KR101911017B1 - 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법, 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법 - Google Patents
타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법, 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법, 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)의 원인균인 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis)의 16S rRNA 유전자 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍을 유효성분으로 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 및 상기 프라이머 쌍을 이용하는 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법과 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법, 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)의 원인균인 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis)의 16S rRNA 유전자의 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍을 유효성분으로 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 및 상기 프라이머 쌍을 이용하는 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법과 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법에 관한 것이다.
타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis, T. equigenitalis) 감염에 의해 얼룩말, 말(조랑말 등), 노새, 당나귀 등의 마과동물(馬科動物)에서 발생하는 생식기 질병인 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)은 1977년 영국에서 세계 최초로 보고된 이후 벨기에, 핀란드, 프랑스, 독일, 네덜란드, 노르웨이, 슬로베니아 등 여러 유럽 국가와 북남미, 호주 등지에서도 발생하였다(Crowhurst R.C ., Vet. Rec ., 100(22):476, 1977; Crowhurst R.C . et al., Vet. Rec ., 104(20):465, 1979; ter Laak EA et al., Tijdschr Diergeneeskd, 114(4):189-201, 1989; Timoney PJ, J Anim Sci ., 89(5):1552-60, 2011; Matsuda M. et al., Vet Microbiol ., 97(1-2):111-22, 2003; Bleumink-Pluym NM et al., Int . J. Syst. Bacteriol ., 43(3):618-21, 1993; Breuil MF et al., Vet. Microbiol ., 148(2-4):260-6, 2011 참조).
특히, 미국은 1970년에 말전염성자궁염 근절에 성공하였으나 2006년에 다시 발생하였으며 현재도 간헐적으로 발생하고 있다. 일본은 1980년에 말전염성자궁염이 최초로 발생한 것으로 보고되었으며 이후 지속적 관리로 2006년부터 2010년까지 추가 발생보고는 없었다(Anzai T et al., J. Vet. Med . Sci ., 64(11):999-1002, 2002 참조).
타일로렐라 에퀴제니탈리스에 감염된 말은 수태율이 저하되며 말산업 전체가 큰 손해를 입기 때문에 국내에는 제2종 가축전염병, 세계동물보건기구(OIE)에서는 관리대상 질병으로 지정하고 있다.
2015년 국내 사육 말에서 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염 질병이 최초로 확인되었으며, 본 질병에 대한 유효한 백신이 없고, 질병의 특성상 재발이 쉬워 질병 근절을 위해서는 의심 개체에 대한 신속한 진단을 통한 격리 및 치료가 필수적인 질병으로 분류된다.
한편, 말전염성자궁염 진단법으로 원인균의 분리동정법 및 실시간유전자진단법이 사용되고 있으며, 현재 1종의 실시간유전자 진단법이 상업화되어 판매 중에 있다. 그러나 기존 원인균의 분리동정법의 경우 시료 채취 후 48시간 이내에 실험실로 운송되어 검사가 되어야 하며, 다른 균주들로부터 타일로렐라 에퀴제니탈리스만을 단독 분리하기 위하여 특수 배지를 사용하여야 하고, 최소 7일 이상의 긴 시간이 소요되는 단점이 있으며, 분리배양 자체의 까다로움 때문에 매우 낮은 분리효율을 가지는 것으로 보고된 바 있다(Timoney P.J. et al., Vet. Rec ., 111(5):107-108, 1982; Atherton J.G., Vet. Rec ., 113(13):299-300, 1983; Ward J. et al., Vet. Rec ., 114(12):298, 1984; Parlevliet JM et al., Theriogenology., 47(6):1169-77, 1997; Wakeley P.R. et al., Vet. Microbiol ., 118(3-4):247-54, 2006; Matsuda M. et al., Vet Microbiol., 97(1-2):111-22, 2003 참조).
또한, 현재 타일로렐라 에퀴제니탈리스 검출용으로 판매중인 타일로렐라 에퀴제니탈리스 검출용 키트는 실시간 유전자 진단법에 이용 가능한 타일로렐라 에퀴제니탈리스만을 검출하는 키트(cador TKP PCR Reagent, cat.no. 285115, Qiagen) 또는 타일로렐라 에퀴제니탈리스, 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)를 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스 키트(cador TKP PCR Reagent, Qiagen)가 있기는 하나, 상기 키트(들)의 공급이 일정하지 않아(2014년도 공급 중단) 입수가 쉽지 않고, 높은 경비가 소요된다는 단점이 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 제품을 생산하는 제조사에 의존하지 않고, 타일로렐라 에퀴제니탈리스를 검출하는 데 이용되는 기존 제품과 비교하여 저렴하면서도 우수한 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)로 신속하게 말전염성자궁염의 원인균인 타일로렐라 에퀴제니탈리스를 검출할 수 있는 조성물, 키트 및 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍(primer pair)을 유효성분으로 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 및 상기 프라이머 쌍을 이용하는 검출방법은 기존 제품 및/또는 기존 검출방법에 비해 타일로렐라 에퀴제니탈리스(바람직하게는 타일로렐라 에퀴제니탈리스에 감염된 동물 또는 검체시료(가검시료)로부터 분리된 타일로렐라 에퀴제니탈리스)의 검출이 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis)의 검출용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis) 감염에 의한 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)의 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis)의 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis) 감염에 의한 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)의 진단방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 유효성분으로 포함하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis)의 검출용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 유효성분으로 포함하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis) 감염에 의한 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)의 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis)의 검출방법에 있어서, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 이용하여 검체 시료로부터 분리된 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산을 주형으로 증폭시켜 타일로렐라 에퀴제니탈리스를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis) 감염에 의한 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)의 진단방법에 있어서, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 이용하여 말전염성자궁염 개체(단, 인간은 제외)의 검체 시료로부터 분리된 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산을 주형으로 증폭시켜 말전염성자궁염 개체의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법을 제공한다.
본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 및 상기 프라이머 쌍을 이용하는 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법은 기존 제품 및/또는 기존 검출방법에 비해 우수한 민감도와 특이도로 인해 신속하게 검체시료(가검시료) 내 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 효율을 향상시킬 수 있으며, 기존 검출법인 실시간 유전자 진단법에 비해 시간, 노동력 및 경비 절감 효과가 있어, 결과적으로 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의해 발생되는 말전염성자궁염의 조기 진단이 가능하여 국내 말산업 보호, 가축방역 및 검역에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표기되는 프라이머 쌍을 도출하기 위해 타일로렐라 에퀴제니탈리스 균주(TE)의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이종 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열과 비교한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표기되는 프라이머 쌍의 결합 부위를 타일로렐라 에퀴제니탈리스 균주(TE)의 16S rRNA 유전자 염기서열(GenBank Accession No. X68645: 1~1499) 상에서 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표기되는 프라이머 쌍의 말전염성자궁염으로 진단받은 말의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 검출능을 확인하기 위하여, 말전염성자궁염으로 진단받은 말의 생식기의 스왑(swab) 시료의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 유래 핵산을 이용하여 상기 프라이머 쌍으로 PCR 반응 수행 후, 수득한 PCR 증폭 생성물을 겔상에서 전기영동하여 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 여부를 확인한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍의 민감도를 확인하기 위하여, 각기 다른 농도의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 유래 주형 DNA를 이용하여 상기 프라이머 쌍으로 PCR 반응 수행 후, 수득한 PCR 증폭 생성물을 겔상에서 전기영동하여 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 여부를 확인한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍의 민감도를 검출 가능한 주형 DNA의 함량 범위로 확인하기 위하여, 각기 다른 함량의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 유래 주형 DNA를 이용하여 상기 프라이머 쌍으로 PCR 반응 수행 후, 수득한 PCR 증폭 생성물을 겔상에서 전기영동하여 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 여부를 확인한 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표기되는 프라이머 쌍의 특이도를 확인하기 위하여, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 및 이종 균주로부터 유래한 주형 DNA를 이용하여 상기 프라이머 쌍으로 PCR 반응 수행 후, 수득한 PCR 증폭 생성물을 겔상에서 전기영동하여 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 여부를 확인한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표기되는 프라이머 쌍의 결합 부위를 타일로렐라 에퀴제니탈리스 균주(TE)의 16S rRNA 유전자 염기서열(GenBank Accession No. X68645: 1~1499) 상에서 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표기되는 프라이머 쌍의 말전염성자궁염으로 진단받은 말의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 검출능을 확인하기 위하여, 말전염성자궁염으로 진단받은 말의 생식기의 스왑(swab) 시료의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 유래 핵산을 이용하여 상기 프라이머 쌍으로 PCR 반응 수행 후, 수득한 PCR 증폭 생성물을 겔상에서 전기영동하여 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 여부를 확인한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍의 민감도를 확인하기 위하여, 각기 다른 농도의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 유래 주형 DNA를 이용하여 상기 프라이머 쌍으로 PCR 반응 수행 후, 수득한 PCR 증폭 생성물을 겔상에서 전기영동하여 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 여부를 확인한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍의 민감도를 검출 가능한 주형 DNA의 함량 범위로 확인하기 위하여, 각기 다른 함량의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 유래 주형 DNA를 이용하여 상기 프라이머 쌍으로 PCR 반응 수행 후, 수득한 PCR 증폭 생성물을 겔상에서 전기영동하여 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 여부를 확인한 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표기되는 프라이머 쌍의 특이도를 확인하기 위하여, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 및 이종 균주로부터 유래한 주형 DNA를 이용하여 상기 프라이머 쌍으로 PCR 반응 수행 후, 수득한 PCR 증폭 생성물을 겔상에서 전기영동하여 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 여부를 확인한 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서 부피, 시간(기간), 농도, 함량 등을 표현하는데 사용된 용어 "약"은 해당 수치 또는 수치 범위에서 최대 10%의 허용오차가 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명은 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 이용한 PCR 기법으로 기존 진단법에 비해 우수한 민감도와 특이도로 신속하게 검체시료(가검시료) 내 포함된 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산을 검출하는 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명에서 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' end hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 정방향(센스) 프라이머 및 역방향(안티센스) 프라이머의 염기서열 및 길이는 당업계에 공지된 기법을 이용하여 변형이 가능하다. 이러한 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제작하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 "정방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자 증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.
본 발명에서 용어 "중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산(주형)에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍(Primer Pair, Primer Set)으로부터 표적 핵산(표적 염기서열)을 증폭하는 방법으로, 대표적인 핵산증폭기술(Nucleic Acid Amplification Test: NAT) 중의 하나이다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 핵산(표적 염기서열)을 증폭하는 단계는 당업계에서 통상적으로 사용되는 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction: LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(Repair Chain Reaction), 전사-중재 증폭(Transcription-mediated Amplification: TMA), 자가 유지 염기서열 복제(Self Sustained Sequence Replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(Selective Amplification of Target Polynucleotide Sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄반응(Consensus Sequence Primed Polymerase Chain Reaction: CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄반응(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction: AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(Nucleic Acid Sequence Based Amplification: NASBA), 가닥 치환 증폭(Strand Displacement Amplification), 고리-중재 항온성 증폭(Loop-mediated Isothermal Amplification: LAMP), 다중 중합효소 연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction: Multiplex PCR), 이중 중합효소 연쇄반응(Nested Polymerase Chain Reaction: Nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소 연쇄반응(Single Tube Nested Polymerase Chain Reaction: Single Tube Nested-PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction: RT-PCR), 역 중합효소 연쇄반응(Inverse Polymerase Chain Reaction: Inverse PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time Polymerase Chain Reaction), 및 실시간 중합효소 연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction: RQ-PCR)등의 방법을 이용하여 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에 있어서, 상기 표적 핵산(표적 염기서열)을 증폭하는 단계는, 표적 핵산을 변성하는 단계(denaturation step); 표적 핵산과 상보적 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍이 상보적인 표적 핵산에 결합하는 단계(annealing step); 및 신장하는 단계(extension step)를 거쳐 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 증폭된 표적 염기서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명의 실시간 중합효소 연쇄반응 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 생성물(DNA 증폭 생성물)의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 나타내는 융해곡선을 분석하여 특정 염기서열인 타일로렐라 에퀴제니탈리스 16S rRNA 유전자 부위의 유무로 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 및/또는 상기 검출에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단이 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선의 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 형광융해곡선분석 방법은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프라이머(들)를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)일 수 있으며(예컨대, 스코피온스 PCR 프라이머), 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자(소스: GenBank Accession No. X68645) 부위에 특이적인 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 이용한 경우 말전염성자궁염으로 진단받은 말의 생식기의 스왑(swab) 시료의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 유래 DNA를 특이적으로 검출하였다(시험예 1 및 도 1~2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 검출용 프라이머 쌍의 민감도를 검증한 결과, 본 발명에 따른 프라이머 쌍은 1μl 당 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 유전자를 1copy까지 검출가능하였고, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 가능한 최소 핵산 함량은 약 1ag으로 상기 프라이머 쌍은 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 민감도가 매우 우수하였다(시험예 2 참조)
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 검출용 프라이머 쌍의 특이도를 검증한 결과, 본 발명에 따른 프라이머 쌍은 타일로렐라 에퀴제니탈리스(ATCC® 700933™, TE) 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스(국내 분리 균주)외에 타일로렐라 아시니제니탈리스(Taylorella asinigenitalis, TA), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa, PA), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae, KP) 및 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus, SZ)와는 교차반응하지 않은 것으로 확인되어 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 감별(진단) 용도에 적합하며, 상기 프라이머 쌍은 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 특이도가 매우 우수하였다(시험예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 PCR 기법은 cador TKP PCR Reagent 유래 프라이머 쌍을 이용한 기존 진단법에 비해 우수한 민감도와 특이도로 신속하게 검체시료(가검시료) 내 포함된 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출/감별 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단이 가능함을 확인하였다(시험예 4 참조).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 유효성분으로 포함하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis)의 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 검출은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time Polymerase Chain Reaction)에 의한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
봉 발명은 다른 관점에서 상기 조성물을 포함하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis)의 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 핵산 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 반응완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 유효성분으로 포함하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis) 감염에 의한 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 진단은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time Polymerase Chain Reaction)에 의한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis) 감염에 의한 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)의 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 핵산 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 반응완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis)의 검출방법에 있어서, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 이용하여 검체 시료로부터 분리된 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산을 주형으로 증폭시켜 타일로렐라 에퀴제니탈리스를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 검체 시료는 동물, 바람직하게는 말과동물, 더욱 바람직하게는 얼룩말, 말(조랑말 등), 노새 및 당나귀로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 상기 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 상기 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다.
상기 검체 시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭은 중합효소 연쇄반응(PCR)으로, 상기 중합효소 연쇄반응은 95℃에서 2분간 가열하는 단계, 및 40사이클로 94℃에서 20초간 가열하고 55℃에서 30초간 가열하며 72℃에서 30초간 가열하는 것을 반복하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis) 감염에 의한 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)의 진단방법에 있어서, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 이용하여 말전염성자궁염 개체의 검체 시료로부터 분리된 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산을 주형으로 증폭시켜 말전염성자궁염 개체(단, 인간은 제외)의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 말전염성자궁염 개체는 말과동물로, 바람직하게는 얼룩말, 말(조랑말 등), 노새 및 당나귀로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검체 시료는 말과동물, 더욱 바람직하게는 얼룩말, 말(조랑말 등), 노새 및 당나귀로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 상기 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 상기 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다.
상기 검체 시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭은 중합효소 연쇄반응(PCR)으로, 상기 중합효소 연쇄반응은 95℃에서 2분간 가열하는 단계, 및 40사이클로 94℃에서 20초간 가열하고 55℃에서 30초간 가열하며 72℃에서 30초간 가열하는 것을 반복하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[
시험예
1]
타일로렐라
에퀴제니탈리스의
검출용
프라이머
쌍의 설계, 제조 및 검증방법
먼저, 세균 종 특이적 시그니쳐 서열(Bacterial species specific signature sequences)인 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis, TE)의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍(정방향 프라이머 및 역방향 프라이머)을 설계하고 제조하기 위해 다음과 같은 분석작업을 실시하였다(참고문헌: Bleumink-Pluym NM et al., Int . J. Syst. Bacteriol ., 43(3):618-21, 1993; Breuil MF et al., Vet. Microbiol., 148(2-4):260-6, 2011).
구체적으로, NCBI(National Center for Biotechnology Information: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 GenBank 데이타베이스를 검색하여 얻은 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자(소스: GenBank Accession No. X68645)를 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)로 분석하여, 말자궁내에 존재할 수 있는 이종 세균, 예컨대 타일로렐라 아시니제니탈리스(Taylorella asinigenitalis, TA), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa, PA), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae, KP) 및 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus, SZ)와는 구분이 되며, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 균주류에 특이적인 16S rRNA 유전자 염기서열 중 공통적인 부위(conserved region)를 선정하여 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위를 특이적으로 검출(탐지)할 수 있는 프라이머 쌍을 설계한 후, 제조하였고(도 1은 타일로렐라 에퀴제니탈리스 균주(TE)의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이종 균주와 비교하여 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표기되는 프라이머 쌍의 결합 부위를 나타낸 것이고, 도 2는 본 발명에 따른 프라이머 쌍의 결합 부위를 타일로렐라 에퀴제니탈리스 균주(TE)의 16S rRNA 유전자 염기서열(GenBank Accession No. X68645: 1~1499) 상에서 나타낸 것임), 상기 프라이머 쌍을 시험예 1 및 후술하는 시험예 2~4의 PCR 반응(conventional PCR, gel-based PCR)에 사용하였다.
상기 프라이머 쌍은 프라이머와 주형 DNA 간의 결합력을 높여 안정적으로 중합효소가 DNA를 신장할 수 있도록 프라이머의 3' 말단에 A 또는 T보다 수소 결합력이 강한 G 또는 C가 위치할 수 있도록 프라이머를 설계하였다. 본 명세서에서 A(adenine), T(thymine), G(guanine) 및 C(cytosine)는 뉴클레오타이드(nucleotide)의 기호를 나타낸 것이다.
하기 표 1은 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍을 나타낸 것이다.
| 서열번호 | 프라이머 이름 | 서열방향(5'-->3') | 길이 | Tm(℃) |
| 서열번호 1 | 정방향 프라이머 (Forward Primer, J1327F) |
5'-CAGAGATGACCTTTTACTATTG-3’ | 22mer | 55 |
| 서열번호 2 | 역방향 프라이머 (Reverse Primer, J1361R) |
5'-AGTCCATGGTATTAACACAAAC-3' | 22mer | 55 |
구체적으로, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 유래 DNA를 주형으로 본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후, 상기 PCR의 증폭 생성물을 통상적인 방법으로 EtBr(ethidium bromide, 0.5㎍/㎖)이 첨가된 1.5%(W/V) 아가로스 겔 상에서 전기영동(agarose gel electrophoresis)으로 분석하여 표적 핵산(타일로렐라 에퀴제니탈리스 유래 DNA)의 존재 여부를 확인하였다(전기영동용 버퍼: 1X TAE(40mM Tris-acetate [pH 8.3], 1mM EDTA)).
상기 PCR 반응 시 반응시료 당 10pmole 정방향 프라이머 및 10pmole 역방향 프라이머를 사용하였고, PCR의 반응조건은 95℃에서 2분간 사전 변성(pre-denaturation)시킨 다음, (94℃ 20초, 55℃ 30초, 72℃ 30초) x 40 사이클(cycle)로 약 1ng~100ng 또는 약 10pg~1ag의 함량 범위의 표적 핵산(DNA)의 증폭반응을 수행하였다.
상기 증폭반응 생성물의 분석 과정에서, 276bp 크기의 DNA 증폭 생성물이 생성되는 경우 타일로렐라 에퀴제니탈리스가 검출된 것(양성반응)으로 판정하고, 276bp 크기의 DNA 증폭 생성물이 생성되지 않은 경우에는 타일로렐라 에퀴제니탈리스가 불검출된 것(음성반응)으로 판정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 말전염성자궁염으로 진단받은 말의 생식기의 스왑(swab) 시료 139개 중 9개를 대상으로 핵산을 추출하여 PCR 증폭한 다음, PCR 증폭 생성물을 겔상에서 전기영동하여 분석 시 레인(lane) 1, 2, 3, 6 및 8은 양성으로 나타났고, 레인 4, 5, 7 및 9는 음성으로 나타났다. 여기서, M(marker)은 100bp DNA ladder(cat.no. D-1030, Bioneer)이고, 레인 10은 양성 대조군(T. equigenitalis ATCC® 700933™의 핵산)이며, 레인 11 및 12는 음성 대조군(주형 핵산 배제)을 나타낸 것이다.
[
시험예
2]
타일로렐라
에퀴제니탈리스
검출용
프라이머
쌍의 민감도 검증
본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 시험예 1의 PCR 조건으로 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 민감도를 확인하기 위하여, 양성 대조군인 타일로렐라 에퀴제니탈리스 DNA 주형(template)을 10배 단계 희석(10-fold serial dilution)하여 PCR 수행한 후 PCR 생성물을 겔상에서 전기영동한 다음, 민감도를 검증하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 쌍은 1μl 당 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 유전자를 1copy까지 검출가능하여 민감도면에서 우수함을 확인하였다(도 4: lane 1(M: 100bp DNA ladder(cat.no. D-1030, Bioneer), lane 2~11(copy수: 108~10-1), lane 12(NC, 음성대조군으로, 주형 DNA 부재))
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산을 10pg~1ag의 함량 범위로 10진 희석한 시료를 본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용한 PCR 반응으로 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 유전자가 검출 가능한지 확인한 결과, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산 함량이 1ag인 경우에도 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 유전자 검출이 가능하였고, Wakeley et al. 문헌에 의거한 분석 결과와 cador TKP PCR Reagent 유래 프라이머 쌍을 이용하여 수득한 Ct 값의 비교 분석 결과, 본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용한 PCR의 결과가 민감도면에서 매우 우수함을 확인하였다(도 5: lane 1~8(타일로렐라 에퀴제니탈리스 핵산: 10pg~1ag; 증폭산물 275bp), lane 9(M: 100bp DNA ladder(cat.no. D-1030, Bioneer), lane 10(Neg.: 음성대조군으로, 주형 DNA 부재), lane 11(Pos: 양성대조군; 증폭산물 648bp).
[
시험예
3]
타일로렐라
에퀴제니탈리스
검출용
프라이머
쌍의 특이도 검증
본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 시험예 1의 PCR 조건으로 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 특이도를 확인하기 위하여, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 및 이종 균주의 DNA 주형을 이용하여 PCR 수행한 후 PCR 생성물을 겔상에서 전기영동한 다음, 특이도를 검증하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 쌍은 레인(lane) 1 및 2의 타일로렐라 에퀴제니탈리스(ATCC® 700933™, TE) 및 레인 11 및 12의 타일로렐라 에퀴제니탈리스(국내 분리 균주)외에 레인 3 및 4의 타일로렐라 아시니제니탈리스(Taylorella asinigenitalis, TA), 레인 5 및 6에서 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa, PA), 레인 7 및 8의 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae, KP) 및 레인 9 및 10의 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus, SZ)와는 교차반응하지 않은 것으로 확인되어 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 감별(진단) 용도로도 적용 가능한 것으로 확인되어 특이도면에서 우수함을 확인하였다(여기서, M은 100bp DNA ladder(cat.no. D-1030, Bioneer)임).
[
시험예
4]
타일로렐라
에퀴제니탈리스의
검출 및
말전염성자궁염의
진단방법
말전염성자궁염으로 진단받은 말의 생식기의 스왑(swab) 시료 139개를 대상으로 하여 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 시험예 1의 PCR 조건과, 비교군으로 Real-time PCR(Wakeley et al., Vet. Microbiol ., 118:247-254, 2006; Bustin et al., Clinical Chemistry 55(4):611-622, 2009)을 참조하여 cador TKP PCR Reagent(cat.no. 285115, Qiagen)에 포함되는 프라이머 쌍을 이용한 PCR 조건에서 PCR을 수행한 후, 타일로렐라 에퀴제니탈리스에 대한 검출능을 비교하였다.
구체적으로, 상기 Wakeley et al. 문헌 및 Bustin et al. 문헌에 의거하여 분석한 결과, Real-time PCR Cq(quantification cycle) 값이 30 이하인 17개의 스왑 시료(검체 1~17)는 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍과 cador TKP PCR Reagent 유래 프라이머 쌍에서 모두 양성반응을 나타내었다.
반면, Real-time PCR Cq 값이 31 이상인 35개의 스왑 시료(검체 18~52)는 cador TKP PCR Reagent 유래 프라이머 쌍을 이용한 경우 모두 양성반응을 나타냈으나, 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 경우 33개의 스왑 시료는 양성반응을 나타내었고, 2개의 스왑 시료는 음성반응을 나타내었다. 특히, Real-time PCR Cq 값이 31 이상인 35개의 스왑 시료 중 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍으로 음성반응을 나타낸 2개의 스왑 시료는 Nested PCR 수행 결과에서도 음성반응을 나타내었다.
또 Real-time PCR Cq 값이 NA(not applicable)인 87개의 스왑 시료(검체 53~139)는 cador TKP PCR Reagent 유래 프라이머 쌍을 이용한 경우 모두 음성반응을 나타냈으나, 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 경우 68개의 스왑 시료는 음성반응을 나타내었고, 19개의 스왑 시료는 양성반응을 나타내었다. 특히, Real-time PCR Cq 값이 NA인 87개의 스왑 시료 중 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍으로 양성반응을 나타낸 19개의 스왑 시료는 염기서열분석(sequencing) 결과에서도 모두 양성반응을 나타내어 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산이 검출되는 것으로 확인되었다(아래 표 2~4 참조).
하기 표 2~4는 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 스왑 시료로부터 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
결국, 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 PCR 기법은 cador TKP PCR Reagent 유래 프라이머 쌍을 이용한 기존 진단법에 비해 우수한 민감도와 특이도로 신속하게 검체시료(가검시료) 내 포함된 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출/감별 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단이 가능함을 확인하였다.
종합하면, 본 발명에 따른 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 16S rRNA 유전자 부위에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법은 cador TKP PCR Reagent 유래 프라이머 쌍과 비교시 민감도 및 특이도 면에서 모두 우수하였다.
아울러, 상기 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법을 이용하여 말전염성자궁염 개체의 검체 시료로부터 분리된 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산을 주형으로 증폭시켜 말전염성자궁염 개체의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염 여부를 확인(진단)할 수 있다. 여기서, 상기 말전염성자궁염 개체는 말과동물로, 바람직하게는 얼룩말, 말(조랑말 등), 노새 및 당나귀로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency)
MEDIAN Diagnostics Inc.
<120> Composition for Detecting Taylorella equigenitalis, Composition
for Diagnosing Contagious Equine Metritis Caused by Taylorella
equigenitalis Infection, Method of Detecting Taylorella
equigenitalis, and Method of Diagnosing Contagious Equine
Metritis Caused by Taylorella equigenitalis Infection
<130> YPD201706-0098
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer for Detecting Taylorella equigenitalis: J1327F
<400> 1
cagagatgac cttttactat tg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer for Detecting Taylorella equigenitalis: J1361R
<400> 2
agtccatggt attaacacaa ac 22
Claims (11)
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 유효성분으로 포함하는, 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)을 유발하는 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis)의 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 검출은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time Polymerase Chain Reaction)에 의한 것임을 특징으로 하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물.
- 제1항의 조성물을 포함하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis)의 검출용 키트.
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 유효성분으로 포함하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis) 감염에 의한 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)의 진단용 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 진단은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time Polymerase Chain Reaction)에 의한 것임을 특징으로 하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물.
- 제4항의 조성물을 포함하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis) 감염에 의한 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)의 진단용 키트.
- 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis)의 검출방법에 있어서, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 이용하여 검체 시료로부터 분리된 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산을 주형으로 증폭시켜 타일로렐라 에퀴제니탈리스를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법.
- 제7항에 있어서, 상기 증폭은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로, 상기 중합효소 연쇄반응은 95℃에서 2분간 가열하는 단계, 및 40사이클로 94℃에서 20초간 가열하고 55℃에서 30초간 가열하며 72℃에서 30초간 가열하는 것을 반복하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법.
- 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis) 감염에 의한 말전염성자궁염(Contagious Equine Metritis, CEM)의 진단방법에 있어서, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 이용하여 말전염성자궁염 개체의 검체 시료로부터 분리된 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 핵산을 주형으로 증폭시켜 말전염성자궁염 개체(단, 인간은 제외)의 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법.
- 제9항에 있어서, 상기 말전염성자궁염 개체는 말과동물인 것을 특징으로 하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 증폭은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로, 상기 중합효소 연쇄반응은 95℃에서 2분간 가열하는 단계, 및 40사이클로 94℃에서 20초간 가열하고 55℃에서 30초간 가열하며 72℃에서 30초간 가열하는 것을 반복하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020170098623A KR101911017B1 (ko) | 2017-08-03 | 2017-08-03 | 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법, 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170098623A KR101911017B1 (ko) | 2017-08-03 | 2017-08-03 | 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법, 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101911017B1 true KR101911017B1 (ko) | 2018-10-25 |
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ID=64131833
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|---|---|---|---|
| KR1020170098623A Active KR101911017B1 (ko) | 2017-08-03 | 2017-08-03 | 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법, 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101911017B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118996010A (zh) * | 2024-09-06 | 2024-11-22 | 中国兽医药品监察所 | 一套检测马健康情况的引物集合和微流控芯片 |
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2017
- 2017-08-03 KR KR1020170098623A patent/KR101911017B1/ko active Active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GenBank Accession No. X68645.1 (1993.09.24) |
| J. Premanandh et al. Veterinary Microbiology, Vol. 95, pp.229-237, 2003. |
| P.R. Wakeley et al. Veterinary Microbiology, Vol.118, pp. 247-254, 2006 |
| 조길재 등. 2016년 한국마사회 연구과제 보고서. 승용말 생산을 위한 번식 효율 향상 기술 개발에 관한 연구 (2017.3.21. 발간) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118996010A (zh) * | 2024-09-06 | 2024-11-22 | 中国兽医药品监察所 | 一套检测马健康情况的引物集合和微流控芯片 |
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