KR102366554B1 - SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 RT-LAMP 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 RT-LAMP 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 RT-LAMP 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 간단한 실시간 등온증폭기기만으로 현장에서 SARS-CoV-2 델타 변이를 신속하게 구별할 수 있으므로, 코로나바이러스감염증-19의 대응관리에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 RT-LAMP(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
SARS-CoV-2 델타 변이는 2020년 10월 인도에서 처음 발견된 코로나19 변이 바이러스로, 당초 '인도 변이'로 불리다가 '델타 변이'로 명칭을 변경하였다. 알파(α, 영국), 베타(β, 남아프리카공화국), 감마(γ, 브라질)와 함께 세계보건기구(WHO)가 지정한 '우려 변이(Variant of Concern)' 중 하나로, 계통 분류체계는 B.1.617이다. WHO는 변이 바이러스가 기존의 코로나19 바이러스보다 전파성이 증가하거나 중증도에 변화가 있는 경우, 백신과 치료제 등의 유효성 저하가 확인되는 경우 '우려 변이'로 지정하고 있는데, 델타 변이는 2021년 5월 10일 우려 변이로 분류되었다.
델타 변이는 기존 코로나19 백신으로 방어가 가능한 것으로 알려지지만, 다른 변이 바이러스보다 전파 속도가 빠른 데다 더 심각한 증상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 실제로 인도를 비롯해 델타 변이가 확산된 지역의 코로나19 환자들은 복통, 메스꺼움, 구토, 식욕 상실, 청력 상실, 관절 통증을 겪는 것으로 알려졌다.
코로나19 바이러스(SARS-CoV-2)는 인체에 침투할 때 바이러스 표면에 있는 스파이크 단백질을 이용해 인간의 세포 수용체와 결합한다. 2020년 9월 영국에서 처음 발견된 알파(α)형은 스파이크 단백질을 이루는 아미노산에 N501Y 변이가 일어난 것으로, 기존 바이러스보다 전파력이 1.5배 더 높은 것으로 알려져 있다. 2020년 5월 남아공에서 발견된 베타(β)형과 2020년 11월 브라질에서 발견된 감마(γ)형에서는 면역을 회피하는 E484K 변이가 확인됐는데, 이는 항체가 생겨도 다시 감염되는 것이 가능하다.
SARS-CoV-2 델타(δ) 변이 (lineage B.1.617.2)는 스파이크 단백질 코딩 서열에 돌연변이가 발생하여 T478K, P681R 및 L452R 치환 변이 등이 확인되었으며, 면역 회피력은 물론 높은 감염력을 가진 것으로 추정되고 있다. 또한, 델타 변이는 상기 위치의 아미노산 치환 외, G142D, T19R, R158G, D950N 변이와 E156 및 F157의 결실 변이도 확인되었다.
한편, 한국등록특허 제2229225호에는 '사스-코로나바이러스-2 표면의 스파이크 단백질에 결합하는 사스-코로나바이러스 감염증의 진단용 결합 분자'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제2109196호에는 '2019 신종코로나바이러스 검출용 LAMP 조성물 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 RT-LAMP 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 SARS-CoV-2 델타(δ) 변이를 구별할 수 있는 진단 방법을 개발하기 위해, SARS-CoV-2 델타 변이에서 발견된 스파이크(spike) 단백질의 E156 및 F157 결실 변이에 기반하여 야생형 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 코딩 유전자 서열에서 LAMP용 프라이머 세트를 제작하였다. 그 후, 이전에 개발한 SARS-CoV-2의 N 유전자 표적 LAMP 프라이머 세트를 통해 SARS-CoV-2 양성으로 확인된 검체를 대상으로, 본 발명에서 제작한 LAMP용 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭 반응을 수행한 결과, 야생형 SARS-CoV-2와 SARS-CoV-2 델타 변이가 구별되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 1, 2, 13, 4, 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 SARS-CoV-2 델타 변이 구별을 위한 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트 조성물 및 고리매개등온증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 감염증 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트 조성물을 이용하여 역전사고리매개등온증폭 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2 델타 변이의 구별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 간단한 실시간 등온증폭기기만으로 현장에서 SARS-CoV-2 델타 변이를 신속하게 구별할 수 있으므로, 코로나바이러스감염증-19의 대응관리에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에서 사용한 SARS-CoV-2의 스파이크(spike) 단백질 코딩 유전자에서 델타 변이 구별을 위한 LAMP 프라이머 제작에 사용된 염기서열 부위와 LAMP 프라이머의 위치를 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 LAMP 프라이머는 야생형 SARS-CoV-2에 대해서는 등온증폭 반응이 일어나지만 SARS-CoV-2 델타 변이에 대해서는 등온증폭 반응이 불가능하도록 고안되었다.
도 2는 델타 변이 영역을 포함하는 야생형 스파이크 단백질 특이적 LAMP 프라이머 세트와 이동형 등온증폭 장비를 이용한 SARS-CoV-2 델타 변이 구별을 위한 LAMP 반응 결과이다.
도 3은 델타 변이 스파이크 결실영역에 특이적인 FIP 프라이머(서열번호 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머)를 포함하는 LAMP 프라이머 세트와 이동형 등온증폭 장비를 이용한 SARS-CoV-2 델타 변이 구별을 위한 LAMP 반응 결과이다.
도 2는 델타 변이 영역을 포함하는 야생형 스파이크 단백질 특이적 LAMP 프라이머 세트와 이동형 등온증폭 장비를 이용한 SARS-CoV-2 델타 변이 구별을 위한 LAMP 반응 결과이다.
도 3은 델타 변이 스파이크 결실영역에 특이적인 FIP 프라이머(서열번호 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머)를 포함하는 LAMP 프라이머 세트와 이동형 등온증폭 장비를 이용한 SARS-CoV-2 델타 변이 구별을 위한 LAMP 반응 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 1, 2, 13, 4, 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 SARS-CoV-2 델타 변이 구별을 위한 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 델타 변이 구별을 위한 RT-LAMP용 프라이머 세트는 GenBank accession no. NC_045512.2인 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서 스파이크(spike) 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 14; 3,822 bp)에 특이적인, 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및/또는 서열번호 1, 2, 13, 4, 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함한다. 상기 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 야생형 스파이크 단백질에서 E156 및 F157 아미노산을 코딩하는 염기가 결실된 SARS-CoV-2 델타 변이에 대해서는 등온증폭 반응이 불가능하도록 고안되었으며, 상기 서열번호 1, 2, 13, 4, 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 E156 및 F157 코딩 서열이 결실된 SARS-CoV-2 델타 변이에 대해 특이적으로 등온증폭 반응이 일어나도록 고안되었다.
본 명세서에 있어서, 용어 '고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)'은 기존 PCR(polymerase chain reaction) 법과 달리 등온의 조건에서 증폭 반응을 수행할 수 있는 방법을 의미한다. LAMP 반응을 위해서는 기본적으로 4종의 프라이머(F3, B3, FIP, BIP)가 필요하고, 반응 속도를 향상시키기 위해 2종의 프라이머(LF, LB)를 추가하여 최종 6종의 각기 다른 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머가 반응에 필요하다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 바람직하게는, RNA를 주형으로 역전사 효소와 중합효소를 하나의 튜브에 혼합하여 역전사 반응과 LAMP 반응이 동시에 일어나도록 수행하는 역전사고리매개등온증폭(RT-LAMP)용일 수 있다.
상기 4종의 기본 프라이머는 외부(outer) 프라이머 2종과 내부(inner) 프라이머 2종으로 구성되며, 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 고리매개 등온증폭반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다. 추가 2종의 프라이머는 정방향 고리(forward loop, LoopF) 프라이머와 역방향 고리(backward loop, LoopB) 프라이머 2종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열에 부착하여 고리매개등온증폭 반응을 가속화시킨다.
본 발명의 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 또는 서열번호 1, 2, 13, 4, 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 1의 프라이머는 정방향 외부 프라이머인 F3이고, 서열번호 2의 프라이머는 역방향 외부 프라이머인 B3이고, 서열번호 3 및 서열번호 13의 프라이머는 정방향 내부 프라이머인 FIP이며, 서열번호 4의 프라이머는 역방향 내부 프라이머인 BIP이며, 서열번호 5의 프라이머는 정방향 고리 프라이머인 LoopF이고, 서열번호 6의 프라이머는 역방향 고리 프라이머인 LoopB이다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 3의 FIP 프라이머의 37번째부터 42번째까지 염기는 야생형 스파이크 단백질의 E156 및 F157 아미노산을 코딩하고 있는 영역(도 1 녹색 박스 영역 참고)에 결합되는 위치로, SARS-CoV-2 델타 변이는 해당 염기가 결실된 변이 스파이크 단백질 코딩 서열을 가지고 있어 등온증폭 반응이 일어날 수 없게 된다. 반대로 서열번호 13의 FIP 프라이머는 상기 야생형 스파이크 단백질의 E156 및 F157 아미노산을 코딩하고 있는 영역이 결실된 염기에 특이적인 것으로, SARS-CoV-2 델타 변이에서만 등온증폭 반응이 일어날 수 있게 된다.
본 발명의 상기 프라이머는, 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1, 2, 5 및 6 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 서열번호 3, 4 및 13 내의 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(19개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 각 프라이머에는 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지로 모식될 수 있다. 검출용 표지는 프라이머에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등일 수 있으며, 이에 한정하지 않으나, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563, BIOTIN, DIGOXIGENIN 및 NED 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 역전사고리매개등온증폭(RT-LAMP)용 프라이머 세트 조성물 및 고리매개등온증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 키트는 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1, 2, 13, 4, 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 RT-LAMP용 프라이머 세트를 포함하며, 상세한 내용은 전술한 것과 같다.
또한, 본 발명의 키트는 서열번호 7 내지 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 RT-LAMP용 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 서열번호 7 내지 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 RT-LAMP용 프라이머 세트는 GenBank accession no. MN908947.3인 Wuhan seafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 제작된 프라이머 세트로서, SARS-CoV-2 델타 변이뿐만 아니라 야생형 SARS-CoV-2 모두에 대해 등온증폭 반응이 가능한 프라이머 세트이다. 상기 서열번호 7 내지 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 RT-LAMP용 프라이머 세트의 상세 정보는 한국등록특허공보 제2109196호에 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 키트에서, 상기 역전사고리매개등온증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 역전사 효소, DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 DNA 중합효소는 Bst 중합효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 역전사고리매개등온증폭법(RT-LAMP)을 위해 기존의 고리매개등온증폭법(LAMP)에서 주로 사용되어진 Bst 중합효소 대신 보다 빠른 증폭 능력과 강력한 역전사효소능을 가지고 있는 GspSSD DNA 중합효소 등를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
SARS-CoV-2 감염증 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트 조성물을 이용하여 역전사고리매개등온증폭 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2 델타 변이의 구별 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 SARS-CoV-2 감염증 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료는 예를 들면, 채취한 인간의 검체(코 면봉 시료(nasal swab) 또는 분리된 인간 혈액)일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, SARS-CoV-2 감염증 환자로부터 분리된 생물학적 시료이면 제한되지 않는다. 상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 델타 변이의 구별 방법에 있어서, 상기 등온증폭 반응은 60℃ 내지 68℃에서 20분 내지 50분 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 66℃에서 20분 내지 50분 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 SYBR Green I을 이용한 형광 측정, 페놀 레드와 같은 지시약의 색상 변화, 탁색도, 침전물 생성, DNA laddering, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있고, 바람직하게는 SYBR Green I을 이용한 형광 측정, 탁색도, DNA laddering일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 SARS-CoV-2 델타 변이의 구별 방법은, SARS-CoV-2 양성으로 확인된 검체를 대상으로, 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 RT-LAMP용 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하면 증폭 신호가 확인되지 않거나, 또는 서열번호 1, 2, 13, 4, 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 RT-LAMP용 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하면 증폭 신호가 확인되는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 RT-LAMP용 프라이머 세트는 야생형 스파이크 단백질의 E156 및 F157이 결실된 변이 스파이크 단백질을 코딩하는 서열을 가진 SARS-CoV-2 델타 변이 시료에 대해서는 등온증폭 반응이 일어나지 않으므로, 야생형 SARS-CoV-2와 SARS-CoV-2 델타 변이를 구별할 수 있게 되는 것이며, 서열번호 1, 2, 13, 4, 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 RT-LAMP용 프라이머 세트는 스파이크 단백질의 E156 및 F157이 결실된 변이 스파이크 단백질을 코딩하는 서열을 가진 SARS-CoV-2 델타 변이 시료에 대해서만 특이적으로 등온증폭 반응이 일어나므로 야생형 SARS-CoV-2와 SARS-CoV-2 델타 변이를 구별할 수 있게 되는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. SARS-CoV-2 델타 변이 구별을 위한 LAMP 프라이머 세트 설계
야생형 SARS-CoV-2와 SARS-CoV-2 델타 변이 구별을 위한 LAMP용 프라이머 세트를 제작하기 위해, GenBank accession no. NC_045512.2인 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서 스파이크(spike) 단백질을 코딩하는 유전자의 정보를 확보한 후, SARS-CoV-2 델타 변이는 스파이크 단백질의 E156 및 F157이 결실된 보고에 기반하여, 야생형 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 코딩 서열에는 결합이 가능하지만 SARS-CoV-2 델타 변이 스파이크 단백질 코딩 서열에는 결합이 불가능하도록 프라이머 서열을 디자인하였다(도 1 참고). LAMP용 프라이머는 OptiGene사의 LAMP Design software를 이용하여 설계하였으며, 최종 설계된 LAMP용 프라이머 세트는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 스파이크 단백질 코딩 유전자 서열에서 336~679번째 염기서열 부위를 표적으로 하며, 각 LAMP 프라이머 서열의 위치는 도 1에 나타낸 바와 같다. 특히, 본 발명에 따른 FIP 프라이머(서열번호 3)의 37번째부터 42번째까지 염기는 야생형 스파이크 단백질의 E156 및 F157 아미노산을 코딩하고 있는 영역에 결합되는 위치로, SARS-CoV-2 델타 변이는 해당 염기가 결실된 변이 스파이크 단백질 코딩 서열을 가지고 있어 등온증폭 반응이 일어날 수 없도록 디자인되었다. 본 발명자는 또한, 상기 E156 및 F157 아미노산을 코딩하고 있는 영역이 결실된 변이 스파이크 단백질 코딩 서열에 특이적인 FIP 프라이머(서열번호 13, 도 3 참고)를 추가로 제작하여, SARS-CoV-2 델타 변이에서만 특이적인 증폭 반응이 일어날 수 있도록 하였다.
SARS-CoV-2 알파(α, B.1.1.7) 변이는 스파이크 단백질 영역에서 H69-, V70-, Y144-, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A 및 D1118H 변이를 가지고 있으며['-'는 결실을 의미], SARS-CoV-2 베타(β, B.1.351) 변이는 스파이크 단백질 영역에서 D80A, D215G, L241-, L242-, A243-, K417N, E484K, N501Y, D614G 및 A701V 변이를 가지고 있으며, SARS-CoV-2 감마(γ, P.1) 변이는 스파이크 단백질 영역에서 L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I, V1176F 변이를 가지고 있는 것으로 알려졌다(https://covariants.org/). 즉, SARS-CoV-2의 알파, 베타 및 감마 변이는 스파이크 단백질의 E156 및 F157이 결실되지 않았으므로, 본 발명에 따른 RT-LAMP 프라이머 세트를 이용한 등온증폭 반응에서 증폭 반응이 야생형과 동일하게 일어날 수 있음을 용이하게 알 수 있다.
실시예 2. RT-LAMP 분석능 평가
제작된 LAMP 프라이머를 이용한 SARS-CoV-2 델타 변이 구별능을 분석하기 위해, 코면봉 임상검체를 이용하여 QIAamp Viral RNA Mini Kit를 사용하여 추출한 핵산을 이용하여 LAMP 반응을 수행하였다. SARS-CoV-2 감염 임상검체는 국군 수도병원, 국군양주병원, 국군의학연구소 진단검사실로부터 제공받아 사용하였다. 추출된 핵산 2㎕를 취하여, Bst 폴리머라제 1㎕ (8U), 10×buffer 2.5㎕, 25mM dNTP 1.5㎕, 10mM MgSO4 1㎕, 5M betaine 5㎕, Reverse Transcriptase 0.1㎕ (10U), 6개의 각 프라이머(F3 및 B3는 각각 5pmol, FIP 및 BIP는 각각 40pmol, LoopF 및 LoopB는 각각 10pmol) 각 1㎕씩, 25×SYBR Green I 1㎕ 및 증류수(up to ~25㎕)를 포함하는 총 25㎕의 반응액을 제조한 후 RT-LAMP를 수행하였다. 실시간으로 등온증폭 산물의 결과를 확인하기 위해, 휴대용 Isothermal Fluorescence PCR 기기인 Gene-8C (ALLSHENG)를 사용하여 66℃, 20분간 등온증폭 반응을 수행하였다. 형광 신호는 매 20초마다 측정하였다. 또한, 한국등록특허공보 제2109196호에 개시된 SARS-CoV-2의 N 유전자에 특이적으로 제작된 프라이머 세트(서열번호 7 내지 12)를 상기 조성과 동일하게 제조하여 등온증폭 반응을 실시하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이, SARS-CoV-2의 N 유전자에 특이적으로 제작된 프라이머 세트(한국등록특허공보 제2109196호)를 이용한 경우 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-2 델타 변이 시료에서 모두 등온증폭 반응이 확인되었으나, 본 발명의 스파이크 단백질 변이 영역 특이적 프라이머 세트(서열번호 1 내지 6)를 이용한 경우 SARS-CoV-2 델타 변이 시료에서는 등온증폭 반응이 확인되지 않는 것을 알 수 있었다. 이를 통해, 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 RT-LAMP용 프라이머 세트를 이용하면 SARS-CoV-2 델타 변이를 구별할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명자는 동일한 시료를 대상으로 델타 변이 스파이크 단백질 특이적 프라이머 세트(서열번호 1, 2, 13, 4, 5 및 6)를 이용하여 등온증폭 반응을 수행한 결과, 야생형 SARS-CoV-2 시료에서는 증폭 신호가 확인되지 않고, SARS-CoV-2 델타 변이 시료에서만 특이적으로 증폭반응 신호가 확인되는 것을 알 수 있었다(도 3). 상기의 결과를 통해 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 코로나바이러스감염증-19의 진단 및 관리에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상되었다.
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<223> B3 primer
<400> 2
ccaatggttc taaagccgaa 20
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIP primer
<400> 3
ccataagaaa aggctgagag acttggatgg aaagtgagtt cag 43
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIP primer
<400> 4
accttgaagg aaaacagggt aagagggaga tcacgcacta 40
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LF primer
<400> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB primer
<400> 6
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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tcaatctgtc aagcagcag 19
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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ctcatcacgt agtcgcaaca gtattgccag ccattctagc 40
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 11
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<212> DNA
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<220>
<223> primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIP primer
<400> 13
ccataagaaa aggctgagag acgttggatg gaaagtggag ttt 43
<210> 14
<211> 3822
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate
Wuhan-Hu-1
<400> 14
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400
aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460
ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580
ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640
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aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820
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atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300
cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360
tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420
ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480
tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540
aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600
caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780
tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822
Claims (5)
- 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 1, 2, 13, 4, 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 SARS-CoV-2 델타 변이 구별을 위한 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트 조성물.
- 제1항에 따른 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트 조성물 및 고리매개등온증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 키트.
- 제2항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 7 내지 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 키트.
- SARS-CoV-2 감염증 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항의 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트 조성물을 이용하여 역전사고리매개등온증폭 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2 델타 변이의 구별 방법. - 제4항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 형광발색, 탁색도, 스핀다운에 의한 침전물 생성 또는 전기영동을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 SARS-CoV-2 델타 변이의 구별 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210091069A KR102366554B1 (ko) | 2021-07-12 | 2021-07-12 | SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 RT-LAMP 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210091069A KR102366554B1 (ko) | 2021-07-12 | 2021-07-12 | SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 RT-LAMP 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102366554B1 true KR102366554B1 (ko) | 2022-02-23 |
Family
ID=80495579
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210091069A Active KR102366554B1 (ko) | 2021-07-12 | 2021-07-12 | SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 RT-LAMP 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102366554B1 (ko) |
-
2021
- 2021-07-12 KR KR1020210091069A patent/KR102366554B1/ko active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Huang 등, Microbial Biotechnology, Vol. 13, No. 4, p.950-961 (2020.04.25.)* * |
| Lopez-Rincon 등, bioRxiv., 페이지 1-16 (2021.05.21.)* * |
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