KR102206085B1

KR102206085B1 - 들깨박 유래 비검화물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102206085B1
Application number: KR1020190035768A
Authority: KR
Inventors: 이준수; 이하나
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2021-01-21
Anticipated expiration: 2039-03-28
Also published as: KR20200114291A

Abstract

본 발명은 들깨박 유래 비검화물(unsaponifiable matter)을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 상기 화장료 조성물을 포함하는 자외선 차단제 및 들깨박 유래 비검화물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

Description

들깨박 유래 비검화물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물{Composition for preventing or improving skin photoaging comprising unsaponifiable matter from Perilla frutescens by-product as effective component}

본 발명은 들깨박 유래 비검화물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

광노화(photoaging)는 태양광선의 자외선(UVR, ultraviolet radiation)에 반복적이거나 장기간 노출되어 피부의 탄력 및 수분이 감소되고 주름이 형성되는 등의 피부손상이 일어나는 현상을 말한다. 생활수준의 향상으로 인해 아름답고 건강한 피부를 유지하려는 욕구가 증대되고, 야외활동이 증가하면서 태양광선 노출로부터 야기되는 피부손상을 방지하기 위한 관심이 증가함에 따라 피부노화 억제에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

자외선은 파장에 따라 UVA(ultraviolet A, 320~400nm), UVB(ultraviolet B, 280~320nm), UVC(ultraviolet C, 200~280nm)로 분류된다. 그 중 UVB는 매우 유해한 광선으로 표피 손상에 관여하거나 건조, 피부홍반, 색소침착, 표피비후(epidermal thickening) 등을 유발한다. 또한 항산화 기전의 불균형을 유발하여 피부를 구성하는 지질, 단백질, 효소 등을 손상시킴으로써 염증반응과 피부암, 광노화를 심화시킨다. 반면, UVA는 UVB에 비해 단기간의 위력은 미미하지만 파장이 길어서 피부 깊숙이 침투해 피부의 진피를 손상시켜서 피부를 검게 하고 피부노화를 촉진시킨다. UVA 및 UVB를 저해할 수 있는 소재 및 제품의 효능기준이 자외선 차단지수로 이용되고 있으며, 피부 광노화에 따른 피부손상을 위해 장기간 사용시에도 부작용없이 효능을 나타낼 수 있는 천연 기능성 소재 및 제품을 개발하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

UVB 자극에 의해 생성되는 ROS(reactive oxygen species)는 광노화의 원인 중 하나로 세포 내 신호전달체계를 자극하여 DNA, 지질 및 단백질 등 생체분자에 산화적 스트레스 유발을 통한 피부조직 손상을 일으킨다. ROS는 표피 각질세포와 진피 섬유아세포의 자극으로 AP-1 및 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activator B cells)의 전사인자를 활성화시키고 염증관련 사이토카인(cytokine)을 분비하도록 하여 MMP(matrix metalloproteinase)의 발현을 증가시키고 피부조직을 구성하는 교원질과 탄력섬유의 분해를 촉진하여 주름을 형성시킨다. 생체에서는 ROS 자극으로부터 생성 및 활성되는 지질과산화물과 산화효소로부터 방어하기 위해 CAT(catalase), SOD(superoxide dismutase) 및 GST(glutathione-s-transferase) 등의 항산화 효소가 작용하며, 체외에서는 비타민 C, E 및 폴리페놀류와 플라보노이드 등의 생리활성물질을 통해 ROS에 의한 손상을 방어한다.

들깨(Perilla frutescens)는 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과(Labiatae, mint family)의 한해살이풀로, 안토시아닌(anthocyanin)의 유효성에 따라 붉은색의 색소가 있는 형태와 색소가 없는 녹색 형태의 물질대사적 표현형(metabolic phenotypes)의 2가지 화학변종 형태(chemovarietal forms)가 존재한다. 들깨는 전통적인 약용작물 중의 하나로 우울증, 종양, 기침, 항균, 항곰팡이, 알려지 등의 다양한 질병을 다스리는데 사용되어 왔다.

한편, 한국등록특허 제1934793호에는 '고욤나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0614970호에는 들깨박 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 및 개선용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 들깨박 유래 비검화물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인간 섬유아세포주 Hs68 세포에 UVB를 조사하여 광노화를 유도한 후 들깨박 유래 비검화물을 처리한 결과, UVB 조사에 의해 감소된 Hs68 세포의 생존율이 증가하고 UVB에 의해 증가된 ROS 생성량은 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 들깨박 유래 비검화물은 UVB 조사에 의해 유도되는 MAPKs(JNK, ERK 및 p38) 및 AP-1(c-fos 및 c-jun)의 인산화 반응을 억제하여 피부 노화를 유도하는 MMP 단백질의 발현을 감소시키고 콜라겐 생성을 촉진하는 TGF(transforming growth factor)-β1 및 Smad2/3의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 들깨박 유래 비검화물(unsaponifiable matter)을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 포함하는 자외선 차단제를 제공한다.

또한, 본 발명은 들깨박 유래 비검화물(unsaponifiable matter)을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 들깨박 유래 비검화물은 피부노화를 유도하는 단백질들의 활성을 감소시킬 뿐만 아니라 콜라겐 생성을 촉진하는 인자들의 활성을 증가시키는 효과가 우수하므로, 자외선에 의한 광노화를 예방 및 개선하기 위한 기능성 소재 및 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인간 섬유아세포주인 Hs68 세포에 들깨박 비검화물(PSU) 또는 들깨박 메탄올 추출물(1, 2.5 또는 5㎍/㎖)을 전처리한 후 UVB를 조사하여 세포의 생존율을 나타낸 그래프(A)와 Hs68 세포에 PSU를 전처리한 후 UVB를 조사하여 세포의 생존율(B 및 C) 및 세포 내 콜라겐 생성량(D 및 E)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 Hs68 세포에 PSU(1, 2.5 또는 5㎍/㎖)를 전처리한 후 UVB를 조사하여 세포 내에서 생성되는 ROS(reactive oxygen species)를 형광 분광기(fluorescent spectrophotometer)로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 Hs68 세포에 PSU(1, 2.5 또는 5㎍/㎖)를 전처리한 후 UVB를 조사하여 MMP(matrix metalloproteinase)-1 및 MMP-3 단백질의 생성량(A 및 B) 및 mRNA 발현량(C 및 D)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 Hs68 세포에 PSU(1, 2.5 또는 5㎍/㎖)를 전처리한 후 UVB를 조사하여 JNK(A), ERK(B) 및 p38(C)의 인산화 수준을 측정한 결과이다.
도 5는 Hs68 세포에 PSU(1, 2.5 또는 5㎍/㎖)를 전처리한 후 UVB를 조사하여 c-jun(A) 및 c-fos(B)의 인산화 활성을 측정한 결과이다.
도 6은 Hs68 세포에 PSU(1, 2.5 또는 5㎍/㎖)를 전처리한 후 UVB를 조사하여 TGF-β1(A), Smad2/3(B) 및 Smad7(C)의 발현량을 측정하여 나타낸 그래프이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 들깨박 유래 비검화물(unsaponifiable matter)을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 '비검화물'은 불검화물이라고도 하며, 일반적으로 알칼리에 의해 가수분해되지 않는 기질을 의미하는 것으로서, 지질 중 검화물과 비교하였을 때 스테롤류 등의 탄화수소, 지용성 색소 등 비타민류 등을 포함하는 물질을 의미한다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 들깨박 유래 비검화물은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용하여 제조할 수 있고, 바람직하게는 들기름을 제조한 후 얻어진 들깨 부산물인 들깨박에 알칼리를 처리하여 검화물을 분해하여 수득할 수 있다. 이때, 분해된 검화물을 제외하고 남은 잔여물에 유기용매를 이용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유기용매는 헥산, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합 용액일 수 있고, 보다 바람직하게는 헥산과 에틸아세테이트의 혼합 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서, 용어 '광노화'는 태양광선의 자외선에 반복적이거나 장기간 노출시 피부손상, 색소침착, 주름생성 또는 피부의 탄력이 저하되는 현상을 말한다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 들깨박 유래 비검화물은 콜라겐 합성을 증가시키고 콜라겐분해효소인 MMP(matrix metalloproteinase)-1 또는 MMP-3의 발현을 감소시키는 효과가 우수하다. 들깨박 비검화물을 이용하여 type Ⅰ 콜라겐의 분해효소인 MMP-1 단백질과 type Ⅳ 콜라겐의 분해효소인 MMP-3 단백질의 활성을 억제시키면, 콜라겐 분해를 감소시킬 수 있으므로 피부조직의 탄력을 유지하여 주름 생성을 예방할 수 있다.

또한, 상기 들깨박 유래 비검화물은 세포 내의 ERK(extracellular signal-regulated kinase), JNK(c-Jun N-terminal kinase), p38, c-fos 또는 c-jun의 인산화 반응을 감소시키고, TGF-β1 및 Smad2/3의 발현을 증가시켜 MMPs 단백질의 발현을 감소시켜 피부 노화를 방지하는 효과가 우수하다. MAPK(mitogen activated protein kinase; ERK, JNK 및 p38) 경로의 활성화는 AP-1(Fos 및 Jun family 단백질로 이루어진 전사인자)의 연속적인 활성을 유도하여 MMPs의 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, ERK의 인산화는 AP-1을 구성하는 c-fos의 발현 및 인산화를 증가시키고, JNK 또는 p38의 인산화는 AP-1을 구성하는 c-jun의 발현 및 인산화를 증가시켜 MMPs의 발현을 증가시킨다. 따라서, 들깨박 추출물을 이용하여 MAPK 및 AP-1의 활성을 저해하면 MMPs의 발현을 억제시켜 주름 생성을 예방할 수 있다. 또한, 들깨박 추출물을 이용하여 TGF(transforming growth factor)-β1 및 Smad2/3의 발현 및 인산화를 유도하여 활성을 증가시키면 핵 내의 전사인자의 활성화를 통해 콜라겐의 생성을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있고, 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨 토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이크림, 모이스쳐크림, 자외선 차단제, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징워터, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 자외선 차단제 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 성분이나, 효과를 증강하는 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 예컨대, 당업계에 공지된 피부 노화방지 및 주름개선 성분으로서, 레티노산, 동물 태반 유래의 단백질, 베튤린산 및 클로렐라 추출물로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가된 성분은 전체 조성물 100 중량부에 대하여, 0.0001 내지 10 중량부로 포함될 수 있을 것이며, 상기 함량 범위는 콜라겐 합성 촉진 활성, 피부 안전성, 제형화 시의 용이성 등의 요건에 따라 조절될 수 있을 것이다.

본 발명은 또한, 들깨박 유래 비검화물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부 광노화 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 들깨박 유래 비검물은 콜라겐 합성을 증가시키고 콜라겐분해효소인 MMP(matrix metalloproteinase)-1 또는 MMP-3의 발현을 감소시킬 뿐만 아니라, 세포 내의 ERK(extracellular signal-regulated kinase), JNK(c-Jun N-terminal kinase), p38, c-fos 또는 c-jun의 인산화 반응을 감소시키고, TGF-β1 및 Smad2/3의 발현을 증가시켜 콜라겐분해효소인 MMPs의 활성을 감소시킬 수 있으므로, 자외선에 반복적이거나 장기간 노출시 유발된 피부손상, 색소침착, 주름생성 또는 피부 탄력 저하와 관련 광노화를 방지하는 효과가 우수하다.

본 발명의 피부 외용제는 본 발명의 조성물을 다양한 방식 또는 형태로 인체에 적용할 수 있으나, 바람직하게는 피부에 국소적으로 도포되어 적용 가능한 피부 외용제의 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 파우더, 연고제, 겔제, 크림제, 리니멘트제, 로션제, 액제, 또는 에어로졸제 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 피부 외용제로 제제화할 경우, 본 발명의 조성물 외에 첨가물 등을 적절하게 배합하여 제조할 수 있다. 상기 첨가물은 당 업계에서 통상적으로 이용되는 것으로, 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 들깨박 유래 비검화물의 제조

제작용기에 들기름을 제조하고 남은 들깨박(들깨 부산물) 3g을 취하여 6% 피로갈롤(pyrogallol) 20㎖을 첨가한 후 질소 충진하고 5분 동안 초음파 처리하고 수산화칼륨(KOH) 8㎖을 첨가하였다. 다시 질소 충진하고 뚜껑을 냉각관으로 교체해주었으며, 75℃의 항온기에서 50분간 반응시킨 후 냉각하였다. 냉각 후 2% 염화나트륨(NaCl) 30㎖을 첨가하고 추출용매(hexane:ethyl acetate=85:15, without BHT) 30㎖씩로 3번 반복 추출하였다. 상기 추출물은 감압 농축하여 용매를 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 재용해하여 세포에 처리하였다.

2. 비타민 E 함량 측정

상기 제조된 들깨박 비검화물을 헥산(hexane)에 재용해하고 필터하여 NPHPLC(normal phase HPLC)로 분석하였다. LiChrosphere^® Diol 100 컬럼(250 x 4 mm i.d., 5 um, Merck, 독일)을 이용하여 수행하였으며, 이동상은 헥산(hexane)/아이소프로판올(isopropanol)(98.9:1.1, v/v)을 1.0㎖/분의 속도로 흘려주었다. 비검화물의 토코페롤(tocopherol)과 토코트리에놀(tocotrienol)의 농도는 표준물질(standard)과 비교하여 평균 피크 면적을 사용하여 계산하였다.

3. 피토스테롤 ( phytosterol ), 폴리코사놀 ( policosanol ), 스쿠알렌( squalene)의 분석

들깨박 비검화물 내의 피토스테롤, 폴리코사놀 및 스쿠알렌 농도는 5α-콜레스탄(cholestane)을 내부표준물질로 하여 측정하였다. 가스 크로마토그래피(Varian 3800; Varian Inc., 미국)에는 SAC-5 fused-silica capillary 컬럼(30m×0.32mm i.d.; Supelco, 미국)과 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector)가 장착되어 있다. 수송용 가스는 헬륨(helium)이고 주입기(injector)와 검출기(detector)의 온도는 각각 310℃와 320℃이며, 보유시간과 표준물질을 통해 피토스테롤, 폴리코사놀 및 스쿠알렌을 각각 구별하였다.

4. 세포배양 및 세포독성 실험

인간 섬유아세포주인 Hs68 세포(American Type Culture Collection, Manassas, 미국)는 FBS(fetal bovine serum, 10%)와 페니실린(penicillin, 100unit/㎖), 스트렙토마이신(streptomycin, 50㎍/㎖)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂, 95% 습공기(humid air)로 조절된 배양기에서 배양하였다. Hs68 세포는 96-웰 배양기에 1.0×10⁴cells/well의 농도로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 FBS가 포함되지 않은 배지에 시료를 희석하여 24시간 동안 배양하였다. MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, 5mg/㎖) 용액 20㎕을 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 반응시킨 후 생성된 청색 포르마잔(formazan) 결정을 DMSO로 용해시켜 흡광도를 측정하였다.

5. UVB 조사에 대한 세포 보호 효과

Hs68 세포를 96-웰 배양기에 1.0×10⁴cells/well의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양한 후 FBS가 포함되지 않은 배지에 시료를 희석하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척한 다음 UVB 램프로 UVB(30mJ/cm²)를 조사하고, UV LIGHT METER(UV-340A, LT Lutron, 대만)를 사용하여 자외선 강도를 모니터링하였다. 모든 UVB 조사는 96-웰 배양기에 부착된 세포에 PBS를 얇게 도포한 후 수행되었으며, 조사 후 FBS가 함유되지 않은 배지에서 시료를 희석하고 24시간 동안 세포에 조사하였다. 대조군은 UVB 조사 없이 상기와 동일한 조건으로 진행하였으며, UVB에 대한 세포 보호 효과는 상기 MTT를 이용한 세포독성 실험과 동일하게 방법을 통해 확인하였다.

6. ROS 생성량 측정

Hs68 세포에 시료를 24시간 동안 전처리하고 PBS로 세척한 후 UVB(30mJ/cm²)를 세포에 조사하였다. UVB가 조사된 세포에 시료를 30분간 처리하고 25μM의 DCFH-DA(dichlorodihydro-fluorescein diacetate)로 염색한 후 형광 분광기(fluorescent spectrophotometer)를 이용하여 485nm의 여기 파장(excitation) 및 530nm의 방출 파장(emission)으로 세포 내 ROS(reactive oxygen species) 생성량을 측정하였다.

7. 수용성 콜라겐 및 MMPs 측정

MMP-1 및 MMP-3 생성량은 human MMP-1 및 MMP-3 ELISA 키트(Merck & Co. Inc., 미국)를 이용하여 배지에 존재하는 MMP-1 및 MMP-3의 함량을 측정하였고, 수용성 콜라겐의 함량은 Sircol^TM soluble collagen assay 키트를 사용하여 측정하였다.

8. qRT - PCR 을 이용한 mRNA 발현량 측정

총 RNA는 TRIzol reagent(SolGent)를 이용하여 추출하였고, cDNA는 (High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 이용하여 합성하였다. 상기 합성된 cDNA, 프라이머, RNase-free water 등이 혼합된 반응 혼합액을 이용하여 qRT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction) 수행하였으며, PCR에 사용된 TaqMan 프라이머는 Thermo Fisher Scientific에서 구입하여 사용하였다(MMP1 Assay ID; Hs00899658_m1, MMP3 Assay ID; Hs00968305_m1).

9. Western blot을 이용한 단백질 발현량 측정

10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 샘플을 로딩한 후 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 5% 탈지유가 함유된 TBST(Tris-Buffered Saline+Tween) 용액에서 1시간 동안 블로킹한 후 5% 탈지유가 함유된 TBST 용액으로 희석한 1차 항체를 이용하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 후 TBST 용액으로 30분간 세척한 후 2차 항체를 이용하여 반응시킨 다음 암실에서 ECL 용액을 처리하여 X-ray 필름에 감광시켰다.

실시예 1. 들깨박 유래 비검화물 내의 비타민 C, 피토스테롤 , 폴리코사놀 및 스쿠알렌의 함량 측정

HPLC(high-performance liquid chromatography) 및 GC(gas chromatography)를 이용하여 들깨박 비검화물 내의 비타민 C, 피토스테롤(phytosterol), 폴리코사놀(policosanol) 및 스쿠알렌(squalene) 함량을 측정한 결과, 들깨박 비검화물의 비타민 E 중에서 가장 풍부한 것은 γ-토코트리에놀(tocotrienol; 330.67mg/100g USM)이었고, 주요 폴리코사놀(policosanol)은 C24(tetracosanol; 857.72mg/100g USM), C26(hexacosanol; 252.88mg/100g USM), C28(octacosanol; 1802.98mg/100g USM), C30(triacontanol; 847.77mg/100g USM)이었으며, 피토스테롤(phytosterol) 중에서 가장 많은 함량을 차지하고 있는 것은 β-시토스테롤(sitosterol; 23016.25mg/100g USM)인 것으로 확인되었다(표 1).

실시예 2. 들깨박 유래 비검화물의 세포보호 효과 및 콜라겐 합성

인간 섬유아세포주인 Hs68 세포에 들깨박 유래 비검화물(이하, PSU)을 처리하고 UVB를 조사하여 세포 생존율 및 세포 내 콜라겐 생성량을 측정하였다.

우선, 들깨박 비검화물과 들깨박 메탄올 추출물의 세포보호 효과를 비교한 결과, UVB 조사군(PSU 무처리)이 UVB/PSU 무처리 대조군에 비해 세포 생존율이 약 75% 수준으로 감소하였으나, PSU(1, 2.5 또는 5㎍/㎖) 또는 들깨박 메탄올 추출물(1, 2.5 또는 5㎍/㎖)을 전처리한 후 UVB를 조사하면 농도의존적으로 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였다. 특히 1㎍/㎖ 농도의 PSU 처리군은 UVB 조사군(PSU 무처리)에 비해 세포 생존율이 유의적으로 증가하였으나, 1㎍/㎖ 농도의 들깨박 메탄올 추출물 처리군에서는 유의적 차이가 없음을 확인하였다. 이를 통해, 들깨박 비검화물은 들깨박 메탄올 추출물에 비해 정상 섬유아세포의 증식에서 UVB에 대한 세포보호 효과가 우수하고, 낮은 농도에서도 세포보호 효과가 우수함을 알 수 있었다(도 1A).

또한, UVB가 조사되지 않은 Hs68 세포에서 PSU 처리군(1, 2.5 또는 5㎍/㎖)과 PSU 무처리 대조군 간의 세포 생존율은 유사한 수준으로 나타나 PSU가 세포 독성이 없음을 알 수 있었다(도 1B). 또한, UVB 조사군(PSU 무처리)이 UVB/PSU 무처리 대조군에 비해 세포 생존율이 약 74% 수준으로 감소하였으나, PSU를 전처리한 후 UVB를 조사하면 PSU 농도의존적으로 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였으며(도 1C), 이를 통해, PSU는 정상 섬유아세포의 증식에서 UVB에 대한 세포보호 효과가 있음을 알 수 있었다.

또한, UVB가 조사되지 않은 Hs68 세포에 PSU를 농도별로 처리하여 세포 내 콜라겐 생성량을 측정한 결과, PSU 5㎍/㎖ 처리군은 PSU 무처리군에 비해 콜라겐 생성량이 유의적으로 증가한 것을 확인하였고(도 1D), UVB 조사군은 UVB 비조사군에 비해 콜라겐 생성량이 현저한 수준으로 감소하였으나, PSU를 전처리한 후 UVB를 조사하면 PSU 농도의존적으로 콜라겐 생성량이 증가한 것을 확인하였다(도 1E).

실시예 3. 들깨박 유래 비검화물의 ROS 생성량 억제 효과 분석

들깨박 유래 비검화물(PSU)의 ROS 생성량 억제 효과를 분석한 결과, UVB 조사군(PSU 무처리)은 UVB/PSU 무처리 대조군에 비해 ROS 생성량이 약 2배 이상 증가하였으나, PSU를 전처리한 후 UVB를 조사하면 UVB 조사에 의해 증가된 ROS 생성량이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 2).

실시예 4. 들깨박 유래 비검화물의 MMP 단백질 생성 억제 효과 분석

MMPs(matrix metalloproteinases) 단백질은 피부의 ECM(extracellular matrix) 구성 단백질을 분해하는 효소로, 노화, UV 또는 열 등의 다양한 스트레스에 의해 각질(keratinocyte)과 진피 섬유아세포(dermal fibroblast)에서 MMP의 생성이 증가하면 ECM의 주성분인 콜라겐과 엘라스틴의 양이 감소되어 피부는 탄력을 잃고 주름이 생기게 된다. 사람의 피부에는 19종의 MMP가 존재하는데 이 중 MMP-1, MMP-3 및 MMP-9만이 자외선 조사에 의하여 발현이 증가한다. 특히, MMP-1은 주요 콜라겐 분해효소로 피부의 주요 콜라겐 형태인 type-Ⅰ과 Ⅲ를 분해시키는데 type-1이 80~90%를 차지하기 때문에 MMP-1의 영향력이 가장 크며, type-1 콜라겐은 진피 섬유아세포에서 콜라겐의 전구체인 프로콜라겐(procollagen)의 형태로 합성 분비된다고 알려져 있다. MMP-1에 의해 분해된 콜라겐은 이어서 MMP-3에 의해 더 분해되며, MMP-3는 pro MMP-1을 활성화시킨다고 알려져 있다. 이에 따라, UVB 자극에 의해 증가된 MMP 단백질에 대한 들깨박 비검화물(PSU)의 영향을 알아보기 위해 세포 내 MMP-1 및 MMP-3의 생성량 및 mRNA 발현량을 측정하였다.

그 결과, UVB 조사군은 UVB/PSU 무처리 대조군에 비해 MMP-1 및 MMP-3의 생성량이 유의적으로 증가하였으나, PSU를 전처리한 후 UVB를 조사하면 UVB 조사군(PSU 무처리)에 비해 MMP-1 및 MMP-3의 생성량이 PSU 농도의존적으로 감소한 것을 확인하였다(도 3A 및 B). 또한, MMP-1 및 MMP-3의 mRNA 발현량 측정 결과도, 상기 MMP-1 및 MMP-3 생성량 결과와 매우 유사하게 나타나는 것으로 확인되었다(도 3C 및 D).

이를 통해, 본 발명의 PSU는 MMP-1 및 MMP-3의 발현과 생성을 모두 저해하여 콜라겐 분해를 억제함으로써 자외선에 의한 피부 광노화를 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 사료되었다.

실시예 5. 들깨박 유래 비검화물의 MAPK 인산화 억제 효과 분석

들깨박 유래 비검화물(PSU)이 MAPK(mitogen activated protein kinase)인 ERK, JNK 및 p38의 인산화에 미치는 영향을 분석하였다. JNK 및 ERK 인산화는 인산화된 MAPK 발현량/MAPK 발현량으로 나타내었다.

그 결과, JNK 인산화 수준은 UVB/PSU 무처리 대조군에 비해 UVB 조사군(PSU 무처리)에서 현저하게 증가하였으나, PSU를 농도별(1, 2.5 또는 5㎍/㎖)로 전처리한 후 UVB를 조사하면 UVB 조사군(PSU 무처리)에 비해 JNK의 인산화 수준이 PSU 농도의존적으로 61%, 30.9%, 19.7%까지 감소하는 것을 확인하였다(도 4A).

또한, ERK 및 p-38 인산화 수준도 상기 JNK 인산화 수준 측정 결과와 매우 유사하게 나타났으며, PSU를 농도별로 전처리한 후 UVB를 조사하면 ERK 인산화 수준의 경우 PSU 농도의존적으로 78.9%, 45.3%, 12.8%까지 감소하고(도 4B), p-38 인산화 수준의 경우 PSU 농도의존적으로 60.9%, 27.8%, 15.3%까지 감소하는 것을 확인하였다(도 4C). 이를 통해, 본 발명의 PSU가 MAPK의 인산화를 억제하여 콜라겐 분해효소의 발현을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6. 들깨박 유래 비검화물의 AP-1 전사인자 활성 억제 효과 분석

전사인자인 AP-1은 c-jun과 c-fos 단백질로 구성되어 있으며 UVB 조사에 의해 활성화되며, 활성화된 AP-1 의해 MMPs 생성량도 증가한다. 상기 실험에서 들깨박 유래 비검화물(PSU)이 MMP 단백질의 발현과 생성을 모두 감소시키는 것을 확인하였으며, PSU가 MMP 단백질의 상위조절자인 AP-1의 활성도 감소시키는지 조사하였다. AP-1 활성은 p-c-jun 또는 p-c-fos 발현량/c-jun 또는 c-fos 발현량으로 나타내었다.

그 결과, c-fos 인산화 수준은 UVB/PSU 무처리 대조군에 비해 UVB 조사군(PSU 무처리)에서 현저하게 증가하였으나, PSU를 농도별(1, 2.5 또는 5㎍/㎖)로 전처리한 후 UVB를 조사하면 c-fos 인산화 수준이 PSU 농도의존적으로 68.1%, 40.1%, 23.3%까지 감소하는 것을 확인하였다(도 5A).

또한, c-jun 인산화 수준도 상기 c-fos 인산화 수준 측정 결과와 매우 유사하게 나타났으며, PSU를 농도별로 전처리한 후 UVB를 조사하면 c-jun 인산화 수준이 PSU 농도의존적으로 88.6%, 80.0%, 63.8%까지 감소하는 것을 확인하였다(도 5B). 이를 통해, 본 발명의 PSU가 AP-1 전사인자의 인산화를 억제하여 콜라겐 분해효소의 발현을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 7. 들깨박 유래 비검화물의 TGF -β 경로 활성 증진 효과 분석

피부의 세포외기질은 노화되는 동안 점차적으로 분열되며, 노화된 인간 피부에서 진피의 세포외기질과 관련된 유전자들은 TGF-β 경로를 통해 감소된다. TGF-β는 Smad2/3의 인산화를 촉진시키고 Smad7의 경우 활성화된 TGFR1에 결합하기 위해 Smad2와 Smad3과 경쟁적으로 작용한다. UVB에 의해 증가된 ROS는 진피 섬유아세포 내에서 TGF-β의 작용을 저해하고 세포 내 전사인자인 AP-1을 활성화시킨다고 알려져 있다. 이에 따라, Type 1 procollagen 합성의 주요 조절인자인 TGFβ/smad 신호전달경로에 들깨박 유래 비검화물(PSU)이 미치는 영향에 대해 분석하였다.

그 결과, TGF-β1 및 Smad2/3의 발현량은 UVB/PSU 무처리 대조군에 비해 UVB 조사군(PSU 무처리)에서 현저하게 감소하였으나, PSU를 농도별(1, 2.5 또는 5㎍/㎖)로 전처리한 후 UVB를 조사하면 UVB 조사군(PSU 무처리)에 비해 TGF-β1과 Smad2/3의 발현량이 PSU 농도의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 6A 및 B)

반면, TGF-β1 및 Smad2/3의 활성을 저해는 Smad7의 발현량은 UVB/PSU 무처리 대조군에 비해 UVB 조사군(PSU 무처리)에서 현저하게 증가하였으나, PSU를 농도별로 전처리한 후 UVB를 조사하면 UVB 조사군(PSU 무처리)에 비해 Smad7의 발현량이 PSU 농도의존적으로 감소한 것을 확인하였다(도 6C).

Claims

들깨박 유래 비검화물(unsaponifiable matter)을 유효성분으로 함유하는 자외선 조사에 의한 피부손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 들깨박 유래 비검화물은 들깨박에 알칼리를 처리하여 검화물을 분해하여 수득한 것을 특징으로 하는 자외선 조사에 의한 피부손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제
삭제
제1항 또는 제3항에 따른 화장료 조성물을 포함하는 자외선 차단제.
들깨박 유래 비검화물(unsaponifiable matter)을 유효성분으로 함유하는 자외선 조사에 의한 피부손상 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물.
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