KR102275912B1 - Hsp 발현 억제 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 그것의 단편인 HSP 결합 펩티드를 포함하는 HSP 발현 억제용 조성물 및 이를 이용한 HSP 발현 억제 방법이 개시된다. 특히 HSP는 암세포에서 특이적으로 증가하는 특성을 가지므로, HSP에 특이적으로 결합하는 펩티드를 이용하여 HSP의 발현을 억제하는 방법이 제공될 수 있다.

Description

HSP 발현 억제 펩티드 및 이를 포함하는 조성물{PEPTIDE FOR INHIBITING HSP EXPRESSION AND COMPOSITION CONTAINING SAME}

본 발명은 HSP 발현 억제 활성을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드로서 HSP 발현 억제 활성을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 그리고 이를 이용한 HSP 발현 억제 방법에 관한 것이다.

암 세포는 몇 가지 열충격 단백질(HSP: Heat Shock Protein)을 고수준으로 발현하여 종양의 공격성을 증강시키고 또한 세포가 치료요법에 의한 사멸과 같은 치사 조건에서 생존하도록 한다. 치료에 대해 내성이 부여되는 것 외에, HSP 발현이 상승되면 프로그래밍된 세포 사멸이 억제되고 자가 성장이 촉진되어 암세포의 성장이 이루어진다.

1962년 처음 보고된 열 충격 단백질은 열, 저산소증, 방사능 등과 같은 스트레스 환경에서 분자 샤페론으로 작용하며 세포를 보호하는 역할을 하는 세포 구성 단백질로 알려져 왔다(Ritossa F. Experimentia 1962;18:571-3.; Lindquist S et al., Craig Annu Rev Genet 988;22:631-77). 최근들어 세포 성장과 세포자멸사(apoptosis) 등에 관여하고, 여러 종양 조직에서 과발현되어 있다는 사실이 밝혀지면서, 열충격단백질이 종양발생과정에 일련의 역할을 할 것으로 추측되었다. HSP는 저산소증과 같은 스트레스 상황에서 세포의 생존에 있어 중요하다. 열 충격단백질은 분자량의 크기에 따라 다양한 군(small HSP family, HSP 60 family, HSP 70 family, HSP 90 family)으로 구분된다.

종양과 관련하여 HSP 70은 자궁 내막암, 악성 골육종, 신장암 등에서 발현이 증가되어 있는데, 이는 HSP 70이 세포자멸사의 단계를 억제하는 데서 비롯되는 것으로 생각되고 있다. HSP 90은 정상 세포 단백질의 1-2%를 차지하며 스트레스 환경에서 특히 발현이 증가된다. HSP 90은 ATP와 반응하여 변성된 단백질을 접는 역할을 하며 폐암, 백혈병, 호지킨병 등에서 발현이 증가되어 있으며, 또한 HSP 90 역시 세포자멸사와 관련이 있는 것으로 보고되나 아직 정확한 역할은 규명되어 있지 않다.

열충격 단백질이 종양발생에 관여한다는 사실이 밝혀지면서 이에 대한 발현 억제제를 항암치료에 이용하고자 하는 노력이 시행되었으며, HSP 90 억제제인 17AAG(17-allylamino-17-demethyxy analogue of geldanamycin)는 항암제로의 가능성을 인정받고 임상시험 단계에 있다. 퀘세틴(Quercetin)은 플라보노이드(flavonoid)에 속하는 폴리페놀(polyphenol)기를 가지는 식물성 화학물질(phytochemical)이며 여러 암세포주를 대상으로 한 실험에서 세포증식을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 그 기전은 확실히 밝혀져 있지 않지만 퀘세틴은 HSP70의 생성을 억제 하는 것으로 알려져 있어, 고온요법(hyperthermia therapy)과 병합하여 치료하는 약제로도 연구되고 있다.

HSP70은 다수의 세포 내 기작과 관련된 고도로 보존된 단백질 샤페론이다. HSP70은 세포 내 스트레스에 의해 유도되며, 스트레스-유도된 세포자멸을 억제한다. 또한, HSP70은 면역조절능을 가지며, 소염성 사이토카인의 생성을 자극하는 것으로 알려져 있다(Van Eden, W. et al., Nat. Rev. Immunol. 5:318-330(2005)). 더불어, 이는 종양 괴사 인자(TNF)에 의해 야기되는 염증성 충격(shock)을 방지하고, 항원 제시 세포(APC, Antigen presenting cell)의 활성화를 유도한다.

HSP70(구성적으로 발현된 Hsc70 및 열 유도성 HSP70-1 및 HSP70-6)은 예비 단계에 관여하는 반면, HSP90은 마지막 단계에서 관여한다. 이들의 기능은 HSP70-조절인자, HSP40, HSP110, BAG 및 HIP와 같은 다수의 공-샤페론; 중간 분자 샤페론 복합체의 형성에 관여하는 HSP-조직화 단백질(HOP)을 필요로 하며, 여기서, 클라이언트는 HSP70으로부터 HSP90으로 통과하고, p23, cdc37 및 이뮤노필린과 같은 다른 것들은 최종 또는 성숙한 HSP90 복합체에서 작용한다. HSP90은 새로운 항암 표적으로서 인식된다. HSP90은 클라이언트 단백질 (client protein)의 형태 안정성, 형상 및 기능을 보장하기 위한 분자 샤페론으로서 기능하는, 편재성이 매우 풍부한 (전체 세포 단백질의 1-2%) 필수 단백질이다. HSP90의 그의 고유 ATPase 활성의 억제는 HSP90-클라이언트 단백질 상호작용을 중단시켜, 유비퀴틴 프로테아좀 경로를 통한 그의 분해를 유발한다. HSP90 클라이언트 단백질의 아류, 예컨대 Raf, AKT, CDK4, 및 ErbB2를 비롯한 EGFR 족은 세포 성장, 분화 및 아폽토시스에 결정적으로 관여하는 발암성 (oncogenic) 신호전달 분자이며, 근본적으로 이러한 과정은 암 세포에서 중요하다.

따라서, HSP70 및 HSP90의 발현을 억제할 수 있는 조성물을 개발한다면 그 파급효과가 클 것으로 예상된다.

[선행기술문헌]

[특허문헌]

KR2012-0117954A

KR2006-0023576A

[비특허문헌]

Van Eden, W. et al., Nat. Rev. Immunol. 5:318-330(2005)

Ritossa F. Experimentia 1962;18:571-3.

Lindquist S et al., Craig Annu Rev Genet 988;22:631-77

이에 본 발명자들은 HSP에 특이적으로 결합하여 HSP의 발현을 억제할 수 있는 약물을 개발하고자 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명자들은 텔로머라제로부터 유래된 펩티드로서 HSP에 특이적으로 결합하며, HSP의 발현을 특이적으로 억제할 수 있는 펩티드를 개발하였다.

본 발명의 목적은 HSP에 결합하여 HSP의 발현을 억제하는 펩티드 및 이를 이용한 HSP 발현 억제 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 일측면에 따르면 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 포함하는 HSP 발현 억제용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일측면에 따른 HSP 결합 펩티드에 있어서, 상기 HSP는 HSP 70 또는 HSP 90일 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 HSP 결합 펩티드에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편일 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 HSP 결합 펩티드에 있어서, 상기 펩티드는 30개 이하의 아미노산으로 구성될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 혈관신생 억제용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 종양의 성장 및 전이, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 황반 변성(macular degeneration), 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 만성 염증 (chronic inflammation), 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 또는 신경퇴행성 질환의 비조절성 혈관신생-관련 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 이용되는 것일 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 혈관신생 억제용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 종양의 성장 및 전이의 예방 또는 치료에 이용되는 것일 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 혈관신생 억제용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물일 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 혈관신생 억제용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 언급된 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 HSP 발현 관련 질환의 예방 및 치료방법일 수 있다.

본 발명에 따르면, HSP에 특이적으로 결합하는 펩티드를 통해 HSP 발현을 효과적으로 억제할 수 있다. 특히 HSP가 암세포에서 증가하는 특성을 가지므로, HSP에 특이적으로 결합하는 펩티드를 이용하면 효과적으로 종양의 성장을 억제 할 수 있는 방법이 제공될 수 있다.

도 1은 PEP 1과 상호작용하는 단백질을 확인하기 위한 것으로 다음과 같다;
(A) GFP(서열번호 3, 4)를 포함하는 정제화된 His-tag, 11머(mer)-GFP(GFP 융합된 짧은 PEP1, GFP fused to short PEP 1), 그리고 PEP 1-GFP 단백질은 HEK293T 세포 용해물과 함께 배양되었고, 각 단백질 복합체는 Ni-NTA 크로마트그래피를 이용하여 정제한 후 SDS-PAGE와 은 염색(silver staining)을 하였다. PEP 1-GFP와 특별히 연관된 단백질은 젤(gel)에서 절제한 후 Maldi-TOF 질량 분석기에 의해 확인한 결과이다.*은 GFP, 11mer-GFP, PEP 1-GFP 밴드(bands)를 의미한다.
(B) PEP 1과 관련된 확인된 단백질은 항체를 이용한 면역 블로팅(immunoblotting, IB)으로 확인한 결과이다.
(C) 다른 세포에서의 PEP 1과 HSP70의 상호 작용을 확인하기 위하여, MCF7과 HepG2세포의 용해물을 GST나 PEP 1-GST 단백질과 함께 배양하였다. 글루타티온 수지를 사용하여 풀 다운한 결과, 면역 블로팅과 항-HSP70항체를 사용하여 HSP70과 PEP 1의 결과를 확인한 결과이다.
(D) MCF7의 막 단편(membrane fraction)이 분리된 후 GFP 또는 PEP 1-GFP와 함께 배양되었다. HSP70의 조합은 Ni-NTA 크로마토그래피 후 면역 블로팅을 통해 확인한 결과이다.
도 2 내지 도 3은 암세포에서 PEP 1 처리에 따른 HSP70과 HSP90의 하향 조절을 나타낸 결과이다. Jurkat(도 2), MCF7(도 3) 세포들을 무혈청 배지에서, 증가하는 농도의 PEP 1 또는 스크램블된(scrambled) 펩티드와 2시간 처리하였다. HSP70 및 HSP90의 단백질의 양은 HSP70, HSP90 및 GAPDH에 대한 항체들을 사용해 면역 블로팅으로 분석하였다.
도 4 내지 도 5는 PEP 1에 의한 저산소증 유도된 HSPs 생산 억제를 나타낸 실험 결과이다. MCF7과 HeLa 세포들은 PEP 1(20μM) 또는 용매제(vehicle)와 처리하고 지정된 시간 동안 저 산소 상태에서 배양하였다. 세포 용해물은 HSP70, HSP90의 양을 분석하기 위해 면역 블로팅을 실시하였다.
도 6은 Jurkat 및 MCF7세포에 용매제(vehicle), PEP 1, 17-AAG, KNK437을 처리한 결과이다. Jurkat 및 MCF7세포들은 무혈청 배지에서 용매제(vehicle), PEP 1 (5 μM for Jurkat and 20 μM for MCF7), 17-AAG (1 μM), KNK437 (1 μM) 와 2시간 처리하였다. 세포 용해물은 도 2에 사용되었던 방법과 유사하게 면역 블로팅으로 분석하였다.
도 7는 MCF7세포들을 MG132 (5 μM) 포함한 상태와, 포함하지 않은 상태 모두에서 PEP 1 또는 PBS로 처리한 결과를 나타낸 것이다. 세포 내의 HSPs 와 세포 표면의 HSPs들은 표면 세포내 염색(surface intracellular staining)과 세포 표면(surface staining) 염색으로 염색하였고, 상기 실험물질 및 방법에 기재된 바와 같이, 유세포 분석을 이용해 분석하였다. 빨강(Red)은 DMSO, 랑(Blue):PEP 1을 첨가한 DMSO(PEP 1 plus DMSO) ; 오렌지(Orange):PEP 1을 첨가한 MG132 (PEP 1 plus MG132); 녹색(Green): MG132을 각 의미한다.
도 8 내지 도 9는 저 산소 상태에서 PEP 1에 의한 암세포 증식 억제를 나타낸 그래프이다. MCF7과 HeLa 세포들은 보통 산소 상태 (왼쪽 패널) 또는 저 산소 상태 (오른쪽 패널)에서 PEP 1을 포함한, 포함하지 않은 상태에서 배양 하였다. 배양일 2일, 4일, 6일 째, 세포들의 수를 측정하였다. 데이타는 평균±표준편차를 나타낸다(Data represent means ± SD). *: p ＜ 0.05 인 경우 통계적 유의성이 있다고 보았다. 1원 t검정(1-way t-test)을 수행하였다.
도 10 내지 도 11은 PEP 1 처리에 의한 종양의 HSP70과 HSP90 단백질 레벨의 감소를 나타낸 결과이다. HSP70과 HSP90에 대한 항체를 이용한 면역조직화학 염색(immunohistochemical staining)을 통해 종양 섹션의 HSP70과 HSP90 단백질 레벨을 시각화 하였고(도 10), Leica Qwin 소프트웨어를 이용해 정량화 하였다(도 11). 각각의 치료그룹의 6개의 슬라이드로부터 10개의 필드를 정량화 하기 위해 임의적으로 선택 하였다. 데이타는 평균±표준편차를 나타냄 (Data represent means ± SD). *** p ＜ 0.001 인 경우 통계적 유의성이 있다고 보았다, 2원 t검정(2-way t-test)을 수행하였다. 종양에서 추출한 단백질 추출물은 HSP70, HSP90, GRP78 그리고 GAPDH에 대한 항체를 이용해 면역 블로팅을 실시하였다(도 12).
도 13 내지 도 14는 PEP 1이 혈액 내 분비되는 HSP70 레벨에 미치는 영향을 나타낸 결과이다. 도 13에서는 HSP70 레벨 (왼쪽 패널)과 HSP90 (오른쪽 패널)은 PEP 1 (50 μg/kg) 또는 PBS (그룹 당 10마리 쥐 (10 mice per group); n=20)를 처리한 마우스 모델로부터 획득한 혈청을 이용해 ELISA를 실시하여 확인하였다. 도 14에서는 혈액의 HSP70 레벨과 종양 무게 (왼쪽 패널) 또는 종양 크기 (오른쪽 패널)의 연관성을 분석하였다. 2원 t검정을 수행하였다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 실시예를 기초로 하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이러한 실시예는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것은 아니며, 본 발명은 특허청구범위에 기재된 바를 기초로 하여 다양한 실시예 및 응용이 가능하며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

텔로미어(telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전 물질로서, 해당 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지한다고 알려져 있다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어의 길이는 조금씩 짧아지는데, 일정한 횟수 이상의 세포 분열이 있게 되면 텔로미어는 매우 짧아지고, 그 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 반면 텔로미어를 길게 하면 세포의 수명이 연장된다고 알려져 있으며, 그 예로 암세포에서는 텔로머라제(telomerase)라는 효소가 분비되어 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문에, 암세포가 죽지 않고 계속 증식할 수 있다고 알려져 있다.

HSP90 패밀리 단백질에 결합하는 화합물로는, 겔다나마이신 (Geldanamycin), 하비마이신 등의 벤조퀴논안사마이신계 항생 물질 및 라디시콜 (Radicicol) 등이 알려져 있다. 이들 화합물은 모두 HSP90 패밀리 단백질에 결합하여 HSP90 패밀리 단백질의 기능을 저해함으로써 항종양 활성 등의 약리 활성을 나타낸다고 보고되어 있다. 따라서, HSP90 패밀리 단백질에 결합하는 화합물은 HSP90 패밀리 단백질 또는 HSP90 패밀리 단백질이 결합하는 단백질 (HSP90 클라이언트 단백질) 이 관여하는 질환의 치료약으로 유용하다고 알려져 있다.

본 발명의 일측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 펩티드를 대량 생산할 수 있다. 예컨대 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 넣어 배양함으로써, 펩티드를 대량 생산할 수 있다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1의 서열을 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제, 구체적으로 인간(Homo sapiens) 텔로머라제에서 유래한 펩티드를 포함한다.

본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일측면에서 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열번호 1의 단편들인 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서 뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 다른 예는 다음 표와 같다.

펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:

(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다. 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 펩티드에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다

펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.

펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된 이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.

펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

본 발명의 일측면에서, 폴리뉴클레오티드는 핵산 분자로서 자연발생적 또는 인공적 DNA 또는 RNA 분자일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 하나 이상일 수 있는데, 동일한 유형의 (예컨대, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는) 핵산 분자일 수도 있고, 다른 유형으로 핵산 분자들일 수 도 있다. DNA, cDNA, decoy DNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, 안티센스 올리고머(antosense oligomer), 플라스미드(plasmid) 및 그 외 변형된 핵산 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 측면은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 그 단편인 펩티드를 HSP 발현 억제가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 HSP 발현 억제방법이다.

본 발명의 또 다른 일 측면은, HSP 발현 억제용 조성물을 제조함에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 그 단편인 펩티드의 용도이다.

본 발명에서의 서열번호 1(이하 'PEP 1')은 텔로머라제 유래 펩티드로서 하기와 같이 16개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.

서열번호 1: EARPALLTSRLRFIPK

서열 번호 1에 기재된 펩티드는 아래 표 2과 같다. 아래 표 2의 "이름"은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1에 기재된 펩티드는 인간 텔로머라제의 전체 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 다른 일측면에서, 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 "합성 펩티드"를 포함한다. 서열번호 2는 전체 텔로머레이즈의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

또한 본 발명의 일측면에 따른 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 세포 내 독성이 낮아 생체 내 안정성이 높다는 장점을 가진다.

본 발명의 일측면은 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드의, 하나 이상의 유효성분을 전달하기 위한 HSP 발현 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면은 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드, 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 HSP 결합 펩티드와 유효성분의 컨쥬게이트를 포함하여, 유효성분을 세포 내로 전달하는 효과가 우수한 약학 또는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물은 일측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 0.1 ㎍/mg 내지 1 mg/mg, 구체적으로 1 ㎍/mg 내지 0.5 mg/mg, 더 구체적으로 10 ㎍/mg 내지 0.1 mg/mg의 함량으로 포함할 수 있다. 상기 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.

경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1 ㎍/kg/일 내지 1 g/kg/일, 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 더 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 50 ㎍/kg/일 내지 100 ㎍/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 액제, 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 더 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 50 ㎍/kg/일 내지 100 ㎍/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).

수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 것 이며, 다른 언급이 없는 한, 각 수치는 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것과 동일하게 본 명세서에 적용된다. 모든 범위의 한계 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.

본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "∼과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명의 기재를 용이하게 하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석 되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다.

이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

발명의 실시를 위한 형태

실시예 1: 펩티드의 합성

서열번호 1의 펩티드(이하 "PEP 1"이라 함)를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Ala-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin

펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.

커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 레진에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H₂O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.

아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.

본 실시예에 사용된 펩티드에 대해 고성능 액체 크로마토 그래피 결과, 모든 펩티드의 순도는 95% 이상이었다.

PEP 1 제조에 관한 구체적인 과정을 설명하면 다음과 같다.

1) 커플링

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl 레진(Resin) 에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

2) Fmoc 탈보호

20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격 (NH₂-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin)을 만들었다.

4) 절단(Cleavage): 합성이 완료된 펩티드 레진에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩티드를 레진에서 분리하였다.

5) 얻어진 혼합물(mixture)에 냉각 다이에틸 에테르(Cooling diethyl ether) 를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침전시킨다.

6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 파우더(powder)로 제조하였다.

실시예 1과 같은 방법으로 제조된 PEP 1을 이용하여 HSP와의 결합 및 HSP 억제 작용에 대한 실험을 실시하였다.

실시예 2: 세포주 배양 및 분석방법

세포주 배양

인간 유방암 세포주 MCF7 (Human breast adenocarcinoma cell line), 인간 T 림프구 세포주 (Jurkat) 및 MC38 (murine colon adenocarcinoma) 세포주들은 10% 소의 태아혈청 (Fetal bovine Serum)과 100 U/ml 페니실린 (penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 RPMI1460 배지에 유지하였다. HeLa (human cervical adenocarcinoma) 세포주는 10% 우태아혈청 (Fetal bovine Serum)과 100 U/ml 페니실린(penicillin)및 스트렙토마이신 (streptomycin)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 유지하였다.

저산소 상태에서의 단백질 발현 및 세포성장의 확인

저 산소 상태에서 PEP 1이 HSP의 레벨에 미치는 영향을 시험하기 위하여, MCF7와 HeLa 세포들을 20μM의 PEP 1과 처리 후, 저 산소 및 정상 산소 상태에서 배양하였다. 90분 안에 촉매반응을 일으켜 산소를 감지할 수 없는 레벨로 감소시키는 BBL GasPak (Becton Dickinson)을 사용해 무산소증을 유도하였다. 배양 시간은 2∼24시간 범위였다. 상기 기재된 바와 같이 세포들은 수거 후, α-HSP70, α-HSP90, α-HIF-1α, or α-GAPDH 항체들을 사용하여 면역 블로팅을 실시하였다. α-GAPDH 는 단백질의 정량(Protein quantification)을 위하여, HSP70/90 의 양을 GAPDH 의 양으로 표준화(normalization) 하기 위하여 사용한 것이다.

PEP 1이 저 산소 상태에서 암세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, MCF7와 HeLa세포를 96웰 플레이트에 웰당 1x10⁴ 셀이 되도록 접종 후 10% FBS가 첨가된 완전 배지(complete media)에 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 2시간 동안 혈청 기아상태(Starvation)처리 후, PEP 1 (20μM)을 포함한, 포함하지 않은 완전 배지 모두에서 배양하였다. 상기 기재된 바와 같이 세포들을 1일에서 6일간 저 산소 상태 또는 정상 산소 상태에서 배양하였다. 생존 가능한 세포들의 수는 트리판 블루 염색(trypan blue Stain) 방법을 사용해 매일 측정하였다. 모든 계산 실험은 중복으로 수행하였다.

면역블로팅(immunoblotting)을 통한 HSP70 및 HSP90 단백질 레벨 분석방법

Jurkat 및 MCF7 세포들 (5 x 10⁵ )을 12시간 동안 접종하고 배양하였다. OPTI-MEM 배지를 넣어 2 시간 동안 기아상태로 처리 한 후, 세포들을 다른 농도의 PEP 1, 스크램블(scrambled) 펩티드 및 17-AAG (1 μM) 또는 KNK437 (1 μM)로 처리하였다. 2 시간 동안 배양 후, 세포들을 수거한 후 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer, Thermo Scientific, IL, USA)를 이용하여 용해하였다. 브레트포드 단백질 어세이 (Bradford Protein Assay, Bio-Rad, USA)를 이용하여, 단백질 농도를 정량한 후, 샘플들을 α-HSP70 (sc-32239 and sc-66048, Santa Cruz, CA, USA), α-HSP90 (ab1429, abcam, USA), α-GRP78 (sc-13968, Santa Cruz, CA, USA), α-HIF-1a (sc-10790, Santa Cruz, CA, USA) 또는 α-GAPDH (sc-25778, Santa Cruz, CA, USA) 항체들을 사용하여 SDS-PAGE와 면역 블로팅을 실시하였다. 면역 반응성 밴드는 강화된 화학발광 키트(chemiluminescence kit, iNtRoN Biotechnology, INC, Korea)를 사용해 시각화 하였으며, ImageQuantTM LAS-4000 (GE Healthcare Life Science, NJ, US)를 사용하여 정량하였다.

유세포 분석을 통한 HSP70 및 HSP90 단백질 레벨 분석 방법

MCF7 세포들은 PEP 1 또는 대조군 처리하였다. 프로테아좀 억제 테스트 (Proteasome inhibition test)를 실시하기 위하여, 배양하는 동안, 세포들을 5μM의 프로테아좀 억제제 MG132 (Calboicam)로 처리하였다. 트립신(Trypsin)을 사용해 세포를 분리 하였고, 차가운 PBS(phosphate buffered saline)와 FACS 버퍼 (PBS containing 1% BSA and 0.1% NaN₃)로 세척하였다. 세포 내 염색을 위해 세포들을 제조 업체의 지침에 따라 투과 버퍼(permeabilization buffer, eBioscience, CA, USA) 로 처리하였다. 세포들은 4℃ 에서 30분간 α-HSP70-FITC (ab61907, Abcam) 또는 α-HSP90-PE (ab65171, Abcam)와 반응시켰다. 유세포 FACScan (FACScan flow cytometer, Becton Dickinson Co., CA, USA)를 이용해 유세포 분석을 실시하였다. 데이터는 FlowjoTM 소프트웨어(version 10.0.5, Tree Star, Inc., OR, USA)를 사용해 분석하였다.

PEP 1이 생체 내 종양 성장에 미치는 영향 평가 방법

7 주령 BALB/c 무흉선의(athymic) (Nu/Nu) 마우스를 (그룹당 10마리 쥐; n=20, 암컷, Orient Bio Co. Gyunggido, Korea) 쥐 결장암(murine colon carcinoma) MC38 (5x10⁵ cells/ml in 200 μl PBS per site) 세포로 피하 접종한 후, 임의로 두 그룹으로 나누었다. 마우스들은 이틀에 한번 복강 내로 PEP 1 (100 μl 0.9% NaCl 용액(Solution) 내에 50 μg/kg) 또는 PBS를 주사하였다. 종양의 크기가 10 mm에 다달았을 때, PEP 1 또는 PBS를 종양 내 주사로 투여하였다. 종양의 크기는 이틀에 한번 측정하였으며, 종양의 부피는 다음과 같은 식을 이용해 계산하였다, 부피(mm³) = ((넓이² x 길이) / 2). 실험 14일 째, 마우스를 희생하고, 종양의 무게를 측정하였다. 모든 동물 실험은 한국의 서울대학교 의과대학 실험동물실(The Institute for Experimental Animals, College of Medicine, Seoul National University at Seoul, Korea)에 의해 승인되었다.

종양 섹션의 증식 세포 및 세포 사멸에 대한 평가

종양의 아폽토시스(apoptosis)를 평가하고자, 포르말린에 고정되고 파라핀에 포매된 종양조직 섹션(Formalin-fixed and Paraffin-embedded tumor sections)을 사용한 Tunnel 어세이를 통해 DNA 단편화(DNA fragmentation)를 분석하였다. 제조업체의 지침에 따라, 종양 섹션은 ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore)를 사용해 염색하였다. 종양 내 증식세포는 PCNA (Proliferating cell nuclear antigen)을 사용해 감지하였다. 항원 검색을 위해, 조직 섹션은 40분간 10μM 사이트레이트 버퍼(citrate buffer) pH6.0에서 탈파라핀하고, 수화하고, 가열하였다. 조직들은 항마우스 PCNA 모노클로날 항체(anti-mouse PCNA monoclonal antibody, ab29, Abcam)를 사용해 염색하였다. 2차 항체 처리 및 현상 후, H＆E 염색 방법을 이용해 조직 섹션을 대조염색 하였다. 그런 다음, 필드는 각각의 처리 그룹의 6개의 슬라이드로부터 임의로 선택하였고, 필드는 정량을 위해 Leica Qwin 소프트웨어로 분석하였다.

종양에서의 HSP 발현 면역 블로팅 분석

PCNA 염색법과 유사한 방법으로 면역조직화학적 염색법(immunohistochemical staining)을 사용해 종양의 HSP70 및 HSP90 단백질의 발현을 평가하였다. 열 충격 단백질 (HSP70; sc-7298, HSP90; ab1429) 에 대한 항체들을 1차 항체들로 사용하였다. 종양에 의한 HSP70과 HSP90 단백질의 발현은 종양 용해물(tumour lysate)를 이용하는 면역블롯팅을 통해 평가하였다. 액체 산소를 이용해 동결 후, 종양는 막자사발을 사용해 갈았고, 추출 버퍼(extraction buffer, 20 mM HEPES, pH7.5, 100 mM NaCl, 0.05% Triton X-100, 1mM DTT, 0.5mM sodium orthovanadate, 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 10 μg/ml aprotinin, 5 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepstatin)에서 균질화 하였다. 반복 원심 분리 후, 상기 기재된 바와 같이 상층액은 SDS-PAGE 및 면역 블로팅(immunoblotting)을 실시하였다.

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 분석

암세포의 VEGF 분비는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 확인하였다. MCF7와 HeLa 세포들은 24시간 PEP 1 또는 용매제(vehicle)를 첨가한 후 저 산소 상태 또는 정상 산소 상태에서 배양하였다. 세포 상층액의 VEGF의 양은 제조업체의 지침에 따라 human VEGF 면역분석 키트 (R＆D Systems, USA)을 사용해 확인하였다. 혈액 내 HSP70 및 HSP90의 농도를 분석하기 위해, 종양을 가지고 있는 마우스 모델로부터 혈액을 채취하였다. 혈청 준비 후, 혈액 내 HSP70과 HSP90의 농도는 HSP70(R＆D systems, USA)과 HSP90(Cusabio Biotech co., Ltd, DE, USA.)의 면역분석 키트를 사용해 확인하였다.

공초점 현미경 분석

슬라이스한 종양 섹션은 상온에서 4% 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde)로 15분간 고정시켰다. PBS로 두 번 세척한 후, 10분간 0.25% Triton X-100을 포함한 PBS에 놓아둔 후, PBS로 다시 세 번 세척하였다. 1% BSA-PBST 로 조직을 30분간 차단 한 후, 마우스 항-Tie2 (557039, BD Pharmigen)와 래트 항-CD11b 항체 (rat anti- CD11b antibodies, ab8878, abcam)의 혼합물과 함께 4 ℃ 습한 쳄버에서 인큐베이션 하였다. 세척 후, 조직들은 AlexaFlour 488 goat anti-mouse IgG 와 AelxaFlour633 goat anti-rat IgG의 혼합물과 함께 인큐베이션 하였다. 세포 핵을 시각화 하기 위해 DAPI (Sigma Aldrich)와 1분간 처리 후, 공초점 현미경으로 분석하였다.

통계 분석방법

컨트롤 및 실험 그룹 간의 통계적 비교는 student t-test를 사용하여 분석하였고, 통계적 유의 수준은 P-value의 값이 P ＜0.05 (*) 또는 0.01 (**)인 경우 유의 하다고 간주하였다.

실시예 3: 풀다운 어세이(Pull down Assay)를 통한 PEP 1의 결합 단백질 스크리닝

PEP 1과 상호 작용하는 단백질을 확인하기 위한 풀다운 실험은 PEP 1-GFP를 포함하는 His-태그를 사용하여 수행하였다. PEP 1-GFP는 HEK293T 세포(한국세포주 은행)의 총 세포 파쇄물과 배양을 한 후 Ni-NTA 친화 크로마토그래피로 처리하였다. GFP 단백질과 GFP와 융합된 PEP 1 펩티드들을 대조군으로 사용하였다. 용출 단백질은 12 % SDS-PAGE에서 분리 후 실버 염색(카탈로그 # PROT-SIL1, 시그마 알드리치, MO, USA)으로 관찰 하였다. 특정 상호 작용을 보여 준 단백질 밴드들은 젤에서 절제하고 그들의 식별을 위해 MALDI-TOF (Proteomix, 서울, 한국)로 분석하였다.

구체적으로는, PEP 1의 N 말단에 GFP 단백질이 결합된 것을 복제하여, E.Coli로부터 정제하였다. PEP 1-GFP, GFP-PEP 1 또는 GFP 단백질을 HEK293T세포의 전체 세포 용해물과 배양시킨다. 각각의 단백질 복합체를 정제하고, SDS-PAGE와 은 염색 실험을 진행한다. 몇 개의 단백질들이 구체적으로 PEP 1-GFP 단백질 복합체에서 발견되었다. 그러나 GFP 단백질이나 GFP-PEP 1 복합체에서는 발견되지 않았다.

다음으로 질량분석을 통한 실험에서 그러한 물질들이 HSP90, HSP70, 에놀레이즈(Enolase) 1 그리고 크레아틴 키나제(Creatinie Kinase) B (도 1A) 라는 것을 밝혀냈다. 이러한 물질들의 PEP 1 상호작용은 항체를 이용한 면역블로팅 실험을 통해서도 확인되었다 (도 1B).

PEP 1-GST는 성공적으로 HSP70를 MCF7 세포와 HepG2세포의 세포 용해물로부터 풀다운 시킬 수 있었다(도 1C). 그 이후, MCF7세포막의 단편들을 정제하고 GFP 또는 GFP-PEP 1과 배양시켰다. 도 1D에서 볼 수 있듯이, HSP70는 GFP-PEP 1과 연관되어 있었고 GFP-PEP 1과 함께 침전되었다. 이 결과는 HSP70의 국소화(localization)와 PEP 1과 HSP70가 상호작용한다는 것을 확인시켜 준다.

통계 분석방법

컨트롤 및 실험 그룹 간의 통계적 비교는 student t-test를 사용하여 분석하였고, 통계적 유의 수준은 P-value의 값이 P ＜0.05 (*) 또는 0.01 (**)인 경우 유의 하다고 간주하였다.

실시예 4: PEP 1 처리에 의한 HSP70 및 HSP90의 발현 억제 확인

PEP 1이 HSP70과 HSP90의 단백질 수치에 영향을 미칠 수 있는지 여부에 대하여 확인하였다. 도 2와 도 3에서 볼 수 있듯이, PEP 1을 2시간 동안 처리하면 Jurkat T세포 림프종 세포와 MCF7 유방암 세포 내의 HSP70과 HSP90 모두 상당한 수준으로 감소시켰다. Jurkat 세포를 이용한 실험에서, 5μM의 PEP 1은 HSP70과 HSP90을 50% 이상 감소시켰다.

MCF7 세포에서는 PEP 1을 5μM 처리한 군에서 HSP90이 대조군과 비교할 때 최대 20%까지 감소하였다. PEP 1을 20μM 처리한 군에서는 HSP70이 대조군에 비하여 약 50% 정도의 감소를 보였다. 그러나, PEP 1과 유사하지만 다른 서열을 가진 스크램블 펩티드들(scrambled peptides)을 처리한 경우에는 HSP70과 HSP90의 수치에 별다른 영향을 미치지 않았다(도 2, 3 참조).

또한, 저산소 조건에서 시간에 따른 PEP 1의 영향을 알아보는 실험을 HSP70 및 HSP90에 대해서 실시하였다. 그 결과는 도 4 및 도 5에 나타내었다. 도 4 및 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군(mock treated control)에서는 HSP70 및 HSP90의 발현이 시간에 따라 영향을 받지 않았지만, PEP 1의 처리를 한 세포에서는 매우 감소하였다는 것을 MCF7과 HeLa 세포 모두에서 확인할 수 있었다. 이는 PEP 1의 처리가 HSPs의 분해를 야기하고, 그 후에 그들의 클라이언트 단백질들을 조절할 수 있음을 더욱 확실하게 확인시켜 준다(도 4, 5 참조). 이러한 결과들은 PEP 1이 저산소 조건과 관련된 다양한 세포의 반응에, HSPs의 단백질 수치를 감소시킴으로써, 영향을 줄 수 있음을 시사한다.

다음으로 PEP 1이 HSPs를 억제하는 활성과, HSP90과 HSP70의 각각의 억제제로 잘 알려진 17-AAG와 KNK437이 HSPs를 억제하는 활성을 비교하였다. 17-AAG는 HSP90의 ATP아제(ATPase)의 활성을 억제함으로써 HSP90의 작용을 직접적으로 억제한다[Uehara Y, Current cancer drug targets, 3:325-30, 2003]; KNK437은 스트레스로부터 유도된 HSPs의 합성을 억제한다. 실험 결과, PEP 1만이 Jurkat 및 MCF7세포에서 HSP90과 HSP70 모두의 수준을 감소시켰다(도 6 참조).

Jurkat 세포에서는 PEP 1만이 HSP70과 HSP90의 단백질 수치를 감소시켰고, 17-AAG와 KNK437은 HSP90의 양은 감소시켰지만, HSP70의 수치를 감소시키지 못하였다. MCF7 세포의 경우에는, PEP 1과 KNK437이 HSP90과 HSP70 둘 모두의 양을 감소시킨 반면, 17-AAG는 HSP90과 HSP70의 수치에 미치는 영향이 적었다.

PEP 1에 의한 HSP90과 HSP70의 감소는 유세포 분석법(Flow Cytometric Analysis)에 의해 더 확실하게 확인할 수 있다. HSP90과 HSP70의 표면염색과 세포 내 염색을 통해, PEP 1의 처리가 세포 표면의 HSPs에 미치는 영향이 세포질의 HSPs에 미치는 영향보다 작았지만, 세포내와 세포질의 HSP90과 HSP70을 감소시킬 수 있음을 보여주었다(도 7 참조). PEP 1과 프로테아좀 억제제인 MG132를 같이 처리한 경우, PEP 1에 의한 작용이 없어졌는데, 이는 PEP 1이 HSP90과 HSP70의 프로테아좀-의존적인 분해를 유발할 수 있음을 제시한다(도 7 참조).

실시예 5: 저산소조건(Hypoxia) 및 정상산소 조건(Normoxia)에서 종양세포 성장 확인

저산소 조건(Hypoxia)과 정상산소 조건(Normoxia)에서 종양 세포 성장에 대한 PEP 1의 효과에 대해 조사하였다. PEP 1은 보통 조건(Normoxia, 정상산소조건)에서 MCF7과 HeLa 세포 성장에 약한 억제 효과를 보였지만, PEP 1의 억제 효과는 저산소 조건에서 매우 증진되었다(도 8, 9 참조).

실시예 6: PEP 1 처리에 의한 종양 내 HSP70과 HSP90의 감소

PEP 1이 생체 내(in vivo) 실험 조건에서 HSP70과 HSP90의 발현을 억제하는지 여부를 확인하기 위해, α-HSP70 또는 α-HSP90 항체를 이용한 면역조직화학 염색을 실시하였다. 암세포주로부터 얻는 데이터와 일관되게, PEP 1이 처리된 군으로부터 채취된 종양 부분은 PBS 처리한 대조군과 비교할 때 약한 염색 패턴을 보였다(도 10 참조). PEP 1 처리된 샘플에서 양성으로 염색된 부분은 대조군 비교할 때 매우 작다(도 11 참조).

PEP 1 처리된 종양 샘플의 감소된 HSP70과 HSP90 단백질의 수치는 종양 용해물(tumor lysates)을 통한 면역 블로팅 실험에 의해서도 확인된다. HSP70과 HSP90의 감소가 세 개의 모든 PEP 1 처리한 종양 샘플에서 관찰되었다(도 12 참조). 특히 HSP90은 PEP 1을 처리한 샘플 내에서 거의 찾아낼 수 없었다. HSP의 다른 패밀리 멤버(family member)로 볼 수 있는 GRP78도 역시 PEP 1 처리한 샘플에서 감소하였다. 종합적으로 이 같은 결과들은 PEP 1이 HSPs를 생체 내 시스템 내에서 감소시키고, 종양의 성장을 억제하는 능력이 있음을 나타낸다.

실시예 7: 혈액 내 분비된 HSP70의 레벨에 PEP 1이 미치는 영향

HSP70과 HSP90 모두 종양 세포로부터 분비될 수 있고, 최근의 연구들은 종양형성과 항 종양 반응에 몇몇 역할을 보여주고 있다. HSP90과 HSP70 분비에 있어 PEP 1의 역할을 더 자세히 설명하기 위해, 종양을 가진 쥐의 혈액으로부터 HSP70과 HSP90의 농도를 측정하였다. 측정 결과, PEP 1 처리 군의 쥐 중 특히 HSP70의 농도 감소에 큰 효과가 있음이 관찰되었다. (도 13 참조).

또한, HSP70의 농도와 종양 무게 및 종양 크기의 분석 결과, HSP70의 종양 무게와 농도는 P = 0.037의 통계적 유의성을, HSP70의 종양 크기와 농도는 P = 0.039의 통계적 유의성을 나타냈다(R² = 1). 이는 낮은 HSP70의 수치가 종양의 양과 종양 무게와 상관관계가 있음을 나타낸다(도 14 참조).

<110> KAEL-GEMVAX CO., LTD. KIM, Sang Jae <120> A Peptide Having Inhibition of HSP expression and the Composition Comprising the Same <130> OF14P081PCT <150> 10-2013-0049983 <151> 2013-05-03 <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 1132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765 Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780 Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro 820 825 830 Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845 Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880 Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895 Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925 Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940 Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln 1010 1015 1020 Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055 Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp 1060 1065 1070 Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085 Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser 1090 1095 1100 Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120 Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130 <210> 3 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Green Fluorescent Protein <400> 3 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 4 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Green Fluorescent Protein <400> 4 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720 720

Claims (11)

1. 유효성분으로서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 포함하는 HSP 발현 억제용 조성물로서,
   상기 HSP는 HSP 70 패밀리 또는 HSP 90 패밀리이고,
   상기 조성물은 자궁 내막암, 악성 골육종, 신장암, 폐암, 백혈병, 호지킨병, T 세포 림프종, 유방암, 자궁경부암, 및 결장암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환의 예방 또는 치료에 이용되는 것인 HSP 발현 억제용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 HSP는 HSP 70 또는 HSP 90인 HSP 발현 억제용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 HSP는 HSP 70인 HSP 발현 억제용 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 종양의 성장 억제에 이용되는 HSP 발현 억제용 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물인 HSP 발현 억제용 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 HSP 발현 억제용 조성물.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제

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