메타민이 포함된다. 본 개시의 임의의 화학물질일 경우, 화학물질은 아세테이트 형태, 및 소듐 포스페이트 형태, 소듐 염 등과 같이 여러 변형된 형태일 수 있다고 이해된다.

조성물은, 예를 들어, 0.04 ng/ml 내지 4 ng/ml; 또는 0.04 ng/ml 내지 0.4 ng/ml; 또는 0.4 ng/ml 내지 4 ng/ml; 또는 4 내지 40 ng/ml; 또는 40 ng/ml 내지 400 ng/ml, 또는 40 ng/ml 내지 4000 ng/ml의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제; 또는 약 0.04 ng/ml, 약 0.08 ng/ml, 약 0.12 ng/ml, 약 0.4 ng/ml, 약 0.8 ng/ml, 약 1.2 ng/ml, 약 4 ng/ml, 약 12 ng/ml, 약 24 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 120 ng/ml, 약 240 ng/ml, 약 400 ng/ml, 약 800　ng/ml, 약 1000 ng/ml, 약 1600 ng/ml, 약 2000 ng/ml, 약 2400 ng/ml, 약 3200 ng/ml, 또는 약 4000 ng/ml의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 조성물은 0.4 μg/ml 내지 40 μg/ml; 또는 0.4 μg/ml 내지 4 μg/ml; 또는 4 μg/ml 내지 40 μg/ml의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제; 또는 약 0.4 μg/ml, 약 0.8 μg/ml, 약 1 μg/ml, 약　1.2　μg/ml, 약 2 μg/ml, 약 4 μg/ml, 약 8 μg/ml, 약 12 μg/ml, 약 20 μg/ml, 또는 약 40 μg/ml의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 조성물은 0.1 mg/ml 내지 1　mg/ml; 또는 0.5 mg/ml 내지 5 mg/ml; 또는 1 mg/ml 내지 10 mg/ml의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제; 또는 약 0.1 mg/ml, 약 0.5 mg/ml, 약 1 mg/ml, 약 2 mg/ml, 약 5 mg/ml, 또는 약 10 mg/ml의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함할 수 있다.

조성물은, 예를 들어, 1 ng/ml 내지 1 μg/ml; 또는 1 ng/ml 내지 10 ng/ml; 또는 10 ng/ml 내지 100 ng/ml; 또는 100 ng/ml 내지 1 μg/ml의 TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편, 또는 약 1 ng/ml, 약 5 ng/ml, 약 10 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 200 ng/ml, 약 500 ng/ml, 약 800 ng/ml, 또는 약 1 μg/ml의 TGFβ3 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 조성물은 적어도 40 ng/ml의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 적어도 4 ng/ml의 TGFβ3 폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 단편과 함께 포함할 수 있다.

또한, 조성물은 하나 이상의 항염증제를 포함할 수 있다. 대표적인 항염증제는, 적어도, 케토티펜 푸마레이트, 디클로페낙 나트륨, 플루비프로펜 나트륨, 케토락 트로메타민, 수프로펜, 셀레콕시브, 나프록센, 로페콕시브, 또는 이의 임의의 유도체 또는 조합을 포함할 수 있다. 특히, 비스테로이드 항염증제(NSAID)가 포함된다. 조성물은 추가적으로 하나 이상의 마취제를 포함할 수 있다. 대표적인 마취제는, 적어도, 국소 마취제, 예를 들어 프로파라카인, 리도카인, 및 테트라카인, 및 이의 임의의 유도체 또는 조합을 포함한다. 눈을 위한 기타 제제는 조성물과 함께 포함하기 위해 선택될 수 있다; 이들은 치료 받는 피험체의 병태 및 요구를 기초로 하여 당 업자에 의해 선택될 수 있다.

본원에 기재된 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 그리고 공지된 방법에 따라서 국소 투여용으로 제제화될 수 있다. 특정 경우에, 안구 내 투여가 바람직할 수 있다. 조성물은 눈에 투여하기에 적합한 임의의 형태로 제공될 수 있다. 대표적인 제제는, 적어도, 적합한 안과 비히클 내에 용액, 현탁액, 유탁액(분산액), 겔, 크림, 또는 연고를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 점안제, 반고체 겔, 또는 스프레이의 형태로 제공될 수 있다. 특정 측면에서, 성형(moulding) 콘택트렌즈 또는 기타 삽입물/이식편은 본 발명의 조성물로 함침될 수 있다. 이러한 방법으로, 조성물은 피험체가 콘택트렌즈를 착용할 때 각막에 연속적으로 지속 방출 방식으로 전달될 수 있다.

눈에 국소 투여 경우, 조성물은 5.0 내지 8.0의 pH 범위로 제제화될 수 있다. 상기 pH 범위는 용액에 완충제를 첨가하여 달성될 수 있다. 제제는 완충액에서 안정한 것이 바람직하다. 즉, 조성물을, 예를 들어 침전 또는 응집에 의해, 불안정하게 할 수 있는 완충제와 활성제 사이의 부정적인 상호작용이 없어야 한다. 조성물은 피험체의 필요(예를 들어, 업무 필요성, 휴식 시간, 수면 등)에 따라 고장성(5% 내지 40%, 바람직하게는 대략 10, 20, 30, 또는 40%) 또는 저장성(0% 내지 5%, 바람직하게는 대략 1, 2, 3, 또는 4%)일 수 있다. 고장성 조성물(예를 들어, 40%)은 본원에서 상세하게 기재된 바와 같이 성형 콘택트렌즈와 병용될 때 사용될 수 있다.

조성물은 선택적인 성분으로 하나 이상의 적합한 방부제를 포함할 수 있다. 적합한 방부제는 오염, 예를 들어 세균 오염을 방지하기 위해서 첨가될 수 있다. 상기 제제는 벤잘코늄 클로라이드, 티머로살, 클로로부탄올, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 페닐에틸 알코올, EDTA, 소르빈산, 오나머(Onamer)® M 및 당 업자에게 공지된 기타 제제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 방부제는 전형적으로 조성물 중량의 0.001% 내지 1.0%의 수준으로 이용될 수 있다.

조성물은 선택적인 보조 용매(co-solvent)를 포함할 수 있다. 본 조성물의 구성요소의 용해도는 조성물 내의 계면활성제 또는 기타 적합한 보조 용매에 의해 상승될 수 있다. 상기 보조 용매/계면활성제는 예를 들어, 폴리소르베이트 20, 60, 및 80, 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 계면활성제(예를 들어, 플루로닉(Pluronic)® F-68, F-84, 및 P-103), 시클로덱스트린, 틸록사폴, 및 당업자에게 공지된 기타 제제, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 상기 보조 용매는 전형적으로 조성물 중량의 0.01% 내지 2%의 수준으로 이용될 수 있다.

침투 촉진제는 조성물의 눈으로의 흡수를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 대표적인 제제는, 적어도, 세틸피리디늄 클로라이드, 라살로시드와 같은 이온투과 담체(ionophore), 벤잘코늄 클로라이드, 파라벤, 트윈(Tween) 20, 사포닌, 브리지(Brij) 35, 브리지 78, 브리지 98, 에틸렌디아민테트라아세트산, 담즙산 염, 및 담즙산(예를 들어 소듐 콜레이트, 소듐 타우로콜레이트, 소듐 글리코데옥시콜레이트, 소듐 타우로데옥시콜레이트, 타우로콜산, 케노데옥시콜산, 및 우르소데옥시콜산), 카프르산, 아존, 푸시딘산, 헥사메틸렌 라우라미드, 사포닌, 헥사메틸렌 옥탄아미드, 및 데실메틸 설폭시드를 포함한다.

또한, 생체결합성 중합체는 눈과 조성물의 접촉을 연장하기 위해서 눈을 덮고 있는 뮤신 외피에 부착하는데 사용될 수 있다. 생체결합성 중합체는 정전기 상호작용을 확립할 수 있는 여러 친수성 작용 기, 예를 들어 카복실-, 히드록실-, 아미드, 및 설페이트를 가진 고분자 히드로콜로이드일 수 있다. 대표적인 제제는, 적어도, 폴리아릴산(예를 들어, 카보폴, 카보필, 및 폴리카보필) 및 카복시메틸 셀룰로스를 포함한다.

또한, 제어 방출 시스템이 사용될 수 있다: 상기 시스템은 제자리 겔, 콜로이드 입자, 나노입자, 및/또는 니오솜을 수반할 수 있다. 기타 약물 전달 시스템은 비침식성 안구 삽입물, 침식성 안구 삽입물, 히드로겔, 콜라겐 보호물, 리포솜, 약물 탑재된 막(예를 들어, NOD®), 및 이온이동법(ionophoresis)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

조성물은 또한 점도를 증가시키는 선택적인 제제를 포함할 수 있다. 단일 수용액의 점도보다 높게 증가된 점도는 활성 화합물의 안구 흡수를 증가시키고, 제제를 분산시키는데 있어 가변성을 감소시키고, 제제의 현탁액 또는 유탁액의 구성성분의 물리적 분리를 감소시키고/거나 그 외 안과 제제를 개선하는데 바람직할 수 있다. 상기 점도 증진제는 예로서 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로오스, 히드록시 프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카복시메틸 셀룰로오스, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 당 업자에게 공지된 기타 제제, 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 제제는 전형적으로 조성물 중량의 0.01% 내지 2%의 수준으로 이용될 수 있다.

특정 측면에서, 조성물은 겔화제, 예를 들어, 고분자량 수용성 다당류, 예를 들어 젤란 검을 포함한다. 젤란 검은 예를 들어 상품명 켈코겔(Kelcogel®)로 판매되는 것과 같이 여러 판매처로부터 구입할 수 있다. 특히, 켈코겔® LT100은 부드럽고 탄력적이며 비취성의 겔을 형성하는 미세 메쉬의 하이 아실 젤란(high acyl gellan)으로서 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 젤란 검 기반 조성물은 0.5% 점안제로서 제제화된다.

조성물을 더 안정화하거나 그 외 강화하기 위해서 기타 제제가 사용될 수 있다. 예를 들어, EDTA, 염화나트륨, 틸록사폴, 황산나트륨, 및/또는 히드록시에틸셀룰로오스 중 하나 이상은 조성물을 더 안정화시키는 추가적으로 유익한 효과를 가질 수 있다.

치료 방법

상기에 나타낸 바와 같이, 각막(예를 들어, 기질 층), 및 각막 세포(예를 들어, 각막 기질 세포)를 재생하거나 증강하는데 특별한 용도를 모색한다. 특히, 조성물은 각막의 향상된 성형(shaping), 두께, 규칙성, 경도, 탄성률, 인장 강도, 또는 기능성(예를 들어, 굴절)을 제공하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 조성물은 각막의 여러 병태를 다루고 눈의 굴절 이상을 교정하는데 사용될 수 있고, 다른 눈 치료법과 함께 보조 요법으로 이용될 수 있다.

앞서 나타낸 바와 같이, 조성물은 눈에 투여를 위해 임의의 적합한 수단으로 제제화될 수 있다. 제제로서 안과 용액, 크림, 유탁액, 연고, 및 겔이 포함된다. 점안제로서 제조된 제제가 특히 잘 알려져 있다. 특정 측면에서, 조성물은 시판중인 여러 유형의 점안제 분배기 중 어느 하나를 이용하여 점안제로서 투여될 수 있다. 예로서, 본 발명의 조성물의 위한 용기는 투명, 반투명 및 불투명할 수 있고 기타 특성 또는 특성들의 조합, 예를 들어, 글라스 라이닝된 것, 밀봉된 것, 단일 또는 소수 용량의 분액으로 포장된 것, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

조성물은 바라는 의료 결과를 달성하기 위해서 피험체에게 치료 유효량으로 투여될 수 있다. 특히, 조성물은 본원에 기재된 안과 병태를 다루거나, 상기 병태의 하나 이상의 증상을 완화시키기는 양으로 투여될 수 있다. 조성물의 정확한 투여(즉, 양 및 일정)는 제시된 피험체 및 병태를 기준으로 하여 임상의에 의해 결정될 수 있다. 대표적인 제제(예를 들어, 점안제)는 하루에 1 내지 24회, 또는 하루에 1 내지 12회, 또는 하루에 1 내지 6회, 또는 하루에 1 내지 4회, 또는 하루에 1 내지 3회, 또는 하루에 1 내지 2회, 또는 하루에 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 18, 또는 24회 투여될 수 있다. 조성물은 치료될 각 눈에 한 방울을 넣어 점적제로서 국소 적용될 수 있다. 별법으로, 2 내지 3방울이 각 눈에 적용될 수 있다.

기재된 조성물 경우, 투여량 범위는 예를 들어, 1회 투여당 눈마다 0.2　pg 내지 2.4 ng; 또는 2 pg 내지 2.4 ng의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제; 또는 약 0.2 pg, 약 0.4 pg, 약 0.6 pg, 약 0.8 pg, 약 1.2 pg, 약 2.4 pg, 약 2 pg, 약 4 pg, 약 6 pg, 약 8 pg, 약 12 pg, 약 18 pg, 약 24 pg, 약 0.2 ng, 약 0.26 ng, 약 0.4 ng, 약 0.6 ng, 약 0.8 ng, 약 1.2 ng, 약 1.8 ng, 또는 약 2.4 ng의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제일 수 있다.

기타 예로서, 투여량 범위는 1회 투여당 눈마다 12 ng 내지 1.3 μg; 또는 6 ng 내지 600　ng의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제; 또는 약 6 ng, 약 8 ng, 약 12 ng, 약 16 ng, 약 18 ng, 약 24 ng, 약 26 ng, 약 30　ng, 약 36 ng, 약 40 ng, 약 48 ng, 약 52 ng, 약 54 ng, 약 60 ng, 약 72 ng, 약 78 ng, 약 80 ng, 약 90 ng, 약 120 ng, 약 130 ng, 약 160　ng, 약 180 ng, 약 240 ng, 약 260 ng, 약 300 ng, 약 360 ng, 약 400 ng, 약 480 ng, 약 520 ng, 약 540 ng, 약 600 ng, 약 720 ng, 약 780 ng, 약 900 ng, 약 1.2 μg, 약 1.3 μg의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제일 수 있다.

또 다른 예로서, 투여량 범위는 1회 투여당 눈마다 1.5 μg 내지 150 μg; 2.6 μg 내지 260 μg; 또는 6.5　μg 내지 650　μg의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제; 또는 약 1.5　μg, 약 2 μg, 약 3 μg, 약 4.5 μg, 약 6 μg, 약 6.5 μg, 약 7.5　μg, 약 10 μg, 약 15 μg, 약 22.5 μg, 약 32.5 μg, 약 20 μg, 약 26 μg, 약　30　μg, 약 40 μg, 약 45 μg, 약 60 μg, 약 65 μg, 약 75 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg, 약 120 μg, 약 130 μg, 약 150 μg, 약 180 μg, 약 225 μg, 약 240 μg, 약 260 μg, 약 200 μg, 약 300 μg, 약 325 μg, 약 450 μg, 약 600 μg, 또는 약 650 μg 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제일 수 있다. 덱사메타손의 특정 제제는 구입 가능하다는 것과 이는 허용되는 투여량 및 일정에 따라 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

상기에 언급된 덱사메타손의 임의의 투여량은 투여당 눈마다 예를 들어, 5 pg 내지 65 ng; 또는 0.5 ng 내지 65 ng의 투여량 범위의 TGFβ3 폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 단편; 또는 약 5 pg, 약 10 pg, 약 15 pg, 약 20 pg, 약 30 pg, 약 45 pg, 약 60 pg, 약 0.05 ng, 약 0.1 ng, 약 0.15 ng, 약 0.2 ng, 약 0.3 ng, 약 0.45 ng, 약 0.5 ng, 약 0.6 ng, 약 0.65 ng, 약 1 ng, 약 1.5 ng, 약 2 ng, 약 3 ng, 약 4 ng, 약 4.5 ng, 약 6 ng, 약 6.5 ng, 약 7.5 ng, 약 9 ng, 약 10 ng, 약 12 ng, 약 13　ng, 약 15　ng, 약 16 ng, 약 20 ng, 약 22.5 ng, 약 24 ng, 약 30 ng, 약 32.5　ng, 약 36 ng, 약 40 ng, 약 45 ng, 약 48 ng, 약 50 ng, 약 52 ng, 약 60 ng, 또는 약 65 ng의 TGFβ3 폴리펩티드, 또는 이의 변이체와 함께 동시 투여될 수 있다.

한쪽 눈의 투여량은 대략 한 방울의 개시된 조성물이다. 조성물의 한 방울은 10 ㎕ 내지 200 ㎕, 20 ㎕ 내지 120 ㎕, 또는 50 ㎕ 내지 80 ㎕ 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있다. 예를 들어, 페펫과 같은 분배기는 1 ㎕ 내지 300 ㎕ 및 그 사이의 임의의 값의 방울을 분배할 수 있다. 바람직하게는, 분배기는 개시된 조성물의 방울당 약 15 ㎕, 약 20 ㎕, 약 30 ㎕, 약 45 ㎕, 약 60 ㎕ ,또는 약 65 ㎕를 분배한다.

조성물이 콘택트렌즈 또는 또 다른 삽입/이식 장치를 통해 투여되는 경우, 콘택트렌즈 또는 삽입물/이식편은, 예를 들어, 0.01　mg 내지 10 mg의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제; 또는 약 0.01 mg, 약 0.1 mg, 약 0.5 mg, 약 0.7 mg, 약 1 mg, 약 5 mg, 또는 약 10 mg의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함할 수 있다. 별법으로, 콘택트렌즈 또는 삽입물/이식편은 10 ng 내지 100 ng의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제; 또는 약 1 ng, 약 5　ng, 약 10 ng, 약 20 ng, 약 50 ng, 약 80 ng, 또는 약 100 ng의 덱사메타손, 또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 콘택트렌즈 또는 삽입물/이식편은 약 10 ng 내지 1 μg의 TGFβ3 폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 단편; 또는 약 10 ng, 약 50 ng, 약 100 ng, 약 200 ng, 약 500 ng, 약 800 ng, 또는 약 1 μg의 TGFβ3 폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 조성물은 여러 외과적 수술 또는 기타 치료법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 눈의 굴절 교정을 위한 외과적 및 비외과적 방법과 함께 사용될 수 있다. 대표적인 방법은 미니 비대칭 방사상 각막 절개술(MARK)을 포함한 방사상 각막 절개술(RK), 육각형 각막 절개술(HK), 굴절 교정 레이저 각막 절개술(PRK), 각막 절삭 성형술, 라식(LASIK), 예를 들어, 인트라라식(intraLASIK)®, 라섹(LASEK), 예를 들어, 에피-라섹(Epi-LASEK), 자동 표층 각막 이식술(ALK), 레이저 온열 각막 성형술(LTK), 전도성 각막 성형술(CK), 각막 윤부 완화 절개술(LRI), 난시 각막 절개술(AK), 상층 각막 렌즈 이식술, 전방 섬모 공막 절개술(ACS), 공막 강화 수술, 노안 회복술, 노안 레이저 회복술(LRP), 각막 내 링 삽입술(ICR), 각막 기질 내 고리 삽입술(예를 들어, 인탁스(INTACTS)®), 안 내 렌즈 삽입술, 공막 확장 밴드(SEB), 및 캄라(Kamra)® 인레이(inlay)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 각막 열성형술, 각막 굴절 교정술, 효소 각막 굴절 교정술, 및 화학적 각막 굴절 교정술이 포함된다.

조성물은 비굴절 병태의 수술적 교정, 예를 들어 각막 열상의 수술적 교정과 함께 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 본원에 기재된 조성물은 각막에 실시되는 특정 수술 방법과 함께 사용될 수 있다. 대표적인 방법은 각막 이식 수술, 전체 층 각막 이식술(PK), 치료 레이저 각막 절제술(PTK), 익상편 절제, 각막 타투, 인공 각막 삽입(예를 들어, K프로(KPro) 또는 돌만-도안(Dohlman-Doane)), 및 치아-인공 각막 삽입(OOKP)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

각막 콜라겐 교차결합과 함께 조성물이 사용될 수 있다. 각막 교차결합은 전형적으로 UV-A 광 노출에 의해 활성화되는 리보플라빈 용액의 사용을 수반한다. 잘알려진 교차결합 방법은 제거된 상피와 각막 교차결합(드레스덴(Dresden) 프로토콜, 또는 에피-오프(epi-off)), 경상피 교차결합(에피-온(epi-on)), 및 가속 교차결합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 교차결합 절차는 일반적으로 이용 가능하고 그 중에서도 CXL, C3-R® CCL® 및 KXL® 각막 교차결합으로 판매된다. 조성물의 투여는 교차결합 절차 전, 및/또는 후에 이루어질 수 있다. 개시된 조성물이 교차결합 절차의 해로운 효과, 예를 들어 기질 혼탁 및 세포 손실(하기에 더 상세하게 기재됨)을 방지하거나 대응하기 위해 사용될 수 있다는 것이 제안되고 있다. 게다가, 개시된 조성물로 각막 재생은 이전에 상기 절차에 부적격한 피험체, 예를 들어, 각막 두께가 400 μm 미만인 피험체에게 교차결합이 실시되도록 허용할 수 있다. 게다가, 개시된 조성물은 그 자신 위에 교차결합을 이용하여 다루어지지 않는 진행성 각막 박막화를 지연 또는 정지시키는데 사용될 수 있다.

본원에 기재된 조성물은 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제와 동시 투여될 수 있다. 여러 측면에서, 동시 투여는 상기 제제와 동시에 또는 다음에 투여되거나, 상기 제제와 통합제제로서 투여될 수 있다. 치료 또는 예방되는 병태에 따라, 본원에 기재된 조성물은 항히스타민, 교감 신경 흥분제, 베타 수용체 차단제, 부교감 신경 흥분제, 부교감 신경 억제제, 프로스타글란딘, 영양제, 혈관수축제, 윤활제, 항균제, 및 마취제를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 제제와 동시 투여될 수 있다. 특히, 비스테로이드 항염증제(NSAID)를 포함한 여러 항염증제가 포함된다. 조성물은 또한 눈 윤활액 및 눈물 대체액과 동시 투여될 수 있다.

마취제의 비제한적인 예는, 벤조카인, 부피바카인, 코카인, 에티도카인, 리도카인, 메피바카인, 프라목신, 프릴로카인, 클로로프로카인, 프로카인, 프로파라카인, 로피카인, 및 테트라카인을 포함한다. 항염증제의 비제한적인 예는 아스피린, 아세트아미노펜, 인도메타신, 설파살라진, 올살라진, 살리실산나트륨, 콜린 마그네슘 트리살리실레이트, 살살레이트, 디플루니살, 살리실살리실산, 설린닥, 에토돌락, 톨메틴, 디클로페낙, 케토롤락, 이부프로펜, 나프록센, 플루비프로펜, 케토프로펜, 페노프로펜, 수프로펜, 옥사프록신, 메페남산, 메클로페남산, 옥시캄, 피록시캄, 테녹시캄, 피라졸리딘디온, 페닐부타존, 옥시펜타트라존, 페니라민, 안타졸린, 나부메톤, COX-2 억제제(셀레브렉스(Celebrex)®), 아파존, 니메술리드 및 질레우톤을 포함한다. 글루코코르티코이드, 예를 들어 히드로코르티손, 프레드니솔론, 플루오로메톨론, 및 덱사메타손이 또한 항염증제로서 사용될 수 있다.

대표적인 항균제는 바시트라신 아연, 클로르암페니콜, 클로로테트라사이클린, 시프로플록사신, 에리트로마이신, 젠타마이신, 노르플록사신, 설파세타미드, 설피속사졸, 폴리믹신 B, 테트라사이클린, 토브라마이신, 이독수리딘, 트리플루리딘, 비다라빈, 아시클로비르, 포스카르넷, 간시클로비르, 나타마이신, 암포테리신 B, 클로트리마졸, 에코나졸, 플루코나졸, 케토코나졸, 미코나졸, 플루시토신, 클린다마이신, 피리메타민, 폴린산, 설파디아진, 및 트리메토프림-설파메톡사졸을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대표적인 혈관수축제는 디피베프린(프로핀(Propine)®), 에피네프린, 페닐에프린, 아프라클로니딘, 코카인, 히드록시암페타민, 나파졸린, 테트라히드로졸린, 다피프라졸, 베탁솔롤, 카르테올롤, 레보부놀롤, 메티프라놀롤, 및 티몰롤을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 영양제는 비타민, 미네랄, 및 기타 유익한 제제, 예를 들어 비타민 A, 비타민 B₁, 비타민 B₆, 비타민 B₁₂, 비타민 C(아스코르브산), 비타민 E, 비타민 K, 및 아연을 포함한다.

특정 측면에서, 본원에 기재된 조성물은 점안제로서 제제화되고, 상기 점안제는 기타 점안 제제와 함께 사용된다. 상기 기타 점안제는 세척/윤활 점안제, 안구 건조 치료제, 스테로이드 및 항생 점안제, 녹내장 점안제, 알레르기/항염증 점안제, 및 결막염 점안제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

조성물은 피험체의 각막의 지지하거나 재성형하는 것을 보조하기 위해 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리와 함께 사용될 수 있다. 각막 삽입물 중에는 각막 인레이(inlay) 및 각막 온레이(onlay) 장치가 포함된다. 예를 들어, 콘택트렌즈, 기질 내 고리, 또는 기타 삽입물/이식편이 조성물로 처리 전, 중, 및/또는 후에 각막 형상을 만들거나 유지하는데 사용될 수 있다. 각막 '삽입물'은 전형적으로 각막에 삽입되는 일시적인 장치를 언급하는 한편, 각막 '이식편'은 전형적으로 더 영구적인 장치를 언급하는 것으로 알려져 있다. 그러나 잘 알려진 많은 장치가 당 업계에서 이식편/삽입물로서 호환적으로 기재된다. 그러므로 본원에서 사용되는 용어 '삽입물/이식편'은 사용하는 시간을 기준으로 엄격히 제한하는 것으로 생각되어서는 안 된다.

콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 각막 결함, 질환, 손상, 상처, 및/또는 변성뿐 아니라 눈의 굴절 이상의 치료를 위해 개시된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 여러 측면에서, 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물의 담체 또는 조성물 용리 장치로서 작용할 수 있다. 다른 측면에서, 콘택트렌즈, 기질 내 고리, 또는 기타 각막 삽입물/이식편은 본원에서 상세하게 기재된 바와 같이 눈에 투여하기 적합한 조성물, 예를 들어 점안제와 함께 이용될 수 있다. 특정 측면에서, 컴퓨터 소프트웨어는 피험체에게 가장 적합한 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리를 결정하고/거나 조성물의 제제를 결정하는데 이용될 수 있다. 특정 측면에서, 본원에 기재된 조성물과 함께 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리를 이용하는 치료는 눈 수술, 예를 들어 굴절 또는 이식 수술 전 또는 후에 사용된다.

치료는 피험체의 평가(예를 들어, 나이, 피험체의 업무 필요성, 눈 결함 또는 질환 등), 각막의 전방 표면의 곡률의 반지름에 필요한 변화를 지원하기 위해 성형 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리의 사용의 처방, 및 콘택트렌즈 또는 이식편/삽입물과 함께 사용될 본원에 기재된 조성물의 처방을 수반할 수 있다. 처방되거나 피험체에 의해 이용되는 콘택트렌즈 또는 이식편/삽입물이 사용되어 각막에 역학적인 힘을 가함으로써 각막의 형상, 즉, 굴절력의 변화를 유도할 수 있다.

특정 바람직한 측면에서, 각막은 개시된 조성물과 함께 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리의 사용에 의해 지지되거나 성형될 수 있다. 시판되는 장치의 예는 인탁스(INTACS)® 및 케라링(KeraRing) 기질 내 각막 고리를 포함한다. 또 다른 측면에서, 성형 콘택트렌즈는 개시된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 콘택트렌즈는 딱딱하거나 단단할 수 있거나 소프트 렌즈일 수 있다. 별법으로, 콘택트렌즈는 딱딱하고 부드러운 부분을 둘 다 포함할 수 있다. 소프트 콘택트렌즈가 사용될 경우, 더 큰 양 또는 음의 곡률이 각막에서 유도될 수 있고, 피험체가 콘택트렌즈에 적응하면서 피험체의 눈의 불편함은 감소할 것이다. 하드 콘택트렌즈가 사용될 경우, 더 큰 역학적 압력이 각막에 가해질 수 있다. 콘택트렌즈는 기체 투과성일 수 있다. 성형 콘택트렌즈는 판매처로부터 구입할 수 있다. 시판되는 렌즈의 예는, 적어도, 드림라이트(DreamLite), OK 렌즈, 아이드림(EyeDream), 미라크렌즈(MiracLens), 드림렌즈(DreamLens), i-GO OVC, GOV, 웨이크 앤 씨(Wake and See), CRT, 파르고/아이시(Fargo/iSee), 에머랄드 앤 웨이브 콘택트렌즈 시스템(Emerald and Wave Contact Lens System) 렌즈를 포함한다.

콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리를 피험체의 눈 위/안에 넣으면, 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 점안제)이 투여될 수 있다. 특정 경우에, 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리의 설치 전에 조성물을 미리 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 유리하게는, 콘택트렌즈, 기질 내 고리, 또는 기타 삽입물/이식편 및 조성물은 함께 사용되어 각막의 형상의 변화로써 각막의 굴절력을 변화를 가져올 수 있다. 조성물은 각막이 형상에서 바라는 변화를 취하도록 하기 위해서 더 빈번하게 투여될 수 있다. 특정 측면에서, 조성물은 적어도 24, 12, 또는 8시간 마다 투여된다. 다른 측면에서, 조성물은 6시간 마다 투여된다. 특정 기타 측면에서, 조성물은 대략 3시간 마다 투여된다. 또 다른 측면에서, 조성물은 대략 2시간 마다 투여된다. 또 다른 측면에서, 조성물은 1시간 마다 투여된다.

어떤 특정 이론에 얽매이지 않더라도, 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리와 본원에 기재된 조성물의 병용은 각막의 분자 구조의 변화를 유도할 수 있고 각막 기질에서 발견되는 세포 및 콜라겐(예를 들어, 콜라겐 II형)과 같은 단백질의 변화를 유도할 수 있다. 각막의 표면은 이로써 더 균일해진다. 각막 표면의 불규칙성을 감소시켜, 모든 이미지(즉, 시력)의 질과 선명도가 향상된다.

성형 콘택트렌즈의 계산을 위해 가장 편평한 각막 곡률 측정법이 실시된다. 당 업자는 또한 더 가파른 각막 곡률 측정법 또는 둘 다의 평균을 이용하거나 상기 각막 곡률을 기초로 하여 각막의 전방 표면의 곡률의 반지름을 편평하게 하거나 가파르게 하는데 필요한 계산 값을 얻어서 눈의 굴절 결함을 교정한다. 성형 콘택트렌즈의 기본 곡선은 각 눈에 굴절력의 변화를 기초로 하여 별도로 계산될 수 있다. 특정 측면에서, 성형 콘택트렌즈의 기본 곡선은 요구되는 굴절 이상에 따라 1 내지 4의 더 편평하거나 더 가파른 디옵터, 더 바람직하게는 1 내지 3의 더 편평하거나 더 가파른 디옵터, 더욱더 바람직하게는 1 내지 2의 더 편평하거나 더 가파른 디옵터로 시작하여 계산될 수 있다. 주변 기본 곡선은 성형 콘택트렌즈의 적응에 따라 결정되고 중심 부위보다 반지름이 0.5mm 더 크게 계산되지만 설계에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 성형 콘택트렌즈의 지름은 8.0 mm 내지 18.0 mm일 수 있다. 시판되는 렌즈는 상기 지름으로 생산된다. 특정 측면에서, 성형 콘택트렌즈는 지름이 8.0 mm 내지 12.0 mm 범위인 하드 콘택트렌즈일 수 있다. 다른 측면에서, 성형 콘택트렌즈는 지름이 13.0 mm 내지 15.0 mm 범위인 소프트 콘택트렌즈일 수 있다. 소프트 콘택트렌즈는 전체 각막을 덮고 공막에서 공막을 지날 수 있다. 또 다른 측면에서, 성형 콘택트렌즈는 단단하고 부드러운 물질로 구성될 수 있다. 콘택트렌즈는 중심에서 대략 12.0 mm, 13.0 mm, 14.0 mm, 또는 15.0 mm까지 밖으로 중심에서 단단하고, 16.0 mm, 17.0 mm, 및 18.0 mm까지 밖으로 주변부에서 부드럽다. 더 큰 콘택트렌즈, 바람직하게는 소프트 콘택트렌즈가 성형 콘택트렌즈로서 밤에 사용될 수 있다.

성형 콘택트렌즈의 도수는 피험체가 편안하게 보는데 필요로 하는 가능한 최근접 굴절력으로 결정될 수 있다. 성형 콘택트렌즈에 적용하는 과정에서, 시력이 피험체의 요구에 적당하지 않을 경우, 피험체는 치료를 받으면서 안경을 처방받는다. 각막이 재성형되고 있거나 재성형되었을 때, 여러 시력 측정법의 측정은 치료가 계획한 바대로 진행되고 있는지와 적합한지를 확인하기 위해 반복될 수 있다. 이러한 측정은 근거리 시력 및 원거리 시력, 오르토타입(orthotype), 각막 곡률 측정값, 타각적 및 자각적 망막 검영법, 성형 콘택트렌즈의 적응 다이어그램, 성형 콘택트렌즈의 움직임, 및 성형 콘택트렌즈의 편안함에 대한 평가를 포함할 수 있다.

측정 실시 후, 상기 측정값을 기초로 하여 치료 프로그램에 변화를 줄 수 있다. 각 평가로, 동일한 성형 콘택트렌즈로 지속할지 또는 신규 콘택트렌즈가 사용되어야 하는지를 결정할 수 있다. 또한, 성형 콘택트렌즈와 함께 사용되는 조성물과 관련하여 동일한 결정이 내려질 수 있다. 성형 콘택트렌즈 및/또는 조성물에 변화를 주어 여러 주에 걸쳐 각막의 바라는 재성형을 유도할 수 있다. 특정 측면에서, 치료 시작 후 처음 8주간 매주 주기적인 교정을 실시한다.

본원에 기재된 조성물은 각막의 콜라겐(예를 들어, 콜라겐 II형)의 함량의 변화를 유도한다. 각막의 해부학, 조직학, 및 생리학의 다른 측면은 또한 조성물에 의해 영향받을 수 있다. 특정 측면에서, 조성물은 각막 수화의 변화를 유도하기 위해 고장성 또는 저장성일 수 있다. 다른 측면에서, 조성물은 각막(예를 들어, 세포 외 바탕질)의 분자 구조를 변화시키고 이 방법으로 각막을 증강 또는 회복하거나, 바라는 곡률로 각막을 재성형하는데 사용될 수 있다.

각막을 재성형할 때, 각막을 부드럽게 하기 위해서 하나 이상의 효소를 동시투여하는 것이 바람직할 수 있다. 대표적인 효소는 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제 ABC, 콘드로이티나아제 AC, 케라타나아제, 및 스트로멜리신을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이들은 각막의 여러 프로테오글리칸 구성요소에 작용하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 효소 콜라게나아제, 바탕질 메탈로프로테이나제 1(간질 콜라게나아제), 및 바탕질 메탈로프로테이나아제 2(젤라티나아제)가 포함된다. 조성물이 상기 임의의 효소와 동시 투여되는 경우, 상기 효소의 작용을 향상시키기 위해서 조성물 내에 중합체(예를 들어, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 셀룰로오스 등)과 같은 비히클을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 메탈로프로테이나아제 효소를 활성화시키기 위해서 추가의 제제, 예를 들어, 인터류킨-1α, 종양 괴사인자 α/β 및 이의 임의의 아형, 모노소듐 유레이트 모노하이드레이트, 4-아미노 페닐수은 아세테이트, 인간 혈청 아밀로이드 A, 인간 B₂ 마이크로글로빈, 및 염화구리가 포함될 수 있다. 또한 카바미드(요소)가 포함될 수 있다. 상기 제제의 임의의 조합이 또한 사용될 수 있다.

또한, 조성물은 각막에서 발견되는 기타 당 또는 단백질을 분해하는 하나 이상의 효소와 함께 동시 투여될 수 있다. 조성물은 각막에 성형 콘택트렌즈 또는 임의의 각막 삽입물/이식편의 자극을 감소시키는데 사용되는 하나 이상의 마취제와 동시 투여될 수 있다. 조성물은 치료 과정에서 피험체의 편안함을 향상시키기는 하나 이상의 윤활제와 동시 투여될 수 있다. 다른 측면에서, 조성물은 하나 이상의 항균제 예를 들어 항세균제, 항바이러스제 및/항진균제와 함께 동시 투여될 수 있다. 조성물은 또한 하나 이상의 혈관수축제와 동시 투여될 수 있다. 당 업자는 치료되는 병태를 기초로 하여 피험체에게 동시 투여하기에 적합한 제제를 결정할 수 있다.

특정 측면에서, 조성물은 키트에 제공될 수 있다. 키트는 성형 콘택트렌즈, 윤활 점안제, 콘택트렌즈용 세척 또는 기타 용액, 콘택트렌즈 휴대 용기, 여분의 콘택트렌즈, 및 콘택트렌즈 착용 및 조성물 사용을 위한 설명서 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 키트와 함께 제공된 조성물은 구성요소(TGFβ3 폴리펩티드(또는 이의 변이체 또는 단편)와 덱사메타손(또는 이의 유도체 또는 관련 스테로이드 제제))의 명시된 조합을 포함하도록 제제화될 수 있거나, 키트는 투여 전에 함께 혼합되거나, 함께, 즉 동시에 또는 순차적인 투여에 의해 투여되는 분리된 제제로서 구성요소를 포함할 수 있다.

실시예

본원에 기재된 실시예는 본 발명의 구체적인 실시양태 및 측면을 예시하기 위한 목적으로 제공되며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 전혀 아니다. 통상의 기술자는 불필요한 실험 없이 다른 실시양태, 측면 및 변이를 만들기 위해 본 개시 및 본원의 교시를 이용할 수 있다. 이러한 모든 실시양태, 측면, 및 변이는 본 발명의 일부로 간주된다.

실시예 1: 실험의 개요

사전 실험에서, 발명자들은 각막 기질 세포가 신경 계통으로 분화해 내려가도록 유도하는 것이 가능하다는 것을 보였다. 본원에 기재된 실험은 각막 기질 세포가 연골 특이적 콜라겐 II형을 분비하는 연골 세포 유사 세포로 전환될 가능성을 조사하고자 하였다. 상기 유형의 연골은 발생 과정에서 발현되는 것으로 생각된다(Linsenmayer et al. 1990). 추가의 목적은 콜라겐 II형 침착이 살아있는 쥐의 각막에서 생체 내에서 유도될 수 있는지와 상기 처리가 각막의 광학적 특성에 긍정적인 영향을 주는지를 밝히는 것이었다. 또 다른 목적은 원추각막의 조직에서 각막 기질 세포가 세포 리프로그래밍 및 콜라겐 II형이 풍부한 ECM의 후속적인 생산의 상기 방법으로 치료 가능할 수 있는지 밝히는 것이었다. 마지막으로, 실험은 경도 및 탄성률의 분석을 가능하게 하는 생체 공학적 접근법인 나노 압입 검사를 이용하여 생체 내 및 생체 외 처리된 각막의 생체역학적 특성에 대해 II형 콜라겐 침착의 효과를 평가하고자 하였다.

실시예 2: 조직 시료

인간 조직

사체의 전체 인간 각막, 이식 수술 시 입수한 원추각막의 각막, 인간 윤부 테두리 및 외과의 절개 DSEK 캡(cap)(데스메 막 제거 각막 내피세포 이식술(Descemet's stripping endothelial keratoplasty)로부터의 과량의 기질 조직)은 뉴질랜드 국립 안구은행(New Zealand National Eye Bank)(뉴질랜드 오클랜드 소재)을 통해 제공받은 공여자로부터 얻었다. 각막 이식 수술을 위해 윤부 연결부위로부터 2 mm 각막 변연부를 남기고 중심 각막 반구피를 제거한 후 인간 윤부의 테두리를 수집하였다. 조직을 사용하기 전에, 북부 X 지역 인간 윤리 위원회(Northern X Regional Human Ethics Committee)로부터 연구 윤리 승인 및 동의를 얻었다. 모든 조직은 사용할 때까지 뉴질랜드 안구은행 배지(이글(Eagles) MEM 중 2% FCS, 2 mM L-글루타민, 1 x 안티-안티(Anti-Anti))에 보관하고 뉴질랜드 안구은행 이동 배지(5% 덱스트란이 보충된 안구은행 배지) 중에 운반하였다.

동물 조직

오클랜드 대학교 동물 윤리 위원회(University of Auckland Ethics Committee)(신청 번호 R856)로부터 동물 연구에 대한 윤리적 승인을 얻었다. 이산화탄소 챔버를 이용하여 안락사 후에 6-8주 성체 수컷 위스타 쥐로부터 눈과 연골을 얻었다. 동물로부터 전체 눈을 꺼내고 해부 현미경의 도움으로 수술 가위를 사용하여 각막을 조심스럽게 절개해냈다. 검상 돌기는 그 말단에 얇고 넓은 판의 연골을 포함하는 흉골의 일부인데, 이것을 스켈펠 칼을 이용하여 절개해 냈다. 동물 조직을 포비돈-요오드(PVP-1) 및 소듐 티오설페이트로 세척하였다. 연골을 덮는 과량의 지방 및 조직을 칼로 긁어냈다. 새로 수거한 눈과 연골은 사용할 때까지 인산 완충 식염수에 최소 시간 보관하였다.

실시예 3: 조직학적 분석

조직 제조 및 동결 절편 제작

각막 및 연골 조각(2 mm x 2 mm)을 최적 절단 온도 화합물(OCT(Optimal Cutting Temperature compound), 티슈-텍(Tissue-Tek), 네덜란드 사쿠라 소재)에 매몰한 후 액체 질소에서 급속 동결하였다. 절편을 마이크롬(Microm) HM550 크라이오스탯(Cryostat)(서모-사이언티픽(Thermo-Scientific), 미국 소재)을 사용하여 10-15 μm 두께로 절단하고 수퍼프로스트™ 플러스(SuperFrost™ Plus) 정전기 슬라이드(멘첼-글렌서(Menzel-Glenser), 독일 소재)에 고정하였다. 동결 절편은 추가로 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.

세포 및 조직 배양

인간 및 쥐 각막으로부터 조직 분해 및 세포 제조

II 등급 층류 후드에서 윤부 테두리를 절개하여 공막으로부터 기질을 단리하였다. 이 다음에, 각막 절개 칼을 이용하여 각막 상피 및 내피를 부드럽게 긁어내서 버렸다. DSEK 캡도 각막 절개 칼로 부드럽게 긁어내어 상피를 제거하였다. 그 후 잔여 기질 조직을 항크스 평형 염류 용액((지브코(GIBCO)®, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 중 0.4% II형 콜라게나아제(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))에서 궤도 진탕기에 37℃에서 서서히 혼합하여 분해하였다. 최적의 조직 분해 및 세포 생존도에 필요한 시간인 5시간과 함께 여러 분해 시간을 사용하였다.

조직 분해가 완료된 후, 세포를 1200 rpm에서 7분간 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 그 후 세포를 최소량의 적합한 세포 배양 배지에 재현탁하고 레이카(Leica) DM IL 실험대 도립 현미경 및 뉴바우어 혈구 계산판(Neubauer hemocytometer)을 이용하여 계수하였다. 트립판 블루 용액(PBS 중 0.04% 트립판 블루 저장액)에 첨가된 1:1 비율의 세포 현탁액을 시료당 최소 3회 계수하여 평균값을 얻어 사용하였다.

각막의 각막 기질 세포의 세포 배양

모든 세포 조작은 II 등급 층류 후드에서 멸균 기술을 이용하여 실시하였다. 단리된 각막 기질 세포는 2-3 ml의 세포 배양 배지 중에 플라스틱 또는 유리 커버 슬립 위에서 12 또는 24 웰 클러스터 플레이트(팔콘(Falcon))에서 배양하였다. 세포는 37℃에서 5% CO₂로 가습된 인큐베이터에서 유지하였다. 배양 배지는 24시간 후, 그 후 이어서 2일 마다, 필요한 경우 더 빈번하게 교환하였다. 배양물은 레이카 DM IL 실험대 도립 현미경으로 매일 관찰하였다. 세포 펠렛 배양일 경우, 조직을 플라스틱 원뿔형 튜브에서 300 g, 20℃에서 7분간 원심분리하여 펠렛으로 만든 후 세포를 신선하게 얻었다. 적합한 배양 배지를 튜브에 첨가하였다. 37℃에서 24시간 인큐베이션한 후, 세포는 수축되고 튜브 벽에 부착하지 않는 펠렛을 형성하였다. 펠렛을 2 ml의 배지 중에 37℃에서 5% CO₂의 가습 대기에서 3주간 배양하였다. 배지는 격일로 교환하였다.

기관형 슬라이스 배양

인간 및 쥐의 각막 및 연골 조직을 칼로 전후방 면에서 얇게 슬라이스하고(1-2 mm) 슬라이스를 기관형 공기-액체 계면 배양 시스템에 놓았다(도 2). 간략하게, 건강한 조직의 외식편을 배양 배지와 CO₂가 풍부한 환경 사이의 계면에 0.4 μm 공극 세포 배양 삽입물(밀리셀(Millicell), 프랑스 소재)에서 배양하였다. 각막 절편을 3 ml의 배양 배지를 포함한 세포 배양 플레이트 삽입물 위에 상피가 위로 오게 놓았다. 배양 배지는 격일로 교환하였다.

실시예 3: 시험관 내 리프로그래밍

배양 배지

하기 표에 기재된 바와 같이 여러 맞춤 배지를 사용하였다.

<표 1>

각막 기질 세포의 연골 발생 리프로그래밍

조직 슬라이스를 연골 발생 분화 배지에서 다양한 시간 간격을 두고 배양하여 성장 인자 처리에 필요한 최적 시간을 결정하였다. 시료를 각 시점으로부터 수집하였다(표 2). 단층의 세포를 얻기 위해서, 각막 기질 세포를 cm²당 15 x 10⁴의 밀도로 유리 커버 슬립에 접종하였다. 세포가 커버 슬립에 부착하도록 24시간 두고 배양 배지를 격일로 교환하였다. 배양은 3주까지 유지하였다.

<표 2>

실시예 4: 생체 내 리프로그래밍

성장 인자 전달을 위한 겔 점안 제제

점안제는 세균, 슈도모나스 엘로데아(Pseudomonas elodea)에 의해 생산되는 수용성 다당류인 젤란 검을 사용하여 제제화하였다. 겔 기반 제제의 사용은 각막 체류시간을 연장하고 치료제의 안구 생체이용률을 증가시킨다. 중합체 젤란 검은 음이온 중합체이기 때문에, Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, K⁺, 및 Na⁺과 같은 1가 및 2가 양이온이 존재할 때 제자리 겔화를 거친다(Bakliwal, & Pawar 2010). 이것이 눈에 주입될 때 눈물에 존재하는 전해질이 중합체의 겔화를 유발하고, 차례로 이는 결과적으로 약물의 더 긴 체류시간과 증가된 생체이용률을 가져온다(Ludwig 2005). 이전의 제제 연구를 근거로 하면, 중합체 제제는 생체 내 용도에 비자극적이고 안전하다(Rupenthal, Green, & Alany 2011).

처음에 증류수를 80℃로 가열한 후 일정하게 교반하면서 젤란 검(켈코겔™ USA)을 첨가하여 0.5% 용액을 제조하였다. 분말이 완전히 용해되면, 용액을 냉각시켜 4℃에 보관하였다. 적당량의 성장 인자를 묽은 겔에 일정하게 교반하면서 첨가하였다. 배양 배지에 사용된 것보다 10배 더 높은 농도의 성장 인자를 사용하여 코눈물관 배출 및 눈 깜박거림을 통해 소실되는 약물을 보충하였다. 점안 겔은 100 ng/ml의 TGFβ3 및 대략 4 μg/ml 덱사메타손의 최종 농도를 포함하였다.

신경 발생 및 연골 발생 인자로 처리

동물을 손으로 누르고 대략 15 ㎕의 점안제를 오른쪽 눈에 주입하였다(도 3). 반대쪽 눈은 대조군 눈으로 사용하였다. 점안제는 1일 3회 신경 선별 군에는 5일까지 연골 발생 선별 군에는 8주까지 투여하였다.

실시예 5: 면역조직화학적(IHC: Immunohistochemical ) 분석

조직 수거 및 처리

처리 종료 시, 이산화탄소 챔버를 사용하여 동물을 안락사시켰다. 눈을 수거하고 인산 완충 식염수로 세척하였다. 그 후 각막을 조심스럽게 절개해내어 4% 파라포름알데히드(PFA)에 1시간 고정하고 조직을 동결방지하기 위하여 수크로오스 용액으로 처리한 후 동결하고 절편으로 만들었다. 동결방지제로서 수크로오스는 동결된 조직 절편에 얼음 결정 산물의 형성을 방지하는 탈수제이다. 조직을 서서히 동결할 경우, 동결보호가 특히 중요하다.

간략하게, 각막을 20% 수크로오스 용액에 4℃에서 5시간 담근 후 30% 수크로오스 용액으로 옮겨 조직이 가라앉을 때까지(대개 하룻밤) 4℃에서 유지하였다. 그 후 각막을 OCT 화합물에 매립하고 액체 질소에 담가 신속하게 동결하였다. 동결된 조직 블록을 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 대략 10-15 μm 두께의 크라이오스탯 절편을 수퍼프로스트™ 플러스 슬라이드 위에 고정하고 슬라이드를 필요할 때까지 -80℃에 보관하였다. 세포 배양일 경우, 커버 슬립에서 배양된 세포를 PBS로 세척하고 4% PFA로 15분간 고정하였다. 커버 슬립은 추가로 사용할 때까지 PBS에 담가두었다.

면역조직화학 분석

조직 동결 절편일 경우, 면역조직화학 분석을 수행하기 전에, 슬라이드를 실온에서 15-20분간 두었다. PBS를 사용하여 OCT를 세척해 내고 왁스 펜을 사용하여 조직 주변 부위에 경계를 표시하였다. 조직 슬라이스를 먼저 10% 정상 염소 혈청의 차단 용액으로 1시간 인큐베이션한 후 적당히 희석된 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 그 후 슬라이드를 PBS로 3회 세척한 후 적당히 희석된 2차 항체와 인큐베이션하였다. 2차 항체를 실온에서 2시간 두었다. 슬라이스를 핵 마커 4', 6'-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대비 염색하고 시티플루오르(Citifluor) 안티페이드(antifade)제에 고정하였다(프로사이테크(ProSciTech), 호주 소재). 올림푸스(Olympus) 플루오뷰(FluoView)™ FV-1000 공초점 레이저 주사 현미경(405 nm, 473 nm, 및 559 nm 파장 레이저) 및 레이카 DMRA 형광 현미경을 영상화에 사용하였다.

<표 3>

실시예 6: 유전자 발현 분석

RNA 단리 및 cDNA 합성

시료로부터 mRNA 추출은 퓨어링크(PureLink)® RNA 마이크로키트(MicroKit)(인비트로젠(Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. 간략하게, 조직 시료를 0.75 ml 트리졸(TRIzol)® 및 운반체 RNA와 혼합하고 수동 균질기(프로 사이언티픽(PRO Scientific, Inc.))를 사용하여 균질화하였다. 그 후 시료를 0.2 ml의 클로로포름과 인큐베이션한 후 4℃, 12000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상층을 분리하고 에탄올과 혼합한 후 수집 컬럼 튜브로 옮겼다.

RNA는 12000 rpm에서 1분간 원심분리하여 컬럼에 수집하였다. 통과액은 버리고 추출된 RNA는 데옥시리보뉴클레아제(DN아제)로 처리하였다. 컬럼을 제공된 완충액으로 여러 번 세척하고 RNA는 최종적으로 리보뉴클레아제(RN아제)가 없는 물에 현탁하였다. 농도는 나노드롭(NanoDrop)®(서모 사이언티픽)을 사용하여 결정하고 mRNA는 -80℃에서 보관하였다.

수퍼스크립트(SuperScript)® 빌로(VILO)™ cDNA 신테시스 키트(Synthesis Kit)(인비트로젠)™, 라이프 테크놀로지스)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 간략하게, 100 ng의 RNA를 빌로™ 리액션 믹스(Reaction Mix,) 수퍼스크립트® 엔자임 믹스(Enzyme Mix) 및 RNA 없는 물과 25℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 그 후 시료를 42℃에서 120분간 인큐베이션한 후 85℃에서 5분간 인큐베이션하였다. cDNA는 -20℃에서 보관하였다.

택맨 ( TaqMan )® 유전자 발현 분석을 이용한 정량 PCR

관심 유전자를 위한 택맨® 유전자 발현 분석을 구입하였다. PCR 단계에서, 10 ㎕의 택맨® 유니버셜 마스터 믹스(Universal Master Mix) II를 1 ㎕의 분석물, 대략 25 ng의 cDNA 및 9 ㎕의 물과 합하여 20 ㎕의 부피를 구성하였다. 튜브를 볼텍스(vortex)하고 신속하게 원심분리하여 내용물을 가라앉혔다. 각 cDNA 시료는 3개씩 제조하고 384웰 플레이트에 피펫팅하였다. 20 ㎕의 각 반응 혼합물을 마이크로앰프(MicroAmp)® 옵티칼(Optical) 384-웰 리액션 플레이트(Reaction Plate)(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))의 각 웰에 로딩하였다. 그 후 플레이트를 마이크로앰프® 옵티칼 어드히시브 필름(Optical Adhesive Film)(어플라이드 바이오시스템스)으로 덮고 플레이트를 신속하게 원심분리하여 기포를 제거하였다. 플레이트를 7900HT 패스트 리얼-타임(Fast Real-Time) PCR 시스템으로 옮기고 하기 열 사이클 파라미터를 이용하여 작동하였다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, 이어서 95℃ 15초 및 60℃ 1분의 40회 주기. 결과는 앞 부분에 기재된 바와 같이 분석하였다.

<표 4>

실시예 7: 제자리 기질 ECM 단백질 침착 후 각막의 생체 역학적 및 광학적 특성의 시험

설치류 전안부(앞면 구조)의 조사

각막 생체 역학은 여러 각막 질환의 진단 및 치료에 적절하고 각막의 구조 및 이의 각막의 생리학적 기능과의 관계에 대해 이해를 제공한다고 밝혀졌다. ECM 단백질의 침착을 일으키는 처리를 받은 각막은 투명도의 감소가 바람직하지 않기 때문에 각막의 혼탁도에 대해 검사받아야 한다.

피닉스 마이크론 IV 설치류 눈 영상화 시스템(피닉스 리서치 랩스(Phoenix Research Labs))을 사용하여 처리된 쥐의 각막을 조사하였다. 먼저, 케타민 및 도미터(Domitor)® (3:2)의 복강 내 주사를 이용하여 쥐에게 진정제를 주었다. 마이크론 IV 영상화 시스템에 세극등을 부착 사용하여 각막의 층을 상세히 조사하고, 각막 완전성 및 투명도를 조사하였다. 또한, 망막 영상화를 실시하여 각막 투명도를 확인하였다. 영상화 후, 쥐에 진정제의 회복을 위해 안티세단(Antisedan)®(아티파메졸(atipamezole)을 투여하였다.

시험관 내 및 생체 내 처리된 각막의 나노 압입 측정

나노 압입은 관심 시료 평면에 수직인 미세한 힘의 적용을 통해 관심 물질의 역학적 측정 및 그 결과 시료 압입의 측정을 제공한다(Dias & Ziebarth 2013). 나노 압입은 최근 조직 및 기타 생체재료에서 나노 및 마이크로 규모의 역학적 특성을 측정하기 위한 강력한 수단으로 알려졌다(Ebenstein & Pruitt 2006). 나노 압자 팁이 나노 압입과 결합된 3D 영상화 장치로서 동시에 사용되는 제자리 주사 프로브 현미경(SPM) 영상화의 더 최근의 발전은 새로운 흐름의 신규 물질 연구를 가능하게 하였다(Dickinson & Schirer 2009). 나노 압입 팁을 제어된 하중으로 각막 조직으로 밀어 넣으면서 동시에 힘, 변위, 및 시간이 기록된다. 나노 압입 과정에서 적용되는 힘은 약간의 나노 뉴턴만큼 작거나 수 뉴턴만큼 커서 연구되는 크기 규모 범위를 가능하게 할 수 있다. 나노 압입 검사는 각막의 강성, 완전성, 및 탄성과 관련한 역학적 특성을 계산하는 잘 정의된 방정식을 이용하여 분석될 수 있는 하중-변위 곡선으로 산출된다.

인간 원추각막의 각막은 대조군 배지에서 또는 특정 ECM 단백질을 유도하는 리프로그래밍 인자를 포함하는 배지에서 기관형 배양에 들어갔다. 그 후 나노 압입 측정은 처리 시간 종료 시에 실시하였다. 생체 내 연구 경우, 동물을 손으로 누르고 리프로그래밍 인자를 포함하는 대략 15 ㎕의 겔 점안 제제를 각 위스타 쥐의 오른쪽 눈에 주입하였다. 반대쪽 눈은 대조군 눈으로 사용하였다. 점안제는 1일 3회 7주까지 투여하였다. 나노 압입 측정은 단리된 눈에 대해 1주, 3주, 또는 7주의 처리 기간 후에 기록하였다.

나노 압입 검사는 오클랜드 대학교 화학 및 재료 공학 연구실에서 수행하였다. 각막을 이의 본래 자리에서 검사하기 위해서, 나노 압입에 몰드가 필요하였다. 이전의 연구에서 각막을 제자리에 고정하기 위해 폴리스티렌의 파랑 압정을 사용하였다. 하중하에 몰드 변형의 영향은 오차의 가능한 원인이기 때문에 검사를 위해 단단한 몰드로 결정하였다. 몰드를 만들기 위해 사용된 첫째 물질은 종래의 플레이 도우였다. 이는 인간 각막 시료의 정확한 형상과 곡률에 맞추어 만들었다(도 6(A)). 그 후 플레이 도우를 두어 다음 2일간 경화시킨 후에 검사에 사용하였다. 쥐 눈의 검사는 완전한 구를 사용한 것과 약간 달랐다. 구를 제자리에 고정하기 위해, 수지로 채워지고 구를 고정하기 위한 작은 압입을 가진 페트리 디시를 사용하였다(도 6(B)). PBS를 사용하여 시료가 건조되지 않도록 유지하였다.

시료는 매우 부드러운 생물학적 시료이기 때문에, 원추구형 액체 팁을 모든 나노 압입 검사에 사용하였다. 인간 시료에 사용된 압입 하중은 50 μN였다. 쥐 안구 경우, 3 내지 5 μN의 하중 범위를 사용하였다. 광섬유를 켜고 시료를 현미경으로부터 광선 줄기 아래 바로 놓았다. 각막의 중심 절편을 가능한 정확하게 광선 줄기에 바로 놓았다(도 6(C)). 각막의 표면이 우수한 해상도로 관찰될 때까지 Z 슬라이더를 조정하여 시료에 초점을 맞추었다. 초점이 각막 시료의 중심 최고 지점에 놓이는지 확인하기 위해서, 시야를 x 및 y 방향으로 움직여 초점이 어떻게 변화하는지를 관찰하였다.

데이터 수집 지점을 각막의 중심에 초점을 맞추면, 시료 경계를 정하고 신속한 접근을 실행하였다. 압입하기 전에, 하중 함수를 정확하게 설정해야 했다. 실제 압입 과정은 하이지트론 트리보인덴터(Hysitron Triboindenter)®에 의해 자동화된다(도 6(D)). 미리 정해진 하중을 압자 팁에 주어 정해진 한계에 도달할 때까지 시료에 침투시킨다. 그 후 팁을 10초간 유지한 후 팁을 시료로부터 빼냈다. 시료의 경도는 팁을 제거한 후 잔여 압입 면역(Ar)에 의해 결정한다.

상기 식에서, P_max는 최대 압입 하중이고 면적은 시료와 원추구형 팁의 접촉 면적이다. 감소된 탄성률은 하기 방정식에서 나타낸 바와 같이 시료 및 압자 팁 모두에서 탄성률을 나타낸다:

상기 식에서, i는 압자를 언급하며 m 은 시료 물질을 언급한다. 감소된 탄성률은 시료의 탄성 정도를 말해준다. 동일한 압자 팁이 각 검사에 사용되기 때문에, 감소된 탄성률이 검사되는 각 시료에서 탄성을 비교하는데 사용될 수 있다.

실시예 8: 성인 인간 각막의 각막 기질 세포는 외인성 TGFβ3 및 덱사메타손으로 처리시 연골 특이적 콜라겐 II형을 생성한다

하나의 성장 인자가 유사하거나 다양한 효과로 여러 유형의 세포에 작용할 수 있지만 많은 성장 인자가 유사한 생물학적 기능을 공유할 수 있다고 알려져 있다. 각막 기질에서 콜라겐 침착을 일으킬 수 있는 성장 인자, 사이토카인, 및 화학물질을 선택할 때, 특정 외인성 인자의 공지된 효과를 고려하는 것이 중요하였다. 본 실험에서, TGFβ3과 덱사메타손의 병용 치료를 이용하였다.

TGFβ3 및 덱사메타손의 효과의 대부분의 증거는 줄기/기원 세포에 대한 이들의 효과에 대해 행해진 연구에 의해서 얻었다(Schuldiner, Yanuka, Itskovitz-Eldor, Melton, & Benvenisty 2000; Worster, Nixon, Brower-Toland, & Williams 2000). 이전에, TGFβ와 덱사메타손의 조합은 기원 세포가 시험관 내에서 연골 세포로 분화하도록 유도하는데 사용되었다(Diekman, Rowland, Lennon, Caplan, & Guilak 2009; Johnstone et al. 1998; Kolambkar, Peister, Soker, Atala, & Guldberg 2007; Winter et al. 2003). 게다가, 합성 스테로이드 약물인 덱사메타손은 눈의 염증성 병태를 치료하는데 사용되어 왔다. 따라서, TGFβ3과 덱사메타손의 조합은 연골 생성 분화 배지에 사용되어 각막 기질 세포의 연골 세포 표현형으로의 분화를 유도하였다.

본 실험에서는, I형 및 II형 콜라겐의 발현을 특히 주목하였다. 자가 조립 및 교차결합하여 고도의 결정 섬유를 형성하는 원섬유 형태의 콜라겐 예를 들어 I형 및 II형은 매우 높은 강성도, 낮은 신장성 및 현저히 탄력적인 에너지 저장능을 보인다고 알려져 있다(Wells 2003). 섬유의 강성도 및 인장 강도에 기여하는 것은 교차결합이다.

각막 기질의 세포 외 바탕질(ECM)은 대부분 콜라겐 I형 및 V형으로 구성된 빽빽이 채워진 이형 콜라겐 섬유로 구성된다. 각막 원섬유와 유사하게, 연골 원섬유는 이형(II형 및 XI형으로 구성)이며 25 nm의 균일한 지름을 갖는다(각막 원섬유보다 약간 작음)(Mendler, Eich-Bender, Vaughan, Winterhalter, & Bruckner 1989). 콜라겐 II는 연골의 주요 원섬유 구성요소이며 분자가 300 nm 길이의 단일 연속된 나선형 도메인으로 필수적으로 이루어진 콜라겐 I과 유사하다. 이들의 유사성으로 인해, 콜라겐 II 및 XI는 다른 조직에서 콜라겐 I 및 V(각막 기질 콜라겐)의 연골 유사체로 생각된다.

본 실험에서, 성인 각막으로부터의 각막의 각막 기질 세포를 TGFβ3 및 덱사메타손을 포함하는 연골 발생 분화 배지 또는 표준 섬유아세포 증식 배지에 접종하였다. 2-3일 내에 연골 발생 분화 배지에 접종된 각막 기질 세포는 대략 50-100 μm 지름의 세포 응집/구체를 형성하였다(도 7(A)). 구체는 중심 부분에 연골 세포 특이적 콜라겐 II형 및 주변부 주위에 네스틴에 대해 표지되었다(도 7(B)). 게다가, 구체를 섬유아세포 증식 배지에 놓으면, 구체로부터의 세포가 밖으로 퍼지기 시작하여(도 7(C)) 배지 접시를 채움으로써 세포 단층을 형성하였다. 세포가 일단 응집된 영역은 콜라겐 II형에 대해 표지되지만 단층 내 세포는 표지되지 않았다(도 7(D)).

섬유아세포 증식 배지에 접종된 각막 기질 세포는 섬유아세포 유사 세포의 평평한 단층을 형성하였으며(도 8(A)) 이는 네스틴 또는 콜라겐 II형으로 표지되지 않았다(도 8(B)). 배지를 연골 발생 분화 배지로 교체하였을 때, 배양물의 외관에는 변화가 없었고 세포는 콜라겐 II형 음성을 유지하였다. 이 결과는 세포 응집이 연골-유사 ECM 생산에 중요해 보인다는 것을 시사한다. 섬유아세포 증식 배지에 접종된 각막 기질 세포는 필수적인 세포 응집을 형성하지 못했다. 따라서 섬유아세포 클러스터를 형성하기 위해서, 전면 섬유아세포를 배양 접시로부터 분리시키고, 펠렛을 형성하고 연골 발생 분화 배지에서 펠렛 배양물로서 추가 3주간 배양하였다. 세포 펠렛은 각막 기질 특이적 ECM 단백질 케라토칸에 대해서 양성으로 표지되었지만 연골 특이적 ECM 단백질 II형 콜라겐에 대해서 표지되지 않았다(도 8(F) 및 (G)).

실시예 9: 성인 인간 각막 및 성체 쥐 각막에서 각막 기질 세포는 TGFβ3 및 덱사 메타손으로 처리될 때 콜라겐 II형을 포함하는 ECM을 분비한다

성인 인간 각막의 슬라이스를 대조군 배지 또는 연골 발생 분화 배지 내 기관형 슬라이스 배양물에 2주간 두었다. 그 후 조직 슬라이스를 연골 세포 특이적 ECM 단백질 콜라겐 II형 및 천연 각막 콜라겐 I형에 대해 표지하였다. 양성 표지는 TGFβ3 및 덱사메타손 처리된 각막에서만 확인되었다(도 9(C) 및 10(B)). 2주 처리 기간이 결과적으로 처리된 각막의 기질 ECM 내에 II형 콜라겐의 침착을 일으켰다는 것이 확인되었다(도 9(C)). 1주간의 처리는 결과적으로 기질 ECM 내에 II형 콜라겐의 눈에 보이는 침착을 전혀 일으키지 않았다(도 9(B)).

천연 콜라겐 I형의 양 및 양상은 처리된 각막에서 약간 변경된 것처럼 보였다. 일반적으로, 표지의 세기는 유사하지만 분포는 더 광범위하고 표지의 양은 미처리된 각막에서 더 많았다(도 9(D)). 게다가, 새로 생성된 II형 콜라겐은 큰 덩어리 또는 응집체를 전혀 형성하지 않으면서 ECM에서 균일하게 그리고 정연한 양상으로 침착하였다. 표지는 각막 기질의 기존의 콜라겐 골격을 따라 분명하게 보였으며 기질 층의 전체 두께를 가로질러 분포되었다.

그 후 시험관 내 인간 각막 조직 실험을 생체 내 설치류 연구로 확장하였으며, 여기서 수컷 위스타 쥐의 오른쪽 각막에 TGFβ3 및 덱사메타손의 젤란 검 기반 점안 제제 15 ㎕를 1일 3회 투여하여 2주간 처리하였다. 2주 후에, 쥐를 안락사시키고 각막은 면역조직화학 분석을 진행하였다. 각막의 전방 부분에서 높은 정도의 침착이 발견된 처리된 각막만이 콜라겐 II형에 대해 양성으로 표지되었다(도 10(D) 및 (E)). 따라서, 연골 발생 분화 배지에서 배양된 각막 슬라이스만이 II형 콜라겐에 대해 양성이었다. 게다가, II형 콜라겐은 기질의 기존의 콜라겐 골격을 따라서 균일한 층으로 침착되었다.

실시예 10: 원추각막의 각막에서 콜라겐 II형 침착의 유도

다음에, 발명자들은 이들 연구에서 확인된 생체 내 리프로그래밍이 원추각막 치료에 이용될 수 있는지 확인해 보았다. 원추각막의 각막에서 각막 기질 세포가 콜라겐 II형 침착의 유도가 가능한지를 확인하기 위해서 실험을 수행하였다. 각막 이식 수술 후 얻은 원추각막의 각막 반구피를 얻자마자 배양물에 넣었다. 각 반구피의 절반을 대조군 배지에 넣고 나머지 절반은 연골 발생 분화 배지에 넣고 2주간 유지하였다. 2주 후에 조직을 면역조직화학 또는 mRNA 추출을 진행하였다. 단지 처리된 절반의 각막의 기질 ECM이 II형 콜라겐에 대해 양성이었다(도 11(B)). 정상 각막 조직과 비교할 때 원추각막 조직에서 표지의 세기는 더 낮았지만, 표지 양상은 유사하였고 기존의 콜라겐 층판의 골격을 따라 더 정연한 배열을 따랐다.

비멘틴 표지는 미처리 및 처리된 원추각막의 각막에서 각막 기질 세포 사이에서 확실한 차이를 나타냈다. 일반적으로 각막 기질 세포 밀도는 각막의 후방 부분에서 세포가 드문 미처리된 각막에서 더 낮았다(도 11(C)). 또한, 처리된 각막에서 각막 기질 세포는 미처리 각막에서 각막 기질 세포와 비교할 때 형태가 더 실 모양이고 완전해 보였다(도 11(E) 및 (F)). 미처리 각막에서 각막 기질 세포와 비교할 때 처리된 각막에서 각막 기질 세포는 더 길었으며 비멘틴에 대해 강하게 표지된 더 많은 수의 세포 돌기를 가졌다.

실시예 11: TGFβ3 및 덱사메타손 처리는 섬유화 단백질의 침착을 유도하거나 각막 혼탁을 일으키지 않는다

연골 발생 분화 배지에서 3주까지 배양된 인간 각막은 섬유화 및 흉터와 관련된 콜라겐 III형 및 αSMA에 대해 표지하였다(Gabbiani 2003; Karamichos et al. 2012). 섬유화 바탕질 침착의 증거가 전혀 없었던 반면, 대조군 조직에서 αSMA 표지의 정도는 더 높았다(도 12). 상기 결과는 TGFβ1 및 TGFβ2와 다르게, TGFβ3이 각막의 각막 기질 세포의 근섬유 아세포로의 분화를 유도하지 않는다는 앞선 결과들을 확인해 준다.

연구 기간에 걸쳐 살아있는 쥐에 세극등 검사를 실행하였다. 검사시, 처리 및 미처리된 각막은 흉터 또는 혼탁의 징후가 없이 구별되지 않았다. 혈관을 밝히는 눈의 후면 영상화는 빛의 통과를 차단하지 않는 투명한 각막을 보였고(도 13(A) 및 (B)) 마이크론 IV 렌즈를 이용한 쥐 각막의 생체 내 단면 영상화는 빛이 쉽게 통과하는 투명한 각막을 나타냈다(도 13(C) 및 (D)). 각막을 통과하는 빛의 차단을 일으키는 각막의 혼탁 또는 흐림의 징후는 전혀 없었다.

실시예 12: 생체 내 처리 시 콜라겐 II형 및 I형의 mRNA 발현에서의 변화

1주, 7주, 및 3주간 생체 내에서 처리 받고 4주의 비처리 기간을 거친 쥐의 각막을 정량 유전자 발현 분석하였다. 목적은 성장 인자 처리를 중단한 후에 II형 콜라겐 발현이 다시 감소하고/거나 영구적으로 정지하는지를 결정하는 것이다. 또한, 천연 각막 콜라겐 II형에 대한 처리 효과를 조사하였다.

7주 처리된 각막과 비교할 때, 1주 처리된 각막은 II형 콜라겐을 매우 높은 수준으로 발현하였다. [도 35]에서, 첫째 그래프에 명시된 바와 같이 치료 중단시 발현 수준이 상당히 떨어졌다. I형 콜라겐 발현 경우, 1주 및 7주 처리된 각막을 이들의 미처리된 각막과 각각 비교하였다. 1주 처리 후에는 I형 콜라겐 발현에서 초기 스파이크가 있었지만 7주까지 I형 콜라겐 발현은 미처리된 각막에서 이의 발현보다 상당히 낮거나 비슷하였다는 것을 확인하였다(도 14 (B)).

실시예 13: 시험관 내 및 생체 내에서 처리된 각막의 생체역학적 특성에서의 변화

II형 콜라겐의 침착이 각막의 강성도 및 탄성에 영향을 줄 것이라고 가설을 세웠다. 상기 변화를 평가하기 위해서, 생체 내 쥐 각막 및 생체 외 처리된 인간 각막, 및 이들의 대응하는 대조군은 나노 압입 검사를 받았다.

미처리 대조군과 비교할 때 1주 생체 내 처리된 쥐 각막은 경도 또는 탄성에 유의한 증가를 보이지 않았다(도 15). 3주 생체 내 처리된 각막에서, 처리된 눈과 대조군 눈 사이에 명백한 차이가 있었다. 각각의 각막은 8회까지 검사하였으며 결과 얻은 하중 변형 그래프는 우수한 재현성을 보였다(도 16). 성장 인자 처리에 노출된 오른쪽 눈에서, 경도 및 감소된 탄성률 모두 현저히 더 높았다. 또한, 대조군 배지 또는 연골 발생 분화 배지에서 6주간 생체 외 배양된 공모양 각막의 대응하는 쌍은 동일한 생체역학적 검사를 받았다. 다시 한번, 검사는 처리된 각막에서 경도 및 탄성률에서 유의한 증가를 밝혔다(도 17).

실시예 14: 성장 인자 및 스테로이드의 조합의 비교

각막의 각막 기질 세포의 연골 발생 분화에서 기타 성장 인자-스테로이드의 조합의 효능을 조사하기 위해서 양의 각막에 생체 외 연구를 수행하였다.

신선한 양의 눈은 오클랜드 식육가공업자(Auckland Meat Precessor)로부터 얻었다. 각막을 즉시 절제하고 포비돈-요오드(PVP-I) 및 및 소듐 티오설페이트 용액으로 세척하였다. 그 후 양의 각막 조직의 8 mm 디스크를 원형절제기를 사용하여 절단하였다. 1개의 양의 각막 디스크를 각 배양 조건에 3주간 두었다(표 5에 개략적으로 설명됨). 그 후 각막 디스크를 기관형 공기-액체 계면 배양 시스템에 놓았다.

간략하게, 건강한 조직의 외식편을 배양 배지와 CO₂가 풍부한 환경 사이의 계면에 0.4 μm 공극 세포 배양 삽입물(밀리셀, 프랑스 소재)에서 배양하였다. 각막 절편을 3 ml의 배양 배지가 있는 세포 배양 플레이트 삽입물 위에 상피가 위로 오게 놓았다. 배양 배지는 격일로 교환하였다. 사용된 기초 배지는 1% 안티-안티(항생제-항진균 용액) 및 1% 글루타맥스(GlutaMAX)™(지브코®)가 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)였다. 3주 종료 시, 각 각막 디스크를 4% 파라포름알데히드(PFA)에 1시간 고정하고 조직을 동결방지하기 위하여 수크로오스 용액으로 처리한 후 동결하고 절편으로 만들었다.

간략하게, 각막을 20% 수크로오스 용액에 4℃에서 5시간 담근 후 30% 수크로오스 용액으로 옮겨 조직이 가라앉을 때까지(대개 하룻밤) 4℃에서 유지하였다. 그 후 각막을 OCT(최적 절단 온도) 화합물에 매립하고 액체 질소에 담가 신속하게 동결하였다. 동결된 조직 블록을 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 대략 4-6개의 40 μm 두께의 크라이오스탯 절편을 수퍼프로스트™ 플러스 슬라이드 위에 고정하고 슬라이드를 필요할 때까지 -80℃에 보관하였다. 그 후 각막 절편을 콜라겐 II형에 대해 표지하였다.

면역조직화학 분석을 위해, 슬라이드를 실온에서 15-20분간 두었다. PBS를 사용하여 OCT를 세척해 내고 왁스 펜을 사용하여 조직 주변 부위에 경계를 표시하였다. 조직 슬라이스를 먼저 10% 정상 염소 혈청의 차단 용액과 1시간 인큐베이션한 후 생쥐 항 콜라겐 II 항체(밀리포어/MAB8887)와 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 그 후 슬라이드를 PBS 중에 3회 세척한 후 적당히 희석된 염소 항 생쥐 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 488 2차 항체(몰레큘라 프로브스®/A-11001)와 인큐베이션하였다. 2차 항체를 실온에서 2시간 두었다. 슬라이스를 핵 마커 4', 6'-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대비 염색하고 시티플루오르 안티페이드제에 고정하였다(프로사이테크, 호주 소재). 올림푸스 플루오뷰™ FV-1000 공초점 레이저 주사 현미경(405 nm, 473 nm, 및 559 nm 파장 레이저) 및 레이카 DMRA 형광 현미경을 사용하여 표지를 가시화하였다.

표 5는 본 연구로부터 결과들을 나타낸다. [도 20]은 각각의 조건에서 각막 절편에서 콜라겐 II형 표지의 대표적인 이미지를 보여준다.

<표 5>

결과는 TGFβ3과 덱사메타손의 조합이 시험된 조합 중 표적 세포로부터 바라는 반응을 유발한 유일한 조합이라는 것을 확인하였다(도 20, 패널 G-H). 기타 성장 인자-스테로이드 조합은 각막 기질 세포에서 콜라겐 II형에서 바라는 변화를 가져오지 못하였다(도 20, 패널 A-F). 또한, 결과는 양의 각막에서 각막 기질 세포의 리프로그래밍을 확인하였다(도 20, 패널 G-H).

이전 연구는 기타 성장 인자 및 기타 스테로이드 화합물이 각막 치료 및 복구에 적합하지 않다는 것을 보였다. TGFβ1 및 TGFβ2는 둘 다 섬유화 흉터를 생성한다(Carrington, Albon et al. 2006; Desmouliere, Chaponnier et al. 2005; Jester, Huang et al. 2002; Cowin et al. 2001; Shah et al. 1995). EGF는 연골 발생을 음성적으로 조절한다(Yoon 2000). 에스트로겐도 연골 발생을 음성적으로 조절한다(Kato & Gospodarowicz 1985). 히드로코르티손은 연골 발생 분화보다는 지방 발생 분화를 촉진한다는 것이 밝혀졌다(Ghoniem et al. 2015; Lee, Kuo et al. 2004). 상기 초기 연구는 각막의 각막 기질 세포의 연골 발생 분화 및 흉터 없는 각막의 치유를 함께 촉진하는 역할을 하는 TGFβ3 및 덱사메타손에 대해 본 결과들의 중요성을 보여준다.

실시예 15: TGFβ3 및 덱사메타손의 투여량의 비교

생체 내 연구 전에, 생체 외 처리에 대해 여러 유효량을 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 상기 두 인자를 변화하는 농도로 포함하는 배양 배지에서 양의 각막을 배양하여 TGFβ3 및 덱사메타손에 대해 용량 범위 연구를 수행하였다.

신선한 양의 눈을 얻어 각막을 절제하고 실시예 14에 나타낸 바와 같이 처리하였다. 1개의 양의 각막 디스크를 16가지 배양 조건의 각각에 3주간 두었다(도 21). 각막 디스크를 배양한 후 실시예 14에 나타낸 바와 같이 면역조직화학 및 현미경 분석을 받았다. [도 21]은 각각의 조건에서 각막 절편에서 콜라겐 II형 표지의 대표적인 이미지를 보여준다.

본 연구는 더 낮은 농도의 TGFβ3(2-4 ng/mL) 및 덱사메타손(1-10 nM)이 생체 외에서 더 낮은 효능을 보인다는 것을 밝혔다(도 21, 1열 및 2열). 더 높은 용량, 즉, 8-10 ng/mL TGFβ3 및 100-1000 nM 덱사메타손은 콜라겐 II형 침착을 유도하는데 효과적이었다(도 21, 3열 및 4열).

본 결과는 효과적인 농도로서 100 nM 덱사메타손 및 10 ng/mL TGFβ3의 사용을 확인하였다(도 21, 3열). 또한, 더 높은 농도의 덱사메타손(1000 nM, 즉, 400 ng/mL)이 효과적으로 나타났다(도 21, 4열). 본 연구에서 시험된 덱사메타손 농도는 시판되는 점안제에 사용되는 농도(즉, 1　mg/mL 덱사메타손)보다 상당히 낮았다는 것이 주목되었다.

실시예 16: 실험 관찰 및 결과의 개요

TGFβ1과 덱사메타손의 조합은 이전에 시험관 내에서 기원 세포가 연골 세포로 분화하도록 유도하는데 사용되었다(Diekman et al. 2009; Johnstone et al. 1998; Kolambkar et al. 2007; Winter et al. 2003). 다른 연구에서, 각막의 기질 세포의 부분 집단이 유사한 연골 발생 분화 조건하에서 연골 특이적 콜라겐 II로 구성된 바탕질을 생성한다고 밝혀졌다(Du, Funderburgh, Mann, SundarRaj, & Funderburgh 2005). 또한, TGFβ1 및 BMP2를 포함하는 연골 발생 분화 배지에서 4주 후에 공막 세포가 아그레칸을 포함한 연골 특이적 마커, 및 콜라겐 II형을 발현하였다고 보고되었다. 게다가, 인간 공막 세포가 쥐 연골 결함에 이식된 후에 생체 내에서 이들의 연골 발생 가능성을 보유한다는 것을 보였다(Seko et al. 2008). 공막과 각막 기질의 섬유아세포성 세포가 공통의 발생학적 기원을 공유한다는 것이 알려져 있다.

본원에서 나타낸 바와 같이, TGFβ3 및 덱사메타손을 포함하고 혈청이 없는 배양 배지에 접종된 각막 기질 세포는 세포 응집에 의해 2-3일 내에 자발적으로 세포 회전 타원체를 형성하였고 3주까지 상기 세포 클러스터는 연골 특이적 II형 콜라겐에 대해 양성으로 표지되었다. 초기에 TGFβ3 및 덱사메타손으로 처리시, I형 콜라겐 발현이 또한 증가하였다. 배지를 소 태아 혈청을 포함하는 대조군 배지로 변경하였을 때, 세포 클러스터는 단층의 세포로 분산되었다. 단층으로 성장하는 세포는 II형 콜라겐을 더 이상 발현하지 않았다. 상기 결과는 세포 응집 또는 환경이 콜라겐 II형 유도에 중요할 수 있다는 것을 시사한다.

특히, 혈청 포함 배지에서 섬유아세포로서 처음에 증식된 각막 기질 세포는 배지를 TGFβ3 및 덱사메타손을 포함하는 연골 발생 분화 배지로 변경하였을 때 콜라겐 II형을 분비하지 않았다. 이는 섬유아세포로서 일단 증식되면, 세포가 연골 발생 경로를 따라 분화하는 능력을 잃어버린다는 것을 시사한다. 이에 더하여, 펠렛으로서 연골 발생 분화 배지에서 3차원적인 배양물로 배양된 섬유아세포는 연골 특이적 콜라겐 II형을 발현하지 못하였다. 이 결과는 휴지의 각막 기질 세포 표현형 및 세포 응집이 연골 발생 분화에 중요하다는 것을 시사한다.

연골 발생 분화 배지에서 정상 및 원추각막의 각막의 생체 외 배양이 기질 층판을 따라 II형 콜라겐의 균일한 침착을 보였다는 것이 본원에서 밝혀졌다. 각막 기질 내의 모든 각막 기질 세포는 콜라겐 II형 표지와 관련되었으며, 이는 연골 발생 표현형으로의 리프로그래밍이 확률적이라는 것을 다시 한번 시사하며 시험관 내 세포 배양으로부터 얻은 결과가 기원 세포의 부분 집합의 증식의 결과로서가 아니라는 것을 확인해 준다. 게다가, 쥐에서 각막의 생체 내 처리는 생체 외 배양에서 나타난 것과 유사한 방식으로 II형 콜라겐의 침착을 일으켰다. 그러나 생체 내에서 처리될 때 각막의 전방 부분에서 II형 콜라겐의 면역표지가 더 강하게 나타났으며, 이는 가장 가능성 있게는 성장 인자가 안구 표면으로부터 기질의 전방 층으로 더 용이하게 확산한다는 것을 반영한다.

원추각막의 각막에서 각막 기질 세포 밀도에서 차이를 알아보는 연구는 세포 밀도에서 전체 감소를 보고하였다. 이 결과는 여기에서도 확인된다. 그러나 기질의 전방 부분에서 세포 밀도에서 현저한 감소를 보고한 다른 연구(Hollingsworth, Efron, & Tullo 2005; Ku et al. 2008; Mencucci et al. 2010; Niederer et al. 2008)와 달리, 여기서 결과는 미처리된 원추각막의 각막의 기질의 후방 부분에서 각막 기질 세포 밀도에서 현저한 감소를 또한 나타낸다. 원추각막에서, 각막의 일반적인 박막화가 존재한다. 그러나 이것이 각막 기질 세포의 아폽토시스 및 후속적인 ECM의 생산 감소에 의한 것인지 또는 각막 기질 세포 아폽토시스가 각막 박막화 과정에 2차적인 것인지는 알지 못한다.

본원에서 나타낸 바와 같이, TGFβ3 및 덱사메타손을 포함하는 연골 발생 배지에서 배양된 원추각막의 각막의 처리된 절반은 대조군과 비교할 때 각막 기질 세포 밀도가 증가하였다. 게다가, 기질의 후방 영역은 각막 기질 세포에 의해 재증식된 것처럼 보였다. 또한, 처리된 절반의 각막 기질 세포는 현저하게 큰 핵 및 여러 세포 돌기를 가지며 더 건강해 보이는 것 같았다. 이는 2가지 인자로의 처리가 아마도 각막 기질 세포가 기질, 특히 각막 기질 세포가 없는 후방 부분을 증식하고 재증식하도록 유발하였다는 것을 나타낸다.

원추각막에 대한 현재 치료법 중 하나인 콜라겐 교차결합은 결과적으로 기질의 전방 부분에서 초기 기간의 각막 기질 세포의 아폽토시스를 일으킨다. 그 후 이는 각막 기질 세포에 의한 기질의 재증식 기간이 뒤따른다. 각막 기질 세포의 세포 사멸은 일반적으로 상처에 반응하여 나타나고, 교차결합 경우에 UVA-유도 세포 손상의 결과로서 이해된다. 이 아폽토시스 반응은 추가의 염증으로부터 각막을 보호하기 위해 발전되었다고 생각된다(Wilson, Netto, & Ambrosio 2003).

여러 달까지 지속될 수 있는 기질 혼탁은 또한 교차결합 치료 후에 관찰된다. 이는 결과적으로 각막 미세구조의 변경을 일으키는 콜라겐 지름 및 콜라겐 섬유 사이의 간격의 증가에 기인하였다. 대부분의 연구는 치료 후 6-12개월 사이에 각막 혼탁의 감소를 보고하였다(Greenstein, Fry, Bhatt, & Hersh 2010; Mazzotta et al. 2008). 교차결합 후 수행된 각막의 여러 임상 관찰이 있었지만, 각막 혼탁 및 치료의 가능한 다른 후속 효과의 원인과 관련하여 분명히 규정되지 않고 있다. 각막이 재증식되고 투명해지는데 수개월이 걸린다는 사실은 교차결합이 기질 내에서 상처 치유 반응을 유발하고 있을 수 있다는 것을 시사한다.

본 연구에서, 심지어 장기간(8주까지) 시험관 내 및 생체 내 처리 시에도 각막 혼탁의 증거는 존재하지 않는다. 이는 아마도 기존의 콜라겐 층판을 따라 균일한 층에 콜라겐 II의 침착에 기인한다. 콜라겐 III형(섬유화와 관련됨)의 침착 및 알파-평활근 액틴(근섬유 아세포 형성 과정에서)은 혼탁 및 흉터를 일으킨다. 이들 둘 다는 각막 상처 형성 과정에서 발견된다. 이들 단백질 모두 처리된 각막에서 발현되지 않으며 이는 흉터를 일으킬 수 있는 상처 치유 캐스케이트가 유발되지 않고 있다는 것을 시사한다.

본원에 기재된 바와 같이, II형 콜라겐 mRNA 발현의 정량적 측정은 이의 발현이 TGFβ3 및 덱사메타손의 중단시 유의하게 낮아졌다는 것을 보였다. 이는 각막 기질 세포의 리프로그래밍이 불가역적이지 않으며 ECM에서 II형 콜라겐의 후속적인 침착이 가능하게는 제어될 수 있다는 것을 시사한다. 이는 억제 불가능한 ECM 침착을 유도하는 것이 바람직하지 않을 것이기 때문에 치료 방법의 개발에 중요하다.

나노 압입은 눈에서 원추각막(각막 이상증) 및 라식 후 확장증을 위한 교차결합과 같은 수술 후 치료 방법의 평가에 이용되어 왔다. 인간 사체 각막에 수행한 한 연구에서, 콜라겐 교차결합이 전방 각막 기질에서 탄성률에 있어 2배 감소를 일으켰지만, 후방 기질은 치료에 의해 영향받지 않았다는 것을 확인하였다(Dias, Diakonis, Kankariya, Yoo, & Ziebarth 2013). 본 연구에서, 전방 각막의 탄성을 측정하였다. 또한, 본 연구에서 결과는 후방 기질의 각막 기질 세포 밀도가 TGFβ3 및 덱사메타손 처리된 각막에서 변경되었다는 것을 나타낸다.

나노 압입은 각각의 콜라겐 원섬유의 특성을 측정하지 못하지만, 이는 콜라겐 교차결합에서 후속적인 증가를 보이는 콜라겐 II 침착 시 변경될 각막의 고유의 탄성 특성에서 변화를 측정할 수 있다. 기질 내에서 구조적 차이는 생체역학적 특성에서 상응하는 차이에서 반영된다. 여기서 결과는 성장 인자 처리된 쥐 각막에서 탄성률 및 경도의 거의 3배 증가가 있었다는 것을 보여준다. 상기 결과는 처리가 결과적으로 각막에서 탄성이 더 높고 강성이 더 커지게 한다는 것을 나타낸다. 탄성률은 탄력적으로 변형되는 것에 대한 물질의 저항의 기준이라서 더 높은 탄성률은 물질이 더 변형하기 어렵다는 것을 나타낸다. 본 연구에서, 1주 처리된 각막과 비교할 때 3주 처리된 각막에서 경도 및 탄성률의 유의한 증가는 적어도 2-3주 처리가 II형 콜라겐의 검출 가능한 층의 침착에 필요하다는 것을 나타내는 면역조직화학적 표지 결과와 일치한다.

유전자 발현 연구 및 생체 역학적 검사와 결합된 면역조직화학적 표지 결과는 완전한 각막 내 각막 기질 세포가 TGFβ3 및 덱사메타손으로 처리에 의해 연골 발생 경로를 따라 재프로그램밍이 가능하다는 것을 보여준다. 조합된 TGFβ3 및 덱사메타손 처리에 의한 리프로그래밍은 확률론적이며 결과적으로 각막이 강성이 더 크고 탄성이 더 커지도록 성장 인자 처리 기간을 통해 제어될 수 있다. 특히, 두 제제 둘 다의 투여가 필요하다. TGFβ3 및 덱사메타손을 별개로 시험할 때 각막 기질 세포에서 콜라겐 II형 생산이 전혀 관찰되지 않는다. 따라서, 신규 치료법은 본원에 기재된 바와 같이 TGFβ3 및 덱사메타손의 투여에 의해, 생체 내 조직 공학을 이용하여 원추각막 및 기타 눈의 병태에 제안된다.

실시예 17: 각막의 재성형을 조사하기 위한 대동물 모델

양 모델에서 최적의 요법을 전달하면서 각막의 재성형

각막의 재성형을 증명하기 위해 대동물을 이용하여 추가의 실험을 수행하였다. 본 실험을 위해, 대동물 모델을 사용하여 처방 콘택트렌즈를 착용하도록 하였다. 양의 눈이 인간의 눈과 크기 및 생리가 유사하기 때문에 양을 모델 동물로서 사용한다. 또한, 수용 시설은 링컨 대학교(Lincoln University, 크리스트처어치 소재)에서 이용 가능하다. 또한, 양은 온순한 성질을 보이며 다루기 쉽다고 알려져 있다.

수용 시설에서 표준 운용 규정에 따라 양에게 진정제를 먹였다. 설치류 용량 최적화 연구를 기초로 하여 최적의 TGFβ3 및 덱사메타손 농도(부피 규모)의 점안 제제를 오른쪽 눈에 주입한 후 각막 인탁스(INTACS)®(또는 유사한 공막 고리)를 넣어 콜라겐 침착 과정에서 각막의 바라는 곡률을 유지하였다(도 18). 3주 기간에 1일 1회 또는 2회 점안제를 계속하여 투여하였다(설치류 최적화 연구에서 결정된 바와 같이). 그 후 인탁스®를 제거하고 동물은 추가 3주 또는 6개월간 계속하여 수용한다.

치료 전 및 치료 종료 시(인탁스®를 제거할 때), 각막 두께 및 곡률을 측정한다. 휴대용 각막 후도계를 사용하여 생체 내에서 처리 vs 대조군 반대쪽 각막의 각막 두께의 변화를 확인한다. 휴대용 펜타캠®을 사용하여 치료 전과 후에 양의 눈의 각막 곡률뿐 아니라 각막 두께를 측정한다(도 19(E) 및 (F)). 각막 측정은 렌즈 제거 후 3주에 최종(가장 정확한) 펜타캠 ® 측정으로 다시 반복한다. 이는 동물을 죽인 후에 그러나 설치류 각막에 대해 상기에 기재된 면역조직학적 및 생체역학적 분석을 위한 눈의 제거에 앞서 측정한다. 만일 양이 하드 콘택트렌즈를 견디지 못할 것 같은 경우에는(감염, 염증 또는 과민성의 징후), 연구는 렌즈 없이 지속하여 II형 콜라겐 침착 및 분포, 및 생체역학적 특성과 같은 주요 매개변수를 완료하도록 한다.

결과를 고려하여, 근시를 포함한 보편적인 각막 결함의 치료법을 제공하는, 각막을 영구적으로 재성형하고 안정화하는 단단한 기체 투과성 오르토K(OrthoK) 콘택트렌즈(또는 유사한)를 병용하여 본원에서 상세하게 기재된 바와 같은 생체 내 조직 공학을 이용할 것을 제안한다.

참고 문헌

당업자는 본원에 기재된 실시양태 또는 측면과 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 결과를 달성하는 이후의 변형, 치환, 및/또는 변이가 본 발명의 상기 관련된 실시양태 또는 측면에 따라 이용될 수 있다는 것을 본 개시 내용으로부터 쉽게 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 그 범위 내에 본원에 개시된 과정, 제품, 물질의 구성, 화합물, 수단, 방법 및/또는 단계의 변형, 치환 및 변이를 포함하고자 한다.

본 명세서에 인용된 특허 및 특허 출원을 포함한 모든 참고 문헌은 이로써 참고로 포함된다. 어떤 참고 문헌도 선행 문헌이 된다고 인정하는 것은 아니다. 또한, 어떤 문헌에 대한 논의도 상기 참고 문헌이 뉴질랜드 또는 어떤 기타 국가에서 당 업계에 보편적인 일반적 지식의 일부를 이루는 것이라고 인정하는 것은 아니다.

SEQUENCE LISTING <110> Auckland UniServices Limited Greene, Carol Ann Greene, Colin Sherwin, Trevor <120> OPHTHALMIC COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREFOR <130> 901 WO1 <150> NZ 705727 <151> 2015-03-05 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide construct <400> 1 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 1 5 10 15 Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45 Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60 Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95 Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110

Claims (46)

1. (i) 각막의 박막화 또는 불규칙성과 관련된 병태를 치료 또는 예방하거나; (ii) 각막의 결함과 관련된 굴절 이상을 치료 또는 예방하기 위한, TGFβ3 폴리펩티드, 및 덱사메타손 또는 이의 임의의 염을 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 덱사메타손은 덱사메타손 포스페이트인 조성물.
3. 제1항에 있어서, (a) 조성물은 적어도 8 ng/ml의 TGFβ3 폴리펩티드, 또는 10 내지 100 ng/ml의 TGFβ3 폴리펩티드를 포함하고/하거나; (b) 조성물은 적어도 100 nM의 덱사메타손, 또는 40 내지 4000 ng/ml의 덱사메타손을 포함하는 것인 조성물.
4. 제1항에 있어서, (a) 조성물은 점안제로서 제제화되고/되거나; (b) 조성물은 젤란 검을 사용하여 제제화되는 것인 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 조성물은 1일 1회 또는 1일 2회 투여용으로 제제화되고/되거나; (b) 조성물은 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제와 동시 투여를 위해 제제화되고/되거나; (c) 조성물은 하나 이상의 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리의 사용과 함께 투여하기 위해 제제화되는 것인 조성물.
6. 제5항에 있어서, 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제는 마취제, 항염증제, 항균제, 및 윤활제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
7. 제5항에 있어서, (a) 하나 이상의 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물에 의한 처리 동안 및/또는 후에 각막 형상을 성형 또는 유지하기에 적합하고/하거나; (b) 하나 이상의 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물을 위한 담체로서 또는 조성물 용리 장치로서 작용을 하기에 적합한 것인 조성물.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 경우, 조성물은 각막 콜라겐 교차결합과 함께 투여하기 위해 제제화되거나; (ii)의 경우, 조성물은 굴절 교정 수술 전 또는 후에 투여하기 위해 제제화되는 것인 조성물.
9. 제8항에 있어서, 조성물의 투여는 교차결합의 전 및/또는 후에 이루어지는 것인 조성물.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 병태는 원추각막, 기질 이상증, 근시, 및 난시로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; (b) 굴절 이상은 근시, 원시, 난시, 및 노안 중 하나 이상과 관련되는 것인 조성물.
11. (i) 각막의 박막화 또는 불규칙성과 관련된 병태를 치료 또는 예방하거나; (ii) 각막의 결함과 관련된 굴절 이상을 치료 또는 예방하기 위한, TGFβ3 폴리펩티드, 및 덱사메타손 또는 이의 임의의 염을 포함하는 조성물을 포함하는 키트.
12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리를 추가로 포함하는 키트.
13. 제12항에 있어서, 하나 이상의 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 (a) 조성물에 의한 처리 동안 및/또는 후에 각막 형상을 성형 또는 유지하기에 적합하고/하거나; (b) 조성물을 위한 담체로서 또는 조성물 용리 장치로서 작용을 하기에 적합한 것인 키트.
14. 제11항에 있어서, 덱사메타손은 덱사메타손 포스페이트인 키트.
15. 제11항에 있어서, (a) 조성물은 적어도 8 ng/ml의 TGFβ3 폴리펩티드, 또는 10 내지 100 ng/ml의 TGFβ3 폴리펩티드를 포함하고/하거나; (b) 조성물은 적어도 100 nM의 덱사메타손, 또는 40 내지 4000 ng/ml의 덱사메타손을 포함하는 것인 키트.
16. 제11항에 있어서, (a) 조성물은 점안제로서 제제화되고/되거나; (b) 조성물은 젤란 검을 사용하여 제제화되는 것인 키트.
17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 조성물은 1일 1회 또는 1일 2회 투여용으로 제제화되고/되거나; (b) 조성물은 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제와 함께 제제화되는 것인 키트.
18. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 키트는 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제를 포함하고/하거나; (b) 키트는 콘택트렌즈 용액을 포함하고/하거나; (c) 키트는 사용 설명서를 포함하는 것인 키트.
19. 제17항에 있어서, 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제는 마취제, 항염증제, 항균제, 및 윤활제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
20. 제18항에 있어서, 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제는 마취제, 항염증제, 항균제, 및 윤활제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
21. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 원추각막, 근시, 원시, 난시, 노안, 및 기질 이상증 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위한 것인 키트.
22. (i) 각막의 박막화 또는 불규칙성과 관련된 병태를 치료 또는 예방하거나; (ii) 각막의 결함과 관련된 굴절 이상을 치료 또는 예방하기 위한,
    (A) TGFβ3 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 및 (B) 덱사메타손 또는 이의 임의의 염을 포함하는 조성물을 포함하는, 동시 투여를 위한 치료 조합물.
23. 제22항에 있어서 덱사메타손은 덱사메타손 포스페이트인 치료 조합물.
24. 제22항에 있어서, (a) TGFβ3 폴리펩티드는 적어도 8 ng/ml, 또는 10 내지 100 ng/ml로 포함되고/되거나; (b) 덱사메타손은 적어도 100 nM, 또는 40 내지 4000 ng/ml로 포함되는 것인 치료 조합물.
25. 제22항에 있어서, (a) 조성물은 점안제로서 제제화되고/되거나; (b) 조성물은 젤란 검을 사용하여 제제화되는 것인 치료 조합물.
26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 치료 조합물은 1일 1회 또는 1일 2회 투여에 적합하고/하거나; (b) 치료 조합물은 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제와 동시 투여에 적합하고/하거나; (c) 치료 조합물은 하나 이상의 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리의 사용과 함께 투여되기에 적합한 것인 치료 조합물.
27. 제26항에 있어서, 눈을 위한 하나 이상의 추가의 제제는 마취제, 항염증제, 항균제, 및 윤활제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 조합물.
28. 제26항에 있어서, (a) 하나 이상의 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물에 의한 처리 동안 및/또는 후에 각막 형상을 성형 또는 유지하기에 적합하고/하거나; (b) 하나 이상의 콘택트렌즈, 각막 삽입물, 각막 이식편, 또는 기질 내 고리는 조성물을 위한 담체로서 또는 조성물 용리 장치로서 작용을 하기에 적합한 것인 치료 조합물.
29. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 경우, 치료 조합물은 각막 콜라겐 교차결합과 함께 투여되기에 적합하거나; (ii)의 경우, 치료 조합물은 굴절 교정 수술 전 또는 후에 투여되기에 적합한 것인 치료 조합물.
30. 제29항에 있어서, 치료 조합물의 투여는 교차결합의 전 및/또는 후에 이루어지는 것인 치료 조합물.
31. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 병태는 원추각막, 기질 이상증, 근시, 및 난시로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; (b) 굴절 이상은 근시, 원시, 난시, 및 노안 중 하나 이상과 관련되는 것인 치료 조합물.
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