KR102414649B1

KR102414649B1 - 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드, 이의 제조 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102414649B1
Application number: KR1020217043158A
Authority: KR
Inventors: 씬 왕; 징 딩; 팅팅 우
Original assignee: 중산 호스피탈 푸단 유니버시티
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2018-03-07
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2038-03-07
Also published as: SG11201906820WA; CN107880109B; JP2020506711A; EP3569613A1; CN107880109A; KR20220003652A; JP6929949B2; US20210171595A1; US11479592B2; KR20190098268A; WO2019085366A1; EP3569613A4

Abstract

본 발명은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 제조방법을 제공한다. 또한, 신경 세포 손상을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 상기 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 용도를 제공한다. 또한, 저산소 뇌손상의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 상기 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 용도를 제공한다. 또한, 간질의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 상기 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 용도를 제공한다. 본 발명의 신규 EPO-유래된 펩타이드는 저분자량을 갖고 뇌-혈관 장벽을 투과할 수 있다. 또한, 인체에서 기능적 단백질에서 유래된 저분자 폴리펩타이드로서, 인체에 대해 다른 개발되거나 합성된 약물에 비하여 현저히 적은 부작용을 갖고, 따라서 우수한 임상적 적용 가능성을 갖는다. 만일 본 발명이 임성시험에 적용된다면, 중추신경계 질환을 예방 및 치료할 수 있는 신규 신경보호 약물이 될 수 있어, 신경 손상을 갖는 환자에 대한 새로운 치료적 방침을 제공할 수 있다.

Description

에리스로포이에틴-유래된 펩타이드, 이의 제조 방법 및 이의 용도{ERYTHROPOIETIN-DERIVED PEPTIDE, PREPARATION METHOD THEREFOR, AND USE THEREOF}

본 발명은 게놈 생물학 분야에 속하며, 에리스로포이에틴에 관련되며, 특히 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드, 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관련된다.

인간 수명의 연장과 함께 신경계 질환은 환자, 가족 및 사회에 점점 더 큰 부담이 되고 있다. 2016년 The Lancet은 세계 질병 부담 보고서 (GBD)의 새로운 세계 사망 원인 분석 보고서를 발표했는데, 상기 보고서는 뇌 혈관 질환으로 인한 사망 원인의 순위가 2015년에 다시 상승하여 인간의 죽음을 일으키는 두 번째 원인으로 부상했다. 중국에서는 뇌 혈관 질환이 중국 인구의 사망 원인과 장애의 주요 원인 중 하나이다. 유병율은 해마다 증가하고 있으며 환자의 연력이 낮아지는 경향이 있다. 또한 알츠하이머 병, 다른 유형의 치매, 간질 및 파킨슨 병과 같은 다른 신경계 질환의 발병율도 매년 증가하고 있으며 사망률은 1990년에서 2015년까지 20% 이상 증가하였다. 건강에 영향을 주고, 뇌 혈관 질환으로 대표되는 신경계 질환은 국가와 사회에 경제적인 부담을 안겨 주었다. 세계 보건기구 (World Health Organization, WHO)는 뇌졸중 및 심근 경색으로 인한 사망률 감소의 10% 중재를 위한 연간 지출을 약 250억 달러 감소시킬 것으로 기대하고 있다. 어떠한 면에서 신경계 질환은 의학적 문제 일뿐만 아니라 사회적 문제이기도 하다.

복잡한 병인 및 수많은 증상으로 인해 효과적인 약물 치료가 어려운 많은 종류의 신경계 질환이 있다. 저산소증 뇌증을 예로 들자면, 고압 산소 챔버는 뇌 조직의 산소 공급을 향상시킬 수 있지만 저조한 고혈압 환자 및 중환자에게 금기이며 2차 대뇌 혈관 수축으로 인한 부작용을 일으킬 수 있어, 임상 적용을 제한 할 수 있다. 허혈성 뇌졸중 질환을 예로 들면, 뇌허혈 후 에너지 대사 장애, 흥분성 혈소판 독성과 같은 일련의 병태 생리가 변화된다. 현재 혈전 용해만이 유일한 치료법이지만, 혈전 용해 요법의 시간 범위는 너무 짧기 때문에 소수의 환자만 혜택을 입는다. 또 다른 방법은 신경 세포의 죽음을 막고 허혈성 반음판에 신경 세포를 저장하는 신경 보호 치료이다. 현재, 보호 효과를 가질 수 있는 주요 신경 보호제는 글루타메이트 길항제, 항염증제, 칼슘 채널 차단제, 나트륨 채널 차단제, 칼륨 채널 활성화제, 자유 라디칼 제거제, GABA 수용체 길항제, 세로토닌 길항제, NMDA 수용체 길항제, 페노바르비탈 저온에서 마취를 유도하는 약물 등이 있다. 현재 동물 실험에서 1,000 가지가 넘는 신경 보호제가 효과적이며 100 가지가 넘는 약물이 임상 시험을 받지만 임상 효과는 거의 없다. 따라서 새로운 신경 보호제를 개발하는 것이 중요하다.

에리스로포이에틴 (EPO)는 초기에 임상적으로 사용되는 사이토카인으로, 신장에서 주로 생산되는 165개 아미노산으로 구성된 34kDa 글리코 단백질 호르몬이다. 과거에는 에리스로포이에틴이 임상의 빈혈 치료에 널리 사용 되었다. 최근에 연구에 따르면 에리스로포이에틴 (EPO)와 에리스로포이에틴 (EPO)의 수용체(EPOR)은 신경, 심장, 신장 등 다양한 비 조혈 조직에도 광범위하게 분포되어 있으며 광범위한 조직 보호 활성을 가진 다기능 분자이다. 특히, 최근 20년 동안의 연구에 따르면 EPO는 생체 내 및 시험 관내 실험에서 신경보호 및 신경 영양성 역할을 수행하였다.

신경계에서 EPO/EPOR은 뉴런, 성상 세포, 혈관 내피 세포 등에서 발현된다. EPO/EPOR는 정상 성인 뇌 조직에서 낮은 발현 상태이지만, 뇌 조직이 손상되거나 허혈, 저산소증 등과 같은 스트레스를 받았을 때 그 발현이 유의하게 증가한다. 그러나, 활성화 된 EPO/EPOR 시스템은 손상된 신경 세포를 보호하기에 충분하지 않으면, 많은 양의 외인성으로 보충된 재조합 에리스로포이네틴 (rhEPO)이 수용체 매개 엔도시토시스 (receptor-mediated endocytosis)에 의한 혈액-뇌 장벽을 통해 신경계에 진입하거나 세포막에서의 음세포 작용을 일으킨다. EPO는 과발현 EPOR와 결합하여 Jak 2 인사화를 유도하여 전사 인자 STAT5 경로, 포스파티딜이노시톨 3 키나아제 (PI3K)/AKT 경로, 핵인자 NF-κB 등을 포함한 신호 전단체 및 경로를 활성화 시킨다. 신경 세포 사멸 및 신경 세포 손상은 항염증제, 항산화성 스트레스, 항-세포 사멸, 흥분 독성 억제, 신경 재생 촉진, 혈액 뇌 장벽 보호 등과 같은 다양한 메커니즘의 조합을 통해 감소되며, 따라서 신경 보호 효과를 발휘한다. 또한, 뇌허혈 및 저산소증, 뇌 허혈-재관류 손상, 척수 손상, 실험적 자가 면역 뇌척수염 (EAE), 지주막하 출혈, 간질, 파킨스 병, 다중 시스템 위축, 좌골 신경 압축, 망막 신경절 세포 손상을 비롯한 다양한 동물 질병 모델에서 EPO의 신경 보호 효과가 확인되었다.

EPO가 시험 관내 및 생체 내에서 신경 보호 효과를 확인한 이후, 최근 수십 년 동안, 뇌 허혈, 염증 및 신경 퇴행에 대한 신경 손상으로부터의 환자에서의 일련의 임상 시험에서 EPO가 인간에게 신경 보호 효과와 재생 기능을 발휘할 수 있는지 여부를 조사했다. 다행히도, 이러한 연구의 대부분은 EPO 치료가 효과가 있다는 것을 확인했다. 그러나 EPO는 적혈구 생성을 촉진시키는 효과가 있으므로 EPO의 고용량 또는 장기 사용은 적혈구 증가증, 고혈압, 혈전증 등과 같은 일련의 심각한 의학적 문제를 직접 일으킬 수 있다. 따라서, 조혈 기능이 없지만 신경 보호 효과가 있는 EPO 유도체, 알로 스테릭 등의 제제의 개발은 현재 신경 과학자들에게 주요 연구 쟁점이다.

최근 몇 년 동안 연구자들은 적혈구 생성 효과가 없으며, 신경 보호 효과가있는 일부 EPO 유도체를 개발하였다. EPO 유도체의 한 종류는 아시알로 EPO, 뉴로 -EPO 등과 같은 변형된 에리스로포이에틴 단백질 유도체를 포함하는 카바밀화 EPO (carbamylated EPO; CEPO)로 대표된다. EPO 및 CEPO에 대한 심층적인 연구를 통해 CEPO는 EPOR과 결합하지 않지만 EPO의 신경 보호 및 기타 조직 보호 효과를 보존 할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 신경 보호를 포함하는 EPO의 조직 보호 효과는 EPOR 및 CD131로 이루어진 이종 중합체, 즉 βcR (β복합체)에 의해 매기되고, 이는 두 개의 EPOR 분자로 구성된 이량 체가 중재하는 EPO의 적혈구 생성 작용과는 다르다. EPO 유도체의 또 다른 종류는 HBP, HBSP (ARA290), pHBSP, Epo 펩 타이드 AB, MKX-2, JM4, Epotris 등 EPO 공간 구조를 모방한 저 분자량 펩타이드이다. 이러한 종류의 폴리 펩타이드 유도체는 저 분자량의 이점을 가지며 유망한 임상적 응용을 갖는 혈액-뇌 장벽을 쉽게 통과한다. 그러나 인체에 미치는 영향을 검증하기 위해서는 임상 연구가 필요하다.

상기 선행기술의 기술적 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드, 이의 제조방법, 및 이의 용도를 제공한다. 본 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드는 적혈구 생성 효과가 없으며, 신경보호 효과를 갖고, 적혈구 생성 효과로부터 야기되는 적혈구 증가증, 고혈압, 혈전증 등과 같은 중대한 의학적 문제점을 회피할 수 있다.

본 발명은 우선 인간 EPO(프로테옴 데이터베이스, P01588)의 개시된 아미노산 서열, 상기 EPO에 포함된 아미노산 서열의 일 부분 및 EPOR 결합 부위에 관한 것이며, EPO 단백질 헬릭스 구조는 1998년 네이쳐지에 개시된 연구 결과(Nature, 1998. 395(6701): p. 511-6)에 따라 선택되고, 아미노산의 일부는 결실될 수 있다(예컨대, EPO 분자의 아미노선 서열에서 86번 위치의 글루타민, 88번 위치의 트립토판, 89번 위치의 글루타메이트, 90번 위치의 프롤린 및 97번 위치의 리신으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 위치가 결실될 수 있고, 바람직하게는 모든 위치에서 결실될 수 있다). 103번 위치의 원래의 아르기닌이 알라닌으로 치환될 때, 본 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드는 적혈구 생성 효과를 잃고, 신경보호 효과를 갖는다.

본 발명의 일 양태에서 (a) SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 또는 (b) (a)의 아미노산 서열에 기초하여 하나 또는 다수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 추가된 폴리펩타이드를 포함하는, 적혈구 생성 효과를 갖지 않고 신경보호 효과를 갖는 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드를 제공한다.

특히 SEQ ID NO: 1은 SEAVLRGQAL LVNSSP LQLHVDAVSGLASLTTLLRAL 이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1에 기재된 서열이다.

또한, SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드는 하기 구조식을 갖는다:

본 발명의 다른 양태는 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드를 포함하는 약제 또는 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드, 및 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제종한다. 투여될 때, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 제형으로 투여된다. 상기 제형은 통상적으로 약제학적으로 허용되는 농도의 염, 버퍼, 보존제, 호환성 담체 및 임의의 다른 치료제를 포함한다.

본 발명의 다른 양태는 상기 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 핵산 분자의 발현 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 발현 벡터의 숙주 세포 또는 바이러스를 제공한다.

또한 본 발명은,

a) 본 발명의 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드;

b) 본 발명의 조성물;

c) 본 발명의 핵산 분자;

d) 본 발명의 발현 벡터;

e) 본 발명의 숙주 세포; 및

f) 본 발명의 바이러스 중 어느 하나를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 상기 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 제조 방법을 제공한다:

(1) 고상 합성 방법을 적용하고, N,N-디메틸포름아미드(DMF) 내에 20분 내지 50분간 루신이 부착된 출발 레진을 함침한 후, 플루오레닐메톡시카보닐(FMOC)을 제거하기 위해 디캐핑(decapping) 용액내에 함침하고, 디메틸포름아미드로 세척하는 단계;

(2) 다음 차례(next)의 아미노산, 축합제 및 염기를 20분 내지 50분간 반응 후, 디메틸포름아미드로 세척하는 단계;

(3) 디캐핑 용액으로 FMOC를 제거하고 30분 후에 디메틸포름아미드로 세척하는 단계; 및

(4) 상기 단계 (2) 및 (3)을 반복해서 순차적으로 아미노산을 링크하는 단계.

또한 본 발명의 제조방법에서 아미노산의 연결순서는 하기와 같다:

루신 → 알라닌 → 아르기닌 → 루신 → 루신 → 트레오닌 → 트레오닌 → 루신 → 세린 → 알라닌 → 루신 → 글리신 → 세린 → 발린 → 알라닌 → 아스파테이트 → 발린 → 히스티딘 → 루신 → 글루타민 → 루신 → 프롤린 → 세린 → 세린 → 아스파라진 → 발린 → 루신 → 루신 → 알라닌 → 글루타민 → 글리신 → 아르기닌 → 루신 → 발린 → 알라닌 → 글루타메이트 → 세린.

바람직하게는, 상기 단계 (2)의 축합제는 TBTU, 즉, O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트이다.

바람직하게는, 상기 단계 (2)의 염기는 모르폴린이다.

바람직하게는, 상기 단계 (2)의 염기는 디캐핑 용액은 헥사하이드로피리딘 및 N,N-디메틸포름아미드의 혼합물이며, 헥사하이드로피리딘 대 N,N-디메틸포름아미드의 부피비는 바람직하게는 1:3 내지 5, 가장 바람직하게는 1:4이다.

본 발명은 또한 신경 세포 손상의 치료를 위한 상기 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 저산소 뇌손상의 치료를 위한 상기 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 간질 치료를 위한 상기 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드을 포함하는 세포 손상의 치료를 위한 약제를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드을 포함하는 저산소 뇌손상의 치료를 위한 약제를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드을 포함하는 간질 치료를 위한 약제를 제공한다.

본 발명은 성공적으로 EPO-유래된 펩타이드를 제조 및 합성할 수 있고, 신규 EPO-유래된 펩타이드의 순도는 본 발명의 제조방법을 사용함에 의해 95%에 달할 수 있다.

본 신규 EPO-유래된 펩타이드의 기능을 보다 조사하기 위해, 본 발명자들은 간질 동물 모델을 디자인하였다. 본 EPO-유래된 펩타이드를 동물 모델에 투여할 때, 발작 잠복(seizure latency)이 연장되어, 신경 세포 손상을 경감하는 효과를 갖는 것으로 나타내었다. 또한, 신경 손상을 갖는 동물에서 신규 EPO-유래된 펩타이드를 투여할 때, 신규 EPO-유래된 펩타이드가 급성 손상 동안 뇌-혈관 장벽을 통과하여 신경 보호 효과는 나타내고 발작 잠복을 연장하여 신경을 보호할 수 있고, 해마에서 뉴론의 손실을 감소시킬 수 있어, 신규 EPO-유래된 펩타이드가 신경 손상 치료에 대한 의학적 효과를 갖는 것이 실험에서 입증되었다.

본 발명의 신규 EPO-유래된 펩타이드는 인비트로에서 항-신경 세포자멸 효과를 갖는다고 나타났다. 산소-글루코스 결핍-유도된 손상 및 NMDA-유도된 손상을 갖기 위한 1차 배양된 세포의 투여후에, EPO-유래된 펩타이드 개입 그룹에서 컨트를 그룹보다 신경 손상이 경감되었고, 세포 생존율이 높았다. 인비보에서, 신규 EPO-유래된 펩타이드는 뇌경색 용적을 감소시킬 수 있고, 뇌허혈을 개선시키고, 신경행동학적 스코어에 의해 산정되는 심각도를 감소시킬 수 있음이 확인되어, 본 신규 래된 펩타이드는 신경 손상을 경감시킬 수 있고, 신경보호 효과를 갖고, 세포자멸을 경감시킬 수 있다. 마우스에 대한 장기간의 투여에서 적혈구 생성을 상당히 증가시키는 부작을을 갖지 않았다. 이와 같이, 본 신규 EPO-유래된 펩타이드는 급성 저산소 손상에 대한 신경보호 효과를 갖고, EPO 보다 우수한 효과를 갖는다.

선행기술과 비교할 때, 본 발명의 기술적 진보는 현저하다. 본 발명은 적혈구 생성 활성을 갖지 않고 신경보호 효과를 갖는 신규 EPO-유래된 펩타이드를 제공한다. 이 새로운 약물은 저분자량을 갖고, 뇌-혈관 장벽을 투과할 수 있다. 또한, 이 신규 약물은 인체의 기능적 단백질에서 유래된 저분자량 폴리펩타이드로서, 인체에 대해 다른 개발되거나 합성된 약물에 비하여 현저히 적은 부작용을 갖고, 따라서 우수한 임상적 적용 가능성을 갖는다. 만일 본 발명이 임성시험에 적용된다면, 중추신경계 질환을 예방 및 치료할 수 있는 신규 신경보호 약물이 될 수 있어, 신경 손상을 갖는 환자에 대한 새로운 치료적 방침을 제공할 수 있다.

도 1은 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 리포트 (A) 및 질량 분석 리포트(B)이다.
도 2는 적혈구 숫자의 비교를 나타낸 히스토그램이다(3일, 7일, 13일). 여기서, 가로 좌표는 측정일을 나타내고, 세로 좌표는 적혈구 숫자를 나타낸다(M/μL).
도 3은 컨트롤 뉴론에서의 MAP-2 및 DAPI의 형광 더불 염색 이미지이며, 여기서 뉴론의 세포체는 녹색이고, 핵은 청색이다.
도 4a는 다른 약물들의 개입에서 산소-글루코스 결핍에 의해 손상된 뉴론의 세포 생존율을 나타낸다. 여기서 가로 좌표는 그룹핑이고, 세포 좌표는 세포 생존율을 나타낸다. 도 4b는 다른 약물들의 개입에서 산소-글루코스 결핍에 의해 손상된 뉴론의 락테이트 데하이드로게네이즈 분비율(lactate dehydrogenase release rate)을 나타내며, 여기서 가로 좌표는 그룹핑이고, 세포 좌표는 락테이트 데하이드로게네이즈 분비율을 나타낸다.
도 5a는 다른 약물들의 개입에서 NMDA에 의해 손상된 뉴론의 세포 생존율을 나타낸다. 여기서 가로 좌표는 그룹핑이고, 세포 좌표는 세포 생존율을 나타낸다. 도 5b는 다른 약물들의 개입에서 NMDA에 의해 손상된 뉴론의 락테이트 데하이드로게네이즈 분비율(lactate dehydrogenase release rate)을 나타내며, 여기서 가로 좌표는 그룹핑이고, 세포 좌표는 락테이트 데하이드로게네이즈 분비율을 나타낸다.
도 6은 다른 투여 그룹에서 마우스의 뇌척수액의 바이오틴(biotin) 농도를 나타내며, 여기서 가로 좌표는 그룹핑이고, 세포 좌표는 바이오틴 농도를 나타낸다.
도 7a는 다른 투여 그룹에서 마우스의 신경행동학적 스코어를 나타내며, 여기서 가로 좌표는 그룹핑이고, 세포 좌표는 신경행동학적 스코어를 나타낸다. 도 7b는 다른 투여 그룹으로부터 마우스의 일시적 중뇌 동맥 폐색의 이미지를 나타낸다. 도 7c는 다른 투여 그룹으로부터 마우스의 뇌경색 용적의 이미지를 나타내며, 여기서 가로 좌표는 그룹핑이고, 세포 좌표는 마우스의 뇌경색 용적을 나타낸다.
도 8은 다른 약물 개입에서 필로카르핀-유도된 발작후에 마우스의 발작 잠복을 나타내며, 여기서 가로 좌표는 그룹핑이고, 세포 좌표는 발작 잠복을 나타낸다.

이하, 본 발명의 구체예에 의해 구체적으로 설명한다.

구체예 1: 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드(즉, SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드)의 제조

본 발명의 EPO-유래된 펩타이드의 합성 단계:

루신을 출발 레진으로서 사용하며, 출발 레진을 디메틸포름아미드에 30분간 함침한 후, 디캐핑 용액을 사용하여 플루오레닐메톡시카보닐을 제거하였고, 30분 후에 디메틸포름아미드를 사용하여 세척하였다; 다음 차례의 아미노산(알라닌), 축합제 및 염기를 첨가하여 30분간 반응시킨 후, 디메틸포름아미드를 사용하여 세척 및 검출하였다; 성공적인 검출후에, 디캐핑 용액을 사용하여 플루오레닐메톡시카보닐을 제거하였고, 30분 후에 디메틸포름아미드을 사용하여 세척하였다; 그 후 다음차례의 아미노산(아르기닌)을 마지막 차례의 아미노산이 결합될 때까지 선형 펩타이드의 정확성을 확인하는 기초하에서, 디자인된 서열에 따라 (SEQ ID NO: 1의 서열을 갖도록) 연결하였다. EPO-유래된 펩타이드를 절단하고, 최종적으로 95% 이상의 순도에 달할 때까지 정제하였다.

신규 EPO-유래된 펩타이드의 순도를 확인하는 방법: 도 1 참조.

조생(crude)의 펩타이드들을 아세토니트릴 수성 용액(아세토니트릴(ACN) 대 물의 비용이 용량으로 1 : 2임)에 용해하였다. HPLC 정제를 수행하였다. HPLC 조건: 유동상 A상: 0.1% TFA (트리플루오로아세트산) / 100% ACN (아세토니트릴); 유동상 B상: 0.1% TFA (트리플루오로아세트산) / 100% 물; 크로마토그래피 컬럼: Kromasil C18, 4.6 x 250 mm, 5 μm; (표 1)

구배	A	B
0.0 분	38%	62%
25.0	63%	37%
25.1	100%	0%
30.0	정지
유속	1.0 ml/분
컬럼 온도	25℃

장치의 평형(equilibration)을 세팅한 후에, 장지를 약 10분동안 작동을 위해 준비조치하였다. 조생의 펩타이드들을 장치에 주입하고 기저선을 수집하고, 장치를 정지하였다. 최종적으로 95.25%의 순도를 갖는 샘플을 얻었다.

구체예 2: 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드의 적혈구 생성(Hematopoietic) 실험

18-22g의 수컷 C57/BL6 마우스(Shanghai SIPPR-BK Laboratory Animal Co., Ltd.,로부터 구입, 총 50 마리 마우스이며, 각각의 그룹마다 10 마리임)를 사용하였다. 5개의 그룹에 EPO (50 μg/kg)를 복강내 주입하였다: 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드(50 μg/kg), 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드(250 μg/kg), 생리학적 식염수(0.1 ml/마우스), 및 용매(ACN+Milliq, 0.1 ml/마우스)를 1일 1회 각각 주입함. 3일, 7일 및 13일째에, 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 수입하고, ProCyte Dx 자동 혈액 세포 분석기로 측정하여 이의 적혈구 세포 수를 얻었다.

실험결과를 하기 표 2에 나타내었다:

. RBC 생성 비교 표 (3일, 7일, 및 13일) 단위: M/μL

	식염수	ACN+MiNiQ	T3 50ug/kg	T3 250ug/kg	Epo 50ug/kg
3일	7.03±0.59	8.10±0.44	9.29±0.13	8.16±0.28	9.14±0.56
7일	7.36±0.47	8.63±0.52	8.75±0.36	9.56±0.54	12.79±0.24
13일	6.28±0.17	5.81±0.14	6.77±0.18	6.52±0.12	11.15±0.23

막대그래프로 표시된 상기 데이타는 도 2에 나타난다. 이것으로 부터, 투여의 횟수가 증가함에 따라, EPO 그룹의 적혈구 갯수가 다른 그룹의 갯수에 비해 현저히 높은 것을 알 수 있었다. 그러나, 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드 그룹(T3)의 적혈구 숫자는 생리학적 식염수 그룹(식염수) 및 용매 그룹(ACN+Milliq)에 비교할 때 유의적인 증가가 없었다. 또한, 고용량 EPO-유래된 펩타이드 그룹 및 저용량 그룹 사이의 적혈구 갯수의 차이에서 통계학적으로 유의한 차이는 없었다.

구체예 3: 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드의 뉴론 보호 실험

문헌으로부터의 방법에 따라, 태아 래트의 대뇌 피질 뉴론을 Neurobasal® 미디움(상업적으로 구매함)의 혈청없는 배양 배지에서 배양하였다. 5% CO₂ 인큐베이터에서 7-14일동안 배양한 후에, 뉴론을 구체적인 라벨링을 하였다: MAP-2(microtubule-associated protein-2)로 염색하고, 확인하였고, 핵을 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)의 형광 염료로 표지하였다. 형광 현미경으로 관찰된 결과를 도 3에 나타내었다.

구체적 조작 방법은 하기와 같다:

태아 래트 대뇌 피질 뉴론의 1차 배양

1. 10% 클로랄 하이드레이트로 임산 18일째은 SD 임신 래트(Shanghai SIPPR-BK Laboratory Animal Co., Ltd.)를 마취시켰다;

2. 75% 알코올로 복부 피부를 마취하고, 복강을 개방한 후, 자궁을 절개하여 태아 래트를 적출하였다;

3. 조직을 분리함: 태아 래트의 머리를 절단하고, 얼음하에서 조작하면서 미리 냉각시킨 PBS 버터를 즉시 넣고, 조심스럽게 뇌 조직을 분리하고, 조심스럽게 대뇌 피질을 분리하고, 조심스럽게 뇌막 및 혈관을 벗기고, PBS 용액으로 두번 세척하였다;

4. 분쇄: 약 1 mm³의 대뇌 피질 조작을 얻기 위해 안과 가위를 사용하여 분쇄하였다;

5. 해리(Digestion): 분쇄된 조직 블록을 깨끗한 50ml 원심분리 튜브로 옮기고, 5ml의 0.125% 트립신-EDTA을 첨가하고 37℃로 예열하였고, 약 5-10분 동안 37℃에서 중탕 냄비에서 해리시켰다;

6. 해리 중지: 5 ml의 FBS-DMEM를 첨가하고 37℃로 예열하여 해리를 중지시켰다; 깨끗한 15 ml 원심분리 튜브내로 유모성(flocculent)의 세포 매스를 흡인시키고, 10% FBS-DMEM 배양 배지를 첨가하여 잔류 해리 용액을 세척하였다;

7. 점적기를 통한 반복된 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, 세포들을 200 메쉬 필터를 통해 필터링하여 단일 세포 현탁액을 얻었다;

8. 2000 rpm 및 4℃에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 10% 소태아혈청을 포함한 시딩(seeding) 배양 배지에 첨가시켜 세포를 다시 부유시켰다;

9. 유리 슬라이드 또는 폴리리신-코팅된 배양 플레이트 상에 1×10⁶/cm² 의 농도로 시딩하고, 밤새 95% 습도, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다;

10. 8-12시간 배양 후에, 모든 배양배지를 NeurobasalA+B27+ 글루타민 혈청없는 배지를 사용하여 대체하고 배양을 유지하였고, 3일 간격으로 배양 배지를 교체하였다.

11. 7-14일 후에 뉴론 확인을 수행하였다.

MAP-2/DAPI에 의한 뉴론 확인

1. 유리 슬라이드 상에서 7-14일간 배양된 뉴론을 선발하고, 예열된 PBS로 5분간 세척하였다;

2. 4% 파라포름알데히드를 첨가하고 30분간 상온에서 고정하였다;

3. PBS 각 5분간 3회 세척하였다;

4. 0.2% TritonX-100 PBS를 첨가하여 20분 동안 상온에서 막을 투과할 수 있게 하였다;

5. PBS 각 5분간 3회 세척하였다;

6. 블록킹(Blocking): 블록킹 용액(5% 염소 혈청)를 첨가하고 상온에서 30-60 분간 블록킹하였다;

7. 액체을 흡인한 후에, 1:100로 희석된 1차 항체(토끼 항-MAP-2 폴리클로날 항체, Abcam)를 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, PBS를 사용하여 1차 항체를 대체하여 음성 콘트롤로 하였다;

8. 액체를 제거하고, 각 5분간 3회 세척하였다;

9. 액체를 제거한 후에, 1:200로 희석된 2차 항체(Alexa Fluor 488 당나귀 항-토끼 형광 2차 항체, Invitrogen)를 첨가하고, 60분간 빛을 제거한 후에 상온에서 인큐베이션하였다;

10. 액체를 제거하고, PBS를 사용하여 각 5분간 3회 세척하였다;

11. 액체를 제거하고, DAP (sigma-Aldrich) 0I로 염색하고, 액체를 제거하고, 10분동안 상온에서 세웠다(standing).

12. 액체를 제거하고, PBS를 사용하여 각 5분간 3회 세척하였다;

13. 항-형광 퀘칭 실링제(50% 글리세린으로 실링)를 첨가한다;

14. 형광 현미경을 사용하여 관찰 및 사진을 찍었다.

결과를 도 3에 나타냈어서, 녹색은 MAP-2 양성 뉴론이고, 청색은 핵이다. 1차 배양의 태아 래트 뉴론의 순도는 90% 이상이며, 배양은 성공적인 것을 결과로부터 알 수 있었다.

뉴론의 산소-글루코스 결핍(OGD)-유도된 손상 및 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드의 보호효과

1차 배양된 태아 래트 대뇌 피질 뉴론을 당없는 DMED 배양 배지에서 배양하였다. 저산소 인큐베이터에 3시간동안 방치하여 뉴론을 손상시켰고, 배양 배지를 혈청없는 배양 배지로 대체하였다. EPO, 본 신규 EPO-유래된 펩타이드(T3) 및 배양 배지는 각각 다른 그룹에 첨가하고, 각각의 그룹들을 5% CO₂ 일반 산소 인큐베이터에서 4시간동안 배양하였다. 그 후, 각각의 그룹에 대한 LDH 방출율 및 MTT 세포 생존율을 측정하였다.

상기 결과에 기초하여, 1차 배양된 뉴론들에 250 μmol/L NMDA를 투여하였다. 60분간 배양한 후에, 결과를 도 5에 나타내었다.

구체적 조작 방법은 하기와 같다:

1. 7-14일 동안 배양된 잘 성장된 뉴론을 선발하고, 뉴론의 이전 배양 배지를 제거하고, PBS 버포로 3회 세척한 후, 당-없는 DMEM를 첨가하였다;

2. 37℃에서 무산소 인큐베이터에 배양 플레이트를 두고, 그 안의 산소 농도를 1%로 세팅하였다.

3. 저산소를 3시간 유지한 후에 배양 배지는 옮기고, 당-없는 DMEM를 첨가하고, 최초의 혈청없는 유지 배지로 대체하고, EPO (5 μg/ml, 100 μg/ml), 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드(5 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml), 및 배양 배지를 각각 첨가하고, 37℃에서 4시간동안 95% 공기를 사용한 5% CO₂ 인큐베이터내 두었다.

4. 4시간 후에, 각각의 그룹에서 세포의 세포 생존율(MTT 키트, Beyotime Biotechnology Co., Ltd.) 및 LDH(lactic dehydrogenase) 방출율(LDH 키트, Promega Corporation)를 측정하였다

결과를 도 4에 나타내었다. EPO 그룹 및 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드 그룹의 LDH 방출율은 콘트롤 그룹에 비해 낮았고, 이들의 세포 생존율은 콘트롤 그룹보다 높았다. 그러한 결과는 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드가 급성 신경 손상을 경감하고, 뉴론 세포자멸을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

뉴론의 N-메틸 D-아스파테이트(NMDA)-유도된 뉴론의 손상 및 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드의 보호효과

1. 7-14일 동안 배양된 잘 성장된 뉴론을 선발하고, EPO (5 μg/ml) 및 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드(100 μg/ml)를 각각 첨가하였다;

2. NMDA를 첨가하여 250 μmol/L의 최종 농도를 맞추고, 37℃에서 60분간 인큐베이터에 배양하였다;

3. 배양 배지를 제거하고, 각각의 그룹에서 세포의 세포 생존율(MTT 키트, Beyotime Biotechnology Co., Ltd.) 및 LDH(lactic dehydrogenase) 방출율(LDH 키트, Promega Corporation)를 측정하였다.

결과를 도 5에 나타내었다. EPO 그룹 및 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드 그룹의 LDH 방출율은 콘트롤 그룹에 비해 낮았고, 이들의 세포 생존율은 콘트롤 그룹보다 높았다. 그러한 결과는 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드가 급성 신경 손상을 경감하고, 뉴론 세포자멸을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

구체예 4: 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드의 뇌-혈관 장벽 통과 실험

바이오틴-표지된 신규 EPO-유래된 펩타이드를 복강내로 투여하였다. 투여 1시간 후에, 전신 마취하에서 5-15 μl의 마우스 뇌척수액을 채취하였다. 바이오틴 어세이 키트를 사용하여 바이오틴-표지된 신규 EPO-유래된 펩타이드가 뇌혈관장벽을 통해서 뇌척수액에 들어간지 여부를 측정하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.

구체적 조작 방법은 하기와 같다:

1. 마우스를 4% 클로랄 하이드레이트로 마취한다;

2. 젖은 거즈로 목의 뒤쪽을 닦고, 도살 셋(dorsal set)을 절개하여 표피를 노출시키고, 후두골 밑의 표피에 시상 절개를 하고, 양쪽의 표피를 분리하여 시야를 확대시켰다;

3. 마우스를 엎드려 놓고, 머리로부터 135°의 각도로 몸체를 두고, 주고성 장치(stereotactic instrument)상에 머리를 고정시켰다; 입체 현미경 하에서 정중선을 따라 피하조직 및 근육을 직접적으로 분리하고, 이 각도에서 경뇌막(dura mater) 및 척수가 후두골 밑의 절개부위에서 명확하게 보였다(주된 특징은 명확한 하얀 표면, 척수 혈관의 주기적인 박동 및 인접 뇌척수액 용적이다);

4. 열 값을 300으로 설정하고 바늘 풀러(needle puller)에서 압력 값을 300으로 설정하고 모세관 유리관을 뾰족한 모세관으로 당기고 끝이 뾰족한 모세관 끝을 가위로 잘라내어 무딘 끝을 0.5 mm 직경으로 만들었다;

5. 모세관 유리관을 부압 장치에 연결하고 미리 수집 시스템의 부압 상태를 유지하였다;

6. 면봉으로 혈액을 닦고 펑크 포인트(puncture point) 주변을 선명하게 유지하였다;

7. 혈관 분포 영역을 피하고, 대조 (cisterna magna)를 마주하고, 입체 현미경으로 조작하고, 뾰족한 모세관 유리 튜브로 경질 재료를 천천히 찔러 넣었다; 뇌척수액은 천공 후에 유리관으로 흘러 들어가는 것을 볼 수 있었다; 뇌척수액이 천천히 5~20 μl로 상승 할 때까지 기다렸다; 부압을 적절히 증가시켜 더 많은 뇌척수액을 수집하였다;

8. 튜브의 뇌척수액이 더 이상 부피가 증가하지 않고 유리 튜브를 천천히 제거한 후 원심 분리 한 후 -80 ℃에서 냉동 보관하거나 즉시 감지하여 뇌척수액을 1.5 ml Eppendorf 튜브로 옮겼다;

대조군, 본 발명의 바이오틴 표지 EPO 유래된 펩타이드 및 본 발명의 간질 , 비오틴 표지 EPO 유도체 쥐의 뇌척수액을 각각 취하여 비오틴 분석 키트에 의해서 비오틴 농도를 검출하였다.

다른 투여군의 마우스에서 뇌척수액의 비오틴 농도

	대조군	대조군+T3 투여군	간질+T3 투여군
뇌척수액에서의 비오틴 표지 된 T3 펩타이드의 농도 (μg/ml)	0.37±0.11	1.67±0.30	1.97±0.51

그 결과를 도 6에 나타내었다. 비오틴은 본 발명 군 EPO- 유래 펩타이드 마우스의 뇌척수액에서 검출되었으나, 대조군에는 거의 비오틴이 없었으며, 그 차이는 통계적으로 유의하였다. 간질 투여군의 뇌척수액에서의 비오틴 농도는 단일 투여군의 뇌척수액 농도보다 높았으며, 간뇌 발작 후에 뇌 혈관 장벽이 파괴되고 침투성이 증가하는 것으로 나타났다. 요약하면, 본 발명의 EPO 유래 펩타이드는 혈액 - 뇌 장벽을 가로 질러 뇌척수액에 진입하여 그 효과를 나타낸다.

구체예 5: 일시적인 중뇌 동맥 폐쇄의 마우스 모델에 대한 본 발명의 EPO 유도체의 신경 보호 효과 실험

ICR 생쥐 (수컷, 25-30g, 18 마리의 마우스, Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd.로부터 구입)를 대조군 (ACN + Millq, 0.2ml / 마우스), EPO 군 (50 μg / kg), 일반 EPO-유래된 펩타이드 군 (T3, 500 μg / kg)으로 6 마리씩 나누었다. 각 그룹의 마우스를 중대 뇌동맥 폐색 모델을 확립하기 위해 마우스에서 봉합-폐쇄 방법으로 조작하고, 마우스에 염산케타민(Ketamine hydrochloride)를 복강내 주사하여 마취시키고 수술대에 고정시켰다. 허혈 60분 후에 봉합사를 제거하여 재관류시키고 용매 (ACN + Milliq), EPO 및 T3를 각각 투여하였다. 신경 행동 학적 점수는 수술 후 3 일째에 측정되었으며, 그 다음 마우스를 재관류하기 위해 희생시켰고 뇌를 채취하여 크레질 바이올렛(cresyl violet)으로 염색된 섹션을 만들었다. 상기 결과를 도 7에 나타내었다.

1. 목을 소독하고, 목 중앙을 절개하고, 스테로이드 현미경 하에 미세 총 동맥을 사용하여 왼쪽 총 경동맥을 노출시키고, 내 경동맥, 외 경동맥 및 익상 동맥을 분리하고, 총 경동맥 및 내 경동맥을 결찰하고, 2개의 필라멘트로 외 경동맥에 2개의 매듭을 만들고, 외 경동맥의 말초 부분에 하나는 죽은 매듭 (dead knot)이고, 외 경도맥의 근위 부분에 있는 것은 풀매듭 이었다;

2. 혈관 크기의 약 절반을 차지하는 금성 가위로 외 경동맥에 작은 절개를 하였다;

3. 외 경동맥을 절단하고, 외 경동맥과 내 경동맥의 분기점으로 외 경동맥으로부터 봉합사를 조심스러벡 역삽입한 다음, 내 경동맥에 매듭을 풀고, 내 경동맥에 봉합사를 삽입하였다. 이것이 중간 대뇌 동맥의 기원인 악간의 저항을 만날때까지 마우스를 케이지에 다시 넣었다.

4. 뇌 허혈의 60분 후에 다시 마취 및 고정하고, 총 경동맥, 내 경동맥 및 봉합사 부품을 입체 현미경으로 재박출하였다;

5. 외 경동맥의 근부위에 결찰하여 미세 수술용 집로 봉합을 고정시키고 천천히 봉합사를 빼내고 외 경동맥의 부분을 결찰하고, 재관류를 달성하기 위해 총 경동맥에 결찰된 필라멘트를 느슨하게 하였다.

6. 목의 절개를 봉합하고, 구역을 소독하고, 관찰을 위해 케이지에 다시 넣었다.

다른 투여군의 신경 행동학적 점수

	대조군	대조군+T3 군	간질군+T3 군
신경 행동학적 점수	8.0±1.0	6.3±0.7	5.7±0.3

다른 투여군의 마우스에서 일과 중대 뇌동맥 폐색의 뇌경색 양

	대조군	대조군+T3 군	간질군+T3 군
대뇌 경색양(mm3)	49.65±10.29	40.54±5.78	37.72±9.20

결과는 도 7에 나타내었다. 본 발명군의 EPO군 및 EPO-유래된 펩타이드의 ㅅ신경 행동학적 점수 및 뇌경색 량은 대조군보다 낮았으며, 이는 EPO 및 본 발명의 EPO 유래 펩타이드가 생체 내에서 뇌 허혈을 개선시킬 수 있고 신경 보호 효과를 나타낼 수 있음을 나타낸다.

구체예 6: 간질의 동물 모델에서 본 발명의 EPO 유도체의 신경 보호 효과 실험

C57 / BL6 마우스 (수컷, 20-25g, 24 마리, Shanghai JieSiJie Laboratory Animal Co., Ltd로부터 구입)를 생리학적 식염수 그룹 (생리학적 식염수 0.2ml / 마우스), 용매 그룹 (ACN + Milliq, 0.2ml / 마우스), EPO 그룹 (50 μg / kg), 새로운 EPO 유래 펩타이드 그룹 (T3, 500 μg / kg)으로 각 6마리씩 나누었다. 약물은 필로카르핀 (pilocarpine)에 의해 유발된 간질이 발생하기 1 일, 4 시간 및 2 시간 전에 투여되었으며, 발작 지연 및 경련의 중증도가 기록되었다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

1. 필로카르핀 투여전 1 일, 4 시간, 2 시간 동안 마우스를 복강 내 투여하였다;

2. 필로카르핀에 의해 유발된 말초 콜린성 반응을 감소시키기 위해 체내에 30분간 스코폴라민 (1㎎/㎏)을 복강내 주사하였다;

3. 필로카르핀 (350 mg / kg)을 복강 내 주사하여 투여시간, 발병시간, 발작의 중증도을 기록하였다;

4. 3급 이상의 발작후, 자발적 활동과 간질 지속 상태가 발생하여 모델이 성공적으로 확립되었다. 성공적으로 모델을 확립 한 후 30 분 후, 다이아제팜(10 mg / kg)을 투여하여 발작을 중지시켰다.

Racine 척도를 이용하여 간질 지속 상태의 행동 등급을 부여하여였다. :

1 등급 : 입과 얼굴의 움직임;

II 등급: 끄덕거림, 단발 (nodding, single jerks);

III 등급: 일 측성 / 양측 외 직근

Grade IV: 양육;

Grade V: l자세의 손실, 반복적으로 뛰어 오르는, 떨어지는, 강장 간간 발작.

다른 약물 중재로 필로카르핀 유발성 발작 후 생쥐의 발작 대기 시간

	EPO	T3	식염수	ACN+miliq
발작대기시간	41.16±3.52	40.58±3.67	32.50±1.80	27.20±2.48

결과는 도 8에 나타내었다. 본 발명의 EPO 및 EPO 유래된 펩타이드는 발작 대기 시간이 생리 식염수군 및 용매군의 발작 대기 시간보다 길었으며, 그 차이는 통계적으로 의한 것으로 나타났다. 본 발명의 EPO 및 EPO-유래된 펩타이드는 생체 내에서 신경 보호 효과를 갖는다.

구체예 7

본 발명의 EPO-유래된 펩타이드를 약제로 제조할 때, 폴리펩타이드의 효과적인 함량, 최소 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 및 희석제 또는 부형제가 혼합될 수 있다. 이러한 조성물들을 제조할 때, 활성 성분은 일반적으로 부형제를 사용하여 혼합되거나 부형제로 희석되거나 캡슐 또는 파우치의 형태로 담체내에 봉입될 수 있다. 부형제가 희석제로 작용할 때, 이것은 부형제, 담체 또는 활성 성분을 위한 배지로서 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 따라서, 약제는 정제, 필(pill), 파우더, 시럽, 멸균 주사용 액제 등일 수 있다. 적합한 부형제의 예로서, 락토오즈, 글루코즈, 수트로즈, 소르비톨, 만니틀, 전분, 미결정화 셀룰로스, 폴리비닐리롤리돈, 셀룰로스, 물 등을 포함한다. 제제는 또한 습윤제, 유화제, 보존제(예컨대, 하이드록시 벤조에이트 및 프로필 하이드록시벤조에이트), 감미제 등을 포함할 수 있다.

요약하면, 본 발명의 신규 EPO-유래된 펩타이드는 신경 세포를 보호할 수 있고, 급성 손상에서의 세포자멸을 감소시킬 수 있다; 마우스에 대한 장기간 투여에서 적혈구 생성의 유의미한 부작용이 없었다; 또한 본 발명의 신규 EPO-유래된 펩타이드는 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있고, 뇌경색 용적을 감소시키고, 인비보에서 허혈성 손상 후 투여에서 뇌허혈을 개선하고, 사전투여에 의해 발작 잠복(seizure latency)을 연장시킬 수 있어서, 신경 손상을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위해 사용될 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 EPO-유래된 펩타이드에 대한 인비보에서의 적혈구 생성 실험을 수행하였고, 적혈구 생성 효과가 없음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 인비트로상의 대뇌 피질 뉴론의 항-세포자멸(anti-apoptosis) 실험에 의해서 신경보호 효과를 갖는 것을 확인하였다. 동물모델에서 투여후 뇌척수액에서 바이오핀-표지된 폴리펩타이드의 측정에서, 본 신규 EPO-유래된 펩타이드는 뇌혈관장벽을 통과할 수 있어 보호 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

<110> Zhongshan Hospital, Fudan University <120> ERYTHROPOIETIN-DERIVED PEPTIDE, PREPARATION METHOD AND USE THEREOF <130> GBRH003-KR <150> PCT/CN 2018/078253 <151> 2018-03-07 <150> CN 201711058179.6 <151> 2017-11-01 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetized amino acid sequence of an erythropoietin-derived peptide <400> 1 Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Pro 1 5 10 15 Leu Gln Leu His Val Asp Ala Val Ser Gly Leu Ala Ser Leu Thr Thr 20 25 30 Leu Leu Arg Ala Leu 35

Claims

SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열로 나타내어지는 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드.
제1항에 있어서, 하기 구조식을 갖는 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드:

.
제1항 또는 제2항의 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드를 포함하는 약제로서, 저산소 뇌손상의 치료 또는 간질 치료용 약제.
제1항 또는 제2항의 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드를 포함하는 조성물로서, 저산소 뇌손상의 치료 또는 간질 치료용 조성물.
제1항 또는 제2항의 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드, 및 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 저산소 뇌손상의 치료 또는 간질 치료용 약제학적 조성물.
제1항 또는 제2항의 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제6항의 핵산분자를 포함하는 발현 벡터.
제6항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
제6항의 핵산 분자를 포함하는 바이러스.
제1항 또는 제2항의 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드를 포함하는 키트로서, 저산소 뇌손상의 치료 또는 간질 치료용 키트.
(1) 고상 합성 방법을 적용하고, N,N-디메틸포름아미드 내에 루신이 부착된 출발 레진을 함침한 후, 플루오레닐메톡시카보닐을 제거하기 위해 디캐핑(decapping) 용액내에 상기 출발 레진을 함침하고, 디메틸포름아미드로 세척하는 단계;
(2) 다음 차례(next)의 아미노산, 축합제 및 염기를 추가하고, 반응 후 디메틸포름아미드로 세척하는 단계;
(3) 디캐핑 용액으로 플루오레닐메톡시카보닐을 제거하고 디메틸포름아미드로 세척하는 단계; 및
(4) 상기 단계 (2) 및 (3)을 반복해서 순차적으로 아미노산을 링크하는 단계;
를 포함하는 제1항 또는 제2항의 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 제조 방법.
제11항에 있어서, 상기 단계 (2)에서 축합제는 O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트인 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 제조 방법.
제11항에 있어서, 상기 단계 (2)의 염기는 모르폴린인 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 제조 방법.
제11항에 있어서, 상기 단계 (3)의 염기는 디캐핑 용액은 헥사하이드로피리딘 및 N, N-디메틸포름아미드인 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드의 제조 방법.