KR102370100B1 - 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염 시 가장 먼저 숙주 내에서 발현하여 숙주면역체계를 억제시키는 인플루엔자 바이러스 유전자(gene) NS1 유전자에 외래 유전자인 항바이러스 작용과 관련이 있는 인터페론-베타 유전자를 도입함으로써 기존의 연구와는 달리 인터페론-베타가 NS1단백질에서 분리되어 고유의 기능인 항바이러스 유도 작용을 수행할 수 있는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스에 대한 것이다.
Description
본 발명은 퓨린 분절 부위를 코딩하는 유전자와 NS1 단백질을 코딩하는 유전자가 융합된 핵산 및 이의 제조방법, 상기 핵산과 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 단백질 발현용 재조합 백터, 상기 벡터를 포함하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스, 상기 바이러스를 포함하는 유전자 전달체, 상기 바이러스를 포함하는 백신 조성물, 상기 백신을 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스 및 유효성분을 매개로 하는 감염/유전자 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 직경이 약 125nm인 입자 크기를 갖는 RNA 외피 바이러스이다. 바이러스는 기본적으로 리피드 이중층 구조 및 외부 글리코단백질을 갖는 바이러스 외피에 의해 둘러 쌓여진 내부 뉴클레오캡시드 또는 핵단백질과 결합된 리보핵산(RNA)의 코어로 이루어져 있다. 바이러스 외피의 내부층은 주로 매트릭스 단백질로 이루어지며, 외부층은 주로 숙주-유래 리피드 물질로 이루어진다.
인플루엔자 바이러스 게놈은 11개의 단백질 (HA, NA, NP, M1, M2, NS1, NEP, PA, PB1, PB1-F2, PB2)를 코드화시키는 8개의 단일 RNA 가닥 상에 함유된다. 게놈의 분절화 성질은 세포 공동서식 동안 상이한 바이러스 균주 사이에서 전체 유전자의 교환을 허용한다. 8개의 RNA 분절은 혈구응집소를 인코딩하는 HA; 뉴라미니다아제를 인코딩하는 NA; 핵단백질을 인코딩하는 NP; 동일한 RNA 분절로부터 상이한 해독 구조를 사용함으로써 2개의 매트릭스 단백질 (M1 및 M2)을 인코딩하는 M; 동일한 RNA 분절로부터 상이한 해독 구조를 사용함으로써 2개의 독특한 비구조 단백질 (NS1 및 NEP)을 인코딩하는 NS; RNA 폴리머라아제를 인코딩하는 PA; 동일한 RNA 분절로부터 상이한 해독 구조를 사용함으로써 RNA 폴리머라아제 및 PB1-F2 단백질 (아팝토시스를 유도함)을 인코딩하는 PB1; 및 RNA 폴리머라아제를 인코딩하는 PB2로 이루어져 있다.
이러한 인플루엔자 바이러스는 두 개의 표면 당단백질인, 헤마글루티닌(Hemagglutinin: HA) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase: NA)로 구성된 고도의 다형성 입자로서, 헤마글루티닌은 바이러스의 숙주 세포에의 부착과 바이러스의 세포 침투 동안 바이러스-세포막의 융합을 매개하며, 이러한 표면 단백질, 특히 헤마글루티닌은 인플루엔자 서브타입의 항원 특이성을 결정하는 것으로 알려져 있다.
인플루엔자 바이러스는 항원의 차이에 기초하여 A형, B형 및 C형으로 분류한다. 인플루엔자 A 바이러스는 서브타입 또는 타입, 지리적 기원, 균주 번호 및 단리 연도를 포함하는 명명법에 의하여, 예를 들면 A/베이징/353/89로 기술된다. 적어도 16개의 HA 서브타입(H1-H16)과 9개의 NA 서브타입(N1-N9)이 있다. 모든 서브타입은 조류에서 발견되나, H1-H3 및 N1-N2는 인간, 돼지 및 말에서 발견된다[참고 문헌 : Murphy and Webster, orthomyxoviruses, in Virology, ed. Fields, B.N., Knipe, D.M., Chanock,R.M., 1091-1152(Raven Press, New York, (1990)]. 최근 HA서브타입의 경우 H18, NA N11까지도 발견되었다는 보고가 있다[참고: Suxiang Tong et al,"New World Bats Harbor Diverse Influenza A Viruses" PLoS Pathogens,(October 2013)].
인플루엔자는 인수 공통 전염병으로서, 인플루엔자 바이러스는 변이성이 크며 한 종에서 다른 종으로 바로 전파될 수 있는 가능성을 가지고 있어, 고병원성 인플루엔자의 세계적인 전파를 해결하는 일이 큰 과제로 떠오르고 있다. 수의분야와 관련하여 인플루엔자 바이러스는 거의 모든 포유류에 감염을 일으키므로 숙주 범위가 넓은 질병에 속한다. 돼지, 닭과 같은 산업동물의 경우 단일 감염으로 소모성 질병 혹은 다른 바이러스 및 세균과 혼합 감염됨으로써 농가에 막대한 경제적 피해를 주기 때문에, 지속적인 생독 및 사독백신을 통한 주기적인 백신접종을 실시하고 있다.
본 발명자들은 다양한 아형을 가지고 있는 A형 인플루엔자를 이용하여 인플루엔자 바이러스를 포함한 다양한 감염성 질환에 대해 보다 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 유전자 전달기술을 이용한 치료 및 백신을 개발하기 위하여 노력하였으며, 그 결과 항바이러스 유도 작용을 하는 외래 단백질 유전자 영역을 NS1 유전자의 변형에 의해 다양한 외래 유전자를 도입하여 제조한 재조합 인플루엔자 바이러스가 이종 아형 바이러스인 A/Ab/Korea/ma81/07/H5N2 (Av/ma81) 포유류 적응형 조류인플루엔자 바이러스에 대해 면역 및 치료반응을 효과적으로 형성하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 퓨린 분절 부위(Furin Cleavage site)를 코딩하는 유전자 및 서열번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어진 NS1 단백질을 코딩하는 유전자가 융합된 핵산을 제공한다.
또한 본 발명은 외래 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 핵산을 포함하는 단백질 발현용 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 발현용 재조합 벡터를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바이러스를 유효성분으로 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이러스를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백신을 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 인플루엔자 바이러스로부터 NS1 유전자를 분리하는 단계; 상기 NS1 유전자를 절단하여 NS1-86 유전자를 형성하는 단계; 및 상기 NS1-86 유전자에 퓨린 분절 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계를 포함하는 퓨린 분절 부위를 코딩하는 유전자 및 NS1 유전자가 융합된 핵산을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 ΔNS1-86 mIFN-β/H1N1 바이러스는 이종 아형 바이러스인 A/Ab/Korea/ma81/07/H5N2 (Av/ma81) 포유류 적응형 조류인플루엔자 바이러스 및 메르스코로나 바이러스(MERS-CoV)에 대한 면역반응 및 감염치료에 효과가 있다. 본 발명에 따른 새로운 플랫폼인 재조합 바이러스는 다양한 아형의 인플루엔자 바이러스 및 메르스코로나 바이러스(MERS-CoV)에 백신 및 치료제 효과를 가지며 인플루엔자 바이러스 및 메르스코로나 바이러스(MERS-CoV)의 감염을 효과적으로 차단하여 질병의 예방과 치료제를 개발 할 수 있다.
도 1은 ΔNS1-86 분절 플라스미드를 만드는 공정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 MDCK 세포에서 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스의 외래 유전자 발현양상을 나타낸다.
도 3은 퓨린 분절 부위 서열의 삽입에 따른 MDCK 세포에서 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스의 외래 유전자 발현양상을 나타낸다.
도 4는 포유류 세포에서 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스의 증식성을 보여주는 그래프이다.
도 5는 BALB/c 마우스에서 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스의 체중변화 및 생존률 및 폐내의 역가를 나타내는 그래프이다.
도 6은 BALB/c 마우스에 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스 선처리 후, ma81 바이러스를 공격접종 하였을 때 마우스의 체중변화, 생존율 및 폐내의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 7은 B6-Mx+/+ 마우스에 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스 선처리 후, ma81 바이러스를 공격접종 하였을 때 마우스의 체중변화, 생존율 및 폐내의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 8은 B6-Mx+/+ 마우스에 ma81 바이러스를 공격접종 후, ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스를 후처리 하였을 때 마우스의 체중변화, 생존율 및 폐내의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 9는 마우스 폐내에서 선/후처리한 바이러스에 의해 유도되는 마우스 인터페론-베타 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 10은 hDPP4 마우스에 MERS-Cov 를 공격접종 후, ΔNS1-86 mIFN-β 바이러스를 후처리 하였을 때 마우스의 체중변화, 생존율 및 폐내의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 2는 MDCK 세포에서 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스의 외래 유전자 발현양상을 나타낸다.
도 3은 퓨린 분절 부위 서열의 삽입에 따른 MDCK 세포에서 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스의 외래 유전자 발현양상을 나타낸다.
도 4는 포유류 세포에서 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스의 증식성을 보여주는 그래프이다.
도 5는 BALB/c 마우스에서 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스의 체중변화 및 생존률 및 폐내의 역가를 나타내는 그래프이다.
도 6은 BALB/c 마우스에 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스 선처리 후, ma81 바이러스를 공격접종 하였을 때 마우스의 체중변화, 생존율 및 폐내의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 7은 B6-Mx+/+ 마우스에 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스 선처리 후, ma81 바이러스를 공격접종 하였을 때 마우스의 체중변화, 생존율 및 폐내의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 8은 B6-Mx+/+ 마우스에 ma81 바이러스를 공격접종 후, ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스를 후처리 하였을 때 마우스의 체중변화, 생존율 및 폐내의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 9는 마우스 폐내에서 선/후처리한 바이러스에 의해 유도되는 마우스 인터페론-베타 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 10은 hDPP4 마우스에 MERS-Cov 를 공격접종 후, ΔNS1-86 mIFN-β 바이러스를 후처리 하였을 때 마우스의 체중변화, 생존율 및 폐내의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 구현 예 및 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현 예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명은 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 퓨린 분절 부위(Furin Cleavage site)를 코딩하는 유전자 및 서열번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어진 NS1 단백질을 코딩하는 유전자가 융합된 핵산에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 단백질 발현용 재조합 벡터에 관한 것이다.
NS1 유전자는 인플루엔자 바이러스 감염 시 가장 먼저 숙주 내에서 발현하여 숙주면역체계를 억제시키는 인플루엔자 바이러스 유전자로서, 상기 NS1 유전자는 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 A/PR8/1934/H1N1 바이러스로부터 분리된 후 절단된 ΔNS1-86인 것일 수 있다. A/PR8/1934/H1N1 바이러스의 NS1 유전자는 본래 NS1-233이며, 야생형 바이러스의 NS1을 절단하여 본 발명에 사용되는 NS1 유전자인 ΔNS1-86(서열번호 1)을 형성할 수 있다. 상기 NS1 유전자는 서열번호 1로 표시되는 폴리누클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 야생형 바이러스의 NS1을 절단함으로써 야생형바이러스를 약독화시킬 수 있으며, 이를 통해 인플루엔자 바이러스의 감염에 따른 숙주면역체계 억제 또는 회피기작을 저해할 수 있다.
상기 NS1 유전자에 항바이러스 작용과 관련이 있는 외래 단백질의 유전자, 예를 들어, INF-β, 형광단백질인 GFP, INF-α, INF-γ, Viperin (RSAD2 (radical SAM domain-containing 2), infrared fluorescent protein(iRFP), 디프테리아 톡신, 중증 열성 혈소판 감소 증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus)의 당단백질(Gn 및 Gc)을 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스가 체내에 투입되었을 때, 상기 외래 단백질은 NS1 단백질에서 분리되어 고유의 기능인 항바이러스 유도 작용을 수행하여 이종 인플루엔자 바이러스에 대해 면역 반응을 나타낼 수 있다.
상기 퓨린 분절 부위는 고병원성 조류인플루엔자 바이러스가 가지는 특징 중 하나로 알려진 다염기성 분절 부위로서, 세포 또는 체내에 존재하는 Furin like protease에 의해 절단될 수 있도록 한다. Furin like protease에 의해 절단된 외래 단백질은 NS1-86으로부터 분리되어 학계에 소개되었던 기존 연구들과는 달리 체내에서 자유롭게 고유기능을 수행할 수 있으며, 본 발명에 따른 바이러스의 인터페론-베타와 같이 항바이러스 작용을 유도 할 수도 있다.
종래의 퓨린 분절 부위(RRRKKR/G; 서열번호 13)는 생체내 외래 유전자 발현시 외래 유전자가 분절되지 않고 NS-86과 융합된 형태로 발현하는 반면(도 3A), 본 발명에 따른 퓨린 분절 부위(LRNTPQRER RRKKR/G LFGAI; 서열번호 14)의 경우는 NS1-86 부분이 융합 단백질(34.1 KDa 및 38.5KDa)에서 제대로 분절되어 11.6 kDa의 밴드가 확인되어(도 3B), 외래 단백질이 NS-86으로부터 분절되어 발현됨을 알 수 있다.
상기 외래 유전자 뒤편에는 Nuclear export protein인 NEP 유전자를 porcine teschovirus-1 (PTV-1) 2A 분절 부위와 연결하여 삽입함으로써 세포질의 리보솜에서 NS1 단백질과 독립적으로 단백질번역이 일어나도록 한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 발현용 재조합 벡터를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이 바이러스를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 감수성 숙주 동물을 감염시키고 질병을 일으킬 수 있는 인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스(MERS-CoV)에 대한 면역 반응을 유도하는 백신 조성물을 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 백신은 상기 단백질 발현용 재조합 벡터를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 재조합 인플루엔자 바이러스는 A/Ab/Korea/ma81/07/H5N2 (Av/ma81) 포유류 적응형 조류 인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스(MERS-CoV)에 대해 면역반응을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 백신이 면역 반응을 일으킬 수 있는 숙주 동물은 포유류 또는 조류일 수 있으며, 예를 들어, 인간, 개, 고양이, 돼지, 말, 닭, 오리, 칠면조, 페럿 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 백신은 약독화된 생독 백신일 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "생독 백신"이란 살아있는 바이러스 활성성분을 포함하는 백신을 의미한다. 또한 용어 "약독화된(attenuation)"이란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 바이러스의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입 및 변이에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 백신은 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 백신은 재조합 인플루엔자 바이러스를 23~28 HAU(hemagglutination unit, 혈구응집 단위)로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 백신의 혈구응집 단위가 22 HAU 미만인 경우, 투여 대상 개체에 효과적으로 항체형성을 유도하지 못할 수 있으며, 28 HAU을 초과하는 경우, 효율대비 비경제적일 수 있다.
본 발명의 백신은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스로부터 NS1 유전자를 분리하는 단계; 상기 NS1 유전자를 절단하여 NS1-86 유전자를 형성하는 단계; 및 상기 NS1-86 유전자에 퓨린 분절 부위를 코딩하는 유전자를 단계에 의해 제조될 수 있다.
상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스, 예를 들어, A/PR8/1934/H1N1 바이러스일 수 있다.
상기 재조합 인플루엔자 바이러스는 예를 들어, 도 1에 도시된 공정에 의해 제조될 수 있다. 도 1은 인플루엔자 A 바이러스의 NS 유전자의 일반적인 구조와 재조합 NS1 유전자 ΔNS1-86 분절 제작과정을 나타낸 것으로, ΔNS1-86 분절의 제작과정은 크게 step 1과 step 2로 나눌 수 있다. Step 1은 야생형 바이러스인 A/PR8/1934/H1N1 바이러스의 NS 유전자에서 ΔNS1-86 분절을 유도하는 과정이다. A/PR8/1934/H1N1 바이러스의 NS1 유전자는 본래 NS1-233인데 반해, 본 발명에 사용되어진 바이러스의 NS1은 ΔNS1-86이다. 야생형 바이러스의 NS1을 절단함으로써 야생형바이러스를 약독화시킬 수 있으며, 이를 통해 인플루엔자 바이러스의 감염에 따른 숙주면역체계 억제 또는 회피기작을 저해할 수 있다. 따라서 PCR기법을 활용하여 절단된 NS1-86을 제작하였고, ΔNS1-86에 외래 유전자인 마우스 인터페론-베타 혹은 형광단백질인 GFP를 삽입하였다. 외래 유전자 삽입 시 ΔNS1-86과 외래 유전자 사이에 고병원성 조류인플루엔자 바이러스가 가지는 특징 중 하나로 알려 진 다염기성 분절부위인 푸린 분절 부위(Furin Cleavage site) (LRNTPQRERRRKKR/GLFGAI; 서열번호 14)를 삽입하여 세포 또는 체내에 존재하는 Furin like protease에 의해 절단될 수 있게 제작하였다. Furin like protease에 의해 절단된 외래 단백질은 NS1-86으로부터 분리되어 학계에 소개되었던 기존 연구들과는 달리 체내에서 자유롭게 고유기능을 수행할 수 있으며, 본 발명에 따라 제작된 바이러스의 인터페론-베타와 같이 항바이러스 작용을 유도할 수 있다. 또한 외래 유전자 뒤편에는 Nuclear export protein인 NEP 유전자를 porcine teschovirus-1 (PTV-1) 2A 분절부위와 연결하여 삽입함으로써 세포질의 리보솜에서 NS1 단백질과 독립적으로 단백질번역이 일어날 수 있게 PCR 기법을 기반으로 제작한다.
Step 2에서는 step 1에서 제작된 NS1-86과 외래 유전자 그리고 NEP를 fusion PCR 기법을 이용하여 하나의 분절로 제조하고, 제조된 ΔNS1-86 mouse interferon-beta(mIFN-β)/GFP 분절을 PR8 backbone과 함께 역유전학 기법(reverse genetics)으로 293t 세포에 transfection하여 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스를 제조한다.
본 발명은 또한, 상기 백신을 인플루엔자 바이러스 감염이 의심되는 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "인플루엔자 바이러스 감염 질환"이란 인플루엔자 바이러스의 감염으로 유발되는 질환으로서, 부비강염, 발작적 천식, 중이염, 낭성 섬유종, 기관지염, 폐렴, 설사 등을 예시할 수 있으나(Pitkaranta와 Hayden, 1998. Ann. Med.), 본 발명은 이들에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "개체"란 인플루엔자 바이러스에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물을 개체에 투여함으로써, 상기 질환을 효율적으로 예방 및 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물로 다양한 인플루엔자 바이러스 아형 또는 변이형의 인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스로 감염된 인간을 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물로 다양한 인플루엔자 바이러스 아형 또는 변이형의 조류 인플루엔자로 감염된 닭 또는 돼지를 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기존의 인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스 감염 질환 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1>
본 발명의 외래 단백질 유전자가 융합된 NS1 유전자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 제조
본 발명자들은 (A/PR/8/1934 (H1N1)) 인플루엔자 바이러스의 NS1 유전자에 외래 단백질을 융합하여 인플루엔자 바이러스의 감염과 동시에 독립적인 외래 단백질의 발현을 유도하였다. 재조합 NS1 유전자를 가지는 인플루엔자 바이러스의 감염에 따른 예방 및 치료효과를 가지는 범 인플루엔자 바이러스 백신 및 치료제를 개발하기 위하여, 먼저 (A/PR/8/1934 (H1N1)) 바이러스의 NS 유전자로부터 NS1(non-structual protein)과 NEP(nuclear export protein)을 분리한 후, NS1 유전자와 외래 단백질을 융합한 후, NS1-외래 단백질 부분과 NEP 부분을 융합하여 재조합 NS 유전자를 제조하였으며, 이를 현재 인체 백신의 백본 바이러스(A/PR/8/1934 (H1N1))에 포함시켜 재조합 바이러스를 제조하였다.
먼저, 재조합 NS1 유전자를 제조하기 위해서, (A/PR/8/1934 (H1N1))의 NS1-86 영역 (서열번호 1)과; 다염기성 분절부위인 푸린 분절 부위(Furin Cleavage site) (서열번호 2)(아미노산 서열: LRNTPQRERRRKKR/GLFGAI)을 융합한 후, mouse interferon-beta 영역(서열번호 3)을 융합하였다. 그런 다음, mouse interferon-beta 부분에 porcine teschovirus-1 (PTV-1) 2A 분절부위(서열번호 4)를 삽입하였고, (A/PR/8/1934 (H1N1))의 NEP 영역 (서열번호 5)을 융합하여 하나의 재조합 NS 유전자 (서열번호12)를 제조하였다.
구체적으로, A/PR/8/1934 (H1N1)는 Bm NS 1F (5-TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG TG- 3; 서열번호 6)와 NS1-86 및 다염기성 분절부위인 퓨린 분절 부위(Furin Cleavage site)을 특정하게 인식하는 프라이머(5-TAT AGC TCC AAA TAG TCC TCT CTT TTT TCT TCT TCT CTC TCC TTG AGG GCT ATT TCT GAG CGC AGG TAC AGA GGC- 3; 서열번호 7)를 사용하여 A/PR/8/1934 (H1N1)의 NS1-86 도메인 영역(서열번호 1과 2)을 만들었다. mouse interferon-beta 도메인 영역(서열번호 3)을 특정하게 인식하는 프라이머(5-CTC AGA AAT AGC CCT CAA GGA GAG AGA AGA AGA AAA AAG AGA GGA CTA TTT GGA GCT ATA ATG AAC AAC AGG TGG ATC-3; 서열번호 8)와 porcine teschovirus-1 (PTV-1) 2A 분절부위를 특정하게 인식하는 프라이머 (5-CGGGCCCGGGTTTTCTTCCACATCGCCCGCCTGTTTCAGCAGGCTAAAGTTGGTCGCGCCGCTGCCGTTTTGGAAGTTTCTGGT- 3; 서열번호 9)를 사용하여 mouse interferon-beta 도메인 영역(서열번호 3과 4)를 만들고, NEP 도메인(서열번호 5)를 특정하게 인식하는 프라이머 (5-GGC AGC GGC GCG ACC AAC TTT AGC CTG CTG AAA CAG GCG GGC GAT GTG GAA GAA AAC CCG GGC CCG ATG GAT CCA AAC ACT GTG-3; 서열번호 10)와 Bm NS 890R (5-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT-3;서열번호 11)을 사용하여 NEP도메인 영역을 만들어 각각의 유전자 단편을 만들었다. Bm NS 1F(서열번호6)과 Bm NS 890R(서열번호 11)을 사용하여 fusion PCR 과정을 통하여 융합, 증폭과정을 거쳐 본 발명의 재조합 NS 유전자(서열번호 1)를 제조하였다.
상기와 같이 제조된 본 발명의 재조합 NS 유전자를 발현벡터 vPHW2000(사용논문:J Gen Virol. 2013 Jun;94(Pt 6):1230-5.doi: 10.1099/vir.0.051284-0. Epub 2013 Mar 13.)에 삽입하여 준비하였다. 상기 서열번호 1 (NS1-86), 서열번호 2(다염기성 분절부위인 퓨린 분절 부위), 서열번호 3(mouse interferon-beta), 서열번호 5(NEP)의 유전자가 삽입되어 있는 발현벡터를 형질감염 시약 TransIT-LT1 transfection reagent (Mirus Bio)를 이용하여 모두 혼합한 후 40분간 실온에 놓아두었다. 24시간 전에 준비해 둔 293t 세포(ATCCCCL-81™)에 벡터 혼합액을 조심스럽게 넣은 다음 6시간 후에 배양액을 무혈청 배양액(GIBCO™ Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X) liquid)으로 교체해 주었다. 형질감염 후 36시간이 지나면 0.2μg/ml의 L-1-tosylamido-2-phenylehtyl chlorometyl ketone(TPCK)-트립신(Sigma-Aldrich)를 함유하는 Opti-MEM I 1ml를 형질감염된 세포에 첨가해주고, 48시간이 지난 후부터 MDCK세포를 이용하여 상층액을 감염하였으며, 48시간 후 상기 MDCK세포에서 본 발명의 재조합 바이러스를 분리하였으며, 이렇게 분리된 재조합 바이러스는 ΔNS1-86 mIFN-β라 명명하였으며, 본 실험에서 사용하였다.
<실시예 1>
제조예 1에서와 같이 제조된 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스를 0.001 MOI로 MDCK 세포에 감염시킨 후 24시간 후에 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스의 외래 단백질 유전자가 MDCK 세포내에서 발현하는지를 확인하였다. 도 2의 A는 western blot 결과를 나타낸 것으로, ΔNS1-86 mIFN-β에서 ΔNS1-86이 절단되어 외래 유전자가 독립적으로 발현되는 것을 간접적으로 알 수 있다. 도 2의 B 및 C는 MDCK 세포에 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스를 0.0001MOI로 감염한 후 24시간 후에 GFP 및 mIFN-β 형광발현을 형광현미경을 통해 관찰함으로써 직접적으로 외래 유전자가 발현됨을 알 수 있다. (p<0.0001)
아울러, 퓨린 분절 부위 대신 종래의 분절 부위(RRRKKR/G)를 삽입한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 공정으로 제조한 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스를 0.001 MOI로 MDCK 세포에 감염시킨 후 24시간 후에 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스의 외래 단백질 유전자가 MDCK 세포내에서 발현하는지를 확인하고 이를 퓨린 분절 부위를 삽입한 제조예 1의 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스와 비교하였다. 현재까지 나와 있는 항체로는 IFN-B나 GFP를 단독을 검출할 수 없어, 본 실험에서는 NS-1 단클론 항체로만 확인하였으며, 기존에 나와 있던 ELISA(IFN-B) 및 IFA(GFP)를 통해 IFN-B 및 GFP의 발현을 확인하였다.
도 3A에서 볼 수 있는 바와 같이, 종래의 퓨린분절 부위(RRRKKR/G; 서열번호 13)로는 NS1-86으로부터 외래 단백질의 절단이 일어나지 못해 NS1-86 (11.6kDa) 밴드가 검출되지 않으며(도 3A의 파란색 박스), 이로부터 일반적인 분절 부위를 삽입한 경우 IFN-B 및 GFP의 분절이 일어나지 않음을 확인할 수 있다. 이와는 달리, 본 발명에 따른 퓨린 분절 부위(LRNTPQRER RRKKR/G LFGAI 서열번호 14)가 삽입된 경우 NS1-86 부분이 융합단백질(34.1 KDa 및 38.5KDa)에서 절단되어 NS1-86 (11.6kDa) 밴드가 검출되는 것을 확인할 수 있어(도 3B의 파란색 박스), IFN-B 및 GFP의 분절이 일어났음을 알 수 있다(도 3B). 즉, 퓨린 분절 부위의 삽입으로 인해 외래 단백질의 분절이 발생하여 free form 형태의 IFN-B 및 GFP 비율이 증가하였다.
<실시예 2>
포유류 세포인 MDCK, A549, NHBE 및 Raw 264.7 세포에 A/PR8/1934/H1N1 야생형 바이러스와 제조예 1에서와 같이 제조한 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스를 감염시킨 후 증식성을 비교하였다. 제조예 1에서와 같이 제조된 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스를 0.0001 MOI로 각각의 세포에 감염시킨 후 12, 24, 48, 72시간 후에 상층액을 채취하여 MDCK 세포에 상층액들을 감염하여 각각의 세포에 따른 바이러스의 증식성을 확인하였다. 그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 야생형 바이러스에 비해 본 발명에 따른 바이러스가 야생형 바이러스에 비해 약독화되었음을 알 수 있다.
BALB/c 마우스에 A/PR8/1934/H1N1 야생형 바이러스와 제조예 1에서와 같이 제조한 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스를 1 x 103.5 TCID50/30ul의 역가로 1회 비강 감염시킨 후, 2주 동안 마우스의 체중변화와 생존율 그리고 폐내의 바이러스 역가를 측정하였다. 그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, A/PR8/1934/H1N1 야생형 바이러스를 감염시킨 마우스 그룹에서는 감염 후 8일 째까지 모두 폐사하였지만, ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스를 감염시킨 마우스 그룹들은 100% 생존하였다. 즉, 도 4의 결과와 마찬가지로 마우스에서 감염 또한 야생형 바이러스에 비해 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스가 유의적으로 약독화 된 것을 알 수 있다. (p<0.05)
표 1은 MDCK세포에서 야생형 A/PR8/1934/H1N1바이러스와 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스의 역가와 50% mouse lethal dose를 측정한 것이다. 바이러스 역가와 50% mouse lethal dose에서도 야생형 바이러스에 비해 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스가 약독화된 것을 알 수 있다.
<실시예 3>
BALB/c 마우스에 공격접종 1일 전에 제조예 1에서와 같이 제조한 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스 및 PBS를 선처리한 후 av/ma81/H5N2 바이러스 공격접종 후 2주 동안 마우스의 체중변화, 생존률 및 폐내의 바이러스 역가를 확인하였다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, ΔNS1-86 GFP 바이러스와 PBS를 선처리한 마우스 그룹에서는 감염 후 8일째와 10일째 까지 모두 폐사하였지만, NS1-86 mIFN-β 바이러스를 선처리한 마우스그룹에서는 체중감소를 회복하며 100% 생존하는 것을 알 수 있었다. (p<0.05)
도 7은 인터페론반응 유도성 유전자인 MX1 유전자를 지닌 B6-Mx+/+ 마우스에 공격접종 1일 전 제조예 1에서와 같이 제조한 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스 및 PBS를 선처리한 후 av/ma81/H5N2 바이러스 공격접종하고 2주 동안 마우스의 체중변화 및 생존률 그리고 폐내의 바이러스 역가를 나타낸 그래프이다. ΔNS1-86 GFP 바이러스와 PBS를 선처리한 마우스 그룹에서는 감염 후 5일째까지 모두 폐사하였지만, NS1-86 mIFN-β 바이러스를 선처리한 마우스그룹에서는 감염 후 4일째부터 체중감소를 회복하며 100% 생존하는 것을 알 수 있었고, 마우스 폐내에서 av/ma81 바이러스의 역가도 감소하여 감염 후 5일째부터 마우스 폐내에 av/ma81 바이러스가 증식하지 않는 것을 알 수 있다. (p<0.05)
도 8은 B6-Mx+/+ 마우스에 av/ma81/H5N2 바이러스 공격접종 1일 후 제조예 1에서와 같이 제조한 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스 및 PBS를 후처리하여 2주 동안 마우스의 체중변화 및 생존률 그리고 폐내의 바이러스 역가를 나타낸 그래프이다. ΔNS1-86 GFP 바이러스와 PBS를 후처리한 마우스 그룹에서는 감염 후 5일째까지 모두 폐사하였지만, NS1-86 mIFN-β 바이러스를 후처리한 마우스그룹에서는 감염 후 4일째부터 체중감소를 회복하며 100% 생존하는 것을 알 수 있었고, 마우스 폐내에서 av/ma81 바이러스의 역가도 감소하여 감염 후 6일째부터 마우스 폐내에 av/ma81 바이러스가 증식하지 않는 것을 알 수 있다. (p<0.05)
도 9는 도 4에서 도 7까지 ΔNS1-86 mIFN-β/GFP 바이러스 및 A/PR8/1934/H1N1 야생형 바이러스를 감염 및 처리했던 모든 마우스 그룹의 bal-fluid에서 인터페론-베타의 발현양을 측정한 결과를 나타낸 것이다. ΔNS1-86 GFP 바이러스 및 A/PR8/1934/H1N1 야생형바이러스를 처리한 마우스그룹에 비해 ΔNS1-86 mIFN-β 바이러스를 선/후처리한 마우스 그룹의 bal-fluid에서 유의적으로 높은 인터페론-베타 발현양을 알 수 있었다. (p<0.05)
도 10은 hDPP4 마우스에 메르스코로나 바이러스(MERS-CoV)를 공격접종 1일 후 제조예 1에서와 같이 제조한 ΔNS1-86 mIFN-β 바이러스 및 PBS를 후처리하여 2주 동안 마우스의 체중변화 및 생존률 그리고 폐내의 바이러스 역가를 나타낸 그래프이다. PBS를 후처리한 마우스 그룹에서는 감염 후 11일째까지 모두 폐사하였지만, ΔNS1-86 mIFN-β 바이러스를 후처리한 마우스그룹에서는 감염 후 8일째부터 체중감소를 회복하며 100% 생존하는 것을 알 수 있었고, 마우스 폐내에서 메르스코로나 바이러스(MERS-CoV)의 역가도 감소하여 감염 후 8일째부터 마우스 폐내에 메르스코로나 바이러스(MERS-CoV)가 증식하지 않는 것을 알 수 있다. (p<0.05)
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
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<210> 1
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NS1-86
<400> 1
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa 60
cgagttgcag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120
aaatccctaa gaggaagggg cagcaccctc ggtctggaca tcgagacagc cacacgtgct 180
ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc 240
atggcctctg tacctgcg 258
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Furin Cleavage site
<400> 2
ctcagaaata gccctcaagg agagagaaga agaaaaaaga gaggactatt tggagctata 60
60
<210> 3
<211> 546
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse interferon-beta
<400> 3
atgaacaaca ggtggatcct ccacgctgcg ttcctgctgt gcttctccac cacagccctc 60
tccatcaact ataagcagct ccagctccaa gaaaggacga acattcggaa atgtcaggag 120
ctcctggagc agctgaatgg aaagatcaac ctcacctaca gggcggactt caagatccct 180
atggagatga cggagaagat gcagaagagt tacactgcct ttgccatcca agagatgctc 240
cagaatgtct ttcttgtctt cagaaacaat ttctccagca ctgggtggaa tgagactatt 300
gttgtacgtc tcctggatga actccaccag cagacagtgt ttctgaagac agtactagag 360
gaaaagcaag aggaaagatt gacgtgggag atgtcctcaa ctgctctcca cttgaagagc 420
tattactgga gggtgcaaag gtaccttaaa ctcatgaagt acaacagcta cgcctggatg 480
gtggtccgag cagagatctt caggaacttt ctcatcattc gaagacttac cagaaacttc 540
caaaac 546
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> porcine teschovirus-1 (PTV-1) 2A cleavage site
<400> 4
ggcagcggcg cgaccaactt tagcctgctg aaacaggcgg gcgatgtgga agaaaacccg 60
ggcccg 66
<210> 5
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NEP
<400> 5
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gacatactgc tgaggatgtc aaaaatgcag 60
ttggagtcct catcggggga cttgaatgga atgataacac agttcgagtc tctgaaactc 120
tacagagatt cgcttggaga agcagtaatg agaatgggag acctccactc actccaaaac 180
agaaacgaga aatggcggga acaattaggt cagaagtttg aagaaataag atggttgatt 240
gaagaagtga gacacaaact gaagataaca gagaatagtt ttgagcaaat aacatttatg 300
caagccttac atctattgct tgaagtggag caagagataa gaactttctc gtttcagctt 360
atttaa 366
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bm NS 1F
<400> 6
tattcgtctc agggagcaaa agcagggtg 29
<210> 7
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
tatagctcca aatagtcctc tcttttttct tcttctctct ccttgagggc tatttctgag 60
cgcaggtaca gaggc 75
<210> 8
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
ctcagaaata gccctcaagg agagagaaga agaaaaaaga gaggactatt tggagctata 60
atgaacaaca ggtggatc 78
<210> 9
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
cgggcccggg ttttcttcca catcgcccgc ctgtttcagc aggctaaagt tggtcgcgcc 60
gctgccgttt tggaagtttc tggt 84
<210> 10
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
ggcagcggcg cgaccaactt tagcctgctg aaacaggcgg gcgatgtgga agaaaacccg 60
ggcccgatgg atccaaacac tgtg 84
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bm NS 890R
<400> 11
atatcgtctc gtattagtag aaacaagggt gtttt 35
<210> 12
<211> 1296
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant NS1
<400> 12
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa 60
cgagttgcag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120
aaatccctaa gaggaagggg cagcaccctc ggtctggaca tcgagacagc cacacgtgct 180
ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc 240
atggcctctg tacctgcgct cagaaatagc cctcaaggag agagaagaag aaaaaagaga 300
ggactatttg gagctataat gaacaacagg tggatcctcc acgctgcgtt cctgctgtgc 360
ttctccacca cagccctctc catcaactat aagcagctcc agctccaaga aaggacgaac 420
attcggaaat gtcaggagct cctggagcag ctgaatggaa agatcaacct cacctacagg 480
gcggacttca agatccctat ggagatgacg gagaagatgc agaagagtta cactgccttt 540
gccatccaag agatgctcca gaatgtcttt cttgtcttca gaaacaattt ctccagcact 600
gggtggaatg agactattgt tgtacgtctc ctggatgaac tccaccagca gacagtgttt 660
ctgaagacag tactagagga aaagcaagag gaaagattga cgtgggagat gtcctcaact 720
gctctccact tgaagagcta ttactggagg gtgcaaaggt accttaaact catgaagtac 780
aacagctacg cctggatggt ggtccgagca gagatcttca ggaactttct catcattcga 840
agacttacca gaaacttcca aaacggcagc ggcgcgacca actttagcct gctgaaacag 900
gcgggcgatg tggaagaaaa cccgggcccg atggatccaa acactgtgtc aagctttcag 960
gacatactgc tgaggatgtc aaaaatgcag ttggagtcct catcggggga cttgaatgga 1020
atgataacac agttcgagtc tctgaaactc tacagagatt cgcttggaga agcagtaatg 1080
agaatgggag acctccactc actccaaaac agaaacgaga aatggcggga acaattaggt 1140
cagaagtttg aagaaataag atggttgatt gaagaagtga gacacaaact gaagataaca 1200
gagaatagtt ttgagcaaat aacatttatg caagccttac atctattgct tgaagtggag 1260
caagagataa gaactttctc gtttcagctt atttaa 1296
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> furin cleavage site
<400> 13
Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly
1 5
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> furin cleavage site
<400> 14
Leu Arg Asn Thr Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu
1 5 10 15
Phe Gly Ala Ile
20
Claims (10)
- 서열번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어진, A/PR8/1934/H1N1 바이러스로부터 분리된 후 절단된 NS1-86 단백질을 코딩하는 유전자;
서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 퓨린 분절 부위(Furin Cleavage site)를 코딩하는 유전자;
외래 단백질을 코딩하는 유전자;
서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어진, porcine teschovirus-1 (PTV-1) 2A 분절부위를 코딩하는 유전자; 및
서열번호 5로 표시되는 염기 서열로 이루어진, NEP(Nuclear export protein)을 코딩하는 유전자;를 순차적으로 포함하는 외래 단백질 발현용 재조합 벡터에서,
상기 재조합 벡터는 외래 단백질을 free form 형태로 발현하는 것을 특징으로 하는, 외래 단백질 발현용 재조합 벡터. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 외래 단백질은 IFN-β, GFP, IFN-α, IFN-γ, Viperin (RSAD2; radical SAM domain-containing 2), infrared fluorescent protein(iRFP), 디프테리아 톡신, 중증 열성 혈소판 감소 증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus)의 당단백질(Gn 및 Gc)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단백질 발현용 재조합 벡터. - 제1항 또는 제3항에 따른 외래 단백질 발현용 재조합 벡터를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스.
- 제4항의 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는 유전자 전달체.
- 제1항의 재조합벡터가 포함된 재조합 인플루언자 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스 MERS-CoV 감염 예방 또는 치료용 백신 조성물에서,
상기 재조합벡터는 외래 단백질을 코딩하는 유전자로 mouse interferon-beta를 코딩하는 유전자를 포함하고,
상기 mouse interferon-beta를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스 MERS-CoV 감염 예방 또는 치료용 백신 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 백신은 바이러스가 약독화 된 생독 백신인 것인 인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스 MERS-CoV 감염 예방 또는 치료용 백신 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 백신은 아형인 A/Ab/Korea/ma81/07/H5N2 (Av/ma81) 포유류 적응형 조류인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스(MERS-coV)에 대해 면역반응 및 치료를 나타내는 것인 인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스 MERS-CoV 감염 예방 또는 치료용 백신 조성물. - 제6항의 백신을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스 또는 메르스코로나 바이러스 MERS-CoV 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
- 인플루엔자 바이러스로부터 NS1 유전자를 분리하는 단계;
상기 NS1 유전자를 절단하여 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 NS1-86 유전자를 형성하는 단계; 및
상기 NS1-86 유전자에 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 퓨린 분절 부위를 코딩하는 유전자, interferon-beta를 코딩하는 유전자, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 porcine teschovirus-1 (PTV-1) 2A 분절부위를 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 NEP(Nuclear export protein)을 코딩하는 유전자를 순차적으로 삽입하는 단계;를 포함하는, NS1-86 유전자, 퓨린 분절 부위를 코딩하는 유전자, interferon-beta를 코딩하는 유전자 porcine teschovirus-1 (PTV-1) 2A 분절부위를 코딩하는 유전자 및 NEP(Nuclear export protein)을 코딩하는 유전자가 융합된 핵산을 제조하는 방법에서,
상기 핵산은 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하고,
상기 핵산은 외래 단백질을 free form 형태로 발현하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20190215 |
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| PA0201 | Request for examination | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20200612 Patent event code: PE09021S01D |
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| AMND | Amendment | ||
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20201217 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20200612 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |
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| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| PX0901 | Re-examination |
Patent event code: PX09011S01I Patent event date: 20201217 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PX09012R01I Patent event date: 20200810 Comment text: Amendment to Specification, etc. |
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20210316 Patent event code: PE09021S01D |
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| AMND | Amendment | ||
| PX0701 | Decision of registration after re-examination |
Patent event date: 20220223 Comment text: Decision to Grant Registration Patent event code: PX07013S01D Patent event date: 20211018 Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event code: PX07012R01I Patent event date: 20210215 Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event code: PX07012R01I Patent event date: 20201217 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PX07011S01I Patent event date: 20200810 Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event code: PX07012R01I |
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| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20220228 Patent event code: PR07011E01D |
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| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20220228 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
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| PG1601 | Publication of registration |