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KR102207696B1 - 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커 조성물 - Google Patents

뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커 조성물 Download PDF

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KR102207696B1
KR102207696B1 KR1020190168269A KR20190168269A KR102207696B1 KR 102207696 B1 KR102207696 B1 KR 102207696B1 KR 1020190168269 A KR1020190168269 A KR 1020190168269A KR 20190168269 A KR20190168269 A KR 20190168269A KR 102207696 B1 KR102207696 B1 KR 102207696B1
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South Korea
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brain
disease
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박주영
이은희
한문
최효진
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재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단
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Abstract

본 발명은 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커 조성물, 보다 상세하게는, MRI 영상 기반으로 뇌 국소영역을 정밀하게 구분하여 해당 국소 영역에서만 혈뇌장벽 변성을 유도하여, 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌질환 동물 모델을 제조하는 방법, 상기 동물 모델을 이용한 혈뇌장벽 변성으로 인한 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커를 스크리닝 하는 방법 및 혈뇌장벽 변성으로 인한 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커 조성물에 관한 것이다.

Description

뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커 조성물 {Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration}
본 발명은 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커 조성물, 보다 상세하게는, MRI 영상 기반으로 뇌 국소영역을 정밀하게 구분하여 해당 국소 영역에서만 혈뇌장벽 변성을 유도하여, 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌질환 동물 모델을 제조하는 방법, 상기 동물 모델을 이용한 혈뇌장벽 변성으로 인한 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커를 스크리닝 하는 방법 및 혈뇌장벽 변성으로 인한 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커 조성물에 관한 것이다.
혈뇌장벽은 뇌와 혈관 사이에 존재하는 장벽으로, 뇌에 외부 물질이 들어오는 것을 막는다. 혈뇌장벽은 뇌에 외부 물질이 들어오는 것을 막고, 대사에 필요한 물질을 받아들여 뇌를 보호하는 역할을 한다. 예를 들어 뇌에서 세균 또는 바이러스로의 침입을 막고, 포도당 공급과 산소-이산화탄소 교환을 원활하게 한다. 혈액은 혈뇌장벽을 통해 여과되며, 결과적으로 뇌에 다다르는 물질은 물이나 기체 분자, 포도당, 특정 지용성 등 극소수이다. 혈뇌장벽은 혈관을 뇌의 내피세포로 감싸는 모양을 띄며, 내피세포는 서로 밀착 연접(tight junction)되어 있기에 세포 사이로 물질이 지나가는 것이 불가능하다. 이 때문에 혈뇌장벽은 진단을 위한 다양한 영상제뿐 아니라, 종양, 알츠하이머, 파킨슨병 등 뇌에 질병이 생겼을 때 약물이 통과하는 것을 막아 뇌 관련 진단 및 치료 기술 개발에 저해가 되고 있다.
최근 연구에서, 알츠하이머 치매의 최초 신호는 혈뇌장벽의 누출이라는 결과가 나왔다. 미국 서던 캘리포니아대학 의대 신경유전자 연구소(Neurogenetic Institute) 소장 베리슬라프 즐로코비치 박사 연구팀에서는 치매는 주범으로 알려진 뇌 신경세포의 독성 단백질 베타 아밀로이드의 응집(plaque)과 타우 단백질의 엉킴(tangle)과 관계없이 혈뇌장벽 누출이 독립적인 위험요인이라는 연구결과를 발표하였다. 인지기능이 정상인 노인 161명을 대상으로 5년에 걸쳐 각종 테스트를 통해 인지기능을 평가하면서 뇌 영상 검사와 뇌 척수액 분석을 통해 혈뇌장벽의 투과성을 측정한 결과, 인지기능 저하와 혈뇌장벽 누출 사이에 밀접한 연관이 있었다. 특히 기억력이 많이 떨어지는 사람일수록 말초 혈관의 혈뇌장벽 누출이 가장 심한 것으로 나타났다. 치매뿐만 아니라 파킨슨 병 등 퇴행성 뇌질환과 혈뇌장벽 손상에 대한 연관성 연구도 많이 진행 중이다. 상기 연구를 위해 치매, 파킨슨병과 같이 퇴행성 뇌질환을 연구하기 위한, 혈뇌장벽 손상으로 인한 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌질환 동물모델이 필요하다. 그러나 기존에 뇌혈관장벽에 관한 모델로 널리 사용되는 동물 모델의 경우 침습적이고, 실시간 관찰이 어려우며 개별 세포요소의 기능을 구별하기 어렵고, 동물실험에 대한 윤리적인 문제가 지속적으로 제기됨에 따라 대안적인 동물 연구 모델이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 혈뇌장벽의 손상 동물 모델을 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, 마우스에 초음파 에너지를 조사하여 혈뇌장벽의 변성을 유도하여 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 마우스 모델을 제작하였고, 상기 마우스 모델의 뇌 조직에서 분리한 단백질을 분석하여 혈뇌장벽의 변성으로 인한 뇌 미세혈관 손상 뇌질환과 관련된 바이오 마커를 스크리닝한 결과, Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2이 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌질환과 관련된 바이오 마커임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는, 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 서술한 조성물을 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 스크리닝 하는 방법을 제공하는데 있다. (a) 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 샘플로부터 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 발현 수준을 임의의 화합물을 처리하지 않은 정상 대조군에서의 상기 유전자 또는 이의 발현 단백질의 수준과 또는 활성 수준을 비교하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 (a) 마우스에 집속 초음파를 0.25 내지 0.27 MPa로 10초 내지 230초 동안 처리는 단계를 포함하는 optimal BBB 변성 마우스 모델을 제작하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 마우스에 집속 초음파 0.42 내지 0.44 MPa로 10초 내지 230초 동안 처리하는 단계를 포함하는 mild damaged BBB 변성 마우스 모델을 제작하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 바이오 마커 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 제제는 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
상기 제제는 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 서술한 조성물을 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 생물학적 시료로부터 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다: (a) 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 샘플로부터 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 발현 수준을 임의의 화합물을 처리하지 않은 정상대조군에서의 상기 유전자 또는 이의 발현 단백질의 수준과 또는 활성 수준을 비교하는 단계.
본 발명은 (a) 마우스에 집속 초음파를 0.25 내지 0.27 MPa로 10초 내지 230초 동안 처리는 단계를 포함하는 optimal BBB 변성 마우스 모델을 제작하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 (a) 마우스에 집속 초음파 0.42 내지 0.44 MPa로 10초 내지 230초 동안 처리하는 단계를 포함하는 mild damaged BBB 변성 마우스 모델을 제작하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 집속 초음파를 마우스에 조사하여 혈뇌장벽(blood-brain barrier; BBB)의 개통으로 인한 뇌 미세혈관 손상 뇌 질환 마우스 모델을 제작하였다. 또한 상기 집속 초음파의 세기를 조절하여 혈뇌장벽의 개통 정도를 조절 하였고, 상기 조절로 경도 손상(optimal damage) 및 중등 손상(mild damage)를 일으켜, optimal BBB 변성 마우스 모델 및 mild BBB 변성 마우스 모델을 제작 하였다. 상기 mild BBB 변성 마우스의 뇌를 가지고, 생물학적 분석 방법인 transcriptome sequencing analysis를 진행하여, BBB의 변성으로 인한 뇌질환 진단 마커를 발굴한 결과, Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2이 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환을 진단할 수 있다는 것을 확인하였다. 상기 시험결과를 바탕으로 optimal BBB 변성 동물 모델 및 mild BBB 변성 동물 모델의 혈액에서 Klk 6 및 Lcn2을 확인인한 결과 증가하는 것을 확인하였다. 상기의 결과를 토대로 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2을 이용하여 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환, 예를 들어 치매, 뇌암, 파킨슨, 뇌진탕 (TBI) 또는 뇌졸중을 진단 할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 집속 초음파를 이용한 BBB 개통 동물모델을 제작하는 방법의 모식도이다.
도 2는 자기공명영상장치를 이용하여 집속 초음파를 이용한 BBB 동물모델의 BBB 변성 정도를 확인한 결과이다.
도 3은 유전체 분석을 통한 BBB 변성 뇌 조직에서 유전자 발현의 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 유전체 분석 결과를 바탕으로 혈액 바이오 마커 후보를 선정한 결과이다.
도 5는 BBB 동물모델의 혈액에서 KLK 6 및 LCN 2의 발현 정도를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 바이오 마커 조성물을 제공할 수 있다.
혈뇌장벽은 뇌와 혈관 사이에 존재하는 장벽으로, 뇌에 외부 물질이 들어오는 것을 막는다. 최근 연구에서 혈뇌장벽 누출이 독립적인 위험요인이라는 연구결과가 발표되었다. 따라서 치매, 파킨슨병과 같은 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌질환을 연구하기 위해, 혈뇌장벽 손상 동물모델이 필요하다. 그러나 기존에 뇌혈관장벽에 관한 모델로 널리 사용되는 동물 모델의 경우 실시간 관찰이 어려우며 개별 세포요소의 기능을 구별하기 어렵고, 동물실험에 대한 윤리적인 문제가 지속적으로 제기됨에 따라 대안적인 동물 연구 모델이 필요한 실정이다. 이에 본 발명자들은 집속 초음파를 마우스에 조사하여 혈뇌장벽(blood-brain barrier; BBB)의 개통 모델을 제작하였다. 특정 집속 초음파의 세기를 조절하여 혈뇌장벽의 개통 정도를 조절 하였고, 상기 조절로 경도 손상(optimal damage) 및 중등 손상(mild damage)을 일으켜, optimal BBB 변성 마우스 모델 및 mild BBB 변성 마우스 모델을 제작하였다. 상기 mild BBB 변성 마우스의 뇌를 가지고, 생물학적 분석 방법인 transciptome sequencing analysis를 진행하여, 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌질환 진단 마커를 발굴하였다. BBB의 손상이 중반 정도로 예상할 수 있는 mild damage BBB 조건에서 RNA sequencing 분석 결과를 통해 시간에 따른 유전자 발현 변화를 control 그룹과 비교하였을 때, 48시간 째 약 518개의 유전자가 증가되었고 174개의 유전자가 감소되는 경향을 나타내었다 (도 3). 상기의 결과를 바탕으로 mild damage BBB 조건에서의 혈액 바이오 마커 후보군을 선정하였다. 518개의 유전자중 Control 대비 3배 이상 증가되고 혈액에서 검출할 수 있는 수용성의 단백질을 코딩 하고 있는 10개(Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2)의 유전자를 후보군으로 선정하였다 (도 4). 상기 유전자 중 KLK 6 및 LCN2의 경우에는 optimal BBB 변성 마우스 모델 및 mild BBB 변성 마우스 모델의 혈액에서 확인한 결과, KlK6의 혈액에서의 발현은 optimal condition과 mild damaged condition에서 BBB 개통 후 시간이 지남에 따라 점차 증가되었고, LCN2의 혈액 내 발현은 optimal condition BBB 개통 후 12시간까지 증가되다가 다시 감소됨을 확인하였다. 이를 통해 뇌미세혈관 손상에 의한 뇌질환의 혈액 바이오 마커 발굴 가능성을 확인하였다 (도 5).
본 발명에 있어서, Lcn2 (Lipocalin 2)은 리포칼린 계열에 속하는 단백질을 암호화하는 유전자로 지질, 스테로이드 호르몬 및 레티노이드와 같은 작은 소수성 분자를 운반한다. 혈액과 소변에서 상기 단백질의 존재는 급성 신장 손상의 초기 바이오 마커이다. 그러나 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 본 발명의 Lcn2의 정보는 예를 들어 NCBI gene ID NM 008491에 개시된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, SPP1(Secreted Phosphoprotein 1)은 파골 세포가 광물질화된 골기질(mineralized bone matrix)에 결합하는데 관여한다. 상기 유전자의 단백질은 또한 인터페론-γ 및 인터루킨-12의 발현을 상향 조절하는 사이토카인 (cytokine)이다. 그러나 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 본 발명의 SPP1의 정보는 예를 들어 NCBI gene ID NM_001204201에 개시된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, Saa3 (Serum amyloid A 3)은 고밀도 지단백질과 관련된 아포질 단백질의 계열이다. 그러나 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 본 발명의 Saa3 의 정보는 예를 들어 NCBI IDNM_011315에 개시된 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, Ptx3(Pentraxin 3)은 여러 중간엽과 상피 세포 유형, 특히 내피 세포 및 단핵 식세포에서 염증성 자극에 대한 반응으로 염증성 사이토카인에 의해 유도된다. 상기 유전자의 단백질은 섬유 세포 분화를 촉진하고 염증 및 보체 활성화 조절에 관여한다. 여러 염증성 질환의 바이오 마커이다. 그러나 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 본 발명의 Ptx3의 정보는 예를 들어 NCBI gene ID NM_008987에 개시된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, A2m(Alpha-2-Macroglobulin)은 프로테아제 억제제 및 사이토카인 트랜스 포터이다. 상기 유전자는 트립신, 트롬빈 및 콜라게나제를 포함하여 광범위한 단백질 분해 효소를 억제하기 위해 사용된다. 염증성 사이토 카인을 억제한다. 그러나 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 본 발명의 A2m의 정보는 예를 들어 NCBI gene ID NM_175628에 개시된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, Lrg1 (Leucine Rich Alpha-2-Glycoprotein)은 Lrg1을 포함하는 leucine-rich repeat (LRR) family는 단백질-단백질 상호작용, 신호 전달 및 세포 부착 및 발달에 관여한다. LRG1은 수두증과 관련이 있다. 그러나 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 본 발명의 Lrg1의 정보는 예를 들어 NCBI gene ID NM_029796에 개시된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, Klk 6(Kallikrein Related Peptidase 6)은 단백질 코딩 유전자이다. 상기 유전자와 관련된 질병에는 위 식도 선암과 시뉴클라식시 병이 있다. 일반적은 암 및 기타 질병 바이오 마커이다. 그러나 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 본 발명의 Klk 6의 정보는 예를 들어 NCBI gene ID NM_001164696에 개시된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, Clcf1(Cardiotrophin Like Cytokine Factor 1)은 인터루킨-6 신호전달과 면역계에서 사이토카인 신호전달과 관련되어 있다. 그러나 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 본 발명의 Clcf1의 정보는 예를 들어 NCBI gene ID NM_001310038에 개시된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, SCGB3A1(Secretoglobin Family 3A Member 1)은 사이토카인 활성과 관련되어 있다. 그러나 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 본 발명의 SCGB3A1의 정보는 예를 들어 NCBI gene ID NM_054037에 개시된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, Bst2 (Bone Marrow Stromal Cell Antigen 2)은 pre-2 세포 성장 및 류마티스성 관절염에 관여한다. BST2와 관련된 질병으로는 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 및 웨스타일 뇌염이 있다. 그러나 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 본 발명의 Bst2 의 정보는 예를 들어 NCBI gene ID NM_198095에 개시된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, ‘진단’은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단이란 뇌 미세혈관의 손상으로 인한 뇌질환의 발병 여부를 확인하는 것이다. 상기 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환은 바람직하게는 경도인지장애 (Mild cognitive impairment), 경도의 외상성뇌질환 (MTBI, mild traumatic brain injury), 일과성 허혈성발작, 루게릭병 치매, 알츠하이머, 파킨슨 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 뇌미세혈관 손상은 뇌혈관장벽의 개통 또는 누출로 발생하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, ‘바이오 마커’란 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환을 진단할 수 있는 물질, 즉 생물학적 시료에서 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌질환의 발생 여부를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 개체와 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌질환 개체 간의 유의적인 차이를 보이는 폴리펩타이드, 핵산 (예:mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상 바이오 마커는 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 mild BBB 변성 마우스 모델에서 시간이 경과함에 따라 증가하는 바, Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 증가된 발현 정도가 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 발병을 뒷받침한다.
본 발명의 목적상 바이오 마커는 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자로, mild BBB 변성 동물모델에서 시간에 따라서 발현이 증가된 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 증가된 발현 정도가 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 발병을 뒷받침한다.
본 발명은 또한 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자는 건강한 정상인에 비하여 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환 모델에서 유의하게 증가하는 바, 이의 유전자 mRNA 발현 또는 이의 단백질 수준을 측정함으로써 퇴행성 뇌질환의 진단이 가능하다.
본 발명에 있어서, Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 수준의 측정은 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 진단을 위하여 생물학적 시료에서 바이오 마커 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 표적 유전자부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 이용해 mRNA의 양을 측정한다. 구체적으로 본 발명에서 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이며, Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 염기 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 디자인 할 수 있다.
본 발명에 있어서, Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 단백질 활성 수준 측정은 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 진단을 위하여 생물학적 시료에서 바이오 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 단백질의 양을 확인할 수 있다.
상기 항체는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 지칭하는 것으로, 본 발명의 목적상 항체는 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어 질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다.
본 발명은 상기 서술한 조성물을 포함하는 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 키트에는 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 제제 외에, 분석방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있으며, 어떠한 형태로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(우센), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있으며, 본 발명의 마커를 이용 하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이 칩을 제작하기 위해서, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2 단백질 활성 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충 용액, 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 생물학적 시료로부터 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 집속초음파 조사에 따른 BBB 개통후 시간에 따른 생물학적 반응을 확인하기 위해서 시간에 따라 (1시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간) mild BBB 변성 뇌조직을 획득한 후, RNA sequencing 분석 결과를 통해 시간에 따른 유전자 발현 변화를 control 그룹과 비교하였을 때, 48시간 째 약 518개의 유전자가 증가되었고 174개의 유전자가 감소되는 경향을 나태었고, 518개의 유전자중 Control 대비 3배 이상 증가되고 혈액에서 검출할 수 있는 soluble form의 단백질을 coding 하고 있는 10개(Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2)의 유전자를 선정한 바, 생물학적 시료에서 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2의 발현 비교 분석을 통해 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 진단을 위한 정보제공방법은 진단을 위한 예비적 단계로써 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
본 발명에 있어서, '생물학적 시료'란 개체로부터 분리되어 목적 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하고, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 시료란 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환 의심 개체에서 뇌 질환의 발병 여부를 진단하기 위한 시료로서, 바람직하게는 혈액일 수 있다.
본 발명에 있어서, 'mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 분석 방법'에는 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), 또는 DNA 마이크로어레이 분석법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, '단백질 활성 수준을 측정하기 위한 분석 방법'에는 웨스턴 블랏팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법 (Radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), 유세포분석법 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 또는 단백질 칩(protein chip) 분석법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 상기 측정된 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 대조군에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 대조군은 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환이 발명하지 않은 건강한 사람이다. 이에 따라 본 발명의 방법은 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준이 대조군 보다 높을 경우, 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환이 진행 중이거나 이미 발병하였을 것으로 판단 할 수 있다.
(a) 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 샘플로부터 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 및 Bst2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 발현 수준을 임의의 화합물을 처리하지 않은 정상대조군에서의 상기 유전자 또는 이의 발현 단백질의 수준과 또는 활성 수준을 비교하는 단계; 를 포함하는 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 스크리닝은 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 치료 효과를 가지는 물질을 선별하는 조작에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 후보물질은 뇌 질환의 치료 활성을 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 들의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 후보 물질은 천연물질뿐 아니라, 합성 물질도 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 단계는 시료에서 후보물질 처리에 의한 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2을 암호화하는 핵산 또는 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다.
본 발명의 스크리닝 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정한 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 활성이 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질의 활성보다 낮은 경우, 후보물질을 뇌 질환의 치료제로 판단하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다. 다시 말해, 후보물질의 처리에 의해 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질의 활성이 후보물질 비처리군의 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2의 mRNA 발현 또는 이의 단백질의 활성보다 낮아지는 경우 상기 후보물질을 뇌 질환 치료제로 판단할 수 있고, 그와 반대로 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질의 활성이 후보물질 비처리군의 Lcn2, SPP1, Saa3, Ptx3, A2m, Lrg1, Klk 6, clcf 1, Scgb3a 또는 Bst2 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성량과 비슷하거나 보다 높아지는 경우 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환 치료제로 사용할 수 없다 판단 할 수 있다.
(a) 마우스에 집속 초음파를 0.25 내지 0.27 MPa로 10초 내지 230초 동안 처리는 단계를 포함하는 optimal BBB 변성 마우스 모델을 제작하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 (a) 마우스에 집속 초음파 0.42 내지 0.44 MPa로 10초 내지 230초 동안 처리하는 단계를 포함하는 mild BBB 변성 마우스 모델을 제작하는 방법을 제공할 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시 예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
BBB변성 모델의 제작
만성 퇴행성 뇌질환은 대부분의 경우 BBB의 손상으로 인해 그 결합이 느슨해져 있다. 이에 본 연구진들은 집속 초음파를 이용하여 BBB의 개통 유도하였다. 뇌질환의 BBB 변성 정도를 조절하여, 퇴행성 뇌질환 모델의 초기 BBB 손상 정도의 동물 모델과 퇴행성 뇌질환 모델의 중기 BBB 손상 정도의 동물 모델을 제작하였다. 8주령의 ICR mice를 이용하여 집속 초음파 유도 BBB 개통 동물 모델을 제작하였다. MRgFUS 기기를 이용한 초음파 처리는 FUS 기기(RK-100)를 사용하였으며, 도 1에 기기 구성의 개략도가 나타나 있다. MR 영상유도 집중초음파 시스템은 도1에 개략도가 나타나 있다. 시스템은 초음파 컨트롤 시스템과 초음파 조사 시스템 (MR 환경 호환)으로 이루어져 있다. 구체적으로 초음파 컨트롤 시스템은 초음파 변환기에 RF 파워를 전달할 수 있는 fuction generator와 RF amplifier로 이루어져 있으며 초음파 변환기에 전달되는 power를 실시간으로 측정할 수 있는 power meter로 구성되어 있다. 초음파 조사 시스템은 초음파 변환기, 초음파 변환기를 3차원으로 정밀 제어 할 수 있는 3축 제어부, water tank로 구성되어 MRI 장비 환경 내에서도 구동가능하게 설계되어 있다. MR 영상유도 집중초음파 시스템은 Bruker 9.4T MRI (BioSpec 94/20 USR - 9.4T, Bruker, MA, USA) 시스템과 연동되어 있다. 구체적인 실험 프로토콜은 초음파 영상 진단용 조영제인 미소기포(DEFINITY®를 생리식염수에 1:50의 비율로 희석하여 0.012ml/s의 속도로 동물의 정맥에 주입한다. 희석된 미소기포를 주입하는 동안 1s에 10ms의 burst length를 가지는 집속 초음파를 MR영상 기반으로 원하는 뇌 지역에 2분간 조사하였다. MR 영상을 통해 MR 조영제 주입 전과 주입 후 영상을 비교하여 BBB 개폐를 확인할 수 있다. 뇌질환의 BBB 변성 정도에 따른 바이오 마커를 발굴하기 위해 optimal damage (0.25~0.27 MPa) 조건과 mild damage BBBD (0.42-0.44 MPa)조건의 초음파 에너지를 ICR mice의 뇌의 thalmus 부위에 조사하여 BBB 변성을 유도하였다. 초음파 조사조건은 중심주파수 1.1 MHz를 이용하여 RFP는 1Hz, 120초동안 조사하였다 (도 1). optimal damage (0.25~0.27 MPa) 조건과 mild damage BBBD (0.42-0.44 MPa)조건의 마우스의 MR영상을 확인하였다 (도 2). MR image는 BBB 개통후 조영제를 투여하고, 시간에 따른 enhancement 정도를 확인하였으며, 관상면(coronal), 축상면(axial) 그리고 시상면 (sagittal) 방향으로 이미지를 획득하였다. MR 조영제 투과정도에 따른 intensity 측정을 통해 optimal(~50%) 및 mild (~100%) BBB 조건으로 실험을 진행하였다. 집속초음파 조사에 따른 BBB 개통후 시간에 따른 생물학적 반응을 확인하기 위해서 시간에 따라 (1시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간) BBB 변성 뇌조직을 획득하였으며, 각 그룹의 mouse에서 혈액을 약 1ml 채취하여 혈청을 분리하였다.
Transcriptome analysis (전사체 분석)
실시예 1의 방법으로 제작된 optimal damage BBB 동물 모델 및 mild damage BBB 동물모델에 집속 초음파를 조사한 뇌 부분의 조직을 액체 질소에 급속 냉동시킨 후, RNA isolation kit (Qiagen)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 총 RNA를 Dnase를 처리하여 DNA 오염을 방지하고, library 제작을 위해 random fragmentation을 제작하였다. RNA fragment를 역전사 효소로 반응시켜 cDNA를 제작하고 만들어 cDNA 양쪽 끝에 adpator를 붙여 sequencing을 수행하였다. sequencing을 통해 얻어진 raw data의 quality를 분석하고 각 샘플의 transcript quantification을 통해 발현량을 FPKM(Fragments per kilobase of transcript per milion mapped reads)값으로 추출하였다 (도 3). 퇴행성 뇌질환의 초기단계로 예상할 수 있는 optimal BBBD 조건에서 RNA sequencing 분석을 통해 시간에 따른 유전자의 발현 변화를 control과 비교하였을 때, 약 20,000개의 유전자중 BBBD에 의해 증가 또는 감소되는 유전자의 발현차이가 약 30개에서 70개 정도로 control과 크게 차이가 없음을 확인 하였다. BBB의 손상이 중반 정도로 예상할 수 있는 mild damage BBBD 조건에서 RNA sequencing 분석 결과를 통해 시간에 따른 유전자 발현 변화를 control 그룹과 비교하였을 때, 48시간 째 약 518개의 유전자가 증가되었고 174개의 유전자가 감소되는 경향을 나타내었다 (도 3). 상기의 결과를 바탕으로 mild damage BBBD 조건에서의 혈액이나 뇌 조직 바이오 마커 후보군을 선정하였다. 518개의 유전자중 Control 대비 3배 이상 증가되고 혈액에서 검출할 수 있는 soluble form의 단백질을 coding 하고 있는 10개의 유전자를 선정하여 후보군으로 선정하였다 (도 4).
유전체 분석 결과와 유전자 발현량의 상관관계 검증
상기 실시예３의 후보 유전자의 sequencing 결과가 유의한지 확인하기 위해 real time PCR실험기법으로 후보군유전자 발현을 확인하여 상관관계를 확인하였다. 실시예 1의 방법으로 제작된 optimal damage BBB 동물 모델 및 mild damage BBB 동물모델에 집속 초음파를 조사한 뇌 부분의 조직을 액체 질소에 급속 냉동시킨 후, Quiagne RNA isolation kit (Quiagen)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 총 RNA를 Dnase를 처리하여 DNA 오염을 방지하고, library 제작을 위해 random fragmentation을 제작하였다. RNA fragment를 역전사 효소로 반응시켜 cDNA를 제작하였다. SYBR®그린 마스터 PCR 믹스 10 μL, 포워드 및 리버스 프라이머 각 5 pmol, 희석된 cDNA 주형 1 μL 및 적절한 양의 멸균 증류수를 함유한 20 μL 반응물 부피에서 SYBR®그린 리얼-타임 PCR 키트를 사용하여 qRT-PCR을 수행했다. 유전자 증폭 조건은 다음과 같았다. 3 분 간 95 ℃에서 초기 변성; 15 초간 95 ℃에서 변성, 60 초간 60 ℃에서 아닐링 및 60 초간 72 ℃에서 신장 40 사이클; 및 5 분간 72 ℃에서 마지막 신장하였다. ABI 스텝 원 플러스 리얼-타임 PCR 시스템에서 qRT-PCR을 수행했다. 모든 정량은 내부 표준으로 U6과 함께 수행되었다. PCR 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다. 그 결과 시간에 따른 유전자의 sequencing결과와 qRT-PCR결과가 유사하다는 것을 확인하였다 (도 4).
Gene Sequcne Sequence number
LCN2 tggaagaaccaaggagctgt 서열번호 1
cacactcaccacccattcag 서열번호 2
SPP1 tctgatgagaccgtcactgc 서열번호 3
cctcagtccataagccaagc 서열번호 4
Cfcl1 aacttggaagtgtggcgaag 서열번호 5
tacgtcggagttcagctgtg 서열번호 6
Scgb3a1 tctgtgtggctctgctcagt 서열번호 7
ggccaagtggcttaatggta 서열번호 8
Klk6 tgtgctgatgtccatctggt 서열번호 9
gacctccagaatcaccctga 서열번호 10
Ptx3 atttgggtcaaagccacaga 서열번호 11
cagccagcttgttctccttt 서열번호 12
ELISA
집속초음파를 이용한 BBB 개통을 유도한 동물모델을 시간에 따라 sacrifice하고, 하대정맥에서 혈액을 약 1ml 정도 취하여, 상온에서 약 30분 혈액을 응고시킨 후, 6000rpm에서 30분간 원심 분리하여 상층액만을 분리하여 serum을 획득하였다. LCN2 ELISA kit (BosterBio社)와 KLK6 (LS bio社)를 이용하여 실험을 수행하기 위해서 serum을 50배와 10배로 blocking buffer에 희석 한 후에 ELISA plate에 100 ul씩 분주하였다. 상온에서 2시간동안 incubation후에 wash buffer로 5분씩 세 번 세척하였다. Biotin이 labelling되어 있는 antibody solution을 100ul씩 분주하고 37 ℃, 1시간동안 incubation하고, wash buffer로 5분씩 3번 세척하였다. ABC solution을 100ul씩 분주하고 37 ℃에서 30분 동안 incubation하고 wash buffer로 세척 후에 TMB substrate solution 90ul를 첨가하여 37 ℃에서 30분 동안 incubation후에 100ul의 stop solution을 첨가하고 plate reader (Tecan 社)를 이용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하여 결과를 분석하였다. KlK6의 혈액에서의 발현은 optimal condition과 mild damaged condition에서 BBB 개통후 시간이 지남에 따라 점차 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한 LCN2의 혈액내 발현이 optimal condition BBB 개통 후 12시간까지 증가되다가 다시 감소됨을 확인하였다. 이를 통해 뇌미세혈관 손상에 의한 혈액 바이오 마커 발굴 가능성을 확인하였다.
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Claims (4)

  1. Bst2 (Bone Marrow Stromal Cell Antigen 2) 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 혈뇌장벽의 변성으로 인한 경도인지장애 (Mild cognitive impairment), 경도의 외상성뇌질환 (MTBI, mild traumatic brain injury), 일과성 허혈성발작, 루게릭병 치매, 알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 혈뇌장벽의 변성으로 인한 뇌 질환을 진단하는 바이오 마커 검출용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 제제는 Bst2 (Bone Marrow Stromal Cell Antigen 2) 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인, 혈뇌장벽의 변성으로 인한 경도인지장애 (Mild cognitive impairment), 경도의 외상성뇌질환 (MTBI, mild traumatic brain injury), 일과성 허혈성발작, 루게릭병 치매, 알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 혈뇌장벽의 변성으로 인한 뇌 질환을 진단하는 바이오 마커 검출용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 제제는 Bst2 (Bone Marrow Stromal Cell Antigen 2) 유전자의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인, 혈뇌장벽의 변성으로 인한 경도인지장애 (Mild cognitive impairment), 경도의 외상성뇌질환 (MTBI, mild traumatic brain injury), 일과성 허혈성발작, 루게릭병 치매, 알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 혈뇌장벽의 변성으로 인한 뇌 질환을 진단하는 바이오 마커 검출용 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 혈뇌장벽의 변성으로 인한 경도인지장애 (Mild cognitive impairment), 경도의 외상성뇌질환 (MTBI, mild traumatic brain injury), 일과성 허혈성발작, 루게릭병 치매, 알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 혈뇌장벽의 변성으로 인한 뇌 질환 진단용 키트.
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