CN108728418A - 一种鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型的制备方法及应用，属于基因功能研究技术领域。本发明将活体电转基因技术和组织片培养相结合，以进行鸡胚中枢神经系统单个神经元的基因功能研究，具体是将鸡胚脊髓或者视顶盖组织经活体电转基因技术，得到转基因组织块，将其切片后对组织切片进行培养，培养后进行外源基因功能研究。使用本发明的方法培养得到的组织片上可以清晰的观察到单个神经元完整的结构，并且神经元轴突的投射更具有规律性，本发明培养的组织片没有经过酶的消化，同时还受到组织片其他细胞及相关分泌因子的影响，更接近活体，组织片上的单个神经元可以模拟活体内神经元的动态变化的过程。

Description

一种鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型的制备方法 及应用

技术领域

本发明涉及一种鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型的制备方法及应用，属于基因功能研究技术领域。

背景技术

器官型组织片培养技术是一种有效的体外组织培养方法，培养的组织片能够保持几乎正常的细胞之间的连接，并且保持几乎正常的生理功能和形态结构特点，因此，避免了常规的细胞培养和活体内实验研究的缺点。器官型组织片培养为中枢神经系统发育过程的研究提供了一种很好的方法。该项技术真正的取得突破性进展是在1981年(BH(1981)Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.J NeurosciMethods 4:329-342)开发的滚管式培养。采用该培养方法，不同部位的脑片可以培养好几周的时间。在1991，Stoppini等(Stoppini L,Buchs PA,Muller D(1991)A simple methodfor organotypic cultures of nervous tissue.J Neurosci Methods 37:173-182)利用带有透明并且具有一定大小孔径薄膜的培养皿进行大鼠海马的培养，取得很好的结果，并建立了一种简单的器官型脑片培养技术。培养的脑片能够成功的模拟活体内神经元发育的过程，而且能够提供和活体内器官一样的实验结果。因此，该方法已经被应用到许多神经生物学研究领域。

目前，器官型脑片培养技术只见于小鼠、大鼠、兔子和猴子等模式动物的报道(Mewes A,Franke H,Singer D(2012)Organotypic brain slice cultures of adulttransgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.PLoS One 7:e45017；Harwell CS,Coleman MP(2016)Synaptophysin depletion and intraneuronal Aβinorganotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice.MolNeurodegener 11:44；Minami N,Maeda Y,Shibao S,Arima Y,Ohka F,Kondo Y,MaruyamaK,Kusuhara M,Sasayama T,Kohmura E,Saya H,Sampetrean O(2017)Organotypic brainexplant culture as a drug evaluation system for malignant brain tumors.CancerMed6:2635-2645；Lee NM,Chae SA,Lee HJ(2017)Effects of neural stem cell mediaon hypoxic injury in rat hippocampal slice cultures.Brain Res 1677:20-25)，没有关于鸡胚器官型脑片培养的研究报道。鸡胚是一种很好的实验模型动物，在发育生物学和神经生物学研究领域被广泛应用，特别是鸡胚中枢神经系统发育过程。鸡胚作为模式动物有其自身的优点，如来源丰富、易于操作和容易获得材料。随着鸡胚活体电转基因技术的出现，在鸡胚发育过程实现鸡胚中枢神经系统外源基因的异常表达成为可能，但是外源基因异常表达后对中枢神经系统发育的影响，目前只见于活体和细胞水平的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型的制备方法，该方法能够在体外培养动物组织，模拟动物体内组织的生长发育过程，为鸡胚脊髓发育过程中外源基因异常表达研究提供了一种新方法。

本发明还提供了上述动态研究模型制备方法的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型的制备方法，包括如下步骤：

1)采用活体电转的方法将含有目的基因的质粒转入鸡胚脊髓或者鸡胚视顶盖组织中，得转基因组织块；

2)将转基因组织块用凝胶进行包裹，得包裹块；将所述包裹块切片，得到组织切片；将得到的组织切片进行培养、观察。

具体的，将组织切片转移到悬挂式细胞培养皿的微孔膜上，然后将悬挂式细胞培养皿转移至普通细胞培养皿中，加入细胞培养基进行培养。

在电转脊髓后，继续培养胚胎发育至5.5-6.5天时进行取材切片，以研究目的基因在单个神经元中的动态功能；在电转视顶盖组织后，继续培养胚胎发育至11-13天时进行取材切片，以研究目的基因在单个神经元中的动态功能。

本发明中建立了一种鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型制备方法，该方法是基于鸡胚活体原位电转基因技术所建立，该方法适合鸡胚发育过程中枢神经系统单个神经元的动态学变化的研究，也为鸡胚中枢神经系统发育过程外源基因异常表达的研究提供了一种新的策略。

当所述转基因组织块为视顶盖组织时，所述包裹的步骤为：将凝胶块粘贴到组织切片机的托盘上；然后在凝胶块一侧切出个槽，将鸡脑嗅球端切除部分组织，嗅球端朝下，视顶盖放入凝胶的槽中，也粘贴于组织切片的托盘上。本发明中在包裹视顶盖组织时，凝胶块预先制作，因此可以排除热的凝胶液对于组织片细胞的伤害。

所述包裹也可以为包埋，具体的步骤为：将转基因组织块用液态琼脂进行包埋，迅速冷却后根据组织大小进行修剪。所述液态琼脂在包埋前预冷至39-41℃，优选的预冷到40℃。

所述凝胶可以为琼脂或者琼脂糖，优选为3.5-4.5％的琼脂，进一步优选为4％的琼脂。浓度太高会导致琼脂块脆性增加，浓度太低硬度不够，起不到包埋固定的作用。

所述组织切片的厚度为250-350μm，优选为300μm。切片太薄操作难度增加，容易破碎，组织切片太厚一个组织只能切到很少的几个切片。

所述切片后将组织切片置于人工脑脊液中。所述切片时在切片机盒中加入冰块。这样可以在切片的过程中防止组织片的干燥和变性。

所述细胞培养基由如下体积份数的组分组成：Neurobasal 48份、Serum-FreeSupplement 1份、GlutaMAX 0.5份和penicillin-streptomycin 0.5份。

人工脑脊液的配方为：120mM NaCl，3.5mM KCl，1.3mM MgCl₂，2.5mM CaCl₂，1.25mMNaH₂PO₄，25.6mM NaHCO₃和10mM glucose。

所述活体电转的步骤为：

1)将所述含有目的基因的质粒用显微注射毛细玻璃针注射到培养2.5-3.5天的鸡胚脊髓中；或者将所述含有目的基因的质粒用显微注射毛细玻璃针注射到培养4-5天的鸡胚视顶盖组织；

2)将电极放在己注射质粒的脊髓或视顶盖组织两侧，进行电转。

具体的，在电转时将0.25μg/μL的质粒0.15-0.25μL用显微注射毛细玻璃针在体视显微镜下注射到培养2.5-3.5天的鸡胚活体脊髓中；或者将0.25μg/μL的质粒0.45-0.55μl用显微注射毛细玻璃针在体视显微镜下注射到培养4-5天的鸡胚视顶盖组织。

在电转脊髓时，使用的参数为总电击5-7次，电压为17-19V，每次电击55-65ms，间隔95-105ms；在电转视顶盖组织时，使用的参数为总电击5-7次，电压为14-16V，每次电击55-65ms，间隔95-105ms。

上述的制备方法可以用于目的基因在单个神经元中的动态功能的研究。

具体的，在电转脊髓后，继续培养胚胎发育至5.5-6.5天时进行取材切片，以研究目的基因在单个神经元中的动态功能；在电转视顶盖组织后，继续培养胚胎发育至11-13天时进行取材切片，以研究目的基因在单个神经元中的动态功能。

本发明的有益效果是：

本发明中的鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型的制备方法，是一种将活体电转基因技术和组织片培养相结合进行基因功能研究的新方法，可以对外源基因在鸡胚中枢神经系统发育过程中的功能在单个细胞水平上进行分析，能够实现鸡胚中枢神经系统发育过程外源基因异常表达对神经元迁移和轴突形成的影响的研究。该技术为外源基因在鸡胚中枢神经系统对神经元的影响提供了一种新的研究方法，是介于活体与细胞之间的一种研究技术。

本发明的实验过程中在培养的组织片上可以观察单个神经元的迁移和轴突路径选择等指标；尽管培养的环境和体内环境存在差别，但培养的组织片上的单个神经元可以模拟活体内神经元的动态变化的过程。

对于普通的体内组织切片来说，在体内组织切片中很难观察到完整的单个神经元的结构，但是在本发明培养的组织片上可以清晰的观察到单个神经元完整的结构。与分离后培养的神经元相比，分离后培养的神经元与本发明组织片培养中的神经元相比会更长，但组织片中的神经元轴突的投射更具有规律性。本发明培养组织片上的神经元与分离的单个神经元相比，没有经过酶的消化，同时还受到组织片其他细胞及相关分泌因子的影响，更接近活体。

附图说明

图1为实施例1的鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型制备方法各个阶段操作图，A、B：鸡胚培养；C：去除3-4ml蛋清；D：注射质粒；E：活体电转；F：鸡胚密封培养；G-I：取材；J-K：GFP阳性表达脊髓的收集；L：组织包埋到4％的琼脂中；M：组织切片；N-O：组织片转移到悬挂式培养皿膜上；标尺＝5mm；

图2为实施例2的鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型制备方法各个阶段操作图；A：质粒注射；B：电击；C：电转后培养到E12时的鸡脑；D-F：GFP阳性表达鸡脑的收集；G：4％琼脂组织块；H-I：侧面切出沟槽的琼脂块；J：4％琼脂包埋的组织块；K：组织切片；L：组织片转移到悬挂式培养皿膜并转移到30mm培养皿内；标尺＝5mm；

图3为实施例1和实施例2中组织切片培养示意图；A-F：脊髓组织片培养；G-I：视顶盖组织片培养；J：组织片培养模式图；标尺＝5mm；

图4为实施例1中培养的脊髓组织片与普通活体组织切片组织结构和神经元形态结构的差异对比图；A-C：E6时对照组pCAGGS-GFP阳性表达的组织切片，A：DAPI染色的细胞核，B：GFP表达结果，C：叠加的图；D-F：E6时组织切片培养48h后pCAGGS-GFP阳性表达的组织；D：DAPI染色的细胞核；E：GFP表达结果，F：叠加的图；G-L：脊髓中培养组织片单个神经元，G：DAPI染色的细胞核，H：GFP阳性表达的组织，I：叠加图；J为G图中的局部放大图，K为H中的局部放大图，L为I中的局部放大图；缩写：sp为脊髓，drg为背根神经节；B-C、E-F中的箭头表示连合纤维，标尺，200μm；

图5为实施例2中培养的视顶盖组织片与普通活体组织切片组织结构和神经元形态结构的差异对比图；A-C：对照组，E12时pCAGGS-GFP阳性表达的组织切片；A：DAPI染色的细胞核；B：GFP表达结果，C为A和B放大后的叠加图；D-F：E12时pCAGGS-GFP阳性表达的组织培养48h后的结果；D：DAPI染色的细胞核，E：GFP表达结果，F为D和E放大后叠加的结果；G-N：视顶盖F图的系列成层扫描的结果；C：箭头表示单个神经元；F-N：箭头表示不同层单个神经元；标尺，200μm。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例中受精种鸡蛋购买于种鸡场，在恒温恒湿培养箱(HWS-150，精宏，中国)培养箱中进行培养，培养温度为37.8℃，相对湿度为65％。当胚胎发育至E2.5时进行实验，最晚在E12时进行取材，每组实验至少收集5个胚胎。报告基因pCAGGS-GFP质粒(绿色荧光蛋白)由本实验室惠存。实验中以质粒中绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因，所有质粒(pCAGGS-GFP)采用质粒大提试剂盒(康为，中国)提取，并采用5M的NaCl和异丙醇进行浓缩，并采用纯净水溶解，终浓度为2mol/L。

除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。

实施例1

本实施例中鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型的制备方法，包括如下步骤：

1、脊髓活体电转获得转基因组织块：

活体电转方法具体操作过程：受精鸡蛋水平放置在培养箱培养到E2.5时(图1，A、B)，在钝头端开孔用注射器去除3-4mL蛋清，侧面正上方用剪刀开口，直径大小1-2cm(图1-C)。在0.25μg/μL的pCAGGS-GFP质粒加入0.01％快绿染液，玻璃毛细管针吸取混合好的质粒，在体视显微镜下将0.2μL质粒注射到脊髓腔(图1-D)，将电转仪的电极置于脊髓两侧马上进行电转(图1-E)，电转参数为电压18V，电极时间60ms，间隔100ms，电击6次。电转后移除电极将开口用医用胶布密封(图1-F)。将鸡胚放回培养箱继续培养到E6时，准备取材并切片培养。

2、组织切片体外培养：

1)在胚胎发育到E6时，选择体视荧光显微镜下观察报告基因GFP胚胎(图1，G-I)并切取GFP阳性部位用于切片(图1-J、K)。将选择的组织用4％琼脂进行包埋，包埋前将琼脂预冷到40℃(图1-L)。

2)在振荡切片机中(VT1200S,Leica,Germany)进行切片，切片厚度为300μm，切片后迅速转移到30mm悬挂式培养皿膜上(PICM03050,Millipore)(图1，M-O)，将皿转移到30mm培养皿中，加入1ml培养基进行培养。

培养基配方：48ml of Neurobasal(Thermo Fisher,USA)，1ml的Serum-Free Supplement(50X)(Thermo Fisher)，0.5ml的1％GlutaMAX(Thermo Fisher,USA)和0.5ml的1％penicillin-streptomycin(Sigma)混合。

切片过程为了防止组织片干燥和变性，切片机盒中加入冰块，并在切片盒中加入人工脑脊液(Artificial cerebrospinal fluid，ACSF)。

ACSF的培养配方为：120mM NaCl，3.5mM KCl，1.3mM MgCl₂，2.5mM CaCl₂，1.25mMNaH₂PO₄，25.6mM NaHCO₃和10mM glucose。

3)将培养皿转移到二氧化碳培养箱中在37℃和5％CO₂培养条件下进行培养(图3，B、H)，组织片培养24h后更换培养液，以后每隔48h更换培养液一次组织片可以持续培养7d时间。培养组织形态学结构和神经元在48h可以在激光共聚焦显微镜(Olympus ix81,Japan)下进行观察。

在脊髓切片培养过程中，当胚胎发育到E2.5时进行活体电转，继续培养当胚胎发育到E6时进行取材，在荧光显微镜下选择GFP阳性表达的胚胎，切取GFP阳性的区域进行切片(图3，A-F)。每个培养皿膜上可以放置6-8片组织进行培养(图3-A)，在组织片培养过程中组织片之间留出足够的空间，同时选择并保留GFP阳性表达的组织片(图3，B、C)。为了保证准确的实验结果膜上的组织片不能出现皱折，选择GFP只表达到脊髓一侧的组织(图3，D-F)。

实施例2

本实施例中鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型的制备方法，包括如下步骤：

1、视顶盖活体电转获得转基因组织块：

视顶盖活体电转具体方法：当鸡胚发育到E2.5时去除6mL蛋清，继续培养至E3.5时，用剪刀从侧面开口，开口大小为1-2cm。将0.25μg/μL的pCAGGS-GFP和0.01％快绿混合，在体视显微镜下采用玻璃管毛细针将0.5μL的质粒混合液注射到一侧视顶盖(图2-A)。电极分别置于视顶盖两侧进行电击(图2-B)。总电击6次，电压为15V，每次电击60ms，间隔100ms(图2-B)。电转后(CUY-21 Electroporator,Nepa Gene,Japan)，移除电极将鸡胚开口用医用胶布密封，继续培养到E12时，进行材料收集(图2-C)。

2、组织切片体外培养：

1)当电转后的胚胎发育到E12时，体视荧光显微镜下观察选择GFP阳性表达的胚胎(图2，D-F)。

在进行组织切片时可以采用两种模式，其一，将4％的琼脂冷却后根据GFP阳性表达鸡脑的大小修剪成长方体(图2-G)，并将修剪好的琼脂块用强力胶粘贴到组织切片机的托盘上(图2-G)。然后在一侧切出个槽(图2，H-I)，将鸡脑嗅球端切除部分组织，嗅球端朝下，视顶盖放入琼脂的槽中，用胶粘贴于组织切片的托盘上(图2-J)。本实施例中采用该种方式。

其二，将GFP阳性表达的鸡脑用4％的琼脂进行包埋，迅速冷却后根据组织大小进行修剪(图2-J)。

2)将粘贴好的组织块在振荡切片机(VT1200S,Leica,Germany)下进行切片，切片厚度为300μm，切片后将组织片转移到悬挂式组织培养皿薄膜上(PICM03050,Millipore)，进一步将皿转移到30mm培养皿中，计入1ml培养液进行培养(图2，K、L)。在切片过程中，为了保护组织的新鲜在切片机缓冲液盘中加入预冷处理的人工脑脊液(图2，K、L)。

培养基和人工脑脊液的配方同实施例1。

3)将培养皿转移到二氧化碳培养箱中在37℃和5％CO₂培养条件下进行培养(图3，B、H)，组织片培养24h后更换培养液，以后每隔48h更换培养液一次组织片可以持续培养7d时间。培养组织形态学结构和神经元在48h可以在激光共聚焦显微镜(Olympus ix81,Japan)下进行观察。

视顶盖组织切片培养过程，每个膜上放置2个组织片(图3-G)。在视顶盖组织片培养过程中，主要是观察被转染神经元的迁移及轴突的投射，因此，选择的组织片GFP应该准确的转染在室管膜区(图3，H-I)。在培养过程中，组织片上方没有浸入到培养液中，而下方是充分的与培养液接触，保证了组织片不会坏死(图3-J)。

通过以上两个实施例组织切片的培养我们得出了以下结果。

1、组织片培养过程中会失去组织在中枢神经系统原有的形态结构

培养的组织片与直接来自胚胎组织切片(图4，A-C)相比，最显著的差异是培养的组织片失去了原有的中枢神经系统的形态结构(图4，D-F)。在组织片培养48h后背根神经节的结构模糊，脊髓与周围组织边界变得模糊(图4-D)。

在视顶盖培养的组织片上也观察到同样的结果(图5，A-F)。胚胎发育过程视顶盖具有典型的层的结构(图5，A-C)。但是，在培养的组织片中边界变得模糊并且层的结构不清晰(图5，D-F)。

2、培养的组织片中神经元失去了严格的调控

在机体内神经元的迁移和轴突的投射是严格的受到多种因子调控的(图4，A-C)。在脊髓中，我们会观察到位于一侧的脊髓神经元纤维准确的投射到对侧(图4，B、C)。在组织片培养48h后，GFP阳性表达的神经元仍然在脊髓的一侧，但是，神经元迁移的方向和连合纤维的投射方向已经发生了改变(图4，E、F)。

3、组织片培养更适合单个神经元动态学的研究

在单个神经元研究中，培养的组织片中的神经元具有非常清晰的突起结构(图4，G-L；图5-F)。在共聚焦下可以观察到完整的单个神经元的结构(图5，G-N)。通常，在来自活体组织直接切片进行神经元观察中很难观察到完整的神经元的结构，因为神经元具有三维结构，在组织切片过程中通常会切除部分结构，使得无法观察到完整的神经元的结构(图5-C)。而在组织片培养过程中，神经前体细胞将进一步形成神经元，进而形成完整的轴突和树突的结构(图5-F)。虽然本发明培养的组织片比活体组织切片厚，在低倍镜下很难观察到完整的单个神经元的结构，但是，在共聚焦显微镜下通过成层扫描可以实现完整的神经元结构(图5，G-N)。另外，在组织片培养过程中，我们能够在显微镜下观察神经元动态性的变化，结合活体电转基因技术我们能够实现鸡胚中枢神经系统发育过程外源基因异常表达对神经元迁移和轴突形成的影响的研究。

4、讨论

在中枢神经系统发育过程，基因的异常表达会导致结构和功能的异常。在中枢神经系统基因功能研究过程中鸡胚是一种常用的动物模型。随着鸡胚活体电转基因技术的出现，在鸡胚中枢神经系统实现基因的异常表达成为可能。在中枢神经系统，神经元的迁移，轴突的投射，轴突路径的选择，神经回路的形成和神经网络的建立是研究的热点。

在此，本发明建立了一种鸡胚中枢神经系统活体电转基因技术与器官型脑片培养技术相结合进行外源基因功能研究的方法。在进行组织片培养之前在鸡胚脊髓或视顶盖中进行活体电转，实现外源基因的异常表达，当鸡胚发育到特定的阶段进行取材并进行组织切片进行培养。在培养的组织片上能够进行神经元形态和结构的观察。我们发现在组织片培养过程中会破坏组织片在活体内原有的形体结构，如脊髓中连合纤维神经元迁移发生改变，连合纤维的投射方向发生改变，视顶盖中失去了典型的层的结构。这种结果也是我们预期到的结果，因为，在组织片培养的过程中，组织是在培养基中进行培养，会失去各种因子对神经元的正确调控。神经元在培养基中存活的环境与活体内的环境存在很大差别，因此，许多功能不能完全反应活体内的功能，这也是进行组织片培养应该注意的问题。体外组织片培养与活体内组织的差异不仅在大体形态上，而且在更细微的结构上也存在差异，如树突的长度，树突上小棘的数量等。

从本发明实验结果中可以看到，在中枢神经组织片培养过程中，最适合单个神经元的研究。在培养过程中能够观察到单个神经元的完整的结构。尽管在组织片培养过程中失去了原有的活体内组织的形态结构，但是神经元仍然是在组织中，因此，实验过程中在培养的组织片上可以观察单个神经元的迁移和轴突路径选择等指标。尽管培养的环境和体内环境存在差别，但培养的组织片上的单个神经元可以模拟活体内神经元的动态变化的过程。在实验中我们对比了培养的组织片和体内组织切片，我们发现，在体内组织切片中很难观察到完整的单个神经元的结构，但是在培养的组织片上可以清晰的观察到单个神经元完整的结构。除此之外，在进行组织片培养之前进行活体电转，实现脊髓和视顶盖中外源基因的异常表达，在此基础上进行组织片培养，我们可以对外源基因在鸡胚中枢神经系统发育过程中的功能在单个细胞水平上进行分析。在前期的实验过程中，我们也对转染后的神经元进行分离培养。分离后培养的神经元与组织片培养中的神经元相比会更长，但组织片中的神经元轴突的投射更具有规律性。培养组织片上的神经元与分离的单个神经元相比，没有经过酶的消化，同时还受到组织片其他细胞及相关分泌因子的影响，更接近活体。总之，该方法提供了一种体外有效的单个神经元迁移及轴突形成研究的策略。

Claims (9)

1.一种鸡胚中枢神经系统单个神经元动态研究模型的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)采用活体电转的方法将含有目的基因的质粒转入鸡胚脊髓或者鸡胚视顶盖组织中，得转基因组织块；

2)将转基因组织块用凝胶进行包裹，得包裹块；将所述包裹块切片，得到组织切片；将得到的组织切片进行培养、观察。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：当所述转基因组织块为鸡胚视顶盖组织时，所述包裹的步骤为：将凝胶块粘贴到组织切片机的托盘上；然后在凝胶块一侧切出个槽，将鸡脑嗅球端切除部分组织，嗅球端朝下，视顶盖放入凝胶的槽中，也粘贴于组织切片的托盘上。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述凝胶为3.5-4.5％的琼脂。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述组织切片的厚度为250-350μm。

5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于：所述切片后将组织切片置于人工脑脊液中。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述活体电转的步骤为：

1)将所述含有目的基因的质粒用显微注射毛细玻璃针注射到培养2.5-3.5天的鸡胚脊髓中；或者将所述含有目的基因的质粒用显微注射毛细玻璃针注射到培养4-5天的鸡胚视顶盖组织；

2)将电极放在己注射质粒的脊髓或视顶盖组织两侧，进行电转。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：在电转脊髓时，使用的参数为总电击5-7次，电压为17-19V，每次电击55-65ms，间隔95-105ms；在电转视顶盖组织时，使用的参数为总电击5-7次，电压为14-16V，每次电击55-65ms，间隔95-105ms。

8.如权利要求1所述的制备方法在研究目的基因在单个神经元中的动态功能中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：在电转脊髓后，继续培养胚胎发育至5.5-6.5天时进行取材切片，以研究目的基因在单个神经元中的动态功能；在电转视顶盖组织后，继续培养胚胎发育至11-13天时进行取材切片，以研究目的基因在单个神经元中的动态功能。