KR102408263B1 - 폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 검정 - Google Patents
폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 검정 Download PDFInfo
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Abstract
본원의 개시내용은 폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.
Description
상호-참조
본 출원은 본원에 전문이 참조로 인용된, 2016년 5월 19일자로 출원된 미국 가출원 제62/338,605호에 대한 우선권의 이득을 주장한다.
본 발명의 기술분야
본원의 개시내용은 폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 방법에 관한 것이다.
금속-촉매 산화 생성물은 제조 또는 저장 공정 동안에 금속 또는 금속 이온과 mAb의 접촉으로 인한 단클론성 항체 (mAb)의 고도로 관련된 품질 속성이다. 정제 또는 저장 동안에, 스테인레스 강은 통상의 표면 접촉 물질이다. 세포 배양 배지에 존재하거나, 스테인레스 강으로부터 침출된 철 이온은 mAb의 Fc 영역에서 메티오닌 및 히스티딘 산화를 유발할 수 있다. 메티오닌 및 히스티딘 산화 외에도, 단백질 내 알데히드/케톤 기의 형성을 말하는 단백질 카보닐화는, 금속-촉매 산화 반응으로부터의 주요 열화 경로이고, mAb에 대해 광범위하게 연구되지 않았다. 산화 카보닐화의 결과로서, 라이신 및 아르기닌 측쇄 상의 양전하와 프롤린 잔기로부터의 입체 제약은 소실된다. 상기 변화는 증가된 단백질 응집 경향을 유도할 수 있고, 따라서 잠재적으로 mAb 제품 품질 및 안정성 프로파일에 영향을 미친다. 추가로, 금속-촉매 산화에 의해 유도된 mAb 응집물은 유전자도입 마우스에서 다른 스트레스 조건에 의해 유도된 것들 보다 더 면역원성을 발생시킬 수 있다. 따라서, 제조 및 저장 동안에 금속-촉매 산화로부터의 mAb의 카보닐화 정도를 확인하는 것이 상당히 중요하다.
총 단백질 카보닐화 수준의 정량적 측정을 위해, 상이한 하이드라자이드가 단백질 상의 카보닐기와 반응하는 유도체화 시약으로서 채택되었다 (문헌참조: Yan et al., 2011). 정량화는 일반적으로 하이드라자이드의 특유의 특징 및 유도체화 후 상응하는 하이드라존을 기준으로 하였다. 예를 들어, 널리 사용된 분광측정 카보닐화 검정은 375nm에서 유도 샘플의 흡광도를 측정하고, 이 파장은 상기 유도체화 시약인 2,4-디니트로페닐하이드라진 (DNPH), 및 수득한 하이드라존에 의해 강하게 흡수된다 (문헌참조: Levine et al., 1990). 형광측정 카보닐화 검정은 플루오레신 티오세미카바지드에 의한 유도체화 후, 유도 샘플의 485nm에서의 여기 및 535nm에서의 방출에 의한 형광을 측정한다 (문헌참조: Mohanty et al., 2010). ELISA 카보닐화 검정은 DNPH에 의한 샘플의 유도체화 후 정량을 위해 항-DNPH 항체를 사용한다 (문헌참조: Buss et al., 1997). 상이한 하이드라자이드 시약은 유도체화 및 정량화 목적을 위해 사용되어 왔지만, 단백질 카보닐화 검정에서 통상의 과정은 카보닐화 수준의 과-정량화를 예방하기 위해 유도체화 단계 후 미결합된 하이드라자이드의 제거한다 (문헌참조: Rogowska-Wrzesinska et al., 2014). 전형적으로, 미결합된 하이드라자이드는 단백질 침전 및 세척을 통해 제거되고, 이는 노동 집약적 과정이고 실험의 가변성의 주요 원인을 구성한다. 사실, 2개의 추가의 세척 단계는 DNPH에 의한 분광측정 카보닐화 검정을 사용하는 경우 카보닐화 결과를 15%까지 감소시키는 것으로 입증되었다 (문헌 참조: Matthijssens et al., 2007). 세척 단계와 관련된 대형 검정 가변성 및 노동 집약적 성질은 이들 카보닐화 검정이 제품 개발 동안에 mAb 카보닐화를 측정하는데 광범위하게 적용되기 어렵게 할 수 있다. 변형된 ELISA (문헌참조: Uehara et al., 2015) 및 DNPH (문헌참조: Mesquita et al., 2014) 검정은 최근에 단순화된 방법을 사용하여 보고되었다. 그러나, 이들 변형된 방법은 여전히 상대적으로 노동 집약적이고, 이들의 강인성(robustness)은 아직 평가되지 않았다. 루시퍼 옐로우 카보하이드라자이드 (LY-CH)는 이전에 항체의 N-글리칸 올리고사카라이드 잔기에 대한 과요오드화산 산화에 의해 형성된 알데히드기를 정량하기 위한 유도체화 시약으로서 사용되어 왔다 (문헌참조: Morehead et al., 1991). LY-CH에 의한 산화된 항체 탄수화물 잔기의 정량적 표지를 조사하기 위한 검정이 기재되었다 (문헌참조: Keener et al., 1994). 본 검정에서, 유도체화 반응에서 LY-CH-대-폴리펩타이드 몰비는 통상의 완충 시스템의 사용으로 인해 제한되고, 미결합된 LY-CH의 제거를 보다 어렵게 한다. 추가로, 검정은 카보닐화 함량의 과대평가를 유도하는 카보닐 함량을 정량하기 위한, 하이드라자이드 시약의 각각의 흡광도에 대한 단백질 기여를 보정하지 않는다.
US 2006/0216756 A1은 산화된 단백질의 특성의 2차원 평가를 위한 방법을 기재하고, 상기 방법은 피부로부터 채취한 호르니 층(horny layer) 표본에서 산화된 단백질의 카보닐기의 특이적 형광 표지 단계를 포함한다. US 2007/0110670 A1은 모발 손상을 평가하기 위해 형광 염료를 사용한, 산화된 단백질의 카보닐기를 표지하는 단계를 포함하는 방법을 기재한다. WO2012175519 A1은 하이드라자이드로 단백질 카보닐기를 표지하고 이어서 1차원 또는 2차원 겔 전기영동을 사용하여 샘플을 분석하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 단백질-함유 샘플에서 단백질 카보닐기를 검출 및/또는 정량하기 위한 방법을 기재한다.
본원의 개시내용에서, 루시퍼 옐로우 카보하이드라자이드를 사용한 단순화된 보다 강력하고 보다 정확한 단백질 카보닐화 검정( C arbonylation A ssay using L ucifer Y ellow carbohydrazide, CALY)이 기재되고, 이는 상기된 바와 같은 선행 기술 분야의 문제점을 극복한다.
본 발명의 개요
본원의 개시내용은 폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 개시내용은 폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 방법에 관한 것이다: 상기 방법은 a) 용액 중 폴리펩타이드를, 하이드라자이드 염료가 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 상에 존재하는 카보닐기와 반응하여 폴리펩타이드-염료-복합체를 형성할 수 있도록 하는 조건하에서 하이드라자이드 염료와 접촉시키는 단계; b) 단계 a)로부터의 수득한 용액으로부터 미결합된 하이드라자이드 염료를 제거하는 단계; c) 단계 b)로부터의 수득한 용액 중에서 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도 및 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도를 결정하는 단계; 및 d) 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도에 대한 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도의 비율을 기준으로 폴리펩타이드의 총 카보닐화 수준을 결정하는 단계;를 포함한다.
하나의 구현예에서, 하이드라자이드 염료는 LY-CH이다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 알칼리 금속 이온의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드의 아미노산 잔기는 아르기닌, 라이신, 프롤린 및 트레오닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드는 항체이다. 하나의 구현예에서, 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중-특이적 항체, 항체 단편, 항체 약물 접합체, THIOMABTM 또는 THIOMABTM 약물 접합체이다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료는 6,000 - 10,000의 최종 몰비로 단계 a)에서 접촉된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 비-이온성 계면활성제의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 환원된 트리톤 X-100이다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 35℃ - 39℃의 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 10 내지 20시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 b)는 여과, 겔 여과 및 투석으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법에 의해 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 b)는 여과에 의해 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 100 내지 300 mM의 인산칼륨의 존재하에 그리고 200 내지 300 mM 염화칼륨의 존재하에 수행된다.
또 다른 양태에서, 기재내용은 본원에 기재된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이고, 상기 키트는 하이드라자이드 염료 및 완충액을 포함한다. 하나의 구현예에서, 하이드라자이드 염료는 LY-CH이다. 하나의 구현예에서, 완충액은 리튬 MES 완충액이다. 하나의 구현예에서, 상기 키트는 추가로 비-이온성 계면활성제, 폴리펩타이드에 대한 표준물 및 하이드라자이드 염료에 대한 표준물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 환원된 트리톤 X-100이다.
도 1은 금속 촉매 산화로부터의 주요 카보닐화 생성물을 보여준다.
도 2a는 LY-CH와 카보닐기 간의 유도체화 반응을 보여준다.
도 2b는 CALY의 작업 흐름을 보여준다.
도 3a는 280nm에서 LY-CH 유도-mAb 샘플 (피크 통합의 개시 및 말단을 보여주는 화살표들) 및 완충액 블랭크 (보다 낮은 프로파일)의 흡광도를 사용한 크기 배제 크로마토그램을 보여준다.
도 3b는 428nm에서 LY-CH 유도-mAb 샘플 (피크 통합의 개시 및 말단을 보여주는 화살표들) 및 완충액 블랭크 (보다 낮은 프로파일)의 흡광도를 사용한 크기 배제 크로마토그램을 보여준다.
도 4a는 280nm에서 폴리펩타이드 및 LY-CH에 대한 표준 곡선을 보여준다. 표준 곡선의 선형 회귀 보정 후, m1=4813.9; b1=-125.98; m3=35.507; b3=1.4328이다.
도 4b는 428nm에서 폴리펩타이드 및 LY-CH에 대한 표준 곡선을 보여준다. 표준 곡선의 선형 회귀 보정 후, m2=10.085; b2=3.2458; m4=18.735; b4=1.3937이다.
도 5는 18시간의 반응 시간을 갖는 LY-CH-대-mAb 몰비에 대한 유도체화 반응 조건의 최적화를 보여준다.
도 6은 8000:1의 LY CH-대-mAb 몰비를 갖는 반응 시간에 대한 유도체화 반응 조건의 최적화를 보여준다.
도 7a는 CALY 검정의 강인성 평가, 구체적으로 유도체화 반응에 대한 mAb 농도를 보여준다.
도 7b는 CALY 검정의 강인성 평가, 구체적으로 유도체화 반응에 대한 몰비를 보여준다.
도 7c는 CALY 검정의 강인성 평가, 구체적으로 유도체화 반응에 대한 pH 값을 보여준다.
도 7d는 CALY 검정의 강인성 평가, 구체적으로 (여과에 의한) 완충액 교환 단계의 횟수를 보여준다.
도 7e는 CALY 검정의 강인성 평가, 구체적으로 주사 용적을 보여준다.
도 7f는 CALY 검정의 강인성 평가, 구체적으로 동결/해동 주기 수에 대한 샘플 안정성을 보여준다.
도 8은 최대 15시간 동안 2-8 ℃에서 자동-샘플채취기에 저장된 LY-CH-유도된 mAb 샘플의 안정성에 대한 강인성 평가를 보여준다.
도 9는 3일 내 2명의 분석가에 의한 공동-혼합물 샘플의 분석에 의해 검정 선형성 및 검정 정확성, 및 2개의 상이한 HPLC 장비에 대한 방법의 수행능을 보여준다.
도 10은 공동-혼합물 샘플의 분석에 의한 검정 선형성 및 검정 정확성에 대한 DNPH 방법의 수행능을 보여준다.
도 11은 PNGase F 처리의 존재 및 부재하에 산화된 mAb 샘플의 총 단백질 카보닐화 수준을 보여준다.
도 12a는 수득한 총 카보닐화 수준과 Fe(Ⅱ) 간의 관계를 보여준다.
도 12b는 수득한 총 카보닐화 수준과 금속-촉매 산화를 위해 사용되는 과산화수소 농도 간의 관계를 보여준다.
도 12c는 총 카보닐화 수준과, Fe(Ⅱ) 및 금속-촉매 산화를 위해 사용되는 과산화수소 농도 간의 관계를 보여준다.
도 13은 다양한 양의 Fe(Ⅱ) (0.1 μM 및 0.8 μM) 및 PS20 (0.02% 및 0.16%, w/v)을 함유하고, 암실에서 4, 8 및 16주 동안 실온에서 저장된 mAb 샘플의 총 단백질 카보닐화 수준을 보여준다. 조건 B5: 0.8 μM Fe(Ⅱ) 및 0.16% PS20; 조건 B3: 0.1 μM Fe(Ⅱ) 및 0.16% PS20; 조건 B4: 0.8 μM Fe(Ⅱ) 및 0.02% PS20; 조건 B2: 0.1 μM Fe(Ⅱ) 및 0.02% PS20; 조건 B1: Fe(Ⅱ) 또는 PS20 불포함 (대조군).
도 2a는 LY-CH와 카보닐기 간의 유도체화 반응을 보여준다.
도 2b는 CALY의 작업 흐름을 보여준다.
도 3a는 280nm에서 LY-CH 유도-mAb 샘플 (피크 통합의 개시 및 말단을 보여주는 화살표들) 및 완충액 블랭크 (보다 낮은 프로파일)의 흡광도를 사용한 크기 배제 크로마토그램을 보여준다.
도 3b는 428nm에서 LY-CH 유도-mAb 샘플 (피크 통합의 개시 및 말단을 보여주는 화살표들) 및 완충액 블랭크 (보다 낮은 프로파일)의 흡광도를 사용한 크기 배제 크로마토그램을 보여준다.
도 4a는 280nm에서 폴리펩타이드 및 LY-CH에 대한 표준 곡선을 보여준다. 표준 곡선의 선형 회귀 보정 후, m1=4813.9; b1=-125.98; m3=35.507; b3=1.4328이다.
도 4b는 428nm에서 폴리펩타이드 및 LY-CH에 대한 표준 곡선을 보여준다. 표준 곡선의 선형 회귀 보정 후, m2=10.085; b2=3.2458; m4=18.735; b4=1.3937이다.
도 5는 18시간의 반응 시간을 갖는 LY-CH-대-mAb 몰비에 대한 유도체화 반응 조건의 최적화를 보여준다.
도 6은 8000:1의 LY CH-대-mAb 몰비를 갖는 반응 시간에 대한 유도체화 반응 조건의 최적화를 보여준다.
도 7a는 CALY 검정의 강인성 평가, 구체적으로 유도체화 반응에 대한 mAb 농도를 보여준다.
도 7b는 CALY 검정의 강인성 평가, 구체적으로 유도체화 반응에 대한 몰비를 보여준다.
도 7c는 CALY 검정의 강인성 평가, 구체적으로 유도체화 반응에 대한 pH 값을 보여준다.
도 7d는 CALY 검정의 강인성 평가, 구체적으로 (여과에 의한) 완충액 교환 단계의 횟수를 보여준다.
도 7e는 CALY 검정의 강인성 평가, 구체적으로 주사 용적을 보여준다.
도 7f는 CALY 검정의 강인성 평가, 구체적으로 동결/해동 주기 수에 대한 샘플 안정성을 보여준다.
도 8은 최대 15시간 동안 2-8 ℃에서 자동-샘플채취기에 저장된 LY-CH-유도된 mAb 샘플의 안정성에 대한 강인성 평가를 보여준다.
도 9는 3일 내 2명의 분석가에 의한 공동-혼합물 샘플의 분석에 의해 검정 선형성 및 검정 정확성, 및 2개의 상이한 HPLC 장비에 대한 방법의 수행능을 보여준다.
도 10은 공동-혼합물 샘플의 분석에 의한 검정 선형성 및 검정 정확성에 대한 DNPH 방법의 수행능을 보여준다.
도 11은 PNGase F 처리의 존재 및 부재하에 산화된 mAb 샘플의 총 단백질 카보닐화 수준을 보여준다.
도 12a는 수득한 총 카보닐화 수준과 Fe(Ⅱ) 간의 관계를 보여준다.
도 12b는 수득한 총 카보닐화 수준과 금속-촉매 산화를 위해 사용되는 과산화수소 농도 간의 관계를 보여준다.
도 12c는 총 카보닐화 수준과, Fe(Ⅱ) 및 금속-촉매 산화를 위해 사용되는 과산화수소 농도 간의 관계를 보여준다.
도 13은 다양한 양의 Fe(Ⅱ) (0.1 μM 및 0.8 μM) 및 PS20 (0.02% 및 0.16%, w/v)을 함유하고, 암실에서 4, 8 및 16주 동안 실온에서 저장된 mAb 샘플의 총 단백질 카보닐화 수준을 보여준다. 조건 B5: 0.8 μM Fe(Ⅱ) 및 0.16% PS20; 조건 B3: 0.1 μM Fe(Ⅱ) 및 0.16% PS20; 조건 B4: 0.8 μM Fe(Ⅱ) 및 0.02% PS20; 조건 B2: 0.1 μM Fe(Ⅱ) 및 0.02% PS20; 조건 B1: Fe(Ⅱ) 또는 PS20 불포함 (대조군).
Ⅰ. 정의
본 명세서를 번역할 목적으로 이하의 정의가 적용되며, 적절한 경우 단수형으로 사용된 용어는 복수형을 포함하며, 그 반대로도 사용된다. 하기에 제시된 임의의 정의가 본원에 참조로 인용된 임의의 문헌과 모순되는 경우에, 하기에 제시된 정의가 조절한다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은, 단수 형태 "a", "or" 및 "the"는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는다면, 복수형 지시대상을 포함한다. 본원에 기재된 본 발명의 측면 및 변형은 상기 측면 및 상기 변형"으로 이루어진(consisting)" 및/또는 "필수적으로 이루어진(consisting essentially of)"을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "약(about)"은 본 기술 분야에서 당업자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상의 오차 범위를 말한다. 본 명세서에 사용된 용어 “약”은 당업자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 보통의 오차 범위를 지칭한다.
본원에서 용어 "항체(antibody)"는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 이들이 목적하는 항원-결합 활성, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 항체 약물 접합체, THIOMABTM 및 THIOMABTM 약물 접합체를 나타내는 한, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 항체 단편을 포함하지만 이제 제한되지 않는 다양한 항체 구조물을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "카보닐화(carbonylation)"는, 예를 들어 도 1에 나타낸 바와 같이 폴리펩타이드 내 아미노산 잔기에 대한 알데히드 또는 케톤 기의 형성을 말한다. 본원에 사용된 용어 "총 카보닐화 수준(total carbonylation level)"은 폴리펩타이드의 단위 양 (nmol 또는 mg) 당 카보닐기의 양(nmol)을 말한다.
본원에 사용된 용어 "유도체화(derivatization)"는, 아미노산 또는 폴리펩타이드 골격 구조가 변화되지 않는 상태를 유지하면서 아미노산 또는 폴리펩타이드의 화학적 성질을 변화시키는 화학 반응을 말한다. 구체적으로, 본원에서 LY-CH는 아미노산 또는 폴리펩타이드에 대한 카보닐기를 화학적으로 변형시키기 위해 도 2a에 나타낸 바와 같은 화학 반응에 사용되며, 이로 인해 폴리펩타이드-염료-복합체는 [도 2a에 나타낸 바와 같은 쉬프 염기(schiff base)를 형성하는 루시퍼 옐로우 카보하이드라자이드 상의 하이드라자이드 그룹과 폴리펩타이드 상의 카보닐기 간의 반응에 의해] 형성된다.
본원에 사용된 용어 "통합된 흡광도 피크 면적(integrated absorbance peak area)"은, 특정 파장에서 특이적 분석물에 대해 측정된 크로마토그램에서 곡선 이하 면적을 말한다. 예를 들어, 도 3은 LY-CH 유도-mAb 샘플의 280nm (도 3a) 및 428nm (도 3b)에서의 흡광도를 갖는 크기 배제 크로마토그램을 보여준다. 상기 화살표는 피크 통합을 위한 개시점 및 종점을 보여준다. 도 3에서 통합된 흡광도 피크 면적은 개시점 및 종점 사이에 있는 곡선 이하 면적이다.
용어 "선형 회귀 보정 (linear regression fitting)"은 하기 문헌에 기재된 바와 같이 본원에 사용된다: Yan, X., Gang Su, X. (2009), Linear Regression Analysis: Theory and Computing, World Scientific.
본원에 사용된 용어 “루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow)”, “루시퍼 옐로우 카보하이드라자이드(Lucifer Yellow carbohydrazide)”, “루시퍼 옐로우 CH”, “LY” 또는 “LY-CH”는 루시퍼 옐로우의 미결합 및/또는 결합된 형태를 말한다. 루시퍼 옐로우는 280nm 및 428nm에서 전자기 방사선의 강한 흡광도를 갖는 수용성 염료이다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩타이드-염료-복합체(polypeptide-dye-complex)”는, 하이드라자이드 염료와 반응함으로써 폴리펩타이드-염료-복합체를 형성하는 폴리펩타이드를 말한다. 구체적으로, 본원에 사용된 용어 "폴리펩타이드-염료-복합체”는 상기된 바와 같이 LY-CH와 반응하는 폴리펩타이드를 말한다. 용어 “미결합된 하이드라자이드 염료”는 구체적으로 유도체화 시약으로서, 즉 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합되지 않는 본원에 사용된 바와 같은 하이드라자이드 염료를 말한다. 용어 “미결합된 LY-CH”는 구체적으로 유도체화 시약으로서, 즉 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합되지 않는 본원에 사용된 바와 같은 LY-CH를 말한다. 용어 “루시퍼 옐로우”, “루시퍼 옐로우 카보하이드라자이드”, “루시퍼 옐로우 CH”, “LY” 또는 “LY-CH”는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 LY-CH는 LY-CH 디리튬 염으로서 사용된다.
본원에 사용된 용어 "하이드라자이드 염료(hydrazide dye)"는, 작용기로서 하이드라자이드를 포함하는 염료를 말한다. 하이드라자이드 염료에 대한 일반적인 구조는 E-N(R)-N(R)2이고, 여기서 R은 수소일 수 있고, E는 염료이다. 상기 용어 “염료”는 예를 들어, 428nm의 파장에서 전자기 방사선을 흡수하는 분자 또는 모이어티(moiety)를 말한다.
본원에 사용된 용어 “몰비(molar ratio)”는, 본원에 기재된 바와 같은 유도체화 반응에서 폴리펩타이드의 양 (몰)에 대해 사용되는 LY-CH의 양 (몰)의 비율을 말한다.
본원에 사용된 필터 유닛의 용어 “명목적 분자량 한계(nominal molecular weight limit)”는, 필터 유닛의 공극 크기를 말하고, 이에 의해 특정 분자량의 용질의 적어도 90%가 보유되고, 예를 들어 30 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛은 30 kDa의 분자량을 갖는 용질의 적어도 90%를 보유한다.
본원에 사용된 용어 "비-이온성 계면활성제(non-ionic surfactant)"는, 2개의 액체 간에 또는 액체와 고체 간에 표면 장력을 저하시키는 능력을 갖는 비-이온성 제제를 말한다. 비-이온성 계면활성제의 예는 노니데트(Nonidet) P-40, 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100, 환원된 트리톤 X-100, 트윈 20 및 트윈 80이다. 본원에 사용된 용어 “환원된 트리톤 X-100”은, 벤젠 고리가 사이클로헥산 고리로 환원된 트리톤 X-100을 말한다. 벤젠 고리로 인해, 비환원된 트리톤 X-100은 폴리펩타이드의 흡수 스펙트럼 (260nm - 280nm)과 중첩하는 흡수 스펙트럼을 갖는다. 사이클로헥산 고리로의 환원은 트리톤 X-100과 폴리펩타이드의 흡수 스펙트럼의 중첩이 일어나지 않음으로 트리톤 X-100이 폴리펩타이드의 분석을 위해 적합하게 한다.
용어 “폴리펩타이드(polypeptide)” 또는 “단백질(protein)”은, 본원에서 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 말하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 폴리머는 선형이거나 측쇄형일 수 있고, 이것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이것은 비-아미노산에 의해 방해될 수 있다. 용어는 또한 천연적으로 변형되거나, 개입, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다. 또한 상기 정의에 포함되는 것은 예를 들어, 당업계에 공지된 다른 변형뿐만 아니라 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함하는) 아미노산의 하나 이상의 유사체를 함유하는 폴리펩타이드이다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 특히 항체를 포함한다.
Ⅱ. 방법
본원의 개시 내용에서, 폴리펩타이드의 총 카보닐화 수준을 측정하기 위한 단순화되고, 보다 강하고 보다 정확한 단백질 카보닐화 검정이 제공된다. 이전에 말된 바와 같이, 단백질 침전 및 세척을 통한 미결합된 하이드라자이드의 제거는 노동-집약적 공정이고, 예를 들어 샘플 손실로 인한 실험 가변성의 주요 원인을 구성한다. LY-CH는 이것이 비교적 높은 수용해도 (~200 mM)를 갖고 DNPH와 같은 많은 하이드라자이드보다 상당히 높은 친수성을 갖기 때문에, 유도체화 시약으로서 선택되었다. LY-CH의 수용성 및 친수성 성질은 우수한 샘플 회수를 유도하는 완충액 교환 여과 공정에 의한 미결합된 LY-CH의 제거를 가능하게 한다. 본원의 개시 내용에서, LY-CH의 상기 용해도는 완충 제제에 대해 수산화리튬을 사용함에 의해 더욱 개선되었다. 개선된 완충액 중 리튬 이온의 존재를 기초로 하는 LY-CH의 개선된 용해도는 유도체화 반응에 대해 보다 높은 LY-CH-대-폴리펩타이드 몰비의 사용, 및 통상적인 완충액 시스템과 비교하여 유도체화 후 잔여 LY-CH 시약의 보다 용이한 제거를 가능하게 한다. 유도체화 시약으로서 사용되는 LY-CH의 또 다른 이점은 수용액 중 루시퍼 옐로우 모이어티의 화학적 안정성이다. 상기 특성은 심지어 일시에 다중 샘플의 분석이 수행되는 경우에도 분석 시간 경과 동안에 수득한 하이드라존 뿐만 아니라 유도체화 시약의 발색단의 안정성을 보장한다.
하나의 측면에서, 상기 기재 내용은 폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 a) 용액 중 폴리펩타이드를 하이드라자이드 염료가 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 상에 존재하는 카보닐기와 반응하여 폴리펩타이드-염료-복합체를 형성할 수 있도록 하는 조건하에서 하이드라자이드 염료와 접촉시키는 단계; b) 단계 a)로부터의 수득한 용액으로부터 미결합된 하이드라자이드 염료를 제거하는 단계; c) 단계 b)로부터의 수득한 용액 중에서 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도 및 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도를 결정하는 단계; 및 d) 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도에 대한 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도의 비율을 기준으로 폴리펩타이드의 총 카보닐화 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 기재내용은 폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 a) 용액 중 폴리펩타이드를 하이드라자이드 염료가 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 상에 존재하는 카보닐기와 반응하여 폴리펩타이드-염료-복합체를 형성할 수 있도록 하는 조건하에서 하이드라자이드 염료와 접촉시키는 단계; b) 단계 a)로부터의 수득한 용액으로부터 미결합된 하이드라자이드 염료를 제거하는 단계; c) 단계 b)로부터의 수득한 용액을 크로마토그래피에 적용하여 i) 제1 통합된 피크 면적을 생성하는 제1 파장에서의 크로마토그램, 및 ⅱ) 제2 통합된 피크 면적을 생성하는 제2 파장에서의 크로마토그램을 생성하는 단계; 및 d) 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도에 대한 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도의 비율을 기준으로 폴리펩타이드의 총 카보닐화 수준을 결정하는 단계로서 각각이 제1 통합된 피크 면적 및 제2 통합된 피크 면적을 기준으로 결정되는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 기재내용은 폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 a) 용액 중 폴리펩타이드를 하이드라자이드 염료가 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 상에 존재하는 카보닐기와 반응하여 폴리펩타이드-염료-복합체를 형성할 수 있도록 하는 조건하에서 하이드라자이드 염료와 접촉시키는 단계; b) 단계 a)로부터의 수득한 용액으로 부터 미결합된 하이드라자이드 염료를 제거하는 단계; c) 단계 b)로부터의 수득한 용액을 크로마토그래피에 적용하여 i) 제1 통합된 피크 면적을 생성하는 제1 파장에서의 크로마토그램, 및 ⅱ) 제2 통합된 피크 면적을 생성하는 제2 파장에서의 크로마토그램을 생성하는 단계; d) 4개의 표준 곡선인, i) 제1 파장에서의 하이드라지드 염료에 대한 표준 곡선, ⅱ) 제2 파장에서의 하이드라지드 염료에 대한 표준 곡선, ⅲ) 제1 파장에서 폴리펩타이드에 대한 표준 곡선, 및 ⅳ) 제2 파장에서 폴리펩타이드에 대한 표준 곡선을 생성하는 단계; e) 4개의 표준 곡선, 제1 통합된 피크 면적 및 제2 통합된 피크 면적을 기준으로 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라지드 염료의 농도 및 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도를 계산하는 단계, 및 f) 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도에 대한 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도의 비율을 기준으로 폴리펩타이드의 총 카보닐화 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 하이드라자이드 염료는 Cy3 하이드라자이드, Cy5 하이드라자이드, Cy5.5 하이드라자이드, Cy7 하이드라자이드, Cy7.5 하이드라자이드, 쿠마린 하이드라자이드, iFluor™ 염료 하이드라자이드, HiLyte™ 플루오르 647 하이드라자이드, Alexa Fluor®488 하이드라자이드, Alexa Fluor®568 하이드라자이드, Alexa Fluor®633 하이드라자이드 및 루시퍼 옐로우 하이드라자이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 하이드라자이드 염료는 LY-CH이다. 하나의 구현예에서, 하이드라자이드 염료는 LY-CH 디리튬 염이다.
하나의 구현예에서, 단계 a)는 알칼리 금속 이온의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 이온은 1 - 100 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 이온은 10 - 90 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 이온은 20 - 80 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 이온은 30 - 70 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 이온은 40 - 60 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 이온은 45 - 55 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 이온은 46 - 54 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 이온은 47 - 53 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 이온은 48 - 52 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 이온은 49 - 51 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 이온은 약 50 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 이온은 50 mM의 농도로 존재한다.
하나의 구현예에서, 단계 a)에 존재하는 알칼리 금속 이온은 리튬 이온, 나트륨 이온 및 칼륨 이온으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)에 존재하는 알칼리 금속 이온은 리튬 이온이다. 하나의 구현예에서, 리튬 이온은 1 - 100 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 리튬 이온은 10 - 90 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 리튬 이온은 20 - 80 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 리튬 이온은 30 - 70 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 리튬 이온은 40 - 60 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 리튬 이온은 45 - 55 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 리튬 이온은 46 - 54 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 리튬 이온은 47 - 53 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 리튬 이온은 48 - 52 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 리튬 이온은 49 - 51 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 리튬 이온은 약 50 mM의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 리튬 이온은 50 mM의 농도로 존재한다.
본원의 개시내용에서, 428nm에서의 보정된 흡광도는 428nm에서의 폴리펩타이드 기여분을 공제함에 의해 샘플 중 카보닐의 몰 농도를 계산하는데 사용되고; 이와 상응하듯이, 280nm에서의 보정된 흡광도는 280nm에서의 LY-CH 기여분을 공제함으로써 폴리펩타이드 농도/양을 계산하는데 사용된다. 비교시, 다른 검정은 카보닐화 함량의 과대평가를 유도하는, 카보닐 함량을 정량하기 위한 하이드라자이드 시약의 각각의 흡광도에 대한 428nm에서의 단백질 기여분을 보정하지 않는다. 달리 말하면, 폴리펩타이드-결합된 루시퍼 옐로우 모이어티 및 폴리펩타이드 성분 둘 다가 280nm 및 428nm에서 측정된 흡광도 피크 면적에 기여하기 때문에, LY-CH의 각각의 농도 및 폴리펩타이드의 각각의 농도는 LY-CH 표준물 및 (폴리펩타이드 표준물로서) 비유도된 mAb에 대해 생성된 표준 곡선을 사용하여 계산하였다. 따라서, 하나의 구현예에서, 루시퍼 옐로우의 흡광도에 대한 보정 및 폴리펩타이드의 흡광도에 대한 보정이 수행된다.
하나의 구현예에서, 제1 파장은 420 - 440nm 범위이다. 하나의 구현예에서, 제1 파장은 425 - 435nm 범위이다. 하나의 구현예에서, 제1 파장은 426 - 430nm 범위이다. 하나의 구현예에서, 제1 파장은 427 - 428nm 범위이다. 하나의 구현예에서, 제1 파장은 약 428nm이다. 하나의 구현예에서, 제1 파장은 428nm이다.
하나의 구현예에서, 제2 파장은 270 - 290nm 범위이다. 하나의 구현예에서, 제2 파장은 275 - 285nm 범위이다. 하나의 구현예에서, 제2 파장은 278 - 282nm 범위이다. 하나의 구현예에서, 제2 파장은 279 - 281nm 범위이다. 하나의 구현예에서, 제2 파장은 약 280nm이다. 하나의 구현예에서, 제2 파장은 280nm이다.
본원에 기재된 바와 같이, 카보닐화는 항체와 같은 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 상에 존재한다. 하나의 구현예에서, 카보닐화가 존재하는 아미노산 잔기는 아르기닌, 라이신, 프롤린 및 트레오닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 카보닐화는 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 알데히드기 상에 존재한다. 하나의 구현예에서, 카보닐화는 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 케톤기 상에 존재한다.
하나의 구현예에서, 폴리펩타이드는 동종-다량체 폴리펩타이드이다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드는 동종-이량체 또는 동종-삼량체이다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드는 이종-다량체 폴리펩타이드이다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드는 생물학적 활성 폴리펩타이드이다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드는 항체이다. 하나의 구현예에서, 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중-특이적 항체, 항체 약물 접합체, THIOMABTM 및 THIOMABTM 약물 접합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 항체는 G 부류의 서브클래스 IgG1 또는 서브클래스 IgG4 또는 이의 변이체이다. 하나의 구현예에서, 항체는 항체 단편이다. 하나의 구현예에서, 항체 단편은 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv), 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료는 6,000 - 10,000의 최종 몰비로 접촉된다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료는 7,000 - 9,000의 최종 몰비로 접촉된다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료는 7,500 - 8,500의 최종 몰비로 접촉된다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료는 7,800 - 8,200의 최종 몰비로 접촉된다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료는 7,900 - 8,100의 최종 몰비로 접촉된다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료는 7,950 - 8,050의 최종 몰비로 접촉된다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료는 6,000, 7,000, 8,000, 9,000 및 10,000으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 최종 몰비로 접촉된다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료는 약 8,000의 최종 몰비로 접촉된다. 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료는 8,000의 최종 몰비로 접촉된다. 하나의 구현예에서, 하이드라자이드 염료는 LY-CH이다.
하나의 구현예에서, 단계 a)는 비-이온성 계면활성제의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 0.01% (w/v) - 5% (w/v)의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 0.1% (w/v) - 5% (w/v)의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 0.2% (w/v) - 4% (w/v)의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 0.3% (w/v) - 3% (w/v)의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 0.4% (w/v) - 2% (w/v)의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 0.5% (w/v) - 1.5% (w/v)의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 0.6% (w/v) - 1.4% (w/v)의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 0.7% (w/v) - 1.3% (w/v)의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 0.8% (w/v) - 1.2% (w/v)의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 0.9% (w/v) - 1.1% (w/v)의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 1% (w/v)의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 약 0.05% (w/v)의 농도로 존재한다.
하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 노니데트(Nonidet) P-40, 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100, 환원된 트리톤 X-100, 트윈 20 및 트윈 80으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 환원된 트리톤 X-100이다.
하나의 구현예에서, 단계 a)는 암실에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 1차 또는 2차 아민을 함유하지 않는 완충액에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 pH 4-7의 수용력을 갖는 완충액에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 1차 또는 2차 아민을 함유하지 않는 MES, MOPS, HEPES, 및 PIPES로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 완충액에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 MES 완충액에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 리튬 MES 완충액에서 수행된다.
하나의 구현예에서, 단계 a)는 5-7의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 5.5-6.5의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 5.6-6.4의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 5.7-6.3의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 5.8-6.2의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 5.9-6.1의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 약 5.9의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 약 6.0의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 약 6.1의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 5.9의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 6.0의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 6.1의 pH 값에서 수행된다.
하나의 구현예에서, 단계 a)는 35℃ - 39℃의 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 36℃ - 38℃의 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 36.5℃ - 37.5℃의 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 약 37℃의 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 37℃의 온도에서 수행된다.
하나의 구현예에서, 단계 a)는 1 내지 50시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 5 내지 40시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 8 내지 30시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 11 내지 25시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 12 내지 20시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 13 내지 19시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 14 내지 18시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 15 내지 17시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 약 16시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 16시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 17 내지 19시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 약 18시간 동안 수행된다. 하나의 구현예에서, 단계 a)는 18시간 동안 수행된다.
하나의 구현예에서, 미결합된 하이드라자이드 염료의 제거는 여과, 겔 여과 및 투석으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법에 의해 수행된다. 하나의 구현예에서, 미결합된 하이드라자이드 염료의 제거는 여과에 의해 수행된다. 폴리펩타이드로부터 하이드라자이드 염료를 분리할 수 있는 임의의 필터가 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 여과는 5-50 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 5 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 10 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 15 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 20 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 25 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 30 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 35 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 40 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 45 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 50 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 미결합된 하이드라자이드 염료의 제거는 겔 여과에 의해 수행된다. 하나의 구현예에서, 미결합된 하이드라자이드 염료의 제거는 투석에 의해 수행된다.
하나의 구현예에서, 여과는 100 내지 300 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 110 내지 290 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 120 내지 280 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 130 내지 270 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 140 내지 260 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 150 내지 250 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 160 내지 240 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 170 내지 230 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 180 내지 220 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 190 내지 210 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 195 내지 205 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 약 200 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 200 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다.
하나의 구현예에서, 여과는 200 내지 300 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 210 내지 290 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 220 내지 280 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 230 내지 270 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 240 내지 260 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 245 내지 255 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 약 250 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 250 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다.
하나의 구현예에서, 여과는 100 내지 300 mM의 인산칼륨의 존재하에 그리고 200 내지 300 mM 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 200 mM의 인산칼륨의 존재하에 그리고 250 mM 염화칼륨의 존재하에 수행된다.
하나의 구현예에서, 여과는 5.4 내지 7.0의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 5.5 내지 6.9의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 5.6 내지 6.8의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 5.7 내지 6.7의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 5.8 내지 6.6의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 5.9 내지 6.5의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 6.0 내지 6.4의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 6.1 내지 6.3의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 약 6.2의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 여과는 6.2의 pH 값에서 수행된다.
하나의 구현예에서, 크로마토그래피 동안에, 폴리펩타이드-염료-복합체는 폴리펩타이드-염료-복합체와 미결합된 하이드라자이드 염료 간의 간섭이 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이 존재하지 않도록 미결합된 하이드라자이드 염료로부터 분리된다. 본원에 사용된 용어 “간섭 없음(no interference)”은, 크로마토그래피 동안에 폴리펩타이드-염료-복합체의 (10 내지 22분에서 용출되는) 기준선 분리된 피크(baseline resolved peak)와 미결합된 하이드라자이드 염료의 (대략 24분에서 용출되는) 기준선 분리된 피크 간에 중첩이 없거나 어떠한 관련 중첩도 없음을 의미한다.
추가로, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 단계 c)에서 사용되었고, 여기서, 상기 미결합된 LY-CH는 폴리펩타이드-염료-복합체로부터 분리된다. SEC를 사용하는 잇점은 하기 실시예에 기재된 강인성 실험에 의해 입증된 바와 같이 샘플 중에 존재하는 미결합된 LY-CH의 가변량에 의해 정량이 영향받지 않는다는 것이다. 유도체화를 위한 LY-CH 및 정량을 위한 SEC 분석을 사용하는 조합은, 따라서 전적으로 및 재생적으로 최적의 방법 수행능을 위한 미결합된 하이드라자이드 시약을 제거하는 것에 의존하지 않는 개선된 샘플 제조 과정을 제공한다.
따라서, 하나의 구현예에서, 크로마토그래피는 크기 배제 크로마토그래피이다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 0.1-0.9 ㎖/분의 등용매 흐름(isocratic flow)으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 0.2-0.8 ㎖/분의 등용매 흐름으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 0.3-0.7 ㎖/분의 등용매 흐름으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 0.4-0.6 ㎖/분의 등용매 흐름으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 약 0.5 ㎖/분의 등용매 흐름으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 0.5 ㎖/분의 등용매 흐름으로 수행된다.
하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 20℃ 내지 30℃의 칼럼 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 21℃ 내지 29℃의 칼럼 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 22℃ 내지 28℃의 칼럼 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 23℃ 내지 27℃의 칼럼 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 24℃ 내지 26℃의 칼럼 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 약 25℃의 칼럼 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 25℃의 칼럼 온도에서 수행된다.
하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 100 내지 300 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 110 내지 290 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 120 내지 280 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 130 내지 270 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 140 내지 260 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 150 내지 250 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 160 내지 240 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 170 내지 230 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 180 내지 220 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 190 내지 210 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 195 내지 205 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 약 200 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 200 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행된다.
하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 200 내지 300 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 210 내지 290 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 220 내지 280 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 230 내지 270 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 240 내지 260 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 245 내지 255 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 약 250 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 250 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행된다.
하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 5.4-7.0의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 5.5-6.9의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 5.6-6.8의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 5.7-6.7의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 5.8-6.6의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 5.9-6.5의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 6.0-6.4의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 6.1-6.3의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 약 6.2의 pH 값에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 6.2의 pH 값에서 수행된다.
하나의 구현예에서, 4개의 표준 곡선은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 생성된다. 하나의 구현예에서, 4개의 표준 곡선은 하기의 수학식을 사용하여 생성된다.
수학식 1을 사용한 4번째 표준 곡선 (280nm에서의 폴리펩타이드): y1=m1x+b1
수학식 2를 사용한 3번째 표준 곡선 (428nm에서의 폴리펩타이드): y2=m2x+b2
수학식 3을 사용한 2번째 표준 곡선 (280nm에서의 루시퍼 옐로우): y3=m3z+b3
수학식 4를 사용한 1번째 표준 곡선 (428nm에서의 루시퍼 옐로우): y4=m4z+b4
여기서, x는 폴리펩타이드의 농도(mg/㎖)이고, z는 루시퍼 옐로우의 몰 농도(μM)이고, m1 내지 m4 및 b1 내지 b4는 선형 회귀 보정으로부터 수득된 상수이다.
하나의 구현예에서, 폴리펩타이드의 카보닐화 수준은 2개-가변 (x 및 z) 선형 수학식을 풀이함에 의해 z/x (nmol/mg)로서 계산된다:
수학식 5: 
수학식 6: 
여기서, z는 카보닐기의 몰 농도 (μM)이고, x는 단백질 농도 (mg/㎖)이고; A280는 도 3a에 설명된 바와 같은, 280nm 흡광도로부터의 LY-CH 유도된 mAb 종의 통합된 피크 면적이고; A428은 도 3b에 설명된 바와 같은, 428nm 흡광도로부터의 LY-CH 유도된 mAb 종의 통합된 피크 면적이다.
z 및 x는 하기와 같이 나타낸 선형 수학식 5 및 6을 풀이함에 의해 결정될 수 있다:
총 카보닐화 수준은 이어서 z/x로서 계산된다.
Ⅲ.
키트
본원에 기재된 적용에 사용하기 위해, 키트 또는 제품이 또한 제공된다. 상기 키트는 폐쇄 국한된 곳에 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기 수단(container means)을 수용하도록 격실화된 캐리어 수단을 포함할 수 있고, 상기 용기 수단 각각은 상기 방법에 사용될 별개의 구성요소들 중 하나를 포함한다. 하나의 구현예에서, 용기 수단 중 하나는 하이드라자이드 염료를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 하이드라자이드 염료는 Cy3 하이드라자이드, Cy5 하이드라자이드, Cy5.5 하이드라자이드, Cy7 하이드라자이드, Cy7.5 하이드라자이드, 쿠마린 하이드라자이드, iFluor™ 염료 하이드라자이드, HiLyte™ 플루오르 647 하이드라자이드, Alexa Fluor®488 하이드라자이드, Alexa Fluor®568 하이드라자이드, Alexa Fluor®633 하이드라자이드 및 LY-CH로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 하이드라자이드 염료는 LY-CH이다. 하나의 구현예에서, 하이드라자이드 염료는 LY-CH 디리튬 염이다. 하나의 구현예에서, 용기 수단 중 하나는 완충액을 포함한다. 하나의 구현예에서, 용기 수단 중 하나는 디리튬 이온을 포함하는 완충액을 포함한다. 하나의 구현예에서, 완충액은 1차 또는 2차 아민을 함유하지 않는다. 하나의 구현예에서, 완충액은 pH 4-7의 수용력을 갖는다. 하나의 구현예에서, 완충액은 1차 또는 2차 아민을 함유하지 않는 MES, MOPS, HEPES, 및 PIPES로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 완충액은 리튬 MES 완충액이다. 하나의 구현예에서, 완충액은 6.0의 pH 값에서 리튬 MES 완충액이다. 하나의 구현예에서, 완충액은 6.1의 pH 값에서 리튬 MES 완충액이다.
하나의 구현예에서, 용기 수단 중 하나는 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 노니데트(Nonidet) P-40, 옥틸-베타-글루코사이드, 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100, 환원된 트리톤 X-100, 트윈 20 및 트윈 80으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 환원된 트리톤 X-100이다.
하나의 구현예에서, 용기 수단 중 하나는 폴리펩타이드에 대한 표준물을 포함하고, 용기 수단 중 하나는 하이드라자이드 염료에 대한 표준물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 용기 수단 중 하나는 필터 유닛을 포함한다. 하나의 구현예에서, 필터 유닛은 30 kDa 필터 유닛이다. 하나의 구현예에서, 용기 수단 중 하나는 인산칼륨을 포함한다. 하나의 구현예에서, 용기 수단 중 하나는 염화칼륨을 포함한다.
키트는 전형적으로 상기 기재된 용기, 및 완충액, 희석제, 필터, 니들, 주사기, 및 사용 설명서를 갖춘 패키지 삽입물을 포함한, 상업적 사용자 입장에서 바람직한 물질을 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 포함할 것이다. 상기 조성물이 비치료적 적용에 사용됨을 나타내도록 용기 상에 라벨이 부여되며, 상기 라벨에는 또한 상기 기재한 바와 같이 시험관내 사용을 위한 지침도 나타나있다. 키트 내 다른 선택적인 성분은 하나 이상의 완충액 (예를 들어, 유도체화 완충액, 블록 완충액, 세척 완충액, 기질 완충액 등), 다른 시약, 예를 들어, 효소적 표지, 에피토프 회수 용액, 대조군 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조군 슬라이드(들) 등에 의해 화학적으로 변형된 기질 (예를 들어, 크로마겐)을 포함한다.
Ⅳ. 특정
구현예
1. 폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는 방법:
a) 용액 중 폴리펩타이드를, 하이드라자이드 염료가 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 상에 존재하는 카보닐기와 반응하여 폴리펩타이드-염료-복합체를 형성할 수 있도록 하는 조건하에서, 하이드라자이드 염료와 접촉시키는 단계;
b) 단계 a)로부터 수득한 용액으로부터 미결합된 하이드라자이드 염료를 제거하는 단계;
c) 단계 b)로부터 수득한 용액 중에서 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도 및 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도를 결정하는 단계; 및
d) 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도에 대한 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도의 비율을 기준으로, 폴리펩타이드의 총 카보닐화 수준을 결정하는 단계.
2. 폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는 방법:
a) 용액 중 폴리펩타이드를, 하이드라자이드 염료가 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 상에 존재하는 카보닐기와 반응하여 폴리펩타이드-염료-복합체를 형성할 수 있도록 하는 조건하에서, 하이드라자이드 염료와 접촉시키는 단계;
b) 단계 a)로부터 수득한 용액으로부터 미결합된 하이드라자이드 염료를 제거하는 단계;
c) 단계 b)로부터 수득한 용액을 크로마토그래피에 적용하여, i) 제1 통합 피크 영역을 생성하는 제1 파장에서의 크로마토그램, 및 ⅱ) 제2 통합 피크 면적을 생성하는 제2 파장에서의 크로마토그램을 생성시키는 단계, 및
d) 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도에 대한 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도의 비율을 기준으로 폴리펩타이드의 총 카보닐화 수준을 결정하는 단계로서, 상기 각각의 농도는 제1 통합 피크 면적 및 제2 통합 피크 면적을 기준으로 결정하는 단계.
3. 폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함한다:
a) 용액 중 폴리펩타이드를, 하이드라자이드 염료가 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 상에 존재하는 카보닐기와 반응하여 폴리펩타이드-염료-복합체를 형성할 수 있도록 하는 조건하에서, 하이드라자이드 염료와 접촉시키는 단계;
b) 단계 a)로부터 수득한 용액으로부터 미결합된 하이드라자이드 염료를 제거하는 단계;
c) 단계 b)로부터 수득한 용액을 크로마토그래피에 적용하여, i) 제1 통합 피크 영역을 생성하는 제1 파장에서의 크로마토그램, 및 ⅱ) 제2 통합 피크 면적을 생성하는 제2 파장에서의 크로마토그램을 생성시키는 단계; 및
d) 4개의 표준 곡선인, i) 제1 파장에서의 하이드라자이드 염료에 대한 표준 곡선, ⅱ) 제2 파장에서의 하이드라자이드 염료에 대한 표준 곡선, ⅲ) 제1 파장에서의 폴리펩타이드에 대한 표준 곡선, 및 ⅳ) 제2 파장에서의 폴리펩타이드에 대한 표준 곡선을 생성하는 단계;
e) 4개의 표준 곡선, 제1 통합 피크 면적 및 제2 통합 피크 면적을 기준으로 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도 및 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도를 계산하는 단계; 및
f) 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도에 대한 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도의 비율을 기준으로, 폴리펩타이드의 총 카보닐화 수준을 결정하는 단계.
4. 상기 1~3의 구현예 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 하이드라자이드 염료는 Cy3 하이드라자이드, Cy5 하이드라자이드, Cy5.5 하이드라자이드, Cy7 하이드라자이드, Cy7.5 하이드라자이드, 쿠마린 하이드라자이드, iFluor™ 염료 하이드라자이드, HiLyte™ Fluor 647 하이드라자이드, Alexa Fluor®488 하이드라자이드, Alexa Fluor®568 하이드라자이드, Alexa Fluor®633 하이드라자이드및 LY-CH로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
5. 상기 1~4의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 하이드라자이드 염료가 LY-CH인, 방법.
6. 상기 1~5의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)가 알칼리 금속 이온의 존재하에 수행되는, 방법.
7. 구현예 6에 있어서, 상기 알칼리 금속 이온이 1 - 100 mM의 농도로 존재하는, 방법.
8. 구현예 6에 있어서, 상기 알칼리 금속 이온은 50 mM의 농도로 존재하는, 방법.
9. 구현예 6 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 알칼리 금속 이온이 리튬 이온, 나트륨 이온 및 칼륨 이온으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
10. 구현예 6 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 알칼리 금속 이온이 리튬 이온인, 방법.
11. 상기 1~10의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)가 리튬 MES 완충액에서 수행되는, 방법.
12. 상기 1~11의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)에서의 반응이 유도체화인, 방법.
13. 상기 1~12의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 제1 파장이 426nm-430nm 범위인, 방법.
14. 상기 1~13의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 제1 파장이 428nm인, 방법.
15. 상기 1~14의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 제2 파장이 278 nm-282 nm 범위인, 방법.
16. 상기 1~15의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 제2 파장이 280nm인, 방법.
17. 상기 1~16의 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 아미노산 잔기가 아르기닌, 라이신, 프롤린 및 트레오닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
18. 상기 1~17의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 항체인, 방법.
19. 구현예 18에 있어서, 상기 항체가 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중-특이적 항체, 항체 단편, 항체 약물 접합체, THIOMABTM 또는 THIOMABTM 약물 접합체인, 방법.
20. 상기 1~19의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료가 단계 a)에서 6,000 - 10,000의 최종 몰비로 접촉되는, 방법.
21. 상기 1~20의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료가 단계 a)에서 8,000의 최종 몰비로 접촉되는, 방법.
22. 상기 1~21의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)가 비이온성 계면활성제의 존재하에 수행되는, 방법.
23. 구현예 22에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제가 노니데트(Nonidet) P-40, 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100, 환원된 트리톤 X-100, 트윈 20 및 트윈 80으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
24. 구현예 22에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제가 환원된 트리톤 X-100인, 방법.
25. 구현예 22 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제가 0.01% (w/v) ~ 5% (w/v)의 농도로 존재하는, 방법.
26. 구현예 22 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제가 0.05% (w/v)의 농도로 존재하는, 방법.
27. 구현예 22 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제가 1% (w/v)의 농도로 존재하는, 방법.
28. 상기 1~27의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)가 암실에서 수행되는, 방법.
29. 상기 1~28의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)가 5-7의 pH 값에서 수행되는, 방법.
30. 상기 1~29의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)가 6.0의 pH 값에서 수행되는, 방법.
31. 상기 1~30의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)가 6.1의 pH 값에서 수행되는, 방법.
32. 상기 1~31의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)가 35℃ - 39℃의 온도에서 수행되는, 방법.
33. 상기 1~32의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)가 37℃에서 수행되는, 방법.
34. 상기 1~33의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)가 10-20시간 동안 수행되는, 방법.
35. 상기 1~34의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)가 16시간 동안 수행되는, 방법.
36. 상기 1~35의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 a)가 18시간 동안 수행되는, 방법.
37. 상기 1~36의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 단계 b)에서 상기 미결합된 하이드라자이드 염료의 제거가 여과, 겔 여과 및 투석으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는, 방법.
38. 상기 1~37의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 미결합된 하이드라자이드 염료의 제거가 여과에 의해 수행되는, 방법.
39. 구현예 35에 있어서, 상기 여과가 5-50 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행되는, 방법.
40. 구현예 35에 있어서, 상기여과가 30 kDa의 명목적 분자량 한계를 갖는 필터 유닛으로 수행되는, 방법.
41. 구현예 35 내지 37 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 여과가 100 내지 300 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행되는, 방법.
42. 구현예 35 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 여과가 200 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행되는, 방법.
43. 구현예 35 내지 39 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 여과가 200 내지 300 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행되는, 방법.
44. 구현예 35 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 여과가 250 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행되는, 방법.
45. 구현예 35 내지 41 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 여과가 6-7의 pH 값에서 수행되는, 방법.
46. 구현예 35 내지 42 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 여과가 6.2의 pH 값에서 수행되는, 방법.
47. 구현예 2 내지 43 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 크로마토그래피 동안에, 폴리펩타이드-염료-복합체가 폴리펩타이드-염료-복합체와 미결합된 하이드라자이드 염료 간의 간섭이 존재하지 않도록 상기 미결합된 하이드라자이드 염료로부터 분리되는, 방법.
48. 구현예 2 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 크로마토그래피가 크기 배제 크로마토그래피인, 방법.
49. 구현예 45에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피가 0.2-0.8 ㎖/분의 등용매 흐름으로 수행되는, 방법.
50. 구현예 45에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피가 0.5 ㎖/분의 등용매 흐름으로 수행되는, 방법.
51. 구현예 45 내지 47 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피가 20℃ - 30℃의 칼럼 온도에서 수행되는, 방법.
52. 구현예 45 내지 48 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피가 25℃의 칼럼 온도에서 수행되는, 방법.
53. 구현예 45 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피가 100 내지 300 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행되는, 방법.
54. 구현예 45 내지 50 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피가 200 mM의 인산칼륨의 존재하에 수행되는, 방법.
55. 구현예 45 내지 51 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피가 200 내지 300 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행되는, 방법.
56. 구현예 45 내지 52 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피가 250 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행되는, 방법.
57. 구현예 45 내지 53 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피가 6-7의 pH 값에서 수행되는, 방법.
58. 구현예 45 내지 54 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피가 6.2의 pH 값에서 수행되는, 방법.
59. 구현예 3 내지 55 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 4개의 표준 곡선이 크기 배제 크로마토그래피에 의해 생성되는, 방법.
60. 구현예 3 내지 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 4개의 표준 곡선이 하기의 수학식을 사용하여 생성되는, 방법.
수학식 1을 사용한 4번째 표준 곡선 (280nm에서의 폴리펩타이드): y1=m1x+b1
수학식 2를 사용한 3번째 표준 곡선 (428nm에서의 폴리펩타이드): y2=m2x+b2
수학식 3을 사용한 2번째 표준 곡선 (280nm에서의 루시퍼 옐로우): y3=m3z+b3
수학식 4를 사용한 1번째 표준 곡선 (428nm에서의 루시퍼 옐로우): y4=m4z+b4
여기서, x는 mg/㎖의 폴리펩타이드의 농도이고, z는 루시퍼 옐로우의 몰 농도(μM)이고, m1 내지 m4, 및 b1 내지 b4는 선형 회귀 보정으로부터 수득된 상수이다.
61. 구현예 3 내지 57 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 카보닐화 수준이 2개-가변 (x 및 z) 선형 수학식을 풀이함에 의해 z/x (nmol/mg)로서 계산되는 방법:
수학식 5: 
수학식 6: 
여기서, z는 카보닐기의 몰 농도 (μM)이고, x는 단백질 농도 (mg/㎖)이고; A280는 도 3a에 설명된 바와 같은, 280nm 흡광도로부터의 LY-CH 유도된 mAb 종의 통합된 피크 면적이고; A428은 도 3b에 설명된 바와 같은, 428nm 흡광도로부터의 LY-CH 유도된 mAb 종의 통합된 피크 면적이다.
z 및 x는 하기와 같이 나타낸 선형 수학식 5 및 6을 풀이함에 의해 결정될 수 있다:
총 카보닐화 수준은 이어서 z/x로서 계산된다.
62. 상기 1~61의 구현예 중 어느 하나의 구현예에 따른 방법을 수행하기 위한 키트로서, 상기 키트가 하이드라자이드 염료 및 완충액을 포함하는, 키트.
63. 구현예 59에 있어서, 상기 하이드라자이드 염료가 Cy3 하이드라자이드, Cy5 하이드라자이드, Cy5.5 하이드라자이드, Cy7 하이드라자이드, Cy7.5 하이드라자이드, 쿠마린 하이드라자이드, iFluor™ 염료 하이드라자이드, HiLyte™ Fluor 647 하이드라자이드, Alexa Fluor®488 하이드라자이드, Alexa Fluor®568 하이드라자이드, Alexa Fluor®633 하이드라자이드 및 LY-CH로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 키트.
64. 구현예 59에 있어서, 상기 하이드라자이드 염료가 LY-CH인, 키트.
65. 구현예 59 내지 61 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 완충액이 리튬 MES 완충액인, 키트.
66. 구현예 59 내지 62 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 키트가 비-이온성 계면활성제를 추가로 포함하는, 키트.
67. 구현예 63에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제가 노니데트(Nonidet) P-40, 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100, 환원된 트리톤 X-100, 트윈 20 및 트윈 80으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 키트.
68. 구현예 63에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제가 환원된 트리톤 X-100인, 키트.
69. 구현예 59 내지 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 키트가 폴리펩타이드에 대한 표준물 및 하이드라자이드 염료에 대한 표준물을 추가로 포함하는, 키트.
Ⅴ.
실시예
하기는 본 발명에 따른 방법의 예이다. 다양한 다른 구현예는 상기 제공된 일반적인 기재내용이 주어진 경우 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
이전의 발명이 이해를 명백히 할 목적으로 설명 및 실시예에 의해 일부 상세히 기재되었지만, 기재사항 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지 말아야 한다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학적 문헌의 기재사항은 이들의 전문이 참조로 명백히 인용된다.
물질
본원의 기재내용에 사용되는 모든 mAb는 Genentech 사 (South San Francisco, CA)에서 제조되었다. LY-CH 디리튬 염, 황화철, 과산화수소 용액 (H2O 중 30%, w/w), 메티오닌 (Met), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 나트륨 숙시네이트, 숙신산, 인산칼륨 (이염기성 및 일염기성), 염화칼륨, 나트륨 아세테이트, 아세트산, 수산화나트륨 용액 (H2O 중 1M), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES), 수산화리튬, 환원된 트리톤 X-100, 및 폴리소르베이트 20은 Sigma-Aldrich 사 (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. TSK G3000 SWXL (7.8x300 mm) 크기 배제 칼럼은 Tosoh Bioscience 사 (King of Prussia, PA, USA)]로부터 구입하였다. OxiSelectTM 단백질 카보닐 검정 키트는 Cell Biolabs 사 (San Diego, CA, USA)로부터 시판되었다. PNGase F (글리세롤 부재)는 New England Biolabs 사 (Ipswich, MA, USA)로부터 구입하였다.
실시예
1: 산화된
mAb
샘플의 제조 및
LY
-CH를 사용한
mAb
샘플의
유도체화
옥시-표준물 mAb 또는 옥시-표준물 mAb(Ⅱ)로 지칭되는 산화된 mAb 샘플은 펜톤(Fenton)의 반응을 사용하여 본원에 기재된 방법을 위해 생성하였다. 따라서, 항체 샘플은 50 mM 나트륨 숙시네이트 완충액 (pH 6.5) 중에서 각각 5 mg/㎖, 2 mM, 및 10 mM의 최종 농도로 FeSO4 및 과산화수소와 혼합하였다. 반응 혼합물은 2시간 동안 실온에서 항온처리하고, 이어서 과량의 메티오닌 및 EDTA를 첨가함에 의해 중지시켰다.
유도체화는 MES 용액을 1M 수산화리튬 용액으로 pH 6.0으로 적정함에 의해 제조된 유도체화 완충액 (50 mM 리튬 MES 완충액, 1% 트리톤 X-100, pH 6.0)에서 수행하였다. 상기 mAb 샘플은 먼저 Amicon 울트라-15 30 KDa 필터 유닛 (Millipore, Billerica, MA, USA)을 사용하여 유도체화 완충액으로 완충액 교환하였다. 후속적으로, mAb 샘플 (0.2mg/㎖의 최종 농도)은 유도체화 완충액에서 (8,000의 최종 LY-CH-대-mAb 몰비를 갖는) LY-CH 및 환원된 트리톤 X-100 (1% 중량/용적 최종 농도)과 혼합하였다. 유도체화는 16시간 동안 37℃에서 암실에서 수행하였다. 유도체화 후, 유도체화된 샘플의 500㎕의 분취액은 15㎖ Amicon 울트라-15 30 kDa 필터 유닛을 사용하여 200 mM 인산칼륨, 250 mM 염화칼륨 (pH 6.2)로 3회 완충액 교환하였다.
유도체화는 MES 용액을 1 M 수산화리튬 용액으로 pH 6.0으로 적정함에 의해 제조된 유도체화 완충액 (50 mM 리튬 MES 완충액, 0.05% 트리톤 X-100, pH 6.0)에서 수행하였다. 상기 mAb 샘플은 먼저 Amicon 울트라-15 30 KDa 필터 유닛 (Millipore, Billerica, MA, USA)을 사용하여 유도체화 완충액으로 완충액 교환하였다. 후속적으로, mAb 샘플 (0.5 mg/㎖의 최종 농도)은 유도체화 완충액 중에서 (8,000의 최종 LY-CH-대-mAb 몰비를 갖는) LY-CH 및 환원된 트리톤 X-100 (0.05% 중량/용적 최종 농도)과 혼합하였다. 유도체화는 18시간 동안 37℃에서 암실에서 수행하였다. 유도체화 후, 유도체화된 샘플의 500㎕의 분취액은 15㎖ Amicon 울트라-15 30 kDa 필터 유닛을 사용하여 200 mM 인산칼륨, 250 mM 염화칼륨 (pH 6.2) 로 3회 완충액 교환하였다.
실시예
2:
mAb의
단백질
카보닐
수준의 결정
CALY의 전체 작업흐름은 도 2b에 도시한다. 상기 mAb 샘플은 Agilent HPLC 시스템에 의해 생성된 0.5㎖/분의 등용매 흐름으로 TSK G3000 SWXL (7.8×300 mm) 크기 배제 칼럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 상기 이동상은 pH 6.2에서 200 mM 인산칼륨, 250 mM 염화칼륨을 함유하였다. 칼럼 온도는 25℃로 조절하고, 자동샘플 채취기(autosampler) 온도는 8℃로 조절하였다. 각각의 샘플에 대해, 25㎕의 mAb 물질 (대략 25㎍)을 분석을 위해 주사하였다. 용출물은 280nm 및 428nm 둘 다에서 UV 흡광도에 의해 모니터링하였다.
유도체화 및 완충액 교환 후, mAb 샘플은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였고, 여기서, 샘플 중에 잔여물 LY-CH은 유도된 mAb로부터 분리하였다. 카보닐화 수준의 정량은 크기 배제 크로마토그램 상에서 (대략 10 내지 22분에서 용출되는) 유도된 mAb의 UV 280nm 및 428nm 흡광도 피크 면적을 기준으로 하였다. 단백질-결합된 루시퍼 옐로우 모이어티 및 단백질 성분 모두가 측정된 UV 280 및 428nm 흡광도 피크 면적에 기여하기 때문에, 루시퍼 옐로우 모이어티 및 단백질의 각각의 농도는 LY-CH 표준물 및 (단백질 표준물로서) 비유도된 mAb의 표준 곡선을 사용하여 계산하였다.
mAb 표준 곡선은 다양한 단백질 농도 (0.25, 0.5, 1, 2, 및 3 mg/㎖)에서 25㎕ 주사에 의한 상응하는 비유도된 mAb 샘플의 크기 배제 크로마토그래피 분석에 의해 생성하였다. 상기 LY-CH 표준 곡선은 유사하게 다양한 몰 농도 (1, 5, 10, 15, 및 20 μM)에서 25㎕의 LY-CH 표준물을 주사함에 의해 생성하였다. 4개의 선형 수학식은 mAb 및 LY-CH 표준물 농도에 대해 수득한 UV 흡광도 피크 면적의 선형 회귀 보정에 의해 각각 생성하였다. 이들 수학식에서, x는 mAb 단백질 농도 (mg/㎖)이고, z는 LY-CH 몰 농도(μM)이고, m1 내지 m4, 및 b1 내지 b4는 선형 회귀 보정으로부터 수득된 상수이다.
수학식 1 (mAb의 UV 280nm 반응): y1=m1x+b1
수학식 2 (mAb의 UV 428nm 반응): y2=m2x+b2
수학식 3 (LY-CH의 UV 280nm 반응): y3=m3z+b3
수학식 4 (LY-CH의 UV 428nm 반응): y4=m4z+b4
도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, 표준 곡선의 선형 회귀 보정 후, m1=4813.9; b1=-125.98; m2=10.085; b2=3.2458; m3=35.507; b3=1.4328; m4=18.735; b4=1.3937이다.
mAb 샘플의 카보닐화 수준은 이어서 2-가변 (x 및 z) 선형 수학식 5 및 6을 풀이함에 의해 z/x (nmol/mg)로서 계산하였고, 여기서 x는 카보닐기의 몰 농도 (μM)이고, z는 단백질 농도 (mg/㎖)이다.
수학식 5: A280=m1x+b1+m3z+b3
수학식 6: A428=m2x+b2+m4z+b4
정량 공정을 설명하기 위해, 유도된 옥시-표준물 mAb의 전형적인 크기 배제 크로마토그래피는 도 3a 및 3b에 나타낸다. 비유도된 옥시-표준물 mAb 및 LY-CH로부터의 4개의 표준물 곡선은 도 4a 및 4b에 나타내고, 이는 흡광도 피크 면적과 각각의 mAb 및 LY-CH 농도 간의 선형 반응을 입증하였다. 데이터의 선형 회귀 보정으로부터 결정 계수 (R2)는 0.99 초과이다. 각각의 유도체화 조건을 위한 총 카보닐화 수준은 이어서 유도된 옥시-표준물 mAb로부터의 통합된 피크 면적, 및 상기 표준 곡선으로부터 4개의 수학식을 기준으로 계산하였다. 하나의 예로서, A280 및 A428 값은 하기와 같이 결정하였다. 4347.7, A280의 피크 면적은 280nm에서 mAb 및 LY-CH의 흡광도 기여의 결과이고, 상기 SEC 프로파일에서 대략 10.1분 내지 22.2분으로부터의 곡선 이하 면적을 통합시킴에 의해 결정하였다. 따라서, 224.0, A428의 피크 면적은 428nm에서의 흡광도와 함께 SEC 프로필 중 대략 10.1분 내지 22.2분으로부터의 곡선 이하 면적을 통합시킴에 의해 결정하였다. 상기 수학식 5 및 6과 연계하여, 이것은 하기의 2개의 수학식을 유도하였다:
이어서 2개의 가변 x 및 z는 2개의 선형 수학식 i) 및 ⅱ)를 풀이함에 의해 결정하였고, x = 0.846 mg/㎖ mAb, z = 11.253 μM LY-CH이고, 이는 13.3nmol/mg의 카보닐화 수준을 생성한다.
실시예
3:
유도체화
조건의 최적화
최적의 완충액 시스템 및
pH
값의 확인
CALY에 대한 최적의 유도체화 조건을 확립하기 위해, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같은 옥시-표준물 mAb 샘플은 유도체화 완충액, LY-CH-대-mAb 몰 비, 및 유도체화 시간을 최적화하기 위한 시험 샘플로서 사용하였다. 유도체화 시약으로서 LY-CH의 사용을 가능하게 하는 최적의 완충액을 확인하기 위해, 유도체화 반응을 위한 제1의 상이한 완충액 pH 값을 고려하였다. pH 5.0 이하에서, 유도체화 반응 동안에 어느 정도의 샘플 침전이 관찰되었다. 샘플 침전을 피하기 위해, 유도체화 pH로서 pH 6.0은 pH 5.0 초과에서 어떠한 침전이 관찰되지 않았고 pH 7.0 이상에서는 유도체화 반응이 상당히 느려지는 것을 고려하여 선택되었다. 이에 상응하여, 6.13의 pKa를 갖는 MES이 완충액 시스템으로서 선택되었다. 상기 완충액은 수산화리튬을 사용하여 50 mM MES 용액을 pH 6.0으로 적정함에 의해 제조하였다. 완충액 제조를 위한 수산화리튬의 사용은, LY-CH의 리튬 염이 나트륨 및 칼륨 염보다 높은 용해도를 갖는다는 고려에 기초한 것이었다. 완충액 중 리튬 이온을 갖는 수득한 LY-CH의 용해도가 높은 것는, 유도체화 반응에 대해 보다 높은 LY-CH-대-mAb 몰비의 사용을 가능하게 하고, 유도체화 후 잔여 LY-CH 시약의 더욱 용이한 제거를 가능하게 한다. 최종적으로, 고려되는 또 다른 인자는 산화된 단백질 샘플이 유도체화 반응 동안에 잠재적으로 샘플 침전을 유발할 수 있는, 더 높은 응집을 갖는 경향이 있다는 것이다. 상기 문제를 해결하기 위해, 계면활성제로서 환원된 트리톤 X-100을 유도체화 완충액에서 0.05% 또는 1% (중량 대 용적)의 최종 농도로 첨가하였다. 환원된 트리톤 X-100은 280 및 428 nm에서 어떠한 유의적 흡광도도 갖지 않는다. 최종의 최적화된 완충액 시스템에서는, 어떠한 샘플 침전도 모든 후속적 분석에서 관찰되지 않았다.
LY
-CH 대 샘플
몰비
및
유도체화
시간의 최적화
LY-CH 대 샘플 몰비 및 유도체화 시간은, 다양한 유도체화 조건에서 옥시-표준물 mAb의 총 카보닐화의 수준을 정량함으로써 최적화되었다. 먼저, LY-CH 대 샘플 몰비는 50, 500, 1000, 1500, 2000, 4000, 6000, 8000 및 10,000의 다양한 몰비에서의 유도체화 정도를 평가함으로써 최적화되었다. 반응 혼합물 중의 최종 옥시-표준물 mAb 농도 (0.2 mg/㎖), 반응 온도 (37℃) 및 반응 시간 (18시간)과 같은 모든 다른 유도체화 조건은 표적 조건에서는 변화되지 않았다. 다양한 몰비에서의 상응하는 카보닐화 수준 (도 5)은 유도체화 반응이 8000의 몰비에서 정체기에 도달함을 보여주었고, 상기 몰비의 초과에서는 어떠한 유의적인 카보닐화 수준의 증가도 관찰되지 않았다. 따라서, 8000의 LY-CH 대 샘플 몰비는 유도체화 반응에 대한 최종 조건으로서 선택되었다. 유사하게, 반응 시간은 표적 조건에서 8000에서의 몰비 및 모든 다른 유도체화 조건이 변화되지 않는 상태로 유지하면서, 항온처리 시간을 다양하게 함에 의해 최적화되었다. 수득한 총 카보닐화 수준 (도 6)은 유도체화 반응이 18시간에 정체기에 도달함을 보여주었다. 따라서 유도체화 반응 동안 최종 반응 시간으로서 18시간이 선택되었다.
실시예
4:
CALY의
평가
강인성(
robustness
) 평가
CALY의 강인성은 다른 방법 조건의 변화 없이, 일정 시간에 하나의 방법 조건/파라미터에 최소 변화를 적용하고, 하고 후속적으로 옥시-표준물 mAb의 총 카보닐화 결과에 대한 이들 최소 변화의 효과를 조사함에 의해 평가하였다. 구체적으로, 유도체화 반응 조건의 효과, 유도체화 후 샘플 취급 및 분석 공정, 및 평가를 위한 SEC 분석 동안에 유도체화된 샘플의 안정성을 조사하였다. 유도체화 반응 조건을 위해, 상이한 mAb 단백질 농도 (0.45, 0.50, 및 0.55 mg/㎖), 상이한 LY-대-mAb 몰비 (7000:1, 8000:1 및 9000:1), 및 유도체화 완충액의 상이한 pH 값(5.9, 6.0 및 6.1)으로부터 옥시-표준물 mAb의 총 카보닐화 수준을 비교하였다. 도 7a 내지 7b에 나타낸 바와 같이, 카보닐화 수준에서 매우 최소의 변화가 반응 단백질 농도, 또는 LY-CH-대-mAb 몰 비에 대해 관찰되었다. 완충액 pH 강인성 데이터로부터 보면, pH 6.1에서의 총 카보닐화 수준은 pH 5.9 및 6.0에서의 총 카보닐 수준보다 약간 낮았고 (도 7c), 이는 pH 6.1에서의 약간 느린 반응 속도 때문일 가능성이 있어, 유도체화 완충액 pH의 엄격한 조절이 최적의 방법 강인성을 위해 필요할 수 있음을 암시한다.
샘플 취급 공정을 위해, 유도체화 후, 여과에 의한 완충액 교환의 각각의 라운드는 샘플에 존재하는 잔류물 LY-CH의 양을 대략 50의 인자로 감소시키는 것과 동등하다고 말할 가치가 있다. 완충액 교환의 2회, 3회 및 4회 라운드의 효과는 샘플 중의 다양한 양의 잔류물 LY-CH의 카보닐화 결과에 영향을 미치는지를 이해하기 위해 조사되었다. 도 7d에 나타낸 바와 같이, 어떠한 유의적 차이도 2회, 3회, 또는 4회의 완충액 교환에 의한 결과에서 관찰되지 않았고, 이는 유도체화 샘플 중의 다양한 양의 잔류물 LY-CH의 존재가 결과에 대해 매우 영향력이 낮은 것을 입증한다. 크기 배제 분석을 위해, 본원 발명자들은 유도체화되고 완충액-교환된 옥시-표준물 mAb에 대해 다양한 주사 용적 (20㎕ 내지 30㎕)을 시험하였다. 상응하는 카보닐화 수준은 도 7e에 나타내고, 이는 상기 방법이 주사 용적/양의 최소 변화에 대해 강인함을 입증하였다.
본원 발명자들은 (-80℃에서의) 1회, 2회 및 3회 동결/해동 주기가 적용된 유도체화된/완충액-교환된 옥시-표준물 mAb 샘플의 결과를 새롭게 제조된 샘플의 결과와 비교함으로써, 다수의 동결/해동 주기에서의 샘플 안정성을 평가하였다. 데이터 (도 7f)는 유도체화된 샘플이 다수의 동결/해동 주기에 대해 안정함을 보여주었다. HPLC 분석에 대한 유도체화된 샘플의 안정성은, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15시간 동안 HPLC 자동샘플 채취기 (8℃로 조절된 온도)에 저장된 유도체화되고 완충액-교환된 옥시-표준물 mAb의 카보닐화 수준을 측정함으로써 평가하였다. 추가로, 도 8에 나타낸 바와 같이, 측정된 카보닐화 수준에서는 어떠한 유의적 차이도 관찰되지 않았고, 이는 유도체화된 샘플이 적어도 15시간 동안 2-8℃에서 안정함을 뒷받침한다.
종합적으로, 시험 샘플로서 옥시-표준 mAb를 사용한 강인성 평가 연구로부터 총 31개의 데이터 포인트가 생성되었고, 이는 2.4%의 가변 (RSD) 계수에 의한 13.0nmol/mg의 평균 총 카보닐화 수준을 보여준다. 이들 데이터는 CALY가 매우 강인하다는 것을 뒷받침한다.
특이성 평가
특이성은 mAb 종을 제외한 모든 샘플 완충액 성분을 갖는 샘플 블랭크를 유도체화, 완충액 교환 및 SEC 분석 단계에 적용함에 의해 조사되었다. 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 목적 영역의 피크 (10 내지 22분)에서 어떠한 피크도 관찰되지 않았고, 이는 완충액 부형제가 정량화 공정에 간섭하지 않았으며, CALY 방법이 mAb 샘플의 총 단백질 카보닐화를 측정하기 위해 특이적임을 입증하였다.
검출 한계 및 정량 한계
검출 한계 (LOD) 및 정량 한계 (LOQ)는 각각 음성 대조군의 카보닐화 수준의 3회 및 10회의 표준 편차로서 계산되었다. 표준 편차는 다양한 단백질 농도에서의 반복되는 주사 (총 27개의 데이터 포인트)에 의해, 음성 대조군 샘플로서 비스트레스 및 비유도의 mAb를 분석함으로써, 표 1에 나타낸 바와 같이 0.058nmol/mg인 것으로 결정되었다. CALY에 대한 LOD 및 LOQ는 이어서 각각 0.2 및 0.6nmol/mg인 것으로 결정되었다.
표 1은 다양한 농도에서의 반복된 주입에 의한, 음성 대조군으로서 LY-CH에 의해 유도되지 않은 비스트레스 mAb 샘플로부터의 카보닐화 수준을 나타낸다. 이들 데이터로부터 표준 편차, 0.0581nmol/mg은 LOD 및 LOQ의 결정을 위해 사용되었다.
선형성 및 정확성
방법 최적화 및 강인성 연구 후, 후속적 평가를 위한 옥시-표준물 mAb 샘플의 또 다른 배치를 제조하였다. 제2 배치의 총 단백질 카보닐화 수준은 CALY에 의해 11.5nmol/mg인 것으로 결정되었고, 이는 제1 배치의 것보다 약간 낮았다. 그러나, 이것은 선형성 및 정확성에 대해 후속적 방법 수행능 평가에 영향을 주지 않는다. 단순화를 위해, 제2 배치 옥시-표준물 mAb는 이후 상기 옥시-표준물 mAb (Ⅱ) 샘플로서 말되었다.
CALY의 선형성을 평가하기 위해, 0-대-100, 25-대-75, 50-대-50, 75-대-25, 및 100-대-0 (질량 대 질량) 비율로, 옥시-표준물 mAb (Ⅱ)와 스트레스받지 않은 mAb를 혼합함으로써, 일련의 동시-혼합 샘플들을 제조하였다. 후속적으로, 동시-혼합 샘플은 2개의 크기 배제 칼럼을 갖는 2개의 HPLC 장비를 이용한 2명의 분석가에 의해 분석되었고, 각각의 분석가는 3개의 독립적인 제제를 3일의 상이한 일자에 분석하였다. 총 6개의 독립적 측정은 각각 동시-혼합물 샘플에 대해 수행하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 본원 발명자는 측정된 총 단백질 카보닐화가 0.997의 선형 회귀 비율로 각각의 동시-혼합물 샘플 중에서 스트레스받은 mAb의 백분율과 비례하여 선형 반응하는 것을 관찰하였다. 상기 데이터는 CALY가 우수한 선형성을 가짐을 입증하였다. 또한, 동시-혼합물 샘플 각각에 대해 2명의 분석가가 하루-내 및 일간 분석으로부터 측정한 가변 계수 (CV)는 15% 미만이었고, 이는 CALY의 정확성을 입증한다.
실시예
5:
DNPH
비색 검정에 의한
mAb의
단백질
카보닐
수준의 결정
일부 mAb 샘플에 대한 총 단백질 카보닐화 수준은 또한 OxiSelectTM 단백질 카보닐 분광측정 검정 키트 (Cell Biolabs 사, Inc., San Diego, CA)를 사용함으로써 정량하였다. 각각의 샘플에 대한 평균 단백질 카보닐화 수준을 보고하기 위해 3개의 독립적 제조가 수행되었다.
DNPH
분광측정 검정과의 비교
DNPH 분광측정 검정은 통상적인 단백질 카보닐화 검정이다. 총 단백질 카보닐화 수준은 DNPH 방법 및 CALY 방법에 의해 옥시-표준물 mAb (Ⅱ), 50:50 동시-혼합물, 및 스트레스 받지 않은 mAb에 대해 측정되어, 2개의 방법에 의한 결과가 얼마나 유사한지를 결정하고 2개의 방법의 수행능을 비교하였다. 종합적으로, 도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, 2개의 방법으로부터 결정된 각각의 카보닐화 수준은 유사하나, CALY 방법이 명백하게 DNPH 방법보다 더 양호한 검정 정확도를 가짐이 입증되었다.
실시예
6:
PNGase
F 처리된
mAb의
CALY
분석
LY-CH는 이전에 유도체화 시약으로서 사용되어, 항체의 N-글리칸 올리고사카라이드 잔기 상의 과요오드산 산화에 의해 형성되는 알데히드기를 정량하였다. 아미노산 잔기 상에 알데히드 및 케톤과 LY-CH의 반응성은 N-글리칸 알데히드와의 반응성과 동일할 수 없기 때문에, LY-CH가 mAb의 아미노산 잔기 상의 금속-촉매된 산화 카보닐화를 정량하기 위해 적합한지를 평가하였다. PNGase F 처리의 존재 및 부재하에 비스트레스 및 펜톤-스트레스받은 mAb 샘플들의 총 단백질 카보닐화 수준은 CALY에 의해 측정하였다. PNGase F 처리는 mAb 샘플로부터 N-글리칸을 제거하기 때문에, PNGase F 처리 후 측정된 mAb 샘플의 총 단백질 카보닐화 수준은 mAb의 아미노산 잔기 상의 카보닐화에 기인한다. 도 11에 나타낸 바와 같이, PNase F 처리의 존재 및 부재하에 옥시-표준물 mAb (Ⅱ) 샘플에 대한 총 단백질 카보닐화 수준은 각각 9.9nmol/mg 및 11.9nmol/mg이었다. 이들 데이터는 아미노산 잔기 상에 금속-촉매된 카보닐화를 정량하는 것에 대한 CALY의 특이적 적합성을 확인시켜 준다. 추가로, 이들 데이터는 본 연구에서 시험된 펜톤의 산화 조건하에, 어떠한 유의적 양의 N-글리칸 알데히드도 mAb 샘플 상에 형성되지 않았음을 나타내었다.
PNGase
F 처리에 의한
탈당화
탈당화 반응은 250㎍의 mAb 샘플을 100 mM HEPES 완충액 (pH 8.0) 중의 12500 유닛의 PNGase F와 1㎖의 최종 용적이 되도록 혼합함으로써 수행하였다. 상기 혼합물은 16시간 동안 37℃에서 항온 처리하였다.
실시예
7: 다양한 양의 Fe(Ⅱ)및 과산화수소를 사용하여 산화된
mAb의
단백질
카보닐
수준의 결정
mAb 샘플은 표 2에 나타낸 바와 같이 Fe(Ⅱ) (4 μM, 20 μM, 100 μM 및 500 μM) 및 과산화수소(8 μM, 40 μM, 200 μM 및 1000 μM)의 다양한 최종 농도의 조합으로 총 16개 조건을 사용하여 제조하였다. 최종 mAb 농도는 5 mg/㎖였다. 혼합물은 2시간 동안 50 mM 나트륨 숙시네이트 완충액 ( pH 6.5)에서 실온에서 항온처리하였다. 후속적으로, 반응은 과량의 메티오닌 및 EDTA를 첨가함에 의해 중단시켰다.
도 12a, 12b 및 12c에 나타낸 바와 같이, 총 단백질 카보닐화 수준에 대한 다양한 양의 Fe(Ⅱ) 및 과산화수소의 효과는 매우 복잡하였다. 보다 낮은 Fe(Ⅱ) 농도 (4 μM 및 20 μM)에서, 스트레스 받은 mAb의 총 카보닐화 수준은 심지어 넓은 범위의 과산화수소 양 (8 μM 내지 1000 μM)에서도 단지 약간만 가변되는 관찰되었다. 대조적으로, 시험된 각각의 과산화수소 농도에 대해, 4 μM 내지 500 μM 범위의 보다 높은 Fe(Ⅱ)의 농도에서 총 카보닐화가 더 잘되는 것을 보여주는 일관된 경향이 있었다. 이들 데이터는 이들 특정된 스트레스 조건하에, 산화 카보닐화 정도가 과산화수소보다 금속 이온 농도의 변화에 비교적 더 민감한 것을 시사하는 것으로 보인다. 따라서, Fe(Ⅱ)는 이들 조건하에서 mAb에 대한 단백질 카보닐화를 생성하는 것에 대해 과산화수소보다 더 중요한 인자일 수 있다.
표 2는 다양한 Fe(Ⅱ) 및 H2O2 농도(최종)를 갖는 총 16개 조건을 나타내는데; 최종 mAb 농도는 5mg/㎖이었고; 산화는 2시간 동안 실온에서 수행되었고, 이어서 과량의 EDTA 및 메티오닌을 첨가함에 의해 켄칭하였다.
실시예
8: PS20 제형 및 저장 동안에 낮은 수준의
Fe(Ⅱ)에
의한
mAb의
단백질
카보닐
수준의 결정
폴리소르베이트 20 (PS20)은 항체 응집을 해결하기 위해 항체 제형 중에 통상적으로 사용되는 계면활성제이지만, 또한 과산화물도 함유하는 것으로 공지되어 있다 (Jaeger et al., 1994). mAb의 저장 동안에, PS20으로부터의 과산화물은 철 이온과 반응하여 항체 카보닐화를 유도할 수 있다. 저장 동안에 mAb 카보닐화에 대한 PS20 및 철의 효과를 조사하기 위해, mAb 샘플은 표 3에 나타낸 바와 같이 다양한 최종 Fe(Ⅱ) (0.1 μM 및 0.8 μM) 및 PS20 (0.02% 및 0.16%, w/v) 농도를 갖는 50 mM 나트륨 숙시네이트 완충액 (pH 6.0) 중에서 제조되었다. PS20 농도는 mAb 제형 중 보고된 PS20 농도 범위를 기준으로 한다 (Hawe et al., 2010). Fe(Ⅱ) 농도는 보고된 침출된 철 이온의 농도 범위를 기준으로 한다 (문헌참조: Zhou et al., 2011). 이들 샘플은 이어서 실온에서 4, 8, 및 16주 동안 암실에 저장하였다. 각각의 시점에서, 과량의 메티오닌 및 EDTA를 샘플에 첨가하여 카보닐화 반응을 켄칭하였다. 후속적으로, 이들 샘플은 CALY에 의한 추가 분석 때까지 -80℃에 저장되었다. 표 3은 저장 실험을 위한 다양한 Fe(Ⅱ) 및 PS20 농도(최종)를 갖는 총 5개 조건을 나타내며, B1은 대조군으로서 포함되었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, PS20 및 Fe(Ⅱ)를 함유하는 모든 4개의 샘플 (B2 내지 B5)에 대해, 카보닐화 수준에서 감지할 수 있는 증가가 저장 동안에 관찰되었다. 대조적으로, 카보닐화 수준에서 어떠한 유의적 변화도 대조군 샘플에 대해 관찰되지 않았다 (B1). 이들 데이터는 저장 동안에 낮은 수준의 철 이온이 존재하는 경우, PS20 제형을 갖는 mAb가 카보닐화에 민감할 수 있는지를 보여주었다. 흥미롭게도, 0.16% PS20를 갖는 샘플 (B5 및 B3)은 철 농도와는 상관없이 4, 8, 및 16주에 0.02% PS20을 갖는 샘플 (B4 및 B2)보다 높은 수준의 카보닐화를 일관적으로 갖는다. 상기 관찰은 PS20이 이들 경우에 mAb 카보닐화에 대해 주요 효과를 가짐을 나타낸다. 따라서, 자유 라디칼의 가능한 공급원인 PS20으로부터의 과산화수소는 저장 조건하에서 mAb 카보닐화의 정도를 제한하는 더욱 중요한 인자가 되었다. 따라서, 과산화수소를 더 많이 함유하는 0.16% PS20 제형은 일관되게 높은 수준의 단백질 카보닐화를 가졌다. 이것은 또한 낮은 수준의 철 이온의 존재하에, 계면활성제 내의 과산화수소 함량이 저장 동안에 mAb 카보닐화에 대해 유의적 영향을 미칠 수 있음을 보여준다. 또 다른 흥미로운 관찰은 샘플 B3 및 B5의 카보닐화 수준이 8주 내지 16주까지 상당히 감소하였다는 것이다. 이들 샘플 중의 카보닐화 함량의 감소는 탈카보닐화 과정이 존재할 수 있음을 보여준다.
참조 문헌
Claims (20)
- 폴리펩타이드에 대한 총 카보닐화 수준을 결정하기 위한 방법으로서, 상기 방법이
a) 용액 중 폴리펩타이드를, 하이드라자이드 염료가 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 상에 존재하는 카보닐기와 반응하여 폴리펩타이드-염료-복합체를 형성할 수 있도록 하는 조건하에서, 하이드라자이드 염료와 접촉시키는 단계,
b) 단계 a)로부터 수득한 용액으로부터 미결합된 하이드라자이드 염료를 제거하는 단계,
c) 단계 b)로부터 수득한 용액 중에서 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도 및 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도를 결정하는 단계, 및
d) 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 폴리펩타이드의 농도에 대한, 폴리펩타이드-염료-복합체에 결합된 하이드라자이드 염료의 농도의 비율을 기준으로, 폴리펩타이드의 총 카보닐화 수준을 결정하는 단계
를 포함하고,
상기 하이드라자이드 염료가 루시퍼 옐로우 카보하이드라자이드(LY-CH)이며,
단계 a)가 알칼리 금속 이온의 존재하에 수행되는 것인 방법. - 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 알칼리 금속 이온이 리튬 이온, 나트륨 이온 및 칼륨 이온으로부터 선택되는, 방법
- 청구항 1에 있어서, 상기 알칼리 금속 이온이 리튬 이온인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 아미노산 잔기가 아르기닌, 라이신, 프롤린 및 트레오닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 항체인, 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 항체가 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중-특이적 항체, 항체 단편, 항체 약물 접합체, THIOMABTM 또는 THIOMABTM 약물 접합체인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩타이드 및 하이드라자이드 염료가 6,000 - 10,000의 최종 몰비로 단계 a)에서 접촉되는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 단계 a)가 비이온성 계면활성제의 존재하에 수행되는, 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제가 환원된 트리톤 X-100인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 단계 a)가 35℃ 내지 39℃의 온도에서 수행되는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 단계 a)가 10 내지 20시간 동안 수행되는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 단계 b)는 여과, 겔 여과 및 투석으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 단계 b)가 여과에 의해 수행되는, 방법.
- 청구항 14에 있어서, 여과가 100 내지 300 mM의 인산칼륨의 존재하에 그리고 200 내지 300 mM의 염화칼륨의 존재하에 수행되는, 방법.
- 청구항 1에 따른 방법을 수행하기 위한 키트로서, 상기 키트가 하이드라자이드 염료 및 완충액을 포함하고, 상기 하이드라자이드 염료가 LY-CH인, 키트.
- 삭제
- 청구항 16 있어서, 상기 완충액이 리튬 MES 완충액인, 키트.
- 청구항 16에 있어서, 상기 키트가 비-이온성 계면활성제, 폴리펩타이드에 대한 표준물 및 하이드라자이드 염료에 대한 표준물을 추가로 포함하는, 키트.
- 청구항 19에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제가 환원된 트리톤 X-100인, 키트.
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