KR102245547B1 - 고밀도의 미정제 세포 배양 수거물의 정화를 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 높은 세포 밀도를 갖는 세포 브로쓰의 정화를 위한 방법을 제공한다.

Description

고밀도의 미정제 세포 배양 수거물의 정화를 위한 방법{METHOD FOR THE CLARIFICATION OF HIGH DENSITY CRUDE CELL CULTURE HARVEST}

본 발명은 세포 배양물 정제 분야에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 높은 세포 밀도를 갖는 미정제 세포 배양 수거물의 정화를 위한 개선된 방법에 관한 것이다.

생물학적 물질, 예를 들어, 생물약제(biopharmaceutical), 백신 및 항체의 생성 분야에서의 최근의 발달은 대규모 제조의 필요성을 유발시켰다. 모든 종류의 질병에 대항하기 위한 충분한 양의 생물학적 물질을 전 세계에 공급하기 위해서는 확실하고 높은 수율의 방법이 필요하다.

상기 이유로, 생물학적 물질의 생성을 위한 세포 기반 방법의 최적화에 많은 노력이 이루어지고 있다. 상기 방법에서, 세포는 부피 당 더 많은 생산 수율을 획득하기 위해 증가하는 밀도로 배양된다. 상기 높은 세포 밀도의 방법은, 예를 들어, WO2004099396호, WO2005095578호 또는 WO2008006494호에 개시되어 있다. 이들의 내용은 참조로서 본원에 포함된다.

WO2008006494호에는 생물반응기 내에서 생물학적 물질을 생성시키는 세포의 배양을 위한 방법이 개시되어 있으며, 여기서 세포 배양물은 분리 시스템 상에서 순환된다. 상기 분리 시스템은 생물학적 물질보다 적은 분자량을 갖는 물질로부터 세포 및 생물학적 물질을 분리시킨다. 세포 및 생물학적 물질은 반응기 내에서 함께 유지되며, 서로 분리되지 않는다.

WO2005095578호에는 생물반응기 내에서 생물학적 물질을 생성시키는 세포를 배양하기 위한 방법이 개시되어 있으며, 여기서 세포 배양물은 필터 모듈 상에서 순환되어, 세포 배양물보다 낮은 세포 밀도를 갖고 생물학적 물질을 포함하는 액체의 유출물을 발생시킨다. 유출물 내의 세포 및 생물학적 물질의 농도는 생물반응기 내에서의 농도보다 실질적으로 낮은데, 이는 23일의 기간에 걸친 관류 속도가 1 내지 13,7 ℓ/일의 범위이기 때문이다(즉, 처리된 부피는 생물반응기의 부피보다 20배 더 많다).

상기 최적화된 세포 배양 방법은 세포 당 높은 생산성의 보존과 함께 높은 세포 밀도(예를 들어, 10×10⁶개 초과의 세포/㎖)로 세포를 배양하는 능력에 의존한다. 이와 함께, 이들은 단일 생물반응기 내에서 고농도의 단백질(예를 들어, 항체)을 갖는 수거된 용액을 획득하는 방법을 제공한다.

세포가 고밀도로 배양되는 방법은 많은 양의 세포 조직파편 및 다른 불순물의 축적을 발생시키는 경향이 있다. 세포와 함께 이들 오염물질은 하류의 정제 방법에서 추가로 처분되어야 하며, 이는 성가신 작업이다. 첫번째 단계로서, 세포 및 세포 조직파편과 같은 고체 물질이 세포 브로쓰 유체로부터 분리되어야 하며, 이는 정화로 언급되는 단계이다. 현재까지 이용되는 정화 방법의 예는 원심분리, 여과(예를 들어, 미세여과, 심층 여과 및 절대 기공 크기 막을 통한 여과) 및 팽창 베드 크로마토그래피(expanded bed chromatography)를 포함한다.

생물학적 물질, 예를 들어, 항체를 정제하기 위한 많은 방법이 이전에 기재되었고, 예를 들어, 반 레이스(van Reis) 등의 문헌[Biotechnology and bioengineering, 1991, Vol. 38, p. 413-422]에 기재되어 있다. 상기 참고문헌에는 발효통으로부터 세포 배양 유체를 회수하는 단계 및 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의해 세포-단백질 분리를 수행하는 단계를 포함하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 상기 방법은 약 0.5 내지 4×10⁶개의 세포/㎖를 포함하는 저밀도 세포 배양으로만 수행되었다. 지금까지는 상기 방법이 높은 세포 밀도를 함유하는 배양에 적용될 수 있음이 개시되어 있지 않거나 예상되지 않았다. 반대로, 상기 방법이 높은 세포 밀도를 함유하는 배양물에 적용될 수 없다는 강한 암시가 종래로부터 추론될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 생산 분야와 관련된 WO 2011/045381호에서, 높은 세포 밀도를 갖는 세포 배양물을 직접 정화시키려는 시도가 이루어졌었다(WO 2011/045381호의 실시예 1 참조). 상기 시도 동안, 필터의 빠른 막힘(clogging)으로 인해 적절한 정화가 이루어질 수 없었다. 명백히, 처리되는 브로쓰의 높은 세포 밀도는 정제 단계를 방해하며, 직접 정화에 접선 유동 여과(TFF)가 적합하지 않게 만든다. 높은 세포 밀도의 브로쓰에 트리톤(세포 용해용)을 처리한 후 도미펜 브로마이드(domiphen bromide)(DB)를 처리한 후에만, 세포 브로쓰가 추가로 처리(정화에 의한 처리)될 수 있다. 미정제 세포 배양물은 수거 후에 직접 TFF에 의해 처리되지 않았다.

이들 결과에 기초하여, 높은 세포 밀도 수거물이 정화 필터를 빠르게 막을 것으로 예상되어 당업자로 하여금 높은 세포 밀도 수거물을 정화 필터 상으로 직접(전처리 없이) 처리하는 것을 단념시켰다.

현재 사용되고, 높은 세포 밀도 배양물의 처리를 위해 당 분야에서 고려되는 방법은, 예를 들어, WO 2010/043700호 또는 쉬르머(Schirmer) 등의 문헌[Bioprocess International, January 2010, p.32-39]에 기재되어 있다. 후자의 참고문헌은 수거물이 먼저 희석된 후, Si-PEI 비드와 혼합되고, 그 후 비드가 가라앉고, 상층액이 제거되고, 심층 여과에 의해 여과되는 방법에 관한 것이다.

이러한 방법의 결점은 수거물이 먼저 수거물 내에서의 세포 농도에 따라 3 내지 5배 희석된다는 점이며, 이는 항체 역가가 또한 3 내지 5배 희석됨을 의미한다. 둘째로, 상기 방법 동안 대량으로 사용되는 크로마토그래피 수지는 매우 비싸며, 재사용될 수 없다. 마지막으로, 상기 기술을 이용한 본 발명자의 경험으로부터, 본 발명자는 회수가 일정하지 않은 것을 관찰하였다.

세포 배양 방법은 규모 확장되며, 세포는 증가하는 밀도로 배양되므로, 바람직하게는 다른 기재된 방법에 비해 낮은 비용, 높은 신뢰도 및 증가된 간이성으로 높은 세포 밀도의 현탁액의 처리를 가능하게 하는 하류 정제 방법이 산업에서 필요하다. 이는 상세하게는 재조합 단백질 및 항체 생성 분야에 적용된다.

본 발명자는 높은 세포 밀도의 세포뿐만 아니라 분비된 단백질을 함유하는 미정제 세포 배양 수거물이 예비 희석 없이 TFF-장치로 처리될 수 있음을 본원에서 발견하였다. 상기 미정제 세포 배양 수거물은 매우 농축되며, 높은 부하량의 세포 조직파편을 함유하나, 이들은 성공적으로 정화되었고, 필터의 막힘을 발생시키는 압력 형성이 관찰되지 않았다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 지금까지 사용된 방법보다 신속하고 값이 싸다. 비싼 크로마토그래피 수지 및 장기간 지속되는 침전 단계가 더 이상 필요하지 않고, 상기 방법은 규모 확장이 용이하다.

따라서, 본 발명은 세포뿐만 아니라 분비된 필요 단백질을 포함하는 미정제 세포 배양 수거물의 정화를 위한 방법에 관한 것으로, 세포는 수거물에서 적어도 15×10⁶개의 세포/㎖의 세포 밀도로 존재하고, 상기 세포의 적어도 20%는 살아 있으며, 상기 방법은,

a. 생물반응기에서 세포를 적어도 15×10⁶개의 세포/㎖의 세포 밀도로 배양하여, 필요한 분비된 단백질을 포함하는 미정제 세포 배양 수거물을 획득하는 단계;

b. 그 후, 접선 유동 여과(TFF)에 의해 단계 a)에서 획득된 실질적으로 전체 미정제 세포 배양 수거물을 처리하는 단계로서, 상기 미정제 세포 배양 수거물의 처리된 부피가 미정제 세포 배양 수거물이 생성된 생물반응기의 부피의 2배 미만이고, 필요 단백질이 미정제 세포 브로쓰로부터 분리되는, 단계; 및

c. 여과액 내의 필요 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 단계 b)의 세포 브로쓰는 단계 a)에서 획득된 세포 브로쓰의 예비 희석 없이 TFF에 적용된다.

일부 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 수거물에서 적어도 50×10⁶개의 세포/㎖의 세포 밀도로 존재한다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 수거물에서 적어도 50×10⁶개의 세포/㎖ 내지 200×10⁶개의 세포/㎖ 범위의 세포 밀도로 존재한다.

다른 바람직한 구현예에서, 필요 단백질은 모노클로날 항체이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 단계 b에서 회수된 필요 단백질은 추가로 정제된다.

다른 바람직한 구현예에서, TFF는 중공 섬유 필터로 수행된다. 상기 중공 섬유 필터는 바람직하게는 750 KDa 내지 0.65 ㎛ 범위의 기공 크기를 포함한다.

다른 바람직한 구현예에서, TFF 장치 내의 중공 섬유 필터는 0.25 ㎜ 내지 1 ㎜ 범위의 내강 직경을 포함한다.

도 1. 실험 구성.

본 발명은 높은 세포 밀도를 포함하는, 세포뿐만 아니라 분비된 단백질을 함유하는 세포 브로쓰의 정화를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 상황에서, "미정제 세포 배양 수거물", "수거물" 또는 "세포 브로쓰"는 온전한 세포가 접종되고, 하기에 규정되는 바와 같은 배양 배지뿐만 아니라 분비된 단백질을 추가로 함유할 수 있는 세포 배양물을 의미한다. 바람직하게는, 세포는 단백질-분비 세포이다.

"정화"는 세포 브로쓰 유체로부터의 고체 물질, 예를 들어, 세포 및 세포 조직파편의 분리를 의미한다. 본 발명에 따르면, 분비된 단백질은 세포 외로 제공되며, 따라서 세포 브로쓰 유체 내에 존재할 것이다. 본 발명에서, "정화"는 세포-함유 미정제 세포 배양 수거물로부터의 분비된 단백질의 분리를 의미한다.

본 발명의 방법에서, 상세하게는 세포 밀도가 극도로 높은 경우, 생물반응기로부터의 시작 물질은 임의로 바람직한 세포 밀도로 희석된다. 그러나, 본 발명에 따른 상기 미정제 세포 배양 수거물의 처리된 부피는 미정제 세포 배양 수거물이 생성된 생물반응기의 부피의 2배를 초과하지 않는다. 본 발명의 목적상, 이렇게 희석된 물질은 용어 미정제 세포 배양 수거물 또는 세포 브로쓰에 여전히 포함된다. 바람직하게는, 미정제 세포 배양 수거물 또는 세포 브로쓰는 미정제 세포 배양 수거물의 예비 희석 없이 TFF에 적용된다.

또한, 본 발명에 따르면, 이는 TFF에 의해 이후 처리되는 단계 a)에서 획득된 실질적으로 전체 미정제 세포 배양 수거물 또는 세포 브로쓰이다. "실질적으로 전체 미정제 세포 배양 수거물"은 전체 미정제 세포 배양 수거물의 적어도 70%를 의미하고, 바람직하게는 이는 전체 미정제 세포 배양 수거물의 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 전체 미정제 세포 배양 수거물의 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 전체 미정제 세포 배양 수거물의 적어도 95%를 의미한다.

"분비된 단백질"은 본원에서 세포에 의한 이의 생성시 배양 배지로 주로 방출(능동 또는 수동 방출)되는 단백질을 의미한다. "필요한"은 본원에서 단백질이 세포를 사용하여 의도적으로 생성되는 것을 의미한다.

본 출원에서 사용되는 "약"은 달리 언급하지 않는 한 ±10%를 의미한다.

본 발명의 방법에 따라 정화되는 미정제 세포 배양 수거물 또는 세포 브로쓰는 적어도 15×10⁶개의 세포/㎖의 포유류 세포의 세포 밀도를 달성하기에 적합한 임의의 세포 배양 방법에 의해 획득될 수 있다. 이에 관한 적합한 방법은, 예를 들어, WO2005095578호, WO2004099396호 및 WO2008006494호에 기재되어 있다. 이들의 내용은 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명에 따르면, 높은 세포 밀도 현탁액은 포유류 세포를 높은 세포 밀도로 배양함으로써 획득된다. 상기 배양은 회분식, 유가식 또는 관류 방식(이에 제한되지는 않음)으로 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 미정제 세포 배양 수거물 내에서의 세포 밀도는 적어도 약 15×10⁶개의 세포/㎖, 예를 들어, 적어도 약 20×10⁶개의 세포/㎖, 예를 들어, 적어도 약 25×10⁶개의 세포/㎖, 예를 들어, 적어도 약 30×10⁶개의 세포/㎖, 예를 들어, 적어도 약 40×10⁶개의 세포/㎖, 예를 들어, 적어도 약 50×10⁶개의 세포/㎖이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 미정제 세포 배양 수거물 내에서의 세포 밀도는, 예를 들어, 약 150×10⁶개 이하의 세포/㎖, 예를 들어, 약 200×10⁶개 이하의 세포/㎖, 예를 들어, 약 250×10⁶개 이하의 세포/㎖, 예를 들어, 약 300×10⁶개 이하의 세포/㎖이다.

본 발명에 따르면, 정화된 세포 브로쓰는 10×10⁶ 내지 300×10⁶개의 세포/㎖, 예를 들어, 약 15×10⁶ 내지 250×10⁶개의 세포/㎖, 예를 들어, 약 30×10⁶ 내지 200×10⁶개의 세포/㎖, 예를 들어, 약 50×10⁶ 내지 150×10⁶개의 세포/㎖, 예를 들어, 약 70×10⁶ 내지 130×10⁶개의 세포/㎖, 예를 들어, 약 90×10⁶ 내지 110×10⁶개의 세포/㎖ 범위의 세포 밀도를 포함한다.

세포 밀도는 세포 계수기, 예를 들어, 트리판 블루(trypan blue) 배제 방법을 이용하는 Vi-CELL™을 이용하여 측정될 수 있다. 다른 적합한 방법은 세포측정법, 농축 세포 용적 결정, 또는 전기저항법(Electrical Sensing Zone Method)을 이용하는 쿨터 계수기를 포함한다.

또한, 본 발명에서, 정화 전의 세포 배양물의 생활력은 20%보다 높게 유지된다. 이는 배양물 내의 세포의 전체량의 적어도 20%가 정화 방법의 시작시에 살아 있음을 의미한다. 특정 구현예에서, 정화 방법의 시작시의 세포 배양물의 생활력은 적어도 40%, 추가 구현예에서, 적어도 60%, 추가 구현예에서, 적어도 80%, 추가 구현예에서, 적어도 90%이다. 생활력은 당업자가 이용 가능한 통상적인 방법, 예를 들어, 트리판 블루 배제, 캐시(Casy) 세포 계수 등을 이용하여 측정될 수 있다.

"배양 배지"는 본원에서 영양소 및 세포의 성장 및 생산을 뒷받침하는 다른 성분을 함유하나, 노폐물 및/또는 숙주 세포 단백질(HCP) 및/또는 용해된 세포로부터의 물질을 또한 함유할 수 있는 세포의 세포외 환경을 의미한다. 배양 배지의 조성은 세포의 배양 과정 동안 때에 따라 다양할 수 있고, 정화 단계에서 본래의 성분 중 하나 이상이 고갈될 수 있다.

단백질이 세포 배양물에 분비된 후, 상기 단백질은 본 발명에 따라 높은 세포 밀도 현탁액 또는 미정제 세포 배양 수거물로부터 정제될 수 있다. 필요 단백질의 상기 정제의 첫번째 단계는 미정제 세포 배양 수거물의 정화이다.

정화

이전 배양 단계로부터 획득된 미정제 세포 배양 수거물은 침전된 불순물 및 세포 조직파편을 제거하기 위해 이후에 정화된다. 본 발명에 따르면, 상기 정화는 TFF 장치를 이용하여 수행된다. 상기 TFF 장치는 바람직하게는 중공 섬유를 포함한다(도 1 참조). 대안적으로, TFF 장치는 카세트 필터를 포함한다. 정화 동안, 분비된 단백질은 접선 유동 여과 장치를 이용하여 미정제 세포 배양 수거물로부터 분리된다. 분비된 단백질은 통상적으로 여과 장치를 통해 접선으로 여과되며, 여과액 중에서 회수된다. 접선 유동 여과는 본 발명의 정화의 확실한 방법이다.

일반적으로, 본 출원에 대해 모든 유형의 중공 섬유 필터가 이용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 중공 섬유는 WaterSep사로부터의 일반적으로 사용되는 Discover, Explorer, Investigator 및 BioProducer 필터이다. 본 발명의 방법에 또한 적절한 다른 필터는 Spectrum Labs사로부터의 MidiKros, MiniKros, KrosFlo 및 CellFlo 필터이다. GE Healthcare사는 또한 PS(폴리설폰)으로 매우 다양한 중공 섬유 필터를 제조한다. 중공 섬유 필터에 대해 바람직한 재료는 폴리에테르설폰(PES), 폴리설폰(PS), 변형된 폴리에테르설폰(m-PES), 혼합된 셀룰로스 에스테르(ME) 또는 세라믹 필터이다.

본 발명에 따르면, 필터는 다양한 기공 크기를 가질 수 있다. 본 발명에 따르면, 중공 섬유는 250 kDa 내지 5 ㎛, 예를 들어, 약 400 kDa 내지 4 ㎛, 예를 들어, 약 500 kDa 내지 2.5 ㎛, 예를 들어, 약 600 kDa 내지 1 ㎛ 범위의 기공 크기를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 기공 크기는 750 kDa 내지 0.65 ㎛의 범위이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 중공 섬유 필터는 0.1 내지 6.0 ㎜, 예를 들어, 0.2 내지 5 ㎜, 예를 들어, 0.2 내지 3 ㎜, 예를 들어, 0.2 내지 2 ㎜ 범위의 내강 직경을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 내강 직경은 0.25 내지 1 ㎜ 범위이다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 내강 직경은 약 0.5 ㎜이다.

본 발명의 정화 방법은 필요 단백질을 함유하는 현탁액으로부터 적어도 70%, 더욱 가능하게는 적어도 80%, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 세포 브로쓰로부터의 전체 세포 및 세포 조직파편을 제거한다.

접선 유동 여과에 의한 미정제 세포 배양 수거물의 정화 후, 필요 단백질이 회수된다. "회수"는 본원에서 세포 및 세포 조직파편을 본질적으로 함유하지 않는 필요한 생성물을 획득하는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 필요 단백질은 TFF 장치의 여과액 중에서 회수된다. 세포 조직파편 및 다른 불순물은 보전물 내에 유지된다.

추가 정제 방법

상기 기재된 단계로부터 획득된 필요 단백질을 포함하는 현탁액을 추가로 정제하기 위해, 당업자는 여러 정제 단계를 인지하며, 상기 여러 정제 단계 사이에서 선택할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 여과(예를 들어, 심층 여과, 미세여과, 초여과, 정용여과), 크로마토그래피(예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정 금속 친화성 크로마토그래피), 수성 2상 추출, 침전 또는 원심분리를 포함한다. 문헌[Shulka et al., 2007 및 Kelly et al., 2009]에서는 당 분야에서 일반적으로 이용되는 추가 정제 단계, 상세하게는 항체 정제에 대한 개관을 제공한다.

필요 단백질로서 면역글로불린의 경우, 친화성 크로마토그래피, 상세하게는 단백질 A 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피가 특히 적합한 분리 방법이다.

본 발명에 따른 특정 구현예에서, 필요 단백질을 함유하는 정화된 현탁액은 초여과에 의해 처리될 수 있다. 초여과는 필요 단백질을 함유하는 현탁액을 농축시키기 위해 사용된다. 현탁액은 5 내지 20배 농축될 수 있다.

본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 완충액 교환은 정용여과를 통해 수행된다. 정용여과, 또는 울트라필터(ultrafilter)를 이용한 완충액 교환은 염, 당 등의 제거 및 교환을 위한 방식이다. 당업자는 완충액 교환이 발생하는 조건 및 어떠한 완충액이 상기 단계에 적절한지 알고 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 다음 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 단계일 수 있다. 상기 단계 동안, 단백질은 양성으로 하전된 물질, 예를 들어, 막, 카트리지 또는 컬럼에 결합된다. 이후의 용리는 불순물 및 남아있는 숙주 세포 DNA로부터 단백질의 분리를 가능케 한다. 또 다른 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 연속 흐름 시스템(flow through system)으로 이용될 수 있다.

특정 구현예에서, 적어도 1회의 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용하는 것이 바람직하다. 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후, 단백질은 충분히 순수할 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서, 상기 방법의 확실성을 증가시키기 위해 크기 배제 크로마토그래피 단계가 추가로 수행된다. 이 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 단계 전 또는 후에 수행될 수 있다.

본 발명의 임의의 상세한 구현예에서, 음이온 교환 생성물은 제형 완충액으로 정용여과될 수 있고, 멸균 여과될 수 있다. 대안적으로, 추가 크로마토그래피 단계(예를 들어, 양이온 교환)가 정용여과 전 또는 후에 추가될 수 있으며, 이는 불순물 및/또는 바이러스/프리온 청소의 확실성을 개선시키는 잠재성을 갖는다.

바이오버든(bioburden)을 제거하는데 도움이 되는 멸균 여과 단계가 상기 방법에 포함될 수 있다. 생성물은 0.22 마이크론 변형 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(예를 들어, Millipore Millipak)을 통해 여과될 수 있다.

세포 배양 시스템 및 하류 처리 시스템의 규모

본 발명의 방법은 규모 변경될 수 있다. 본 발명에서 이용되는 세포 배양물은 소규모 배양(예를 들어, 1 내지 10 리터 작업량)으로부터 중간 규모 배양(예를 들어, 10 내지 1000 ℓ 작업량) 및 대규모의 상업 규모 제조, 예를 들어, 1000 내지 10 000 ℓ 생성물 작업량의 범위에 이른다. 접선 유동 여과 단계는 배양 부피에 따라 규모가 정해지는 한편, 음이온 교환 크로마토그래피와 같은 임의 및 이후의 단계는 필요 단백질의 투입량에 따라 규모가 정해진다. 따라서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피와 같은 임의 및 이후의 단계는 생물반응기 생산성 평가를 기초로 할 것이다.

고농도의 단백질을 함유할 수 있는 고밀도 미정제 세포 배양 수거물로부터의 단백질의 정제가 본 발명으로 가능해진다. 많은 양의 세포 조직파편 및 숙주 세포 DNA를 함유하는 이들 세포 현탁액을 처리할 가능성은 현탁액 부피 당 많은 양의 단백질, 예를 들어, 항체의 정제를 가능하게 한다. 고농도의 필요 단백질을 함유하는 높은 세포 밀도를 갖는 세포 배양 배치를 처리함으로써, 처리된 부피 당 매우 높은 수율을 가능하게 하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 장점이다. 본 발명의 방법은 대규모 세포 배양에 적용 가능하나, 세포가 여전히 높은 세포 밀도로 더 작은 규모에서 배양되는 것을 가능하게 할 것이며, 효과적으로 추가로 처리될 수 있는 높은 생산 수율을 여전히 달성할 것이다. 이러한 방법은 필요 단백질의 고도로 농축된 배치를 처리할 가능성을 제공하며, 이는 전체 생물약제학적 정제 산업에 크게 영향을 미칠 것이다.

세포

본 발명에 따른 세포는 임의의 유형의 세포, 바람직하게는, 포유류 세포, 예를 들어, CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포, 하이브리도마, BHK(새끼 햄스터 신장) 세포, 골수종 세포, 인간 세포, 예를 들어, HEK-293 세포, 인간 림프아구성 세포, PER.C6 세포, 마우스 세포, 예를 들어, NSO 세포, MDCK 세포, Vero 세포, 양수 세포, 오리 세포주(duck cell line) 등일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서의 세포는 단백질-분비 세포이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서의 세포는 PER.C6 세포 또는 이의 유도체이다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 5,994,128호 및 미국 특허 7,291,484호 참조). PER.C6 세포는 ECACC 번호 96022940으로 수탁된 세포에 의해 예시된다.

분비된 단백질

본 발명에 따른 세포에 의해 생성될 수 있는 분비된 단백질(예를 들어, 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 발현시킴으로써 생성)은, 예를 들어, 재조합 단백질, 상세하게는, 수용체, 효소, 융합 단백질, 혈액 단백질, 예를 들어, 혈액 응고 캐스케이드로부터의 단백질, 다기능성 단백질, 예를 들어, 에리트로포이어틴, 바이러스 또는 박테리아 단백질, 예를 들어, 백신에서 사용하기 위한 바이러스 또는 박테리아 단백질; 면역글로불린, 예를 들어, IgG 또는 IgM 등이다. 본 발명에 따른 분비된 단백질은 더욱 바람직하게는 면역글로불린 또는 이의 일부이며, 세포에 의해 생성된다. 바람직한 구현예에서, 분비된 필요 단백질은 모노클로날 항체이다. 바람직하게는, 세포에 의해 생성된 단백질은 약학적 제조물에서 활성 성분으로 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명된다. 실시예는 본 발명을 어떠한 방식으로든 제한하지 않는다. 이들은 단지 본 발명을 명료화시키기 위해 제공된다.

실시예

실시예 1:

CR6261 항체를 발현하는 PER.C6 세포를 WO2008006494호에 개시된 방법에 따라 혈청 비함유 배양 배지에서 37℃에서 생물반응기 내에서 약 75×10⁶개의 전체 세포/㎖의 세포 밀도로 배양하였다. 수거시의 세포 생활력은 약 68%였다.

2 ℓ의 미정제 세포 배양 수거물을 입구 압력이 급격하게 상승하기 시작할 때(보전물 내 약 300×10⁶개의 세포/㎖에 해당함)까지 4000 s^-1의 전단율에서 중공 섬유를 통한 접선 유동 여과에 의해 여과시켰다. TFF 장치에서 사용된 필터는 0.5 ㎜ 내강 직경 및 1050 ㎠ 표면적을 갖는 Spectrum Laboratories사로부터의 0.5 ㎛ 기공 크기 중공 섬유 필터였다(cat#M1-M05E-360-F1N).

이후 단계에서, 정용여과를 시작하였다. 보전물을 3 정용여과 부피의 1×PBS로 세척한 후, 높은 입구 압력으로 인해 더 이상 여과가 가능하지 않을 때까지 추가로 농축시켰다.

보전물 내에서의 최종 세포 농도는 약 570×10⁶개의 전체 세포/㎖였다. 최종 투과 부피는 3064 g이었고, 희석 인자는 1.6이었고, 81%의 생성물 회수가 달성되었다. 이는 놀랍게도 본 발명의 방법이 고밀도의 항체-생성 세포를 포함하는 세포 배양 수거물의 직접적인 정화에 적절한 것을 나타낸다.

실시예 2:

CR57 항체를 발현하는 PER.C6 세포를 WO2008006494호에 개시된 방법에 따라 혈청 비함유 배양 배지에서 37℃에서 생물반응기 내에서 약 82×10⁶개의 전체 세포/㎖의 세포 밀도로 배양하였다. 수거시의 세포 생활력은 약 58%였다.

1 ℓ의 미정제 세포 배양 수거물을 입구 압력이 급격하게 상승하기 시작할 때(보전물 내 약 270×10⁶개의 세포/㎖에 해당함)까지 4000 s^-1의 전단율에서 중공 섬유를 통한 접선 유동 여과에 의해 여과시켰다. TFF 장치에서 사용된 필터는 0.5 ㎜ 내강 직경 및 1050 ㎠ 표면적을 갖는 Spectrum Laboratories사로부터의 0.5 ㎛ 기공 크기 중공 섬유 필터였다(cat#M1-M05E-360-F1N).

이후 단계에서, 정용여과를 시작하였다. 보전물을 3 정용여과 부피의 1×PBS로 세척한 후, 높은 입구 압력으로 인해 더 이상 여과가 가능하지 않을 때까지 추가로 농축시켰다.

보전물 내에서의 최종 세포 농도는 약 540×10⁶개의 전체 세포/㎖였다. 최종 투과 부피는 1755 g이었고, 따라서 희석 인자는 1.7이었고, 87%의 생성물 회수가 달성되었다. 이는 본 발명의 방법이 고밀도의 항체-생성 세포를 포함하는 세포 배양 수거물의 직접적인 정화에 적절한 것을 입증한다.

실시예 3:

CR8020 항체를 발현하는 PER.C6 세포를 WO2008006494호에 개시된 방법에 따라 혈청 비함유 배양 배지에서 37℃에서 생물반응기 내에서 약 194×10⁶개의 전체 세포/㎖의 세포 밀도로 배양하였다. 수거시의 세포 생활력은 약 85%였다.

1 ℓ의 미정제 세포 배양 수거물을 입구 압력이 급격하게 상승하기 시작할 때(보전물 내 약 300×10⁶개의 세포/㎖에 해당함)까지 4000 s^-1의 전단율에서 중공 섬유를 통한 접선 유동 여과에 의해 여과시켰다. TFF 장치에서 사용된 필터는 0.5 ㎜ 내강 직경 및 1050 ㎠ 표면적을 갖는 Spectrum Laboratories사로부터의 0.5 ㎛ 기공 크기 중공 섬유 필터였다(cat#M1-M05E-360-F1N).

이후 단계에서, 정용여과를 시작하였다. 보전물을 3 정용여과 부피의 1×PBS로 세척한 후, 높은 입구 압력으로 인해 더 이상 여과가 가능하지 않을 때까지 추가로 농축시켰다.

보전물 내에서의 최종 세포 농도는 약 610×10⁶개의 전체 세포/㎖였다. 최종 투과 부피는 1780 g이었고, 따라서 희석 인자는 1.8이었고, 97%의 생성물 회수가 달성되었다. 이는 놀랍게도 약 200×10⁶개의 전체 세포/㎖의 높은 세포 밀도에서도 본 발명의 방법이 항체-생성 세포를 포함하는 세포 배양 수거물의 직접적인 정화에 적절한 것을 나타낸다.

참고문헌

Claims (6)

1. 세포뿐만 아니라 분비된 필요 단백질을 포함하는 미정제 세포 배양 수거물의 정화를 위한 방법으로서, 세포가 수거물에서 적어도 50×10⁶개의 세포/㎖의 세포 밀도로 존재하고, 상기 세포의 적어도 20%가 살아 있고, 상기 방법이,
   a. 생물반응기에서 세포를 적어도 50×10⁶개의 세포/㎖의 세포 밀도로 배양하여, 분비된 필요 단백질을 포함하는 미정제 세포 배양 수거물을 획득하는 단계;
   b. 그 후, 접선 유동 여과(TFF)에 의해 단계 a)에서 획득된 전체 미정제 세포 배양 수거물의 적어도 70%를 처리하는 단계로서, 상기 미정제 세포 배양 수거물의 처리된 부피가 미정제 세포 배양 수거물이 생성된 생물반응기의 부피의 2배 미만이고, 필요 단백질이 미정제 세포 브로쓰(broth)로부터 분리되고, TFF는 250kDa 내지 5μm 범위의 기공 크기를 갖는 중공 섬유 필터를 이용하여 수행되는, 단계; 및
   c. 여과액 내의 필요 단백질을 회수하는 단계를 포함하되,
   상기 필요 단백질이 모노클로날 항체인, 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 세포가 수거물에서 적어도 50×10⁶개의 세포/㎖ 내지 200×10⁶개의 세포/㎖ 범위의 세포 밀도로 존재하는 방법.
4. 삭제
5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 단계 b에서 회수된 필요 단백질이 추가로 정제되는 방법.
   
6. 삭제

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